KR101322873B1

KR101322873B1 - 퀴놀리논 카르복사미드 화합물의 결정형

Info

Publication number: KR101322873B1
Application number: KR1020077025632A
Authority: KR
Inventors: 폴 알. 패더리; 에스. 데릭 터너; 아담 골드블럼; 로버트 차오; 다니엘 제노브
Original assignee: 세라밴스 인코포레이티드
Priority date: 2005-04-06
Filing date: 2006-04-05
Publication date: 2013-10-30
Also published as: ZA200708071B; WO2006108127A3; CN101151264A; MX2007012438A; ES2350495T3; EA200702161A1; AU2006232129A1; HRP20100629T1; MA29403B1; WO2006108127A2; IL186023A; NZ561900A; US7728004B2; TW200643020A; JP5230407B2; BRPI0610657A2; PT1874766E; PE20061310A1; AU2006232129B2; US8658671B2

Abstract

본 발명은 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염 또는 그의 용매화물을 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 결정성 염 형태를 포함하는 약학 조성물, 5 HT₄ 수용체 활성과 관련된 질병을 치료하기 위해 그러한 결정성 염 형태를 이용하는 방법, 및 그러한 결정성 염 형태를 제조하는데 유용한 방법을 제공한다.

Description

퀴놀리논 카르복사미드 화합물의 결정형{Crystalline form of a quinolinone-carboxamide compound}

본 발명은 5-HT₄ 수용체 작용제로서 유용한 퀴놀린 카르복사미드 화합물의 결정성 염 형태에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 결정성 화합물을 포함하는 약학 조성물, 5-HT₄ 수용체 활성에 의해 매개되는 의학적 상태를 치료하기 위해 그러한 화합물을 사용하는 방법, 및 그러한 화합물을 제조하는데 유용한 방법에 관한 것이다.

공동으로 양도된 2004년 4월 7일자 출원의 미국 가출원 60/560,076, 및 2005년 4월 6일자 출원의 미국특허출원 11/100,113은 위장관 운동 저하의 질병을 치료하는데 유용한 것으로 기대되는 신규한 퀴놀리논-카르복사미드 화합물을 개시하고 있다. 특히, 화합물 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드는 특히 이 출원들에서 5-HT₄ 작용제 활성을 입증하는 것으로 개시되어 있다.

1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8- [(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 화학 구조는 하기 화학식 I과 같다:

이러한 화합물을 치료제로서 효과적으로 이용하기 위해, 용이하게 제조될 수 있으며 허용 가능한 화학적 및 물리적 안정성을 갖는 고체상태의 염 형태를 갖는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 약 200℃가 넘는 온도에서 열적으로 안정하고 흡습성 및 조해성을 갖지 않아, 물질의 가공 및 저장을 용이하게 하는 염 형태를 갖는 것이 매우 바람직할 것이다. 결정성 고체는 제조된 제품의 순도 및 안정성을 향상시킬 수 있어 일반적으로 무정형에 비해 바람직하다.

화학식 I의 화합물의 결정성 염 형태는 이전에 전혀 보고되지 않았다. 따라서, 흡습성도 없고 조해성도 없으며 유리한 열 안정성을 나타내는 안정한 화학식 I의 화합물의 결정성 염 형태가 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염 또는 그의 용매화물을 제공한다. 일 측면에서, 본 발명의 결정성 염 형태는 화학식 I의 화합물의 결정성 염산염이다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 결정성 염 형태는 화학식 I의 화합물의 염산염의 결정성 수화물이다.

놀랍게도, 본 발명의 결정성 염산염은 약 200℃ 보다 높은 온도에서 열적으로 안정하며, 실온에서 약 2% 내지 약 90% 범위의 상대습도에 노출 시 약 0.2% 미만의 중량변화를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 본 발명의 결정성 염산염 및 그의 수화물은 모두 실온에서 90% 이하의 상대습도에 노출 시 조해성을 나타내지 않는다.

다른 용도 중에서도, 본 발명의 결정성 염은 위장관의 운동 감소 질환을 치료하기 위한 약학 조성물을 제조하는데 유용한 것으로 기대된다. 따라서, 조성물의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염 또는 그의 용매화물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 포유류에게 치료학적으로 유효한 양의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염 또는 그의 용매화물을 투여하는 것을 포함하는, 5-HT₄ 수용체 활성과 관련된 질병 또는 상태, 예를 들어 위장관 운동 감소 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면의 방법에 있어서, 본 발명은 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드를 염산과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성시키는 단계; 및 상기 반응 혼합물로부터 결정성 염산염을 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 결정성 염산염을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 의약으로서 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 결정성 염산염을 제공하며, 뿐만 아니라 의약의 제조, 특히 포유류의 위장관 운동 감소 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 결정성 염산염의 용도를 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염 및 그의 용매화물을 제공한다.

정의

본 발명의 화합물, 조성물, 및 방법을 기재할 때, 하기 용어는 달리 나타내지 않는다면 다음과 같은 의미를 갖는다.

용어 "치료학적으로 유효한"이란 치료가 필요한 환자에게 투여 시 치료 효과를 내는데 충분한 양을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "치료"는 포유류(특히, 인간)와 같은 환자에서의 질병, 질환, 또는 의학적 상태의 치료를 의미하며, 하기 사항을 포함한다:

(a) 질병, 질환, 또는 의학적 상태가 일어나는 것을 방지하는 것, 즉 환자의 예방적 치료;

(b) 질병, 질환, 또는 의학적 상태를 완화시키는 것; 즉 환자의 질병, 질환, 또는 의학적 상태의 제거 또는 퇴화 유발;

(c) 질병, 질환, 또는 의학적 상태를 억제하는 것, 즉 환자의 질병, 질환, 또는 의학적 상태의 진전을 늦추거나 저지하는 것; 또는

(d) 환자의 질병, 질환, 또는 의학적 상태의 증상을 경감시키는 것.

용어 "용매화물"은 하나 이상의 용질 분자, 즉 본 발명의 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염, 및 하나 이상의 용매 분자에 의해 형성된 복합체 또는 응집물을 의미한다. 그러한 용매화물은 실질적으로 고정된 몰 비율의 용질 및 용매를 갖는 전형적으로 결정성의 고체이다. 대표적인 용매는 예를 들어, 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세트산 등을 포함한다. 상기 용매가 물인 경우, 형성된 용매화물은 특히 수화물이라고 부른다.

본 명세서에 기재된 용어 "결정성 염산염"은 결정 격자 내에 실질적으로 고정된 몰 비율의 용매 분자를 포함하지 않는 결정성 고체, 즉 용매화물이 아닌 결정성 고체를 의미한다. 본 발명의 용매화물, 또는 구체적으로 수화물은 명백하게 표시하여 나타낸다.

명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단일 형태 "a", "an", "one", 및 "the"는 명백히 달리 나타내지 않는다면, 복수의 지시물을 포함할 수 있다.

용어 "아미노-보호기"는 아미노 질소에서 원하지 않는 반응을 억제하는데 적절한 보호기를 의미한다. 대표적인 아미노 보호기는 포밀; 예를 들어, 알카노일(예: 알세틸)기와 같은 아실기; 알콕시카보닐기(예: t-부톡시카보닐(Boc)); 아릴메톡시카보닐기(예: 벤질옥시카보닐(Cbz) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc)); 아릴메틸기(예: 벤질(Bn), 트리틸(Tr), 및 1,1-디-(4'-메톡시페닐)메틸)); 실릴기(예: 트리메틸실릴(TMS) 및 t-부틸디메틸실릴(TBDMS)) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

활성 약물

본 발명의 염 형태에서의 활성 약물, 즉 화학식 I의 화합물은 상업적으로 입수 가능한 AutoNom 소프트웨어(MDL Information Systems, GmbH, Frankfurt, Germany)를 이용하면 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드라고 명명된다. (1S,3R,5R)의 표시는 바이시클릭 고리 시스템과 관련된 결합의 상대적인 배향을 나타낸다. 상기 화합물은 택일적으로 N-[(3-엔도)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일]-1-(1-메틸에틸)-2-옥소-1,2-디하이드로-3-퀴놀린카르복사미드라고도 나타낸다.

본 발명의 염 형태

일 측면에서, 본 발명은 결정성의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드 염산을 제공한다.

본 발명의 결정성 염산염은 전형적으로 화학식 I의 화합물의 몰당량당 약 0.8 내지 약 1.2 몰당량의 염산을 함유하며, 화학식 I의 화합물의 몰 당량당 약 0.9 내지 약 1.1 몰당량의 염산을 포함한다.

염산의 상기 활성성분에 대한 몰 비율은 당업자가 이용 가능한 방법에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 그러한 몰 비는 질산은 표준용액을 이용한 적정에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 택일적으로, 원소분석, ¹H NMR, 및 이온 크로마토그래피 방법이 몰 비율을 결정하기 위해 이용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 결정성 염산염은 분말 X-선 회절(PXRD) 패턴이 4.41±0.2, 8.82±0.2, 9.08±0.2, 11.21±0.2, 14.40±0.2, 16.42±0.2, 17.35±0.2, 17.61±0.2, 18.14±0.2, 19.04±0.2, 19.95±0.2, 20.20±0.2, 21.23±0.2, 22.13±0.2, 22.48±0.2, 22.83±0.2, 24.16±0.2, 25.37±0.2, 25.56±0.2, 26.22±0.2, 27.33±0.2, 29.08±0.2, 및 29.61±0.2에서 선택된 2θ 값에서 두 개 이상의 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 한다. 특히, 이러한 측면에서 상기 결정형은 분말 X-선 회절 패턴이 14.40±0.2, 17.35±0.2, 17.61±0.2, 19.04±0.2, 21.23±0.2, 및 22.13±0.2에서 선택된 2θ 값에서 두 개 이상의 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 한다.

분말 X-선 회절 분야에서 알려져 있는 바와 같이, PXRD 스펙트럼의 피크 위치는 샘플 제조 및 기구의 기하학적 배열과 같은 실험적 세부 조건에 피크 높이보다 상대적으로 덜 민감하다. 따라서, 일 측면에서 화학식 I의 화합물의 결정성 염산염은 분말 X-선 회절 패턴의 피크 위치가 도 1에 나타낸 것과 실질적으로 일치하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 결정성 염산염은 또한 높은 온도에서의 열 안정성을 갖는 것을 특징으로 하며, 이는 도 2에 나타낸 바와 같이 약 230℃ 내지 약 260℃의 온도 범위에서 흡열 열 흐름의 피크를 나타내는 시차 주사 열량법(DSC) 기록에 의해 입증된다. 더욱이, 열 중량 분석(TGA) 기록은 약 225℃ 미만에서 현저한 열 이벤트를 나타내지 않는다.

또 다른 측면에서, 결정성 염산염은 적외선 흡광 스펙트럼이 약 758, 783, 795, 802, 949, 981, 1149, 1158, 1217, 1332, 1377, 1453, 1467, 1487, 1525, 1566, 1575, 1615, 1672, 및 3197 cm^-1에서 현저한 흡광 밴드를 나타내는 것을 특징으로 한다.

화학식 I의 화합물의 결정성 염산염은 도 3에 나타낸 바와 같이 이례적으로 낮은 수준의 흡습성(즉, 실온에서 2% 상대습도 내지 90% 상대습도 범위에서 약 0.2 중량% 미만의 증가)을 갖는 가역성의 흡착/탈착 프로파일을 갖는 것으로 입증되었다.

또한, 화학식 I의 화합물의 결정성 염산염은 장기간동안 상승된 온도 및 습도에 노출 시 안정한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 40℃ 및 75% 상대습도에서 24 시간 동안 저장 후, HPLC에 의해 분석한 결과, 화학적 분해가 나타나지 않았으며, DSC, TGA, 또는 PXRD 결과에서 감지할만한 변화가 없었다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 염산염의 결정성 수화물을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명의 염산염의 결정성 수화물은 분말 X-선 회절(PXRD) 패턴이 5.30±0.2, 7.43±0.2, 8.72±0.2, 10.52±0.2, 13.85±0.2, 14.11±0.2, 15.80±0.2, 15.99±0.2, 17.26±0.2, 19.53±0.2, 20.08±0.2, 21.06±0.2, 21.48±0.2, 21.92±0.2. 22.85±0.2, 23.91±0.2, 25.28±0.2, 26.06±0.2, 27.34±0.2, 27.51±0.2, 및 29.67±0.2에서 선택된 2θ 값에서 두 개 이상의 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 한다. 특히, 이러한 측면에서 상기 결정성 형태는 분말 X-선 회절 패턴이 10.52±0.2, 13.85±0.2, 15.80±0.2, 17.26±0.2, 및 21.06±0.2에서 선택된 2θ 값에서 두 개 이상의 회절 피크를 갖는 것을 특징으로 한다.

또 다른 측면에서, 화학식 I의 화합물의 염산염의 결정성 수화물은 분말 X-선 회절 패턴이 피크의 위치가 도 4에 나타낸 것과 실질적으로 일치하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 염산염의 결정성 수화물은 또한 시차 주사 열량법 기록이 도 5에 나타낸 바와 같이, 약 225℃ 내지 약 250℃ 범위에서 결정의 용융으로 인지되는 흡열 열 흐름에서 실질적인 피크를 나타내며 더 낮은 온도에서 넓거나 약한 흡열을 갖는 것을 특징으로 한다. 더욱이, 열중량분석(TGA) 기록은 분해 온도가 약 250℃ 이상인 것을 나타낸다.

화학식 I의 화합물의 염산염의 결정성 수화물은 도 6에 나타낸 바와 같이, 약 2% 내지약 90%의 상대습도 전체 범위에서 실온에서 가역적인 흡착/탈착 프로파일을 갖는 것으로 입증되었다. 상기 결정성 수화물은 약 40% 내지 약 75%의 상대습도 범위에서 약 0.25 중량% 미만의 중량 증가를 나타낸다.

본 발명의 염 형태의 이러한 특징은 하기 실시에에서 더욱 상세하게 설명한다.

합성 방법

활성 약물, 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드는 하기 실시예에 나타낸 바와 같은 방법을 이용하여 또는 본 출원의 배경기술 분야에 열거되어 있는 공동에게 양도된 미국출원에 기재되어 있는 방법을 이용하여 용이하게 입수 가능한 출발물질로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 결정성 염산염을 제조하기 위해, 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드는 전형적으로 약 1 내지 약 1.2 몰당량을 포함한 약 1 내지 약 1.5 몰당량의 진한 염산과 접촉시킨다. 일반적으로, 이러한 반응은 약 20℃ 내지 약 80℃ 범위의 온도에서 불활성 희석제 중에서 수행한다. 이러한 반응을 위한 적절한 불활성 희석제는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 톨루엔, 테트라하이드로퓨란, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

반응의 완료 시, 본 발명의 결정성 염은 침전, 농축, 원심분리 등과 같은 임의의 수단에 의해 반응 혼합물로부터 분리한다.

상기 결정성 수화물은 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 염산염을 물에 약 50 mg/mL 이상의 농도로 용해하여 현탁액을 제조하고, 그 결과 생성되는 결정성 수화물을 그로부터 종래의 방법을 이용하여 분리함으로써 제조할 수 있다.

약학 조성물

본 발명의 결정성 염산염 형태는 전형적으로 약제학적 조성물의 형태로 환자에게 투여한다. 그러한 약학 조성물은 환자에게, 경구, 직장, 질, 경비, 흡입, 국소(경피 포함) 및 주사 투여 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 허용 가능한 투여 경로로 투여할 수 있다.

따라서, 그 조성물의 측면 중 하나에서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 화학식 I의 화합물의 결정성 염산염 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한 약학 조성물에 관한 것이다. 선택적으로, 그러한 약학 조성물은 필요하다면 다른 치료제 및/또는 제제화제를 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 전형적으로 본 발명의 치료학적으로 유효한 양의 결정성 염을 함유한다. 전형적으로, 그러한 약학 조성물은 약 5 내지 약 60 중량%의 활성성분과 같이, 약 1 내지 약 70 중량%를 포함한, 약 0.1 내지 약 95 중량%의 활성성분을 함유할 것이다.

임의의 종래의 담체 또는 부형제가 본 발명의 약학 조성물에 이용될 수 있다. 구체적인 담체 또는 부형제의 선택, 또는 담체 또는 부형제의 조합은 특정 환자 또는 의학적 상태나 질병 상태의 종류를 치료하기 위해 이용되고 있는 투여방법에 따라 달라질 것이다. 이와 관련하여, 특정 투여방법을 위한 적절한 약학 조성물의 제조 방법은 약제학 기술분야에 잘 알려져 있다. 또한, 그러한 조성물을 제조하기 위한 성분은, 예를 들어, Sigma, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178로부터 상업적으로 입수 가능하다. 추가적으로 설명하면, 종래의 제제화 기술이 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); 및 H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999)에 기재되어 있다.

약제학적으로 허용 가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 대표적인 예는 (1) 락토오스, 글루코오스, 및 수크로오스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 미세결정 셀룰로오스 및 그 유도체(예: 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스)와 같은 셀룰로오스; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유, 및 대두유; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (12) 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 아가; (14) 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 파이로젠 제거 수(水); (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) 인산 완충액; (21) 약제학적 조성물에 이용되는 다른 무독성의 적합한 물질 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 전형적으로 본 발명의 화합물을 약학적으로 허용 가능한 담체 및 하나 이상의 선택적인 성분과 완전하고 긴밀하게 혼합하거나 블렌딩함으로써 제조한다. 필요하거나 원한다면, 그 결과 형성된 균질하게 블렌딩된 혼합물은 그런 다음 종래의 방법 및 기구를 이용하여 정제, 캅셀, 환제 등으로 성형하거나 로딩할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 단위 제형으로 포장한다. 용어 "단위 제형"이란 환자에게 투여하기에 적절한 물리적으로 구별되는 단위를 말하며, 즉, 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 유닛과 조합하여 원하는 치료 효과를 생성시키도록 계산된 기결정된 양의 활성성분을 함유하는 각각의 단위를 말한다. 예를 들어, 그러한 단위 제형은 캅셀, 정제, 환제 등일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 경구투여에 적절하다. 경구 투여에 적절한 약학 조성물은 캅셀, 정제, 환제, 로젠지, 카켓, 드래기, 산제, 과립제의 형태이거나; 또는 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 또는 유중수 액상 유제로서; 또는 엘릭실제 또는 시럽제 등의 형태로 존재하고; 각각은 활성성분으로서 기결정된 양의 본 발명의 화합물을 함유한다.

고체 제형(즉, 캅셀, 정제, 환제 등)으로 경구투여 하고자 할 경우에는, 본 발명의 약제학적 조성물은 전형적으로 활성성분으로서 본 발명의 화합물, 및 구연산 나트륨 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 것이다. 선택적으로 또는 택일적으로, 그러한 고체 제형은 또한 (1) 전분, 미세결정 셀룰로오스, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 및/또는 규산과 같은 필러 또는 증량제; (2) 카르복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로오스, 및/또는 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤과 같은 흡습제(humectant); (4) 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 소정의 실리케이트, 및/또는 탄산나트륨과 같은 붕해제; (5) 파라핀과 같은 용해 지연제; (6) 4급 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (7) 세틸알콜 및/또는 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카올린 및/또는 벤토나이트 점토와 같은 흡습제; (9) 탈크, 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및/또는 이들의 혼합물과 같은 활택제; (10) 착색제; 및 (11) 완충제를 포함할 수 있다.

이형제, 습윤제, 코팅제, 감미제, 향미 방향제, 보존제, 및 항산화제가 또한 본 발명의 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 산화제의 예는 (1) 아스코르브산, 시스테인 염산, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설페이트, 소듐 설파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파 토코페롤 등과 같은 지용성 항산화제, 및 (3) 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이팅제 등이 있다. 정제, 캅셀, 환제 등을 위한 코팅제는 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 메타크릴산-메타크릴산 에스테르 코폴리머, 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트(CAT), 카르복시메틸 에틸 셀룰로오스(CMEC), 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트(HPMCAS) 등과 같이 장용성 코팅을 위해 이용되는 것을 포함한다.

원한다면, 본 발명의 약학 조성물은 예를 들어, 다양한 비율로 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스를 이용하거나; 다른 폴리머 매트릭스, 리포좀, 및/또는 마이크로스피어를 이용하여 활성성분의 서방출 또는 제어방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있으며, 그것이 위장관의 소정 부위에서만 또는 그 부위에서 우선적으로, 선택적으로는 지연된 방식으로 활성성분을 방출하도록 제제화될 수 있다. 이용될 수 있는 이식 조성물의 예는 폴리머 물질 및 왁스를 포함한다. 활성성분은 적절하게는 하나 이상의 상기 부형제와 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.

적절한 경구 투여용 액상 제형은 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 유제, 마이크로에멀젼, 액제, 현탁제, 시럽제, 및 엘릭실제를 포함한다. 그러한 액상 제형은 전형적으로 활성성분 및 불활성 희석제(예: 물 또는 다른 용매), 가용화제 및 유화제(예: 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 윗점오일, 올리브유, 피마자유, 및 참개유), 글리세롤, 테트라하이드로퓨릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물 포함한다. 현탁제는 상기 활성성분 이외에 현탁화제(예: 에톡실화이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 솔비톨, 및 소르비탄 에스테르), 미세결정 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가, 및 트라가칸트, 그리고 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.

택일적으로, 본 발명의 약학 조성물은 흡입 투여를 위해 제제화된다. 흡입 투여에 적절한 약학 조성물은 전형적으로 에어로졸 또는 산제의 형태일 것이다. 그러한 조성물은 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기, 네불라이저, 또는 유사한 전달 장치와 같은 일반적으로 잘 알려진 전달 장치를 이용하여 투여한다.

가압 용기를 이용하여 흡입 투여할 경우, 본 발명의 약학 조성물은 전형적으로 활성성분 및 적절한 추진체(예: 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소, 또는 다른 적절한 기체)를 포함할 것이다.

또한, 상기 약학 조성물은 본 발명의 화합물 및 분말 흡입기에 사용하기 위한 적절한 분말을 포함하는 캅셀 또는 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로부터 제조)의 형태일 수 있다. 적절한 분말 베이스는 예를 들어, 락토오스 또는 전분 등이 있다.

본 발명의 화합물은 또한, 공지된 경피 전달 시스템 및 부형제를 이용하여 경피로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 아자사이클로알칸-2-온 등과 같은 투과촉진제와 함께 혼합되어, 팻치 또는 유사한 전달 시스템에 통합될 수 있다. 겔화제, 유화제, 및 완충제를 포함한 부가적인 부형제는 원한다면 그러한 경피 조성물에 이용될 수 있다.

하기 제제는 대표적인 본 발명의 약학 조성물의 예를 나타낸다.

제제 실시예 A

경구 투여용 경질 젤라틴 캅셀을 하기와 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 성분들을 완전히 블렌딩한 다음, 경질 젤라틴 캅셀에 로딩하였다(캅셀당 조성물 260 mg).

제제 실시예 B

경구 투여용 경질 젤라틴 캅셀을 하기와 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 성분들을 완전히 블렌딩한 다음, No. 45 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시키고 경질 젤라틴 캅셀에 로딩하였다(캅셀당 조성물 200 mg).

제제 실시예 C

경구 투여용 캅셀을 하기와 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 성분들을 완전히 블렌딩한 다음, 젤라틴 캅셀에 로딩하였다(캅셀당 조성물 310 mg).

제제 실시예 D

경구 투여용 정제를 하기와 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 활성 성분, 전분, 및 셀룰로오스를 No. 45 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시키고 완전히 혼합하였다. 그 결과 생성된 분말을 폴리비닐피롤리돈 용액과 혼합한 다음, 이 혼합물을 No. 14 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시켰다. 그리하여 생성된 과립을 50-60℃에서 건조하고 No. 18 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시켰다. 그런 다음, 소듐 카르복시메틸 전분, 스테아린산 마그네슘, 및 탈크(미리 No. 60 메쉬 U.S. 체 통과)를 상기 과립에 부가하였다. 혼합한 후, 그 혼합물을 타정기 상에서 압축하여 중량 100 mg의 정제를 생성시켰다.

제제 실시예 E

경구 투여용 정제를 하기와 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 성분들을 완전히 블렌딩한 다음, 타정하여 정제를 형성시켰다(정제당 조성물 440 mg).

제제 실시예 F

경구 투여용 단일 스코어 정제를 하기와 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 성분들을 완전히 블렌딩한 다음, 타정하여 단일 스코어 정제를 형성시켰다(정제당 조성물 215 mg).

제제 실시예 G

경구 투여용 현탁제를 하기와 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 성분들을 혼합하여 현탁제 10 mL당 활성성분 10 mg을 함유하는 현탁제를 형성시켰다.

제제 실시예 H

흡입 투여용 건조 분말을 하기와 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 활성성분을 미분화한 다음 락토오스와 함께 블렌딩하였다. 그런 다음, 이러한 블렌딩 혼합물을 젤라틴 흡입 카트리지에 로딩하였다. 상기 카트리지의 내용물을 분말흡입기를 이용하여 투여한다.

제제 실시예 I

정량 흡입기로 흡입 투여하기 위한 건조 분말을 다음과 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 본 발명의 염 5 중량% 및 레시틴 0.1 중량%를 함유하는 현탁제를, 탈염수 200 mL 중에 레시틴 0.2 g을 용해하여 형성시킨 용액 중에 활성 화합물을 10 ㎛ 미만의 평균 크기를 갖는 미분화 입자로서 분산시킴으로써 제조하였다. 상기 현탁액을 분무 건조한 다음, 그 결과 생성된 물질을 미분화하여 1.5 ㎛ 미만의 평균 직경을 갖는 입자로 하였다. 그 입자들을 가압 1,1,1,2-테트라플루오로에탄이 구비된 카트리지에 로딩하였다.

제제 실시예 J

주사 제제를 다음과 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 성분들을 블렌딩하고, pH를 0.5 N HCl 또는 0.5 N NaOH를 이용하여 4 ± 0.5로 조정하였다.

제제 실시예 K

경구 투여용 캅셀을 다음과 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 성분들을 완전히 블렌딩한 다음, 젤라틴 캅셀(사이즈#1, 백색, 불투명)에 로딩하였다(캅셀당 조성물 264 mg).

제제 실시예 L

경구 투여용 캅셀을 다음과 같이 제조하였다:

대표적인 방법: 상기 성분들을 완전히 블렌딩한 다음, 젤라틴 캅셀(사이즈#1, 백색, 불투명)에 로딩하였다(캅셀당 조성물 148 mg).

유용성

화학식 I의 화합물, 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드는 5-HT₄ 수용체 작용제이므로, 본 발명의 화학식 I의 화합물의 결정성 염 형태는 5-HT₄ 수용체에 의해 매개되거나 5-HT₄ 수용체 활성과 관련된 의학적 상태, 즉 5-HT₄ 수용체 작용제로 치료 시 경감되는 의학적 상태를 치료하는데 유용할 것으로 기대된다. 그러한 의학적 상태는 과민성 대장 증후군(IBS), 만성 변비, 기능성 소화불량, 위 배출 지연, 위식도 역류 질환(GERD), 위장 마비, 당뇨병성 및 특발성 위장질환, 수술 후 장폐색증, 장 가성 폐쇄, 및 약물 유도 통과지연을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 몇몇 5-HT₄ 수용체 작용제 화합물은 인지 장애, 행동 장애, 정서 장애, 및 자율기능 조절장애를 포함한 중추 신경계 질환의 치료에 이용될 수 있는 것으로 제안되었다.

특히, 본 발명의 염 형태는 위장관(GI)의 운동을 증가시키고 그리하여 인간을 포함한 포유류의 운동 감소에 의해 야기되는 GI관 질환을 치료하는데 유용한 것으로 기대된다. 그러한 GI 운동 질환은 예를 들어, 변비, 변비 우세형 과민성대장증후군(C-IBS), 당뇨병성 및 특발성 위마비, 및 기능성 소화불량을 포함한다.

그러므로, 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 결정성 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료학적으로 유효한 양의 약학 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는 포유류의 위장관 운동을 증가시키는 방법을 제공한다.

GI관의 운동성 감소 질환 또는 다른 5-HT₄ 수용체에 의해 매개되는 다른 상태를 치료하기 위해 사용할 경우, 본 발명의 염 형태는, 다른 투여 형태를 사용할 수 있음에도 불구하고, 전형적으로 하루에 단일 투여 또는 하루에 여러 번 투여를 경구로 할 것이다. 1 회 투여 당 투여되는 활성성분의 양 또는 하루에 투여되는 총 투여량은 전형적으로 내과의사가 치료하는 환자의 상태, 선택된 투여경로, 투여되는 실제 화합물, 및 상대적인 활성, 나이, 체중, 및 각각의 환자의 반응, 환자의 증상의 정도를 포함한 관련 상태의 견지에서 결정할 것이다.

GI관의 운동성 감소 질환 또는 다른 5-HT₄ 수용체에 의해 매개되는 다른 상태를 치료하기 위한 적절한 투여량은 약 0.0007 내지 약 1 mg/kg/일을 포함한 약 0.0007 내지 약 20 mg/kg/일의 활성성분의 범위인 것으로 예상된다. 평균 70 kg의 인간의 경우, 이것은 약 0.05 내지 약 70 mg/일의 활성성분의 양이 될 것이다.

본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 염 형태는 만성 변비를 치료하는데 이용된다. 만성변비를 치료하기 위해 이용될 경우, 본 발명의 염은 전형적으로 경구로 하루에 일 회 또는 하루에 여러번 투여될 것이다. 만성 변비를 치료하기 위한 투여량은 약 0.05 내지 70 mg/일의 범위일 것으로 예상된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 염 형태는 과민성 대장 증후군을 치료하는데 이용된다. 변비-우세형 과민성 대장 증후군을 치료하는데 이용될 경우, 본 발명의 염은 전형적으로 경구로 하루에 일 회 또는 하루에 여러번 투여될 것이다. 변비-우세형 과민성 대장 증후군을 치료하기 위한 투여량은 약 0.05 내지 70 mg/일의 범위일 것으로 예상된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 염 형태는 당뇨병성 및 특발성 위장마비를 치료하는데 이용된다. 당뇨병성 및 특발성 위장마비를 치료하는데 이용될 경우, 본 발명의 염은 전형적으로 경구로 하루에 일 회 또는 하루에 여러번 투여될 것이다. 당뇨병성 및 특발성 위장마비를 치료하기 위한 투여량은 약 0.05 내지 70 mg/일의 범위일 것으로 예상된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 염 형태는 기능성 소화불량을 치료하는데 이용된다. 기능성 소화불량을 치료하는데 이용될 경우, 본 발명의 염은 전형적으로 경구로 하루에 일 회 또는 하루에 여러번 투여될 것이다. 기능성 소화불량을 치료하기 위한 투여량은 약 0.05 내지 70 mg/일의 범위일 것으로 예상된다.

본 발명은 또한 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 염 형태 또는 본 발명의 염 형태를 포함하는 약학 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 5-HT₄ 수용체 활성과 관련된 질병 또는 상태를 갖는 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 염 형태는 5-HT₄ 수용체 작용제이다. 그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 염 형태를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는 포유류의 5-HT₄ 수용체를 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 염산염 형태의 상기 유용성뿐만 아니라 이러한 특징은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 in vitro 및 in vivo 어세이를 이용하여 입증될 수 있다. 대표적인 어세이를 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 다양한 측면을 첨부하는 도면을 참조하여 설명한다.

도 1은 본 발명의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시 클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염의 분말 X-선 회절(PXRD) 패턴을 나타낸다.

도 2는 본 발명의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염의 시차주사열량법(DSC) 기록(하부측, 우측 수직축) 및 열중량분석(TGA)(상부측, 좌측 수직축) 기록을 나타낸다.

도 3은 본 발명의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염의 동역학적 수분 흡착(DMS) 기록을 나타낸다.

도 4는 본 발명의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 염산염의 결정성 수화물의 분말 X-선 회절 패턴(PXRD) 패턴을 나타낸다.

도 5는 본 발명의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 염산염의 결정성 수화물의 시차주사열량법(DSC) 기록(상부측, 좌측 수직축) 및 열중량분석(TGA)(하부측, 우측 수직축) 기록을 나타낸다.

도 6은 본 발명의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 염산염의 결정성 수화물의 동역학적 수분 흡착(DMS) 기록을 나타낸다.

하기 합성 및 생물학적 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공하는 것이며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어져서는 안된다. 하기 실시예에서, 하기 약어는 달리 나타내지 않는다면 하기 의미를 갖는다. 하기 정의되지 않은 약어는 그것의 일반적으로 수용되는 의미를 갖는다.

Boc = t-부톡시카보닐

(Boc)₂O = 디-t-부틸 디카보네이트

DCM = 디클로로메탄

DMF = N,N-디메틸포름아미드

DMSO = 디메틸 술폭시드

EtOAc = 에틸 아세테이트

mCPBA = m-클로로벤조산

MeCN = 아세토니트릴

MTBE = t-부틸 메틸 에테르

PyBop = 벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노-포스포늄 헥사플루 오로포스페이트

R_f = 체류 요소

RT = 실온

TFA = 트리플루오로아세트산

THF = 테트라하이드로퓨란

시약(이차 아민을 포함) 및 용매는 상업적 공급업체(Aldrich, Fluka, Sigma 등)로부터 구입하였으며, 추가적인 정제 과정 없이 사용하였다. 반응은 달리 나타내지 않는다면 질소 분위기 하에서 수행하였다. 반응 혼합물의 반응 진행은 TLC(박층 크로마토그래피), 분석적 고성능 액체 크로마토그래피(anal. HPLC), 및 질량분광분석법에 의해 모니터링 하였으며, 그 상세한 내용은 아래에 그리고 별도로 구체적인 반응예 기재하였다. 반응 혼합물을 각각의 반응에서 구체적으로 기재된 바와 같이 수행하였으며; 공통적으로 그 반응 혼합물들은 추출, 및 온도-, 용매- 의존적 결정화와 같은 다른 정제 방법, 그리고 침전에 의해 정제하였다. 또한, 반응 혼합물들을 제조적 HPLC에 의해 통상적으로 정제하였다. 반응 혼합물의 규명은 질량분광분석법 및 ¹H-NMR 분광분석법에 의해 통상적으로 수행하였다. NMR 측정의 경우, 샘플을 중수소화 용매(CD₃OD, CDCl₃, 또는 DMSO-d ₆) 중에 용해하고, ¹H-NMR 스펙트럼을 표준 흡수 조건 하에서 Varian Gemini 2000 기구(300 MHz)로 획득하였다. 화합물의 질량분광분석적 규명을 Applied Biosystems(Foster City, CA) 모델 API 150 EX instrument 또는 Agilent(Palo Alto, CA) 모델 1100 LC/MSD instrument 를 이용하여 ESMS(electrospray ioniation method)에 의해 수행하였다. 물 함량은 Brinkmann(Westbury, NY) Metrohm Karl Fischer Model 813 쿨로미터(coulometer)를 이용하여 Karl Fischer 적정에 의해 결정한다.

제조 1: (1S,3R,5R)-3-아미노-8- 아자바이시클로[3.2.1]옥탄 -8- 카르복실산 t-부틸 에스테르

a. 8-벤질-8- 아자바이시클로[3.2.1]옥탄 -3-온의 제조

진한 염산(30 mL)을 불균질한 물(170 mL) 중의 2,5-디메톡시 테트라하이드로퓨란(82.2 g, 0.622 mol) 수용액에 교반하면서 부가하였다. 0℃(아이스 배쓰)로 냉각된 별도의 플라스크에, 진한 염산(92 mL)를 물(350 mL) 중의 벤질 아민(100 g, 0.933 mol) 수용액에 서서히 부가하였다. 2,5-디메톡시하이드로퓨란 용액을 약 20 분간 교반하고, 물(250 mL)로 희석하고 나서, 벤질아민 용액을 부가한 다음, 물(400 mL) 중의 1,3-아세톤디카르복실산(100 g, 0.684 mol) 용액을 부가하고 나서, 물(200 mL) 중의 인산수소나트륨(44 g, 0.31 mol)을 부가하였다. pH를 40% NaOH를 이용하여 pH 1 내지 pH ~4.5로 조정하였다. 그 결과 생성된 흐리고 백색에 가까운 황색의 용액을 밤새 교반하였다. 그런 다음, 그 용액을 50% 염산을 이용하여 pH 3 내지 pH 7.5로 조정하고, 85℃로 가열하고, 2 시간동안 교반하였다. 그 용액을 실온으로 냉각하고, 40% NaOH를 이용하여 pH 12로 염기성으로 하고, 디클로로메탄(3 x 500 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 함수로 세척하고, 건조하 고(MgSO₄), 여과하고, 감압 하에서 농축하여 점성의 갈색 오일로서 조 표제 중간체를 생성시켰다.

메탄올(1000 mL) 중의 상기 조 중간체의 용액에 0℃의 디-t-부틸 디카보네이트(74.6 g, 0.342 mol)을 부가하였다. 상기 용액을 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 메탄올을 감압 하에서 제거하고, 그 결과 생성된 오일을 디클로로메탄(1000 mL) 중에 용해하였다. 중간체를 1 M H₃PO₄(1000 mL) 중에 추출하고, 디클로로메탄(3 x 250 mL)으로 세척하였다. 수층을 NaOH 수용액을 이용하여 pH 12로 염기성화 하고, 디클로로메탄(3 x 500 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고(MgSO₄), 여과하고, 감압 하에서 농축하여 점성의 밝은 갈색 오일로서 표준 중간체를 생성시켰다. ¹H-NMR(CDCl₃) δ(ppm) 7.5-7.2(m, 5H, C₆H₅), 3.7(s, 2H, CH₂Ph), 3.45(broad s, 2H, CH-NBn), 2.7-2.6(dd, 2H, CH₂CO), 2.2-2.1(dd, 2H, CH₂CO), 2.1-2.0(m, 2H, CH₂CH₂), 1.6(m, 2H, CH₂CH₂). (m/z): [M+H]⁺ 계산치 216.14; 실측치 216.0.

b. 3-옥소-8- 아자바이시클로[3.2.1]옥탄 -8- 카르복실산 t-부틸 에스테르의 제조

EtOAc(300 mL) 중의 8-벤질-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온(75 g, 0.348 mol)의 용액에 EtOAc(300 mL) 중의 디-t-부틸 디카보네이트(83.6 g, 0.383 mol, 1.1 eq)의 용액을 부가하였다. 그 결과 생성된 용액 및 린스(100 mL EtOAc)를 질소 증기 하에서 팔라듐 히드록사이드 23 g(물로 ~50% 적셔진 탄소 상의 건조 염기, Pd 20 중량%; 예를 들어 Pearlman's catalyst)을 함유하는 1 L Parr 수소화 용기에 부가하였다. 반응 용기에서 기체를 제거하고(진공 및 N₂ 교대로 5회), 60 psi H₂ 기체로 가압하였다. 그 반응 용액을 2 일간 교반하고, 규소 박막 크로마토그래피로 모니터링 시 반응이 완료될 때까지, H₂ 기압을 60 psi로 유지하기 위해 필요할 경우 H₂로 충전하였다. 그런 다음, 검정색의 용액을 Celite® 패드를 통해 여과하고 감압 하에서 농축하여 표제 중간체를 점성의 황색 내지 오렌지색 오일로서 정량적으로 생성시켰다. 그것을 그 다음 단계에서 추가적인 처리 없이 사용하였다. ¹H NMR (CDCl₃) δ(ppm) 4.5(broad, 2H, CH-NBoc), 2.7(broad, 2H, CH₂CO), 2.4-2.3(dd, 2H, CH₂CH₂), 2.1(broad m, 2H, CH₂CO), 1.7-1.6(dd, 2H, CH₂CH₂), 1.5(s, 9H, (CH₃)₃COCON)).

c. (1S,3R,5R)-3-아미노-8- 아자바이시클로[3.2.1]옥탄 -8- 카르복실산 t-부틸 에스테르의 제조

이전의 단계의 생성물(75.4 g, 0.335 mol)의 메탄올(1 L) 중의 용액에 포름산 암모늄(422.5 g, 6.7 mol), 물(115 mL), 및 활성화 탄소 상의 팔라듐(물로 ~50% 적셔진 건조 염기 상의 10%; Degussa type E101NE/W) 65 g을 기계적 교반기에 의해 교반하면서 N₂ 증기 하에서 부가하였다. 24 시간 및 48 시간 후에, 부가적인 일부의 암모늄 포르메이트(132 g, 2.1 mol)를 각각의 시간에 부가하였다. 분석 HPLC에의해 모니터링한 결과, 일단 반응 진행이 종료되면, 셀라니트®(>500 g)을 부가하고, 그 결과 생성된 진한 현탁액을 교반한 다음, 합한 고체를 메탄올(~500 mL)로 세척하였다. 여액을 합하고, 모든 메탄올이 제거될 때까지 감압 하에서 농축하였다. 그런 다음, 그 결과 생성된 흐린, 2 상의 용액을 1 M 인산으로 희석하여, 최종 부피가 pH 2에서 ~1.5 내지 2.0 L가 되도록 하고, 디클로로메탄(3 x 700 mL)으로 세척하였다. 수층을 40% NaOH 수용액을 이용하여 pH 12로 염기성으로 하고, 디클로로메탄(3 x 700 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO₄로 건조하고, 여과하고, 회전증발기에 의해 농축한 다음 고 진공으로 하여 통상적으로 N-Boc-endo-3-aminotropane으로 불리는 52 g(70%)의 표제 화합물을 백색 내지 연황색의 고체로서 생성시켰다. 생성물의 endo 내지 exo 아민의 이성질체 비율은 ¹H-NMR 분석에 기초하여 >99 였다(분석적 HPLC에 의해 순도 >96%). ¹H NMR (CDCl₃) δ(ppm) 4.2-4.0 (broad d, 2H, CHNBoc), 3.25 (t, 1H, CHNH₂), 2.1-2.05(m, 4H), 1.9(m, 2H), 1.4(s, 9H, (CH₃)₃OCON), 1.2-1.1 (broad, 2H). (m/z): [M+H]⁺ C₁₂H₂₂N₂O₂ 계산치 227.18; 실측치, 227.2. 분석적 HPLC (등용매 방법; 5 분에 걸쳐 2:98(A:B) 내지 90:10(A:B)): 체류 시간 = 2.14 분.

제조 2: 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산

우선, 아세톤(228.2 mL, 3.11 mol)을 실온에서 물(2 L) 중의 2-아미노페닐메탄올(255.2 g, 2.07 mol) 및 아세트산(3.56 mL, 62 mmol)의 교반 현탁액에 부가하였다. 4 시간 후에, 상기 현탁액을 0℃로 냉각하고, 추가로 2.5 시간동안 교반한 다음 여과하였다. 고체를 수집하고 물로 세척하고 그 젖어 있는 고체를 냉각하고 동결건조하여 회백색의 고체로서 2,2-디메틸-1,4-디하이드로-2H-벤조[1,3]옥사진(332.2 g, 98%)를 생성시켰다. ¹H NMR (CDCl₃; 300MHz): 1.48(s, 6H, C(CH₃)₂), 4.00(bs, IH, NH), 4.86(s, 2H, CH₂), 6.66(d, IH, ArH), 6.81(t, IH, ArH), 6.96(d, 1H, ArH), 7.10(t, 1H, ArH).

THF(1 L) 중의 2,2-디메틸-1,4-디하이드로-2H-벤조[1,3]옥사진(125 g, 0.77 mol) 용액을 2.5 시간에 걸쳐 신틸레이션 깔대기를 통해 여과한 다음, 부가 깔대기에 의해 0℃의 THF(800 mL) 중의 1.0M LiAlH₄의 교반용액에 적가하였다. 상기 반응을 서서히 조금씩 0℃에서 1.5 시간에 걸쳐 Na₂SO₄·10H₂O(110 g)를 적가함으로써 냉각시켰다. 그 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 여과한 다음, 고체의 염을 THF로 완전히 세척하였다. 여액을 감압 하에서 농축하여 2-이소프로필아미노페닐메탄올(120 g, 95%)을 황색의 오일로서 생성시켰다. ¹H NMR (CDCl₃; 300MHz): 1.24(d, 6H, CH(CH₃)₂), 3.15(bs, 1H, OH), 3.61(sept, 1H, CH(CH₃)₂), 4.57(s, 2H, CH₂), 6.59 (t, IH, ArH), 6.65(d, IH, ArH), 6.99(d, IH, ArH), 7.15(t, IH, ArH).

이산화마그네슘(85% 182.6 g, 1.79 mol)을 톨루엔(800 mL) 중의 2-이소프로필아미노페닐메탄올(118 g, 0.71 mol)의 교반용액에 부가하고, 그 반응 혼합물을 4 시간동안 117℃로 가열하였다. 그 반응 혼합물을 밤새 실온으로 냉각한 다음, 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 그것을 톨루엔으로 용리하였다. 여액을 감압 농축하여 오렌지색의 오일로서 2-이소프로필아미노벤즈알데히드를 생성시켰다(105 g, 90%). ¹H NMR (CDCl₃; 300MHz): 1.28(d, 6H, CH(CH₃)₂), 3.76(sept, 1H, CH(CH₃)₂), 6.65 (t, IH, ArH), 6.69(d, 1H, ArH), 7.37(d, 1H, ArH), 7.44(t, 1H, ArH), 9.79(s, IH, CHO).

통상적으로 Meldrum의 산이라고 불리는 2,2-디메틸-[1,3]디옥산-4,6-디온(166.9 g, 1.16 mol)을 0℃에서 메탄올(1 L) 중의 2-이소프로필아미노벤즈알데히드(105 g, 0.64 mol), 아세트산(73.6 mL, 1.29 mol), 및 에틸렌디아민(43.0 mL, 0.64 mol)의 교반용액에 부가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1 시간동안 교반한 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 그 결과 생성된 현탁액을 여과하고, 그 고체를 메탄올로 세척하고 수집하여 표제 중간체인 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산(146 g, 98%)을 회백색의 고체로서 생성시켰다. ¹H NMR (CDCl₃; 300MHz): 1.72(d, 6H, CH(CH₃)₂), 5.50(bs, 1H, CH(CH₃)₂), 7.44(t, 1H, ArH), 7.75- 7.77(m, 2H, ArH), 7.82(d, 1H, ArH), 8.89 (s, IH, CH).

실시예 1: 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-( 메탄술포닐 - 메틸 -아미노)프로필]-8- 아자 - 바이시 클로[ 3.2.1]옥트 -3-일}아미드의 합성

a. (1S,3R,5R)-3-[1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카보닐 )아미노]-8- 아자바이시클로[3.2.1]옥탄 -8- 카르복실산 t-부틸 에스테르의 제조

3 L 플라스크에, 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산(112.4 g, 0.486 mol, 1.1 eq)를 톨루엔(1 L) 중에 현탁하였다. 그 혼합물을 85℃로 가열하고 티오닐 클로라이드(86.74 g, 0.729 mol)를 70 분에 걸쳐 적가하였다. 그 혼합물을 교반하면서 1.5 시간동안 95℃에서 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다.

별도의 12 L 플라스크에, (1S,3R,5R)-3-아미노-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-8-카르복실산 t-부틸 에스테르(100.0 g, 0.442 mol, 1 eq)을 톨루엔(1 L) 중에 현탁하고 3 M NaOH(4 eq)를 부가하였다. 그 혼합물을 10 분동안 실온에서 교반한 다음, 약 5℃로 냉각하였다. 내부 온도를 10℃ 미만으로 유지하면서, 염산 용액을 40 분에 걸쳐 교반하면서 서서히 부가하였다. 그 혼합물을 30 분동안 3-5℃에서 교반하고, 층이 밤새 분리되도록 하였다. 톨루엔 층(~ 2.5 L)을 수집하고, 회전 증발에 의해서 약 1/2(~ 1.2L)로 농축하고, 직접 다음 단계에서 사용하였다.

b. 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산 {(1S,3R,5R)-8- 아자바이시클로[ 3.2.1]옥트 -3-일}아미드의 제조

이전의 단계에서 제조된 톨루엔 용액(~1.2L)에 20℃에서 20 분에 걸쳐 교반하면서 트리클로로아세트산(200 mL)을 부가하였다. 그 혼합물을 2 시간동안 20℃ 교반하였다. 물(1.55 L)을 부가하고, 그 혼합물을 20℃에서 30 분간 교반하였다. 30 분 후에, 상기 혼합물을 3 개의 층으로 분리하였다. 점성의 갈색 오일인 바닦층(~ 350 mL)은 조 중간체를 함유하였다.

MTBE(2.8 L)를 넣은 12 L 플라스크에, 교반하면서 1-2℃에서 1 시간에 걸쳐 조 갈색 오일을 부가하였다. 그 현탁액을 동일한 온도에서 1 시간동안 교반한 다음, 여과하였다. 여액을 MTBE(2 x 300 mL)로 세척하고 실온에서 4 일 동안 진공건조하여 표제 중간체인 트리플루오로아세테이트염(163.3 g)을 엷은 황색의 분말로서 생성시켰다.

c. N- 메틸 -N-[(S)-2- 옥시란 -2- 일메틸 ] 메탄술폰아미드의 제조

12 L 플라스크에 물(1 L)를 넣은 다음, NaOH(수중 50%, 146.81 g, 1.835 mol)을 부가하였다. NaOH를 함유하는 비이커를 물(2 x 500 mL)로 세척하고, 그 세척액을 상기 플라스크에 가하였다. 그 혼합물을 실온에서 10 분간 교반하고 ~8℃로 냉각하였다. 물(500 mL) 중의 (N-메틸)메탄술폰아미드(200.2 g, 1.835 mol)을 5 분에 걸쳐 부가하였다. 그 혼합물을 ~4℃에서 1 시간동안 교반하고, (S)-2-클로로메틸옥시란(339.6 g, 3.67 mol)을 가하였다. 그 혼합물을 3-4℃에서 20 시간동안 교반하였다. 디클로로메탄(2 L)를 부가하고 그 혼합물을 5-10℃에서 30 분간 교반하였다. 두 개의 층을 10 분에 걸쳐 분리되도록 하고 수집하였다. 유기 층(~2.5 L)을 12 L 플라스크에 다시 넣고, 1 M H₃PO₄(800 mL) 및 함수(800 mL)로 세척하였다. 디클로로메탄을 회전증발에 의해 제거하였다. 조 생성물에, 톨루엔(400 mL)를 부가하고 회전증발에 의해 제거하였다. 톨루엔 공정의 추가적인 3 개의 주기 후에, 표제 중간체를 획득하고(228.2 g), 다음 단계에서 추가의 정제과정 없이 사용하였다.

d. 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-( 메탄술포닐 - 메틸 -아미노)프로필]-8- 아자 - 바이시클로[3.2.1]옥 트-3-일}아미드의 합성

3 L 플라스크 중에서, 절대 에탄올(400 mL) 중에 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산{(1S,3R,5R)-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드 트리플루오로아세테이트(105.0 g, 0.232 mol)을 현탁시켰다. 이 현탁액에, 절대 에탄올(100 mL) 중에 용해된 NaOH(수중의 50%, 0.243 mol, 1.05 eq)를 실온에서 부가하였다. NaOH를 함유하는 비이커를 에탄올(2 x 50 mL)로 세척하고, 그 세척액을 상기 반응 혼합물에 부가하였다. 30 분간 교반한 다음, 절대 에탄올(100 mL) 중의 N-메틸-N-[(S)-2-옥시란-2-일메틸]메탄술폰아미드(62.0 g, 1.5 eq) 용액을 부가하였다. 그 혼합물을 2 시간동안 환류하고, 실온으로 냉각하고, 표제 화합물의 종자 결정을 부가하였다. 약 5 분간 교반한 후에, 백색의 고체가 형성되었다. 그 혼합물을 3-5℃로 냉각하고 2 시간 동안 교반하였다. 백색의 고체를 여과하고, 젖은 케이크를 차가운 절대 에탄올(3 x 50 mL)로 세척하였다. 그 고체를 30 ℃에서 60 시간동안 진공건조하여 표제 화합물을 생성시켰다(93.8 g, Karl Fischer 방법에 의한 수분 함량 2.03%). ¹H NMR (CDCl₃) δ ppm 10.52 (d, IH), 8.83(s, IH), 7.75(d, 2H), 7.64-7.60(m, 2H), 7.28-7.26(m, 1H), 4.33-4.26(m, 2H), 3.78-3.75(m, 1H), 3.27-3.20(m, 4H), 3.01(s, 3H), 2.88(s, 3H), 2.58-2.53(m, 1H), 2.30-1.81(m, 11H), 1.68 (d, 6H).

상기 종자 결정은 더 작은 스케일로 이 실시예의 방법에 의해 표제 화합물의 이전의 제조로부터 획득하였으며, 여기에서 결정화는 동시에 일어났다.

실시예 2: 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-( 메탄술포닐 - 메틸 -아미노)프로필]-8- 아자 - 바이시 클로[ 3.2.1]옥트 -3-일}아미드의 결정성 염산염의 합성

1 L 플라스크에, 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드(34.7 g, 0.069 mol)을 절대 에탄올(210 mL) 중에 현탁시켰다. 진한 HCl(1.1 eq)를 실온에서 교반하면서 부가하였다. 그 혼합물을 30 분간 환류 교반하고 실온으로 냉각하고 2 시간동안 교반하였다. 그 고체를 여과하고, 젖은 케이크를 차가운 절대 에탄올(3 x 50 mL)로 세척하였다. 그 고체를 30℃에서 48 시간동안 진공건조하여 표제 화합물을 생성시켰다(34.5 g, 93.7% 수율, Karl Fischer 법에 의한 수분 함량 0.13%).

실시예 3: 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-( 메탄술포닐 - 메틸 -아미노)프로필]-8- 아자 - 바이시 클로[ 3.2.1]옥트 -3-일}아미드의 염산염의 결정성 수화물의 합성

1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드 하이드로클로라이드(139 mg, 0.28 mol)을 멸균 주사용수(2 mL) 중에 용해하였다. 수 시간 후에, 그 용액은 흐린 현탁액이 되었다. 그 현탁액을 교반하고 주위 온도에서 밤새 정치하여 백색의 침전물을 생성시켰다. 그 고체를 여과에 의해 수집하고, 2 분간 주위 조건(약 40-50% 상대습도)에서 건조하여 표제 화합물(130 mg, 91% 수율)을 생성시켰다.

실시예 4-9: 본 발명의 염 형태의 특성

실시예 2에서 제조된 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드(화학식 I의 화합물)의 결정성 염산염의 샘플 및 실시예 3에서 제조된 화학식 I의 화합물의 염산염의 결정성 수화물의 샘플을 분말 X-선 회절(PXRD), 시차주사열랑법(DSC), 열중량분석(TGA), 적외선 분광분석법(IR) 및 원소분석법에 의해 분석하였다.

실시예 4: 분말 X-선 회절

분말 X-선 회절 패턴을 Si(Li) 고체상 검출기로 1.542Å(45 kV, 40 mA)에서 Cu Kα 조사를 이용하여, Thermo ARL X-선 회절기 모델 XTRA(Thermo ARL SA, 스위스)로 획득하였다. 분석은 전형적으로 2θ 각도에서 2°내지 35°범위에 걸쳐 포인트당 0.03° 스텝 사이즈를 가지고 2°/분의 스캔 속도로 수행하였다. 샘플은 그대로 또는 미세한 분말로 분쇄하여, 기구의 상부에 로딩하는 분석용 샘플 컵에 맞춰지도록 디자인된 관용되는 작은 부피의 인서트에 부드럽게 채웠다. ±0.02° 2θ 각도 이내로의 기구 캘리브레이션은 규소 금속 표준물질과 비교하여 매주 확인하였다. 본 발명의 결정성 염산염의 샘플 및 염산염의 결정성 수화물의 샘플에 대한 대표적인 PXRD 패턴을 도 1 및 4에 각각 나타내었다.

실시예 5: 열분석

시차주사열량법(DSC)를 TA Instrument Model Q-100 모듈을 이용하여 수행하였다. 데이터를 수집하고 Q Series^TM 소프트웨어용 TA Instrument Thermal Advantage를 이용하여 분석하였다. 약 1-10 mg의 샘플을 정확하게 칭량하여 뚜껑 달린 알루미늄 팬에 두었다. 상기 샘플을 5℃ 내지 전형적으로 265℃ 범위에서 10℃/분의 선형 가열 램프를 이용하여 평가하였다. 사용하는 동안 DSC 셀에 건조 질소를 퍼징하였다. 화학식 I의 화합물의 결정성 염산염 샘플 및 화학식 I의 화합물의 염산염의 결정성 수화물의 대표적인 DSC 기록을 각각 도 2 및 도5에 나타내었 다.

열중량 분석(TGA)를 TA Instrument Model Q-500 모듈을 이용하여 수행하였다. 데이터를 Q Series^TM 소프트웨어용 TA Instruments Thermal Advantage를 이용하여 수집하고 분석하였다. 약 1-5 mg 중량의 샘플을 백금 받침대(cradle) 상의 알루미늄 팬에 두고, 10℃/분의 선형 가열 속도로 주위 온도로부터 300℃까지 스캔하였다. 저울 및 가열로 챔버(furnace chamber)를 사용하는 동안 질소로 퍼징하였다. 화학식 I의 화합물의 결정성 염산염 샘플 및 화학식 I의 화합물의 염산염의 결정성 수화물의 대표적인 TGA 기록을 각각 도 2 및 도 5에 나타내었다.

도 2에서의 DSC 기록은 본 발명의 염산염이 약 230℃ 내지 약 260℃ 범위에서 흡열 열 흐름에 있어서 최대로 탁월한 열 안정성을 가지며, 약 225℃ 미만에서는 유의적인 열적 이벤트를 나타내지 않는다는 것을 입증해 준다. DSC 및 TGA 기록의 비교는 본 발명의 염산염이 약 230℃ 초과의 온도에서 동시에 용융 및 분해가 이루어진다는 것을 나타낸다.

본 발명의 수화물 형태에 대한 도 5에서의 DSC 기록은 약 225℃ 내지 약 250℃ 범위에서 결정의 용융으로 확인되는 흡열 열 흐름에 있어서의 실질적인 피크를 나타내며, 더 낮은 온도에서는 넓거나 약한 흡열을 나타낸다. DSC 및 TGA 기록의 비교는 수화물 결정형의 분해가 용융 전이의 온도에서 유의적이지 않다는 것을 나타낸다.

실시예 6: 동역학적 수분 흡착 평가

동역학적 수분 흡착(DMS) 평가를 VTI 대기 미량천칭, SGA-100 시스템(VTI Corp., Hialeah, FL 33016)을 이용하여 25℃에서 수행하였다. 약 5-10 mg의 샘플 사이즈를 이용하고 습도를 분석 개시 시의 주위 값으로 세팅하였다. 전형적인 DMS 평가는 세 개의 스캔으로 구성되었다: 5% RH/단계의 스캔 속도로 주위 내지 2% 상대습도(RH), 2% RH 내지 90% RH, 90% RH 내지 5% RH). 중량을 2 분마다 측정하고, 샘플의 중량이 5 개의 연속적인 포인트에서 0.02% 이내에서 안정할 때, RH를 다음 값(±5% RH)으로 변경시켰다. 화학식 I의 화합물의 결정성 염산염 샘플 및 화학식 I의 화합물의 염산염의 결정성 수화물의 대표적인 DMS 기록을 각각 도 3 및 도 6에 나타내었다.

상기 염산염은 2% 내지 90% RH의 범위 전체에서 0.2% 보다 작은 중량변화를 갖는 가역적인 흡착/탈착 프로파일을 나타내었다. 상기 수화물 형태는 샘플을 주위습도로부터 2% RH에서 건조 시 약 2.3%의 중량 손실을 갖고, 건조된 견본을 2% RH에서 40% RH로 노출 시 다시 회복되는 가역적인 흡착/탈착 프로파일을 나타내었다. 상기 수화물 형태는 40% RH 내지 75% RH 범위에서 0.25%보다 낮은 중량 증가를 가졌다.

실시예 7: 적외선 분석

적외선(IR) 흡광 스펙트럼을 Nicolet 감쇠전반사(ATR) 샘플 홀더가 구비된 Avatar 360 FT-IR 분광분석기를 이용하여 4000 내지 675 cm^-1의 진동수 범위에서 결정하였다. 본 발명의 결정성 염산염의 샘플의 대표적인 IR 흡광 스펙트럼은 758±l, 783±1, 795±1, 802±l, 949±1, 981-fcl, 1149±1, 1158±1, 1217±1, 1332±1, 1377±1, 1453±1, 1467±1, 1487±1, 1525±1, 1566±1, 1575±1, 1615±1, 1672±1, 및 3197±1 cm^-1에서 유의적인 흡광 밴드를 가졌다.

실시예 8: 고체 상태 안정성 평가

본 발명의 염산염 샘플을 40℃ 및 75% RH에서 다중 개방 유리 바이얼에 저장하였다. 특정 간격에서, 화학적 순도에 대해 대표적인 바이얼의 내용물을 취하여 DSC, TGA, PXRD, 및 HPLC에 의해 제거하고 분석하였다. 24 주간의 저장 후에, DSC 또는 TGA 열분석도 및 PXRD 패턴에 있어서 어디에서도 감지할만한 변화가 감지되지 않았다. 상기 저장된 샘플의 화학적 순도는 99.6% 였다.

실시예 9: 상대이온 몰비의 결정

염산(HA)의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드(화학식 I의 화합물)에 대한 상대이온 몰비를 하기 식에 따라 계산하였다.

상대이온 비율 = (W_HA/MW_HA)/(W_I/MW_I)

상기 식에서, W_HA는 샘플에서의 HCl의 중량%이고, MW_HA는 HCl의 분자량이고, MW_I는 화학식 I의 화합물의 분자량(504.6 amu)이고, W_I는 하기 식에 따라 계산되는 샘플에서의 화학식 I의 화합물의 중량% 이다:

W_I = 100 - W_HX - W_H2O - W_RS

화학식 I의 화합물은 불순물을 가지고 있지 않다는 조건 하에서, 상기 W_H2O 는 물 함량의 중량%이고, W_RS 는 잔여 용매의 중량% 이다.

본 발명의 결정성 염산염 샘플에서의 염산의 화학식 I의 화합물에 대한 몰비는 HCl의 중량%(W_HA) 6.3% 및 W_H2O= 0.26% 및 W_RS = 0.47%를 이용하여 0.94:1로 계산되었다. HCl 함량은 질산은 표준 용액으로 적정함으로써 결정하였으며, 물 함량 W_H2O는 전기량 Karl Fisher 적정에 의해 결정하고, 잔여 용매량 W_RS는 기체 크로마토그래피로 결정하였다.

비교예 1: 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-( 메탄술포닐 - 메틸 -아미노)프로필]-8- 아자 - 바이시 클로[ 3.2.1]옥트 -3-일}아미드의 시트르산염의 합성

1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드(0.1 g, 0.2 mmol)을 에탄올(1 mL) 중에 현탁시켰다. 이 현탁액에 에탄올 중의 시트르산 1M 용액(0.072 mL, 0.072 mmol, 0.33 eq)을 부가하였다. 상기 혼합물을 투명해질 때까지 간단하게 초음파 처리하고, 캡을 씌운 다음, 밤새 정치하였다. 그런 다음, 캡을 제거하고 그 혼합물을 고체가 관찰될 때까지 주위 온도 하에서 증발시켰다. 그런 다음, 그 혼합물을 캡을 다시 씌우고 72 시간동안 정치시켰다. 그 결과 생성된 고체를 여과하고 차가운 에탄올로 세척하여 표제 화합물을 고체로서 생성시켰다(74.3 mg).

비교예 2: 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-( 메탄술포닐 - 메틸 -아미노)프로필]-8- 아자 - 바이시 클로[ 3.2.1]옥트 -3-일}아미드의 산 염의 합성

상기 비교예 1의 방법에 따라, 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 하기와 같은 산과의 염을, 표시한 당량의 산을 이용하여 고체 형태로 제조하였다(두 번째 괄호는 생성물 중량): 아디프산(0.5 eq)(48.5 mg); 인산(0.5 eq)(86.6 mg); 황산(0.5 eq)(27.0 mg); 타르타르산 (0.5 eq)(66.3 mg); 말산(0.5 eq)(25.3 mg); 및 브롬산(1 eq)(62.9 mg).

비교예 3: 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-( 메탄술포닐 - 메틸 -아미노)프로필]-8- 아자 - 바이시 클로[ 3.2.1]옥트 -3-일}아미드의 메탄술폰산 염의 합성

50% 아세토니트릴/물(1 mL) 중의 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드(0.1 g, 0.2 mmol)의 용액에 에탄올 중의 메탄술폰산 1 M 용액(0.2 mL, 0.2 mmol, 1 eq)을 부가하였다. 그런 다음, 그 혼합물을 밤새 냉동시키고 동결건조하였다. 그 결과 생성된 고체는 서서히 가온하면서 이소프로판올(1 mL) 중에 용해한 다음, 냉각시켰다. 그 결과 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고 차가운 이소프로판올로 세척하여 표제 화합물을 고체(90 mg)로서 생성시켰다.

비교예 4: 1-이소프로필-2-옥소-1,2- 디하이드로퀴놀린 -3- 카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-( 메탄술포닐 - 메틸 -아미노)프로필]-8- 아자 - 바이시 클로[ 3.2.1]옥트 -3-일}아미드의 산 염의 합성

상기 비교예 3의 방법에 따라, 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 하기와 같은 산과의 염을, 표시한 당량의 산을 이용하여 고체 형태로 제조하였다(두 번째 괄호는 생성물 중량): 푸마르산(1 eq)(107.2 mg); 벤조산(1 eq)(105.2 mg); 및 (R)-만델산(1 eq)(96.1 mg).

비교예 5: 비교예 1-4의 화합물의 특성

비교예 1-4의 화학식 I의 화합물의 결정성 산염을 PXRD, DSC, 및 TGA에 의해 분석하였다. 모든 경우에서, 중량 소실이 TGA에 의해 약 100℃ 미만의 온도에서 관찰되었으며, 이는 대부분 용매의 소실에 의한 것으로 보여진다. PXRD에 의한 결정형의 확인과 함께, 용매 소실에 기인한 저온의 특징을 제외한 DSC에서 흡열 열 흐름이 관찰되는 온도를 표 1에 요약하였으며, 산 염을 제조하기 위해 이용되는 산의 당량의 수로 화학양론을 나타내었다.

어세이 1: 5- HT ₄ _(c) 인간 수용체 상의 방사성 리간드 결합 어세이

a. 멤브레인 제조물 5- HT ₄ _(c)

인간 5-HT₄ _(c) 수용체 cDNA로 안정적으로 트랜스펙션된 HEK-293(인간 배아 신장) 세포([³H]-GR113808 멤브레인 방사성 리간드 결합 어세이를 이용하여 결정 시 Bmax = ~ 6.0 pmol/mg 단백질)를 T-225 플라스크에서 10% 우태아혈청(FBS)(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#10437), 2 mM L-글루타민 및 (100 유닛) 페니실린-(100 ㎍) 스트렙토마이신/mL(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#15140)이 보충되고 4,500 mg/L D-글루코오스 및 피리독신 염산(GIBCO-Invitrogen Corp., Carlsbad CA: Cat#11965)을 함유하는 Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM) 중에서 37℃에서 5% CO₂, 가습 배양기에서 증식시켰다. 세포를 800 ㎍/mL 제네티신(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#10131)을 상기 배지에 부가하여 연속적인 선택 압력 하에서 증식시켰다.

세포를 약 60-80% 컨플루언시로 증식시켰다(< 35 계대배양 패시지). 채취 전 20-22 시간에, 세포를 2회 세척하고, 혈청이 없는 DMEM을 공급하였다. 멤브레인 제조의 모든 단계를 얼음 상에서 수행하였다. 모든 세포 단일층을 부드러운 기계적 교반에 의해 들어 올리고, 25 mL 피펫으로 분쇄하였다. 세포를 1000 rpm(5분)에서의 원심분리에 의해 수집하였다.

멤브레인 제조를 위해, 세포 펠렛을 얼음처럼 차가운 pH 7.4(멤브레인 제조 완충액)의 50 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)(30-40 T225 플라스크로부터의 40 mL/총세포 수율)에 재현탁 하고, 얼음 상에서 폴리트론 분쇄기(19, 2 x 10 s로 세팅)를 이용하여 균질화하였다. 그 결과 생성된 균질물을 4℃에서 5 분간 1200 g로 원심분리하였다. 상기 펠렛을 버리고 상청액을 40,000 g(20 분)로 원심분리하였다. 상기 펠렛을 멤브레인 제조 완충액으로 재현탁하고 40,000 g(20 분)으로 원심분리하여 1 회 세척하였다. 상기 최종 펠렛을 50 mM HEPES, pH 7.4(어세이 완충액)(당량 1T225 플라스크/1 mL) 중에 재현탁하였다. 멤브레인 현탁액 중의 단백질 농도를 Bradford 방법(Bradford, 1976)에 의해 결정하였다. 멤브레인을 -80℃에서 분액으로(in aliquots) 냉동건조하였다.

b. 방사성 리간드 결합 어세이

방사성 리간드 결합 어세이를 0.025% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 pH 7.4의 50 mM HEPES 중에서 2 ㎍ 멤브레인 단백질을 함유하는 400 ㎕의 총 어세이 부피에서 총 1.1 mL 96- 딥 웰 폴리프로필렌 어세이 플레이트(Axygen)에서 수행하였다. 상기 방사성 리간드의 K_d 값의 결정을 위한 포화 결합 연구를 0.001 nM - 5.0 nM 범위의 8-12 개의 서로 다른 농도에서 [³H]-GR113808(Amersham Inc., Bucks, UK: Cat #TRK944; 특이적 활성 ~82 Ci/mmol)을 이용하여 수행하였다.

시험 화합물을 DMSO 중의 10 mM 스탁 용액으로서 입수하고, 25℃에서 pH 7.4의 50 mM HEPES로 400 μM로 희석한 다음, 동일한 완충액으로 계열희석(1:5) 하였다. 1 μM의 라벨링되지 않은 GR113808의 존재 하에서 비특이적 결합을 결정하였다. 어세이를 실온에서 60 분간 배양한 다음, 결합 반응을 0.3% 폴리에틸렌이민 중에 담그어진 96-웰 GF/B 유리 섬유 필터 플레이트(Packard BioScience Co., Meriden, CT)를 통한 신속한 여과에 의해 종결시켰다. 필터 플레이트를 여과 완충액(얼음처럼 차가운 50 mM HEPES, pH 7.4)으로 3 회 세척하여, 비결합 방사능을 제거하였다. 플레이트를 건조하고, 35 ㎕ Microscint-20 액상 신틸레이션액(Packard BioScience Co., Meriden, CT)을 각각의 웰에 부가하고, 플레이트를 Packard Topcount 액상 신틸레이션 계수기(Packard BioScience Co., Meriden, CT)에서 계수하였다.

결합 데이터를 일 지점 경쟁 3-파라미터 모델을 이용하는 GraphPad Prism Software 팩키지(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)로 비선형 회귀 분석법에 의해 분석하였다. BOTTOM(곡선 최소값)을 비특이적 결합 값으로 고정하였으며, 1 μM GR113808의 존재 하에서 결정하였다. 시험 화합물의 K_i 값을 베스트-핏 IC₅₀ 값 및 방사성 리간드의 K_d 값으로부터, Cheng-Prusoff 식(Cheng and Prusoff, Biochemical Pharmacology, 1973, 22, 3099-108): K_i = IC₅₀/(1+[L]K_d) (상기 식에서 [L] = [³H]-GR113808의 농도)을 이용하여 Prism 에서 계산하였다. 결과를 Ki 값, pKi의 음성 십진 로그값(negative decadic logarithm)으로서 나타내었다.

이러한 어세이에서 더 높은 pK_i 값을 갖는 시험 화합물은 5-HT₄ 수용체에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 화학식 I의 화합물은 이러한 어세이에서 약 7.5보다 더 큰 pK_i 값을 가졌다.

어세이 2: 5- HT _3A 인간 수용체에 대한 방사성 리간드 결합 어세이 :

수용체 서브타입 선택성의 결정

a. 멤브레인 제조물 5- HT _3A

인간 5-HT_3A 수용체 cDNA로 안정적으로 트랜스펙션된 HEK-293(인간 배아 신장) 세포를 Dr. Michael Bruess(University of Bonn, GDR)로부터 획득하였다([³H]-GR65630 멤브레인 방사성 리간드 결합 어세이를 이용하여 결정 시 Bmax = ~ 9.0 pmol/mg 단백질). 세포를 T-225 플라스크 또는 세포 공장(cell factories)에서 10% 열 불활성화 우태아혈청(FBS)(Hyclone, Logan, UT: Cat#SH30070.03) 및 (50 유닛) 페니실린-(50 ㎍) 스트렙토마이신/mL(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#15140)이 보충된 Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM)(GIBCO-Invitrogen Corp., Carlsbad, CA: Cat#11965) 및 50% Ham's F12(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#11765) 중에서 37℃에서 5% CO₂, 가습 배양기에서 증식시켰다. 세포를 800 ㎍/mL 제네티신(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#10131)을 상기 배지에 부가하여 연속적인 선택 압력 하에서 증식시켰다.

세포를 약 70-80% 컨플루언시로 증식시켰다(< 35 계대배양 패시지). 멤브레인 제조의 모든 단계를 얼음 상에서 수행하였다. 세포를 채취하기 위해, 배지를 빨아내고 세포를 Ca² ⁺, Mg² ⁺-결여 Dulbecco's 인산 완충 식염수(dPBS)로 세척하였다. 세포 단일층을 부드러운 기계적 교반에 의해 들어 올렸다. 세포를 원심분리에 의해 1000 rpm(5분)으로 수집하였다. 막 제조를 위한 이후의 단계는 5-HT₄ _(c) 수용체를 발현하는 막에 대해 상기 기재된 프로토콜을 따랐다.

b. 방사성 리간드 결합 어세이

방사성 리간드 결합 어세이를 0.025% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 pH 7.4의 50 mM HEPES 중에서 1.5-2 ㎍ 멤브레인 단백질을 함유하는 200 ㎕의 총 어세이 부피에서 96-웰 폴리프로필렌 어세이 플레이트에서 수행하였다. 상기 방사성 리간드의 K_d 값의 결정을 위한 포화 결합 연구를 0.005 nM - 20 nM 범위의 12 개의 서로 다른 농도에서 [³H]-GR65630(PerkinElmer Life Science Inc., Boston, MA: Cat #NET1011, 특이적 활성 ~85 Ci/mmol)을 이용하여 수행하였다. 화합물의 pK_i 값의 결정을 위한 치환 어세이를 0.050 nM의 [³H]-GR65630 및 10 pM 내지 100 μM 범위의 12 개의 서로 다른 화합물 농도로 수행하였다. 화합물을 DMSO 중의 10 mM 스탁 용액으로서 입수하고(섹션 3.1 참조), 25℃에서 0.1% BSA를 함유하는 pH 7.4의 50 mM HEPES로 400 μM로 희석한 다음, 동일한 완충액으로 계열희석(1:5) 하였다. 10 μM의 라벨링되지 않은 MDL72222의 존재 하에서 비특이적 결합을 결정하였다. 어세이를 실온에서 60 분간 배양한 다음, 결합 반응을 0.3% 폴리에틸렌이민 중에 담그어진 96-웰 GF/B 유리 섬유 필터 플레이트(Packard BioScience Co., Meriden, CT)를 통한 신속한 여과에 의해 종결시켰다. 필터 플레이트를 여과 완충액(얼음처럼 차가운 50 mM HEPES, pH 7.4)으로 3 회 세척하여, 비결합 방사능을 제거하였다. 플레이트를 건조하고, 35 ㎕ Microscint-20 액상 신틸레이션액(Packard BioScience Co., Meriden, CT)을 각각의 웰에 부가하고, 플레이트를 Packard Topcount 액상 신틸레이션 계수기(Packard BioScience Co., Meriden, CT)에서 계수하였다.

K_i 값을 결정하기 위해 상기 기재된 비선형 회귀 분석법을 이용하여 결합데이터를 분석하였다. BOTTOM(곡선 최소값)을 비특이적 결합 값으로 고정하였으며, 10 μM MDL72222의 존재 하에서 결정하였다. Cheng-Prusoff 식에서 양 [L]을 [³H]-GR65630으로 한정하였다.

5-HT₃ 수용체 서브타입에 대한 5-HT₄ 수용체 서브타입의 선택성을 K_i(5-HT_3A)/K_i(5-HT_4(c))의 비율로서 계산하였다. 화학식 I의 화합물은 이러한 어세이에서 약 1000보다 더 큰 5-HT₄/5-HT₃ 수용체 서브타입 선택성을 가졌다.

어세이 3: 인간 5- HT ₄ _(c) 수용체를 발현하는 HEK -293 세포를 이용한 전세포( whole - cell ) cAMP 축적 플래쉬플레이트 어세이

이 어세이에서는, 시험 화합물의 기능적 효능을, 5-HT₄ 수용체를 발현하는 HEK-293 세포를 서로 다른 농도의 시험 화합물과 접촉 시 생성된 cAMP의 양을 측정함으로써 결정하였다.

a. 세포 배양

클론된 인간 5-HT₄ _(c) 수용체 cDNA로 안정적으로 트랜스펙션되어, 서로 다른 두 가지의 밀도:(1) [³H]-GR113808 멤브레인 방사성리간드 결합 어세이를 이용하여 결정 시 약 0.5-0.6 pmol/mg 단백질의 밀도, 및 (2) 약 6.0 pmol/mg 단백질의 밀도로 상기 수용체를 발현하는 HEK-293(인간 배아 신장) 세포를 제조하였다. 상기 세포를 T-225 플라스크에서 10% 우태아혈청(FBS)(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#10437) 및 (100 유닛) 페니실린-(100 ㎍) 스트렙토마이신/mL(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#15140)이 보충된 4,500 mg/L D-글루코오스(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#11965)를 함유하는 Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM) 중에서 37℃에서 5% CO₂, 가습 배양기에서 증식시켰다. 세포를 제네티신(800 ㎍/mL: GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#10131)을 상기 배지에 부가하여 연속적인 선택 압력 하에서 증식시켰다.

b. 세포 제조

세포를 약 60-80% 컨플루언시로 증식시켰다. 어세이 전 20-22 시간에, 세포를 2회 세척하고, 4,500 mg/L D-글루코오스(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat#11965)를 함유하는 혈청이 없는 DMEM을 공급하였다. 세포를 채취하기 위해, 상기 배지를 빨아내고 10 mL Versene(GIBCO-Invitrogen Corp.: Cat #15040)을 각각의 T-225 플라스크에 부가하였다. 세포를 RT에서 5 분간 배양한 다음, 기계적 교반에 의해 플라스크로부터 벗겨냈다. 세포 현탁액을 동일한 부피의 예열된(37℃) dPBS를 함유하는 원심분리기 튜브로 옮기고, 1000 rpm에서 5 분간 원심분리 하였다. 상청액을 버린 다음, 펠렛을 예열된(37℃) 자극 완충액(2-3 T-225 플라스크 당 10 mL 당량)에 재현탁하였다. 이 시간을 주시하여 시간 0으로 표시하였다. 상기 세포를 Coulter 계수기로 계수하였다(8 ㎛ 초과로 계수, 플라스크 수율은 1-2 x 10⁷ 세포/플라스크 였다). 세포를 예열된(37℃) 자극 완충액(플래쉬 플레이트 키트에 제공) 중에서 5 x 10⁵ 세포/mL의 농도로 재현탁하고, 37℃에서 10 분간 예비배양 하였다.

cAMP 어세이를 제조사의 지시사항에 따라 ¹²⁵I-cAMP(SMP004B, PerkinElmer Life Sceinces Inc., Boston, MA)로 Flashplate Adenylyl Cyclase Activation Assay System을 이용하여 방사성 면역 어세이 포맷에서 수행하였다.

세포를 증식시키고 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 어세이에서 최종 세포 농도는 25 x 10³ 세포/웰이었으며, 최종 어세이 부피는 100 ㎕ 였다. 시험 화합물을 DMSO 중의 10 mM 스탁 용액으로서 입수하고, 25℃에서 0.1% BSA를 함유하는 pH 7.4의 50 mM HEPES로 400 μM로 희석한 다음, 동일한 완충액으로 계열희석(1:5) 하였다. cAMP 축적 어세이를 10 pM 내지 100 μM(최종 어세이 농도) 범위의 11 개의 서로 다른 화합물의 농도로 수행하였다. 5-TH 농도-반응 곡선(10 pM 내지 100 μM)은 모든 플레이트 상에 포함되었다. 세포를 37℃에서 15 분간 진탕 배양하고, 반응을 각각의 웰에 100 ㎕의 얼음으로 차가워진 검출 완충액(플래쉬 플레이트 키트에 제공)의 부가에 의해 종결시켰다. 상기 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 배양하였다. 결합된 방사능을 Topcount(Packard BioSceince Co., Meriden, CT)를 이용하여 신틸레이션 근접 분광분석법(scintillation proximity spectroscopy)에 의해 정량하였다.

반응액 mL 당 생성된 cAMP의 양을 제조사의 사용자 매뉴얼에 제공된 지시사항에 따라 cAMP 표준 곡선으로부터 외삽하였다. 데이터를 3-파라미터 S자형 용량-반응 모델(억지로 단일화된 경사, slope constrained unity)을 이용하여 GraphPad Prism Software 팩키지로 비선형 회귀 분석법에 의해 분석하였다. 효능 데이터를 EC₅₀ 값의 음성 십진 로그값(negative decadic logarithm) pEC₅₀ 값으로서 보고하였으며, 상기 EC₅₀은 최대 반응의 50%를 나타내는데 효과적인 농도이다.

이러한 어세이에서 더 높은 pEC₅₀ 값을 나타내는 시험 화합물은 5-HT₄ 수용체를 촉진하는데 더 높은 효능을 갖는다. 약 0.5-0.6 pmol/mg 단백질의 밀도를 갖는 세포주(1)에서 이러한 어세이에서 시험한 화학식 I의 화합물은 약 7.5 보다 큰 pEC₅₀ 값을 가졌다.

어세이 4: hERG 심장 칼륨 채널을 발현하는 전세포에서 칼륨 이온 전류 억제의 in vitro 전압 클램프 어세이

hERG cDNA로 안정적으로 트랜스펙션된 CHO-K1 세포를 Wisconsin 대학의 Gail Robertson으로부터 획득하였다. 세포를 필요할 때까지 저온저장 상태로 두었다. 세포를 증량시키고(expanded), 10% 우태아혈청 및 200 ㎍/mL 제네티신이 보강된 Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM)/F12 중에서 배양하였다. 세포를 분리된 세포가 전세포 전압-클램프 연구에 선택될 수 있도록 하는 밀도로 35 mm² 접시(2 mL 배지 함유)에 폴리-D-라이신(100 ㎍/mL)이 코팅된 유리 커버슬립 상에 접종하였다. 상기 세포를 37℃에서 가습된 5% CO₂ 환경에서 유지하였다.

세포외 용액을 7 일 이상 제조하고, 사용하지 않을 때에는 4℃에서 보관하였다. 세포외 용액은 (mM): NaCl(137), KCl(4), CaCl₂(1.8), MgCl₂(1), 글루코오스(10), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)(10)를 함유하였으며, NaOH로 pH 7.4로 하였다. 시험 화합물의 존재 또는 부존재 하에서의 세포외 용액은 저장소(reservior)에 담았으며, 그로부터 약 0.5 mL/분의 속도로 기록 챔버에 흐르도록 하였다. 세포내 용액을 제조하고, 분액하고, 사용하는 날까지 -20℃에서 저장하였다. 세포내 용액은 (mM):KCl(130), MgCl₂(1), 에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르) N,N,N'N'-테트라아세트산염(EGTA)(5), MgATP(5), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)(10)를 함유하였고, KOH로 pH 7.2로 하였다. 모든 실험을 실온(20-22℃)에서 수행하였다.

세포를 접종한 커버슬립을 기록 챔버로 옮기고 계속적으로 넘치도록 하였다. 세포 및 팻치 전극 사이에 기가홈 실(gigaohm seal)이 형성되었다. 일단 안정한 팻치가 얻어지면, 개시 유지 전압을 -80mV로 하여 전압 클램프 모드에 기록이 개시되었다. 안정한 전세포(whole-cell) 전류가 얻어진 다음에는, 세포를 시험 화합물에 노출시켰다. 표준 전압 프로토콜은 유지 전압을 4.8초 동안 -80 mV 내지 +20 mV의 단계로 하고, 5 초동안 -50 mV로 재분극한 다음, 원래의 유지 전압(-80 mV)으로 복귀시켰다. 이러한 전압 프로토콜을 15 초마다 한 번씩(0.067 Hz) 구동시켰다. 재분극 상(phase) 동안 최고 전류 진폭을 pClamp 소프트웨어를 이용하여 결정하였다. 3 μM 농도의 시험 화합물을 5 분동안 세포에 관류한(perfuse) 다음, 화합물이 존재하지 않는 5-분 워시 아웃(wash-out) 기간을 갖도록 하였다. 최종적으로 양의 대조군(시사프라이드, 20 nM)을 세포의 기능을 시험하기 위해 관류 통과액에 부가하였다. -80 mV 내지 +20 mV의 단계는 hERG 채널을 활성화하고, 그 결과 외부의 전류를 유발하였다. 채널이 불활성화로부터 회복하고 비활성화될 때, -50 mV로 되돌리는 단계는 외부의 테일 전류를 유발한다.

재분극상 동안 최고 전류 진폭을 pCLAMP 소프트웨어를 이용하여 결정하였다. 대조군 및 시험 물건 데이터를 Origin®(OriginLab Corp., Northampton MA)로 보내고, 거기에서 개별적인 전류 진폭을 시험 화합물의 부재 하에서의 개시 전류 진폭으로 정규화하였다. 각각의 조건의 정규화된 전류 수단 및 표준 오차를 계산하고 실험 시간 경과에 대해 도시하였다.

시험 물건 또는 매질 대조군(대개 0.3% DMSO) 중 하나에 5 분간 노출한 후 관찰되는 K⁺ 전류 억제 간에 비교를 수행하였다. 실험 그룹들 간의 통계학적 비교를 두 개의 집단, 독립적인 t-테스트(Microcal Origin v. 6.0)을 이용하여 수행하였다. 차이는 p < 0.05에서 유의적인 것으로 인정되었다.

이러한 어세이에서 칼륨 이온 전류의 퍼센트 억제가 더 작을수록, 치료제로서 사용될 때, 심장 재분극의 패턴을 변화시키는 시험 화합물의 전압이 더 작다. 화학식 I의 화합물은 이러한 어세이에서 3 μM의 농도로 시험하였으며, 약 15% 미만의 칼륨 이온 전류의 억제를 나타내었다.

어세이 5: 경구 생체이용율의 in vitro 모델: Caco -2 투과 어세이

경구 투여 후에 소장을 통해 통과하여 혈류로 들어가는 시험 화합물의 능력을 설계하기 위해, Coco-2 투과 어세이를 수행하였다. 용액에서 시험 화합물이, 인간의 소장 단일층을 흉내내도록 설계된 세포 단일층을 통과하는 속도를 결정하였다.

Caco-2(대장, 샘암종; 인간) 세포를 ATCC(American Type Culture Collection; Rockville, MD)로부터 입수하였다. 투과 연구를 위해, 세포를 미리 적셔진 트랜스웰 폴리카보네이트 필터(Costar; Cambridge, MA) 상에 63,000 세포/cm²의 밀도로 접종하였다. 21일 간의 배양 후에, 세포 단일층이 형성되었다. 트랜스웰 플레이트 상에 세포를 배양한 후에, 세포 단일층을 함유하는 멤브레인을 트랜스웰 플레이트로부터 떼어내고, 확산 챔버(Costar; Cambridge, MA)에 삽입하였다. 확산 챔버를, 온도 조절을 위해 회전하는 외부의 정온으로 조절된 37℃의 물로 채워진 가열 블록에 삽입하였다. 공기 다양성(manifold)이 확산 챔버의 각각의 절반에 95% O₂/5% CO₂ 를 전달하고, 세포 단일층을 통해, 교반되지 않는 주위 층을 감소시키는데 효과적인 층류 패턴을 생성시켰다.

단일층의 무결함을 모니터링하기 위해, 100 μM의 시험 화합물의 농도 및 ¹⁴C-만니톨에서 투과 연구를 수행하였다. 모든 실험을 60 분동안 37℃에서 수행하였다. 샘플을 챔버의 공급부 및 수용부 모두에서 0, 30, 및 60 분에서 취하였다. 샘플을 시험 화합물 및 만니톨 농도에 대해 HPLC 또는 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 분석하였다. cm/초의 투과 상수(Kp)를 계산하였다.

이러한 어세이에서, 약 10 x 10^-6 cm/초보다 큰 K_p 값은 적합한 생체이용율을 나타내는 것으로 인정된다. 화학식 I의 화합물을 이 어세이에서 시험하였으며, 약 20 x 10^-6 cm/초보다 큰 K_p 값을 나타내었다.

어세이 6: 랫트에서의 약물동태학적 연구

시험 화합물의 수용액 제제를 0.1% 락트산 및 약 5 내지 약 6의 pH를로 제조하였다. 웅성 Sprague-Dawley 랫트(CD 균주, Charles River Laboratories, Wilmington, MA)에게 2.5 mg/kg의 투여량으로 정맥내 투여(IV)로, 또는 5 mg/kg의 투여량으로 경구 개비지(PO)로 투여하였다. 투여 부피는 IV의 경우 1 mL/kg이고 PO 투여의 경우 2 mL/kg 이었다. 연속적인 혈액 샘플을 동물로부터 투여 전, 및 투여 후 2(IV 만), 5, 15, 및 30 분, 그리고 1, 2, 4, 8, 및 24 시간에 채취하였다. 혈장에서의 시험 화합물의 농도를 1 ng/mL의 양을 하한으로 액체 크로마토그래피-질량 분광 분석법(LC-MS/MS)(MDS SCIEX, API 4000, Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 결정하였다.

표준 약물동태학적 파라미터를 WinNomlin(Version 4.0.1, Pharsight, Mountian View, CA)을 이용하여 비컴파트먼트 분석(IV의 경우는 Model 201, PO의 경우는 Model 200)에 의해 평가하였다. 혈액 혈장 vs. 시간에서의 시험 화합물의 농도의 곡선에서의 최대값은 C_max를 나타낸다. 투여시간으로부터 가장 마지막 측정 가능한 농도까지 농도 vs. 시간 곡선하 면적(AUC(o-t))를 선형 사다리꼴 규칙에 의해 계산하였다. 경구 생체이용율(F(%)), 즉 PO 투여의 AUC(o-t)의 IV 투여의 AUC(o-t)에 대한 투여량-정규화된 비율을 하기 식과 같이 계산하였다:

F(%) = AUC_PO/AUC_IV x Dose_IV/Dose_PO x 100%

이러한 어세이에서 더 높은 파라미터 값, C_max, AUC(o-t), 및 F(%)를 나타내는 시험 화합물은 경구 투여시 더 큰 생체이용율을 갖는 것으로 기대된다. 화학식 I의 화합물은 랫트 모델에서 C_max 0.16 ㎍/mL, AUC(o-t) 0.46 ㎍^.hr/mL, 및 경구 생체이용율(F(%)) 약 19%의 값을 가졌다.

본 발명을 특정 구현예를 참조로 하여 설명하였지만, 당업자는 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화를 줄 수 있으며 등가물로 치환할 수 있다는 것을 알아야 한다. 또한, 특정한 상황, 물질, 조성물, 방법, 방법 단계 또는 단계들, 본 발명의 목적, 요지, 및 범위에 적응시키기 위해, 많은 변경이 이루어질 수 있다. 모든 그러한 변경은 본 명세서에 첨부된 청구항의 범위 내에서 이루어지도록 의도된다. 추가적으로, 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허문헌은 개별적으로 참고로 통합되었다고 할지라도 전체가 참고로 본 명세서에 통합된다.

Claims

분말 X-선 회절 패턴이 4.41±0.2, 8.82±0.2, 9.08±0.2, 11.21±0.2, 14.40±0.2, 16.42±0.2, 17.35±0.2, 17.61±0.2, 18.14±0.2, 19.04±0.2, 19.95±0.2, 20.20±0.2, 21.23±0.2, 22.13±0.2, 22.48±0.2, 22.83±0.2, 24.16±0.2, 25.37±0.2, 25.56±0.2, 26.22±0.2, 27.33±0.2, 29.08±0.2, 및 29.61±0.2에서 선택된 2θ 값에서 두 개 이상의 회절 피크를 갖는 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염.
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제 1 항에 있어서, 상기 분말 X-선 회절 패턴은 14.40±0.2, 17.35±0.2, 17.61±0.2, 19.04±0.2, 21.23±0.2, 및 22.13±0.2에서 선택된 2θ 값에서 두 개 이상의 회절 피크를 포함하는 것을 특징으로 하는 결정성 염산염.
제 1 항에 있어서, 상기 결정성 염산염은 분말 X-선 회절 패턴의 피크 위치가 하기 패턴의 피크 위치와 실질적으로 일치하는 것을 특징으로 하는 결정성 염산염:

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제 1 항에 있어서, 상기 결정성 염산염은 시차 주사 열량법 기록이 230℃ 보다 큰 온도에서 최대 흡열 열 흐름을 나타내는 것을 특징으로 하는 결정성 염산염.
제 1 항에 있어서, 상기 결정성 염산염은 시차 주사 열량법 기록이 하기 나타낸 것과 실질적으로 일치하는 것을 특징으로 하는 결정성 염산염:
분말 X-선 회절 패턴이 5.30±0.2, 7.43±0.2, 8.72±0.2, 10.52±0.2, 13.85±0.2, 14.11±0.2, 15.80±0.2, 15.99±0.2, 17.26±0.2, 19.53±0.2, 20.08±0.2, 21.06±0.2, 21.48±0.2, 21.92±0.2. 22.85±0.2, 23.91±0.2, 25.28±0.2, 26.06±0.2, 27.34±0.2, 27.51±0.2, 및 29.67±0.2에서 선택된 2θ 값에서 두 개 이상의 회절 피크를 갖는 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드 염산염의 결정성 수화물.
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제 8 항에 있어서, 상기 분말 X-선 회절 패턴은 10.52±0.2, 13.85±0.2, 15.80±0.2, 17.26±0.2, 및 21.06±0.2에서 선택된 2θ 값에서 두 개 이상의 회절 피크를 포함하는 것을 특징으로 하는 결정성 수화물.
제 8 항에 있어서, 상기 결정성 수화물은 분말 X-선 회절 패턴의 피크 위치가 하기 패턴의 피크 위치와 실질적으로 일치하는 것을 특징으로 하는 결정성 수화물:

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제 8 항에 있어서, 상기 결정성 수화물은 시차 주사 열량법 기록이 하기 나타낸 것과 실질적으로 일치하는 것을 특징으로 하는 결정성 수화물

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제 1 항, 제 4 항, 제 5 항 내지 제 8 항, 및 제 10 항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 결정성 염산염 또는 수화물, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 포유류의 위장관 운동 감소 질환 치료용 약학 조성물.
제 15 항에 있어서, 상기 위장관 운동 감소 질환은 만성 변비, 변비 우세형 과민성대장증후군, 당뇨병성 및 특발성 위마비, 및 기능성 소화불량으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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(a) 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드를 절대 에탄올 중에서 염산과 접촉시키고, 그 혼합물을 환류 교반하고, 그 혼합물을 실온으로 냉각시켜 반응 혼합물을 형성시키는 단계; 및

(b) 상기 반응 혼합물로부터 결정성 염산염을 분리하는 단계를 포함하는,

제 1 항에 따른 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드의 결정성 염산염을 제조하는 방법.
(a) 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드 염산을 물에 밀리리터 당 50 mg 이상의 농도로 용해하여 현탁액을 형성시키는 단계; 및

(b) 상기 현탁액을 주위 온도에서 정치하여 백색의 침전물을 형성시킨 다음, 그 현탁액으로부터 결정성 수화물을 분리하는 단계를 포함하는,

제 8 항에 따른 1-이소프로필-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실산 {(1S,3R,5R)-8-[(R)-2-히드록시-3-(메탄술포닐-메틸-아미노)프로필]-8-아자바이시클로[3.2.1]옥트-3-일}아미드 염산염의 결정성 수화물을 제조하는 방법.