CN101141973A - 关节用草药制剂 - Google Patents

Abstract

本发明系一种草药短瓣花(Brachystemma calycinum)萃取物，其用于改善或治疗骨关节炎引发的或与骨关节炎有关的疼痛或不适。该萃取物通过多步萃取方法得到，其中每个步骤的温度决不达到沸点。

Description

关节用草药制剂

发明领域

本发明一般而言涉及非处方食品增补剂(dietary supplement)和保健食品(health supplement)及植物产品。具体而言，本发明涉及一种草药萃取物，其用于改善或治疗骨关节炎引发的或与骨关节炎相关的疼痛或不适。

发明背景

本发明公开中所引用的参考文献不一定是现有技术，因此其引用并不在任何区域构成对这些参考文件为现有技术的承认。

草药短瓣花(Brachystemm.Calycimum D.Don，B.calycinum)为一种生长于中国西南部喜马拉雅山脉的植物，其生境范围延伸至南亚及东南亚。在中国，该草药被称为“短瓣花”。科学界对该草药知之甚少，除植物分类学和分类学文献资料外，几乎没有资料发表其信息。

在2001年发表的一篇论文中描述了从这种植物的乙醇萃取物中分离出的四种微量环肽(Cheng等人)。在2002年，Cheng等人从这种草药的乙醇萃取物中分离出五种含氮化合物。Cheng等人还从该草药的根分离出五种新的生物碱。

本发明的目的是教导一种制备这种草药的有用萃取物的方法。

发明概述

本发明的一方面系一种制备草药短瓣花的萃取物的方法。本发明的方法一般而言包括：提供所述草药，在适当的酸中酸化所述草药，将所述草药在适当的液体中煎煮，过滤煎剂并浓缩煎剂，得到草药萃取物，这是本发明的第二个方面。

更明确地说，本发明的优选实施方案包括：提供经干燥的草药，通过将经干燥的草药浸泡在米醋中而将其酸化，加热经酸浸泡的草药至干，并将所述草药在水中与动物骨(优选猪骨)一起煎煮，重复所述煎煮，将来自这两次煎煮的滤液合并，并浓缩滤液，形成所述萃取物。然后可以进一步加工所述草药萃取物，使其更适合口服给药。

本发明的另一方面系施用治疗有效量的通过所教导的方法制备的短瓣花的萃取物，用于改善骨关节炎引发的或与骨关节炎相关的关节损伤和不适。这种施用也可以用于预防或治疗该疾病。

本发明的另一方面系短瓣花的萃取物在制备治疗和/或预防性治疗骨关节炎或关节疼痛或不适的药物中的用途。

本发明的另一方面系一种用于治疗骨关节炎的制剂，所述制剂包含经酸化的草药短瓣花的萃取物。

本发明也可用作保健食品或营养增补剂(nutritional supplement)。

附图简述

图1系制备为用于HPLC分析的含水样品的HPLC色谱图。

图2系制备为用于HPLC分析的乙醇样品的萃取物的HPLC色谱图。

图3系用于HPLC分析的与乙酸乙酯一起回流的萃取物在一种分辨率下的HPLC色谱图。

图4系在另一种分辨率下显示的图3的色谱图。

详细描述

本说明书和权利要求书中使用的术语“包括”和“包含”意即“包括但不限于”。例如，一种含有A、B和C的方法、设备、分子或其它项目可以正确地说成包括A和B。同样，一种“包括A和B”的方法、设备、分子或其它项目也可能包括任何另外的步骤、部件、原子或其它项目。

同样，除非另有定义，本文中所用的全部技术及科学术语的含义与本发明所属的中药(TCM)领域的普通技术人员的一般理解相同。虽然与本文中所述类似的任何方法或材料都可以用于本发明的实践或测试中，但只描述了优选实施方案。中草药制备和使用领域的技术人员利用下文的描述，可以轻松地实践所请求保护的发明的方法。

尽管在中草药方面传统上使用并优选经干燥的材料，但必须认识到，植物材料的干燥便于其储存、运输和随后的加工。干燥可能并不是获得这些草药的益处所需要的。因此，要理解，本发明也可以用相应量的新鲜植物材料来实践。足以达到所用萃取物的必要量和比例的新鲜植物材料的使用也在本申请权利要求的范围内。

本领域技术人员会理解，可以利用植物细胞和组织培养技术体外培养该草药的细胞及组织，并从这些细胞及组织中萃取任何感兴趣的活性成分。因此，尽管优选和教导了从经干燥的植物中萃取活性成分，但从培养物中的植物细胞和组织中萃取这种草药的这些成分也在本申请权利要求的范围和实质之内。

教导的技术包括在加工过程中减小植物材料的尺寸。这里，减小过程可以通过多种方法实现，包括但不限于切断、剁碎、切碎、捣烂、磨粉、浸渍、碾磨及研磨。尽管可能介绍了一种优选方式，但也可以使用其它实现减小材料尺寸的方式和方法。

因此，这些方法及材料都在所附权利要求的范围之内。

下面是一个如何实践本发明的实例。

提供草药

为用于本发明的方法中，草药短瓣花(下文简称短瓣花)通常在春季和夏季在中国云南省采得，并清理泥土和其它杂质，清洗，然后干燥。可以通过手工或机械方式将该草药尺寸减小至约l0-15mm长的片(例如，采用切断或剁碎的方式)，以便干燥。可以在日光下或在温控炉中干燥草药，但最好在阴暗处干燥草药。提供强迫通风可加速草药的干燥。将草药干燥直至其水分含量低于10％。然后，如果需要则可以进一步研磨草药。

草药的酸化

将100kg经干燥研磨的草药(地上部分和地下部分)在合适的耐酸容器中用25kg中国米醋浸泡，即，草药与醋的重量比为5∶1，以便萃取。中国米醋的pH值范围一般为2.0～4.0。确保经干燥的草药的全部物料均匀地浸泡在米醋中是重要的。然后，将草药与醋的混合物加热至不超过60℃，优选温度范围在50～60℃之间，直至酸液完全蒸发，随后再次充分干燥草药。这一般进行一天，在该时间中不断搅拌和翻动草药与醋的混合物以确保均匀加热和干燥草药物料。一般情形下，从此步骤可以得到约100kg经酸化的草药。要得到更多的量，则可以相应增加草药和醋的量或者按需要重复以上方法。

煎煮

然后，将750kg经酸化的草药转移入渗滤器(TQX3型多功能渗滤器，Changshou City Chemical Engineering Machine Manufacturing，中国江苏省)中进行煎煮。向此量的经研磨干燥酸化的草药中加入300kg猪骨(优选为经清洗、净化、沥干和剁碎或碾碎的骨盆和长骨的大块骨)，使经酸化的草药与骨的重量比为2.5∶1。然后将内容物均匀地铺在所述渗滤器的底部，之后加入10500L水，即，水与固体的重量比为10∶1。将内容物放置1小时后，将温度升到90～95℃。在此温度范围内煨煮内容物90分钟，同时搅拌或循环液体。决不使所述内容物沸腾。然后将渗滤器中的液体倒出并过滤，得到第一滤液。过滤通过逐渐加细的筛孔滤网进行，直至滤液基本上没有可见颗粒。

然后，向渗滤器中的固体残渣中加入8400L水(水与固体的重量比为8∶1)，再次在90～95℃下将内容物煨煮60分钟，同时搅拌或循环液体。再次如上将渗滤器中的液体倒出并过滤，得到第二滤液。然后合并第一和第二滤液，其为本发明的煎剂。

煎剂的浓缩

然后在低于标准大气压的0.06～0.075Mpa的低压和65℃或低于65℃的温度下浓缩煎剂(941型高效浓缩器，Hunan Energy-Saving EquipmentManufacturing，中国湖南省)，直至得到相对密度在1.20～1.30之间的萃取物，所述相对密度由在浓缩过程中定期取样测得。

喷雾干燥液体萃取物

尽管然后可以通过诸如真空干燥法的多种方法干燥萃取物，但优选将其喷雾干燥，形成粉末。入口温度设为200～220℃，而出口温度设为80～100℃。可以通过80目筛来进一步筛分此粉末。从此方法所用的所述量可以得到约100kg萃取物。这样得到的萃取物是高度吸湿的。将其储存在密封容器中，优选放入适当的干燥剂，并在低温(4℃左右)下储存或者如下教导立即加工。可以进一步加工萃取物，或者使其成为适合包装、储存或口服给药的形式。

通过HPLC表征萃取物

对通过上述方法得到的本发明的萃取物进行高效液相色谱(HPLC)分析。

为此，将2.0g萃取物分别与30ml水、95％乙醇或乙酸乙酯回流1小时，过滤，然后蒸发至干。向这样得到的三种残渣中加入10ml甲醇，形成用于在Shimadzu HPLC系统中分析的三种样品。

色谱柱长150mm，且基质为十八烷基硅烷，化学键和的硅胶作为填料。所用的流动相为30∶70比例的乙腈-水混合物；泵流速为1ml/分钟，且柱温保持在40℃。在254nm下进行样品检测。图1至图4中给出了用水、乙醇和乙酸乙酯三种不同的溶剂萃取得到的萃取物的色谱图。

图1至附图4的色谱图所示的水、乙醇和乙酸乙酯草药萃取物发明的可检测成分的洗脱曲线对于本发明的方法而言是典型和特征性的。洗脱曲线可以通过目测比较或通过合适的软件校准，以进行质量控制分析。

采用TLC进行质量控制

可以如下通过由薄层色谱法(TLC)分析比较草药短瓣花与本发明的主要成分来确定本发明的萃取物的质量。

向5g本发明的萃取物中加入50ml乙醇。对混合物进行30分钟的声波处理，过滤并将滤液蒸发至干，得到残渣。将该残渣溶解于50ml水中，并用水饱和的正丁醇萃取三次(分别为20ml、15ml和10ml)。然后移出有机层，合并，并用正丁基饱和的水(分别为20ml、15ml和10ml)再萃取，然后将合并的有机层蒸发至干，形成第二残渣。加入2ml甲醇以溶解此残渣，所得溶液形成研究溶液。

通过向10g尺寸已被减小为粉末的经干燥的草药中加入100ml水而得到参比溶液。在回流和加热下将草药粉末萃取1小时。然后过滤混合物，并蒸发至干，得到一种残渣。然后，加入100ml乙醇以溶解滤渣，对混合物进行30分钟的声波处理，并过滤。蒸发滤液至干，然后将其溶解于50ml水中。然后用水饱和的正丁醇(分别为20ml、15ml和10ml)萃取此溶液。移出有机层，合并，并用正丁基饱和的水(分别为20ml、15ml和10ml)再萃取。蒸发来自此第二次萃取的合并的有机层至干，形成另一残渣。加入2ml甲醇以溶解此残渣，所得溶液形成参比溶液。

随后，将研究溶液及参比溶液各50μl点样在硅胶G板上。在30～60℃下，使用石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸∶水(2.5∶5∶0.5∶0.5)作为流动相，分离主要成分。风干后，在紫外光(254nm和365nm)下观看色谱。两种溶液均可见具有相同Rf值的黄绿色荧光点，表示两种溶液中存在所述主要成分。

萃取物的任选深加工

为了加工或使适合口服给药，萃取物的优选形式为加入适当的赋形剂的胶囊。在一个实施方案中，在混合器中混合作为赋形剂的糊精、可溶淀粉和天冬甜素与草药萃取物混合。加入足量的液态乙醇(75％)作为粘合剂。充分混合此混合物，然后在干燥机(FZGX 15-00型真空干燥机，WuhanPharmaceutical Machinery Manufacturing，中国湖南省)内真空干燥。

然后通过在(GHL-120型湿法造粒机，China Harbin High TechnologyCompany，中国黑龙江省)中经80号孔径的筛粉碎而将混合物造粒，得到细粉末。可加入滑石粉以改善流动性，然后在1号胶囊中填充萃取物粉末用于口服。将未包装的萃取物用于动物研究，而将胶囊中的萃取物给予人类患者进行以下描述的临床观察。

在另一实施方案中，将从第一实施方案得到的萃取物进一步与一种或多种成分混合，得到制剂。这些成分可包括中草药灵芝(Ganoderma)、独活(Radix Augelicae Pubescentis)、茯苓(Poria)和秦艽(Radix GentianaeMacrophyllae)。

动物研究

对大鼠进行的以下研究测量参数如重量增加、食欲、血液测试组(细胞与生化标记)、内脏重量变化以及来自病理学及组织学检查的观测结果。

动物

从广东省医学实验动物中心得到57～72克的雄性和雌性健康Sprague-Dawley鼠。给动物喂食它们的来源中心提供的标准谷物饲料。

实验设计

将健康动物随机分成四组，每组15只雄性和15只雌性动物。在每组内，按性别将动物分开装入不同的笼中。这四组分别为对照(蒸馏水)、低剂量(1.51g/kg体重)、中等剂量(3.01g/kg体重)及高剂量(6.03g/kg体重)。这些剂量等同于按表面积计12.5x、25x及50x人类临床剂量和按重量计66.6x、133.3x及266.7x人类临床剂量。人类临床剂量等同于每日三个胶囊或1.35g。

在90天的时间段内，按其实验组，通过管饲法每日给这120只动物喂食蒸馏水或各剂量的在水中的草药萃取物。每周将各只动物称重并记录食用的饲料量。然后相应调整剂量，每100g体重给药1.0ml萃取物。

90天后，每组处死10只雄性和10只雌性动物进行分析，同时对所有剩余动物均停止实验和对照治疗(适用时)，持续30天的恢复期。

一般观测结果

在实验期及恢复期内，观察动物的食欲、一般活动和粪便。

实验数据及观测结果

食物利用

下表1给出了90天给药期内的平均净重增加、总食物摄入及食物利用率。

表1：给药期内的净重增加、总食物摄入及食物利用率(x±S，n＝15)

性别	剂量(g/kg)	净重增加(g/鼠)	总食物摄入(g/鼠)	食物利用(％)
					雄性	0.00	455.4±46.3	2412.7±35.6	20.6±11.5
1.51	436.5±45.6	2385.8±34.7	19.8±12.1
				3.01		409.0±39.4	2243.3±27.5	19.5±11.5
6.03	390.0±37.7	2211.3±28.4	19.0±11.4
				雌性		0.00	251.9±34.7	1988.7±30.7	14.1±12.9
1.51	256.4±25.5	1986.7±24.2	14.1±11.0
					3.01	254.7±33.7	1901.8±28.2	14.6±11.1
6.03	248.1±24.4	1687.9±14.3	14.7±11.6

下表2给出了30天恢复期内的平均净重增加、总食物摄入及食物利用率。

表2：30天的恢复期内的平均净重增加、总食物摄入及食物利用率(x±s，n＝5)

性别	剂量(g/kg)	净重增加(g/鼠)	总食物摄入(g/鼠)	食物利用(％)
					雄性	0.00	75.4±12.9	1524.4±58.4	4.7±3.5
1.51	81.2±41.2	1569.6±63.5	5.2±2.5
				3.01		82.0±50.8	1564.0±81.5	5.2±1.8
6.03	65.4±23.8	1487.8±76.1	4.1±2.9
				雌性		0.00	18.6±17.2	961.0±50.3	2.1±1.0
1.51	20.4±18.4	1021.0±55.3	2.1±0.8
					3.01	20.6±7.4	1041.3±56.7	1.9±0.8
6.03	16.2±3.7	952.6±52.9	1.8±1.4

血液组

在给药期及恢复期后，对一组常规标记进行常规血液检查。通过Beckman 5dif型血细胞分析仪分析抽出的血。该组标记包括白细胞(WBC)计数、白血球分类、红细胞(RBC)计数、血红蛋白(Hb)测定、血小板(PLT)计数以及血细胞比容(HCT)。表3给出了给药期结束时的结果，而表4给出了恢复期结束时的结果。

表3：给药期内的血液标记(x±s，n＝10)

性别	剂量(g/kg)	WBC(X109/L)	RBC(X1012/L)	Hb(g/l)	PLT(X109/L)	HCT(L/L)
							雄性	0.00	9.9±3.7	8.6±0.5	158.4±8.4	693±90	0.47±0.02
1.51	11.4±3.1	7.7±2.8	161.6±19.8	724±108	0.48±0.01
						3.01		12.0±2.1	8.4±0.3	153.0±4.9	737±125	0.45±0.01
6.03	9.9±1.5	7.8±1.4	146.4±5.2	697±93	0.44±0.02
						雌性		0.00	6.4±1.1	8.3±0.5	158.5±6.5	770±106	0.46±0.02
1.51	7.2±1.4	8.2±0.2	154.5±5.8	786±95	0.44±0.02
							3.01	8.5±2.8	7.7±0.4	148.9±6.2	711±121	0.44±0.02
6.03	7.3±2.0	7.8±0.9	148.9±11.3	736±161	0.45±0.04

表4：恢复期内的血液标记(x±s，n＝5)

性别	剂量(g/kg)	WBC(X109/L)	RBC(X1012/L)	Hb(g/l)	PLT(X109/L)	HCT(L/L)
							雄性	0.00	10.8±3.0	8.5±1.1	159.5±10.8	766±89	0.43±0.03
1.51	10.5±1.2	8.8±0.1	163.1±3.4	740±48	0.45±0.01
						3.01		12.0±2.2	9.2±0.2	162.4±3.8	911±60	0.44±0.01
6.03	9.8±2.8	8.8±0.2	162.9±3.9	757±68	0.44±0.01
						雌性		0.00	7.3±2.6	8.2±0.6	152.8±5.0	770±106	0.41±0.01
1.51	6.6±0.5	8.4±0.5	158.5±6.2	786±95	0.42±0.02
							3.01	6.8±2.9	8.0±0.9	153.6±16.8	711±121	0.40±0.04
6.03	8.3±1.80	8.0±0.4	149.5±10.7	736±161	0.40±0.03

血液生化

测量的血液生化标记包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酸(Crea)、总蛋白质(TP)、清蛋白(ALB)、总胆固醇(T-cho)、血糖(GLu)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)。使用Beckman CX5自动生物分析仪检查这些标记。表5显示了给药期的数据，而表6显示了恢复期的数据。

表5：给药期内的血液生化标记(x±s)

性别	剂量(g/kg)	ALT(u/l)	AST(u/l)	BUN(mmol/L)	TP(g/l)	ALB(g/l)	Crea(umol/L)
								雄性	0.00	70.9±7.7	218.5±36.3	9.0±0.5	74.2±3.4	37.0±1.4	104.0±22.2
1.51	71.2±9.7	184.9±29.6	8.0±0.5	72.6±4.2	36.9±2.0	97.5±32.3
							3.01		71.7±10.7	193.1±34.2	7.5±0.6	76.4±3.2	36.4±0.8	78.5±32.0
6.03	69.7±8.4	202.3±31.7	7.7±0.6	75.6±3.3	37.3±1.0	87.3±31.2
							雌性		0.00	71.7±8.4	199.3±38.6	9.8±2.1	74.6±5.0	37.1±3.0	116.6±33.4
1.51	66.5±7.4	172.1±30.4	9.0±1.2	78.7±6.1	39.0±1.8	96.6±33.6
								3.01	71.4±7.4	168.4±24.4	8.4±1.2	79.5±4.3	38.7±1.6	115.6±16.8
6.03	63.9±8.0	201.6±26.2	8.0±1.0	81.3±4.0	39.2±1.7	96.9±17.4

表6：恢复期内的血液生化标记(x±s)

性别	剂量(g/kg)	Tcho(mmol/L)	Glu(mmol/L)	ALP(IU/L)	ABIL(u mol/L)
						雄性	0.00	1.5±0.3	6.6±0.6	235.1±34.4	34.8±7.4
1.51	1.6±0.3	6.3±0.5	223.6±37.7	34.9±14.3
					3.01		1.5±0.2	7.4±1.0	241.7±28.0	25.8±14.9
6.03	1.4±0.2	7.8±1.0	229.9±25.8	45.3±20.8
					雌性		0.00	1.6±0.4	7.8±1.3	216.6±54.6	22.7±7.0
1.51	1.7±0.2	7.1±0.7	216.9±50.6	25.0±4.4
						3.01	2.1±0.2	7.3±0.6	226.7±49.0	24.9±11.2
6.03	1.8±0.3	7.6±0.6	205.0±39.0	31.1±8.3

内脏检查

在各期(给药期和恢复期)结束时，处死动物，并取出器官(肝、肾、心、肺、脾、脑、肾上腺、前列腺及睾丸或子宫)，称重并检查任何明显病理症候。表7和表8分别给出了给药期及恢复期的器官及其重量。

表7：给药期结束时的内脏重量(g，x±s，n＝10)

性别	剂量(g/kg)	心	肝	脾	肺	肾
							雄性	0.00	1.59±0.23	17.6±1.9	0.83±0.16	2.29±0.66	2.97±0.40
1.51	1.50±0.19	17.2±2.3	0.96±0.12	2.46±0.48	2.93±0.30
						3.01		1.55±0.19	15.4±1.9	0.87±0.19	2.53±0.64	3.00±0.32
6.03	1.49±0.19	16.4±1.3	0.88±0.15	2.35±0.37	3.10±0.35
						雌性		0.00	1.09±0.10	9.6±1.7	0.59±0.11	1.91±0.25	1.99±0.23
1.51	1.06±0.08	10.2±1.0	0.62±0.11	1.86±0.32	2.03±0.20
							3.01	1.10±0.19	10.1±1.7	0.79±0.28	1.90±0.27	1.97±0.23
6.03	1.05±0.11	3.22±1.0	0.66±0.10	1.92±0.39	2.09±0.16

表7续

性别	剂量(g/kg)	脑	肾上腺	前列腺	睾丸	子宫
							雄性	0.00	1.96±0.16	0.10±0.03	0.62±0.12	3.54±0.18
1.51	1.94±0.14	0.10±0.02	0.68±0.20	3.52±0.29
						3.01		2.00±0.20	0.10±0.03	0.66±0.20	3.52±0.30
6.03	1.97±0.13	0.10±0.04	0.66±0.22	3.59±0.35
						雌性		0.00	1.65±0.27	0.12±0.03			0.22±0.09
1.51	1.63±0.34	0.10±0.02			0.18±0.08
							3.01	1.89±0.11	0.10±0.02			0.20±0.07
6.03	1.91±0.10	0.11±0.03			0.23±0.09

图8：恢复期结束时的内脏重量(g，x±s，n＝5)

性别	剂量(g/kg)	心	肝	脾	肺	肾
							雄性	0.00	1.65±0.22	20.5±5.7	1.09±0.92	2.52±1.10	3.08±0.62
1.51	1.67±0.30	20.3±5.2	0.89±0.14	2.44±0.59	3.22±0.64
						3.01		1.48±0.18	18.6±3.2	1.02±0.24	2.51±0.46	3.10±0.35
6.03	1.53±0.05	17.5±1.4	0.98±0.10	2.26±0.54	2.64±0.11
						雌性		0.00	1.02±0.16	11.2±1.6	0.72±0.19	1.96±0.70	1.87±0.27
1.51	1.09±0.14	12.2±1.1	0.71±0.09	2.24±0.61	2.01±0.06
							3.01	1.13±0.08	11.9±0.4	0.99±0.40	1.84±0.14	2.20±0.16
6.03	0.98±0.08	10.1±0.4	0.72±0.10	1.72±0.28	2.01±0.22

表8续

性别	剂量(g/kg)	脑	肾上腺	前列腺	睾丸	子宫
							雄性	0.00	2.04±0.32	0.08±0.02	1.15±0.08	3.65±0.22
1.51	2.03±0.28	0.07±0.03	0.97±0.06	3.88±0.20
						3.01		1.84±0.27	0.09±0.04	0.76±0.34	3.69±0.37
6.03	1.81±0.29	0.08±0.02	1.09±0.27	3.33±0.50
						雌性		0.00	1.65±0.27	0.13±0.04			0.21±0.06
1.51	1.63±0.34	0.09±0.02			0.21±0.04
							3.01	1.89±0.11	0.08±0.01			0.18±0.04
6.03	1.91±0.10	0.09±0.02			0.24±0.15

组织学

在大体肉眼检查后，通过标准组织学技术处理对照组和高剂量组中动物的器官的组织，进行镜检。将器官组织固定在福尔马林中，包埋入石蜡中，用切片机切片，并装在载波片上，用苏木精和曙红(H&E)染色，然后进行检查。肉眼没有观察到大体病理。因此，只对来自对照组和高剂量组的组织样品进行显微镜下的检验。观测结果如下。

肝：在显微镜下观察到，肝膜完整，厚度没有增加。肝细胞中未见水样变性、脂肪状改变以及坏死。肝细胞及胆管中未见胆汁淤积。未见括约肌扩张也未见渗出物。

肾：肾小球结构明显完整，无明显水肿、萎缩或纤维化。未见远端和近端小管中的明显水肿，未见脂肪状改变、透明变性(hyaline change)或坏死。基膜完整。集合小管中未见脱落物。

心：心包膜完整，结缔组织无增生。未见心肌纤维增生或心肌萎缩。心肌纤维排列良好，无破裂、坏死或瘢痕形成。心肌细胞中未见水肿。心内膜细胞完整，无梗塞改变或血栓迹象。

脾：脾膜和脾索中未见纤维性结缔组织增生。无明显的炎性细胞浸润，脾窦中无反应性增生。红髓中未见瘀血和炎性细胞渗出物。

脑：脑表面未见浸润。白质和灰质结构清晰。神经元没有改变或坏死。间质(interstitia)中未见出血、炎症或异常。

胃和肠：粘膜表面光滑，且颜色正常。未见异常渗出物、出血、坏死或溃疡。肠和胃结构完整，且胃膜粘膜浅层完整。腺排列良好。未见上皮脱离、坏死或溃疡。粘膜下层中未见如充血或水肿的异常病理改变。

睾丸：外层白色膜是完整的。小叶和附睾精索(epidydimal cord)呈放射状排列。精索内的支持细胞、初级精子细胞、次级精子细胞或精母细胞中未见萎缩或脱离。

前列腺：前列腺的腺组织结构正常。腺上皮排列良好。上皮中未见坏死。腺腔内无结石。无间质增生。未见炎性细胞浸润。

卵巢：在卵巢组织内可见结构良好的初级卵泡(primary ovum follicle)、次级卵泡(secondary ovum follicle))和初级卵泡(primary follicle)。表皮完整，无任何充血或腐烂存在。子宫：在显微镜下，子宫内膜腺和间质正常，且子宫肌结构正常，无出血和其它异常改变。

甲状腺：在显微镜下，甲状腺的滤泡结构正常，无胶质样沉积。

胸腺：在显微镜下，胸腺结构正常，无任何异常病理改变。

肾上腺：球状带(zona glomerulosa)、皮质内网状细胞中未见多形性改变或坏死。髓质细胞中无病理改变。

淋巴结：在显微镜下，淋巴结的皮质和髓质正常，无异常改变。

观察

从以上可见，在给药(研究)期和恢复期内，与对照组比较，不同动物组的主要器官(心、肝、肺、脾、肾、脑、胃、肠、胸腺、甲状腺、胰腺、肾上腺、淋巴腺、睾丸、前列腺、卵巢及子宫)正常，无明显病理改变。

上述实验数据表明，本发明的草药萃取物对动物无任何不良作用。从第10周起，中等剂量组和高剂量组内的雄性大鼠的重量增长更缓慢。与对照组相比，这一差异是统计学上显著性的(p≤0.05)。实验组与对照组在诸如血液参数、生化参数及病理学观测结果的其它指标方面无其它显著差异。未见急性或慢性毒性反应。

临床观测结果

将如上所述包装在胶囊中的本发明的萃取物给予抱怨由骨关节炎和其它关节疾病引起的关节问题的患者。下面列出了一些值得注意的实例以说明所述萃取物在改善与骨关节炎有关的症状、关节疼痛及损伤方面的功效。骨关节炎与类风湿性关节炎的区别见下。

类风湿性关节炎

类风湿性关节炎(RA)是一种不明原因的慢性多系统疾病。RA的特征为持久性炎性滑膜炎，通常包括对称分布的外周关节。

流行病学及遗传学：家族研究显示遗传倾向。

病理学及发病机制：多种特征组合，包括滑膜衬细胞增生和肥大；包括微脉管损伤、血栓形成和新血管形成在内的局灶性或节段性脉管改变；水肿；以及单核细胞浸润。类风湿性滑膜的特征在于炎性细胞因子和趋化因子的局部产生，它们导致类风湿性滑膜炎的许多特征，包括滑膜组织炎症、滑液炎症、滑膜增生、软骨及骨损伤以及RA的系统表现。

临床表现：特征上，RA是一种慢性多关节炎，特别是手部、腕、膝和足部的慢性多关节炎。初期疼痛、肿胀和压痛可不适地在关节局部发生。总是出现晨僵。多数患者会出现诸如虚弱、易疲劳、食欲缺乏和重量减轻的全身症状。

关节外表现：这包括类风湿结节、类风湿性血管炎、胸膜肺表现及费尔蒂综合征。

化验所见：在超过三分之二的患该病的成年人中发现了类风湿因子、自身抗体。几乎所有患有活动性RA的患者中红细胞沉降率均增加。在滑液分析中，多形核白细胞占优势。

临床病程及预后：多数患者的病情持久但又不断变化。

治疗：通常建议疾病缓解性抗风湿药、免疫抑制治疗、手术。

骨关节炎

骨关节炎(OA)表现为动关节(活动性的、衬有滑膜的)损坏。特发性(原发性)OA是该疾病的最常见的形式，其无明显的诱病因子。继发性OA在病理学上与特发性OA无法区分，但可归因于包括创伤、代谢、内分泌因素等在内的潜在原因。

流行病学及危险因子：OA是人类最常见的关节疾病。年龄是OA最大的危险因子。在45～65岁的妇女中，患病率为30％。严重的创伤及关节的反复使用也是OA重要的危险因子。继发性OA可以分为创伤性、代谢性及内分泌性的等。肥胖是膝OA及手OA的危险因子。OA是一种器官即关节软骨受力区内的滑膜关节的疾病。关节表面变薄、软骨变软、表面完整性被破坏，并且出现垂直裂。

临床特征：OA的关节痛通常被描述为深痛并局限于所涉及的关节。一般地，OA的疼痛由关节使用加重，而由休息减轻。常出现局部压痛和骨组织或软组织肿胀。骨捻发音是特征性的。

化验所见及放射造影所见：临床及放射造影诊断OA，其中关节空间变窄、软骨下骨硬化、软骨下囊肿以及骨赘病单独或全部可见。没有化验研究能诊断OA。

OA的药物治疗：目前OA的治疗是治标的，没有证明有药物在人类中预防OA、减缓OA的恶化(progression)或反转OA的病理改变。

下面是用本发明的草药胶囊制剂治疗患者的实例。

患者A

女性患者，17岁，四肢和关节受伤，膝活动受限。给该患者的处方为每日服用一粒胶囊，持续五天。另开费啶与喜疗妥的处方用于瘀伤。在五天后，她的病情得到改善且她被治愈。

患者B

男性患者，85岁，诊断为双下肢骨关节炎，运动及活动受限，并伴有疼痛。给他的处方为每日两次，每次一粒胶囊。25天后，他疼痛明显减轻，走路时平稳度增加。

患者C

女性患者，80岁，双膝患有严重关节炎。给她的处方为每日两次，每次一粒胶囊，持续23天。之后，她步行时平稳度显著增加，并且疼痛减轻。

患者D

男性患者，27岁，手指肿胀，指骨间关节和右肘患有关节炎。给他的处方为每日三次胶囊，持续30天。之后患者完全康复。

患者E

另外一名17岁的女性患者，抱怨每天多个指骨间肿胀和疼痛。给她的处方为每隔两周一粒胶囊，持续九个月。然后症状发生的频率降低，从每日出现降至每隔两周左右出现一次。

患者F

男性患者，56岁，第一指骨间关节肿胀及关节痛。给他每日两粒胶囊，持续两个月的处方后，他康复。

患者G

女性患者，45岁，被诊断在她的左膝患有关节炎，步行困难。给她的处方为每日两次，每次一粒胶囊，持续四个月。之后，将剂量减少至每周一粒胶囊，持续一年。患者肿胀及疼痛减轻，且完全恢复步行能力。

临床观测结果概述

从上述实例可以看出，草药萃取物有效地治疗与骨关节炎和其它有关损伤有关的病征中的关节损伤及疼痛。尽管功效是在为治疗施用萃取物中看到的，但预计该萃取物也可用于预防这些疾病。

已知骨关节炎几乎是一种不能治愈的疾病，因为骨关节炎的治疗是治标的，且没有证明有药物在人类中有效预防骨关节炎或减缓骨关节炎的恶化或反转骨关节炎的病理改变。上述实例已证实所述草药萃取物具有改善骨关节炎的症状和恶化及恢复受折磨患者的功能的功效。因此，可以预计，此草药萃取物可能能够在易感个体中预防骨关节炎，在放射学或MRI证据表明有骨关节炎的早期征象的患者中延迟临床症状的发作，在患有临床骨关节炎的患者的恶化，并反转骨关节炎的病理改变。有证据表明，此草药萃取物可能还可用于患有类风湿性关节炎的患者，其不阻碍类风湿性关节炎的免疫部分，而是帮助阻碍继发于由畸形关节引起的功能障碍和由机能障碍造成的对软骨的压力的疾病的恶化。已证明本发明具有治疗骨关节炎或者至少改善骨关节炎的症状的功效。

本发明实践中的变体

以上实例遵循药品的严格《生产质量管理规范》(GMP)。这是任选的规范，取决于使用者的要求，不是必需的。

虽然上文教导了如何实践本发明的实例，但是本领域技术人员也会认识到，它们只是为了说明，在不背离本发明的范围和实质的情况下，在制备方法中可能有多种等同和替代步骤。

例如，虽然使用的是全草，但可以在权利要求的范围内选择草药的各个部分(茎、叶、花、根等)。本领域技术人员会认识到，利用植物细胞和组织培养技术，可以在体外培养这些草药的细胞和组织，并从这些细胞和组织中提取重要的有效成分。因此，虽然从经干燥的植物部分中提取这些有效成分是优选的并且被教导，但从培养的植物细胞和组织中提取这些成分也是可能的。

关于酸化步骤，除了自然发酵的醋以外，还可使用多种食用酸。例如，人工合成的乙酸或天然果汁可以用于酸化草药。另外，尽管在优选的实施分案中使用猪骨，但在本发明范围内，也可以使用来自其他动物如爬行动物、哺乳动物或鱼类的的适当的骨。此外，本领域技术人员会认识到，尽管煎剂是在减压下浓缩且通过喷雾干燥得到萃取物，但通过冻干法或冷冻干燥法得到萃取物同样是可行的。

尽管草药萃取物被包装在胶囊中，但其他用于包装的适当的制备方法同样是可行的。为了口服给药，萃取物可以作为片剂、水或油混悬剂、散剂(dispersible powder)或颗粒剂、乳剂、硬胶囊剂或软胶囊剂、糖浆剂、酏剂或饮料提供。供口服使用的组合物可根据药用可接受的组合物的生产领域中已知的任何方法进行制备，且这些组合物中可含有一种或多种以下试剂：甜味剂、芳香剂、着色剂和防腐剂。甜味剂和芳香剂会增加制剂的可口性。胶囊中可以包含萃取物以及适合胶囊生产使用的药用可接受的无毒试剂或赋形剂。试剂是“药用可接受的”意为所述试剂在与制剂中的其他成分相容(和对患者无害)方面是可接受的。这些赋形剂包括惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或褐藻酸；粘合剂如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术包衣以延迟在胃肠道内的崩解和吸收，从而提供较长时间段的持续作用。例如，可使用延时物质，如单独使用甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或将其与蜂蜡一起使用。

供口服使用的制剂也可以为硬明胶胶囊，其中有效成分与惰性固体稀释剂混合，例如与碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者为软明胶胶囊，其中有效成分与水或油介质混合，如与花生油、液体石蜡或橄榄油混合。在某些实施分案中，水混悬剂可含有本发明的萃取物和适合于水混悬剂生产的赋形剂。这些赋形剂包括助悬剂、分散剂或润湿剂、一种或多种防腐剂、一种或多种着色剂、一种或多种芳香剂及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。

油混悬剂可以通过在植物油或矿物油中悬浮有效成分而配制，所述植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，所述矿物油如液体石蜡。油混悬剂可含有增稠剂，如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂(如上文列举的甜味剂)和芳香剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过加入的抗氧化剂如抗坏血酸来保存。适合于通过加入水而制备水混悬剂的本发明的散剂和颗粒剂提供一种或多种萃取物与分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂。还可加入其他赋形剂，如甜味剂、芳香剂和着色剂。

糖浆剂和酏剂可用甜味剂如甘油、山梨糖醇或蔗糖配制。这些制剂还可以含有缓和剂、防腐剂、芳香剂或着色剂。

虽然口服给药是优选的，但也不排除本发明的萃取物的其它给药方法。用于肠胃外给药的萃取物制剂可以是无菌注射制剂的形式，如无菌注射水混悬剂或油混悬剂。这种混悬剂可根据本领域已知的方法，使用适当的分散剂或润湿剂以及助悬剂来制备。无菌注射制剂也可以为在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂如1，3-丁二醇中的无菌注射溶液或悬浮液。适当的稀释剂包括例如水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发油也可方便地用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的单酸甘油酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸也可用于注射制剂的制备中。

药物组合物还可以为水包油型乳剂。油相可以为植物油如橄榄油或花生油，矿物油如液体石蜡，或它们的混合物。适当的乳化剂包括天然树胶如阿拉伯树胶和黄蓍树胶，天然磷脂如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸的酯类或偏酯，己糖醇酐如失水山梨醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物如聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。所述乳剂中还可含有甜味剂和芳香剂。

可以与载体物质混合以制备单剂形式的萃取物的量取决于受治疗患者和特定的给药方式而变。

虽然为了清楚理解的目的，已通过例示和实例详细描述了前述本发明，但根据本发明的教导，对本领域普通技术人员而言很明显，在不背离所描述和请求保护的本发明的实质和范围的情况下，可以对其做出某些变动和修改。

参考资料

1.Cheng Y-X，Zhou J和Tan N-H(2001)Journal of Integrative Plant Biology(Acta Botanica Sinica)43(7)：760-765 New minor cyclic peptides fromBrachystemma calycinum.

2.Cheng Y-X，Zhou J，Teng R-W和Tan N-H(2001)Acta BotanicaYunnanica 23(4)：527-530 Nitrogen-containing compounds fromBrachystemma calycinum.

3.Cheng YX，Zhou J，Tan NH，Teng RW，Lu Y，Wang C和Zheng QT(2002)Journal of Natural Products 65(5)：750-2 Isolation and characterization ofBrachystemidines A-E，novel alkaloids from Brachystemma calycinum.

Claims (23)

1.一种包含草药短瓣花(Brachystemma calycinum)萃取物的草药萃取物，其中所述萃取物通过包括以下步骤的方法得到：

a.提供所述草药；

b.酸化所述草药；

c.在液体中煎煮所述草药，得到煎剂；

d.浓缩所述煎剂，得到所述萃取物。

2.如权利要求1所述的草药萃取物，其中酸化步骤b还包括：

(i)用醋浸泡所述草药，形成混合物；和

(ii)在不超过60℃的温度下加热并搅拌所述混合物，直至所述混合物充分干燥。

3.如权利要求1所述的草药萃取物，其中煎煮步骤c还包括在低于沸点的温度下，将来自步骤b的经酸化的草药在液体中与动物骨一起煨煮。

4.如权利要求3所述的草药萃取物，其中所述煨煮步骤还包括将含草药与骨的液体搅拌或循环足够的时间段。

5.如权利要求3所述的草药萃取物，其中所述动物骨为猪骨。

6.如权利要求1所述的草药萃取物，其中煎煮步骤c还包括过滤所述煎剂。

7.如权利要求1所述的草药萃取物，其中浓缩步骤d在低于标准大气压的压力下进行。

8.如权利要求1所述的草药萃取物，其中浓缩步骤d还包括干燥经浓缩的萃取物的干燥步骤，并且所述干燥步骤选自真空干燥和喷雾干燥。

9.如权利要求1所述的草药萃取物，其中浓缩步骤d还包括将经浓缩的萃取物与适当的赋形剂混合。

10.如权利要求8所述的草药萃取物，其中在适当的赋形剂存在下进行所述干燥步骤。

11.如权利要求1所述的草药萃取物，其中所述方法还包括将所述萃取物加工成适合口服的形式。

12.如权利要求11所述的草药萃取物，其中所述适合口服的形式是胶囊。

13.如权利要求1所述的草药萃取物，其中所述方法还包括在所述萃取物中添加选自草药灵芝(Ganoderma)、独活(Radix Angelicae Pubescentis)、茯苓(Poria)和秦艽(Radix Gentianae Macrophyllae)的成分。

14.一种改善骨关节炎症状的方法，其包括给药治疗有效量的草药短瓣花的萃取物。

15.一种改善骨关节炎症状的方法，其包括给药治疗有效量的权利要求1所述的萃取物。

16.一种改善骨关节炎症状的制剂，其包含治疗有效量的草药短瓣花的萃取物。

17.一种预防、改善或治疗骨关节炎引发的或与骨关节炎相关的疼痛或不适的方法，其包括给药治疗有效量的包含草药短瓣花的萃取物的药物。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述药物还包含来自草药灵芝、独活、茯苓和秦艽的成分。

19.一种保健食品，其包含酸化的草药短瓣花的萃取物。

20.如权利要求2所述的草药萃取物，其中步骤(ii)中的温度在50～60℃的范围内。

21.如权利要求16所述的制剂的制备方法，其包括以下步骤：

a.提供草药短瓣花；

b.酸化所述草药；

c.在液体中煎煮来自步骤b的草药，得到煎剂；

d.浓缩所述煎剂，得到所述萃取物；和

e.将所述萃取物加工成适合口服的形式。

22.如权利要求21所述的方法，其中

酸化步骤b还包括：

(i)用醋浸泡所述草药，形成混合物；和

(ii)在不超过60℃的温度下加热并搅拌所述混合物，直至所述混合物充分干燥；且

煎煮步骤c还包括：

(i)在低于沸点的温度下，将来自步骤b的经酸化的草药在液体中与动物骨一起煨煮，其中该煨煮步骤包括将含草药和骨的液体搅拌或循环足够的时间段，得到煎剂；和

(ii)过滤所述煎剂；且

浓缩步骤d还包括：

(i)在低压下浓缩所述煎剂，得到所述萃取物；

(ii)在适当的赋形剂存在下干燥经浓缩的萃取物；和

(iii)将所述萃取物加工成适合口服给药的形式，得到所述制剂。

23.如权利要求22所述的方法，其中浓缩步骤d(i)还包括在低压和65℃或低于65℃的温度下浓缩所述煎剂，直至所述萃取物的相对密度达1.2～1.3的步骤。

Images