CN101124888A - 铁皮石斛四倍体的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种铁皮石斛四倍体的培育方法。常规铁皮石斛开花后采用人工方法授粉，将其种子接种在1/2MS液体培养基中非共生萌发培养时，再转入含有0.01％Oryzalin+0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行诱变处理，然后转入1/2MS固体培养基上，光照；取新生长的根尖固定，用压片法制备染色体标本，卡宝品红染色液染色，染色体数目为2n＝76的幼苗为四倍体铁皮石斛，按通常方法进行栽培管理。本发明大幅度地提高了铁皮石斛的药材产量。培育方法简单易行，诱变频率达到80％以上，一次就可以获得数百株四倍体铁皮石斛种苗，满足多倍体选种之用，使多倍体育种成为铁皮石斛遗传改良、新品种培育的重要方法。
Description
技术领域
本发明涉及植物新品种的培育方法，特别是铁皮石斛四倍体的培育方法。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)又称黑节草，是一种附生，多年生草本兰科植物。加工后俗称铁皮枫斗，为传统名贵中药材，具有滋阴养胃，清热生精、润肺止咳之功效。近年，由于市埸供不应求，人们过度采挖，环境恶化，铁皮石斛自然资源日趋枯竭。现有的铁皮石斛均为二倍体种，生长缓慢，株高仅5～20公分，产量很低。植物多倍化后的显著特征是，植物的根、茎、叶等营养器官的变大，次生代谢物含量的提高。因此，培育四倍体铁皮石斛，可以较大幅度地提高铁皮石斛药材产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种铁皮石斛四倍体的培育方法，可以克服一般方法多倍体诱变频率低的缺陷。它是采用铁皮石斛种子类原球茎(PLBs)作为多倍体诱变材料，在种子非共生萌发培养过程中，种子原球茎分化前，即原胚时期，采用Oryzalin(C12H18N4O6S)+秋水仙碱作为多倍体诱变剤，由于Oryzalin毒性小，对细胞损伤少，提高了诱变频率，一次就可以获得足够数量的多倍体群体，供选种使用。
本发明提供的一种铁皮石斛四倍体的培育方法包括以下步骤：按常规方法进行铁皮石斛栽培管理，开花后采用人工方法授粉，取授粉后的铁皮石斛种子接种在1/2MS液体培养基中非共生萌发培养至种子原球茎呈球形时，再转入含有0.01％Oryzalin+0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行诱变处理，然后转入1/2MS固体培养基上，在光照条件下继续培养成苗分化；取新生长的根尖放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理，后转入甲醇：冰醋酸固定液中固定，用压片法制备染色体标本，卡宝品红染色液染色，选取染色体数目为2n＝76的幼苗为加倍成功的四倍体铁皮石斛，按通常铁皮石斛管理方法进行栽培管理。
本发明提供一种铁皮石斛四倍体的培育方法包括以下步骤：
1)铁皮石斛的开花与人工授粉：按常规方法进行栽培管理，在铁皮石斛开花(每年的4～5月份)后以自花或同株异花进行人工授粉；授粉后的铁皮石斛要精心管理，放在透风半透光，室温20～25℃条件下，保持一定湿度，防止落花落果。
2)铁皮石斛种子非共生萌发培养：取授粉后5～8个月的铁皮石斛种子在超净台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞消毒10分钟，无菌蒸餾水冲洗5遍，用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，将种子接种在1/2MS液体培养基中，间歇振荡进行非共生萌发培养。
3)铁皮石斛四倍体诱导：将非共生萌发的种子转入含有0.01％Oryzalin+0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行诱变处理，然后转入1/2MS固体培养基上，在光照下继续培养，直至成苗分化。
4)多倍体的鉴定：在瓶苗移栽时，按株分别编号，取新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理4小时，后转入体积比为3∶1甲醇∶冰醋酸固定液中固定4小时以上，4℃冰箱中保存备用，用压片法制备染色体标本，卡宝品红染色液染色，显微镜观察染色体数目，选取染色体数目为2n＝76的幼苗，为加倍成功的四倍体铁皮石斛；其他染色体数目的幼苗，为非整倍体，是加倍不成功的，不能使用；
5)铁皮石斛四倍体的栽培管理：四倍体铁皮石斛按常规的二倍体铁皮石斛进行栽培管理，进行室外定植。对四倍体铁皮石斛各时期的生长情况，要与一般二倍体铁皮石斛进行对比观察记载，比较其根、茎、叶、花的大小和有效成分的变化，为选育优良四倍体铁皮石斛奠定基础。
步骤1)在铁皮石斛花开花5～10天内进行人工杂交授粉，取自花或同株异花花粉进行授粉。
步骤2)所述的非共生萌发培养是在透风半透光下，60次/分振荡培养，室温20～25℃条件下进行非共生萌发培养10～20天。
步骤3)所述的诱变处理是种子非共生萌发培养铁皮石斛种子原球茎呈球形时进行多倍体诱变处理100-130小时。
步骤4)所述的继续培养是在周期14小时/天，光强度3000Lux，室温25℃条件下进行。
步骤5)所述的室外定植方法：待瓶苗长至3-4片叶时，特瓶盖打开，练苗4-5天，然后用清水轻轻地将培养基冼净，将瓶苗移栽在兰花土+火烧土+椰糠(重量比为1∶1∶1)基质中，放在阴凉处，按一般二倍体铁皮石斛栽培管理方法，进行精心管理，特别要注意病虫害的防冶。
本发明可以克服一般方法多倍体诱变频率低的缺陷。四倍体铁皮石斛的根、茎、叶、株高等都明显大或高于原二倍体铁皮石斛，大幅度地提高了铁皮石斛的药材产量。本发明是对铁皮石斛进行了遗传改良，建立了四倍体铁皮石斛新品的培育方法，创造出同源四倍体铁皮石斛新种质。通过对种子类原球茎时期，用Oruzalin+秋水仙素进行诱变处理，不仅方法简单易行，而且提高了诱变频率，达到80％以上，一次就可以获得数百株四倍体铁皮石斛种苗，满足多倍体选种之用，使多倍体育种成为铁皮石斛遗传改良、新品种培育的重要方法。
附图说明：
图1：铁皮石斛开花与授粉。
图2：铁皮石斛的朔果。
图3：铁皮石斛种子非共生萌发培养。
图4：铁皮石斛种子类原球茎。
图5：四倍体铁皮石斛染色体。
图6：四倍体铁皮石斛瓶苗。
图7：四倍体铁皮石斛移栽幼苗。
具体实施方式：
本发明突出的特点和显著进步可从下述实例中得以体现，但它不会对本发明作任何限制。
2005年4月自云南文山引入铁皮石斛，于当年5月20日进行同株异花人工授粉，授粉后的铁皮石斛放在25℃，50％自然光照条件下，至2005年10月22日，剪下蒴果，在超净工作台内，先用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，然后沿蒴果纵轴方向，用无菌解剖刀将蒴果切开，将铁皮石斛种子接种在1/2MS液体培养基中，25℃条件下，150rpm/min振荡培养。在培养20天后，转入含有0.01％Oryzalin(氨磺灵)+0.01％秋水仙素的1/2MS液体培养基中，诱变处理130小时，后转入1/2MS固体培养基上，在光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温25℃条件下继续培养，直至铁皮石斛幼苗分化。在瓶苗移栽前，先炼苗15天，然后按株分别取新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理4小时，后将根尖放入3∶1甲醇∶冰醋酸固定液中固定4小时以上，4℃冰箱中保存备用。用压片法制备染色体标本，卡宝品红染色液染色，显微镜观察，染色体数目2n＝76的幼苗为加倍成功的四倍体铁皮石斛幼苗，其他染色体数目的幼苗为非整倍体，不能使用。四倍体铁皮石斛幼苗，按一般二倍体铁皮石斛进行栽培管理，直至成苗期采摘。实验结果见图1-7。
Claims (7)
1.一种铁皮石斛四倍体的培育方法，其特征在于包括以下步骤：按常规方法进行铁皮石斛栽培管理，开花后采用人工方法授粉，取授粉后的铁皮石斛种子接种在1/2MS液体培养基中非共生萌发培养至种子原球茎呈球形时，再转入含有0.01％Oryzalin+0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行诱变处理，然后转入1/2MS固体培养基上，在光照条件下继续培养成苗分化；取新生长的根尖放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理，后转入甲醇：冰醋酸固定液中固定，用压片法制备染色体标本，卡宝品红染色液染色，选取染色体数目为2n＝76的幼苗为加倍成功的四倍体铁皮石斛，按通常铁皮石斛管理方法进行栽培管理。
2.一种铁皮石斛四倍体的培育方法，其特征在于包括以下步骤：
1)铁皮石斛的开花与人工授粉：按常规方法进行栽培管理，在铁皮石斛开花后以自花或同株异花进行人工授粉；
2)铁皮石斛种子非共生萌发培养：取授粉后6～8个月的铁皮石斛种子在超净台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞消毒10分钟，无菌蒸餾水冲洗5遍，用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，将种子接种在1/2MS液体培养基中，间歇振荡进行非共生萌发培养；
3)铁皮石斛四倍体诱导：将非共生萌发的种子转入含有0.01％Oryzalin+0.01％秋水仙碱的1/2MS液体培养基中进行诱变处理，然后转入1/2MS固体培养基上，在光照下继续培养，直至成苗分化；
4)多倍体的鉴定：在瓶苗移栽时，按株分别编号，取新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理4小时，后转入体积比为3∶1甲醇∶冰醋酸固定液中固定4小时以上，4℃冰箱中保存备用，用压片法制备染色体标本，卡宝品红染色液染色，显微镜观察染色体数目，选取染色体数目为2n＝76的幼苗，为加倍成功的四倍体铁皮石斛；
5)铁皮石斛四倍体的栽培管理：四倍体铁皮石斛按常规的二倍体铁皮石斛进行室外定植栽培管理。
3.按照权利要求2所述的铁皮石斛四倍体的培育方法，其特征在于步骤1)在铁皮石斛花开花5～10天内进行人工杂交授粉，取自花或同株异花花粉进行授粉。
4.按照权利要求2所述的铁皮石斛四倍体的培育方法，其特征在于步骤2)所述的非共生萌发培养是在透风半透光下，60次/分振荡培养，室温20～25℃条件下进行非共生萌发培养10～20天。
5.按照权利要求2铁皮石斛四倍体的培育方法，其特征在于步骤3)所述的诱变处理是种子非共生萌发培养铁皮石斛种子原球茎呈球形时进行诱变处理150-300小时。
6.按照权利要求2所述的铁皮石斛四倍体的培育方法，其特征在于步骤3)所述的继续培养是在周期14小时/天，光强度3000Lux，室温25℃条件下进行。
7.按照权利要求2所述的铁皮石斛四倍体的培育方法，其特征在于步骤5)所述的室外定植方法：待瓶苗长至3-4片叶时，特瓶盖打开，练苗4-5天，然后用清水轻轻地将培养基冼净，将瓶苗移栽在兰花土+火烧土+椰糠(重量比为1∶1∶1)基质中，放在阴凉处，按一般二倍体铁皮石斛栽培管理方法，进行精心管理，特别要注意病虫害的防冶。
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