CN101119737B

CN101119737B - 杏鲍菇、五加皮和三七的草本植物混合物提取物以及用于预防和治疗牙周炎的包含其的组合物

Info

Publication number: CN101119737B
Application number: CN2006800046738A
Authority: CN
Inventors: 金正根; 金世源; 金炯建; 高鲜一; 白东宪
Original assignee: Oscotec Inc
Current assignee: Oscotec Inc
Priority date: 2005-02-18
Filing date: 2006-02-17
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2026-02-17
Also published as: EP1848450A1; US20080038212A1; JP2008530203A; JP4949272B2; KR100661398B1; EP1848450A4; KR20060092651A; CN101119737A; US20100196288A9; US7794760B2; WO2006088324A1

Abstract

本发明涉及杏鲍菇、五加皮和三七的草本植物混合物提取物和含有所述草本植物混合物提取物作为活性成分的用于预防和治疗牙周疾病的组合物，更精确地，本发明涉及具有通过增加成骨细胞中护骨蛋白(OPG)的表达而抑制破骨细胞产生和活化，通过抑制破骨细胞增殖而防止牙槽骨破坏和保持牙周纤维细胞和牙龈成纤维细胞生长的活性的草本植物混合物提取物，和含有以上混合物作为活性成分的用于预防和治疗牙周疾病的组合物。

Description

杏鲍菇、五加皮和三七的草本植物混合物提取物以及用于预防和治疗牙周炎的包含其的组合物

技术领域

本发明涉及杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、五加皮(Acanthopanacis Cortex)和三七(Notoginseng Radix)的草本植物混合物提取物和含有所述草本植物混合物提取物作为活性成分的用于预防和治疗牙周疾病的组合物。

背景技术

牙周组织由牙槽骨、牙龈和牙周纤维组成。牙龈是口腔中牙齿支持器官的一部分，从其引起诸如龈炎的疾病。当疾病变严重而深度扩展到牙周支持器官中时，破坏附着在牙槽骨上的齿根和牙周纤维，导致牙槽骨本身的破坏。结果，牙周炎发展。

包括龈炎和牙周炎的牙周疾病的特征在于由细菌感染所引起的牙齿支持器官中的炎症，其带有出血、牙周袋形成和牙槽骨破坏的症状，导致牙齿损失。牙周疾病通过下列步骤进展：细菌菌落形成，细菌侵入到牙周组织中以及牙周组织的破坏。特别是，由于不良的口腔卫生，口腔细菌形成牙齿蚀斑，导致由于炎症的牙龈出血和口臭。当这些症状继续时，牙齿和牙龈之间的缝隙变得更大，导致形成牙周袋，在那里引起牙周疾病的细菌增殖，导致牙周炎。随着牙周炎发展，牙龈可以通过甚至更弱的刺激诸如刷牙而触发出血并且变得肿胀，并且有时它发展成带有巨大疼痛的急性炎症。所述炎症减少成骨细胞与胶原蛋白、钙和磷的羟基磷灰石形成骨的功能并且增加破骨细胞破坏并再吸收骨的功能。结果，牙槽骨在量上减少并进一步被破坏，导致牙齿损失。破骨细胞源自于骨髓中的单核细胞/巨噬细胞。单核细胞前体细胞通过血液循环，增殖并融合在骨内膜中而形成多核细胞[Scheven，B.A.A等，Nature，321：79-81，1986]。破骨细胞在特征上含有TRAP(耐酒石酸盐的酸性磷酸酶)，其是具有酒石酸盐耐受性的酸性磷酸酶并且被用作细胞化学标记酶从而从其它骨组织细胞区别破骨细胞[Minkin，C.，Calcif.Tissue Int.，34：285-290，1982]。

存在多种牙周疾病的原因。例如，牙周袋中的牙齿蚀斑的沉积为周围的厌氧革兰氏阴性细菌提供栖息地，导致那些细菌在牙周袋中深度增殖。增殖的厌氧革兰氏阴性细菌的毒素及其它产物由此可以直接破坏所述组织或刺激免疫系统。因此，通过多种相关的免疫应答破坏牙周组织并且引起炎症。作为针对这种炎症的防御机制，需要多形核白细胞和全身免疫应答。

即，作为厌氧革兰氏阴性细菌代谢的结果，高毒性硫化氢、氨和胺的水平在牙周组织中增加并且同时直接通过内毒素诸如脂多糖，一种细胞壁组分，破坏组织，或者通过细胞外的活性氧、前列腺素、白三烯(leukotrien)、组胺和白介素经由这些毒素刺激的体液的和细胞介导的免疫系统作用而发展牙龈中的炎症。细菌和白细胞诱导胶原酶的分泌，通过胶原酶的分泌，作为牙周组织基质的胶原蛋白分解，导致牙龈的衰退。如果不治疗，它发展成牙周疾病。

因此，针对厌氧革兰氏阴性细菌，一个基本的引发因素的杀菌活性和抑菌作用，毒素排出和损伤的牙周组织的恢复是预防和治疗牙周疾病的关键点。

为了治疗牙周疾病，除强调患者的口腔卫生之外，已经进行了非外科手术的或外科手术的刮牙、根面平整术、刮除术和利用新连接物的牙周组织再生。然而，这些外科手术治疗仅限于进行性疾病的治疗，对于预防疾病无效，并且必定要求患者看牙科门诊。大多数牙周疾病在无早期治疗的情况下发展成慢性疾病。已经用基本治疗进行了补充治疗诸如抗生素和局部缓释试剂给药，但是它具有由施用至全身的药物所引起的副作用的问题，其意味着也影响非目标区域，并且产生具有针对抗生素耐性的牙周疾病细菌(事实上，已经分离了显示抗生素耐性的牙周疾病细菌)。

为了克服外科手术治疗的有限应用和抗生素的副作用，需要具有恢复破坏的和损失的牙周组织活性的新试剂用于预防和治疗牙周疾病。

根据Melcher，涉及牙周组织再生的细胞来源是影响所述再生的关键因素。例如，如果涉及从骨起源的细胞，则发生骨结合。如果涉及结缔组织来源的细胞(例如牙龈成纤维细胞)，则发生齿根再吸收。如果涉及上皮组织来源的细胞，则生成长的上皮接合，说明牙周组织的再生是不令人满意的。如果涉及牙周纤维细胞来源的细胞，则可以预期最合乎需要的牙周组织再生[Melcher，A.H.，Journal of Periodontology，47(5)：256-260，1976]。

诱导的炎性细胞因子(TNF-、IFN-、GM-CSF、IL-2、IL-6)分泌的CD4+T细胞的活化刺激成骨细胞表面上的护骨蛋白配体的表达，引起在骨破坏中起至关重要作用的破骨细胞发生，基于这一事实，本发明人充分接受开发新试剂的必要性，所述新试剂具有通过抑制由细胞因子分泌所引起的炎症而防止牙槽骨受到破坏，增强成骨细胞的增殖和分化并且减少破骨细胞的形成和活化以保护牙槽骨，但是不影响牙龈成纤维细胞和牙周纤维细胞的增殖的活性[Kong，Y.Y.等，Nature 402：304-309，1999]。

因而，证实促进牙周组织再生的最好方式是促进牙周纤维细胞的生长并且保持牙龈成纤维细胞的正常生长。如果不可能满足以上两个条件，对于试剂，优选至少不影响两种类型细胞的生长，特别是通过牙龈成纤维细胞增殖防止软组织的备选愈合(Melcher，A.H.，Journal of Periodontology，47(5)：256-260，1976)。

因此，本发明人已经研究了草本植物药物以试验作为抑制细胞因子分泌、促进成骨细胞增殖和分化、并减少破骨细胞的形成和活化以防止牙槽骨被破坏的试剂的可能性。结果，通过证实杏鲍菇、五加皮和三七的草本植物混合物提取物可以抑制由牙周疾病带有的炎症但是不影响牙龈成纤维细胞和牙周纤维细胞的正常生长，以致所述提取物可以有效地用于预防和治疗牙周疾病，本发明人完成了本发明。

发明公开内容

技术问题

本发明的一个目的是提供杏鲍菇、五加皮和三七的草本植物混合物提取物。

本发明的另一个目的是提供用于预防和治疗牙周疾病的组合物，所述组合物含有所述草本植物混合物提取物作为活性成分。

技术方案

本发明提供杏鲍菇、五加皮和三七的草本植物混合物提取物。

本发明也提供用于预防和治疗牙周疾病的组合物，所述组合物含有所述草本植物混合物提取物作为活性成分。

附图简述

参考附图，将最好理解本发明优选实施方案的应用，其中：

图1是显示根据本发明实施方案实施例的本发明的草本植物混合物提取物以及每个独立的提取物对于护骨蛋白(OPG)在牙龈成纤维细胞中表达的影响的图。

图2是显示根据本发明实施方案实施例的本发明的草本植物混合物提取物对于破骨细胞的形成和活化的影响的图。

图3是显示根据本发明实施方案实施例的本发明草本植物混合物提取物对于人牙周纤维细胞的影响的图。

图4是显示根据本发明实施方案实施例的本发明草本植物混合物提取物对于人牙龈成纤维细胞的影响的图。

实施本发明的最佳方式

以下，详细描述本发明。

杏鲍菇，一种腐生植物，属于侧耳(Pleurotus)属，侧耳(Pleurotusostreatus)种，并且栖息在亚热带地区的草地。在欧洲杏鲍菇称为草原牛肝菌(Boletus of the steppes)或杏鲍菇(King oyster mushroom)。根据Dongeuibogam，韩国的传统医疗文献，杏鲍菇有甜味但是无毒并且产生强烈香味。它帮助胃和肠功能并促进能量循环，因此将杏鲍菇用作草本植物药物，用于麻木的手和足、疲劳和冷的膝盖和后背的症状。还没有完全鉴定杏鲍菇的组分，尽管已经报道了它作为降低胆固醇水平并具有抗癌活性的碱性食品的特征和性质。杏鲍菇含有许多蛋白质和维生素，瓦解综合征并对扁桃体炎、乳腺炎、和多种成年人疾病具有药用作用。特别是，作为碱性食品，杏鲍菇在日本有利地作为具有抗癌效果的健康食品。

五加皮是属于五加科(Araliaceae)的灌木，仅在北半球的亚洲远东发现。特别是，五加皮在韩国分类为受保护的野生植物，处于灭绝的边缘。将五加皮分成刺五加(Acanthopanax senticosus)、五加属(Acanthopanax)和韩国五加(Acanthopanax koreanum)。已经将五加皮的根和皮用作顶级药物，因为它们迄今未显示任何毒性或副作用。五加皮的叶含有具有药用效果的chiisanoside。五加皮的根不仅含有五加皮糖苷而且含有丁香苷和香豆素糖苷。五加皮含有作为五加皮糖苷的无梗五加苷B和D，以及增加免疫性的水溶性多糖。它的味道是苦和辣的，并且它具有加热东西的性质。已知其除去肝和神经系统中的痛风，滋补身体并增长元气。其已经药用于这样的疾病诸如Oro(由五脏器官虚弱所引起的疲劳)、Chilsang(由身体虚弱所引起的男子中显示的七种典型症状)和难以移动腿。五加皮的长期给药增加能量，保护胃，使精力充沛，净化心灵，增加意志力，防止衰老，帮助具有轻松的心脏并且净化身体中的血液。所以，五加皮已经用于治疗这样的症状如脊椎疼痛、男性阳痿、阴囊湿疹、女性闭经等。

三七(假人参(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen))是属于五加科的多年生草本植物的根。它小于人参并且具有7片叶。它的根是小的线鼓形状，并且它广泛地在中国南方的云南和四川种植。因为所述植物在三个枝上具有7片叶子，所以将它称为Samchil(三-七)并且经常称为Samchil人参，因为它的类似于高丽参(Korean ginseng)的外观。所述根具有3～8％的皂苷，并且它的主要组分是人参皂苷Rb₁、Rg₁和Re，和三七皂苷(notoginsenoside)R₁、R₂、Fa和Fc，但是也包括少量的人参皂苷R₂、b₂、d、e、c。不包含R₀或如果包含它，则它必须是最少的。三七中的精油组成比人参(Panax ginseng)中的少。三七另外包括齐墩果酸(oleanolie acid)。它的根具有止血和强心活性。从动物试验证实，所述根具有增加冠状动脉血流、减少氧消耗和降低血液中脂质与胆固醇水平的功效。三七也具有抗炎、镇痛和止血的功能，以致其不仅对于炎性疾病包括肝炎的治疗，而且对于损伤、割伤等的出血以及内出血的治疗是非常有用的。施用至伤口或口服给药产生同样的效果。

通过混合杏鲍菇、五加皮和三七，然后利用水、C₁～C₄醇或其混合物进行萃取，制备本发明的草本植物混合物提取物。在这里，所述醇优选是乙醇。所述草本植物混合物由25～55重量份的杏鲍菇、1～20重量份的五加皮和35～75重量份的三七，更优选35～45重量份的杏鲍菇、5～15重量份的五加皮和45～55重量份的三七，并且最优选40重量份的杏鲍菇、10重量份的五加皮和50重量份的三七组成。

可以通过常规方法诸如浸解、浸渍和利用适当的溶剂加热提取进行提取，并且特别优选在70～80℃乙醇提取3～5小时。

本发明草本植物混合物提取物的制备更详细地描述在下面。

在除去杂质以后，将杏鲍菇、五加皮和三七粉碎并混合，放在提取容器中。向其添加蒸馏水，接着是热水提取。在室温下使提取物冷却，用滤纸过滤，并在减压下浓缩。更精确地，优选在真空条件中在减压下在20～40℃进行浓缩。

本发明的草本植物混合物提取物增加护骨蛋白(OPG)的表达，从而抑制破骨细胞的形成(图1)。

本发明的草本植物混合物提取物减少认为是破骨细胞的TRAP(+)多核细胞的产生并且活化破骨细胞，从而抑制骨组织破坏(图2)。

本发明的草本植物混合物提取物有效支持人牙周纤维细胞和牙龈成纤维细胞的生长(图3和图4)。

因此，如上所述，可以将本发明的草本植物混合物提取物作为医疗或健康食品而有效用于预防和治疗牙周疾病，因为所述提取物具有低的毒性，增加成骨细胞中的OPG表达，抑制破骨细胞的形成和活化以保护牙槽骨免受破坏并且支持人牙周纤维细胞和牙龈成纤维细胞的生长。

本发明还提供用于预防和治疗牙周疾病的组合物，所述组合物含有杏鲍菇、五加皮和三七的草本植物混合物提取物作为活性成分。

本发明的组合物可以含有一种或多种显示与本发明草本植物混合物提取物同样或类似功能的活性成分。

本发明的组合物可以另外含有一种或多种补充本发明草本植物混合物提取物功能的活性成分。

本发明的组合物含有用于牙周疾病的预防和治疗组合物，所述组合物含有本发明的草本植物混合物提取物作为活性成分。

除以上提到的活性成分之外，本发明的组合物还可以包括用于给药的一种或多种药用载体。可以选择药用载体或者通过混合超过一种选自由盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、右旋糖溶液、maltodextrose溶液、甘油和乙醇组成的组的组分而制备。可以添加其它一般的添加剂诸如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等。为了制备可注射的溶液、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂，可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。还可以按照Remington′s Pharmaceutical Science(最新版)，Mack PublishingCompany，Easton PA中说明的方法以适合每种疾病的形式或根据成分制备本发明的组合物。

可以经口或胃肠外(例如，静脉内的、皮下注射的、局部的或腹膜注射)施用本发明的组合物。可以根据重量、年龄、性别、健康状态、饮食、给药频率、给药方法、排泄和疾病严重性确定组合物的有效剂量。基于三七提取物的剂量，剂量是0.1～100mg/kg每天，优选0.1～10mg/kg每天，并且更优选0.1～3mg/kg每天。给药频率是一天一次或优选一天几次。

本发明的组合物可以单独施用或者连同外科手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗和生物反应调节剂一起进行治疗以预防和治疗牙周疾病。

本发明的组合物可以包括用于预防和治疗牙周疾病的口服组合物，所述组合物含有草本植物混合物提取物作为活性成分。

本发明的草本植物混合物提取物对于牙周疾病诸如龈炎和牙周炎具有治疗效果，虽然它不是抗生素物质但是缓解牙龈上的炎症，并且使牙龈坚固以抵抗细菌感染，以致可以将所述草本植物混合物提取物制备为用于预防和治疗牙周疾病的口服组合物。

可以将含有本发明草本植物混合物提取物的口服组合物制备为一般制剂。特别是，可以将所述口服组合物制备为牙膏、口用漱口剂或漱口水(mouthrinse)。本发明的口服组合物可以通过与研磨剂、润湿剂、起泡剂、粘合剂、甜味剂、pH调节剂、防腐剂、药理学活性的成分、有香气物质、漂白剂、着色剂、溶剂等混合而配制。

本发明的组合物可以包括用于缓解牙周疾病的健康食品组合物，所述组合物含有草本植物混合物提取物作为活性成分。

这时，根据常规方法，本发明的草本植物混合物提取物可以原样加入或当其与其它食品或组分混合之后添加。由使用目的(预防、健康或治疗学的治疗)而确定活性成分的混合比。在生产含有本发明草本植物混合物提取物的食品或饮料的情况下，优选将所述提取物以小于100重量份，更优选小于50重量份添加到原料中。然而，当其长期施用以改善健康状况时，所述提取物的含量可以小于上述，但是有效剂量可以含有超过以上的量，因为本发明的提取物是很安全的。

在可应用的食品中不存在限制，可以例举肉类、香肠类、面包、巧克力、糖果、小吃、饼干、比萨饼、ramyun、面条、包括冰激凌的奶制产品、汤、饮料、茶、饮料(drinks)、酒精饮料和维生素复合物等，并且事实上一般生产的每种健康食品全部包括在内。

类似其它饮料，含有本发明组合物的健康饮料可以另外包括多种香料或天然糖类等。上面的天然糖类可以是单糖诸如葡萄糖和果糖，二糖诸如麦芽糖和蔗糖，多糖诸如糊精和环糊精，和糖醇诸如木糖醇、山梨糖醇和赤藻糖醇其中之一。作为甜味剂，可以使用天然甜味剂诸如奇甜蛋白和甜菊(stevia)提取物或人造甜味剂诸如糖精和阿司帕坦。天然糖类对本发明组合物的比率优选是0.1～20g比100ml，更优选1～10g比100ml。

除上述组分之外，本发明的组合物可以包括多种营养物、维生素类、电解质类、增香剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸(arginic acid)及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、用于加入到碳酸水的碳酸化剂(carbonators)等。本发明的组合物还可以包括天然果汁、果汁饮料和/或可加入到蔬菜饮料的果肉。全部提到的成分可以单独或一起添加。事实上那些成分的混合比无关紧要，但是通常，各自可以添加0.05～50重量份/100重量份本发明组合物。

实施方式

如下列实施例所示说明本发明的实际的和目前优选的实施方案。

然而，本领域技术人员在考虑公开内容上应当理解，在本发明实质和范围之内可以进行修改和改进。

<实施例1>草本植物提取物的制备

栽植的杏鲍菇、五加皮和三七是从批发干草药店购买的。

<1-1>草本植物混合物的醇粗提取物

将每种草药切成1～2cm的碎片，将其用流水清洗以除去杂质。将切断的草药磨碎。以4∶1∶5的比率混合杏鲍菇、五加皮和三七，产生粉末混合物。将200g的混合粉末放在3升的烧瓶中。利用2,000ml乙醇在回流搅拌情况下在78.5℃将加热提取进行4小时，重复三次。将提取溶液过滤并在减压下在40℃通过利用真空旋转式汽化器浓缩，产生草本植物混合物提取物。

<1-2>草本植物混合物的水粗提物

通过如实施例<1-1>中所描述的相同方式进行提取，不同之处在于将水用作提取溶剂代替乙醇。

<1-3>草本植物混合物的混合溶剂粗提物

通过如实施例<1-1>中所描述的相同方式进行提取，不同之处在于将混合溶剂(水∶乙醇＝25％∶75％)用作提取溶剂代替乙醇。

<1-4>每种草本植物提取物的制备

用如上所述的相同方式制备杏鲍菇、五加皮或三七的每种的提取物。<实验例1>用草本植物混合物提取物增加成骨细胞中OPG(护骨蛋白)的表达

进行下列实验以检验<实施例1>中制备的草本植物混合物提取物或每种独立的草本植物提取物对成骨细胞中护骨蛋白表达的影响。

<1-1>成骨细胞选择和细胞培养

将下列三个类型的细胞用于研究本发明的草本植物混合物提取物或每种独立的草本植物提取物对于成骨细胞增殖的影响。人类骨肉瘤来源的细胞系MG-63(ATCC号，CRL-1427)和小鼠肌肉来源的细胞系C2C12(ATCC号，CRL-1772)由美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection(ATCC，美国))供应。细胞在具有100％湿度的37℃、5％CO₂的培养箱中，在补充有10％FBS(胎牛血清)的DMEM(Gibco，BRL，美国)上培养。

作为原代培养细胞，使用从Sprague-Dawley大鼠颅盖获得的破骨细胞。确切地，从19天龄的Sprague-Dawley大鼠的颅盖提取额骨和顶骨，然后用含有0.1％胶原酶、0.05％胰蛋白酶和0.5mM EDTA的酶溶液分别在37℃顺序处理10分钟、10分钟、10分钟、20分钟和20分钟。分离I～V型细胞。在它们之中，将主要由具有成骨细胞特征的那些构成的类型IV和V型细胞混合并在补充有10％FBS的DMEM中原代培养。将细胞利用胰蛋白酶-EDTA溶液收集并计数，用于实验中进一步的用途。

<1-2>OPG(护骨蛋白)的表达抑制破骨细胞产生

将密度大约为10⁶细胞/20ml的MG-63细胞培养基从100mm细胞培养皿移去。用5ml的DPBS(Dulbeco改性的磷酸盐缓冲盐水)清洗所述皿。除去缓冲液并且将0.5ml的胰蛋白酶-EDTA涂敷在培养皿上，将其在CO₂培养箱中保持一分钟以取出细胞。将细胞放在5ml补充有10％FBS的DMEM中并充分混合。将所述溶液放在15ml试管中，接着在1500rpm离心5分钟。在离心完成后，除去上清液并将残留的细胞培养溶液转移到5ml补充有10％FBS的DMEM中并充分混合。用血细胞计数器计数细胞的数目，然后以10⁴细胞/孔的浓度分布在96-孔板中。在分布后24小时，用稀释在以0.22、0.66、2和6mg/ml的不同浓度含有青霉素/链霉素的DMEM中的草本植物提取物处理细胞。

为了增加试验结果的可靠性，用20mM的CaCl₂处理阳性对照以诱导比阴性对照中高2～5倍的OPG表达。在处理以后24小时，利用DPBS稀释(1/200)各自的上清液。将100μl的稀释溶液放在ELISA板中用于进一步的分析。使用OPG的ELISA试剂盒(OCT)并且在450nM测量光密度。根据下面的数学公式1，利用标准曲线将提取物处理组的OPG水平转变为对于提取物无处理的对照组中的OPG水平的相对％。

<数学公式1>

OPG表达率(％)＝(1-实验组的O.D.₄₅₀/对照组的O.D.₄₅₀)×100

(在式中，O.D.₄₅₀是指在450nm的光密度)

从对抑制破骨细胞产生的OPG表达的研究结果，证实本发明的草本植物混合物提取物剂量依赖地增加OPG的表达，并且在6mg/ml的浓度观察到最大OPG表达(高达230％)。并且所述草本植物混合物提取物促进OPG表达，优于每种独立的草本植物提取物(图1)。

<实验例2>草本植物混合物提取物对破骨细胞增殖的抑制

为了检验本发明的草本植物混合物提取物和每种独立的草本植物提取物是否可以抑制破骨细胞形成并减少细胞活性，本发明人进行了下列实验。

<2-1>破骨细胞前体细胞的分离和破骨细胞前体细胞分化成成熟破骨细胞

为了分离小鼠骨髓细胞，通过折裂颈部处死7-9周龄的雄性小鼠，然后在无菌条件下提取股骨和胫骨。除去软组织和切掉髂骨的两端。通过利用26G针，将1ml含有0.1％胶原酶(Gibco)、0.05％胰蛋白酶和0.5mMEDTA(Gibco)的酶溶液注射到髓腔的一端中。取出骨髓，接着搅拌30分钟。回收骨髓细胞并在补充有10％FBS的α-MEM(α-极限必需培养基)中预培养24小时。获得独立的细胞。将所述独立的细胞，破骨细胞前体细胞，接种到平板中(2×10⁵细胞/孔)，接着培养。将本发明的草本植物混合物提取物在8天培养期间处理到含有20ng/ml巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF，Peprotech，美国)和30ng/ml的核因子-B配体的受体激活剂(RANKL，Peprotech，美国)的α-MEM中。在培养完成后，固定细胞并进行TRAP染色以检验破骨细胞的产生。为了进一步检验破骨细胞的活性，研究取出细胞的再吸收区域。

<2-2>TRAP(+)多核细胞产生的抑制

在骨髓细胞培养完成后，用PBS清洗贴壁细胞并用柠檬酸盐-乙酸盐-甲醛固定5分钟。将细胞在37℃的含有萘酚AS-BI磷酸盐、不易褪(fast)Garnet GBC溶液和7mM酒石酸盐缓冲液(pH5)的乙酸盐缓冲液(pH5.0)中进一步培养一小时，接着用TRAP染色。具有超过3个核的TRAP(+)多核细胞被认为是破骨细胞。

在本发明中，已知含有破骨细胞前体细胞的骨髓用于诱导破骨细胞的分化，并且将TRAP(+)多核细胞认为是破骨细胞。用实施例1中制备的本发明的草本植物混合物提取物或每种独立的草本植物提取物处理破骨细胞前体细胞，接着培养8天。然后，测量TRAP(+)多核细胞的数目并从而根据下面的数学公式2计算抑制率。还测量了破骨细胞标记酶TRAP的活性。结果，相比于提取物未处理的对照，在草本植物混合物提取物处理组中抑制TRAP(+)多核细胞的形成高达100％。以上结果表明本发明的草本植物混合物提取物对于破骨细胞形成具有抑制作用(图2)。

<数学公式2>

TRAP(+)多核细胞产生抑制率(％)＝100-[(实验组多核细胞的数目/对照组多核细胞的数目)×100]

<实验例3>本发明草本植物混合物提取物对于牙龈成纤维细胞和牙周纤维细胞增殖的影响

进行下列实验以研究<实施例1>的草本植物混合物提取物或每种独立的草本植物提取物对于人牙周纤维细胞和牙龈成纤维细胞增殖的影响

<3-1>人牙周纤维细胞和牙龈成纤维细胞的选择和细胞培养

将从为了畸齿校正处理的正常健康人提取的前臼齿的牙周纤维在无菌条件下通过刮匙刮，然后将其放在培养皿上。向其添加少量补充有10％FBS(胎牛血清)的DMEM(Gibco，BRL，美国)，接着培养。还取出一部分牙龈以获得牙龈成纤维细胞，通过与上述相同的方式培养。通过在显微镜下观察，证实细胞是从所述组织移植的。在形成集落以后，除去每种组织样品并诱导单层方式的细胞生长，接着继代培养。

<3-2>人牙周纤维细胞和牙龈成纤维细胞的增殖

人牙周纤维细胞和牙龈成纤维细胞以20,000细胞/孔的浓度分布在24-孔板中，接着在5％CO₂培养箱中培养48小时。然后，处理以不同浓度在培养基中含有的草本植物混合物提取物和每种独立的草本植物提取物，接着进一步再培养48小时。在除去培养基以后，向其添加胰蛋白酶-EDTA。用血细胞计数器测量细胞的数目。通过下面的数学公式3，通过比较未用任何提取物处理的对照的增殖来测量增殖率。牙龈成纤维细胞和牙周纤维细胞的增殖在草本植物混合物提取物处理组中比各自用单独的草本植物提取物处理的组中更正常地保持(图3和图4)。

<数学公式3>

细胞增殖率(％)＝实验组的细胞数/对照组的细胞数×100

本发明的草本植物混合物提取物的每种成分不显示任何上述的性质，但是当它们混合时(作为草本植物混合物提取物)，混合物显示合乎要求的保持牙龈成纤维细胞和牙周纤维细胞正常增殖的性质。

本发明组合物的制备例描述在下文中。

<制备例1>药物制剂的制备

<1-1>散剂的制备

草本植物混合物提取物 2g

乳糖 1g

通过混合全部以上组分制备散剂并用它们填充气密袋。

<1-2>片剂的制备

草本植物混合物提取物 100mg

玉米淀粉 100mg

乳糖 100mg

硬脂酸镁 2mg

通过用制备片剂的常规方法混合全部以上组分制备片剂。

<1-3>胶囊的制备

草本植物混合物提取物 100mg

玉米淀粉 100mg

乳糖 100mg

硬脂酸镁 2mg

根据用于胶囊的常规方法，通过混合以上组分制备胶囊并用它们填充明胶胶囊。

<制备例2>漱口剂的制备

本发明的草本植物混合物提取物 0.01～1.0g

木糖醇 5～10g

乙醇 5～15g

山梨糖醇 5～15g

糖精钠 10～100mg

单氟磷酸钠 500～1000mg

十二烷基硫酸钠 100～200mg

聚山梨酯20 100～1000mg

欧薄荷香料 10～100mg

苯甲酸钠 10～100g

纯化水适量

染料适量

总共 100g

根据漱口剂的常规方法通过混合以上组分，制备对于牙周炎具有预防和治疗效果的口服组合物漱口剂。

<制备例3>食品的制备

含有本发明草本植物混合物提取物的食品制备如下。

<3-1>面粉食品的制备

通过将本发明的草本植物混合物提取物以0.5～5.0重量份添加到小麦粉，然后将所述面粉制成面包、蛋糕、饼干、薄脆饼干和面条而制备改善健康的面粉食品。

<3-2>乳制品的制备

将本发明的草本植物混合物提取物以5～10重量份添加到乳以制备乳制品诸如黄油、冰淇淋等。

<3-3>Sunsik的制备

通过常规方法将糙米、大麦、糯米和薏苡(coix)(job′s tear)胶质化，接着干燥。将干燥的混合物分散并磨碎，得到60-筛目尺寸的颗粒粉末。

将黑豆、黑芝麻和紫苏通过常规方法蒸煮并干燥。将干燥的混合物分散并磨碎，得到60-筛目尺寸的颗粒粉末。

将本发明的草本植物混合物提取物利用真空浓缩器在减压下真空浓缩，然后将其用热风干燥器喷雾干燥。用研磨器将干燥物质磨碎，产生60-筛目尺寸的颗粒粉末。

将制备的谷物、种子、和干燥的草本植物混合物提取物粉末全部以下列比率混合。

谷物(糙米30重量份，薏苡15重量份，大麦20重量份)，种子(紫苏7重量份，黑豆8重量份，黑芝麻7重量份)，草本植物混合物提取物的干燥粉末(3重量份)，灵芝(Ganoderma lucidum)(0.5重量份)，地黄(Rehmanniaglutinosa)(0.5重量份)

<制备例4>饮料的制备

<4-1>充碳酸气饮料的制备

将糖(5～10％)，柠檬酸(0.05～0.3％)，焦糖(0.005～0.02％)和维生素C(0.1～1％)混合，向其添加纯化水(79～94％)以制造糖浆。将制备的糖浆在85～98℃灭菌20～180秒，然后用冷却水以1∶4的比率混合。然后，将二氧化碳气(0.5～0.82％)给予所述混合物以制备含有本发明草本植物混合物提取物的充碳酸气饮料。

<4-2>保健饮料的制备

将酸性果糖(0.5％)，寡糖(2％)，糖(2％)，盐(0.5％)和水(75％)全部与所述草本植物混合物提取物均匀混合，接着灭菌。将所述混合物放在小容器诸如玻璃瓶或小瓶(pat bottle)中，产生保健饮料。

<4-3>蔬菜汁的制备

将5g本发明的草本植物混合物提取物添加到1,000ml的番茄或胡萝卜汁以制备保健蔬菜汁。

<4-4>果汁的制备

将1g本发明的草本植物混合物提取物添加到1,000ml的苹果或葡萄汁以产生保健果汁。

工业应用性

如上所述，本发明的杏鲍菇、五加皮和三七的草本植物混合物提取物增加成骨细胞中护骨蛋白(OPG)的表达，抑制破骨细胞的形成和活化，最终抑制破骨细胞的增殖并且支持牙齿环纤维细胞和牙龈成纤维细胞的增殖。因此，本发明的草本植物混合物提取物可以作为医药或保健食品产品而有效用于预防和治疗包括龈炎和牙周炎在内的牙周病。

本领域技术人员将理解，可以将上述说明中公开的概念和具体实施方案容易地用作修改或设计其它用于实施本发明相同用途的实施方案的基础。本领域技术人员也将理解，这样的等价实施方案不背离如后附权利要求中陈述的本发明的实质和范围。

Claims

1.一种35～45重量份的杏鲍菇、5～15重量份的五加皮和45～55重量份的三七的草本植物混合物提取物在制备用于预防和治疗牙周疾病的组合物的用途。

2.如权利要求1中所述的用途，其中所述草本植物混合物由40重量份的杏鲍菇、10重量份的五加皮和50重量份的三七组成。

3.一种用于预防和治疗牙周疾病的组合物，所述组合物含有35～45重量份的杏鲍菇、5～15重量份的五加皮和45～55重量份的三七的草本植物混合物提取物作为活性成分。

4.如权利要求3中所述的组合物，其中所述草本植物混合物由40重量份的杏鲍菇、10重量份的五加皮和50重量份的三七组成。