CN101039699B - 用于减小药物化合物毒性的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种或多种胆汁酸和水溶性淀粉转化产物或非淀粉多糖的澄清水溶液。本发明的溶液可以与具有一种或多种毒性作用的药物化合物一起施用于受治疗者。在一些实施方案中，本发明的溶液可以与涉及周围神经毒性的药物化合物(例如顺铂和/或苏拉明)一起施用于哺乳动物，以缓解或消除神经病变作用。

Description

用于减小药物化合物毒性的方法和组合物
技术领域
本发明涉及可用来改善物质(如化疗剂)毒性作用的一种或多种胆汁酸澄清水溶液。
发明背景
由于与之抵消的毒性作用，一些药物化合物(如药剂、药品)可能难以或不可能实现其全部治疗价值。有时，药物的一种或多种毒性作用可能如此显著，以致该药物不能安全地用于人体。还有时，可能不得不限制剂量以避免毒性作用。又有时，可能不得不缩短疗程。此外，紧急情况或威胁生命的疾病可能迫使病人完全承受这样的毒性作用以获得药物化合物的益处。
发明内容
因此，需要改善或消除药物化合物毒性的方法和组合物。
本发明涉及可改善或消除药物化合物毒性(如毒性作用)的方法和组合物。例如，一种改善或消除药物化合物毒性作用的方法可包括将药物化合物与胆汁酸组合物共同给药。在一些实施方案中，药物化合物可选自化疗剂、斯达汀、蛋白体抑制剂和抗逆转录酶病毒药。在一些实施方案中，共同给药可包括大致同时或在同一期间内施用一种或多种制剂。例如，共同给药可包括在单一组合物中施用药物化合物和胆汁酸。其也可包括同时施用多种组合物。作为替代方案，共同给药可包括在同一期间的不同时间施用多种组合物。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含如下组分的组合物：(1)胆汁酸、胆汁酸衍生物、胆汁酸盐或与胺结合的胆汁酸，(2)水，和(3)水溶性淀粉转化产物，其量足以使所述胆汁酸和所述淀粉转化产物在选定的pH范围内的任何pH下保持在溶液中。
本发明还涉及一种包含如下组分的组合物：(1)胆汁酸、胆汁酸衍生物、胆汁酸盐或与胺结合的胆汁酸，(2)水，和(3)水溶性非淀粉多糖，其量足以使所述胆汁酸和所述多糖在选定的pH范围内的任何pH下保持在溶液中。
本发明还涉及一种包含如下组分的药物组合物：(1)胆汁酸、胆汁酸衍生物、胆汁酸盐或与胺结合的胆汁酸，(2)水，(3)药学适宜量的药物化合物，和(4)水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖，其量足以使所述胆汁酸、所述药物化合物和所述碳水化合物在选定的pH范围内的任何pH下保持在溶液中。根据本发明的非限制性实施方案，药物化合物可选自顺铂、顺铂的药学活性衍生物或类似物、苏拉明、苏拉明的药学活性衍生物或类似物、化疗剂、斯达汀、蛋白体抑制剂和抗逆转录酶病毒药。
本发明还涉及溶液剂型的胆汁酸组合物。这些剂型可具有改进的胆汁酸生物利用率和可吸收性。当这些组合物还含有药物化合物时，它们也可具有改进的药物化合物的生物利用率和可吸收性。
本发明的一些实施方案中提供一种包含如下组分的组合物：(1)胆汁酸、胆汁酸衍生物、胆汁酸盐或与胺结合的胆汁酸，(2)水，和(3)碳水化合物，其量足以使所述胆汁酸组分和所述碳水化合物在选定的pH范围内的任何pH下保持在溶液中，其中所述碳水化合物为水溶性淀粉转化产物和水溶性非淀粉多糖的组合。在同时含可溶性非淀粉多糖和高分子量淀粉转化产物的实施方案中，二者各自的量应使得当其共同组合在组合物中时能足以使胆汁酸组分、高分子量淀粉转化产物、可溶性非淀粉多糖和药物化合物(如果有的话)在选定的pH范围内的任何pH下保持在溶液中。
本发明的一些实施方案中提供一种可增加对药物化合物的反应强度或增加药物化合物功效的组合治疗组合物。该组合物可实现药物化合物的较低剂量给药、在不同位点攻击疾病综合症、影响药物化合物的消除和/或改变药物的吸收。该组合物可导致或有助于减少药物的毒性和/或副作用。
附图说明
通过结合附图参照下面的描述，可对本发明实施方案及其优点获得更完整和透彻的理解，在附图中：
图1A为条形图，示出细胞存活率检测的结果，其中，N18D3杂合神经元与浓度逐渐增大的顺铂经培养48小时(与顺铂处理相比，*P＜0.05；**P＜0.001)；
图1B为条形图，示出细胞存活率检测的结果，其中N18D3杂合神经元与10μM的顺铂经培养标示时间；
图2A为显微照片，示出在对照溶液中培养的N18D3杂合神经元；
图2B为显微照片，示出在含10μM顺铂的溶液中培养的N18D3杂合神经元；
图2C为显微照片，示出在含20μM顺铂的溶液中培养的N18D3杂合神经元；
图3A为荧光显微照片，示出在对照溶液中培养并经Hoechst 33258染色的N18D3杂合神经元；
图3B为荧光显微照片，示出在含10μM顺铂的溶液中培养并经Hoechst 33258染色的N18D3杂合神经元；
图3C为荧光显微照片，示出在含20μM顺铂的溶液中培养并经Hoechst 33258染色的N18D3杂合神经元；
图4示出尺寸分级的DNA，分别来自市售DNA Ladder(“M”)、在对照溶液中培养的N18D3(“CTL”)、在含10μM顺铂的溶液中培养的N18D3(“Cis 10μM”)、和在含20μM顺铂的溶液中培养的N18D3(“Cis 20μM”)；
图5A示出了使用抗p53、p21、BCL-2、BCL-XL、BAX和β-肌动蛋白的抗体在对照溶液(“0”)中和在含浓度为1μM、2μM、5μM、10μM或20μM的顺铂的溶液中培养48小时后N18D3神经元的Western印迹；
图5B示出了使用抗p53、p21、BCL-2、BCL-XL、BAX和β-肌动蛋白的抗体在20μM的顺铂中培养标示时间后的N18D3神经元的Western印迹；
图6A为条形图，示出了细胞存活率检测的结果，其中，N18D3杂合神经元与顺铂和浓度逐渐增大的UDCA一起培养(*p＜0.05；**p＜0.001)；
图6B为条形图，示出了细胞存活率检测的结果，其中，N18D3杂合神经元与浓度逐渐增大的UDCA一起培养；
图7A为显微照片，示出了在对照溶液中培养的N18D3杂合神经元；
图7B为显微照片，示出了在含20μM顺铂的溶液中培养的N18D3杂合神经元；
图7C为显微照片，示出了在含20μM顺铂和1mg/mL UDCA的溶液中培养的N18D3杂合神经元；
图8A为荧光显微照片，示出了在对照溶液中培养并经Hoechst 33258染色的N18D3杂合神经元；
图8B为荧光显微照片，示出了在含20μM顺铂的溶液中培养并经Hoechst 33258染色的N18D3杂合神经元；
图8C为荧光显微照片，示出了在含20μM顺铂和1mg/mL UDCA的溶液中培养并经Hoechst 33258染色的N18D3杂合神经元；
图9示出了尺寸分级的DNA，分别来自市售DNA Ladder(“M”)、在对照溶液中培养的N18D3(“CTL”)、在含20μM顺铂的溶液中培养的N18D3(“Cis 10μM”)、和在含20μM顺铂和1mg/mL UDCA的溶液中培养的N18D3(“Cis+UDCA”)；
图10A示出了使用抗p53、p21、BCL-2、BCL-XL、BAX和β-肌动蛋白的抗体在对照溶液(“Vehicle”)、在含顺铂的溶液(“Cis(μM)”)、和在含UDCA的溶液(“UDCA(mg/mL)”)中培养的N18D3神经元的Western印迹；
图10B为条形图，示出了图10A中p53 Western印迹的光密度值；
图10C为条形图，示出了图10A中p21 Western印迹的光密度值；和
图11示出了在不经预处理(“CTL”)、经不含UDCA的溶液预处理(“Ve”)、或经含标示量的UDCA的溶液预处理后在含20μM顺铂的对照溶液中培养的N18D3神经元的蛋白印迹；
图12为条形图，示出了细胞存活率检测的结果，其中人A1杂合神经元与50μM的过氧化氢和浓度逐渐增大的UDCA一起培养。
详细描述
当药物化合物也表现出毒性时，其治疗益处可被减弱或甚至被否定。例如，虽然顺铂和苏拉明属于最有效的化疗剂，但它们与治疗后的癌症病人中的感觉神经疾病有关。顺铂诱导或苏拉明诱导的神经毒性的靶点为脊髓背根神经节(DRG)神经元。长期暴露于顺铂或苏拉明的动物在DRG神经元的轴突运输和微管组装中出现失调并出现DRG神经元中的凋亡性细胞死亡。顺铂产生氧自由基，氧自由基是化疗后的一种致病中间体。其它药剂如化疗剂、斯达汀、蛋白体抑制剂和抗逆转录酶病毒药可类似地靶向DRG神经元和/或可能与轴突退化有关。
虽然斯达汀可引起周围神经病，但发病率可能低。鉴于斯达汀在心血管保护方面的有益效果，这样的发病率可认为是相对无害的。沙立度胺神经病的发病率可能高(如在一些系列中高达四分之三)。虽然关于剂量依赖性的数据不确定，但较低的累积剂量可能对应较低的毒性。同沙立度胺一样，据报道，新型的蛋白体抑制剂硼替佐米(bortezomib)对治疗多发性骨髓瘤有效并与周围神经病有关。奥克赛铂和埃坡霉素是潜在毒害神经的新兴抗癌药物。同样，批准用于类风湿性关节炎治疗的新的疾病缓解剂来氟米特被报道引起神经疾病。抗逆转录酶病毒药可能与抗逆转录酶病毒中的毒性神经疾病(ATN)、主要特征为包括远端区域中长轴突“逆死性”轴突退化、无鞘神经纤维缺失和周围神经及脊髓背根神经节中不同程度的巨噬细胞浸润等感觉症状的病症有关。一些抗氧化剂可有效保护神经元免受神经毒性侵害，但这种神经保护机理尚未建立。可介导毒性和/或抗氧化剂神经保护的细胞因子包括p53、Fas和Fas配体(Fas-L)。
可能是熊胆汁的主要组分的熊脱氧胆酸(3α-7β-二羟基-5β-胆烷酸)(“UDCA”)可用作治疗和预防多种疾病(如肝病)的药物化合物。其医药用途可包括溶解射线可透过的胆石和治疗胆汁性消化不良、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、慢性活动性肝炎和C型肝炎。
尽管作为治疗活性剂和作为载体和/或辅药，胆汁酸具有特别有价值的治疗活性和医药用途，但胆汁酸的商业应用已经限于其中胆汁酸以固体形式存在的药剂(如片剂、胶囊和悬浮体)。这可能是由于胆汁酸在pH约1-8下不溶于水介质中的缘故。胆汁具有特别苦的味道和同样苦的余味且余味能持续数小时，这可能都是由于胆汁的不溶性引起的。能买到的少数几种水剂型都不稳定，且由于pH控制和保持问题因而用途非常有限。而且，一些市售的胆汁酸药物剂型已经显示出生物利用率不足。
本发明提供可溶性胆汁酸的澄清、稳定溶液，所述溶液能改善或减轻药剂的毒性。本发明的溶液可用作具有一种或多种毒性作用的药剂的递送载体。作为替代方案，本发明的溶液可在给药途径和时间两方面单独给药。在本发明的一些实施方案中，胆汁组合物阻断p53介导的毒性作用。在本发明的一些实施方案中，胆汁组合物阻断氧化过程介导的毒性作用。
在一个实施方案中，本发明的溶液可用来减少或消除药物化合物(如化疗剂、斯达汀、蛋白体抑制剂和抗逆转录酶病毒药)在人或人以外的哺乳动物中的神经毒性作用。本发明的溶液也可减少或消除抗肿瘤和/或免疫活性药(如顺铂、卡波铂、奥克赛铂、苏拉明、硫酸博来霉素、硫唑嘌呤、阿扎胞苷、白消安、盐酸阿霉素、紫杉醇、丝裂霉素、埃坡霉素、秋水仙碱、甲硝唑、氨苯砜(sapsone)、米索硝唑、柳氮磺胺吡啶、二硫化四乙基秋兰姆、硝酸呋喃妥因、他克莫司、核苷类似物、紫杉烷类、神经节苷脂、长春新碱、青霉胺、沙立度胺、阿糖腺苷、异烟肼、长春花生物碱(vincaalkaloids)、乙胺碘呋酮、哌克昔林和来氟米特)、蛋白体抑制剂(如硼替佐米(bortezomib))、抗逆转录酶病毒药(如去羟肌苷、扎西他滨、司他呋啶、拉米呋啶)和/或羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(如普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、罗苏伐他汀)的毒性作用。
本发明涉及一种包含如下组分的水溶液：(i)一种或多种可溶性的胆汁酸、水溶性的胆汁酸衍生物、胆汁酸盐或与胺结合的胆汁酸(统称为“胆汁酸”)，(ii)水，和(iii)一种或多种水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖，其量足以产生在期望的pH范围内的任意pH下均不形成沉淀的溶液。所述组合物可含有其自身具有药学效用的胆汁酸或胆汁酸盐。本发明的制剂可作为载体、辅药或增强剂，用于递送在所述期望的pH范围内在本发明的组合物中保持溶解的药物。或者，根据本发明的一些实施方案，所述组合物可包含不完全可溶的非胆汁酸药物。
在一些实施方案中，在从酸性到碱性的任何pH下胆汁酸和碳水化合物保持溶解而不沉淀是一个优点。这些胆汁酸水溶液体系基本无沉淀或颗粒物。本发明的另一优点在于所述水溶液体系在加入强酸或碱后不表现出物理性质的改变，如澄清度、颜色或气味的改变，即便在50℃的加速条件下贮存数月后再观察也如此。
在本发明的一些实施方案中，胆汁酸水溶液体系通过口服给药，因此其通过胃肠道到达肠中，不因与酸性胃液和碱性肠液接触而发生胆汁酸沉淀。这些溶解的胆汁酸制剂表明肠中完好的溶液体系可被有效和完全地吸收，从而经过肠肝循环。根据本发明的实施方案，胆汁酸溶解度(如沉淀和物理性质改变)受某些胆汁酸的羧酸侧链是否可被质子化(非离子化)、是离子化的或是简单羧酸的影响。
胆汁酸羧酸侧链的离子化状态在很大程度上影响这些水溶液体系中胆汁酸的疏水性和亲水性。在本发明的一些实施方案中，所述离子化状态通过调节pH来操纵以控制胆汁酸的毒性、吸收性和两亲性。一种或多种胆汁酸可作为治疗活性剂、作为药物辅药、作为药物载体或作为药物溶解度增强剂溶解于这些水溶液体系中。这些水溶液体系可制备为具有期望的pH而在长时间后没有沉淀或物理性质劣化缺点的口服剂、灌肠剂、漱口药、含漱液、鼻用制剂、耳用制剂、注射剂、灌洗剂、局部皮肤制剂、其他局部制剂和化妆品制剂。
适合的胆汁酸为任意类型的水溶性胆汁酸。胆汁酸盐为胆汁酸的任意水溶性盐。胆汁盐对磷脂和胆固醇具有更高的增溶能力，因此是更好的清洁剂。越疏水的胆汁盐可能对各种膜越有伤害，不论在体内还是在体外。胆汁酸的水溶盐可通过前述胆汁酸与胺反应形成，所述胺包括但不限于脂肪族游离胺，例如三亚乙基四胺、二亚乙基三胺、四亚乙基五胺、和碱性氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和氨、和氨基糖，例如D-葡萄糖胺、N-烷基葡萄糖胺、和季铵衍生物例如胆碱、杂环胺例如哌嗪、N-烷基哌嗪、哌啶、N-烷基哌啶、吗啉、N-烷基吗啉、吡咯烷、三乙醇胺和三甲醇胺。根据本发明，胆汁酸的水溶性金属盐、胆汁酸与环糊精及其衍生物间的包合物以及水溶性的O-磺化胆汁酸也包括在可溶性的胆汁酸盐之内。
根据本发明的一些实施方案，可溶性的胆汁酸衍生物可为在水溶液中溶解性同于或高于相应未衍生的胆汁酸的那些衍生物。胆汁酸衍生物包括但不限于在胆汁酸的羟基和羧酸基处与其他官能团(包括但不限于卤素和氨基)形成的衍生物。可溶性胆汁酸可包括胆汁酸与盐酸、磷酸、柠檬酸、醋酸、氨或精氨酸中的一种相结合的游离酸形式的水剂。
可根据本发明教导使用的胆汁酸包括但不限于熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、胆酸、猪脱氧胆酸、脱氧胆酸、7-氧代石胆酸、石胆酸、碘代石胆酸、碘代胆汁酸、牛熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺石胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和其甾核上羟基或羧酸基处的衍生物。
在本发明的一些实施方案中，主要的优点可在于溶液中胆汁酸的递送较常规制剂获得更高的胆汁酸体内水平。因此，胆汁酸的治疗潜能可较前述制剂更完整地获得。用其中胆汁不完全溶解的现有制剂可获得的胆汁酸体内水平较低并需要施用较大量的胆汁酸。由于胆汁酸完全溶于本发明的制剂，因此可获得较高的胆汁酸体内水平，甚至给药剂量更低。
在本发明的一些实施方案中，多种胆汁酸可用于单一制剂中。两种或多种不同疏水性的胆汁盐的混合物可起到中间疏水性的单一胆汁盐的作用。因此，两种不同疏水性的胆汁酸的混合物的去污性和毒性通常介于各个组分之间。
适用于本发明的碳水化合物包括水溶性淀粉转化产物和水溶性非淀粉多糖。根据本发明的一些实施方案，水溶性淀粉转化产物包括淀粉在不同的pH条件下部分或不完全水解直接得到的碳水化合物。非限制性的实例包括麦芽糊精、糊精、液体葡萄糖、玉米糖浆固体(液体葡萄糖的干粉)和可溶性淀粉，优选麦芽糊精或玉米糖浆固体，最优选玉米糖浆固体。例如，可用MALTRIN
Figure 200580034884110000210003_0
 M200(一种玉米糖浆固体)和MALTRIN
Figure 200580034884110000210003_1
 M700(一种麦芽糊精)，二者均由GPC
Figure 200580034884110000210003_2
(Grain Processing Corporation of Muscatine，Iowa)生产。对于本实施方案，术语“玉米糖浆”包括玉米糖浆和液体葡萄糖。如果淀粉转化产物是聚合型的，那么该聚合物有至少一个还原端和至少一个非还原端，并可为线型或支化的。分子量可为约100质量单位到106质量单位以上。高分子量的水溶性淀粉转化产物为分子量高于105的那些。
根据本发明的一些实施方案，水溶性非淀粉多糖可通过各种水解或合成机制处于不同的pH条件下。非限制性的实例包括葡聚糖、瓜尔胶、果胶、不能消化的可溶性纤维。如果是聚合型的，那么该聚合物有至少一个还原端和至少一个非还原端。所述聚合物可为线型或支化的。分子量为约100质量单位到106质量单位以上。优选分子量为105质量单位以上。
用于本发明的实施方案中的高分子量水溶性淀粉转化产物和/或水溶性非淀粉多糖的量至少为使制剂中所选胆汁酸在期望的浓度和期望的pH范围内可溶所需的量。在本发明的一些实施方案中，为防止UDCA沉淀所需的麦芽糊精对UDCA的大致最小重量比为6∶1(即100mL水中：1.2g麦芽糊精/0.2g UDCA，6g麦芽糊精/1g UDCA，和12g麦芽糊精/2gUDCA)。在本发明的一些实施方案中，麦芽糊精的大致最小量为30g/200mg鹅脱氧胆酸，12g/200mg 7-氧代石胆酸，10g/200mg胆酸和50g/200mg脱氧胆酸。在本发明的一些实施方案中，为防止胆汁酸从本发明的水溶液剂型中沉淀所需的液体葡萄糖(市售淡玉米糖浆)对UDCA的大致最小重量比为约25∶1(即100mL水中12.5g液体葡萄糖/500mg UDCA和200mL水中25g液体葡萄糖/1g熊脱氧胆酸)。在本发明的一些实施方案中，为防止胆汁酸从本发明的水溶液剂型中沉淀所需的液体葡萄糖干粉(玉米糖浆固体，如MALTRIN
Figure 200580034884110000210003_3
 M200)的大致最小量为100mL水中30g/1g熊脱氧胆酸和200mL水中约60g/2g熊脱氧胆酸。在本发明的一些实施方案中，为防止胆汁酸从本发明的水溶液剂型中沉淀所需的可溶性非淀粉多糖的大致最小量为100mL水中50g瓜尔胶/500mg熊脱氧胆酸和100mL水中80g果胶/500mg熊脱氧胆酸。高分子量水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖的最小所需量主要由溶液制剂中胆汁酸的绝对量而不是浓度决定。
在本发明的一些实施方案中，除淀粉转化产物和/或非淀粉多糖外，制剂还可包含环糊精。
在本发明的一些实施方案中，制剂还包含膳食纤维。膳食纤维的非限制性实例包括瓜尔胶、果胶、车前子、燕麦胶、玉米糠、纤维素和麦麸。
在本发明的一些实施方案中，制剂还包含乳化剂。对于本发明，术语“乳化剂”包括乳化剂和悬浮剂。乳化剂的非限制性实例包括瓜尔胶、果胶、阿拉伯胶、角叉菜胶、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、黄原胶和脱水山梨糖醇酯。
其中制剂不会沉淀出其胆汁酸、淀粉转化产物、可溶性非淀粉多糖或其药物化合物的选定的pH范围可为水溶液体系可得到的任意pH范围。优选该范围介于约pH 1和约pH 14之间，更优选介于约pH 1和约pH 10之间。还更优选该范围为，在根据给药方法足以使药物制剂从制备到给药到在体内吸收的过程中一直保持溶液状态的水溶液体系中可得到的pH范围的任意子集。因此，所述组合物可用作其中药物化合物在口腔、胃和肠中占主导的pH水平下保持溶解状态而不沉淀的药物制剂。尽管酸性条件下胆汁酸通常不溶，但在本发明的一些实施方案中，胆汁酸在酸性条件下作为游离胆汁酸保持溶解。
在本发明的一些实施方案中，所述药物为顺铂。其他药物化合物的非限制性实例包括激素、激素拮抗剂、止痛剂、退热剂、抗炎药、免疫活性药、抗肿瘤药、抗生素、抗炎剂、拟交感神经药、抗感染药、抗肿瘤剂和麻醉剂。进一步的非限制性实例包括靶向或作用于胃肠道、肝脏、心血管系统和呼吸系统的药物。药物化合物的进一步的非限制性实例包括胰岛素、肝素、降血钙素、氨苄青霉素、奥曲肽、柠檬酸西地那非、钙三醇、二氢速甾醇、阿朴吗啡、育亨宾、曲唑酮、无环鸟苷、盐酸金刚烷胺、盐酸金刚乙胺、西多福韦、地拉韦啶甲磺酸盐、去羟肌苷、泛昔洛韦、膦甲酸钠、氟尿嘧啶、更昔洛韦钠、碘苷、α-干扰素、拉米夫定、奈韦拉平、喷昔洛韦、三氮唑核苷、司他夫定、三氟尿苷、盐酸万乃洛韦、扎西他滨、齐多夫定、硫酸茚地那韦、利托那韦、甲磺酸奈非那韦、甲磺酸沙奎那维、D-青霉胺、氯喹、羟基氯喹、硫代葡萄糖金、硫代苹果酸金钠、金诺芬、左旋咪唑、氮烯唑胺、异丙肌苷、甲基次黄嘌呤单磷酸酯、胞壁酰二肽、二氮嗪、盐酸肼苯哒嗪、米诺地尔、潘生丁、盐酸异克舒令、烟酸、盐酸苄丙酚胺、酚妥拉明、甲磺酸多沙唑嗪、盐酸派唑嗪、盐酸特拉唑嗪、盐酸可乐定、硝苯地平、吗多明、乙胺碘呋酮、乙酰水杨酸、维拉帕米、地尔硫卓、尼索地平、伊拉地平、苄普地尔、异山梨醇二硝酸酯、季戊四醇四硝酸酯、硝基甘油、西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁、雷尼替丁、兰索拉唑、奥美拉唑、米索前列醇、硫糖铝、盐酸甲氧氯普胺、红霉素、铋化合物、前列地尔、沙丁胺醇、吡布特罗、硫酸特布他林、沙美特罗、氨茶碱、二羟丙茶碱、麻黄素、乙基去甲肾上腺素、新异丙肾上腺素、异丙基肾上腺素、二羟苯基异丙氨基乙醇、奈多罗米、胆茶碱、茶碱、比托特罗、非诺特罗、布地缩松、氟尼缩松、二丙酸倍氯米松、丙酸氟替卡松、可待因、硫酸可待因、磷酸可待因、氢溴酸右美沙芬、曲安奈德、孟鲁司特钠、扎鲁司特、齐留通、色甘酸钠、溴化异丙托品、奈多罗米钠、盐酸苯海拉明、氢可酮酒石酸氢盐、盐酸美沙酮、硫酸吗啡、乙酰半胱氨酸、愈创木酚甘油醚、碳酸铵、氯化铵、酒石酸锑钾、甘油、水合萜品、棕榈胆磷(colfoscerilpalmitate)、阿伐他汀钙、色伐他汀(cervastatin)钠、氟伐他汀钠、洛伐他汀钠、辛伐他汀、胡黄连、穿心莲、辣木、albizzia lebeck、鸭嘴花、姜黄、苦瓜、匙羹藤、阿江榄仁、印楝、青牛胆(tinosporia cordifolia)、甲硝唑、两性霉素B、克霉唑、氟康唑、卤普罗近、酮康唑、灰黄霉素、伊曲康唑、盐酸特比奈芬、硝酸益康唑、咪康唑、制霉菌素、硝酸奥昔康唑、硝酸硫康唑、二盐酸西替利嗪、地塞米松、氢化可的松、强的松龙、可的松、儿茶素及其衍生物、甘草甜素、甘草酸、倍他米松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、甲基强的松龙、生长抑制素、人胰岛素类似物(lispro)、胰高血糖素、胰岛素原、不溶性胰岛素、阿卡波糖、氯磺丙脲、格列甲嗪、格列苯脲、盐酸二甲双胍、瑞格列奈、甲苯磺丁脲、氨基酸、秋水仙碱、磺吡酮、别嘌呤醇、吡罗昔康、托美丁钠、吲哚美辛、布洛芬、双氟尼酸、甲灭酸、萘普生和曲恩汀。
可包括在本发明制剂中的药物化合物的其他实例为当加入到制剂中时保持可溶的任意化合物。当制剂中含另外的药物化合物时，溶解状态的胆汁酸可起到辅药、载体或某些药物活性剂的溶解度增强剂的作用，其中所述药物活性剂包括但不限于胰岛素(pH 7.4-7.8)、肝素(pH 5-7.5)、降血钙素、氨苄青霉素、金刚烷胺、金刚乙胺、西地那非、硫酸新霉素(pH 5-7.5)、阿朴吗啡、育亨宾、曲拉唑酮、三氮唑核苷、紫杉醇及其衍生物、松香油、和维甲酸，它们在酸和/或碱中可溶并稳定并可根据需要加入到本发明某些浓度的胆汁酸的这些水溶液剂型中。在酸和/或碱中可溶并稳定的某些药物活性剂，包括但不限于盐酸二甲双胍(pH 5-7)、盐酸雷尼替丁、西咪替丁、拉米夫定、二盐酸西替立嗪(pH 4-5)、金刚烷胺、金刚乙胺、西地那非、阿朴吗啡、育亨宾、曲拉唑酮、三氮唑核苷和地塞米松、氢化可的松、强的松龙、曲安西龙、可的松、烟酸、牛磺酸、维生素、天然存在的氨基酸、儿茶素及其衍生物、甘草提取物及其主要成分例如甘草甜素和甘草酸、水溶性铋化合物(如酒石酸铋钠)，它们在酸和/或碱中可溶并稳定并可根据需要加入到本发明含熊脱氧胆酸的这些水溶液剂型中。
本发明的一些实施方案可用pH调节剂实施。非限制性的实例包括HCl、H3PO4、H2SO4、HNO3、CH3COOH、柠檬酸、马来酸、酒石酸、乳酸、磷酸盐、eidetic acid和碱。
在本发明的一些实施方案中，所述制剂可用来治疗人类和哺乳动物疾病。本发明涵盖胃肠病、肝病、胆石和高脂血症的治疗。肝病的非限制性实例包括酒精性肝病和非酒精性肝病。胃肠病的非限制性实例包括慢性胃炎、反流性胃炎和消化性溃疡病。非酒精性肝病的非限制性实例包括原发性胆汁性肝硬化、急性和慢性肝炎、原发性硬化性胆管炎、慢性活动性肝炎和肝脏中脂肪的过度堆积。本发明还涵盖病毒、细菌和真菌病的治疗。在本发明的一些实施方案中，制剂被用来治疗和/或根除幽门螺杆菌感染。在本发明的一些实施方案中，制剂被用来治疗和/或根除C型肝炎病毒感染、流感A、流感C、副流感1、仙台(sendai)、风疹和假性狂犬病病毒。在本发明的一些实施方案中，制剂被用来治疗急性或慢性炎性疾病。炎性疾病的非限制性实例包括支气管炎、慢性咽炎和慢性扁桃体炎。在本发明的一些实施方案中，制剂被用来治疗高胆固醇血症。
在本发明的一些实施方案中，所述制剂被改性以使其可作为液体、固体、粉末或片剂给药。在本发明的一些实施方案中，所述制剂包含在溶液、糖浆、稠糖浆或膏体中。溶液的非限制性实例为其中麦芽糊精的浓度低于500g/L的麦芽糊精溶液。糖浆的非限制性实例为其中麦芽糊精的浓度介于500g/L和1.0kg/L(端点值包括在内)之间的麦芽糊精溶液。稠糖浆的非限制性实例为其中麦芽糊精的浓度介于1.0kg/L和1.2kg/L(端点值包括在内)之间的麦芽糊精溶液。膏体的非限制性实例为其中麦芽糊精的浓度高于1.2kg/L的麦芽糊精溶液。
本发明制剂的稳定性可通过测定不同pH和温度水平下包含可溶性胆汁酸、高分子量水溶性淀粉转化产物和水的制剂中相关胆汁酸随时间的浓度来评估。各种胆汁酸的保留时间(高效液相色谱)可根据需要加以调节以实现对复合样品(即含多种胆汁酸的样品)中所存在的各种胆汁酸的单独分析。也可通过测定试液的光散射性质进行稳定性试验。此外可采用公认的加速试验条件。
对本发明的溶液进行的所有稳定性试验均令人满意，因为在不同的pH水平下通过HPLC测得的胆汁酸浓度不随时间明显变化。特别地，所有受试的胆汁酸溶液制剂均在稳定性试验中表现出优异的结果，在试验期间无沉淀并无物理外观的改变。一些制剂保持稳定的时间超过2年。受试的根据本发明的水溶液剂型在加速条件下的不同pH条件下物理或化学性质均无改变，不论是否加入在盐酸溶液中稳定并可溶的药物和化学活性剂。因此，这些水溶液体系可以是对于药物活性胆汁酸制剂和/或药物递送制剂的特别有价值的药物剂型，在所述药物递送制剂中胆汁酸在不同的pH条件下起药物辅药、药物载体或通过胶束形成起药物溶解度增强剂作用，而没有稳定性问题，包括酸性条件下的沉淀问题。
实施例
本发明可通过下面的实施例得到更好的理解。但本领域技术人员将容易理解所描述的特定材料、组合物和结果仅用于说明本发明，而非旨在也不应理解为限制本发明及其实施方案的范围。
实施例1：胆汁酸溶液的制备
胆汁酸储液的制备：首先将UDCA(60g)溶于500mL NaOH(6.7g)溶液中。然后，在激烈搅拌下向所得澄清溶液中逐份加入375g麦芽糊精。然后通过在高能超声处理(750W，20kHz)下逐滴加入HCl而将pH调节至7.0到7.2之间。用可注射的蒸馏水将体积调节至1.0L。最后，用0.22μGP ExpressPlus膜在无菌条件下对所得澄清溶液过滤除菌。按标准制药方法稀释溶液到期望的UDCA浓度。
实施例2：N18D3杂合神经元细胞系的表征
用稳定的小鼠N18D3杂合神经元细胞系作为模型神经元细胞培养体系来研究顺铂诱导的神经病中涉及的病理机制。该细胞系为从四周龄Balb/C小鼠分离得到的小鼠DRG神经元和小鼠成神经细胞瘤细胞系N18TG2之间的杂合物。N18D3细胞在6-厘米培养皿中生长，培养基为Dulbecco的改良Eagle培养基，其中含5％胎牛血清和5％马血清，并且在37℃下、在含5％CO2的湿润空气中培养。
无性系的N18D3细胞具有其亲本成神经细胞瘤不具有的神经元样性质。例如，N18D3杂合神经元对高分子量神经丝蛋白(NF-H)表现出特异性的免疫反应性，表明这些神经元具有神经元的特异表型。免疫细胞化学表明N18D3杂合神经元还表达微管相关蛋白-2和低分子量及中等分子量的神经丝，并且全细胞钳实验表明N18D3杂合神经元具有钠通道活性。
实施例3：MTT试验
细胞成活率通过测定3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)的还原来评估，MTT还原为细胞吡啶核苷酸氧化还原态的指标。将N18D3细胞(1×105)接种到96孔板上的0.1ml培养基中，二十四小时后与顺铂和/或实施例1的UDCA溶液接触。然后在顺铂、UDCA或二者的存在下将细胞培养预定的一段时间。
每孔加10微升MTT溶液[5mg/ml，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中]，然后将板在37℃下培养3小时。用二甲基亚砜(Sigma)洗提染料后，以630nm为参照，在双束微量滴定板读数仪上测定570nm下的吸光值。
实施例4：用Hoechst 33258进行核染色
将在盖玻片上生长的N18D3细胞用顺铂处理预定的一段时间，用4％的多聚甲醛(pH 7.4)固定10分钟，用PBS洗涤三次，然后用10μg/ml的Hoechst 33258/PBS培养10分钟。核形态变化用Olympus共焦荧光显微镜检查。
实施例5：DNA断裂分析
从接触顺铂或顺铂加根据实施例1制备的0.1mg/mL UDCA溶液的N18D3杂合神经元中提取总DNA。为分析DNA断裂的方式，将细胞溶解在5mM的pH为7.4并含0.5％Triton X-100和20mM EDTA的Tris-HCl中。溶胞产物在16,090g和4℃下离心15分钟。上清液用苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)萃取，在含0.3M醋酸钠的乙醇中沉淀，并在Tris-EDTA缓冲液中重新悬浮。在1.2％的琼脂糖凝胶上对可溶的DNA样品进行电泳。
实施例6：顺铂诱导N18D3杂合神经元中的凋亡性细胞死亡
如根据实施例3的MTT还原分析所测得，以剂量和时间依赖性方式对顺铂处理的N18D3神经元诱导细胞毒性(图1A、1B、6A和6B)。接触20μM的顺铂36小时后，细胞存活率降至未经处理的对照细胞的40％(图1A)。顺铂诱导N18D3神经元中细胞死亡以及形态改变例如细胞收缩和细胞质空泡化(图2B、2C和7B)。如根据实施例4用Hoechst 33258染色所示，接触顺铂的N18D3神经元也出现凋亡性细胞死亡的特征性的浓缩和断裂的核改变(图3B、3C和8B)。此外，根据实施例5的DNA断裂分析，在经顺铂处理后，顺铂诱导了明显的180-到200-碱基对片段的核小体间DNA断裂(图4和9)。这些发现表明顺铂在N18D3杂合神经元中诱导的细胞毒性是由顺铂介导的凋亡病理机制引起的，但这并非要将本发明限制于任何特定的作用机制。
实施例7：UDCA溶液实质性降低N18D3杂合神经元中顺铂诱导的凋亡性细胞死亡
在顺铂处理前，先用根据实施例1的胆汁溶液对N18D3杂合神经元预处理一小时。如通过实施例3的MTT分析所知，用胆汁溶液(1mg/mLUDCA)预处理后与20μM的顺铂接触的神经元的存活率显著增加(图6A)。用根据实施例1制备的无UDCA的对照溶液进行的预处理对顺铂存在下的存活率没有影响(图6A最右边的条)。此外，如MTT分析所测得，实施例1的胆汁溶液对细胞存活率没有不良影响(图6B)。
而且，用所述胆汁溶液预处理的N18D3杂合神经元表现出较低的顺铂诱导的形态变化如细胞收缩和细胞质空泡化(图7C)，并且没有浓缩或断裂的核形态(图8C)。与顺铂接触36小时的胆汁预处理的N18D3杂合神经元没有观察到在不经胆汁预处理即与顺铂接触的细胞中的核小体间DNA断裂。
在该实施例中，用于减轻顺铂诱导的细胞毒性的UDCA的最佳浓度为1mg/mL(相当于0.1mM UDCA)。
实施例8：Western印迹分析
N18D3杂合神经元用PBS洗涤并在冰上的RIPA缓冲液(50nMTris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％sodium ceoxycholate，含1mM苯甲基磺酰氟的0.1％ sodium docecy sulfate，和1μg/mL抑胃肽A)中溶解15分钟。溶胞产物在18,890g下离心15分钟得到清液。如通过Bio-Rad蛋白测定测得的40微克蛋白质通过12％的丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠变性凝胶进行电泳。凝胶被转移至Immobilon(Millipore，Bedford，MA)并用供应商推荐的抗体进行检测。特异性蛋白的检测采用增强化学发光系统进行。
实施例9：胆汁酸溶液阻断p53和p21的累积
通过对以前认为参与凋亡的多种蛋白的表达水平进行分析，研究胆汁溶液在N18D3杂合神经元中发挥神经保护作用的关键效应物分子和调节机制。在用20μM的顺铂处理4小时后p53蛋白累积增加，24小时时达到最高水平，其后略微下降(图5B)。比较起来，在胆汁预处理的神经元中p53蛋白累积要低得多(图10A、10B和11)。
这些结果与实施例6和7中讨论的结果一致，包括同样的UDCA最佳浓度，即1mg/mL。并非要限制本发明于任何特定的作用机制，但这些结果表明顺铂诱导的p53累积是神经元凋亡性细胞死亡的主要原因之一，而胆汁溶液抑制p53累积是其发挥神经保护作用的关键条件。
与p53表达数据相平行，活化p53的下游靶蛋白p21在用顺铂处理后4小时后增加，8小时达到高峰并随后下降，这可能是半胱天冬酶的活性所致。实施例1的胆汁酸溶液显著抑制p21的累积(图10A、10C和11)。这一结果也与实施例6和7的结果一致，包括同样的UDCA最佳浓度，即1mg/mL。
相比之下，p53的其它下游基因产物，包括Bcl-2、Bcl-XL和Bax(Bcl2相关X蛋白)，在用顺铂处理后其表达水平没有变化(图10A)。同样，并非要限制本发明于任何特定的模型，但这些结果总的表明顺铂诱导的凋亡与神经元中p53的激活紧密相关，而本发明的胆汁溶液可经由p21调控p53信号通路而发挥其神经保护作用。
实施例10：本发明胆汁溶液的抗氧化性
通过测定MTT还原来评估细胞存活率；MTT还原为细胞吡啶核苷酸氧化还原态的指标。将人杂合神经元细胞系(1×105)(Neurobiology ofDisease 11，184-198，2002)接种到96孔板上的0.1ml培养基中，二十四小时后与实施例1的溶液接触。另外，还将一些细胞在与胆汁溶液接触1小时(预先培养)后再接触过氧化氢。其他细胞在与过氧化氢接触的同时接触胆汁溶液。根据实施例3进行MTT试验。
图12中示出预先培养细胞的结果，该结果与同时接触的细胞结果相似。相对未经处理的对照组，单独接触过氧化氢可导致大约75％的细胞死亡。然而，用本发明的UDCA溶液预先处理后，将近80％的杂合神经元在过氧化氢处理后存活。并非要限制本发明于任何特定的作用机制，但这些数据表明本发明的溶液具有抗氧化性。
附录
图1A的表
用顺铂处理48小时
对照：100±11.2(％，平均值±SEM)
顺铂1μM：89.0±9.7
顺铂5μM：67.3±12.3
顺铂10μM：47.2±8.4
顺铂20μM：39.0±3.6
顺铂50μM：37.1±5.7
图1B的表
用20μm顺铂处理
0小时：100±13.7
8小时：101.2±15.3
12小时：96.7±8.9
24小时：57.6±9.2
36小时：42.3±7.6
48小时：41.3±4.3
图6A的表3(n＝6)
对照＝100±13.7％
顺铂20μM＝38.2±4.6％
顺铂20μM+UDCA(0.1mg/mL)＝41.3±7.35％
顺铂20μM+UDCA(0.2mg/mL)＝61.3±8.67％
顺铂20μM+UDCA(0.5mg/mL)＝79.2±4.72％
顺铂20μM+UDCA(1.0mg/mL)＝86.7±6.84％
顺铂20μM+载体＝35.2±5.17％
图6B的表3(n＝6)
对照＝100±13.7％
UDCA(0.1mg/mL)＝97.6±15.7％
UDCA(0.2mg/mL)＝104.3±11.6％
UDCA(0.5mg/mL)＝102.7±4.8％
UDCA(1.0mg/mL)＝95.3±13.2％
载体＝103.2±9.7％
对于P53的图10B的表4(n＝3)
对照＝100±21.3％
顺铂20μM＝383.5±31.2％
顺铂20μM+UDCA(0.1mg/mL)＝386.9±13.5％
顺铂20μM+UDCA(0.2mg/mL)＝339.0±27.3％
顺铂20μM+UDCA(0.5mg/mL)＝198.9±19.7％
顺铂20μM+UDCA(1.0mg/mL)＝175.1+±15.2％
顺铂20μM+载体＝376.35±22.6％
对于P21的图10C的表4
对照＝100±9.7％
顺铂20μM＝209.7±11.8％
顺铂20μM+UDCA(0.1mg/mL)＝202.2±13.6％
顺铂20μM+UDCA(0.2mg/mL)＝186.7±10.3％
顺铂20μM+UDCA(0.5mg/mL)＝122.3±4.7％
顺铂20μM+UDCA(1.0mg/mL)＝119.8±8.8％
顺铂20μM+载体＝200.15±15.2％
*P＜0.05
**P＜0.01

Claims (10)

1.组合物在制备用于改善或消除药物化合物的p53介导的毒性作用的药物中的用途，所述组合物包含：
(I)对至少一种哺乳动物具有至少一种毒性作用的药物化合物；以及
(II)澄清水溶液，所述澄清水溶液包含：
(a)第一物质，其选自胆汁酸、胆汁酸盐和通过酰胺键与胺结合的胆汁酸；
(b)选自水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖的碳水化合物；
(c)水，其中所述第一物质和所述碳水化合物在选定的pH 1至pH10的pH值范围内的所有溶液pH值下均保持溶解状态，
其中所述药物化合物选自顺铂、卡波铂、奥克赛铂、苏拉明、硫酸博来霉素、丝裂霉素、埃坡霉素、柳氮磺胺吡啶、二硫化四乙基秋兰姆、长春新碱、阿糖腺苷、来氟米特和硼替佐米。
2.权利要求1所述的用途，其中所述p53介导的毒性作用是神经病变作用、轴突退化或其组合。
3.权利要求1所述的用途，其中所述第一物质选自鹅脱氧胆酸、胆酸、猪脱氧胆酸、脱氧胆酸、7-氧代石胆酸、石胆酸、碘代脱氧胆酸、碘代胆汁酸、牛熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和它们的盐。
4.权利要求1所述的用途，其中所述第一物质是熊脱氧胆酸或熊脱氧胆酸的钠盐。
5.权利要求1所述的用途，其中所述水溶性淀粉转化产物选自麦芽糊精、糊精、液体葡萄糖、玉米糖浆固体和可溶性淀粉。
6.权利要求5所述的用途，其中所述水溶性淀粉转化产物为麦芽糊精。
7.权利要求1所述的用途，其中所述水溶性非淀粉多糖选自葡聚糖、瓜尔胶、果胶、不能消化的可溶性纤维。
8.权利要求1所述的用途，其中所述药物化合物是顺铂。
9.权利要求1所述的用途，其中所述药物化合物是苏拉明。
10.一种澄清水溶液，所述水溶液包含：
(a)第一物质，其选自水溶性胆汁酸、胆汁酸盐和通过酰胺键与胺结合的胆汁酸；
(b)水溶性的淀粉水解产物；
(c)药学有效量的化疗化合物，所述化合物选自顺铂和苏拉明；以及
(d)水，
其中所述第一物质和水溶性的淀粉水解产物在pH 1至pH 10的pH值范围内的所有pH值下均保持溶解状态。
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