CN101036671A - 家蚕保健品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用5龄家蚕制备具有治疗和预防糖尿病功效的保健品。具体涉及将5龄家蚕用蛋白酶消化等制备方法以及按该方法制备的相关制剂。该制剂富含丰富营养物质，含人体所必须的氨基酸和有效的降血糖成分，对高血糖的预防效果和高血糖产生后(II型糖尿病)的治疗效果良好，是理想的血糖调节剂。本发明方法具有生产成本低，效果好，安全，服用方便，质量可控等优点。

Description

家蚕保健品及其制备方法

技术领域

本发明涉及保健品，具体涉及用5龄家蚕制备具有治疗和预防糖尿病功效的保健品及其制备方法。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种常见的慢性内分泌代谢性疾病，主要特征是高血糖和糖尿，临床上表现为多饮、多食、多尿和体重减轻的“三多一少”等症状，中医称之为消渴。

糖尿病是一种富贵病。近年来，随着人民生活水平的提高，糖尿病发病率逐年升高。国际上II型糖尿病占整个糖尿病比例的85％-95％，而中国的发病率在90％以上[见郭啸华等，高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾病特点，中国糖尿病杂志，2002，10卷5期，290-294]。糖尿病特别是II型糖尿病的治疗和预防成为医学工作者的一个重要课题。在中国、日本、韩国都有利用家蚕治疗糖尿病的民间疗法。在《本草纲目》中有“蚕蛹煎汁饮，止消渴”的记载。韩国针对家蚕具有治疗糖尿病的功效提出了以全蚕粉为降糖健康辅助食品及全蚕粉的制备方法，并在中国、日本、韩国同时申请专利(中国专利公告号1127637)。随后，中国有多家单位也申请了有关全蚕粉制备方法的相关专利。但至今尚未有服用方便，效果好的家蚕保健品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用家蚕制备服用方便、安全、质量可控的家蚕保健品。

本发明提供了一种具有调节血糖功能的家蚕保健品。

本发明目的是这样实现的：将5龄3日至7日活体家蚕快速冷冻后，用蛋白酶消化，分离消化产物。

本发明公布了一种用蛋白酶消化5龄家蚕制备具有预防高脂高糖高蛋白食物引起的高血糖症和对II型糖尿病有治疗功效的保健营养品的制备方法。

本发明所用材料如下：

家蚕：871×872和苏镇×春光，由中国农业科学院蚕业研究所提供蚕种，用桑叶饲养至5龄。胃蛋白酶(1∶250)、胰蛋白酶(1∶250)蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解酶(复合酶)、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等均为市场售产品。尿酸测定试剂盒(氧化酶法)，购自上海荣盛生物技术有限公司。葡萄糖测定试剂盒，购自上海生物制品研究所。实验动物昆明系小鼠购买于中国科学院上海实验动物中心。其它所有化学药品均为分析纯。切向流超滤器Vivaflow 50为vivascience公司产品，截留分子量5000。

本发明的方法包括下列步骤：

家蚕的处理(将饲养的5龄3日至7日活体家蚕装入塑料袋内，-20℃快速冷冻保存)→粉碎(组织粉碎机)→蛋白酶消化→煮沸灭酶活→分离水相(去除固相物质)→超滤(去除大分子物质)→质量检测→产品本发明产品可为口服液、胶囊、片剂或颗粒剂等口服制剂。

本发明方法具体有下列步骤：

(1)家蚕的处理：

5龄3日蚕至7日蚕均可，将饲养的活体家蚕装入塑料袋内，-20℃快速冷冻保存；

(2)蛋白酶消化：

将冷冻保存的家蚕取出，称重，按重量比为0.5-2的比例加去离子纯化水，用组织粉碎机粉碎，按蚕重的0.1-2％加入蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解酶(复合酶)、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等均可)消化，煮沸灭酶活，冷却，在酸性条件下pH2-5用2层纱布过滤，并挤干，收集水相；

(3)超滤

将上述过滤后的上清用NaOH调pH至6-7，通过蠕动泵用切向流超滤器过滤，去除未消化的蛋白质、脂肪大分子物质，滤过液备用；

(4)干燥：

将上述步骤(3)的滤过液经冷冻干燥制得粉末备用；

(5)制剂：

将上述步骤(3)的滤过液或步骤(4)的粉末按常规方法制得家蚕保健品制剂。

质量控制

1)、对α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果测定

①α-葡萄糖苷酶制备：处死小鼠，然后取小肠挤出食麇，肠壁用生理盐水冲洗干净，用玻片刮取粘膜，冰浴5Min后粉碎，重悬于磷酸缓冲液中(0.02M PBSPh7.2)，4000RPM 4℃离心10Min以除去大的细胞碎片，继续以10000RPM 4℃离心20Min，取上清作α-葡萄糖苷酶。紫外法测蛋白浓度后，于-20℃保存备用。使用时加入200μL 0.0067mol/L pH6.8的磷酸缓冲液，配成0.1mg/ml酶溶液。

②α-葡萄糖苷酶活力测定：将50μL酶溶液和50μL水混合，37℃预温水酶混合物5分钟，加入100μL底物(0.028M麦芽糖/0.1M马来酸pH6.8)，37℃水浴10分钟，加入40μlNa2CO3(0.1mol/L)中止反应。取20μl溶液用葡萄糖测定试剂盒测其中的葡萄糖含量。以在pH6.8，温度为37℃的条件下，每分钟水解麦芽糖释放1μmol葡萄糖所需的酶量为α-葡萄糖苷酶活力的单位，按下列公式计算：

α-葡萄糖苷酶活力(I/mg)＝葡萄糖浓度(μM)×0.00024÷0.005÷10

当α-葡萄糖苷酶活力(I/mg)≥10时，可以用于α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果测定

③α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果测定：将50μL酶溶液和50μL水(作为对照)或50μL保健液混合，37℃预温水酶混合物5分钟，加入100μL底物(0.028M麦芽糖/0.1M马来酸pH6.8)，37℃水浴30分钟，加入40μlNa2CO3(0.1mol/L)中止反应。取20μl溶液用葡萄糖测定试剂盒测其中的葡萄糖含量。按下列公式计算抑制率：

抑制率＝(对照管葡萄糖含量-实验管葡萄糖含量)÷对照管葡萄糖含量×100％

质量控制要求：抑制率≥80％

2)、氨基酸(多肽)含量测定

将保健液用水稀释100倍，以水为空白对照，紫外扫描仪测定260nm和280nm的光吸收值，按下列公式计算氨基酸(多肽)含量：

含量(mg/mL)＝(1.47×280nm吸收值-0.47×260nm吸收值)×100

质量控制要求：含量≥50mg/mL.

3)、尿酸盐含量测定

用上海荣盛生物技术有限公司生产的尿酸测定试剂盒(氧化酶法)测定尿酸盐含量，参照说明书并约加改动(即将反应体系由1mL改为2mL)进行：即按下表加入相关试剂后，混匀，37℃水浴5min，于波长520nm，以空白调零，测定吸光值。尿酸含量＝(样本吸光值/校准管吸光值)×6mg/L。，

	样本管(S)	校准管(AL)	空白(B)
				蒸馏水			50μL
样本	50μL
				校准液		50μL

试剂

2.0mL

2.0mL

2.0mL

质量控制要求：尿酸含量≤50mg/L

产品

产品两种，一为经质量测定后调整浓度的保健液，二为保健液的冻干粉末。

保健液：样品经质量测定后调整浓度，用0.22μm无菌滤膜过滤后，分装，室温保存。

冻干粉末：经过质量检测后的样品用冷冻干燥机冻干，分装，室温或4℃保存。

将本发明方法制备的冻干保健品送中国科学院上海生化与细胞生物学研究所用酸裂解后以氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量，结果该保健品中氨基酸含量为36.64％，各种氨基酸的组成见下表：

氨基酸	毫克分子	％	氨基酸	毫克分子	％
						牛磺酸TAU			异亮Ile		1.73
天冬Asp		4.33	亮Leu		2.60
						苏Thr		1.59	酪Tyr		1.56
丝Ser		1.49	苯丙Phe		1.93
						谷Glu		5.41	鸟ORN		0.30
脯Pro		0.70	赖Lys		2.61
						甘Gly		2.59	氨NH3
丙Ala		2.32	组His		1.54
						胱Cys		0.41	色Try
缬Val		2.36	精Arg		2.45
						甲硫Met		0.72

本发明方法制得的家蚕保健营养器经动物实验测试结果如下：

用本发明方法制备的保健品的降血糖动物实验结果

一、对二型糖尿病动物模型鼠的降血糖效果

材料：实验动物：雄性昆明小鼠(20g±2g)，购自复旦大学医学院。葡萄糖测定试剂盒，购自上海生物制品研究所；四氧嘧啶(Alloxan)购自Fluka公司，使用时称取0.210g，用10ml生理盐水溶解。糖尿病治疗药物拜糖苹购自第一医药商店。高糖高脂高蛋白饲料：由本实验室提供配方，海军医学研究所动物饲料厂制成小鼠饲料(饼干)。该饲料的配方如下：常规饲料112.5kg，食糖30kg，蛋黄粉：4.5kg，猪油3kg。保健液：参照本发明方法说明书制备，其氨基酸(多肽)含量为60mg/mL，对糖苷酶酶活力的抑制率为85.61％，尿酸含量为29mg/L。

方法：由正常小鼠尾静脉注射100μl制备四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，在注射48h后测空腹血糖，选取血糖值在200mg/dL以上者进行分组，分组时各组动物平均血糖值之差不大于10mg/dL，每组9只。共分3组，即保健液实验组分组，药物(拜糖苹)对照组，生理盐水对照组。分组后以高糖高脂高蛋白饲料饲养。保健液和药物均用饮水方法喂饲，即先观察各组动物每天的饮水量(约200mL)，再将所用剂量的保健液、药物、生理盐水分别用水稀释至200mL，放入饮水瓶内，供小鼠饮用，每天对所用饮水瓶进行煮沸消毒，换液一次。保健液的剂量为0.5mL/鼠/天，拜糖苹的剂量为0.5mg/鼠/天。喂饲28天后，禁食过夜，断尾采集空腹鼠尾静脉血，然后喂食，在喂食后2小时，摘眼球取血。待血液凝固后离心分离血清，用葡萄糖测定试剂盒测定血糖浓度。

结果：本发明方法制备的保健液在二型糖尿病动物模型鼠中具有良好的降血糖效果(见下表)。

组别	动物数	空腹血糖浓度(mg/dL)	餐后血糖浓度(mg/dL)
				实验组	9	127.97±9.96	154.79±32.26
药物对照组	9	113.77±12,56	133.72±19.57
				生理盐水对照组	9	151.86±10.52	262.83±25.26

二、对轻度二型糖尿病动物模型鼠的降血糖效果

材料与方法：所用试剂、实验方法同对二型糖尿病动物模型鼠的降血糖效果实验。实验动物：为对二型糖尿病动物模型鼠的降血糖效果实验时注射四氧嘧啶后血糖浓度未达到要求的昆明系小鼠，以常规小鼠饲料喂养。将动物分为2组，即保健液实验组和生理盐水对照组，两组在喂饲实验开始前的血糖值分别为168.98±29.23和163.51±31.36。按上述对二型糖尿病动物模型鼠的降血糖效果实验方法喂饲保健液和生理盐水，共喂饲40天。

结果：两组动物在喂饲40天后空腹6小时(即禁食6小时)和空腹16小时(即禁食16小时)的血糖浓度见下表。该结果表明本发明方法制备的保健液能显著降低轻度二型糖尿病动物模型鼠的血糖浓度(空腹6小时)，防止长时间饥饿(16小时)造成的血糖浓度降低，显示该保健液具有调节血糖功效。

组别	空腹6小时		空腹16小时
					动物数	血糖浓度(mg/dL)	动物数	血糖浓度(mg/dL)
	实验组	5	132.35±17.2	4					112.38±35.41
生理盐水组					6	156.68±28.24	6	86.18±23.60

三、对高糖高蛋白高脂肪食物所至高血糖的预防效果

材料：实验动物，雄性昆明小鼠(20g±2g)，购自复旦大学医学院。保健液，按本发明方法说明书制备，其氨基酸(多肽)含量为60mg/mL，对糖苷酶酶活力的抑制率为85.61％，尿酸含量为29mg/L。高糖高蛋白高脂肪饲料同同对二型糖尿病动物模型鼠的降血糖效果实验。

方法：实验动物用高糖高蛋白高脂肪饲料饲养。将动物分为两组，按上述对二型糖尿病动物模型鼠的降血糖效果实验方法喂饲保健液和生理盐水，共喂饲40天。

结果：两组动物在喂饲40天后空腹6小时(即禁食6小时)和空腹16小时(即禁食16小时)的血糖浓度见下表。该结果表明本发明方法制备的保健液对高糖高蛋白高脂肪食物所至血糖生高有良好预防效果。

组别	空腹6小时		空腹16小时
					动物数	血糖浓度(mg/dL)	动物数	血糖浓度(mg/dL)
	实验组	5	108.20±18.02	4					93.35±15.86
生理盐水组					6	120.56±18.43	6	104.58±19.89

本发明方法制得的保健品具有下列特点：

1，有效性，用该方法制备的保健品既保留了家蚕的丰富营养成分，又含有有效降血糖成分，具有降糖、提供营养、防止长时间空腹时的低血糖等功效；

2安全性，有效去除了可能引起过敏反应的大分子物质及家蚕中的大部分(80％)尿酸盐(尿酸盐是引起痛风的主要原因)，使其服用更为安全；

3，方便性，去除了家蚕中的非有效物质，服用更为方便；

4，质量可控，通过对氨基酸(多肽)含量测定、对糖苷酶活力抑制效果测定和尿酸含量测定来进行质量检测。

具体实施方式：

实施例一：

1、制备例1

52克冷冻保存蚕，加入150mL水，用组织粉碎机粉碎，煮沸5分钟，冷却后用NaOH调pH至8.0，按加入胰蛋白酶，混匀，消化3小时，煮沸2分钟灭酶活。冷却后用10NHCl调pH至4.0-5.0，加入胃蛋白酶，消化3小时，煮沸2分钟灭酶活。用2层纱布过滤，并挤干，收集水相，再用定性滤纸过滤，去除所有颗粒。调pH至7.0，超滤。得150mL产品，其氨基酸(多肽)含量为57mg/mL，对糖苷酶酶活力的抑制率为84.81％，尿酸含量为27mg/L。

在相关步骤中取50μL样品，用水稀释1倍，进行糖苷酶的抑制实验，结果表明该方法充分保留了家蚕中能抑制糖苷酶的有效成分(见下表)。

样品	抑制率(％)
		蚕粉碎后样品	92.12
胰蛋白酶消化后样品	91.51
		胃蛋白酶消化后样品	84.81
超滤后样品	86.65

取50mL保健液冻干，干物质重量为2.4g，既50g蚕可获得7.2g冻干保健品。

将本发明方法制备的冻干保健品送中国科学院上海生化与细胞生物学研究所用酸裂解后以氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量，结果该保健品中氨基酸含量为36.64％，各种氨基酸的组成见下表：

氨基酸	毫克分子	％	氨基酸	毫克分子	％
						牛磺酸TAU			异亮Ile		1.73
天冬Asp		4.33	亮Leu		2.60
						苏Thr		1.59	酪Tyr		1.56
丝Ser		1.49	苯丙Phe		1.93
						谷Glu		5.41	鸟ORN		0.30
脯Pro		0.70	赖Lys		2.61
						甘Gly		2.59	氨NH3
丙Ala		2.32	组His		1.54
						胱Cys		0.41	色Try
缬Val		2.36	精Arg		2.45
						甲硫Met		0.72

2、制备例2

156克冷冻保存蚕，加入150mL水，按上述方法消化，超滤后加水稀释至330mL，其，其氨基酸(多肽)含量为54mg/mL，对糖苷酶酶活力的抑制率为85.61％，尿酸含量为29mg/L。

实施例二：

保健品中尿酸减少量观察

由于家蚕无排尿器官，家蚕中尿酸含量较高，而尿酸盐是引起痛风的主要原因，因而我们对本发明方法制备样品的尿酸的减少量进行了测定：取2条家蚕(6.3g)，加入15mL 0.05M NaOH，均质器裂解，80℃水浴保温1小时，10000转/分离心20分钟，取上清，用0.05M NaOH稀释至相当于6.3g蚕制备的保健液体积(20mL)，用尿酸测定试剂盒(购自上海荣盛生物技术有限公司)测定该样品及保健液中的尿酸含量，结果该样品中尿酸含量为139.42mg/L，本发明方法制备保健液中的尿酸含量为27.20mg/L，说明用本发明方法制备保健液可以降低80.5％的尿酸，使该保健液的服用更为安全。

Claims (5)

1.一种具有调节血糖功能的家蚕保健品，其特征在于该家蚕保健品是通过下列方法制得的：

(1)家蚕的处理：

5龄3日蚕至7日蚕，将饲养的活体家蚕装入塑料袋内，-20℃快速冷冻保存；

(2)蛋白酶消化：

将冷冻保存的家蚕取出，称重，按重量比为0.5-2的比例加去离子纯化水，用组织粉碎机粉碎，按蚕重的0.1-2％加入蛋白酶消化，煮沸灭酶活，冷却，在酸性条件下pH2-5用2层纱布过滤，并挤干，收集水相；

(3)超滤

将上述过滤后的上清用NaOH调pH至6-7，通过蠕动泵用切向流超滤器过滤，去除未消化的蛋白质、脂肪大分子物质，滤过液备用；

(4)干燥：

将上述步骤(3)滤过液经冷冻干燥制得粉末备用；

(5)制剂：

将步骤(3)滤过液或步骤(4)的粉末按常规方法制得家蚕保健品制剂。

2、一种如权利要求1所述的具有调节血糖功能的家蚕保健品制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)家蚕的处理：

5龄3日蚕至7日蚕，将饲养的活体家蚕装入塑料袋内，-20℃快速冷冻保存；

(2)蛋白酶消化：

将冷冻保存的家蚕取出，称重，按重量比为0.5-2的比例加去离子纯化水，用组织粉碎机粉碎，按蚕重的0.1-2％加入蛋白酶消化，煮沸灭酶活，冷却，在酸性条件下pH2-5用2层纱布过滤，并挤干，收集水相；

(3)超滤

将上述过滤后的上清用NaOH调pH至6-7，通过蠕动泵用切向流超滤器过滤，去除未消化的蛋白质、脂肪大分子物质，滤过液备用；

(4)干燥：

将上述步骤(3)的滤过液经冷冻干燥制得粉末备用；

(4)干燥：

将上述步骤(3)的滤过液经冷冻干燥制得粉末备用；

(5)制剂：

将上述步骤(3)的滤过液或步骤(4)的粉末按常规方法制得家蚕保健品制剂。

3、根据权利要求2所述的具有调节血糖功能的家蚕保健品制备方法，其特征在于其中所述的步骤(2)中的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解复合酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。

4、根据权利要求2所述的具有调节血糖功能的家蚕保健品制备方法，其特征在于其中所述步骤(5)制得的家蚕保健品制剂为口服液、胶囊、片剂或颗粒剂。