CN100577170C - 吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂在制备治疗心肌梗死的药物中的应用 - Google Patents
吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂在制备治疗心肌梗死的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及通过给哺乳动物施用治疗有效量的化学Src家族酪氨酸激酶蛋白抑制剂治疗哺乳动物的以及该抑制剂化合物在制备治疗心肌梗死的药剂中的应用。心肌梗死可通过给哺乳动物施用预防量的抑制剂而得到预防。抑制剂优选是选自吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂、大环二烯酮类Src家族酪氨酸激酶抑制剂、吡啶并[2，3-d]嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂、4-苯胺基-3-喹啉甲腈类Src家族酪氨酸激酶抑制剂及其混合物。Src家族酪氨酸激酶抑制剂可用于制备治疗心肌梗死的药剂。还公开了含有化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂的制品。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是2002年11月18日提交的美国专利申请序列号为10/298,377的申请的部分继续，序列号为10/298,377的申请是于2000年3月29日提交的美国专利申请序列号为09/538,248的申请的部分继续，序列号为09/538,248的申请是1999年12月22日提交的美国专利申请序列号为09/470,881的申请的部分继续，依次序列号为09/470,881的申请是1998年5月29日提交的国际专利申请序列号为PCT/US99/11780的申请的部分继续，序列号为PCT/US99/11780的申请指定美国，该申请要求1998年5月29日提交的美国暂时专利申请序列号为60/087,220的申请的权益。这些申请的全部公开内容在此处引入作为参考。
政府权利的声明
本发明是按照与国家健康研究所的合同号为CA50286，CA45726，CA75924，CA78045，HL54444和HL09435的合同在政府支持下完成的。政府对于本发明拥有一定的权利。
技术领域
本发明通常涉及医学领域，尤其涉及治疗哺乳动物的心肌梗死的方法和组合物。
背景
由于损伤，疾病或其它对于血管的外伤造成的血管通透性是血管渗漏和与组织损伤相关的水肿的一种主要原因。例如，与脑血管意外(CVA)或其它脑或脊椎组织中的血管损伤有关的脑血管疾病是神经障碍的最普遍的原因，并且是残疾的一种主要原因。典型地，在CVA范围内对脑或脊椎组织的损伤会伴随血管渗漏和/或水肿。典型地，CVA可以包括由于脑缺血，中断正常的流向脑的血流所造成的损伤；由于对于血流的短暂的扰乱造成的脑功能不全；由于颅内或颅外动脉栓塞或血栓形成造成的梗塞；出血；以及动脉或静脉的畸形。缺血性中风和脑出血可能突然出现，并且相关的影响通常是反映在大脑损伤的区域上。(见The Merck Manual，16thed.Chp.123，1992)。
除了CVA，中枢神经系统(CNS)的感染或疾病也能影响脑和脊柱的血管，并且例如在细菌性脑膜炎，病毒性脑炎和大脑脓肿形成这样的实施例中可能伴随发炎和水肿。(见The Merck Manual，16thed.Chp.125，1992)。全身性疾病这样的生理状态也能够使血管变弱并且导致血管渗漏和水肿，这样的全身性疾病例如糖尿病，肾病，动脉硬化症，心肌梗死等。因此，血管渗漏和水肿是严重的与癌症截然不同并且不依赖于癌症的病状，这样的病状需要与多种损伤，外伤或疾病情况有关的有效的特异的治疗方法的介入。
心肌梗死是由于对心脏肌肉供血的堵塞造成的心脏组织的坏死。心肌梗死是在西方国家对就医的病人作出的最普遍的诊断之一。已经有报道在美国每年有大约一百一十万人被诊断为急性心肌梗死。心肌梗死的死亡率可能超过53％，而活下来的病人有66％不能够痊愈。即使让死亡率降低一个百分点一年就可以挽救3400个生命。心肌梗死和随之出现的水肿通常是当冠状动脉被堵塞，原来由被堵塞的动脉供给的心脏组织的氧供应被切断的时候出现。当血液供应被阻断，通常由被阻塞的动脉供应血液的组织变得缺血。最后缺氧的心脏组织开始相继死去(坏死)。Honkanen等在美国专利申请号为5,914,242的申请中描述了给予心脏缺血发作后的病人一定的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的酶抑制剂和相关多肽来减轻心肌梗死的方法。这样的酶和多肽很昂贵并且当作为药学上的应用时其制造加工和纯化非常复杂。
我们已经发现对于Src家族酪氨酸激酶活性的抑制可以为治疗心肌梗死提供一种有用的方法，该方法是通过减少水肿和冠状组织坏死来起作用的，因此可以减轻由于心肌梗死造成的组织损伤，这种坏死通常由于冠状动脉堵塞造成的。
发明概述
本发明涉及通过抑制Src家族酪氨酸激酶活性来治疗心肌梗死(MI)的方法。该方法包括利用有效剂量的一种Src家族酪氨酸激酶的抑制剂来治疗患有冠状动脉堵塞的哺乳动物的心脏组织。该哺乳动物可以是人类病人或非人类哺乳动物。被治疗的冠状组织可以是由于冠状动脉阻塞而缺血(即，血流的缺失)的心脏的任意一个部分。治疗性治疗是利用有效剂量的所需的药物组合物作用于目标冠状组织，该药物组合物包含化学(即，非肽类)Src家族酪氨酸激酶的抑制剂。这种方法用于治疗正在发生或已经发生损伤笥的血管阻塞区域附近的患病心脏组织是有效的。该方法使得通常由于冠状血管阻塞造成的组织坏死(梗死)得到缓解。
本发明的进一步的方面是关于制品，该制品包括包装材料以及包装材料所包含的药物组合物，其中该药物组合物能够缓解由于冠状血管阻塞造成的血流缺失所引起的冠状组织坏死。该包装材料包括说明该种药物组合物能够被用于治疗心肌梗死的标签，并且该药物组合物包括有效治疗剂量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，该抑制剂是存在于药学上可接受的载体中的。
适合于本发明目的的Src家族酪氨酸激酶抑制剂包括吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，例如4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑[3，4-d-]嘧啶(AGL1872)，4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑[3，4-d-]嘧啶(AGL1879)等；大环二烯酮类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，例如根赤壳菌素R2146，格尔德霉素，Herbimycin A等；吡啶并[2，3-d]嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，例如PD173955等；4-苯胺基-3-喹啉甲腈类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，例如SKI-606等；以及这些物质的混合物。
本发明的方法对于治疗心肌梗死是有效的。特别是，本发明的方法对于改善由于冠状血管堵塞而造成的心脏组织坏死有效，该血管堵塞可以是由于心脏的疾病，损伤或外伤造成的。
附图简述
这些附图构成本发明的一部分：
FIG.1是人类c-Src的cDNA序列(SEQ ID NO：1)，该序列最初由Braeuninger等在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88：10411-10415(1991)报导。该序列可通过GenBank Accession Number X59932X71157获得。该序列含有2187个核苷酸其蛋白编码部分从134位核苷酸开始到1486位核苷酸截止。
FIG.2是FIG.1中显示的人c-Src编码序列编码的氨基酸残基序列。(SEQ ID NO：2)。
FIG.3描述的是编码人类c-Yes蛋白的cDNA的核酸序列(SEQ IDNO：3)。该序列可通过GenBank Accession Number M15990获得。该序列含有4517个核苷酸其蛋白编码区从208位核苷酸开始至1839位核苷酸截止，翻译成的氨基酸序列在FIG.4中描述。
FIG.4描述的是c-Yes的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
FIG.5展示的是对Src，Fyn或Yes缺失的小鼠的皮肤中的VEGF引起的VP进行改良的Miles分析的结果。FIG.5A是处理过的耳朵的照片。FIG.5B是各种缺失的小鼠刺激的实验结果的图表。FIG.5C表示对处理过的组织洗脱的Evan’s蓝染料的量。
FIG.6是显示在Src+/-，Src-/-，野生型(WET)以及AGL1872(即4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑[3，4-d-]嘧啶)处理过的野生型小鼠的脑梗塞的相对大小的图片。剂量是每千克体重1.5毫克。
FIG.7显示的是对照小鼠和AGL1872处理的小鼠大脑的连续MRI扫描，结果显示利用AGL1872处理的动物(右图)比对照动物(左图)脑梗塞要少。
FIG.8描述了本发明优选的吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂的结构。
FIG.9描述了本发明优选的大环二烯酮类Src家族酪氨酸激酶抑制剂的结构。
FIG.10描述了本发明优选的吡啶并[2，3-d]嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂的结构。
FIG.11描述了已经使其受损来诱导心肌梗死的大鼠心脏组织的活体染色的显微照相图片；右侧的图片是对照，显示了明显程度的坏死；左侧的图片显示的是利用化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂(AG1872)处理过的组织，显示了明显的坏死程度的减轻。
FIG.12显示的是在不同抑制剂(AGL1872)浓度作用下心肌梗死的大小的柱状图。
FIG13显示的是利用抑制剂(AGL1872)处理后不同时间心肌梗死的大小的柱状图。
FIG.14显示的是在不同抑制剂(AGL1872)浓度作用下心肌水含量的柱状图。
发明详述
A.定义
此处所用的术语“氨基酸残基”是指氨基酸，该氨基酸的形成是通过将多肽在其肽键处进行化学降解(水解)形成的。此处描述的氨基酸残基优选以“L”型异构体的形式存在。然而，只要多肽所需的功能性质得以保留，“D”型异构体的残基可以替代任何L-氨基酸残基。NH2是指在多肽的氨基末端出现的游离的氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端出现的游离的羧基基团，这是与标准的多肽命名法保持一致的。(在J.Biol.Chem.，243：35552-59(1969)中有所描述并且在37CFR§1.822(b)(2)被采纳)。
应该注意到的是此处出现的所有的氨基酸残基序列其左和右的顺序是按照习惯的从氨基末端(N-末端)到羧基末端(C-末端)的方向。此外，应该注意到的是氨基酸残基序列开始和末尾的破折号表示的是与另一个序列之间的肽键，该序列具有一个或更多的氨基酸残基。
此处所用的术语“多肽”是指氨基酸残基通过α-氨基基团与相邻的氨基酸残基的羧基基团之间的肽键彼此相连的线性序列。
此处所用的术语“肽”是指多肽中彼此相连的氨基酸残基不超过50个的线性序列。
此处所用的术语“蛋白质”是指多肽中彼此相连的氨基酸残基超过50个的线性序列。
B.总论
本发明通常涉及：(1)发现VEGF诱导的血管渗透性(VP)被例如Src和Yes这样的酪氨酸激酶蛋白特异性地介导并且VP可以通过抑制Src家族酪氨酸激酶活性来调节；以及(2)发现在体内给予Src家族酪氨酸激酶抑制剂可以缓解由于疾病或损伤相关的血管渗透性增加而引起的组织损伤。
由于血管渗透性在多种疾病进程中所起的作用，所以该发现是很重要的。本发明涉及与血管渗透性可以通过抑制Src家族酪氨酸激酶活性来特异性的调控和改善这一发现。特别是，本发明涉及在体内给予Src家族酪氨酸激酶抑制剂可以缓解由于血管渗透性增加而引起的组织损伤这一发现，其中血管渗透性的增加是与疾病或损伤相关而与癌症或血管发生无关。
血管渗透性涉及到多种疾病的进程，其中组织损伤是由于血管外伤引起的VP的突然增加而造成的。因此，能够特异的调控VP的能力使得新的有效的缓解中风的不利影响的治疗方法得以实现。
可以从利用Src家族激酶抑制剂进行特异的抑制调节得益的，与疾病或损伤诱导的血管渗漏和/或水肿相关的实施例包括风湿性关节炎，糖尿病视网膜病，炎症疾病，血管再狭窄，中风，心肌梗死等。
已经有报道在全身利用VEGF受体IgG融合蛋白来中和VEGF蛋白可以减小脑缺血之后的梗塞的大小。这种效应是由于缓解了VEGF介导的血管渗漏产生的。N.van Bruggen等J.Clin.Inves.104：1613-1620(1999)。然而，VEGF不是血管渗漏增加的重要的调控因子，而已经发现Src是其重要的调控因子。此外，Src可以被除了VEGF之外的其它的刺激激活。可见例如，Erpel等，Cell Biology，7：176-182(1995)。
本发明特别与Src家族酪氨酸激酶抑制剂，特别是Src的抑制剂可以用于治疗心肌梗死的发现相关，这是通过改善哺乳动物中由于冠状血管堵塞而引起的冠状组织损伤来起作用的。
C.Src家族酪氨酸激酶蛋白
此处所用的以及在所附的权利要求中的术语“Src家族酪氨酸激酶蛋白”以及其语法上的变体是专指一种蛋白，该种蛋白与v-Src具有氨基酸序列同源性，其N末端是豆蔻酰化的，并且具有N末端多变区的保守结构域结构，在此之后是SH3结构域，SH2结构域，酪氨酸激酶催化结构域以及C末端调节结构域。术语“Src蛋白”和“Src”同指酪氨酸激酶Src蛋白的各种形式，该蛋白具有60kDa分子量，包括2个PKC磷酸化位点和一个PKA磷酸化位点的N末端可变区，比其它已知的Src家族亚类成员(例如，Yes，Fyn，Lck，和Lyn)具有与已知的Src蛋白更高的全氨基酸序列同一性并且该蛋白可以通过磷酸化与在SEQ ID NO：2中位于416位的酪氨酸对等的酪氨酸来活化。术语“Yes蛋白”和“Yes”同指酪氨酸激酶Yes蛋白的各种形式，该蛋白具有62kDa分子量，其N末端可变区没有任何磷酸化位点，与已知的Yes蛋白的全氨基酸序列同一性比与其它已知的Src家族亚类成员(例如，Src，Fyn，Lck，和Lyn)高并且该蛋白可以通过磷酸化与在SEQ IDNO：4中位于426位的酪氨酸对等的酪氨酸来活化。
优选的检测冠状缺血的分析方法包括通过结扎大鼠冠状动脉诱导缺血然后利用MRI，超声波心动描记术以及此类的技术来检测心肌梗死的大小，该种检测是按照以下详细描述的方式按时间检测的。
D.治疗和预防心肌梗死的方法
本发明的方法包括对缺血的冠状组织给予包含至少一种化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂的药物组合物。
合适于本发明目的的Src家族酪氨酸激酶抑制剂包括Src的化学抑制剂例如吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，大环二烯酮类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，吡啶并[2，3-d]嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，4-苯胺基-3-喹啉甲腈类Src家族酪氨酸激酶抑制剂。也可以使用这些抑制剂的混合物。
优选的吡唑并嘧啶类抑制剂包括，4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(有时也称为PP1或AGL1872)，4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(有时也称为PP2或AGL1879)等，这些物质的详细的制备在Waltenberger等，Circ.Res.，85：12-22(1999)中有所描述，相关的报道在此处引入作为参考。AGL1872和AGL1879的化学结构在FIG.8中显示。AGL1872(PP1)经Pfizer，Inc.的许可下可从Biomol获得。AGL1879(PP2)经Pfizer，Inc.的许可下可从Calbiochem获得。(也可见Hanke等，J.Biol.Chem.271(2)：695-701(1996))。
优选的大环二烯酮类抑制剂包括，例如根赤壳菌素R2146，格尔德霉素，Herbimycin A等。根赤壳菌素R2146，格尔德霉素，HerbimycinA的结构在FIG.9中显示。格尔德霉素可从Life Technologies获得。Herbinmycin A可从Sigma获得。根赤壳菌素可通过商业渠道从不同的公司获得(例如Calbiochem，RBI，Sigma)，该物质是一种抗真菌的大环内酯抗生素也可作为非特异性的蛋白酪氨酸激酶抑制剂起作用并且能够抑制Src激酶的活性。大环二烯酮类抑制剂包括12到20个碳的大环内酰胺或内酯环结构，包括α，β，γ，δ-双-不饱和酮(即二烯酮)部分以及氧化的芳基部分作为大环环状结构的一部分。
优选的吡啶并[2，3-d]嘧啶类抑制剂包括，例如PD173955等。Parke Davis发现的抑制剂PD173955的结构由Moasser等在CancerRes.59：6145-6152(1999)中描述，与此相关的报道在此处引入作为参考。PD173955的化学结构在FIG.10中显示。
优选的4-苯胺基-3-喹啉甲腈类抑制剂包括，例如可从Wyeth获得的SKI-606。4-苯胺基-3-喹啉甲腈Src抑制剂的实施例在U.S.PatentPublications No.2001/0051520和No.2002/00260052中有所揭示，相关的报道在此处引入作为参考。
其它的可以用于本发明的方法和组合物中的特异的Src激酶抑制剂包括PD162531(Owens等，Mol.Biol.Cell 11：51-64(2000))，该抑制剂是由Parke Davis发明的，但是目前无法从文献中获得其结构。
优选的化学抑制剂是吡唑并嘧啶抑制剂，更加优选的是AGL1872和AGL1879，最优选的化学抑制剂是AGL1872。另一个优选的Src抑制剂是称为SKI-606的4-苯胺基-3-喹啉甲腈。
另外的合适Src家族酪氨酸激酶抑制剂可以通过本领域中已知标准分析方法来鉴别和表征。例如，对于化学化合物进行筛选来寻找作为Src或其它酪氨酸激酶的有效的有选择性的抑制剂的工作已经完成，其结果是鉴定出可以用作Src家族酪氨酸激酶有效的抑制剂的化学部分。
例如，邻苯二酚已经被鉴定出来作为从自然产物衍生出来的许多酪氨酸激酶抑制剂的重要结合元件并且在一些化合物中发现其存在，这些化合物是通过组合的目标导向挑选c-Src的选择性抑制剂发现的。可见Maly等“组合的目标导向的配体结合：对于有效的选择性亚类的c-Src抑制剂的鉴定”PNAS(USA)97(6)：2419-2424(2000))。利用已知的对于抑制Src重要的部分作为起点基于组合化学来筛选候选抑制剂化合物，是一种有效的有力的分离和鉴定其它的Src家族酪氨酸激酶的化学抑制剂的方法。
但是，即使是对潜在的结合元件进行的谨慎选择也可被用于进行活性抑制剂的组合筛选，该选择根据其模拟多肽和核酸所具有的广泛功能性的能力而进行。例如，因为O-甲基肟库尤其适用于这一目的，该库可以很容易通过将O-甲基羟胺与任何可以大量购买的醛缩合来制备。O-烷基肟构成物适合大范围的功能性，该构成物在生理pH是稳定的。可见Maly等，supra。
虽然可以理解本发明的原理指出本方法即使对于非人类的哺乳动物也是有效的，可是用本发明所表达的方法来治疗的哺乳动物最好是人。在上下文中，哺乳动物被理解成为包括任何需要治疗组织损伤相关的血管渗漏或水肿的哺乳动物，农业用以及家养的哺乳动物，也包括人类。
优选的治疗方法包括给予患有心肌梗死的哺乳动物治疗上有效剂量的生理上可以接受的一种组合物，该种组合物含有化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂，特别是Src的化学(即非肽类)抑制剂。
优选的预防心肌梗死的方法包括给予具有患心肌梗死风险的哺乳动物预防剂量的生理上可以容忍的一种组合物，该种组合物含有化学的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，特别是Src化学(即非肽类)抑制剂。
给予象AGL1872或SKI-606这样的化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂的剂量范围可以在大约每千克体重0.1毫克到每千克体重100毫克的范围之内或者到达该活性试剂在该药物载体中的溶解的限度。优选的剂量是大约每千克体重1.5毫克。本发明所包括的药物组合物也可以通过口服的方式给予。示例性的口服的药剂形式包括胶囊，有或没有肠衣包被的药片等。
在急性损伤或外伤的实施例中，最好在事故发生之后尽快给予治疗。然而，在急性事件的实施例里，有效地给予Src家族酪氨酸激酶抑制剂的时间可以在损伤或外伤发生的大约48小时之内。优选的是在发生之后24小时之内给药，如果在6小时之内则更好。最优选的是在损伤发生大约45分钟之内给予病人Src家族酪氨酸激酶抑制剂。在损伤开始48小时之后给药可能适合于改善由于进一步血管渗漏或水肿引起的额外的组织损伤；然而，在这样的实施例中对于最初的组织损伤的有益的作用可能会减弱。
预防性的给药是用来预防与外科手术程序相关的心肌梗死，或在考虑达到易患病标准时被使用，给药可以在任何实际的冠状动脉堵塞之前或在能够引起这样的堵塞的事件过程中，例如像血管成形术这样的经皮心血管干涉。对于治疗导致冠状动脉血管堵塞的慢性疾病情况，给予的化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂可以被制成以持续剂量服用的形式。
通常，剂量可以随着病人的年龄，身体条件，性别以及损伤的程度的变化而变化，并且可以由在本领域的技术人员来决定。如果出现任何并发症，剂量也可以由该病人的医生来调节。
本发明的药物组合物优选的是：不经过消化道而用注射给予，或通过一段时间的逐渐灌注给予。虽然需要治疗的组织可以典型地通过全身给药的方式在体内达到并且因此最常用的治疗是通过静脉注射的方式给予治疗组合物，但是如果有可能目标组织含有目标分子也可以考虑其它的组织和运送方式。因此，本发明的组合物可以通过静脉，腹腔内，肌肉，皮下，腔内，透皮，口服来给药并且也可以通过蠕动方式给药。
例如，静脉给药通过注射单位剂量实施。术语“单位剂量”当用在本发明的关于治疗组合物的时候是指作为给予受试者的合适的物理上不连续的单支的剂量，每个单支药剂含有一定量的活性成分以及所需的稀释剂，该活性成分的量是通过计算的可以产生所需治疗效果而事先决定的；该稀释剂即媒介物或载体。
在一个优选的实施方案中活性试剂是通过静脉以单一剂量给予的。局部给药可以通过直接注射来完成或利用解剖学上分离的区室，分离目标器官系统的微循环，在循化系统中进行再灌注，或者以与患病组织相关的脉管系统的目标区域的以导管为基础的暂时性阻塞。
药物组合物通过合适于药剂类型的方式并且以治疗有效的剂量给予。此处用的以及所附权利要求中用的术语“治疗有效的剂量”和“预防用的剂量”当涉及到药物组合物的时候是指药物组合物的量可以引起受试者生物学或医学上的反应，该反应是临床医生所希望的(例如，对于组织坏死的改善或对于心肌梗死的预防)。
给予的量和时间依赖于接受治疗的受试者，依赖于受试者的身体系统对于活性成分利用的能力以及治疗效果需要达到的程度。给予的活性成分的准确的量依赖于从业者的意见并且对于每一个个体是不同的。然而，此处公开合适的全身应用的剂量范围并且该范围依赖于给药路径。合适的给药的方式和规律也是可变的，但是典型的是在第一次给药之后间隔一个或多个小时然后通过后续的注射或如口服这样的其它的给药方法给予重复的剂量。可选择的是，可以预期持续的静脉灌注足以将血液中的浓度维持在适于体内治疗的范围之内。
本发明的缓解组织损伤的方法可以减轻疾病的症状并且依赖于该疾病可以对治疗该疾病起一定的作用，其中该种组织损伤是由于与不同的冠状动脉疾病或与心脏的损伤或水肿相关的冠状动脉堵塞引起的。组织中坏死的程度以及因此本发明方法可以达到的抑制的程度可以通过多种方法来确定。特别是，本发明的方法不同寻常的适用于治疗心肌梗死。
对于由冠状血管堵塞引起的组织损伤的缓解可以在给予治疗组合物很短的一段时间内发生。在急性损伤和水肿的实施例中，大部分的治疗效果可以在给药之后的24小时之内观察到。然而，持续给药的效果不会很快的显现出来。
时间限制因子包括组织吸收的效率，细胞摄取的效率，蛋白转运或核酸翻译(根据治疗不同而不同)的效率以及蛋白定位的效率。因此，组织损伤调节效应可能在给予抑制剂之后仅仅一个小时之内发生。利用合适的条件心脏组织也可以附加的或延长的暴露于Src家族酪氨酸激酶抑制剂之中。因此，可以通过调节这样的参数来达到各种需要的治疗时间表。
E.治疗组合物
此处描述的Src家族酪氨酸激酶抑制剂可以被用来制备用于治疗心肌梗死的药物。这些抑制剂可以被包含在用于此处描述的治疗和预防方法的药物组合物中。本发明的药剂组合物含有生理可以耐受的载体与溶解或分散于其中的作为活性成分的此处描述的化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂。在优选的实施方案中，当为了治疗的目的给予哺乳动物患者该药物组合物的时候该组合物不具有免疫原性，这样的哺乳动物例如人类。
此处用到的术语“药学上可接受的”，“生理上可耐受的”及其语法上的变体当它们是指组合物，载体，稀释剂和试剂的时候是可互换的并且代表该物质可以被给予或用于哺乳动物而不会产生不良的生理反应，这样的生理反应例如恶心，头晕，反胃等。
含有溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备在本领域已经被人们充分理解并且不需要以剂型为基础来进行限制。典型的这样的组合物被制成可注射的液体溶液或悬浮液。也可以制成适合于在使用之前用液体溶解成溶液或悬浮液的固体形式。制剂也可以被乳化或制成脂质体组合物。
活性成分可以与赋形剂混合，该赋形剂是药学上可接受的并且与活性成分兼容的并且它的量适合于此处所描述的治疗方法。合适的赋形剂是例如，水，生理盐水，葡萄糖，甘油，乙醇或这些的相似物及其组合。另外，如果需要，该组合物可以包含大量的辅助物质例如润湿剂的或乳化剂，pH缓冲试剂等能够增强活性成分效果的物质。
本发明的治疗组合物可以包括活性成分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的游离的氨基基团形成的)该盐是与无机酸例如盐酸或磷酸形成的或与有机酸例如乙酸，酒石酸，苯基乙醇酸等形成的。与游离的羧基形成的盐也可以是与无机碱或有机碱形成的，这样的无机碱例如，氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化胺，氢氧化钙或氢氧化铁，这样的有机碱例如异丙胺，三甲胺，2-乙胺乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。
生理上可耐受的载体在本领域中是众所周知的。典型的液态载体是仅含有水和活性组分的无菌水溶液，或者含有缓冲液例如生理pH值的磷酸钠，生理盐水或两者都有，例如磷酸缓冲的生理盐水。更进一步，含水的载体可以含有多于一种的缓冲盐，及盐类例如氯化钠和氯化钙，葡萄糖，聚乙二醇以及其它的溶质。
液体组合物可以包含有或无水的液相。典型的这样的液相成分是甘油，例如棉花子油这样的植物油以及水-油乳化物。
本发明的化学治疗组合物包含生理上可耐受的载体与溶解或分散于其中的作为活性成分的Src家族酪氨酸激酶抑制剂。
合适的Src家族酪氨酸激酶抑制剂抑制Src家族酪氨酸激酶的酪氨酸激酶生理活性。一种更适合的Src家族酪氨酸激酶对于抑制Src蛋白活性具有主要的特异性并且次要地抑制最密切相关的Src家族酪氨酸激酶。
F.制品
本发明也关注制品，该物品是一种标记的容器用以提供治疗有效量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂。该抑制剂可以是单一包装的Src家族酪氨酸激酶抑制剂或者多于一种抑制剂的组合物。制品包括包装物质以及在包装物之中的药剂。该制品可能也包括两种或更多种亚治疗有效量的药物组合物，其协同作用结果是缓解由于冠状动脉堵塞造成的组织损伤。
此处所用的术语包装物质是指能够通过固定的方式保存药剂的材料，这样的材料例如玻璃，塑料，纸，金属箔等。因此，例如，包装物质可以是塑料或玻璃的小瓶，薄片的包装膜等容器，该容器是用来承装包括药剂在内的药物组合物的。
在优选的实施方案中，包装物质包括标签，该标签用切实的表述描述制品的内容以及其中所含有的药物组合物的使用。
在制品中的药剂可以是本发明的任意一种组合物，该组合物适合于提供一种Src家族酪氨酸激酶抑制剂，按照此处描述的已经公开出来的说明制成药学上可接受的形式。合适于本发明目的的Src家族酪氨酸激酶抑制剂包括Src的化学抑制剂，包括吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，例如4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(AGL1872)，4-氨基-5-(4-氯苯)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(AGL1879)等；大环二烯酮类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，例如根赤壳菌素R2146，格尔德霉素，Herbimycin A等；吡啶并[2，3-d]嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，例如PD173955等；4-苯胺基-3-喹啉甲腈类Src家族酪氨酸激酶抑制剂，例如SKI-606等；以及这些物质的混合物。制品包括大量的药剂无论是单支还是多次剂量都足以用于治疗此处指出的病症。
包装物质包括标签，该标签表明所含有的药剂的使用，例如通过抑制血管渗漏的增加来帮助治疗病症以及此处描述的相似的病症。该标签可以进一步包括使用说明以及市场所需的相关信息。包装物质可以包括用于储存药剂的容器。
实施例
以下关于本发明的实施例是以举例的方式提出的，当然不应该被解释成对本发明的特别的限制。而且，可以被本领域的技术人员所预计的本发明的现在已知或以后发展的变动应该被认为属于本发明的保护范围之内。
实施例1.VEGF-介导的VP活性依赖于Src和Yes，但是不依赖于Fyn
VP对于Src需求的特异性已经通过检验VEGF诱导的VP活性揭示出来，该VP活性是与例如Fyn或Yes这样的SFKs相关的，其中Fyn和Yes象Src一样，已知是在内皮细胞中表达(Bull等，FEBSLetters，361：41-44(1994)；Kiefer等，Curr.Biol.4：100-109(1994))。已经确认这三种SFKs在野生型小鼠大动脉中表达量相等。象src-/-小鼠一样，缺乏Yes的动物在VEGF诱导的VP存在缺陷。然而令人惊奇的是，缺少Fyn的小鼠保持了对于VEGF的高VP反应并且这样的反应与对照组动物的反应没有明显的区别。在src-/-或yes-/-小鼠中对VEGF诱导的VP的破坏表明特异的SFKs激酶活性对于VEGF介导的导致VP活性的信号事件是重要的但是对于血管发生则不是。
在src+/-(FIG.5A左边的图)或src-/-(FIG.5A右边的图)小鼠的皮肤中的VEGF的血管渗漏特性是通过对小鼠皮内注射生理盐水或VEGF(400ng)来决定的，该小鼠已经通过静脉注射Evan’s蓝染料。15分钟之后，对于皮肤斑点进行拍照(刻度图示为1mm)。星形物表示注射点。VEGF，bFGF或生理盐水的注射点周围的区域被解剖并且通过洗脱的Evan’s蓝色染料来对VP进行定量鉴定，该染料的量是通过在甲酰胺中58℃保温24小时然后在500nm测定吸收值来确定的(FIG.5B，左边的图)。在src+/-或src-/-的小鼠中测定已知的能够诱导炎症相关的VP的炎症介导因子(异硫氰酸烯丙酯)的能力(FIG.5B右边)。
VEGF诱导VP的能力在src-/-，fyn-/-或yes-/-的小鼠中通过Miles分析来比较(FIG.5C)。Miles分析的数据是以三个动物的平均值±SD的方式来表示的。src-/-和yes-/-的VP缺陷与对照组比起来有明显的统计学上的不同(＊p＜0.05，成对t检验)，然而在VEGF处理的fyn-/-小鼠或异硫氰酸烯丙酯处理的src+/-小鼠中VP的缺陷都没有明显的统计学上的不同(＊＊p＜0.05)。
实施例2.Src家族酪氨酸激酶抑制剂处理的小鼠以及src-/-小鼠与未处理的野生型小鼠相比在水肿或血管损伤相关的组织损伤方面有所缓解
Src家族酪氨酸激酶抑制剂降低血管损伤或例如中风这样的失调之后病理性血管渗漏及透过性。血管内皮是一种动态的细胞类型可以对于许多刺激进行反应来调节生理进程，这样的进程例如肿瘤血管发生过程中新血管的长出以及对于中风诱导的水肿和组织损伤过程中的血管壁渗透性的调节。
通过药物抑制Src路径达到的两个小鼠中风模型中血管渗透性的减少足以通过减少缺血诱导的血管渗漏来抑制脑损伤。此外，在基因缺失Src的小鼠中梗塞的体积也变小了，该小鼠的血管渗漏/通透性降低。综合合成的Src抑制剂的数据与在中风和其它相关的模型中的降低血管渗漏的遗传学证据的支持可以证实这种方法在缓解中风之后的脑损伤方面的生理相关性。利用这些信号级联的一系列的可得到的Src家族酪氨酸激酶抑制剂来抑制这些通路对于缓解由血管渗漏相关的组织损伤引起的脑损伤是具有治疗上的益处的。
我们使用了两种不同的方法来诱导局部脑缺血。两种局部脑缺血的动物模型已经被很好的建立起来并且在中风研究中被广泛应用。两种模型以前被应用于观察脑缺血的病理生理学以及测试抗中风的新药。
(a)利用2，2，2-三溴乙醇(AVERTINTM)麻醉小鼠并且将动物放置在加热垫上保持体温。在右耳和右眼之间切一切口。通过收缩颞肌使scull暴露出来并且在大脑中动脉(MCA)之上的区域进行颅骨钻孔。移除脑膜，利用加热的细丝形成堵塞物来堵塞右侧的MCA。可以使动物复原并放回其笼子里。24小时之后脑被灌注，切下来并被切成1mm的横断面。这些切片浸入2％的氯化2，3，5-三苯基四唑(TTC)的溶液中并且梗塞的脑区域可以通过被活(红色)组织包围的未染色(白色)组织来鉴定。梗塞的体积通过这些切片未染色区域的面积的和乘以其厚度来确定。
Src缺陷(Src-/-)的小鼠被用于研究在脑缺血中Src的作用。Src+/-小鼠作为对照。我们发现在Src-/-小鼠中在损伤之后24个小时梗塞的体积从对照的26±10mm3减小到16±4mm3。当C57B16野生型小鼠血管堵塞之后30分钟被通过腹腔注射1.5mg/kgAGL1872这样的效果更加明显。梗塞的体积从未处理组的31±12mm3减少到AGL1872处理组的8±2mm3。
(b)在第二个病灶性脑缺血模型中是通过将阻塞物放置在MCA的起点来堵塞MCA的。利用修饰的PE-50导管将一个完整的富含纤维蛋白的24小时龄的相应凝块放到MCA的起点。脑缺血的诱导是通过身体同侧半球的脑血流对比对侧半球脑血流的减少来证实的。24小时之后脑被切出，然后制备连续的切片并且用苏木精-曙红(HE)染色。梗塞的体积通过将连续的HE切片中梗塞的面积相加然后乘以每个切片之间的距离得到。
该研究使用的AGL1872的剂量(1.5mg/kgi.p.)是通过经验选择的。已知VEGF最初是在脑缺血3小时之后表达并且在12到24个小时之后达到最大值。在该研究中AGL1872是在梗塞发生30分钟之后给予的以便完全的阻遏VEGF诱导的血管通透性的增加。按照典型的VEGF表达时间进程，可能治疗有效的给予Src抑制剂的时间可以是中风之后12个小时。在血管通透性持续增加相关的疾病中Src抑制类药物的持续给药是很适宜的。
FIG.6是描述在损伤之后小鼠脑中梗塞的平均体积(mm3)的比较的结果，其中的小鼠分别为异源Src(Src+/-)，Src显性负突变体(Src-/-)，野生型小鼠(WET)或用1.5mg/kg AGL1872处理的野生型小鼠。
FIG.7显示的是诱导CNS损伤的处理之后分离的灌注的小鼠脑的连续MRI扫描的样本，其中AGL1872处理的动物的扫描的结果(右)与对照的未处理的动物的扫描结果(左)相比清楚的显示出更少的梗塞。
实施例3.Src家族酪氨酸激酶抑制剂处理的大鼠和Src-/-小鼠与未处理野生型的小鼠相比在冠状血管外伤或损伤相关的组织损伤方面有所缓解
心肌缺血是通过对Sprague-Dawley大鼠的冠状动脉左前降支结扎来诱导的。给予受影响的心脏组织化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂，这是通过在诱导缺血之后腹腔(i.p.)注射吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂AGL1872或SKI-606来完成的。高分辨率核磁共振成像(MRI)，干重测量，梗塞的大小，心脏的体积以及具有风险的区域是在手术后24小时测定的。存活率，超声波心动描记术是在手术后四周测定的，并且这些测定是在心肌梗死(MI)后接受剂量为大约1.5mg/kg的抑制剂i.p.注射的大鼠身上做的。
FIG.11显示的是利用曙红染料(活体染色)染色的处理过的(左)和对照(右)大鼠心脏组织的显微照相图片。对照组织(右上的图片)显示了在组织的外围很大区域的坏死。对比来看，处理过的组织(左上的图片)显示出非常小的坏死组织。
FIG.12显示的是处理过24小时之后梗塞大小(组织的毫克数)对抑制剂(AGL1872)的浓度所作的柱状图。最佳抑制水平是在剂量为大约1.5mg/kg时达到的。大约3mg/kg的剂量并没有在梗塞大小的缩小方面显示出任何明显的差别。
在手术后24小时之内利用Src家族酪氨酸激酶抑制剂进行治疗可以产生一种剂量依赖方式的梗塞大小和风险区域面积的减小的结果。对于梗塞大小的减小的最大值是在诱导缺血之后约45分钟给予抑制剂而抑制剂剂量为大约1.5mg/kg这样的条件下达到的，这个最大值为大约68％(p＜0.05)(FIG.13)。在诱导缺血6小时之后给予抑制剂仍然是有效的，其结果是梗塞的大小减小约42％(p＜0.05)。对Src的抑制作用并不干扰VEGF在缺血组织中的表达，这是通过免疫组化分析确定的。梗塞大小的减小伴随着心肌水含量的减少(大约5％+/-1.3％；p＜0.05)以及水肿组织体积的减小，这表明抑制Src所产生的有效的作用是与阻遏VEGF介导的VP相关，其中水肿组织的大小是通过MRI测定的(FIG.14)。利用超声波心动描记术分析手术后4周的大鼠发现部分缩短在对照组为约29％而在处理过的大鼠为约34％(p＜0.05)。非常重要地，处理过的大鼠的四周存活率出乎预料的高(100％)相对的对照大鼠的存活率为63％。
为了在体内准确测定水肿，我们使用了高分辨率的核磁共振成像(MRI)来评价大鼠的心脏组织，测定的大鼠是在持久的冠状动脉左前降枝(LAD)堵塞后使用或没使用Src抑制剂AGL1872或SKI-606处理的。由于其水含量的增加，可以预计水肿区域比未水肿区域有更长的T2舒张。为了量化水肿，将T2＞49ms(比正常的灌注心肌的平均值大两个标准偏差)的区域画出来。缺血发生之后一个小时，T2加权信号显示Src抑制不影响起始的细胞毒性水肿。然而24小时之后，对于T2图谱的计算显示出利用AGL1872处理对比于仅用媒介物处理对于梗塞相关的心肌水肿有47％的减小(n＝2AGL1872组，n＝1媒介物组)。这个结果与利用非缺血心肌的湿重/干重计算的ex vivo心肌水含量相关。AGL1872使得水肿和梗塞大小剂量依赖性减小，并且减小的最大值在1.5mg/kg达到(每组n＞5，p＜0.001)。在大鼠和小鼠中持久的堵塞之后给予SKI-606也可以使梗塞的大小明显的减小。为了测定这种反应的动力学，在堵塞后不同的时间给予AGL1872。在堵塞之后45分钟给药可以达到最大的作用(梗塞的体积减小50％)，而6小时之后给予治疗仍然可以提供25％的保护(每组n＝5，p＜0.05)。
超声波心动描记术显示与未处理的大鼠相比，Src抑制在四周之内提供了明显的维持部分缩短和舒张左心室(LV)直径的作用，这个结果表明受救治的组织的收缩功能能够维持很长时间。抑制Src也可以提供理想的收缩LV直径以及局部室壁运动(表1)。利用SKI-606Src抑制剂治疗也可以很好的影响局部缩短和局部室壁运动值(每组n＝7，p＜0.01)。为了衡量MI后的存活率，我们使用2岁龄的C57黑小鼠作为模型并用LAD结扎后的相当大的死亡率(＞40％)来表征。MI后45分钟给予AGL1872(1.5mg/kg)与对照组相比在四周之内的存活率升高(分别为91.7％vs.58.3％，每组n＝12)，表明抑制Src具有长时程的治疗效果。
表1.MI后的功能性恢复：超声波心动描记术
慢性心肌纤维化是在梗塞之后发生的并且是MI之后组织坏死程度的直接反映。为了衡量抑制Src对于MI后4周大鼠的纤维化的作用，利用可恢复的三色染色方法来进行对纤维组织的组织病理学分析。对比于对照组抑制Src可以使LV纤维化组织降低52％(19.1±2.2％vs.40.0±3.0％，n＝4每组，p＜0.01)。在接受Src抑制剂的样本中总是可以观察到对于心肌纤维和LV结构更好的保留，这表明抑制Src在MI之后起到长时间的保护心肌的作用。
为了确定暂时缺血之后抑制Src的效果，大鼠被诱导成堵塞然后被再灌注，在此之后24小时衡量心室膨胀功能以及梗塞的大小。对比于对照组利用AGL1872抑制Src可以保持左心室(LV)部分短缩并且可以减少梗塞大小(n＝4每组，p＜0.05)。缺血再灌注后梗塞的大小会减小18％，对比来看永久的堵塞之后会减小50％其中含氧量过低的刺激会促使VEGF的表达。另外，在缺血再灌注的模型中SKI-606(5mg/kg)可以使梗塞大小减小43％(每组n＝5，p＜0.01)。共同来说，这些数据显示出在短暂缺血之后抑制Src可以提供有益的效果。
实施例4.MI对于血管完整性以及梗塞周围区域存活力的影响.
由于VEGF表达主要在梗塞周围区域增加，观察了MI后3-24小时的Src抑制对于在这个区域小血管的超微结构的影响。表2提供了利用透射电镜显微技术检测的每组250根血管的结果的总结。对照于正常的心肌组织许多的在梗塞周围区域的损伤的实施例在梗塞影响的组织中被观察到。渗出血细胞(RBC，血小板以及嗜中性粒细胞)在间质组织出现，明显是从附近的血管漏出来的。一些内皮细胞(EC)会肿胀并堵塞部分血管内腔，经常显示出电子透明并且含有很多空泡。大的圆的空泡出现在内膜，经常比EC的厚度大几倍。肌细胞的损伤在MI之后随时间增加而增加并且在邻近的细胞间变化，这可以通过线粒体断裂，线粒体嵴混乱，胞内水肿以及肌丝解体来确认。受影响最大的肌细胞经常贴近受损血管或游离的血细胞。我们经常在MI后24小时观察到嗜中性粒细胞，该细胞参与到损伤的急性反应中并且可能对VEGF的产生起作用。
表2.MI或VEGF注射后对小鼠心脏组织超微结构的观察
对于每组来说，左心室组织在透射电子显微镜上检测4小时(大约250条微血管)并且观察按照以下的标准来计算和归类：
(a)EC屏障功能紊乱：裂缝，薄膜开口，渗出的血细胞；
(b)血小板激活/粘附：血小板，脱粒血小板，血小板簇，粘附于ECM的血小板
(c)EC损伤：电子透明EC，肿胀EC，大的EC空泡，堵塞的血管腔；以及
(d)心脏损伤：线粒体肿胀，嵴紊乱，肌丝解体。
MI之后三个小时经常可以在相邻的EG之间观察到裂缝，这种现象可以解释血细胞渗漏到周围的间质空隙。令人惊奇的是，许多裂缝被血小板塞住。一些血小板与EC之间暴露的基底层接触，然而在其它的实施例中基底层看起来也被破坏了。一些血小板被脱粒并且可能增强循环血小板的进一步激活，粘附以及聚集。尽管这些血小板栓可能防止进一步血管渗漏，这些栓子可能通过微血栓的形成来对降低小血管灌注起作用，这可能引起进一步的与缺血相关的组织疾病。
实施例5.MI和全身VEGF注射产生相似的血管反应
为了检测VEGF对于复合病理或MI的作用，VEGF通过静脉注射到正常的小鼠并且在30分钟后在超微结构水平上检测心脏组织。令人惊奇的是，VEGF诱导的内皮屏障功能紊乱以及血管损伤的程度都可以与在MI后在梗塞周围区域见到的相当(表2)。可以观察到很多的血小板粘附到EC基底膜还观察到肌细胞的损伤。全身注射VEGF后也发现脑损伤的相似的证据这表明这些效果可能是全身的。这些结果表明VEGF介导的VP平行于许多MI后的血管反应。
为了确定是否VEGF足以介导与MI相关的长时程病理，在2小时的过程中小鼠被注射了四次VEGF。这种处理产生的损伤与MI后24小时产生的相似。我们也发现血小板粘附，中性粒细胞以及明显的肌细胞损伤，还发现许多电子透明的EC，其中许多的EC肿胀并且堵塞血管内腔。综合在一起，暴露于VEGF30分钟足以诱导与MI后3小时所观察到的相似超微结构，MI后三个小时是VEGF在梗塞周围区域表达明显增加的时间。长时间的暴露于VEGF会引起与MI后24小时组织内引起的相似的血管重造。
Src缺乏的小鼠在MI之后得到保护并且在局部注射VEGF之后皮肤和脑没有VP出现的事实证实Src缺乏的小鼠得以免于受到心脏内VEGF诱导的VP的损害。与Src抑制剂的结果一致，在VEGF注射之后在pp60Src-/-小鼠中没有发现血管反应的征兆(表2)，这是与野生型小鼠中裂缝，血小板活性，受影响的EC以及渗漏出来的血细胞相比较的结果。对于所有反应的完全阻断证实在缺血性疾病过程中VEGF介导的Src活性起始会导致VP诱导的损伤的级联反应。
讨论
在小鼠中，全身给予VE-钙粘着蛋白抗体可以导致在心和肺中的VP，组织间隙水肿以及暴露的基底膜的病灶斑，该病灶斑在超微结构水平上看起来与给予VEGF后观察到的损伤相似。在小鼠胚胎中，β-连环蛋白无效血管包括变平的有小孔的内皮细胞，这与经常出血有关。以前的体外研究已经推测VEGF能调节VE-钙粘着蛋白的功能。在EC中在有血流的条件下，VE-钙粘着蛋白与Flk复合。为了在体内检测VE-钙粘着蛋白-VEGF复合物，从注射或不注射VEGF的小鼠制备心脏裂解液。这些裂解液先利用抗-Flk进行免疫沉淀，然后针对VE-钙粘着蛋白和β-连环蛋白进行免疫印记。在对照的小鼠中，在血管内观察到预先存在的Flk，β-连环蛋白以及VE-钙粘着蛋白之间的复合物。该复合物在VEGF刺激之后2-5分钟被很快的破坏了并且在体内在血管中15分钟之内重新结合。该复合物的解离的时间表完全平行于Flk，β-连环蛋白和VE-钙粘着蛋白的磷酸化也平行于β-连环蛋白从VE-钙粘着蛋白上的解离。由于在Src抑制剂预处理的小鼠中VEGF刺激后Flk-钙粘着蛋白-连环蛋白信号复合物保持完整并且β-连环蛋白和VE-钙粘着蛋白的磷酸化没有发生，所以这些VEGF介导的事件是Src依赖的。在注射碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)之后没有观察到这些事件，该因子是一种相似的抗原性生长因子并且不会促进血管渗透性。
尽管单一注射VEGF时会产生可逆的，快速的并且短暂的信号反应，该信号反应会在15分钟之内恢复到基线，但是四次VEGF注射(间隔三十分钟)可以产生长期的信号反应。例如将暴露VEGF的时间延长后Flk-连环蛋白的解离以及Erk的磷酸化会持续。这种模型可适用于MI后的生理条件，在该生理条件中由于组织缺氧VEGF的表达增加并且会持续几天。
在急性MI或全身给予VEGF后的VP中Src起到生理和分子的作用。MI后的结果很显然一部分是由于梗塞区域周围灌注的心脏微血管的超渗透性。这些血管被VEGF不利影响并且经历一种Src依赖的VP增加并且最终损伤到周围的肌细胞，该种VP增加会导致血管堵塞或萎陷。排除再灌注中的血管开放，以上的结果与已有报导的MI后不足的组织灌注以及高死亡率是一致的。MI后6小时抑制Src仍然可以提供针对VEGF诱导的VP的明显保护，这表明本方法很适用于临床方向。在MI之后给予Src抑制剂看起来是通过阻断Flk-钙粘着蛋白-连环蛋白复合物的解离来限制VP的，该复合物具有内皮屏障的功能。
超微结构数据表明MI后VEGF开始的作用包括内皮连接的打开，内皮基底膜的暴露。血小板粘附于这些位点，其中很多血小板脱粒并且活化。这引起我们的兴趣由于血小板含有VEGF，当VEGF随血小板活化释放的时候会增强VP反应。事实上，很可能抑制Src的一些有益的效果是由于其对于血小板活化的影响。从现在的数据可以明显的看出在MI之后的早期事件开始了一系列的反应，其结果是水肿和组织损伤的积累，然后就是纤维化以及心脏组织的重构。在这里指出纤维化重构的心脏组织在功能上比正常的心脏组织差是很重要的。因此通过早期限制损伤的效果，可以使得需要重构的组织更少，从而可以期望得到长时程的益处。由于对于单一的冠状血管的堵塞会使急性损伤增强从而导致梗塞区域的增长，纤维化以及在一些实施例中导致死亡，所以在这种进程中早期的有效的干涉可能会很好的提供长时间的保护和益处。
目前的数据显示Src抑制剂可能很好的起到这样的作用。抑制Src可以维持Flk-钙粘着蛋白-连环蛋白复合物并且使内皮结合处对抗VEGF的渗漏性增加的作用。
令人惊奇的是，全身注射VEGF可以产生许多在MI之后可以见到的对于心血管超微结构的影响。在体内仅用VEGF就足以诱导内皮屏障功能异常以及血管的损伤。同样地，本发明的方法不仅抑制MI后的这些现象而且也可以抑制全身VEGF注射之后的现象，该方法包括利用Src家族酪氨酸激酶抑制剂来阻遏Src。即使在VEGF刺激的情况下，抑制Src仍然可以稳定Flk-钙粘着蛋白-连环蛋白复合物。其它对于VEGF诱导VP起作用的因子可能包括空泡或visiculo-空泡细胞器(VVOs)以及穿孔。由于pp60Src-/-小鼠在VEGF注射之后没有显示出通透性的症状，所以这些通透性的模式也可以是Src依赖的。可以选择的是，内皮裂缝，渗漏出来的血细胞以及暴露的基底膜可能诱导穿孔以及VVOs。
在体内VEGF是反应于多种因子(细胞因子，原癌基因，组织缺氧)而表达的并且起到诱导通透性以及血管发生还有内皮细胞增殖，迁移，和抑制细胞凋亡的作用。肿瘤产生大量的VEGF，这是可以在血流中检测出来的。事实上，肿瘤中的或接近肿瘤的血管会出现很多与本研究中VEGF注射之后相似的症状，例如内皮开口，内皮间连接开放以及成簇的融合空泡。具有各种癌症的病人血清中的VEGF水平在100-3000pg/ml的范围之内，然而局部细胞或组织的VEGF水平可以更高10-100倍。已经有报导在MI后的病人中血清中VEGF水平在100-400pg/ml的范围之内，并且在急性MI的病人中比稳定心绞痛病人中的含量更高。在一些原发的和转移的肿瘤中，梗塞周围区域的局部的VEGF水平可能大大的超过血清中的水平。由于循环系统中VEGF聚集的增加会激起VP反应，该反应会吸引血小板并导致血流的丧失，所以现有的数据可能可以解释一些癌症病人具有更多的血栓形成疾病这一发现。另外，最近的报道或许可以解释与晚期癌症相关的胸膜渗漏以及全身水肿。因此，对Src的阻遏对于癌症相关的水肿类疾病可能具有重要的作用。
当其抑制Src家族酪氨酸激酶的时候，AGL1872也干扰一定范围的其它的激酶，然而SKI-606据报道更加具有选择性的抑制Src和Yes。这两种抑制剂都显示出相似的生物学活性模式，这些模式与Src缺乏的小鼠显示出来的一致。给予野生型动物药理学上的Src抑制剂也能对于组织损伤，心血管的生化和超微结构产生与基因敲除小鼠中所见的同样的影响，该事实证实该影响主要是由于EC介导的渗漏而与这些动物的遗传素质无关。Src和Yes，但是除了Fyn，对于VEGF介导的VP反应以及脑中缺血损伤之后的梗塞组织的生长是很重要的。综合在一起，以上数据证实在MI之后给予Src家族酪氨酸激酶抑制剂的有效作用实际上是Src激酶抑制的功能，并且可以推测pp60Src和pp62Yes象Src激酶一样最有可能牵涉其中。
在MI或直接VEGF注射之后可以观察到重要的相同的超微结构的变化。VEGF主要对于内皮细胞而不是其它的细胞类型发挥作用的事实证实在ECs中阻遏Src可以解释超微结构观察的结果。此外，观察到的大部分的变化是与EC中的细胞-细胞接触以及血管完整性直接相关，这些变化在Src基因敲除的动物或用Src抑制剂处理的野生型动物中几乎没有观察到。重要的是，Src在VP中的作用可归因于其磷酸化VE-钙粘着蛋白和β-连环蛋白并且促进这些连接蛋白与VEGF受体之间形成的复合物的解离的能力，其中VEGF受体为Flk。
本发明的方法非常适合于特异的改善VP诱导的组织损伤，特别是由于心肌梗死造成的组织损伤，因为针对于Src家族酪氨酸激酶功能的抑制集中抑制VP而对于VEGF诱导的其它反应不具有长时程的作用，其中VEGF诱导的其它反应可能对于损伤的恢复具有有益的影响。
Src似乎是通过影响VEGF介导的血管通透性来调节组织损伤的并且因此代表一种新的在心肌缺血的病理生理学上的治疗靶位。冠状动脉堵塞之后心肌损伤的程度可以通过对Src家族酪氨酸激酶急性的药理学抑制来得到明显的减轻。
对于合成的，相对的小分子化学抑制剂的应用比利用相对大的蛋白更安全并且更易于处理。因此，前者更优选地作为治疗活性剂。
前述的详细说明使得本领域中的技术人员可以将本发明付诸实施。实际上，除了这里显示和描述的那些以外，对于本发明的各种修饰对于本领域中的技术人员是显而易见的并且仍在附加的权利要求的范围之内。
Claims (1)
1.吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂在制备治疗心肌梗死的药物中的应用，其中该吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂选自4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶，及其混合物。
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