PL209912B1

PL209912B1 - Zastosowanie inhibitora kinazy tyrozynowej w medycynie

Info

Publication number: PL209912B1
Application number: PL377040A
Authority: PL
Inventors: David A. Cheresh; Robert Paul; Brian Eliceiri
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2002-11-18
Filing date: 2003-11-18
Publication date: 2011-11-30
Also published as: EP1567160A4; KR101174333B1; BR0316382A; MXPA05005307A; RU2330665C2; ZA200504774B; PL377040A1; JP2006510620A; WO2004045563A3; CA2506476A1; CN100577170C; CA2506476C; EP1567160A2; AU2003293037A1; US20030130209A1; KR20050086698A; RU2005119174A; WO2004045563A2; CN1738624A

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania inhibitora kinazy tyrozynowej w medycynie.

Przepuszczalność naczyń spowodowana obrażeniem, chorobą lub innym urazem naczyń krwionośnych jest główną przyczyną przecieków naczyniowych i obrzęku związanego z uszkodzeniem tkanki. Przykładowo, choroba naczyniowo-mózgowa związana z udarem naczyniowym mózgu (CVA) lub inne uszkodzenia naczyniowe w tkankach mózgowych lub rdzenia kręgowego są najczęstszą przyczyną schorzeń neurologicznych i zasadniczą podstawą inwalidztwa. Uszkodzenia tkanki mózgowej lub rdzenia kręgowego w obszarze CVA wiąże się zazwyczaj z przeciekam naczyniowymi i/lub obrzękiem. Typowo, CVA może obejmować uszkodzenia wywołane niedokrwieniem mózgu, przerwaniem normalnego dopływu krwi do mózgu, niewydolność mózgową wywołana przejściowymi zakłóceniami przepływu krwi, zawałem spowodowanym przez zator lub zakrzep tętnic wewnątrzczaszkowych lub zewnątrzczaszkowych, krwotokiem i tętniczo-żylnymi wadami rozwojowymi. Udar niedokrwienny i krwotok mózgowy mogą wystąpić nagle, a skutki incydentu z reguły odzwierciedlają obszar w mózgu, który został uszkodzony. (Patrz The Merck Manual, wyd. 16, rozdz. 123, 1992).

Poza CVA, infekcje lub choroby centralnego układu nerwowego (CNS) mogą także wywierać wpływ na naczynia krwionośne mózgu i kręgosłupa oraz mogą pociągać za sobą zapalenie i obrzęk tak, jak ma to przykładowo miejsce przy bakteryjnym zapaleniu opon mózgowych, wirusowym zapaleniu mózgu i tworzeniu ropni w mózgu, (Patrz The Merck Manual, wyd. 16, rozdz. 125, 1992), Do przecieków naczyniowych i obrzęku oraz osłabienia naczyń krwionośnych mogą również prowadzić ogólnoustrojowe stany chorobowe takie, jak przykładowo cukrzyca, choroba nerek, miażdżyca tętnic, zawał mięśnia sercowego i tym podobne. Przecieki naczyniowe i obrzęki są zatem niebezpiecznymi patologiami, odrębnymi i niezależnymi od choroby nowotworowej, które wymagają skutecznej specyficznej interwencji terapeutycznej w związku z różnymi obrażeniami, urazami lub stanami chorobowymi.

Zawał mięśnia sercowego jest to śmierć tkanki serca spowodowana zamknięciem dopływu krwi do mięśni serca. Zawał mięśnia sercowego jest jedną z najczęstszych diagnoz u hospitalizowanych pacjentów w krajach zachodnich. Doniesiono, że w Stanach Zjednoczonych u około 1,1 miliona osób rocznie diagnozowany jest ostry zawał mięśnia sercowego. Śmiertelność na skutek zawału mięśnia sercowego może przekraczać 53%, a niemal 66% pacjentów, którzy przeżyli nie dochodzi w pełni do zdrowia. Zmniejszenie śmiertelności nawet o jeden procent mogłoby uratować życie do 3400 pacjentom rocznie. Zawał mięśnia sercowego i towarzyszący mu obrzęk zasadniczo występują wówczas, gdy dochodzi do zamknięcia tętnicy wieńcowej, odcinając dopływ tlenu do tej tkanki serca, do której dostarczała tlen zablokowana tętnica. Gdy dopływ krwi jest odcięty tkanka w normalnych warunkach zaopatrywana w krew przez zablokowaną tętnicę staje się niedokrwiona. W końcu pozbawiona tlenu tkanka serca zaczyna obumierać (nekroza). Honkanen i wsp. w opisie patentowym USA nr 5,914,242 opisują sposób zmniejszenia zawału mięśnia sercowego obejmujący podawanie pacjentowi po wystąpieniu niedokrwistości serca pewnych inhibitorów enzymu fosfatazy serynowo/treoninowej i pokrewnych peptydów. Takie enzymy i polipeptydy są kosztowne i trudne do otrzymania i należytego dla zastosowań farmaceutycznych oczyszczenia.

Niniejszym stwierdziliśmy, że zahamowanie aktywności kinazy tyrozynowej z rodziny Src dostarcza przydatnego sposobu leczenia zawału mięśnia sercowego poprzez zmniejszenie pojawiających się normalnie na skutek zamknięcia naczyń wieńcowych obrzęku i spowodowanej przezeń nekrozy tkanki wieńcowej, łagodząc tym samym niszczące tkanki skutki zawału mięśnia sercowego.

Tak więc, leczenie zawału mięśnia sercowego (MI) można realizować poprzez hamowanie aktywności kinazy tyrozynowej z rodziny Src. Pożądane leczenie osiąga się dzięki działaniu na tkankę wieńcową ssaka cierpiącego na zamknięcie naczyń wieńcowych skuteczną ilością inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src. Ssakiem może być dowolny pacjent - człowiek albo też niebędący człowiekiem ssak. Tkanka wieńcowa poddawana działaniu inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src może być dowolną częścią serca pacjenta cierpiącą na niedokrwienie (tzn. utratę przepływu krwi) spowodowane zamknięciem naczyń wieńcowych. Działanie terapeutyczne osiąga się przykładowo dzięki kontaktowaniu docelowej tkanki wieńcowej ze skuteczną ilością pożądanej kompozycji farmaceutycznej zawierającej chemiczny (tzn. niepeptydowy) inhibitor kinazy tyrozynowej z rodziny Src. Szczególnie użyteczne jest działanie na chorą tkankę wieńcową w obszarze w pobliżu miejsca, w którym dochodzi lub doszło do szkodliwego zamknięcia naczynia krwionośnego. Takie postępowanie umożliwia zmniejszenia nekrozy tkanek (zawału) spowodowanej zazwyczaj zamknięciem naczyń wieńcowych.

PL 209 912 B1

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest więc zastosowanie inhibitora kinazy tyrozynowej SKI-606 z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli do wytwarzania leku do leczenia zawału mięśnia sercowego albo do zapobiegawczego leczenia ssaka z ryzykiem wystąpienia zawału mięśnia sercowego.

Korzystnie ssakiem jest człowiek albo ssak inny, niż człowiek.

Lek obejmujący inhibitor kinazy tyrozynowej SKI-606 z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli może stanowić element zestawu obejmującego materiał opakowaniowy oraz kompozycję farmaceutyczną zawartą w materiale opakowaniowym, przy czym kompozycja farmaceutyczna zawierająca inhibitor kinazy tyrozynowej SKI-606 z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli jest zdolna do zmniejszenia nekrozy w tkance wieńcowej cierpiącej na utratę przepływu krwi na skutek zamknięcia naczynia wieńcowego. Materiał opakowaniowy obejmuje zazwyczaj etykietę wskazującą, że kompozycja farmaceutyczna może być stosowana do leczenia zawału mięśnia sercowego, oraz, iż zawiera ona skuteczną terapeutycznie ilość inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku.

Jako odpowiednie inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src można wskazać również inne inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy pirazolopirymidyn takie, jak 4-amino-5-(4-metylofenylo)-7-(t-butylo)pirazolo[3,4-d-]pirymidyna (AGL 1872), 4-amino-5-(4-chlorofenylo)-7-(t-butylo)pirazolo[3,4-d-]pirymidyna (AGL 1879) i im podobne, czy też inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy dienonów makrocyklicznych takie, jak Radicicol R2146, Geldanamycyna, herbimycyna A i im podobne, bądź też inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy pirydo[2,3-d]pirymidyn takie, jak PD173955 i jemu podobne.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zastosowanie inhibitora kinazy tyrozynowej SKI-606 z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli do wytwarzania leku do leczenia zawału mięśnia sercowego albo do zapobiegawczego leczenia ssaka z ryzykiem wystąpienia zawału mięśnia sercowego jest użyteczne w łagodzeniu nekrozy tkanki serca spowodowanej blokadą naczyń wieńcowych wynikającej z choroby serca, obrażenia lub urazu.

Krótki opis figur

Na rysunku stanowiącym część niniejszego wniosku:

Fig. 1 przedstawia sekwencję cDNA (SEKW, NR ID.: 1) ludzkiej c-Src, którą po raz pierwszy opisali Braeuninger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:10411-10415 (1991). Sekwencja dostępna jest przez numer dostępowy GenBank X59932 X71157. Sekwencja zawiera 2187 nukleotydów, przy czym część kodująca białko zaczyna się i kończy odpowiednio na nukleotydach w pozycji 134 i 1486.

Fig. 2 przedstawia kodowaną sekwencję aminokwasową ludzkiej c-Src sekwencji kodującej przedstawionej na Fig. 1 (SEKW. NR ID.: 2).

Fig. 3 przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW. NR ID.: 3) cDNA kodującego ludzkie białko c-Yes. Sekwencja dostępna jest przez numer dostępowy GenBank M15990. Sekwencja zawiera 4517 nukleotydów, przy czym część kodująca białko zaczyna się i kończy odpowiednio na nukleotydach w pozycji 208 i 1839 i podlega translacji na sekwencję aminokwasową przedstawioną na Fig. 4.

Fig. 4 przedstawia sekwencję aminokwasową c-Yes (SEKW. NR ID.: 4).

Fig. 5 przedstawia wyniki zmodyfikowanego testu Milesa przepuszczalności naczyń (VP) VEGF w skórze myszy pozbawionych Src, Fyn i Yes. Fig. 5A są to fotografie poddanych działaniu uszu. Fig. 3B są to wykresy wyników doświadczalnych stymulacji różnych zmutowanych myszy. Fig. 5C jest wykresem ilości niebieskiego barwnika Evana wyeluowanego przez poddane działaniu tkanki.

Fig. 6 przedstawia wykres obrazujący względny rozmiar zawału mózgowego u myszy Src +/-, Src -/-, dzikich (WET) oraz myszy dzikich leczonych AGL1872 (tzn. 4-amino-5-(4-metylofenylo)-7-(t-butylo)pirazolo[3,4-d-]pirymidyny). Dawka wynosiła 1,5 mg/kg masy ciała.

Fig. 7 przedstawia skany sekwencyjnego MRI mózgów myszy kontrolnych i leczonych AGL1872, pokazując mniejszy zakres zawału mózgu u zwierzęcia leczonego AGL1872 (prawy) w porównaniu ze zwierzę ciem kontrolnym (lewy).

Fig. 8 przedstawia struktury korzystnych inhibitorów kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy pirazolopirymidyn.

Fig. 9 przedstawia struktury korzystnych inhibitorów kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy dienonów makrocyklicznych.

Fig. 10 przedstawia struktury korzystnych inhibitorów kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy pirydo[2,3-d]pirymidyn.

PL 209 912 B1

Fig. 11 przedstawia obrazy mikrofotograficzne przyżyciowo wybarwionej tkanki serca szczura, którą poddano urazowi dla zaindukowania zawału mięśnia sercowego; obraz po prawej jest kontrolą wykazującą znaczący poziom nekrozy; obraz po lewej przedstawia tkankę poddaną działaniu chemicznym inhibitorem kinazy tyrozynowej z rodziny Src (AGL1872) wykazującą wyraźnie zmniejszony poziom nekrozy.

Fig. 12 przedstawia wykres słupkowy rozmiaru zawału mięśnia sercowego w funkcji stężenia inhibitora (AGL1872).

Fig. 13 przedstawia wykres słupkowy rozmiaru zawału mięśnia sercowego w funkcji czasu po zadziałaniu inhibitorem (AGL1872).

Fig. 14 przedstawia wykres słupkowy zawartości wody w mięśniu sercowym w funkcji stężenia inhibitora (AGL1872).

Wszystkie stosowane w niniejszym opisie określenia mają standardowo przyjęte znaczenia, chyba, że wskazano inaczej.

W szczególności termin reszta aminokwasowa w użytym tu znaczeniu odnosi się do aminokwasu wytworzonego w wyniku chemicznego trawienia (hydrolizy) polipeptydu w miejscu jego wiązań peptydowych. Opisane tu reszty aminokwasowe korzystnie są w postaci izomeru L. Reszty w postaci izomeru D mogą jednak być podstawione w miejsce dowolnej reszty L-aminokwasu pod warunkiem, że przez polipeptyd zachowana jest pożądana własność funkcjonalna. NH2 odnosi się do wolnej grupy aminowej obecnej na N-końcu polipeptydu. COOH odnosi się do wolnej grupy karboksylowej obecnej na C-końcu polipeptydu, zgodnie ze standardowym nazewnictwem polipeptydów (opisanym w J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) i przyjętym na 37 CFR §1.822(b)(2)).

Należy zauważyć, że wszystkie sekwencje reszt aminokwasowych są przedstawione tu wzorami, których orientacja od lewej do prawej jest konwencjonalną orientacją od końca aminowego (N-końca) do końca karboksylowego (C-końca), Ponadto należy zauważyć, że myślnik na początku lub na końcu sekwencji reszt aminokwasowych oznacza wiązanie peptydowe z dalszą sekwencją jednej lub więcej reszt aminokwasowych.

Termin polipeptyd w użytym tu znaczeniu odnosi się do liniowej serii reszt aminokwasowych połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi pomiędzy grupą aminową alfa a grupą karboksylową kolejnych reszt aminokwasowych.

Termin peptyd w użytym tu znaczeniu odnosi się do liniowej serii nie więcej niż około 50 reszt aminokwasowych połączonych ze sobą tak, jak w polipeptydzie.

Termin białko w użytym tu znaczeniu odnosi się do liniowej serii więcej niż 50 reszt aminokwasowych połączonych ze sobą tak, jak w polipeptydzie.

Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że: (1) w zaindukowanej przez VEGF przepuszczalności naczyń (VP) swoiście pośredniczą białka kinaz tyrozynowych takie, jak Src i Yes, i że VP można modulować przez hamowanie aktywności kinazy tyrozynowej z rodziny Src, oraz (2) podawanie in vivo inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src zmniejsza uszkodzenia tkanek spowodowane związanym z chorobą lub obraż eniem wzrostem przepuszczalno ś ci naczyń .

Powyższe stwierdzenie jest istotne ze względu na rolę, jaką przepuszczalność naczyń odgrywa w szeregu różnych procesów chorobowych. Niniejszy wynalazek opiera się na stwierdzeniu, że przepuszczalność naczyń może być swoiście modulowana i łagodzona przez hamowanie aktywności kinazy tyrozynowej z rodziny Src. Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek opiera się na stwierdzeniu, iż zastosowanie in vivo inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src zmniejsza uszkodzenia tkanek spowodowane związanym z chorobą lub obrażeniem wzrostem przepuszczalności naczyniowej, który nie jest związany z nowotworem lub angiogenezą. Stwierdzono udział przepuszczalności naczyń w wielu procesach chorobowych, w których uszkodzenie tkanek wywoł ane jest nagł ym wzrostem VP spowodowanym przez uraz naczynia krwionośnego. Zdolność swoistego modulowania VP umożliwia zatem wprowadzenie nowych i skutecznych sposobów leczenia zmniejszającego szkodliwe skutki udaru. Do przykładów tkanek związanych z zaindukowanymi przez chorobę lub obrażenie przeciekami naczyniowymi i/lub obrzękiem, w których korzystne byłoby swoiste hamujące modulowanie przy zastosowaniu inhibitora kinazy z rodziny Src należą reumatoidalne zapalenie stawów, retynopatia cukrzycowa, choroby zapalne, nawrót zwężenia, udar, zawał mięśnia sercowego i im podobne.

Doniesiono, że ogólnoustrojowe neutralizowanie białka VEGF przy zastosowaniu białka fuzyjnego receptora VEGF z IgG zmniejsza rozmiar zawału po niedokrwieniu mózgu. Działanie to przypisano zmniejszeniu pośredniczonej przez VEGF przepuszczalności naczyń. N. van Bruggen i wsp., J. Clin. Inves. 104:1613-1620 (1999). VEGF nie jest jednak krytycznym mediatorem wzrostu przepuszPL 209 912 B1 czalności tak, jak zgodnie z ostatnim doniesieniem jest nim Src. Ponadto Src może być aktywowana przez inne bodźce, niż VEGF. Patrz, przykładowo, publikacja Erpel i wsp., Cell Biology, 7:176-182 (1995).

Niniejszy wynalazek odwołuje się konkretnie do stwierdzenia, że inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src, zwłaszcza inhibitory Src, a w szczególności inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli są użyteczne w leczeniu zawału mięśnia sercowego poprzez złagodzenie uszkodzenia tkanki wieńcowej u ssaka spowodowanego zamknięciem naczyń wieńcowych.

Zgodnie ze stosowanym niniejszym oraz załączonych zastrzeżeniach znaczeniem, termin białko kinazy tyrozynowej z rodziny Src oraz wszelkie gramatyczne odmiany tego terminu odnosi się do białka posiadającego homologię sekwencji aminokwasowej do v-Src, N-końcową mirystylację, zachowaną strukturę domenową zawierającą N-końcowy obszar zmienny, po którym następuje domena SH3, domena SH2, domena katalityczna kinazy tyrozynowej oraz C-końcowa domena regulatorowa. Terminy białko Src i Src stosowane są wspólnie w stosunku do różnych postaci białka kinazy tyrozynowej Src posiadających masę cząsteczkową 60 kDa, N-końcowy obszar zmienny zawierający dwa miejsca fosforylacji PKC i jedno miejsce fosforylacji PKA, stosunkowo wyższą ogólną identyczność sekwencji ze znanymi białkami Src w porównaniu ze znanymi przedstawicielami innych podgrup rodziny Src (np. Yes, Fyn, Lek i Lyn), i które są aktywowane przez fosforylację tyrozyny odpowiadającej tyrozynie w pozycji 416 w SEKW. NR ID.: 2. Terminy białko Yes i yes stosowane są zbiorczo w stosunku do różnych postaci białka kinazy tyrozynowej Yes posiadających masę cząsteczkową 62 kDa, N-końcowy obszar zmienny pozbawiony miejsc fosforylacji, stosunkowo wyższą ogólną identyczność sekwencji ze znanymi białkami Yes w porównaniu ze znanymi przedstawicielami innych podgrup rodziny Src (np. Src, Fyn, Lek i Lyn), i które są aktywowane przez fosforylację tyrozyny odpowiadającej tyrozynie w pozycji 426 w SEKW. NR ID.: 4.

Korzystne oznaczenie dla pomiaru niedokrwienia wieńcowego polega na indukcji niedokrwienia u szczurów przez podwiązanie tętnicy wieńcowej i ocenie rozmiaru zawału mięśnia sercowego przez MRI, echokardiografię i podobne techniki, w różnym czasie tak, jak szczegółowo opisano to poniżej.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zastosowanie inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli może obejmować kontaktowanie niedokrwionej tkanki wień cowej ze stanowiącą lek kompozycją farmaceutyczną, która zawiera przynajmniej jeden chemiczny inhibitor kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli. Do innych odpowiednich do stosowania inhibitorów kinazy tyrozynowej z rodziny Src należą również inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy pirazolopirymidyn, inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy dienonów makrocyklicznych oraz inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy pirydo[2,3-d]pirymidyn. Mogą również być wykorzystywane mieszaniny inhibitorów.

Do użytecznych inhibitorów z klasy pirazolopirymidyn należą 4-amino-5-(4-metylofenylo)-7-(t-butylo)pirazolo[3,4-d-]pirymidyna (zwana też niekiedy PP1 lub AGL 1872), 4-amino-5-(4-chlorofenylo)-7-(t-butylo)pirazolo[3,4-d-]pirymidyna (zwana też niekiedy PP1 lub AGL 1879) i im podobne, których szczegółowe przygotowanie opisano w publikacji Waltenberger, i wsp. Circ. Res., 85:12-22 (1999), którą włącza się niniejszym jako odnośnik literaturowy. Struktury chemiczne AGL1872 i AGL1879 są przedstawione na Fig. 8. AGL1872 (PP1) dostępny jest z Biomol, na licencji z Pfizer, Inc. AGL1879 (PP2) jest dostępny z Calbiochem, na licencji z Pfizer, Inc. (patrz też Hanke i wsp., J. Biol. Chem. 271(2): 695-701 (1996)).

Do przykładowych inhibitorów z klasy dienonów makrocyklicznych należą Radicicol R2146, Geldanamycyna, Herbimycyna A i im podobne. Struktury Radicicolu R2146, geldanamycyny i herbimycyny A przedstawione są na Fig. 9. Geldanamycyna jest dostępna z Life Technologies. Herbimycyna A jest dostępna z Sigma. Radicicol, który jest oferowany w handlu przez różne firmy (np. Calbiochem, REI, Sigma) jest przeciwgrzybiczym makrocyklicznym antybiotykiem laktonowym, który działa też jako nieswoisty inhibitor białkowej kinazy tyrozynowej i dla którego wykazano, że hamuje aktywność kinazy Src. Inhibitory z klasy dienonów makrocyklicznych obejmują laktam makrocykliczny o 12 do 20 atomach węgla lub strukturę pierścienia laktonowego zawierającą grupę α,β,γ,δ-bis-nienasyconego ketonu (tzn. dienonu) oraz nasyconą tlenem grupę arylową jako część pierścienia makrocyklicznego.

Do przykładowych inhibitorów z klasy pirydo[2,3-d]pirymidyn należą, przykładowo PD173955 i tym podobne. Struktura PD173955, inhibitora opracowanego przez Parke Davis, jest opisana w pracy Moasser, i wsp., Cancer Res., 59:6145-6152 (1999), której istotny opis jest tu włączony przez referencję. Struktura chemiczna PD173955 przedstawiona jest na Fig. 10.

PL 209 912 B1

Do korzystnych inhibitorów kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli według wynalazku należy, przykładowo, SKI-606 dostępny z Wyeth. Przykłady inhibitorów Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli są opisane również w publikacjach patentowych USA nr 2001/0051520 i nr 2002/00260052, które włącza się niniejszym jako odnośnik literaturowy.

Do innych użytecznych swoistych inhibitorów kinazy Src należy PD162531 (Owens i wsp., Mol. Biol. Cell 11:51-64 (2000)), który opracowano w Parke Davis, lecz struktura którego nie została dotychczas podana w literaturze.

Inhibitorem chemicznym może być inhibitor pirazolopirymidynowy, zwłaszcza AGL19872 i AGL1879, w szczególnoś ci AGL1872.

Korzystnym inhibitorem Src jest 4-anilino-3-chinolinokarbonitryl znany jako SKI-606.

Przy zastosowaniu znanych w technice metod i oznaczeń mogą być również zidentyfikowane i scharakteryzowane i inne odpowiednie inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src. Przykł adowo, przeprowadzono przeszukiwanie związków chemicznych pod kątem silnego i wybiórczego hamowania Src lub innych kinaz tyrozynowych, co doprowadziło do identyfikacji grup chemicznych użytecznych w silnych inhibitorach kinaz tyrozynowych z rodziny Src.

Przykładowo, katechole zidentyfikowano jako istotne elementy wiążące dla szeregu inhibitorów kinaz tyrozynowych pochodzących z produktów naturalnych oraz określono w oparciu o kombinatoryczną ukierunkowaną na cel selekcję wybiórczych inhibitorów c-Src. Patrz Maly i wsp. Combinatorial targetguided ligand assembly: Identification of potent subtype-selective c-Src inhibitors PNAS(USA) 97(6) :2419-2424 (2000)). Oparte na chemii kombinatorycznej przeszukiwanie inhibitorów - kandydatów, przy zastosowaniu jako startowych grup, o których wiadomo, że są istotne ze względu na hamowanie Src jest silnym i skutecznym sposobem izolowania i charakteryzowania rozmaitych chemicznych inhibitorów kinaz tyrozynowych z rodziny Src.

Jednakże, nawet staranna selekcja potencjalnych elementów wiążących oparta na zdolności naśladowania szerokiego zakresu funkcji obecnych w polipeptydach i kwasach nukleinowych może być wykorzystana do przeprowadzenia kombinatorycznych poszukiwań aktywnych inhibitorów. Przykładowo, szczególnie odpowiednie do tego celu są biblioteki O-metylooksymowe, biorąc po uwagę, że bibliotekę taką można łatwo przygotować poprzez kondensację O-metylohydroksyloaminy z dowolnym ze znacznej liczby dostępnych w handlu aldehydów. Tworzenie oksymów O-alkilowych jest zgodne z szeregiem róż nych funkcji, które są stabilne przy fizjologicznej wartości PH. Patrz Maly i wsp., powyżej.

Ssak, u którego można stosować lek zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest korzystnie człowiekiem, aczkolwiek należy mieć na uwadze, że leczenie zawału mięśnia sercowego można prowadzić także u ssaków innych niż człowiek. W tym kontekście pojęcie ssaka obejmuje dowolny gatunek ssaka, u którego pożądane jest leczenie związanego z przeciekiem naczyniowym lub obrzękiem uszkodzenia tkanek, zarówno zwierzęta hodowlane jak i domowe gatunki ssaków, a także ludzi.

Lek do leczenia zawału mięśnia sercowego może być podawany cierpiącemu na zawał mięśnia sercowego w skutecznej terapeutycznie ilości w postaci tolerowanej fizjologicznie kompozycji zawierającej chemiczny inhibitor kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli.

Zapobiegania zawałowi mięśnia sercowego może obejmować podawanie ssakowi, u którego występuje ryzyko zawału mięśnia sercowego profilaktycznej ilości tolerowanej fizjologicznie kompozycji zawierającej chemiczny inhibitor kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli.

Zakresy dawki użytecznej do podawania chemicznych inhibitorów kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli mogą zawierać się w zakresie od około 0,1 mg/kg masy ciała do około 100 mg/kg masy ciała ssaka, lub też być determinowane poprzez granicę rozpuszczalności czynnika aktywnego w nośniku farmaceutycznym. Korzystną dawką jest około 1,5 mg/kg masy ciała. Stanowiące lek kompozycje farmaceutyczne powinny być podawane doustnie. Przykładowe postacie dawkowania dla podawania doustnego obejmują kapsułki, tabletki powlekane jelitowo lub niepowlekane i tym podobne.

W przypadku ostrego obraż enia lub urazu najlepiej jest podawać lek jak najszybciej po wystąpieniu incydentu. Czas dla skutecznego zastosowania inhibitorów kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli moż e jednak wynosić aż do okoł o 48 godzin od wystą pienia obrażenia lub urazu w przypadku ostrych incydentów. Pożądane jest, by podanie nastąpiło do około 24 godzin od wystąpienia obrażenia lub urazu, a nawet do 6 godzin. Najlepiej inhibitor kinazy tyrozynowej z rodziny Src obrażenia lub urazu jest podawany w ciągu około 45 minut od obrażenia. Podanie po upływie 48 godzin od wstępnego obrażenia może być odpowiednie dla złagodzenia dodatkowego

PL 209 912 B1 uszkodzenia tkanki spowodowanego dalszymi przeciekami naczyniowymi lub obrzękiem, jednakże korzystny wpływ na wstępne uszkodzenia tkanki może być w takich przypadkach zmniejszony.

Gdy podawanie jest prowadzone w celach profilaktycznych dla zapobiegania zawałowi mięśnia sercowego związanego z zabiegiem chirurgicznym lub ze względu na predysponujące kryteria diagnostyczne, podawanie może nastąpić przed wystąpieniem właściwego zamknięcia naczynia wieńcowego lub podczas wydarzenia powodującego takie zamknięcie, przykładowo przezskórnego zabiegu sercowo-naczyniowego takiego, jak angioplastyka wieńcowa. Dla leczenia schorzeń przewlekłych, które prowadzą do zamknięcia naczyń wieńcowych, podawanie chemicznego inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src może być prowadzone w trybie dawkowania ciągłego.

Ogólnie, dawkowanie może ulegać zmianie w zależności od wieku, stanu pacjenta, płci i zakresu obrażeń przezeń doznanych i może być bez trudu określone przez specjalistę w dziedzinie. Dawkowanie może także być dostosowane przez konkretnego lekarza w przypadku jakichkolwiek powikłań.

Stanowiące lek kompozycje farmaceutyczne mogą być również podawane pozajelitowo w postaci zastrzyku lub stopniowego wlewu przez określony czas. Mimo, że dostęp do leczonej tkanki w organizmie może zwykle być zapewniony przez podawanie ogólnoustrojowe i w związku z tym leczenie najczęściej jest prowadzone poprzez dożylne podawanie kompozycji terapeutycznych, rozważane są inne tkanki i sposoby podawania tam, gdzie zachodzi prawdopodobieństwo, że docelowa tkanka zawiera docelową cząsteczkę. Kompozycje takie mogą być zatem podawane dożylnie, dootrzewnowe, domięśniowo, podskórnie, dojamowo, przezskórnie, doustnie, a także mogą być podawane metodami perystaltycznymi.

Podawanie dożylne prowadzi się, przykładowo, poprzez wstrzyknięcie dawki jednostkowej. Termin dawka jednostkowa stosowany w odniesieniu do kompozycji terapeutycznej odnosi się do fizycznie odrębnych jednostek, odpowiednich jako jednostkowe dawki dla pacjenta, przy czym każda jednostka zawiera w połączeniu z niezbędnym rozcieńczalnikiem, tzn. nośnikiem lub zaróbką określoną ilość składnika aktywnego skalkulowaną dla zapewnienia pożądanego działania terapeutycznego.

Składnik aktywny może być podawany w postaci pojedynczej dawki dożylnie. Podawanie domiejscowe można osiągnąć przez bezpośrednie wstrzyknięcie lub wykorzystanie odizolowanych anatomicznie przedziałów, izolację mikrokrążenia docelowych układów narządów, reperfuzję w układzie krążącym lub czasowe zamknięcie za pomocą cewnika docelowych obszarów układu naczyniowego związanych z chorymi tkankami.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane w sposób zgodny z formulacją dawki i w ilości skutecznej farmaceutycznie. Terminy ilość skuteczna terapeutycznie i ilość profilaktyczna stosowane w niniejszym opisie i załączonych zastrzeżeniach, w odniesieniu do kompozycji farmaceutycznych, oznaczają ilość kompozycji farmaceutycznej, która wywoła u pacjenta pożądaną przez lekarza klinicystę odpowiedź biologiczną lub medyczną (np. złagodzenie uszkodzenia tkanek lub zapobieżenie zawałowi mięśnia sercowego).

Ilość i czas podawania zależą od konkretnego leczonego pacjenta, zdolności jego organizmu do wykorzystania składnika aktywnego i zakresu pożądanego działania terapeutycznego. Dokładne ilości podawanego składnika aktywnego zależą od oceny lekarza i są właściwe dla każdego osobnika. Niniejszym opisano przykładowe odpowiednie zakresy dawki dla podawania ogólnoustrojowego, które zależą od drogi podawania. Odpowiednie tryby podawania również są różne, lecz typowo stanowią je podanie wstępne, po którym następują powtarzające się dawki w odstępach jednej lub więcej godziny podawane przez kolejne wstrzyknięcia lub inne podawanie, np. podawanie doustne. Alternatywnie rozważa się ciągły dożylny wlew wystarczający do utrzymania stężenia we krwi w zakresie wyznaczonym dla terapii in vivo.

Sposoby łagodzenia uszkodzenia tkanek spowodowanego przez zamknięcie naczynia wieńcowego związane z różnymi postaciami choroby wieńcowej lub wywołanego obrażeniem lub urazem serca łagodzą objawy choroby, zależnie od choroby i mogą się przyczynić do poprawy stanu chorobowego. Zakres nekrozy w tkance, a zatem zakres hamowania uzyskanego dzięki zastosowaniu leku zawierającego inhibitor kinazy tyrozynowej z rodziny Src można oceniać różnymi metodami. Konkretnie, takie sposoby łagodzenia uszkodzenia tkanek szczególnie dobrze nadają się do leczenia zawału mięśnia sercowego. Łagodzenie uszkodzenia tkanek wywołanego przez zamknięcie naczynia wieńcowego może nastąpić w krótkim czasie po podaniu pacjentowi stanowiącej lek kompozycji terapeutycznej. Większość skutków terapeutycznych można zobrazować w 24 godziny po podaniu, w przypadku ostrego obrażenia lub urazu. Skutki podawania ciągłego nie będą jednak tak wyraźnie widoczne.

PL 209 912 B1

Do ograniczających czasowo czynników należą tempo wchłaniania przez tkanki, pobierania przez komórki, przemieszczania białek lub translacji kwasów nukleinowych (zależnie od czynnika terapeutycznego) i sortowania białek w komórce. Działanie modulujące uszkodzenia tkanki może zatem wystąpić już nawet cztery godziny po czasie podania inhibitora. Tkanka serca może też być poddana dalszemu lub przedłużonemu działaniu inhibitorów kinazy białkowej z rodziny Src przy zastosowaniu odpowiednich warunków. Można zatem zaprojektować różne okresy czasu działania terapeutycznego przez modyfikacje takich parametrów.

Jak wspomniano powyżej inhibitory kinazy białkowej z rodziny Src mogą być stosowane do przygotowania leków użytecznych do leczenia zawału mięśnia sercowego. Inhibitory te mogą być zawarte w kompozycjach farmaceutycznych użytecznych w praktyce opisanych niniejszym sposobów terapeutycznych i profilaktycznych. Takie kompozycje farmaceutyczne zawierają tolerowany fizjologicznie nośnik wraz z rozpuszczonym lub zawieszonym w nim jako składnik aktywny inhibitorem kinazy tyrozynowej z rodziny Src. Szczególnie użyteczna przy podawaniu w celu terapeutycznym pacjentowi - ssakowi takiemu, jak człowiek jest kompozycja farmaceutyczna nieimmunogenna.

Zgodnie ze stosowanym niniejszym znaczeniem terminy dopuszczalny farmaceutycznie, tolerowany fizjologicznie i ich odmiany gramatyczne, stosowane wymiennie w odniesieniu do kompozycji, nośników, rozcieńczalników i odczynników oznaczają, że materiały te mogą być podawane ssakowi bez wywołania jakichkolwiek niepożądanych skutków ubocznych takich, jak nudności, zawroty głowy, rozstrój żołądka i tym podobne.

Przygotowanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej rozpuszczone lub zawieszone w niej składniki aktywne jest dobrze znane w dziedzinie i nie musi być ograniczone do określonych formulacji. Typowo kompozycje takie są przygotowywane jako kompozycje przeznaczone do wstrzyknięć, w postaci roztworów płynnych albo zawiesin. Mogą też być przygotowane postacie stałe nadające się do rozpuszczenia lub zawieszenia w płynie przed użyciem. Kompozycję może także stanowić preparat zemulgowany albo dostarczony w postaci kompozycji liposomowej.

Składnik aktywny może być mieszany z zaróbkami, które są farmaceutycznie dopuszczalne i są zgodne ze składnikiem aktywnym oraz występują w ilościach odpowiednich do stosowania w opisanych niniejszym zastosowaniach terapeutycznych. Odpowiednimi zarobkami są, przykładowo, woda, roztwór soli, glukoza, glicerol, etanol lub podobne oraz ich połączenia. Dodatkowo, jeżeli jest to pożądane, kompozycja może zawierać pewne ilości substancji pomocniczych takich, jak środki zwilżające lub emulgujące, środki buforujące pH i im podobne, które wzmacniają skuteczność składnika czynnego.

Kompozycja farmaceutyczna może zawierać również farmaceutycznie dopuszczalne sole jej składników aktywnych. Do farmaceutycznie dopuszczalnych soli należą sole addycyjne z kwasami (tworzone poprzez wolne grupy aminowe polipeptydu), które otrzymuje się w reakcjach z kwasami nieorganicznymi takimi, jak przykładowo kwas solny lub fosforowy albo też kwasami organicznymi takimi, jak kwas octowy, winny, migdałowy i tym podobne. Sole tworzone przez wolne grupy karboksylowe mogą także pochodzić od zasad nieorganicznych takich, jak przykładowo wodorotlenki sodu, potasu, amonu, wapnia lub żelaza, oraz takich zasad organicznych takich, jak izopropyloamina, trimetyloamina, 2-etyloamino etanol, histydyna, prokaina i tym podobne.

Tolerowane fizjologicznie nośniki są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Przykładami nośników płynnych są jałowe roztwory wodne niezawierające żadnych materiałów poza składnikami aktywnymi i wodą, albo zawierające bufor taki, jak fosforan sodu przy fizjologicznej wartości pH, sól fizjologiczną lub jedno i drugie, jak roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem. W jeszcze dalszym stopniu nośniki wodne mogą zawierać więcej niż jedną sól buforową, a także sole takie jak chlorki sodu i potasu, glukozę, glikol polietylenowy i inne substancje rozpuszczone.

Kompozycje ciekłe mogą zawierać również dodatkowo do obecności lub zamiast wody fazy ciekłe. Przykładami takich dodatkowych faz ciekłych są gliceryna, oleje roślinne takie, jak olej z nasion bawełny i emulsje woda-olej.

Użyteczne chemiczne kompozycje terapeutyczne mogą zawierać tolerowany fizjologicznie nośnik wraz z rozpuszczonym lub zawieszonym w nim w charakterze składnika aktywnego inhibitorem kinazy tyrozynowej z rodziny Src.

Odpowiednie inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src hamują biologiczną aktywność kinazy tyrozynowej z kinaz tyrozynowych z rodziny Src. Bardziej odpowiednia kinaza tyrozynowa z rodziny Src wykazuje główną swoistość w kierunku hamowania aktywności białka Src, a dodatkowo hamuje najbliżej spokrewnione kinazy tyrozynowe z rodziny Src.

PL 209 912 B1

Kompozycja farmaceutyczna taka jak stanowiąca lek zawierający inhibitor kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli mo ż e stanowić integralną część wytworu obejmującego oznakowany pojemnik przeznaczony do dostarczania skutecznej terapeutycznie ilości kompozycji. Inhibitor może być pojedynczym zapakowanym chemicznym inhibitorem kinazy tyrozynowej z rodziny Src lub połączeniem więcej niż jednego inhibitora. Wytwór taki zazwyczaj obejmuje materiał opakowaniowy oraz składnik farmaceutyczny zawarty w tymże materiale opakowaniowym. Wytwór może zawierać również dwie lub więcej subterapeutycznie skutecznych ilości kompozycji farmaceutycznej, które razem działają synergistycznie przyczyniając się do złagodzenia uszkodzeń tkanek spowodowanych zamknięciem naczynia wieńcowego.

Zgodnie ze stosowanym niniejszym znaczeniem termin materiał opakowaniowy odnosi się do materiału takiego, jak szkło, tworzywo sztuczne, papier, folia i tym podobne, zdolnego do utrzymywania w określonym położeniu składnika farmaceutycznego. Materiałem opakowaniowym mogą zatem być plastikowe lub szklane fiolki, laminowane koperty i podobne pojemniki stosowane do przechowywania kompozycji farmaceutycznej zawierającej czynnik farmaceutyczny.

W szczególności materiał opakowaniowy obejmuje etykietę , która w konkretny sposób opisuje zawartość wytworu i zastosowanie zawartego w nim czynnika farmaceutycznego.

Składnik farmaceutyczny obecny w wytworze może stanowić dowolna z opisanych powyżej kompozycji odpowiednich do dostarczania inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src, formułowanego do dopuszczalnej farmaceutycznie postaci tak, jak opisano tu według ujawnionych wskazówek. Do odpowiednich inhibitorów kinazy tyrozynowej z rodziny Src, należą między innymi chemiczne inhibitory Src, w tym inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy pirazolopirymidyn takie, jak 4-amino-5-(4-metylofenylo)-7-(t-butylo)pirazolo[3,4-d-]pirymidyna, 4-amino-5-(4-chlorofenylo)-7-(t-butylo)pirazolo[3,4-d-]pirymidyna i im podobne; inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy dienonów makrocyklicznych takie, jak Radicicol R2146, geldanamycyna, herbimycyna A i im podobne; inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy pirydo[2,3-d]pirymidyn takie, jak PD173955 i jemu podobne. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem szczególnie korzystne są inhibitory kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli takie, jak SKI-606 i jemu podobne oraz ich mieszaniny. Wytwór zawiera ilość składnika farmaceutycznego wystarczającą do zastosowania w leczeniu wskazanego tu schorzenia, w dawce jednostkowej albo w dawkach wielokrotnych.

Materiał opakowaniowy obejmuje etykietę, która określa zastosowanie zawartego w nim składnika farmaceutycznego, np. wskazanie schorzeń, które mogą być leczone i w których pomocne jest zahamowanie wzrostu przepuszczalności naczyń i podobnych opisanych tu schorzeń. Etykieta może ponadto zgodnie z ewentualnymi wymogami wprowadzenia na rynek zawierać instrukcje użytkowania i pokrewne informacje.

Materiał opakowaniowy może zawierać pojemnik(i) do przechowywania czynnika farmaceutycznego.

P r z y k ł a d y

Następujące przykłady ilustrują niniejszy wynalazek i mają charakter jedynie ilustracyjny i nie mogą być rozumiane jako ograniczające jego zakres. Jest oczywistym, że zakresem wynalazku są objęte również i inne, ekwiwalentne a nie opisane niniejszym wykonania.

P r z y k ł a d 1. Aktywność VP, w której pośredniczy VEGF zależy od Src i Yes, ale nie od Fyn

Swoistość wymogu Src dla VP zbadano analizując zaindukowaną przez VEGF aktywność VP (przepuszczalności naczyń) związaną z SFK takimi, jak Fyn lub Yes, które, podobnie jak Src, są wyrażane w komórkach śródbłonka (Bull i wsp., FEBS Letters, 361: 41-44 (1994); Kiefer i wsp., Curr. Biol. 4: 100-109 (1994)). Potwierdzono, że te trzy SFK były jednakowo wyrażane w aortach myszy dzikich. Podobnie, jak myszy src^-/-, zwierzęta pozbawione Yes wykazywały również defekt w zaindukowanej przez VEGF VP. Zaskakująco jednak, myszy pozbawione Fyn utrzymały silną odpowiedź VP na VEGF, która nie różniła się znacząco od zwierząt kontrolnych. Zaburzenie indukowanej przez VEGF VP u myszy src^-/- lub yes^-/- wykazało, że aktywność kinazowa konkretnych SFK jest niezbędna dla zdarzenia sygnalizacyjnego, w którym pośredniczy VEGF prowadzącego do aktywności VP, lecz nie do angiogenezy.

Aktywność VEGF indukującą przepuszczalność naczyń w skórze myszy src^+/- (FIG. 5A, lewy panel) oraz src^-/- (FIG. 5A, prawy panel) wyznaczono przez śródskórne wstrzyknięcie roztworu soli lub VEGF (400 ng) myszom, którym wcześniej dożylnie wstrzyknięto barwnik błękit Evana. Po 15 minutach plastry skóry sfotografowano (słupek skali 1 nm). Gwiazdki wskazują miejsca wstrzyknięcia. Obszary otaczające miejsca wstrzyknięcia VEGF, bFGF lub soli wycięto, zaś VP oznaczono ilościowo przez elucję barwnika błękitu Evana w formamidzie w 58°C przez 24 godziny i pomiar absorbancji

PL 209 912 B1 przy długości fali 500 nm (FIG. 5B, lewy wykres). Zdolność mediatora zapalnego (izotiocyjanian allilu), o którym wiadomo, ż e indukuje zwią zaną z zapaleniem VP zbadano u myszy src^+/-lub myszy src^-/(FIG. 5B, po prawej).

Zdolność VEGF do indukcji VP porównano u myszy src^-/-, fyn^-/- lub yes^-/- w oznaczeniu Milesa (FIG. 5C). Dane dla każdego z oznaczeń Milesa wyrażono w postaci średniej ± SD z trzech zwierząt. Defekty VP u zwierząt^-/- i yes^-/- w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi były statystycznie istotne (*p<0,05, test t dla prób zależnych) podczas, gdy defekt VP u poddanych działaniu VEGF myszy fyn^-/ani u poddanych działaniu izotiocyjanianu allilu myszy src^+/- nie był znaczący (**p<0,05).

P r z y k ł a d 2. Myszy leczone inhibitorem kinazy tyrozynowej z rodziny Src oraz myszy Src^-/wykazują zmniejszone uszkodzenia tkanki związane z urazem lub obrażeniem naczyń krwionośnych w porównaniu z nieleczonymi myszami typu dzikiego

Inhibitory kinaz tyrozynowych z rodziny Src zmniejszają patologiczne przeciekanie i przepuszczalność naczyń po obrażeniu naczyń lub schorzeniu takim, jak udar. Śródbłonek naczyniowy jest dynamicznym typem komórek reagującym na wiele bodźców dla regulowania procesów takich, jak tworzenie nowych naczyń krwionośnych podczas angiogenezy nowotworu, do regulacji przepuszczalności ściany naczynia podczas wywołanego udarem obrzęku i uszkodzenia tkanek.

Zmniejszenie przepuszczalności naczyniowej w dwóch mysich modelach udaru przez zahamowanie szlaku Src przy pomocy leków wystarcza do zahamowania uszkodzenia mózgu przez zmniejszenie wywołanego niedokrwieniem przecieku naczyniowego. Ponadto, u myszy genetycznie pozbawionych Src, które wykazują zmniejszone przeciekanie/przepuszczalność naczyń, objętość zawału jest również zmniejszona. Połączenie danych zebranych za pomocą syntetycznych inhibitorów Src z wspierającymi je genetycznymi dowodami na zmniejszone przeciekanie naczyń w udarze i innych pokrewnych modelach, wykazuje fizjologiczne znaczenie tej strategii dla zmniejszenia uszkodzenia mózgu po udarach. Zahamowanie tych szlaków szeregiem dostępnych inhibitorów kinazy tyrozynowej z rodziny Src dla tych kaskad sygnalizacyjnych daje korzyść terapeutyczną łagodzenia uszkodzenia mózgu spowodowanego związanym z przepuszczalnością naczyń uszkodzeniem tkanek.

Zastosowano dwa różne sposoby indukowania ogniskowego niedokrwienia mózgu. Oba zwierzęce modele ogniskowego niedokrwienia mózgu są dobrze zbadane i szeroko stosowane w badaniach nad udarem. Oba modele stosowano wcześniej do badania patofizjologii niedokrwienia mózgu a takż e do badania nowych leków przeciwudarowych.

(a) Myszy znieczulono 2,2,2-tribromoetanolem (AVERTIN™) i utrzymywano temperaturę ciała przez trzymanie zwierzęcia na podgrzewanej macie. Dokonano nacięcia pomiędzy prawym uchem a prawym okiem. Czaszkę odsłonięto przez odciągnięcie mięśnia skroniowego i wywiercono mały otwór w obszarze nad tętnicą środkową mózgu (MCA). Usunięto opony i zamknięto prawą MCA przez koagulację przy pomocy drutu żarnikowego. Zwierzętom pozwolono wrócić do zdrowia i umieszczono je z powrotem w klatkach. Po 24 godzinach mózgi perfundowano, usunięto i pocięto na 1 mm skrawki poprzeczne. Skrawki zanurzono w 2% roztworze chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) i zidentyfikowano powierzchnię zawału jako niewybarwioną (białą) tkankę otoczoną żywą (czerwoną) tkanką. Objętość zawału zdefiniowano jako sumę niewybarwionych obszarów skrawków pomnożoną przez ich grubość.

Do badania roli Src w niedokrwieniu mózgu wykorzystano myszy pozbawione Src (Src -/-). Myszy Src+/- służyły jako kontrole. Stwierdziliśmy, że u myszy Src-/- objętość zawału była zmniejszona z 26 ± 10 mm³ do 16 ± 4 mm³ u kontroli 24 godziny po urazie. Efekt był jeszcze bardziej wyraź ny, gdy dzikim myszom C57B16 wstrzyknięto dootrzewnowo (i.p.) 1,5 mg/kg AGL1872 30 minut po zamknięciu naczynia. Rozmiar zawału zmniejszył się z 31 ± 12 mm³ w grupie nieleczonej do 8 ± 2 mm³w grupie leczonej AGL1872.

(b) W drugim modelu ogniskowego niedokrwienia mózgu MCA zamknięto umieszczając czop zatorowy u początku MCA. Pojedynczy cały bogaty w fibrynę 24-godzinny homologiczny skrzep umieszczono na początku MCA przy zastosowaniu zmodyfikowanego cewnika PE-50. Indukcję niedokrwienia mózgu wykazano przez zmniejszenie przepływu krwi w mózgu w półkuli leżącej po stronie zamknięcia w porównaniu z półkulą przeciwstronną. Po 24 godzinach mózgi usunięto, przygotowano serię skrawków i wybarwiono hematoksyliną-eozyną (HE). Objętości zawału wyznaczono dodając powierzchnie w seryjnych skrawkach HE pomnożone przez odległość pomiędzy każdym skrawkiem.

Zastosowane w tym badaniu dawkowanie AGL1872 (1,5 mg/kg i.p.) dobrano doświadczalnie. Wiadomo, że VEGF jest początkowo wyrażany około 3 godziny po niedokrwieniu mózgu i osiąga maksimum po 12 do 24 godzinach. W tym badaniu AGL1872 podano 30 minut po rozpoczęciu zawału

PL 209 912 B1 w celu pełnego zablokowania zaindukowanego przez VEGF zwiększenia przepuszczalności naczyń. Zgodnie z przebiegiem czasowym typowego wyrażania VEGF, potencjalne okno terapeutyczne dla podawania inhibitorów Src może dochodzić do 12 godzin po udarze. W chorobie związanej z utrzymującym się wzrostem przepuszczalności naczyń odpowiednie jest ciągłe podawanie leku hamującego Src.

FIG. 6 jest wykresem obrazującym porównawcze wyniki uśrednionych objętości zawału (mm³) w mózgach myszy po obraż eniu, gdzie myszy były heterozygotami Src (Src+/-), dominującymi negatywnymi mutantami Src *Src-/-), myszami dzikimi (WET) lub myszami dzikimi leczonymi 1,5 mg/kg AGL1872.

FIG. 1 przedstawia przykładowe skany sekwencyjnego IMRI wyizolowanego perfundowanego mózgu myszy po działaniu indukującym obrażenie CNS, gdzie kolejne skany u zwierzęcia leczonego AGL1872 (po prawej) wykazują mniejszy zawał mózgu, niż kolejne skany u kontrolnego, nieleczonego zwierzęcia (po lewej).

P r z y k ł a d 3. Szczury leczone inhibitorem kinazy tyrozynowej z rodziny Src oraz myszy Src-/- wykazują zmniejszone uszkodzenia tkanki związane z urazem lub obrażeniem wieńcowych naczyń krwionośnych w porównaniu z nieleczonymi myszami typu dzikiego

Niedokrwienie mięśnia sercowego zaindukowano przez podwiązanie tętnicy wieńcowej lewej przedniej zstępującej u szczurów Sprague-Dewley. Uszkodzoną tkankę serca kontaktowano z chemicznym inhibitorem kinazy tyrozynowej z rodziny Src przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src z klasy pirazolopirymidyn AGL1872 lub SKI-606 po zaindukowaniu niedokrwienia. W 24 godziny po operacji wyznaczono obrazy rezonansu magnetycznego wysokiej rozdzielczości (MRI), pomiary suchej masy, rozmiar zawału, objętość serca i zagrożony obszar. Współczynniki przeżywalności i echokardiografię wyznaczono 4 tygodnie po operacji u szczurów, które otrzymywały zastrzyki i.p. inhibitora w dawce około 1,5 mg/kg po zawale mięśnia sercowego (MI).

FIG. 11 przedstawia mikrofotograficzne obrazy leczonych (po lewej) i kontrolnych (po prawej) tkanek serca szczura wybarwionych barwnikiem eozynowym (barwienie przyżyciowe). Tkanka kontrolna (obraz u góry po prawej) wykazuje duży obszar nekrozy na obrzeżach tkanki. W przeciwieństwie do niej, tkanka leczona (obraz u góry po lewej) wykazuje bardzo niewiele tkanki nekrotycznej.

FIG. 12 przedstawia wykres słupkowy rozmiaru zawału 24 godziny po leczeniu (w mg tkanki) w funkcji stężenia inhibitora (AGL1872). Optymalny poziom hamowania osią gnięto przy dawce około 1,5 mg/kg. Dawka około 3 mg/kg nie spowodowała znaczącego zmniejszenia rozmiaru zawału.

Leczenie inhibitorem kinazy tyrozynowej z rodziny Src dało w rezultacie zmniejszenie rozmiaru zawału i zagrożonego obszaru w sposób zależny od dawki w ciągu 24 godzin po operacji. Maksymalne hamowanie o około 68% (P<0,05) rozmiaru zawału uzyskano przy dawce inhibitora około 1,5 mg/kg dostarczonej około 45 minut po zaindukowaniu niedokrwienia (FIG. 13). Inhibitor był też skuteczny przy podawaniu około 6 godzin po zaindukowaniu niedokrwienia, powodując zmniejszenie rozmiaru zawału o około 42% (p<0,05). Hamowanie Src nie zaburzało ekspresji VEGF w niedokrwionych tkankach, jak wyznaczono to na podstawie analizy immunohistochemicznej. Zmniejszonemu rozmiarowi zawału towarzyszyła zmniejszona zawartość wody w mięśniu sercowym (około 5% +/- 1,3%; p<0,05) oraz zmniejszenie objętości obrzękłej tkanki wykrywanej w MRI, co wskazuje na to, że korzystny wpływ hamowania Src jest związany z zapobieżeniem pośredniczonej przez VEGF VP (FIG. 14). Frakcja skracania włókien badana przez echokardiografię około 4 tygodni po operacji wynosiła około 29% w kontroli i około 34% u leczonych szczurów (p<0,05). Co znaczące, przeżywalność po czterech tygodniach była nieoczekiwanie wysoka (100%) u szczurów leczonych, w porównaniu z około 63% u szczurów kontrolnych.

Dla dokładnego śledzenia obrzęku in vivo zastosowaliśmy obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) o dużej rozdzielczości do zbadania tkanki serca szczurów leczonych lub nieleczonych inhibitorami Src AGL 1872 lub SKI-606 po stałym zamknięciu tętnicy wieńcowej lewej przedniej zstępującej (LAD). Ze względu na zwiększoną zawartość wody oczekuje się, że obrzękłe obszary będą miały dłuższy czas relaksacji T2 niż obszary nieobrzękłe. Dla ilościowego oznaczenia obrzęku wydzielono obszary o T2>49 ms (więcej niż dwa odchylenia standardowe powyżej średniej dla prawidłowo perfundowanego mięśnia sercowego). Jedną godzinę od początku niedokrwienia sygnał T2-zależny wskazał, że hamowanie Src nie miało wpływu na początkowy obrzęk cytotoksyczny. Jednakże po 24 godzinach obliczone mapy T2 wykazały 47% zmniejszenie związanego z zawałem obrzęku mięśnia sercowego pod wpływem AGL1872 w porównaniu z nośnikiem (n=2 w grupie AGL1872, n=1 w grupie z noś nikiem). Wynik ten koreluje z zawartoś cią wody w mięśniu sercowym obliczon ą ex vivo przy pomocy mokrej/suchej masy nie niedokrwionego mięśnia sercowego. AGL1872 dostarczył zależnego od

PL 209 912 B1 dawki zmniejszenia obrzęku i rozmiaru zawału, z maksymalnym zmniejszeniem przy 1,5 mg/kg (n>5 w każdej grupie, P<0,001). SK-606 takż e dostarczył znaczącego zmniejszenia rozmiaru zawału przy podawaniu po stałym zamknięciu u myszy i szczura. Dla zbadania kinetyki tej odpowiedzi AGL1872 podawano w różnym czasie od zamknięcia. Podczas gdy maksymalną korzyść (rozmiar zawału mniejszy o 50%) osiągnięto przy podawaniu 45 minut po zamknięciu, leczenie po 6 godzinach wciąż dawało 25% ochrony (n=5 w każdej grupie, P<0,05).

Echokardiografia wykazała, że hamowanie Src pozwala znacząco zachować przez cztery tygodnie frakcje skracania włókien i średnicę rozkurczową lewego przedsionka (LV) w porównaniu ze szczurami nieleczonymi, co wskazuje na długoterminowe zachowanie funkcji kurczliwej w ratowanej tkance. Hamowanie Src miało także korzystny wpływ na skurczową średnicę LV i segmentarną kurczliwość mięśnia sercowego (Tabela 1). Leczenie inhibitorem Src SKI-606 także miało korzystny wpływ na frakcję skracania włókien i segmentarną kurczliwość mięśnia sercowego (n=7 w każdej grupie, P<0,01). Dla zbadania przeżywalności po MI wykorzystaliśmy dwuletnie czarne myszy C57 jako model cechujący się znaczną śmiertelnością (>40%) po podwiązaniu LAD. Podanie AGL1872 (1,5 mg/kg) 45 po MI zwiększyło przeżywalność w porównaniu z kontrolą w ciągu pierwszych 4 tygodni (odpowiednio 91,7% vs, 58,3%, n=12 w każdej grupie), wykazując długofalowe działanie terapeutyczne hamowania Src.

T a b e l a 1

Funkcjonalne ozdrowienie po MI: Echokardiografia

	Kontrola	AGL 1872	% polepszenia	Wartość P
Średnica LV, rozkurcz (mm)	0,93 ± 0,02	0,82 ± 0,02	11	0,01
Średnica LV, skurcz (mm)	0,71 ± 0,03	0,59 ± 0,04	16	0,03
Frakcja skracania włókien (%)	23,8 ± 1,7	32, 8 ± 3,2	38	0,03
Segmentarna kurczliwość mięśnia sercowego	26,9 ± 0,8	24,0 ± 0,5	9	0,01
Liczba szczurów w grupie	8	8

Przewlekłe zwłóknienie mięśnia sercowego następuje po zawale i jest bezpośrednim odzwierciedleniem zakresu nekrozy tkanek po MI. Dla zbadania wpływu hamowania Src na zwłóknienie 4 tygodnie po MI u szczurów przeprowadzono analizę histopatologiczną zwłókniał ej tkanki, przy pomocy elastycznego barwienia trójbarwnego. Hamowanie Src przyczyniło się do 52% zmniejszenia zwłóknienia tkanki LV w porównaniu z kontrolą (19,1 ± 2,2% vs. 40,0 ± 3,0%, n=4 w każdej grupie, P<0,01). Wśród próbek, którym podano inhibitor Src obserwowano powtarzalnie lepsze zachowanie włókien mięśnia sercowego i architektury LV, co wskazuje, że hamowanie Src przyczynia się do długofalowego działania ochronnego na mięsień sercowy po MI.

Dla określenia skuteczności hamowania Src po przejściowym niedokrwieniu szczury poddano zamknięciu, po którym nastąpiła reperfuzja, a następnie zbadano funkcję przedsionkową i rozmiar zawału po 24 godzinach. Hamowanie Src przez AGL1872 zachowało frakcję skracania włókien lewego przedsionka (LV) i zmniejszyło rozmiar zawału w porównaniu z kontrolami (n=4 w każdej grupie, P<0,05). 18% zmniejszenie rozmiaru zawału po niedokrwieniu-reperfuzji porównuje się z 50% zmniejszeniem po trwałym zamknięciu, w którym bodziec niedotlenienia kierujący wyrażaniem VEGF jest utrzymywany. Ponadto, SKI-606 (5 mg/kg) umożliwił 43% zmniejszenie rozmiaru zawału w modelu niedokrwienia-reperfuzji (n=5 w każdej grupie, P<0,01). Dane te zebrane razem wykazują korzystne działanie hamowania Src po przejściowym niedokrwieniu.

P r z y k ł a d 4. Wpływ MI na stan naczyń i żywotność miocytów w strefie około-zawałowej.

Ponieważ ekspresja VEGF wzrasta głównie w strefie około-zawałowej, zbadano ultrastrukturalne skutki hamowania Src na małe naczynia w tym obszarze 3-24 godziny po MI. Tabela 2 przedstawia podsumowanie obserwacji dla 250 naczyń krwionośnych zbadanych w każdej grupie przy zastosowaniu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W przeciwieństwie do prawidłowej tkanki mięśnia sercowego, w tkance dotkniętej zawałem zaobserwowano liczne przykłady uszkodzeń w strefie okołozawałowej. Wynaczynione komórki krwi (czerwone krwinki, płytki i granulocyty obojętnochłonne) były obecne w śródmiąższu, wyraźnie na skutek ucieczki z pobliskich naczyń. Niektóre komórki śródbłonka (EC) były obrzmiałe i zamykały część światła naczynia, często wyglądając na przezroczyste dla elektronów i zawierając liczne kaweole. W śródbłonku obecne były duże okrągłe wakuole, nierzadko kilkaPL 209 912 B1 krotnie większe niż grubość EC. Obrażenia miocytów narastały wraz z czasem po MI i różniły się pomiędzy sąsiadującymi komórkami, objawiając się jako pękanie mitochondriów, zaburzenia grzebieni (cristae) mitochondrialnych, obrzęk wewnątrzkomórkowy i rozpad miofilamentów. Najciężej dotknięte miocyty często sąsiadowały z uszkodzonymi naczyniami krwionośnymi lub wolnymi komórkami krwi. Często obserwowaliśmy 24 godziny po MI granulocyty obojętnochłonne, które uczestniczą w ostrej odpowiedzi na obrażenie i mogą przyczyniać się do wytwarzania VEGF.

T a b e l a 2. Obserwacje ultrastrukturalne w tkance serca myszy po MI lub wstrzyknięciu VEGF

	Dysfunkcja bariery EC	Aktywacja i przyleganie płytek	Obrażenia	EC Uszkodzenia serca
3 godz. po MI	18	36	31	22
3 godz. po MI + AGL1872	2	11	14	2
24 godz. po MI	5	7	34	45
24 godz. po MI + AGL1872	0	1	15	9
Kontrola	0	0	1	0
VEGF, pp60Src +/+	24 '	18	33	16
VEGF, pp60Src +/+	0	0	0	0

Dla każdej z grup tkankę lewego przedsionka badano przez 4 godziny (około 250 mikronaczyń) za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, zaś obserwacje zliczano i grupowano według:

(a) Dysfunkcja bariery EC: Przerwy, fenestracja, wynaczynione komórki krwi, (b) Aktywacja/przyleganie płytek: Płytki, degranulacja płytek, skupiska płytek, przyleganie płytek do ECM (c) Obrażenia EC: EC przezroczyste dla elektronów, obrzmiałe EC, duże wakuole EC, zamknięte światło naczynia, i (d) Uszkodzenia serca: Pęcznienie mitochondriów, zaburzenia grzebieni, rozpad miofilamentów

Trzy godziny po MI często obserwowano przerwy pomiędzy sąsiadującymi EG, co może wyjaśnić wynaczynianie komórek krwi do otaczającej przestrzeni śródmiąższowej. Co zaskakujące, wiele z tych przerw było zatkanych przez płytki. Niektóre płytki kontaktowały się z błoną podstawną odsłoniętą pomiędzy EC, podczas gdy w innych przypadkach błona podstawna też wyglądała na przerwaną. Niektóre płytki uległy degranulacji i mogły zapoczątkować dalszą aktywację, przyleganie i agregację krążących płytek. Podczas gdy czopy płytkowe mogły zapobiec dalszemu przeciekaniu naczynia, mogły też przypadkowo przyczynić się do zmniejszenia perfuzji małych naczyń przez tworzenie mikroskrzepów, co mogło prowadzić do postępu związanej z niedokrwieniem choroby tkanek.

P r z y k ł a d 5. MI i systematyczne wstrzykiwanie VEGF wytwarzają podobną odpowiedź naczyniową.

Dla wyznaczenia udziału VEGF w złożonej patologii MI wstrzyknięto dożylnie VEGF normalnym myszom i zbadano na poziomie ultrastrukturalnym tkankę serca po 30 minutach. Zaskakująco, zakres zaburzeń bariery śródbłonkowej i obrażeń naczyń zaindukowanych przez VEGF był porównywalny z obserwowanym w strefie około-zawałowej po MI. Zaobserwowano znaczące przyleganie płytek do błony podstawnej EG oraz uszkodzenia miocytów. Podobne ślady uszkodzeń w mózgu zaobserwowano po ogólnoustrojowym wstrzyknięciu VEGF, co sugeruje, że działanie to może mieć charakter ogólnoustrojowy. Wyniki te wykazują, że pośredniczona przez VEGF VP naśladuje wiele spośród skutków naczyniowych po MI.

Dla stwierdzenia, czy VEGF wystarcza do pośredniczenia w długofalowej patologii związanej z MI myszom wstrzyknię to czterokrotnie VEGF w cią gu 2 godzin. Dział anie to wywoł a ł o uszkodzenia podobne do zaobserwowanych 24 godziny po MI. Stwierdzono przyleganie płytek, granulocyty obojętnochłonne i znaczne uszkodzenia miocytów, a także liczne przezroczyste dla elektronów EC, z których wiele obrzmiało i zamykało światło naczynia. W sumie, poddanie działaniu VEGF przez 30 minut wystarczyło do zaindukowania ultrastruktury podobnej do obserwowanej po 3 godzinach MI, w którym

PL 209 912 B1 to czasie ekspresja VEGF w strefie około-zawałowej znacząco wzrasta. Długofalowe działanie VEGF wywołało przemodelowanie naczyń podobne do obserwowanego w tkankach 24 godziny po MI.

Fakt, że myszy pozbawione Src były chronione po MI i nie wykazywały VP w skórze i mózgu po miejscowym wstrzyknięciu VEGF sugeruje, że myszy pozbawione Src nie uległy zaindukowanej przez VEGF VP w sercu. Zgodnie z wynikami uzyskanymi dla inhibitorów Src, nie zaobserwowano żadnych oznak odpowiedzi naczyniowej po wstrzyknięciu VEGF u myszy pp60Src-/- (Tabela 2), w porównaniu z przerwami, aktywnoś cią pł ytek, zaburzeniami EC i wynaczynionymi komórkami krwi u myszy dzikich. Całkowite zablokowanie wszelkiej odpowiedzi sugeruje, że aktywność Src, w której pośredniczy VEGF zapoczątkowuje kaskadę prowadzącą do zaindukowanych przez VP obrażeń podczas choroby niedokrwiennej.

Dyskusja

U myszy ogólnoustrojowe podawanie przeciwciał a przeciwko VE-kadherynie powodował o VP w sercu i w płucach, obrzęk śródmiąższowy i ogniska odsłoniętej błony podstawnej wyglądające na poziomie ultrastruktury podobnie do uszkodzeń obserwowanych po podaniu VEGF. W zarodkach myszy, pozbawione β-kateniny naczynia krwionośne zawierają spłaszczone, ulegające fenestracji komórki śródbłonka, związane z częstymi krwotokami. Wcześniejsze badania in vitro wykazały rolę VEGF w regulacji funkcji VE-kadheryny. W EC w warunkach przepływu VE-kadheryna tworzy kompleksy z Flk. Dla zbadania kompleksu VE-kadheryny z VEGF in vivo przygotowano lizaty serc myszy, którym wstrzyknięto VEGF albo nie. Lizaty te poddano immunoprecypitaci i anty-Flk, po czym immunohybrydyzacji pod kątem VE-kadheryny i β-kateniny. U myszy kontrolnych zaobserwowano istniejący uprzednio kompleks Flk, β-kateniny i VE-kadheryny w naczyniach krwionośnych. Kompleks ten był szybko rozbijany w ciągu 2-5 minut od stymulacji VEGF i ponownie formował się przed upływem 15 minut w naczyniach krwionośnych in vivo. Skala czasowa dysocjacji kompleksu odpowiadała skali czasowej fosforylacji Flk, β-kateniny i VE-kadheryny oraz dysocjacji β-kateniny od VE-kadheryny. Te pośredniczone przez VEGF wydarzenia są zależne od Src, ponieważ kompleks sygnalizujący Flk-kadheryna-katenina pozostawał nienaruszony, a fosforylacja β-kateniny i VE-kadheryny nie zachodziła, u myszy stymulowanych VEGF, którym uprzednio podano inhibitory Src. Wydarzeń tych nie obserwowano po wstrzyknięciu zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), podobnego angiogennego czynnika wzrostu, który nie wywołuje przepuszczalności naczyń.

Podczas, gdy pojedyncze wstrzyknięcie VEGF powodowało odwracalną, szybką i przejściową odpowiedź sygnalizacyjną, która powracała do podstawowego poziomu po 15 minutach, cztery wstrzyknięcia VEGF (co trzydzieści minut) wytworzyły przedłużoną odpowiedź sygnalizacyjną. Przykładowo, dysocjacja Flk-kateniny i fosforylacja Erk utrzymywały się podczas przedłużonego działania VEGF. Model ten może mieć zastosowanie do fizjologicznej sytuacji po MI, gdzie ekspresja VEGF wzrasta z powodu niedotlenienia i utrzymuje się w ciągu dni.

Src odgrywa fizjologiczną rolę w VP o ostrym MI lub po ogólnoustrojowym podaniu VEGF. Złe prognozy po MI są wyraźnie w części spowodowane zwiększoną przepuszczalnością perfundowanych mikronaczyń w sercu otaczających strefę zawału. Naczynia te niekorzystnie reagują na działanie VEGF i ulegają zależnemu od Src wzrostowi VP, co prowadzi do zamknięcia lub zapadnięcia się naczynia i ostatecznie do uszkodzenia otaczających je miocytów. Jest to zgodne z utrzymywaniem się słabej perfuzji tkanek i wysoką śmiertelnością, które udokumentowano jako następstwa MI, pomimo otwarcia naczyń podczas reperfuzji. Zahamowanie Src nawet do 6 godzin po MI wciąż dostarcza znaczącą ochronę przeciwko zaindukowanej przez VEGF VP, co wskazuje na znaczenie tej strategii w warunkach klinicznych. Podawanie inhibitorów Src po MI zdaje się ograniczać VP przez zapobieżenie dysocjacji kompleksów Flk-kadheryna-katenina, które utrzymują funkcję bariery śród błonkowej.

Dane ultrastrukturalne sugerują, że początkowe skutki działania VEGF po MI polegają na otwarciu połączeń śródbłonkowych i odsłonięciu błony podstawnej śródbłonka. Płytki, z których wiele uległo degranulacji i aktywacji, przylegają do tych miejsc. Jest to interesujące, ponieważ płytki zawierają VEGF, który po miejscowym uwolnieniu podczas aktywacji płytek może wzmacniać odpowiedź VP. W istocie możliwe jest, że część z korzystnych skutków zahamowania Src spowodowana jest jego wpływem na aktywację płytek. Na podstawie prezentowanych danych oczywiste jest, że wczesne wydarzenia po MI inicjują kaskadę, która powoduje nagromadzanie się obrzęku, zniszczeń tkanek, co następnie prowadzi do zwłóknienia i przemodelowania tkanki serca. Należy podkreślić, że zwłókniała przemodelowana tkanka serca jest funkcjonalnie słabsza niż prawidłowa tkanka serca. Wcześniej ograniczając wpływ obrażenia możemy zatem spodziewać się długofalowych korzyści spowodowanych zmniejszoną potrzebą przemodelowania tkanki serca. Ponieważ zablokowanie pojedynczego

PL 209 912 B1 naczynia wieńcowego wywołuje ostre obrażenia, prowadzące do przyrostu strefy zawału, zwłóknienia, a w niektórych przypadkach ś mierci, wczesna skuteczna interwencja w tym procesie moż e dostarczyć długofalową ochronę i korzyść.

Prezentowane dane ujawniają, że inhibitor Src może skutecznie odgrywać taką rolę. Hamowanie Src utrzymuje kompleks Flk-kadheryna-katenina i uodparnia połączenia śródbłonkowe na wywołujące przepuszczalność działanie VEGF.

Co zaskakujące, ogólnoustrojowe wstrzyknięcie VEGF wytworzyło wiele ultrastrukturalnych skutków w naczyniach krwionośnych serca przypominających obserwowane po MI. Sam VEGF wystarczał do zaindukowania zaburzenia funkcji bariery śródbłonkowej i uszkodzenia naczynia krwionośnego in vivo. Podobnie, sposób według niniejszego wynalazku, polegający na blokowaniu Src przy pomocy inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src, nie tylko hamował te wydarzenia następujące po MI, ale działał tak również po ogólnoustrojowym podaniu VEGF. Hamowanie Src stabilizuje kompleks Flk-kadheryna-katenina pomimo stymulacji VEGF. Do zaindukowanej przez VEGF VP mogą też przyczyniać się kaweole lub organella pęcherzykowo-wakuolarne (VVO) i fenestracje. Takie drogi przepuszczalności mogą również zależeć od Src, gdyż myszy pp60Src-/- nie wykazują żadnych znaków przepuszczalności po wstrzyknięciu VEGF. Alternatywnie, przerwy śródbłonkowe, wynaczynione komórki krwi i odsłonięta błona podstawna mogą indukować fenestracje i VVO-y.

VEGF jest wyrażany in vivo w odpowiedzi na szereg różnych czynników (cytokiny, onkogeny, niedotlenienie) i działa w kierunku zwiększenia przepuszczalności i angiogenezy, a także proliferacji, migracji i ochrony przed apoptozą komórek śródbłonka. Nowotwory wytwarzają duże ilości VEGF, który można wykryć w krwiobiegu. W istocie, naczynia krwionośne wewnątrz lub w pobliżu nowotworów wykazują wiele wspólnych cech obserwowanych w niniejszych badaniach po wstrzyknięciu VEGF takich, jak ulegający fenestracji śródbłonek, otwarte połączenia międzyśródbłonkowe i groniaste połączone kaweole. Poziomy VEGF w surowicy pacjentów z różnymi nowotworami mogą wynosić od 100-3000 pg/ml, podczas gdy lokalne poziomy VEGF w tkance lub komórkach mogą być 10-100 razy wyższe. U pacjentów po MI opisano poziomy VEGF w surowicy pomiędzy 100-400 pg/ml, są one wyższe u pacjentów z ostrym MI w porównaniu z pacjentami ze stabilną dusznicą (anginą). Podobnie jak w niektórych pierwotnych i przerzutowych nowotworach, lokalne poziomy VEGF w obszarze około-zawałowym mogą znacznie przewyższać poziomy w surowicy. Niniejsze dane mogą wyjaśnić obserwacje, że u niektórych pacjentów chorych na chorobę nowotworową występuje wzrost choroby zakrzepowej, ponieważ zwiększone nagromadzenie VEGF w krwiobiegu zapoczątkowało by odpowiedź VP, która przyciąga płytki i prowadzi do utraty przepływu krwi. Ponadto, niedawno opisane obserwacje mogą wyjaśnić wysięk opłucnowy i ogólny obrzęk związane z późnymi stadiami choroby nowotworowej. Blokowanie Src może, zatem mieć głęboki wpływ na związaną z nowotworem chorobę obrzękową.

AGL1872, obok hamowania kinaz tyrozynowych z rodziny Src, zaburza także działanie szeregu innych kinaz, podczas gdy SKI-606 jest bardziej wybiórczy względem Src i Yes. Oba te inhibitory wykazywały podobny wzór aktywności biologicznej, odzwierciedlający skutki obserwowane u myszy pozbawionych Src. Fakt, że farmakologiczne inhibitory Src podawane zwierzętom typu dzikiego wywoływały takie same skutki w obrażeniach tkanek, biochemii i ultrastrukturze naczyń serca, jak obserwowano u myszy z nokautem genowym, sugeruje, że działanie to jest zasadniczo spowodowane przeciekami, w których pośredniczy EC i nie jest związane z predyspozycją genetyczną u tych zwierząt. Src i Yes, ale nie Fyn są niezbędne dla odpowiedzi VP, w której pośredniczy VEGF i przyrostu tkanki zawałowej po obrażeniu niedokrwiennym w mózgu. Razem dane te sugerują, że korzystny wpływ podawania inhibitora kinazy tyrozynowej z rodziny Src po MI jest w istocie zależny od hamowania Src i wykazują, że związanymi z nim kinazami Src są najprawdopodobniej pp60Src i pp62yes.

Zasadniczo identyczne zmiany ultrastrukturalne obserwowano po MI lub po bezpośrednim wstrzyknięciu VEGF. Fakt, że VEGF działa głównie na śródbłonek, a nie na inne typy komórek, sugeruje, że blokowanie Src w EC odpowiada za obserwacje ultrastrukturalne. Ponadto, większość obserwowanych zmian była bezpośrednio związana ze zmianami w kontaktach między komórkami EC i całości naczynia krwionośnego, z których to zmian niewiele lub żadnych nie obserwowano u zwierzą t z nokautem Src albo zwierzą t dzikich leczonych inhibitorami Src. Co ważne, rola Src w VP może być przypisana zdolności do fosforylowania VE-kadheryny i β -kateniny i wywoływania dysocjacji kompleksu pomiędzy tymi białkami odpowiedzialnymi za połączenia międzykomórkowe a receptorem VEGF - Flk.

PL 209 912 B1

Sposoby według niniejszego wynalazku są dobrze dostosowane do swoistego złagodzenia zaindukowanych przez VP uszkodzeń tkanek, zwłaszcza wynikających z zawału mięśnia sercowego, gdyż ukierunkowane hamowanie działania kinazy tyrozynowej z rodziny Src koncentruje się na hamowaniu VP bez długofalowego wpływu na inne zaindukowane przez VEGF odpowiedzi, które mogą być korzystne dla odzyskania zdrowia po obrażeniu.

Src zdaje się regulować uszkodzenia tkanek przez wpływ na przepuszczalność naczyń, w którym pośredniczy VEGF stanowi zatem nowy cel terapeutyczny w patofizjologii niedokrwienia mięśnia sercowego. Zakres uszkodzeń mięśnia sercowego po zamknięciu tętnicy wieńcowej może być znacząco zmniejszony przez ostre farmakologiczne zahamowanie kinaz tyrozynowych z rodziny Src.

Zastosowanie syntetycznych stosunkowo drobnocząsteczkowych inhibitorów chemicznych jest ogólnie bezpieczniejsze i łatwiejsze do kontrolowania, niż zastosowanie stosunkowo większych białek. Te pierwsze są zatem korzystniejsze jako aktywne terapeutycznie czynniki.

Powyższy opis pozwoli specjaliście na praktykowanie wynalazku. W istocie, szereg różnych modyfikacji wynalazku obok przedstawionych tu i opisanych będzie oczywistych dla specjalistów na podstawie powyższego opisu i znajdzie się w zakresie dołączonych zastrzeżeń.

PL 209 912 B1

Lista Sekwencji <110> The Scripps Research Institute Cheresh, David A.

Paul, Robert Eliceiri, Brian <120> Zastosowanie inhibitora kinazy tyrazynowej w medycynie <130> TSRI-651.6 <150> 10/298,377 <151> 2002-11-18 <150> 09/538,248 <151> 2000-03-29 <150> 09/470,881 <151> 1999-12-22 <150> PCT/US99/11780 <151> 1999-05-28 <150> 60/087,220 <151> 1998-05-29 <160> 4 <170> FastSEQ for Windows wersja 4.0 <210> 1 <211> 2187 <212> DNA <213> homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (134)...(1486) <400> 1 gcgccgcgtc ccgcaggccg tgatgccgcc cgcgcggagg tggcccggac cgcagtgccc 60 caagagagct ctaatggtac caagtgacag gttggcttta ctgtgactcg gggacgccag 120 agctcctgag aag atg tca gca ata cag gcc gcc tgg cca tcc ggt aca 169

Met Ser Ala Ile Gin Ala Ala Trp Pro Ser Gly Thr 15 10

gaa Glu

tgt Cys

att Ile 15

gcc Ala

aag Lys

tac Tyr

aac Asn

ttc Phe 20

cac His

ggc Gly

act Thr

gcc Ala

gag Glu 25

cag Gin

gac Asp

ctg Leu

217

ccc

ttc

tgc

aaa

gga

gac

gtg

ctc

acc

att

gtg

gcc

gtc

acc

aag

gac

265

PL 209 912 B1

Pro

Phe 30

Cys

Lys

Gly

Asp

Val 35

Leu

Thr

Ile

Val

Ala 40

Val

Thr

Lys

Asp

ccc

aac

tgg

tac

aaa

gcc

aaa

aac

aag

gtg

ggc

cgt

gag

ggc

atc

313

Pro

Asn

Trp

Tyr

Lys

Ala

Lys

Asn

Lys

Val

Gly

Arg

Glu

Gly

Ile

45

50

55

60

cca

gcc

aac

tac

gtc

cag

aag

ccg

gag

ggc

gtg

aag

gcg

ggt

acc

361

Pro

Ala

Asn

Tyr

Val

Gin

Lys

Arg

Glu

Gly

Val

Lys

Ala

Gly

Thr

Lys

65

70

75

ctc

agc

ctc

atg

cct

tgg

ttc

cac

ggc

aag

atc

aca

cgg

gag

cag

get

409

Leu

Ser

Leu

Met

Pro

Trp

Phe

His

Gly

Lys

Ile

Thr

Arg

Glu

Gir.

Ala

80

85

90

gag

cgg

ctt

ctg

tac

ccg

gag

aca

ggc

ctg

ttc

ctg

gtg

cgg

gag

457

Glu

Arg

Leu

Tyr

Pro

Glu

Thr

Gly

Leu

Phe

Leu

Val

Arg

Glu

95

100

105

ago

acc

aac

tac

ccc

gga

gac

tac

acg

ctg

tgc

gtg

agc

tgc

gac

ggc

505

Ser

Thr

Asn

Tyr

Pro

Gly

Asp

Tyr

Thr

Leu

Cys

Val

Ser

Cys

Asp

Gly

110

115

120

aag

gtg

gag

cac

tac

coc

atc

atg

tac

cat

gcc

agc

aag

ctc

agc

atc

553

Lys

Val

Glu

His

Tyr

Arg

Ile

Met

Tyr

His

Ala

Ser

Lys

Leu

Ser

Ile

125

130

135

140

gac

gag

gtg

tac

ttt

gag

aac

ctc

atg

cag

ctg

gtg

gag

cac

tac

601

Asp

Glu

Val

Tyr

Phe

Glu

Asn

Leu

Met

Gin

Leu

Val

Glu

His

Tyr

145

150

155

acc

tca

gac

gca

gat

gga

ctc

tgt

acg

cgc

ctc

att

aaa

cca

aag

gtc

64 9

Thr

Ser

Asp

Ala

Asp

Gly

Leu

Cys

Thr

Arg

Leu

Ile

Lys

Pro

Lys

Val

160

165

170

atg

gag

ggc

aca

gtg

gcg

gcc

cag

gat

gag

ttc

tac

cgc

agc

ggc

tgg

697

Met

Glu

Gly

Thr

Val

Ala

Gin

Asp

Glu

Phe

Tyr

Arg

Ser

Gly

Trp

175

18C

185

gcc

ctg

aac

atg

aag

gag

ctg

aag

ctg

cag

acc

atc

ggg

aag

ggg

745

Ala

Leu

Asn

Met

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

G1 n

Thr

Ile

Gly

Lys

Gly

190

195

200

gag

ttc

gga

gac

gtg

atg

ctg

ggc

gat

tac

ega

ggg

aac

aaa

gtc

gcc

793

Glu

Phe

Gly

Asp

Val

Met

Leu

Gly

Asp

Tyr

Arg

Gly

Asn

Lys

Val

Ala

205

210

215

220

gtc

aag

tgc

att

aag

aac

gac

gcc

act

gcc

cag

gcc

ttc

ctg

get

gaa

841

Val

Lys

Cys

Ile

Lys

Asn

Asp

Ala

Thr

Ala

Gin

Ala

Phe

Leu

Ala

Glu

225

230

235

gcc

tca

gtc

atg

acg

caa

ctg

cgg

cat

agc

aac

ctg

gtg

cag

ctc

ctg

889

Ala

Ser

Val

Met

Thr

Gin

Leu

Arg

His

Ser

Asn

Leu

Val

Gin

Leu

240

245

250

ggc

gtg

atc

gtg

gag

aag

ggc

ggg

ctc

tac

atc

gtc

act

gag

tac

937

Gly

Val

Ile

Val

Glu

Lys

Gly

Leu

Tyr

Ile

Val

Thr

Glu

Tyr

255

260

265

atg

gcc

aag

ggg

agc

ctt

gtg

gac

tac

ctg

cgg

tet

agg

ggt

cgg

tca

985

Met

Ala

Lys

Gly

Ser

Leu

Val

Asp

Tyr

Leu

Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

PL 209 912 B1

270

275

280

gtg

ctg

ggc

gga

gac

tgt

ctc

aag

ttc

teg

eta

gat

gtc

tgc

gag

1033

Val

Leu

Gly

Asp

Cys

Leu

Lys

Phe

Ser

Leu

Asp

Val

Cys

Glu

285

290

295

300

gcc

atg

gaa

tac

ctg

gag

ggc

aac

aat

ttc

gtg

cat

ega

gac

ctg

get

1081

Ala

Met

Glu

Tyr

Leu

Glu

Gly

Asn

Phe

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

305

310

315

gcc

cgc

aat

gtg

ctg

gtg

tct

gag

gac

aac

gtg

gc.c

aag

gtc

age

gac

1129

Ala

Arg

Asn

Val

Leu

Vai

Ser

Glu

Asp

Asn

Val

Ala

Lys

Val

Ser

Asp

320

325

330

ttt

ggt

ctc

acc

aag

gag

gcg

t cc

age

acc

cag

gac

acg

ggc

aag

ctg

1177

Phe

Gly

Leu

Thr

Lys

Glu

Ala

Ser

Thr

Gin

Asp

Thr

Gly

Lys

Leu

335

340

345

cca

gtc

aag

tgg

aca

gcc

cct

gag

gcc

ctg

aga

gag

aag

aaa

ttc

tcc

1225

Pro

Val

Lys

Trp

Thr

Ala

Pro

Glu

Ala

Leu

Arg

Glu

Lys

Phe

Ser

350

355

360

act

aag

tct

gac

gtg

tgg

agt

ttc

gga

atc

ctt

ctc

tgg

gaa

atc

tac

1273

Thr

Lys

Ser

Asp

Val

Trp

Ser

Phe

Gly

Ile

Leu

Trp

Glu

Ile

Tyr

365

370

375

380

tcc

ttt

ggg

ega

gtg

cct

tat

cca

aga

att

ccc

ctg

aag

gac

gtc

1321

Ser

Phe

Gly

Arg

Val

Pro

Tyr

Pro

Arg

Ile

Pro

Leu

Lys

Asp

Val

385

390

395

cct

cgg

gtg

gag

aag

ggc

tac

aag

atg

gat

gcc

ccc

gac

ggc

tgc

ccg

1369

Pro

Arg

Val

Glu

Lys

Gly

Tyr

Lys

Met

Asp

Ala

Pro

Asp

Gly

Cys

Pro

400

405

41C

ccc

gca

gtc

tat

gaa

gtc

atg

aag

aac

tgc

tgg

cac

ctg

gac

gcc

1417

Pro

Ala

Val

Tyr

Glu

Val

Met

Lys

Asn

Cys

Trp

His

Leu

Asp

Ala

415

420

425

atg

cgg

ccc

tcc

ttc

eta

cag

ctc

ega

gag

cag

ctt

gag

cac

atc

aaa

1465

Met

Arg

Pro

Ser

Phe

Leu

Gin

Leu

Arg

Glu

Gin

Leu

Glu

His

Ile

Lys

430

435

440

acc

cac

gag

ctg

cac

ctg

tga

cggctggcct ccgcctgggt catgggcctg

1516

Thr

His

Glu

Leu

His

Leu

*

445

450

tggggactga acctggaaga tcatggacct ggtgcccctg ctcactgggc ccgagcctga 1576 actgagcccc agcgggctgg ogggcctttt tcctgcgtcc cagcctgcac ccctccggcc 1636 ccgtctctct tggacccacc tgtggggcct ggggagccca ctgaggggcc agggaggaag 1696 gaggccacgg agcgggaggc agcgccccac cacgtcgggc ttccctggcc tcccgccact 1756 cgccttctta gagttttatt cctttccttt tttgagattt tttttccgtg tgtttatttt 1816 ttattatttt tcaagataag gagaaagaaa gtacccagca aatgggcatt ttacaagaag 1876 tacgaatctt atttttcctg tcctgcccgt gagggtgggg gggaccgggc ccctctctag 1936 ggacccctcg ccccagcctc attccccatt ctgtgtccca tgtcccgtgt ctcctcggtc 1996 gccccgtgtt tgcgcttgac catgttgcac tgtttgcatg cgcccgaggc agacgtctgt 2056 caggggcttg gatttcgtgt gccgctgcca cccgcccacc cgccttgtga gatggaattg 2116 taataaacca cgccatgagg acaccgccgc ccgcctcggc gcttcctcca ccgaaaaaaa 2176 aaaaaaaaaa a 2187 <210> 2 <211> 450

PL 209 912 B1 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2

Met 1

Ser Ala

Ile

Gin 5

Ala

Trp

Pro

Ser 10

Gly

Thr

Glu

Cys

Ile 15

Ala

Lys

Tyr

Asn

Phe

His

Gly

Thr

Ala

Glu

Gin

Asp

Leu

Pro

Phe

Cys

Lys

20

25

30

Gly

Asp

Val

Leu

Thr

ile

Val

Ala

Val

Thr

Lys

Asp

Pro

Asn

Trp

Tyr

35

40

45

Lys

Ala

Lys

Asn

Lys

Val

Gly

Arg

Glu

Gly

Ile

Pro

Ala

Asn

Tyr

50

55

60

Val

Gin

Lys

Arg

Glu

Gly

Val

Lys

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Ser

Leu

Met

65

7 0

75

80

Pro

Trp

Phe

His

Gly

Lys

Ile

Thr

Arg

Glu

Gin

Ala

Glu

Arg

Leu

85

90

95

Tyr

Pro

Glu

Thr

Gly

Leu

Phe

Leu

Val

Arg

Glu

Ser

Thr

Asn

Tyr

100

105

110

Pro

Gly

Asp

Tyr

Thr

Leu

Cys

Val

Ser

Cys

Asp

Gly

Lys

Val

Glu

His

115

120

125

Tyr

Arg

Ile

Met

Tyr

His

Ala

Ser

Lys

Leu

Ser

Ile

Asp

Glu

Val

130

135

140

Tyr

Phe

Glu

Asn

Leu

Met

Gin

Leu

Val

Glu

His

Tyr

Thr

Ser

Asp

Ala

145

150

155

160

Asp

Gly

Leu

Cys

Thr

Arg

Leu

Ile

Lys

Pro

Lys

Val

Met

Glu

Gly

Thr

165

170

175

Val

Ala

Gin

Asp

Glu

Phe

Tyr

Arg

Ser

Gly

Trp

Ala

Leu

Asn

Met

180

185

190

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Gin

Thr

Ile

Gly

Lys

Gly

Glu

Phe

Gly

Asp

195

200

205

Val

Met

Leu

Gly

Asp

Tyr

Arg

Gly

Asn

Lys

Val

Ala

Val

Lys

Cys

Ile

210

215

220

Lys

Asn

Asp

Ala

Thr

Ala

Gin

Ala

Phe

Leu

Ala

Glu

Ala

Ser

Val

Met

225

230

235

240

Thr

Gin

Leu

Arg

His

Ser

Asn

Leu

Val

Gin

Leu

Gly

Val

Ile

Val

245

250

255

Glu

Lys

Gly

Leu

Tyr

Ile

Val

Thr

Glu

Tyr

Met

Ala

Lys

Gly

260

265

270

Ser

Leu

Val

Asp

Tyr

Leu

Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

Val

Leu

Gly

275

280

285

Asp

Cys

Leu

Lys

Phe

Ser

Leu

Asp

Val

Cys

Glu

Ala

Met

Glu

Tyr

290

295

300

Leu

Glu

Gly

Asn

Phe

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

Arg

Asn

Val

305

310

315

320

Leu

Val

Ser

Glu

Asp

Asn

Val

Ala

Lys

Val

Ser

Asp

Phe

Gly

Leu

Thr

325

330

335

Lys

Glu

Ala

Ser

Thr

Gin

Asp

Thr

Gly

Lys

Leu

Pro

Val

Lys

Trp

340

345

350

Thr

Ala

Pro

Glu

Ala

Leu

Arg

Glu

Lys

Phe

Ser

Thr

Lys

Ser

Asp

355

360

365

Val

Trp

Ser

Phe

Gly

Ile

Leu

Trp

Glu

Ile

Tyr

Ser

Phe

Gly

Arg

370

375

380

Val

Pro

Tyr

Pro

Arg

Ile

Pro

Leu

Lys

Asp

Val

Pro

Arg

Val

Glu

385

390

395

400

Lys

Gly

Tyr

Lys

Met

Asp

Ala

Pro

Asp

Gly

Cys

Pro

Ala

Val

Tyr

405

410

415

Glu

Val

Met

Lys

Asn

Cys

Trp

His

Leu

Asp

Ala

Met

Arg

Pro

Ser

420

425

430

Phe

Leu

Gin

Leu

Arg

Glu

Gin

Leu

Glu

His

Ile

Lys

Thr

His

Glu

Leu

435

440

445

His

Leu

PL 209 912 B1

450 <210> 3 <211> 4517 <212> DNA <213> homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (208)...(1839) <400> 3 gcggagccaa ggcacacggg tctgaccctt gggccggccc ggagcaagtg acacggaccg gtcgcctatc ctgaccacag caaagcggcc cggagcccgc ggaggggacc tgacgggggc gtaggcgccg gaaggctggg ggccccggag ccgggocggc gtggoccgag ttccggtgag cggacggcgg cgcgcgcaga tttgata atg ggc tgc att aaa agt aaa gaa aac

Met Gly Cys Ile Lys Ser Lys Glu Asn

120

180

234

1

5

cl ci cl

agt

cca

gee

att

aaa

tac

aga

cct

gaa

aat

act

cca

gag

cct

gtc

Lys

Ser

Pro

Ala

Ile

Lys

Tyr

Arg

Pro

Glu

Asn

Thr

Pro

Glu

Pro

Val

10

15

20

25

agt

aca

agt

gtg

age

cat

tat

gga

gca

gaa

ccc

act

aca

gtg

tea

cca

Ser

Thr

Ser

Val

Ser

His

Tyr

Gly

Ala

Glu

Pro

Thr

Val

Ser

Pro

30

35

40

tgt

ccg

tea

tet

tea

gca

aag

gga

aca

gca

gtt

aat

ttc

age

agt

ctt

Cys

Pro

Ser

Ala

Lys

Gly

Thr

Ala

Val

Asn

Phe

Ser

Leu

45

50

55

tcc

atg

aca

cca

ttt

gga

tcc

tea

ggg

gta

acg

cct

ttt

gga

ggt

Ser

Met

Thr

Pro

Phe

Gly

Ser

Gly

Val

Thr

Pro

Phe

Gly

60

65

70

gca

tet

tcc

tea

ttt

tea

gtg

cca

agt

tea

tat

cct

get

ggt

tta

Ala

Ser

Phe

Ser

Val

Pro

Ser

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

75

80

85

aca

ggt

gtt

act

ata

ttt

gtg

gee

tta

tat

gat

tat

gaa

get

aga

Thr

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

Val

Ala

Leu

Tyr

Asp

Tyr

Glu

Ala

Arg

90

95

100

105

act

aca

gaa

gac

ctt

tea

ttt

aag

ggt

gaa

aga

ttt

caa

ata

att

Thr

Glu

Asp

Leu

Ser

Phe

Lys

Gly

Glu

Arg

Phe

Gin

Ile

110

115

120

aac

aat

acg

gaa

gga

gat

tgg

gaa

gca

aga

tea

atc

get

aca

gga

Asn

Thr

Glu

Gly

Asp

Trp

Glu

Ala

Arg

Ser

Ile

Ala

Thr

Gly

125

130

135

aag

aat

ggt

tat

atc

ccg

age

aat

tat

gta

gcg

cct

gca

gat

tcc

att

Lys

Asn

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Asn

Tyr

Val

Ala

Pro

Ala

Asp

Ser

Ile

140

145

150

cag

gca

gaa

tgg

tat

ttt

ggc

aaa

atg

ggg

aga

aaa

gat

get

gaa

Gin

Ala

Glu

Trp

Tyr

Phe

Gly

Lys

Met

Gly

Arg

Lys

Asp

Ala

Glu

155

160

165

aga

tta

ctt

ttg

aat

cct

gga

aat

caa

ega

ggt

att

ttc

tta

gta

aga

282

330

378

426

474

522

570

618

666

714

62

PL 209 912 B1

Arg

Leu

Asn

Pro

Gly

Asn

Gin Arg

Gly

Ile

Phe

Leu

Val

Arg

170

175

180

185

gag

agt

gaa

aca

act

aaa

ggt

gct

tat tcc

ctt

tet

att

cgt

gat

tgg

810

Glu

Ser

Glu

Thr

Lys

Gly

Ala

Tyr Ser

Leu

Ser

Ile

Arg

Asp

Trp

190

195

200

gat

gag

ata

agg

ggt

gac

aat

gtg

aaa cac

tac

aaa

att

agg

aaa

ctt

858

Asp

Glu

Ile

Arg

Gly

Asp

Asn

Val

Lys His

Tyr

Lys

Ile

Arg

Lys

Leu

205

210

215

gac

aat

ggt

gga

tac

tat

atc

aca

acc aga

gca

caa

ttt

gat

act

ctg

906

Asp

Asn

Gly

Tyr

Ile

Thr

Thr Arg

Ala

Gin

Phe

Asp

Thr

Leu

220

225

230

cag

aaa

ttg

gtg

aaa

cac

tac

aca

gaa cat

cct

gat

ggt

tta

tgc

cac

954

Gin

Lys

Leu

Val

Lys

His

Tyr

Thr

Glu His

Ala

Asp

Gly

Leu

Cys

His

235

240

245

aag

ttg

aca

act

gtg

tgt

cca

act

gtg aaa

cct

cag

act

caa

ggt

eta

1002

Lys

Leu

Thr

Val

Cys

Pro

Thr

Val Lys

Pro

Gin

Thr

Gin

Gly

Leu

250

255

260

2 65

gca

aaa

gat

gct

tgg

gaa

atc

cct

ega gaa

tet

ttg

ega

eta

gag

gtt

1050

Ala

Lys

Asp

Ala

Trp

Glu

Ile

Pro

Arg Glu

Ser

Leu

Arg

Leu

Glu

Val

270

275

280

aaa

eta

gga

caa

gga

tgt

ttc

ggc

gaa gtg

tgg

atg

gga

aca

tgg

aat

1098

Lys

Leu

Gly

Gin

Gly

Cys

Phe

Gly

Glu Val

Trp

Met

Gly

Thr

Trp

Asn

285

290

295

gga

acc

acg

aaa

gta

gca

atc

aaa

aca eta

aaa

cca

ggt

aca

atg

1146

Gly

Thr

Lys

Val

Ala

Ile

Lys

Thr Leu

Lys

Pro

Gly

Thr

Met

300

305

310

cca

gaa

gct

ttc

ctt

caa

gaa

gct

cag ata

atg

aaa

tta

aga

cat

1194

Pro

Glu

Ala

Phe

Leu

Gin

Glu

Ala

Gin Ile

Met

Lys

Leu

Arg

His

315

320

325

gat

aaa

ctt

gtt

cca

eta

tat

gct

gtt gtt

tet

gaa

cca

at.t

tac

1242

Asp

Lys

Leu

Val

Pro

Leu

Tyr

Ala

Val Val

Ser

Glu

Pro

Ile

Tyr

330

335

340

345

att

gtc

act

gaa

ttt

atg

tca

aaa

gga age

tta

gat

ttc

ctt

aag

1290

Ile

Val

Thr

Glu

Fhe

Met

Ser

Lys

Gly Ser

Leu

Asp

Phe

Leu

Lys

350

355

360

gaa

gga

gat

gga

aag

tat

ttg

aag

ctt cca

cag

ctg

gtt

gat

atg

gct

1338

Glu

Gly

Asp

Gly

Lys

Tyr

Leu

Lys

Leu Pro

Gin

Leu

Val

Asp

Met

Al a

365

370

375

gct

cag

att

gct

gat

ggt

atg

gca

tat att

gaa

aga

atg

aac

tat

att

1386

Ala

Gin

Ile

Ala

Asp

Gly

Met

Ala

Tyr Ile

Glu

Arg

Met

Asn

Tyr

Ile

380

385

390

cac

ega

gat

ctt

cgg

gct

aat

att ctt

gta

gga

gaa

aat

ctt

gtg

1434

His

Arg

Asp

Leu

Arg

Ala

Asn

Ile Leu

Val

Gly

Glu

Asn

Leu

Val

395

400

405

tgc

aaa

ata

gca

gac

ttt

ggt

tta

gca agg

tta

att

gaa

gac

aat

gaa

1482

Cys

Lys

Ile

Ala

Asp

Phe

Gly

Leu

Ala Arg

Leu

Ile

Glu

Asp

Asn

Glu

PL 209 912 B1

410

415

420

4 25

tac

aca

gca

aga

caa

ggt

gca

aaa

ttt

cca

atc

333

tgg

aca

gct

cct

1530

Tyr

Thr

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Lys

Phe

Pro

Ile

Lys

Trp

Thr

Ala

Pro

430

435

440

gaa

gct

gca

ctg

tat

ggt

cgg

ttt

aca

ata

aag

tet

gat

gtc

tgg

tea

1578

Glu

Ala

Leu

Tyr

θΐν

Arg

Phe

Thr

Ile

Lys

Ser

Asp

Val

Trp

Ser

445

450

455

ttt

gga

att

ctg

caa

aca

gaa

eta

gta

aca

aag

ggc

ega

gtg

cca

tat

1626

Phe

Gly

Ile

Leu

Gin

Thr

Glu

Leu

Val

Thr

Lys

Gly

Arg

Val

Pro

Tyr

460

465

470

cca

ggt

atg

gtg

aac

cgt

gaa

gta

eta

gaa

C33

gtg

gag

ega

gga

tac

1674

Pro

Gly

Met

Val

Asn

Arg

Glu

Val

Leu

Glu

Gin

Val

Glu

Arg

Gly

Tyr

4 75

4 80

4 85

agg

atg

ccg

tgc

cct

cag

ggc

tgt

cca

gaa

tcc

ctc

cat

gaa

ttg

atg

1722

Arg

Met

Pro

Cys

Pro

Gin

Gly

Cys

Pro

Glu

Ser

Leu

His

Glu

Leu

Met

490

495

500

505

aat

ctg

tgt

tgg

aag

gac

cct

gat

gaa

aga

cca

aca

ttt

gaa

tat

1770

Asn

Leu

Cys

Trp

Lys

Asp

Pro

Asp

Glu

Arg

Pro

Thr

Phe

Glu

Tyr

510

515

520

att

cag

tcc

ttc

ttg

gaa

gac

tac

ttc

act

gct

aca

gag

cca

cag

tac

1818

Ile

Gin

Ser

Phe

Leu

Glu

Asp

Tyr

Phe

Thr

Ala

Thr

Glu

Pro

Gin

Tyr

525

530

535

cag cca gga gaa aat tta taa ttcaagtagc ctattttata tgcacaaatc 1869

Gin Pro Gly Glu Asn Leu *

540 tgccaaaata taaagaactt gtgtagattt tctacaggaa tcaaaagaag aaaatcttct 1929 ttactctgca tgtttttaat ggtaaactgg aatcccaga- atggttgcac aaaaccactt 1989 ttttttcccc aagtattaaa ctctaatgta ccaatgatga atttatcagc gtatttcagg 2049 gtccaaacaa aatagagcta agatactgat aacagtgtgg gtgacagcat ggtaatgaag 2109 gacagtgagg ctcctgctta tttataaatc atttcctttc tttttttccc caaagtcaga 2169 attgctcaaa gaaaattatt tattgttaca gataaaactt gagagataaa aagctatacc 2229 ataataaaat ctaaaattaa ggaatatcat gggaccaaat aattccattc cagtttttta 2289 aagtttcttg catt-attat tctcaaaagt tttttctaag ttaaacagtc agtatgcaat 2349 cttaatatat gctttctttt gcatggacat gggccaggtt tttcaaaagg aatataaaca 2409 ggatctcaaa cttgattaaa tgttagacca cagaagtgga atttgaaagt ataatgcagt 2469 acattaatat tcatgttcat ggaactgaaa gaataagaac tttttcactt cagtcctttt 2529 ctgaagagtt tgacttagaa taatgaaggt aactagaaag tgagttaatc ttgtatgagg 2589 ttgcattgat tttttaaggc aatatataat tgaaactact gtccaatcaa aggggaaatg 2649 ttttgatctt tagatagcat gcaaagtaag acccagcatt ttaaaagccc ttttttaaaa 2709 actagacttc gtactgtgag tattgcttat atgtccttat ggggatgggt gccacaaata 2769 gaaaatatga ccagatcagg gacttgaatg cacttttgct catggtgaat atagatgaac 2829 agagaggaaa atgtatttaa aagaaatacg agaaaagaaa atgtgaaagt tttacaagtt 2889 agagggatgg aaggtaatgt ttaatgttga tgtcatggag tgacagaatg gctttgctgg 2949 cactcagagc tcctcactta gctatattct gagactttga agagttataa agtataacta 3009 taaaactaat ttttcttaca cactaaatgg gtatttgttc aaaataatga agttatggct 3069 tcacattcat tgcagtggga tatggttttt atgtaaaaca tttttagaac tccagttttc 3129 aaatcatgtt tgaatctaca ttcacttttt tttgttttcr tttttgagac ggagtctcgc 3189 tctgccgccc aggctggagt gcagtggcgc. gatctcggct cactgcaagc tctgcctccc 3249 aggttcacac cattctcctg cctcagcctc ccgagtagct gggactacag gtgcccacca 3309 ccacgcctgg ctagtttttt gtatttttag tagagacgca gtttcaccgt gttaaccagg 3369 atggtctcga tctcctgacc ttgtgatctg cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt 3429 acaggtgtga gccaccgcgc ccagcctaca ttcacttcta aagtctatgt aatggtggtc 3489

PL 209 912 B1 attttttccc ttttagaata cattaaatgg ttgatttggg gaggaaaact tattctgaat 3549 attaacggtg gtgaaaaggg gacagttttt accctaaagt gcaaaagtga aacatacaaa 3609 ataagactaa tttttaagag taactcagta atttcaaaat acagatttga atagcagcat 3669 tagtggtttg agtgtctagc aaaggaaaaa ttgatgaata aaatgaaggt ctggtgtata 3729 tgttttaaaa tactctcata tagtcacact ttaaattaag ccttatatta ggcccctcta 3789 ttttcaggat ataattctta actatcatta tttacctgat tttaatcatc agattcgaaa 3849 ttctgtgcca tggcgtatat gttcaaattc aaaccatttt. taaaatgtga aaatggactt 3909 catgcaagtt ggcagtggtt ctggtactaa aaattgtggt tgttttttct gtttacgtaa 3969 cctgcttagt attgacactc tctaccaaga gggtcttcct aagaagagtg ctgtcattat 4029 ttcctcttat caacaacttg tgacatgaga ttttttaagg gctttatgtg aactatgata 4089 ttgtaatttt tctaagcata ttcaaaaggg tgacaaaatt acgtttatgt actaaatcta 4149 atcaggaaag taaggcagga aaagttgatg gtattcatta ggttttaact gaatggagca 4209 gttccttata taataacaat tgtatagtac ggataaaacji ctaacaatgt gtattcattt 4269 taaattgttc tgtattttta aattgccaag aaaaacaact tcgtaaattt ggagatattt 4329 tccaacagct tttcgtcttc agtgtcttaa tgtggaagtt aacccttacc aaaaaaggaa 4339 gttggcaaaa acagccttct agcacacttt tttaaatgaa taatggtagc ctaaacttaa 4449 tatttttata aagtattgta atattgtttt gtggataatt gaaataaaaa gttctcattg 4509 aatgcacc 4517 <210> 4 <211> 543 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4

Met

Gly

Cys

Ile

Lys

Ser

Lys

Glu

Asn

Lys

Ser

Pro

Ala

Ile

Lys

Tyr

1

5

10

15

Arg

Pro

Glu

Asn

Thr

Pro

Glu

Pro

Val

Ser

Thr

Ser

Val

Ser

His

Tyr

20

25

30

Gly

Ala

Glu

Pro

Thr

Val

Ser

Pro

Cys

Pro

Ser

Ala

Lys

35

40

45

Gly

Thr

Ala

Val

Asn

Phe

Ser

Leu

Ser

Met

Thr

Pro

Phe

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Val

Thr

Pro

Phe

Gly

Ala

Ser

Phe

Ser

Val

65

70

75

80

Val

Pro

Ser

Tyr

Pro

Ala

Gly

Leu

Thr

Gly

Val

Thr

Ile

Phe

85

90

95

Val

Ala

Leu

Tyr

Asp

Tyr

Glu

Ala

Arg

Thr

Glu

Asp

Leu

Ser

Phe

100

105

110

Lys

Gly

Glu

Arg

Phe

Gin

Ile

Asn

Thr

Glu

Gly

Asp

Trp

115

120

125

Trp

Glu

Ala

Arg

Ser

Ile

Ala

Thr

Gly

Lys

Asn

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

130

135

140

Asn

Tyr

Val

Ala

Pro

Ala

Asp

Ser

Ile

Gin

Ala

Glu

Trp

Tyr

Phe

145

150

155

160

Gly

Lys

Met

Gly

Arg

Lys

Asp

Ala

Glu

Arg

Leu

Asn

Pro

Gly

165

170

175

Asn

G.i.n

Arg

Gly

Ile

Phe

Leu

Val

Arg

Glu

Ser

Glu

Thr

Lys

Gly

180

185

190

Ala

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ile

Arg

Asp

Trp

Asp

Glu

Ile

Arg

Gly

Asp

Asn

195

200

205

Val

Lys

His

Tyr

Lys

Ile

Arg

Lys

Leu

Asp

Asn

Gly

Tyr

Ile

210

215

220

Thr

Arg

Ala

Gin

Phe

Asp

Thr

Leu

Gin

Lys

Leu

Val

Lys

His

Tyr

225

230

235

240

Thr

Glu

His

Ala

Asp

Gly

Leu

Cys

His

Lys

Leu

Thr

Val

Cys

Pro

24 5

250

255

Thr

Val

Lys

Pro

Gin

Thr

Gin

Gly

Leu

Ala

Lys

Asp

Ala

Trp

Glu

Ile

260

265

270

Pro

Arg

Glu

Ser

Leu

Arg

Leu

Giu

Val

Lys

Leu

Gly

Gin

Gly

Cys

Phe

275

280

285

PL 209 912 B1

Gly

Glu 290

Val

Trp Met

Gly

Thr 295

Trp

Asn

Gly

Thr

Thr 300

Lys

Val

Ala

Ile

Lys

Thr

Leu

Lys

Pro

Gly

Thr

Met

Pro

Glu

Ala

Phe

Leu

Gin

Glu

305

310

315

320

Ala

Gin

Ile

Met

Lys

Leu

Arg

His

Asp

Lys

Leu

Val

Pro

Leu

Tyr

325

330

335

Ala

Val

Ser

Glu

Pro

Ile

Tyr

Ile

Val

Thr

Glu

Phe

Met

Ser

340

345

350

Lys

Gly

Ser

Leu

Asp

Phe

Leu

Lys

Glu

Gly

Asp

Gly

Lys

Tyr

Leu

355

360

365

Lys

Leu

Pro

Gin

Leu

Val

Asp

Met

Ala

Gin

Ile

Ala

Asp

Gly

Met

370

375

380

Ala

Tyr

Ile

Glu

Arg

Met

Asn

Tyr

Ile

His

Arg

Asp

Leu

Arg

Ala

385

390

395

400

Asn

Ile

Leu

Val

Gly

Glu

Asn

Leu

Val

Cys

Lys

Ile

Ala

Asp

Phe

Gly

405

410

415

Leu

Ala

Arg

Leu

Ile

Glu

Asp

Asn

Glu

Tyr

Thr

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

420

425

430

Lys

Phe

Pro

Ile

Lys

Trp

Thr

Ala

Pro

Glu

Ala

Leu

Tyr

Gly

Arg

435

440

445

Phe

Thr

Ile

Lys

Ser

Asp

Val

Trp

Ser

Phe

Gly

Ile

Leu

Gin

Thr

Glu

450

455

460

Leu

Val

Thr

Lys

Gly

Arg

Val

Pro

Tyr

Pro

Gly

Met

Val

Asn

Arg

Glu

465

470

475

480

Val

Leu

Glu

Gin

Val

Glu

Arg

Gly

Tyr

Arg

Met

Pro

Cys

Pro

Gin

Gly

485

490

495

Cys

Pro

Glu

Ser

Leu

His

Glu

Leu

Met

Asn

Leu

Cys

Trp

Lys

Asp

500

505

510

Pro

Asp

Glu

Arg

Pro

Thr

Phe

Glu

Tyr

Ile

Gin

Ser

Phe

Leu

Glu

Asp

515

520

525

Tyr

Phe

Thr

Ala

Thr

Glu

Pro

Gin

Tyr

Gin

Pro

Gly

Glu

Asn

Leu

530

535

540

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie inhibitora kinazy tyrozynowej SKI-606 z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli do wytwarzania leku do leczenia zawału mięśnia sercowego.
2. Zastosowanie inhibitora kinazy tyrozynowej SKI-606 z rodziny Src z klasy 4-anilino-3-chinolinokarbonitryli do wytwarzania leku do zapobiegawczego leczenia ssaka z ryzykiem wystąpienia zawału mięśnia sercowego.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że ssakiem jest ssak inny, niż człowiek.
4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.

PL 209 912 B1

Rysunki

FIG. 1 (SEQ ID HO: 1) gcgccgc gtc ccgcaggccg tgatgccgcc cgcgcggagg tggcccggac cgcagtgccc 60 caagagagct ctaatggtac c aagt gacag gt tggcttta ctgtgec tcg gggacgccag 120 agctcctgag aag atg tca gca ata cag gcc gcc tgg cca tcc ggt aca 169 Met Ser . Ala Ile Gin Ala Ala Trp Pro Ser Gly Thr 1 5 10 gaa tgt att gcc aag tac aac ttc cac ggc act gcc gag cag gac ctg 217 Glu Cys Ile Ala Lys Tyr Asn Phe His Gly Thr Al a Glu Gin Asp Leu 15 20 25 ccc ttc tgc aaa gga gac gtg ctc acc att gtg acc gtc acc aag gac 265 Pro Phe Cys Lys Gly Asp Val Leu Thr Ile Val Ala Val Thr Lys Asp 30 35 40 ccc aac tgg tac aaa gcc aaa 33.C aag gtg ggc cgt gag ggc atc atc 313 Pro Asn Trp Tyr Lys Ala Lys Asn Lys Val Gly Arg Glu Gly Ile Ile 45 50 55 60 cca gcc aac tac gtc cag aag cgg gag ggc gtq aag gcg ggt acc aaa 361 Pro Al a Asn Tyr Val Gin Lys Arg Glu Gly Val Lys Ala Gly Thr Lys 65 70 75 ctc agc ctc atg cct tgg ttc cac ggc aag atc aca cgg gag cag gct 409 Leu Ser Leu Met Pro Trp Phe His Gly Lys Ile Thr Arg Glu Gin Ala 80 85 90 gag cgg ctt ctg tac ccg ccg gag aca ggc ctg ttc ctg gtg cgg gag 457 Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Pro Glu Thr Gly Leu Phe Leu Val Arg Glu 95 100 105 agc acc aac tac ccc gga gac tac acg ctg tgc gtg agc tgc gac ggc 505 Ser Thr Asn Tyr Pro Gly Asp Tyr Thr Leu Cys Val Ser Cys Asp Gly 110 115 120 aag gtg gag cac tac cgc atc atg tac cat gcc agc aag ctc agc atc 553 Lys Val Glu His Tyr Arg Ile Met Tyr His Ala Ser Lys Leu Ser Ile 125 130 135 140 gac gag gag gtg tac ttt gag aac ctc atg cag ctg gtg gag cac tac 601 Asp Glu Glu Val Tyr Phe Glu Asn Leu Met Gin Leu Val Glu His Tyr 145 150 155 acc tca gac gca gat gga ctc tgt acg cgc ctc att aaa cca aag gtc 649 Thr Ser Asp Ala Asp Gly Leu Cys Thr Arg Leu Ile Lys Pro Lys Val 160 165 170 atg aag ggc aca gtg gcg gcc cag gat gag .ttc tac cgc agc ggc tgg 697 Met Glu Gly Thr Val Ala Ala Gin Asp Glu Phe Tyr Arg Ser Gly Trp 175 180 185 gcc ctg aac atg aag gag ctg aag ctg ctg cag acc atc ggg aag ggg 745 Ala Leu Asn Met Lys Glu Leu Lys Leu Leu Gin Thr Ile Gly Lys Gly 190 195 200

PL 209 912 B1

FIG. 1 kontynuacja gag ttc gga gac gtg atg ctg ggc gat tac ega ggg aac aaa gtc Val gcc Ala 220 793 Glu Phe Gly Asp 205 Val Met 210 Leu Gly Asp Tyr Arg 215 Gly Asn Lys gtc aag tgc att aag aac gac gcc act gcc cag gcc ttc ctg gct gaa 841 Val Lys cys Ile Lys Asn Asp Ala Thr Ala Gin Ala Phe Leu Ala Glu 225 230 235 gcc Tl cći gcc atg acg caa ctg cgg cat agc aac ctg gtg cag ctc ctg 889 Ala Ser Val Met Thr. Gin Leu Arg His Ser Asn Leu Val Gin Leu Leu 240 245 250 ggc gtg atc gtg gag gag aag ggc ggg ctc tac atc gtc act gag tac 937 Gly Val Ile Val Glu Glu Lys Gly Gly Leu Tyr Ile Val Thr Glu Tyr 255 260 265 atg gcc aag ggg agc cct gtg gac tac ctg cgg tet agg ggt cgg tca 985 Met Ala Lys Gly Ser Leu Val Asp Tyr Leu Arg Ser Arg Gly Arg Ser 270 275 280 gtg ctg ggc gga gac tgt ctc ctc aag ttc tcg eta gat gtc tgc gag 1033 Val Leu Gly Gly Asp Cys Leu Leu Lys Phe Ser Leu Asp Val Cys Glu 285 290 295 300 gcc atg gaa tac ctg gag ggc aac aat ttc gtg cat ega gac ctg gct 1081 Ala Met Glu Tyr Leu Glu Gly Asn Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala 305 310 315 gcc cgc aat gtg ctg gtg tet gag gac aac gtg gcc aag gtc agc gac 1129 Ala Arg Asn Val Leu Val Ser Glu Asp Asn Val Ala Lys Val Ser Asp 320 325 330 ttt ggt ctc acc aag gag gcg tcc agc acc cag gac acg ggc aag ctg 1177 Phe Gly Leu Thr Lys Glu Ala Ser Ser Thr Gin Asp Thr Gly Lys Leu 335 340 345 CCS gtc aag tgg aca gcc cct gag gcc ctg aga gag aag aaa ttc tcc 1225 Pro Val Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Leu Arg Glu Lys Lys Phe Ser 350 355 360 act aag tet gac gtg tgg agt ttc gga atc ctt ctc tgg gaa atc tac 1273 Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Tyr 365 370 375 380 tcc ttt ggg ega gtg cct tat cca aga att ccc ctg aag gac gtc gtc 1321 Ser Phe Gly Arg Val Pro Tyr Pro Arg Ile Pro Leu Lys Asp Val Val 385 390 395 cct cgg gtg gag aag ggc tac aag atg gat gcc ccc gac ggc tgc ccg 1369 Pro Arg val Glu Lys Gly Tyr Lys Met Asp Ala Pro Asp Gly Cys Pro 400 405 410 ccc gca gtc tat gaa gtc atg aag aac tgc tgg cac ctg gac gcc gcc 1417 Pro Ala Val Tyr Glu Val Met Lys Asn Cys Trp His Leu Asp Ala Ala 415 420 425

PL 209 912 B1

FIG. 1 kontynuacj a atg Met cgg Arg 430 ccc tcc ttc Phe eta cag Leu Gin 435 ctc Leu ega gag cag ctt Gin Leu 4 4 0 gag cac atc aaa Glu His Ile Lys 1465 Pro Ser Arg Glu acc cac gag ctg cac ctg tgacggctgg cctcc igcctg ggtcatgggc 1513 Thr His Glu Leu His Leu 4 4 5 450 ctgtggggac tgaacctgga agateatgga cctggtgccc ctgctcactg ggcccgagcc 157 3 tgaactgagc cccagcgggc tggcgggcct ttttcctgcg tcccagcctg cacccctccg 1633 gccccgtctc tcttggaccc acctgtgggg cctggggagc ccactgaggg gccagggagg 1693 aaggaggcca cggagcggga ggcagcgccc caccacgtcg ggcttccctg gcctcccgcc 1753 actcgccttc ttagagtttt attcctttcc ttttttgaga ttttttttcc gtgtgtttat 1813 tttttattat ttttcaagat aaggagaaag aaagtaccca gcaaatgggc attttacaag 1873 aagtacgaat cttatttttc ctgtcctgcc cgtgagggtg ggggggaccg ggcccctctc 1933 tagggacccc tcgccccagc ctcattcccc attctgtgtc ccatgtcccg tgtctcctcg 1993 gtcgccccgt gtttgcgctt gaccatgttg cactgtttgc atgcgcccga ggcagacgtc 2053 tgtcaggggc ttggatttcg tgtgccgctg ccacccgccc acccgccttg tgagatggaa 2113 ttgtaataaa ccacgccatg aggacaccgc cgcccgcctc ggcgcttcct ccaccgaaaa 2173 aaaaaaaaaa aaaa 2187

PL 209 912 B1

FIG. 2 (SE' Q ID NO: 2) Met Ser Ais Ile Gin Ala Ala Trp Pro Ser Gly Thr Glu Cys Ile Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Asn Phe His Gly Thr Ala Glu Gin Asp Leu Pro Phe Cys Lys 20 25 30 Gly Asp Val Leu Thr Ile Val Ala Val Thr Lys Asp Pro Asn Trp Tyr 35 40 45 Ly s Ala Lys Asn Lys Val Gly Arg Glu Gly Ile Ile Pro Ala Asn Tyr 50 55 60 Val Gin Lys Arg Git Gly Val Lys Ala Gly Thr Lys Leu Ser Leu Met 65 7 0 75 80 Pro Trp Phe His Gly Lys Ile Thr Arg Glu Gin Ala Glu Arg Len Leu 85 90 95 Tyr Pro Pro Glu Thr G1 y Leu Phe Leu Val Arg Glu ' Ser Thr Asn Tyr 100 105 110 Pro Gly Asp Tyr Thr Leu Cys Val Ser Cys Asp Gly Lys Val Glu His 115 120 125 Tyr Arg Ile Met Tyr His Ala Ser Lys Leu Ser Ile Asp Glu Glu Val 130 135 140 Tyr Phe Glu Asn Leu Met Gin Leu Val Glu His Tyr Thr Ser Asp Ala 145 150 155 160 Asp Gly Leu Cys Thr Arg Leu Ile Lys Pro Lys Val Met Glu Gly Thr 165 170 175 Val Ais Ala Gin Asp Glu Phe Tyr Arg Ser Gly Trp Ala Leu Asn Met 180 185 190 Lys Glu Leu Lys Leu Leu Gin Thr Ile Gly Lys Gly Glu Phe Gly Asp 195 200 205 Val Met Leu Gly Asp Tyr Arg Gly Asn Lys Val Ala Val Lys Cys Ile 210 215 220 Lys Asn Asp Ala Thr Ala Gin Ala Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Met 225 230 235 240 Thr Gin Leu Arg His Ser Asn Leu Val Gin Leu Leu Gly Val Ile Val 245 250 255 Glu Glu Lys Gly Gly Leu Tyr Ile Val Thr Glu Tyr Met Ala Lys Gly 260 265 270 Ser Leu Val Asp Tyr Leu Arg Ser Arg Gly Arg Ser Val Leu Gly Gly 275 280 285 Asp Cys Leu Leu Lys Phe Ser Leu Asp Val Cys Glu Ala Met Glu Tyr 290 295 300 Leu Glu Gly Asn Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val 305 310 315 320 Leu Val Ser Glu Asp Asn Val Ala Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Thr 325 330 335 Lys Glu Ala Ser Ser Thr Gin Asp Thr Gly Lys Leu Pro Val Lys Trp 340 345 350 Thr Ala Pro Glu Ala Leu Arg Glu Lys Lys Phe Ser Thr Lys Ser Asp 355 360 365 Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Tyr Ser Phe Gly Arg 370 37 5 380 Val Pro Tyr Pro Arg Ile Pro Leu Lys Asp Val Val Pro Arg Val Glu 385 390 395 400 Lys Gly Tyr Lys Met Asp Ala Pro Asp Gly Cys Pro Pro Ala Val Tyr 405 410 415 Glu Val Met Lys Asn Cys Trp His Leu Asp Ala Ala Met Arg Pro Ser 420 425 430 Phe Leu Gin Leu Arg Glu Gin Leu Glu His Ile Lys Thr His Glu Leu 435 440 445

His Leu

4 50

PL 209 912 B1

FIG. 3 (SEQ ID NO: 3) gcggagccaa ggcacacggg tctgaccctt gggccggccc ggagcaagtg acacggaccg 60 gtcgcctatc ctgaccacag caaagcggcc cggagcccgc ggaggggacc tgacgggggc 120 gtaggcgccg gaaggctggg ggccccggag ccgggccggc gtgacccgag ttccggtgag 180 cggacggcgg cgcgcgcaga tttgata atg ggc tgc stt aaa agt aaa caa aac 234 Met Gly Cys Ile Lys Ser Lys Glu Asn aaa Lys 10 agt Ser cca Pro gee Ala att Ile aaa Lys 15 tac Tyr aga Arg 1 cct Pro gaa Glu aat Asn 20 act Thr 5 cca Pro gag Glu cct Pro gtc Val 25 262 agt aca agt gtg age cat tat gga gca gaa ccc act aca gtg tea cca 330 Ser Thr Ser Val Ser 30 His Tyr Gly Ala Glu 35 Pro Thr Thr Val Ser 40 Pro tgt ccg tea tet tea gca aag gga aca gca gtt aat ttc age agt ctt 378 Cys Pro Ser Ser 45 Ser Ala Lys Gly Thr 50 Ala Val Asn Phe Ser 55 Ser Leu tcc atg aca cca ttt gga gga tcc tea ggg gta acg cct ttt gga ggt 426 Ser Met Thr 60 Pro Phe Gly Gly Ser 65 Ser Gly Val Thr Pro 70 Phe Gly Gly gca tet tcc tea ttt tea gtg gtg cca agt tea tat cct get ggt tta 474 Ala Ser 75 Ser Ser Phe Ser Val 80 Val Pro Ser Ser Tyr 85 Pro Ala Gly Leu aca ggt ggt gtt act ata ttt gtg gee tta tat gat tat gaa get aga 522 Thr 90 Gly Gly Val Thr Ile 95 Phe Val Ala Leu Tyr 100 Asp Tyr Glu Ala Arg 105 act aca gaa gac ctt tea ttt aag aag ggt gaa aga ttt caa ata att 570 Thr Thr Glu Asp Leu 110 Ser Phe Lys Lys Gly 115 Glu Arg Phe Gin Ile 120 Ile aac aat acg gaa gga gat tgg tgg gaa gca aga tea atc get aca gga 618 Asn Asn Thr Glu 125 Gly Asp Trp Trp Glu 130 Ala Arg Ser Ile Ala 135 Thr Gly aag aat ggt tat atc ceg age aat tat gta gcg cct gca gat tcc att 666 Lys Asn Gly 140 Tyr Ile Pro Ser Asn 145 Tyr Val Ala Pro Ala 150 Asp Ser Ile cag gca gaa gaa tgg tat ttt ggc aaa atg ggg aga aaa gat get gaa 714 Gin Ala 155 Glu Glu Trp Tyr Phe 160 Gly Lys Met Gly Arg 165 Lys Asp Ala Glu aga tta ctt ttg aat cct gga aat caa ega ggt att ttc tta gta aga 762 Arg 170 Leu Leu Leu Asn Pro 175 Gly Asn Gin Arg Gly 180 Ile Phe Leu Val Arg 185 gag agt gaa aca act aaa ggt get tat tcc ctt tet att cgt gat tgg 810 Glu Ser Glu Thr Thr 190 Lys Gly Ala Tyr Ser 195 Leu Ser Ile Arg Asp 200 Trp

PL 209 912 B1

FIG. 3 kontynuacja gat Asp gag ata agg Arg 205 ggt Gly gac Asp aat Asn gtg aaa cac tac aaa att agg aaa Lys ctt Leu 858 Glu Ile Val Lys 210 His Tyr Lys Ile Arg 215 gac aat ggt gga tac tat atc aca acc aga gca caa ttt gat act ctg 9D6 Asp Asn Gly Gly Tyr Tyr Ile Thr Thr Arg Ala Gin Phe Asp Thr Leu 220 225 230 cag aaa ttg gtg aae cac tac aca gsa cat get gat ggt tta tgc CSC 954 Gin Lys Leu V a .1 Lys His Tyr Thr Glu His Ala Asp Gly Leu Cys Kis 235 240 245 aag ttg aca act gtg tgt CCS act gtg aaa cct cag act caa ggt eta 1002 Lys Leu Thr Thr Val Cys Pro Thr Val Lys Pro Gin Thr Gin Gly Leu 250 255 260 265 gca aaa gat get tgg gaa atc cct ega gaa tet ttg ega eta gag gtt 1050 Ala Lys Asp Ala Trp Glu Ile Pro Arg Glu Ser Leu Arg Leu Glu Val 270 275 280 aaa eta gga caa gga tgt ttc ggc gaa gtg tgg atg gga aca tgg aat 1098 Lys Leu Gly G.ln Gly Cys Phe Gly Glu Val Trp Met Gly Thr Trp Asn 285 290 2 95 gga acc acg aaa gta gca atc aaa aca eta aaa cca ggt aca atg atg 1146 Gly Thr Thr Lys Val Al a Ile Lys Thr Leu Lys Pro Gly Thr Met Met 300 305 310 cca gaa get ttc ctt caa gaa get cag ata atg 333 aaa tta aga cat 1194 Pro Glu Ala Phe Leu Gin Glu Ala Gin Ile Met Lys Lys Leu Arg His 315 320 325 gat aaa ctt gtt cca eta tat get gtt att tet gaa gaa cca att tac 1242 Asp Lys Leu Val Pro Leu Tyr Ala Val Val Ser Glu Glu Pro Ile Tyr 330 335 340 345 att gtc act gaa ttt atg tea aaa . ,gga age tta tta gat ttc ctt aag 1290 Ile Val Thr Glu Phe Met Ser Lys Gly Ser Leu Leu Asp Phe Leu Lys 350 355 360 gaa gga gat gga aag tat ttg aag ctt cca cag ctg gtt gat atg get 1338 Glu Gly Asp Gly Lys Tyr Leu Lys Leu Pro Gin Leu Val Asp Met Ala 365 370 375 get cag att get gat ggt atg gca tat att gaa aga atg aac tat att 1386 Ala Gin Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Ile Glu Arg Met Asn Tyr Ile 380 385 390 cac ega gat ctt cgg get get aat att ctt gta gga gaa aat ctt gtg 1434 His Arg Asp Leu Arg Ala Ala Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Leu Val 395 400 405 tgc aaa ata gca gac ttt ggt tta gca agg tta att gaa gac aat gaa 1482 Cys Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp Asn Glu 410 415 420 425 tac aca gca aga caa ggt gca aaa ttt cca atc aaa tgg aca get cct 1530 Tyr Thr Ala Arg Gin Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro

430 435 440

PL 209 912 B1 FIG .3 kon tynuacj a gaa gct gca ctg tat ggt cgg ttt aca ata aag tct gat gtc tgg tea 1578 Glu Ala Ala Leu Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser 445 450 455 ttt gga att ctg caa aca gaa eta gta aca aag ggc ega gtg cca tat 1626 Phe Gly Ile Leu Gin Thr Glu Leu Val Thr Lys Gly Arg Val Pro Tyr 460 4 65 470 cca ggt atg gtg aac cgt gaa gta eta gaa caa gtg gag ega gga tac 1674 Pro Gly Met Val Asn Arg Glu Val Leu Glu Gin Val Glu Arg Gly Tyr 475 480 485 agg atg ccg tgc cct cag ggc tgt cca gaa tcc ctc cat gaa ttg atg 1722 Arg Met Pro Cys Pro Gin Gly Cys Pro Glu Ser Leu His Glu Leu Met 490 495 500 505 aat ctg tgt tgg aag aag gac cct gat gaa aga cca aca ttt gaa tat 1770 Asn Leu Cys Trp Lys Lys Asp Pro Asp Glu Arg Pro Thr Phe Glu Tyr 510 515 520 att cag tcc ttc ttg gaa gac tac ttc act gct aca gag cca cag tac 1818 Ile Gin Ser Phe Leu Glu Asp Tyr Phe Thr Ala Thr Glu Pro Gin Tyr 525 530 535 cag cca gga gaa aat tta taat teaa ,gt a geet attt t at atgc :acaa 1866 Gin Pro Gly Glu Asn Leu 540 atctgccaaa atataaagaa cttgtgtaga ttttctacag gaatcaaaag aagaaaatct 1926 tctttactct gcatgttttt aatggtaaac tggaatccca gatatggttg cacaaaacca 1986 cttttttttc cccaagtatt aaactctaat gtaccaatga tgaatttatc agcgtatttc 2046 agggtccaaa caaaatagag ctaagatact gatgacagtg tgggtgacag catggtaatg 2106 aaggacagtg aggctcctgc ttatttataa atcatttcct ttcttttttt ccccaaagtc 2166 agaattgctc aaagaaaatt atttattgtt acagataaaa cttgagagat aaaaagctat 2226 accataataa aatctaaaat taaggaatat catgggacca aataattcca ttccagtttt 2286 ttaaagtttc ttgcatttat tattctcaaa agttttttct aagttaaaca gtcagtatgc 2346 aatcttaata tatgctttct tttgcatgga catgggccag gtttttcaaa aggaatataa 2406 acaggatctc aaacttgatt aaatgttaga ccacagaagt ggaatttgaa agtataatgc 2466 agtacattaa tattcatgtt catggaactg aaagaataag aactttttca cttcagtcct 2526 tttctgaaga gtttgactta gaataatgaa ggtaactaga aagtgagtta atcttgtatg 2586 aggttgcatt gattttttaa ggcaatatat aattgaaact actgtccaat caaaggggaa 2646 atgttttgat ctttagatag catgcaaagt aagacccagc attttaaaag ccctttttta 2706 aaaactagac ttcgtactgt gagtattgct tatatgtcct tatggggatg ggtgccacaa 2766 atagaaaata tgaccagatc agggacttga atgcactttt gctcatggtg aatatagatg 2826

PL 209 912 B1

FIG. 3 kontynuacja aacagagagg aaaatgtatt taaaagaaat acgagaaaag aaaatgtgaa agttttacaa 2886 gttagaggga tggaaggtaa tgtttaatgt tgatgtcatg gagtgacaga atggctttgc 2946 tggcactcag agctcctcac ttagctatat tctgagactt tgaagagtta taaagtataa 3006 ctataaaact aatttttctt acacactaaa tgggtatttg ttcaaaataa tgaagttatg 3066 gcttcacatt cattgcagtg ggatatggtt tttatgtaaa acatttttag aactccagtt 3126 ttcaaatcat gtttgaatct acattcactt ttttttgttt tcttttttga gacggagtct 3186 cgctctgccg cccaggctgg agtgcagtgg cgcgatctcg gctcactgca agctctgcct 3246 cccaggttca caccattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta caggtgccca 3306 ccaccacgcc tggctagttt tttgtatttt tagtagagac gcagtttcac cgtgttagcc 3366 aggatggtct cgatctcctg accttgtgat ctgcccgcct cggcctccca aagtgctggg 3426 attacaggtg tgagccaccg cgcccagcct acattcactt ctaaagtcta tgtaatggtg 3486 gtcatttttt cccttttaga atacattaaa tggttgattt ggggaggaaa acttattctg 3546 aatattaacg gtggtgaaaa ggggacagtt tttaccctaa agtgcaaaag tgaaacatac 3606 aaaataagac taatttttaa gagtaactca gtaatttcaa aatacagatt tgaatagcag 3666 cattagtggt ttgagtgtct agcaaaggaa aaattgatga ataaaatgaa ggtctggtgt 3726 atatgtttta aaatactctc atatagtcac actttaaatt aagccttata ttaggcccct 3786 ctattttcag gatataattc ttaactatca ttatttacct gattttaatc atcagattcg 3846 aaattctgtg ccatggcgta tatgttcaaa ttcaaaccat ttttaaaatg tgaagatgga 3906 cttcatgcaa gttggcagtg gttctggtac taaaaattgt ggttgttttt tctgtttacg 3966 taacctgctt agtattgaca ctctctacca agagggtctt cctaagaaga gtgctgtcat 4026 tatttcctct tatcaacaac ttgtgacatg agatttttta agggctttat gtgaactatg 4086 atattgtaat ttttctaagc atattcaaaa gggtgacaaa attacgttta tgtactaaat 4146 ctaatcagga aagtaaggca ggaaaagttg atggtattca ttaggtttta actgaatgga 4206 gcagttcctt atataataac aattgtatag tagggataaa acactaacaa tgtgtattca 4266 ttttaaattg ttctgtattt ttaaattgcc aagaaaaaca actttgtaaa tttggagata 4326 ttttccaaca gcttttcgtc ttcagtgtct taatgtggaa gttaaccctt accaaaaaag 4386 gaagttggca aaaacagcct tctagcacac ttttttaaat gaataatggt agcctaaact 4446 taatattttt ataaagtatt gtaatattgt tttgtggata attgaaataa aaagttctca 4506 ttgaatgcsc c 4517

PL 209 912 B1

FIG. 4 (SEQ ID NO: 4) Met 1 Gly Cys Ile Lys Ser Lys Glu Asn Lys Ser Pro Ala Ile Lys 15 Tyr 5 10 Arg Pro Glu Asn Thr Pro Glu Pro Val Ser Thr Ser Val Ser His Tyr 20 25 30 Gly Ala Glu Pro Thr Thr Val Ser Pro Cys Pro Ser Ser Ser Ala Lys 35 40 4 5 Gly Thr Ala Val Asn Phe Ser Ser Leu Ser Met Thr Pro Phe Gly Gly 50 55 60 Ser Ser Gly Val Thr Pro Phe Gly Gly Ala Ser Ser Ser Phe Ser Val 65 70 75 80 Val Pro Ser Ser Tyr Pro Ala Gly Leu Thr Gly Gly Val Thr Ile Phe 85 90 95 Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Thr Thr Glu Asp Leu Ser Phe 100 105 110 Lys Lys Gly Glu Arg Phe Gin Ile Ile Asn Asn Thr Glu Gly Asp Trp 115 120 125 Trp Glu Ala Arg Ser Ile Ala Thr Gly Lys Asn Gly Tyr Ile Pro Ser 130 135 140 Asn Tyr Val Ala Pro Ala Asp Ser Ile Gin Ala Glu Glu Trp Tyr Phe 145 150 155 160 Gly Lys Met Gly Arg Lys Asp Ala Glu Arg Leu Leu Leu Asn Pro Gly 165 170 175 Asn Gin Arg Gly Ile Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly 180 185 190 Ala Tyr Ser Leu Ser Ile Arg Asp Trp Asp Glu Ile Arg Gly Asp Asn 195 200 205 Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Asn Gly Gly Tyr Tyr Ile 210 215 220 Thr Thr Arg Ala Gin Phe Asp Thr Leu Gin Lys Leu Val Lys His Tyr 225 230 235 240 Thr Glu His Ala Asp Gly Leu Cys His Lys Leu Thr Thr Val Cys Pro 245 250 255 Thr Val Lys Pro Gin Thr Gin Gly Leu Ala Lys Asp Ala Trp Glu Ile 260 265 270 Pro Arg Glu Ser Leu Arg Leu Glu Val Lys Leu Gly Gin Gly Cys Phe 275 280 285 Gly Glu Val Trp Met Gly Thr Trp Asn Gly Thr Thr Lys Val Ala Ile 2 90 295 300 Lys Thr Leu Lys Pro Gly Thr Met Met Pro Glu Ala Phe Leu Gin Glu 305 310 315 320 Ala Gin Ile Met Lys Lys Leu Arg His Asp Lys Leu Val Pro Leu Tyr 325 330 335 Ala Val Vał Ser Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Val Thr Glu Phe Met Ser 340 345 350 Lys Gly Ser Leu Leu Asp Phe Leu Lys Glu Gly Asp Gly Lys Tyr Leu 355 360 365 Lys Leu Pro Gin Leu Val Asp Met Ala Ala Gin Ile Ala Asp Gly Met 370 375 380 Ala Tyr Ile Glu Arg Met Asn Tyr Ile His Arg Asp Leu Arg Ala Ala 385 390 395 400 Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Leu Val Cys Lys Ile Ala Asp Phe Gly 405 410 415 Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp Asn Glu Tyr Thr Ala Arg Gin Gly Ala 420 425 430

PL 209 912 B1

FIG. 4 kontynuacja Lys Phe Pro 435 Ile Lys Trp Thr Ala 440 Pro Glu Ala Ala Leu Tyr Gly Arg 445 Phe Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Gin Thr Glu 450 455 4 60 Leu Val Thr Lys Gly Arg Val Pro Tyr Pro Gly Met Val Asn Arg Glu 4 65 470 475 480 Val Leu Glu Gin Val Glu Arg Gly Tyr Arg Met Pro cys Pro Gin Gly 485 490 4 95 Cys Pro Glu Ser Leu His Glu Leu Met Asn Leu Cys Trp Lys Lys Asp 500 505 510 Pro Asp Glu Arg Pro Thr Phe Glu Tyr Ile Gin Ser Phe Leu Glu Asp 515 520 525 Tyr Phe Thr Ala Thr Glu Pro Gin Tyr Gin Pro Gly Glu Asn Leu 530 535 540

PL 209 912 B1 izotiocyjanian allilu