CN113209096B - 培西达替尼在制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死及其相关疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了培西达替尼在制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死及其相关疾病药物中的应用,属于医药技术领域。本发明通过研究发现培西达替尼能够降低心肌梗死后小鼠死亡率,减小梗死面积,减轻心肌梗死后左心室重构,改善心脏功能。研究结果表明培西达替尼具有制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死及其相关疾病药物的应用,其中心肌梗死及其相关疾病包括急性ST段抬高型心肌梗死、急性非ST段抬高型心肌梗死、缺血性心肌病、心力衰竭等。本发明发现了培西达替尼的新应用,为预防、缓解和/或治疗心肌梗死提供了新策略。

Description

培西达替尼在制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死及其相关疾 病药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种已知临床药物培西达替尼在制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死及其相关疾病药物中的应用。
背景技术
急性心肌梗死是冠状动脉粥样硬化心脏病最严重的类型之一,具有高发病率、高死亡率、高致残率等特点,严重影响患者生存质量和居民健康,也导致了沉重的经济负担[1]。国际上多项研究(1995-2012)的汇总数据显示,45岁以上人群中,首次心肌梗死后1年内男性和女性的死亡率分别达到了18%和23%[2]。而在我国,心肌梗死及其导致的心力衰竭是心血管患者的主要死亡原因之一[3]。近年来溶栓和介入治疗的迅速发展,导致缺血心肌及时再灌注治疗的患者比率明显增加,但心肌梗死所致的心力衰竭、心律失常甚至猝死比例仍然很高[3]。心肌缺血后病理性心肌重构,比如心肌纤维化,是梗死后心力衰竭等并发症的病理基础[4,5]。虽然ACEI和ARB等药物可能改善心肌梗死患者的远期预后[6,7],但仍然缺乏更加有效的干预心肌梗死后病理性心肌重构的药物。
培西达替尼(Pexidartinib,PLX3397)于2019年获美国食品和药物管理局(FDA)批准,用于治疗存在严重的发病率或功能限制且不适合手术改善的症状性腱鞘巨细胞瘤(TGCT)成人患者[8,9]。培西达替尼是一种小分子物质,可通过抑制集落刺激因子1受体(CSF1R),抑制滑膜中异常细胞的增值和积累[9]。然而,培西达替尼在心肌梗死及其病理性心肌重构中的作用仍然未知。
参考文献:
1.Anderson,J.L.and D.A.Morrow.Acute Myocardial Infarction.N Engl JMed.2017.376:2053-2064.
2.Virani SS,Alonso A,Benjamin EJ,Bittencourt MS,Callaway CW,CarsonAP,Chamberlain AM,Chang AR,Cheng S,Delling FN,Djousse L,Elkind MSV,FergusonJF,Fornage M,Khan SS,Kissela BM,Knutson KL,Kwan TW,Lackland DT,Lewis TT,Lichtman JH,Longenecker CT,Loop MS,Lutsey PL,Martin SS,Matsushita K,Moran AE,Mussolino ME,Perak AM,Rosamond WD,Roth GA,Sampson UKA,Satou GM,Schroeder EB,Shah SH,Shay CM,Spartano NL,Stokes A,Tirschwell DL,VanWagner LB and TsaoCW.American Heart Association Council on Epidemiology and PreventionStatistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee Heart disease andstroke statistics-2020update:a report from the American Heart Association.Circulation.2020.141:e139–e596.
3.中国心血管健康与疾病报告编写组.中国心血管健康与疾病报告2019概要.中国循环杂志.2020.35:833-854.
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5.Thygesen K,Alpert JS,Jaffe AS,Chaitman BR,Bax JJ,Morrow DA,WhiteHD,and Executive Group on behalf of the Joint European Society of Cardiology/American College of Cardiology/American Heart Association/World HeartFederation Task Force for the Universal Definition of Myocardial.FourthUniversal Definition of Myocardial Infarction(2018).J Am CollCardiol.2018.72:2231-2264.
6.Evans M,Carrero JJ,Szummer K,
Figure BDA0003069587360000021
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7.Korhonen MJ,Robinson JG,Annis IE,Hickson RP,Bell JS,Hartikainen Jand Fang G.Adherence Tradeoff to Multiple Preventive Therapies and All-CauseMortality After Acute Myocardial Infarction.J Am Coll Cardiol.2017.70:1543–1554.
8.Tap WD,Wainberg ZA,Anthony SP,Ibrahim PN,Zhang C,Healey JH,Chmielowski B,Staddon AP,Cohn AL,Shapiro GI,Keedy VL,Singh AS,Puzanov I,KwakEL,Wagner AJ,Von Hoff DD,Weiss GJ,Ramanathan RK,Zhang J,Habets G,Zhang Y,Burton EA,Visor G,Sanftner L,Severson P,Nguyen H,Kim MJ,Marimuthu A,Tsang G,Shellooe R,Gee C,West BL,Hirth P,Nolop K,van de Rijn M,Hsu HH,Peterfy C,LinPS,Tong-Starksen S and Bollag G.Structure-Guided Blockade of CSF1R Kinase inTenosynovial Giant-Cell Tumor.N Engl J Med.2015.373:428-37.
9.Lamb YN.Pexidartinib:First Approval.Drugs.2019.79:1805-1812.
发明内容
目前临床上治疗心肌梗死病理性心肌重构仍存在不足,仍需要新颖的治疗手段改善心肌梗死患者预后。本发明阐述并明确了培西达替尼能够抑制心肌梗死后病理性心室重构、并改善心脏功能,提供了一种已知临床药物培西达替尼在制备预防、缓解和/或治疗心肌梗死及其相关疾病药物中的新应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
本发明以C57BL/6小鼠为实验对象,通过灌胃方式给予培西达替尼(40mg/kg/天,溶剂为10%DMSO+90%玉米油),通过永久性结扎左前降支动脉构建心肌梗死模型。结果表明,培西达替尼能够降低心肌梗死后小鼠死亡率,减小梗死面积,减轻心肌梗死后左心室重构,改善心脏功能。本发明为研究预防、缓解和/或治疗心肌梗死的新策略提供了理论依据和临床基础。
以培西达替尼为活性成分制备的预防、缓解和/或治疗心肌梗死及其相关疾病的药物也属于本发明的保护范围。
一种预防、缓解和/或治疗心肌梗死及其相关疾病的药物,包含培西达替尼,还可包含培西达替尼药学上可接受的载体和/或赋形剂。
所述心肌梗死及其相关疾病包括但不限于:急性ST段抬高型心肌梗死,急性非ST段抬高型心肌梗死,缺血性心肌病,心力衰竭等。
本发明所提供的以培西达替尼为活性成分的预防、缓解和/或治疗心肌梗死及其相关疾病药物具有如下优点:
(1)培西达替尼是已经被美国食品和药物管理局批准的药物,可利用已有的毒理、剂量等数据,节省时间和成本。
(2)培西达替尼明显减轻心肌梗死后心肌损伤、病理性心肌重构,改善心脏功能,效果显著。
附图说明
图1是心肌梗死小鼠的生存曲线、梗死面积、心肌损伤结果图。A:生存曲线;B:TTC染色梗死面积效果图;C:梗死面积柱状图;D-E:心重/体重,心重/胫骨长度柱状图;F-G:血清、心肌组织乳酸脱氢酶水平;H-I:血清、心肌组织CK-MB水平。
图2是小鼠心肌梗死后心功能、心肌纤维化结果图。A:心脏超声代表图像;B:左心室舒张末径(LVEDD);C:左室收缩末径(LVESD);D:左室射血分数(LVEF);E:左室射短分数(LVFS);F:心肌纤维化代表图及纤维化面积统计结果。
图3小鼠心肌细胞凋亡图。A-E:凋亡相关蛋白clever-caspase 3(c-caspase3)、Bax、Bcl-2代表性WB条带以及定量结果柱状图;F-G TUNEL+凋亡细胞荧光代表图像及凋亡细胞比率柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实验动物及饲养:
C57BL/6小鼠,雄性,4周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养在武汉大学人民医院标准化实验动物中心(SPF级),饲养条件:温度在22-24℃之间,湿度在40-70%之间,明暗交替照明时间为12h,自由饮水摄食。
实验例1培西达替尼减小心肌梗死后梗死面积,抑制心肌损伤
1、培西达替尼给药方式
(1)小鼠在SPF级标准化动物中心适应环境2周。
(2)通过灌胃方式给予培西达替尼(PLX3397)(40mg/kg/天,溶剂为10%DMSO+90%玉米油),对照组同时给予vehicle(10%DMSO+90%玉米油)灌胃。PLX3397、DMSO、玉米油均购买自MedChemExpress(MCE)公司。21天后,所有小鼠随机分为4组:sham+vehicle组,sham+PLX3397组,MI+vehicle组,MI+PLX3397组。
2、心肌梗死模型获得
(1)3%戊巴比妥钠90mg/kg腹腔注射麻醉,用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛发(充分暴露手术区),用碘酒和75%乙醇手术区消毒。
(2)气管插管:麻醉后,夹趾检测无反应即可进行MI手术。打开外置光源、显微镜开关,打开呼吸机,设置好各参数(呼吸频率110bpm),将气管插管沿声门插入气管,取下小鼠接上呼吸机,观察小鼠呼吸状况,胸廓起伏与呼吸机频率一致表示插管成功,即可进行MI手术。
(3)小鼠采用右侧卧位,用眼科剪在左前肢腋下,用显微剪于三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏,显微直镊轻轻夹起少量心包并于左心耳下撕开少许心包,充分暴露左冠状动脉前降支(LAD)或所在区域。
(4)结扎冠状动脉:于显微镜下找到LAD走向或可能所在位置,持针器持取7-0带针缝合线,于左心耳下缘2mm处进针,缝线穿过LAD,以完全阻断LAD血流。
(5)关胸:结扎完成后,6-0缝线完全缝合胸腔开口(保证无缝隙、无错位)关闭胸腔,由内向外逐层缝合各层肌肉和皮肤。
(6)术后管理:术后密切关注小鼠状态,有无呼吸异常等。待小鼠自然苏醒后将小鼠从呼吸机上取下并取下气管插管,正常饲养。分别于MI术后3天、7天取材。
3、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloricej,TTC)染色
(1)处死小鼠后,快速取出心脏组织,置于10%KCl溶液。
(2)清洗心脏后,置于-20℃冰箱30分钟。
(3)取出心脏组织,由心尖至心底部沿心脏长轴均匀切成切片,将切片立即置于10mL 2%TTC溶液中,37℃恒温孵育20min。正常心脏组织染色后呈鲜红色,而梗死区呈苍白色。
(4)用10%中性福尔马林溶液固定脑组织切片,大体拍照,计算梗死面积。
4、心肌损伤指标测定
(1)处死小鼠前,眼眶采血法采取血液200μL,置于促凝管中。
(2)3000转/分钟,离心30分钟,吸取血清待测。
(3)小鼠心脏组织分为梗死区、交界区、非梗死区,分别存放于-80℃冰箱保存。
(4)取心脏交界区组织10mg,加入10mL生理盐水研磨,12000转/分钟离心20分钟,取组织匀浆,并使用BCA法测定组织匀浆浓度;
(5)参照生产厂家说明书(南京建成),使用试剂盒分别测定血清、组织匀浆乳酸脱氢酶(LDH)和CK-MB浓度。
心脏梗死面积和心肌损伤结果如图1所示。培西达替尼可降低小鼠死亡率(图1A),减小心梗后梗死面积(图1B、C)。培西达替尼能够减轻心重/体重、心重/胫骨长度(图1D、E)。培西达替尼可降低心梗后血清、心脏组织的LDH和CK-MB水平(图1F-I),提示培西达替尼能够减轻心梗后心肌损伤。因此培西达替尼能够减轻心梗后心肌损伤,减小梗死面积。
实验例2培西达替尼改善心肌梗死后心脏功能,减轻心肌纤维化
1、心脏功能评估
(1)小鼠处死前,用剃毛刀剔除胸前鼠毛。
(2)1.5%异氟烷麻醉,使用超声仪(VINNO 6,飞依诺科技有限公司,苏州,中国)行小鼠超声心脏检查。
(3)短轴测心率(HR)、左室舒张末径(LVEDD)、左室收缩末径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)、左室射短分数(LVFS)。
2、心肌纤维化面积测定
(1)制备石蜡标本及切片
1)将小鼠心脏组织从10%福尔马林溶液取出,在通风橱内修剪心脏组织,并将修剪好的心脏组织和相对应的标签置于脱水盒中。
2)脱水浸蜡:将脱水盒放进脱水机中,进行脱水浸蜡处理。75%乙醇(4h)→85%乙醇(2h)→90%乙醇(2h)→95%乙醇(1h)→无水乙醇I(30min)→无水乙醇II(30min)→醇苯(5-10min)→二甲苯I(5-10min)→二甲苯II(5-10min)→65℃融化石蜡I(1h)→65℃融化石蜡II(1h)→65℃融化石蜡III(1h)。
3)心脏组织包埋:先将融化的石蜡注入进包埋框中,趁石蜡未凝固时,从脱水盒内将心脏组织取出,心底部朝下放入包埋框中,并贴上相对应的标签,水平置于-20℃冻台上冷却。待石蜡凝固后,从包埋框中将蜡块取出。
4)心脏组织切片:将蜡块进行修整并固定在石蜡切片机上,切片厚度为4-5μm。转动切片机手柄连续切片,使切片漂浮于温水中并将切片展平。用载玻片将切片捞起,使切片位于载玻片的正中位置,置于60℃烘箱内烘烤,保存备用。
(2)天狼猩红(PSR)染色
1)石蜡切片脱蜡至水。
2)天狼猩红染色:将切片置于天狼猩红溶液中染色8-10min。
3)脱水封片:切片经乙醇脱水后,放入二甲苯中透明5min,封片。
4)光学显微镜下检查,采集并分析图片。
心功能与心肌纤维化结果如图2所示。培西达替尼能够改善心梗后左心室功能,表现为LVEDD、LVESD降低,LVEF、LVFS升高(图2A-E)。培西达替尼也能够降低心肌纤维化面积(图2F)。总之,培西达替尼能够改善心梗后心脏功能,减轻心室重构。
实验例3培西达替尼减轻心肌梗死后心肌细胞凋亡
1、Western Blot监测凋亡相关蛋白
(1)组织蛋白提取
1)剪取适量左心室梗死交界区组织(约30mg)放入对应的EP管中,称量并记录每个样本的重量,同时打开离心机将温度预冷至4℃。
2)按照按100mg/1mL计算所需裂解液总量。其中1mL裂解液包含720μL RIPA、100μLPhosstop(磷酸酶抑制剂)、100μL Complete(蛋白酶抑制剂)、50μL NaF、10μL Na3VO4和20μLPMSF(丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂,最后加入)。将裂解液分别加入到EP管中。
3)提前预冷研磨适配器,将装有样品的EP管对称放进研磨适配器中,并将研磨适配器安装在研磨仪上,研磨仪的程序设置为30Hz/s、90s。
4)研磨结束后取出EP管,稍离心后将溶液转移至新的1.5mL EP管中,静置10min。
5)超声裂解仪裂解样品,每次1-2s,中间间隔1s,重复10-20次,频率设置为5KHz。
6)将样品放入离心机中,4℃条件下12000g离心30min。离心后取出样品,吸取上清液并转移至新的EP管中,记录上清液体积。
(2)组织蛋白定量(BCA法)
1)配制工作液(按A液:B液50:1的比例)。
2)配制标准品:准备6个200μL的小EP管,依次标记为A、B、C、D、E和F。A管标准品的浓度1000μg/mL,B管标准品的浓度500μg/mL,C管标准品的浓度250μg/mL,D管标准品的浓度125μg/mL,E管标准品的浓度25μg/mL,F管浓度为0μg/mL。
3)吸取4μL待测样品并分别加入装有116μL去离子水的EP管中(稀释30倍),混匀后备用。
4)按25μL/孔吸取标准品或待测样品,加入到96孔板中,同时做2个复孔。每孔均加入200μL的工作液,37℃恒温箱中孵育30min。
5)将96孔板置于酶标仪中,测量所有样品在562nm波长处的吸光度值,计算标准曲线和待测样品的总蛋白浓度。
6)根据待测样品的总蛋白浓度进行定量处理,计算待测样品的终体积。加入相应量的5×蛋白上样缓冲液和去离子水。
7)将样品混匀后分装,放入72℃水浴锅中水浴10min以促进蛋白变性(每2-3min翻动一次),结束后置于-80℃冰箱中备用。
(3)制备SDS-PAGE凝胶电泳
1)清洗制胶架和玻璃板,将玻璃板安装在制胶架上,其中厚玻璃板朝内,薄玻璃板朝外。加满去离子水测试渗漏情况,若无渗漏,则缓慢倒出去离子水,滤纸吸尽水滴后备用。
2)准备2个50mL的离心管,分别用记号笔写上分离胶和浓缩胶。根据目的蛋白的分子量配制适宜浓度的分离胶(按5mL/玻璃板配制),依次向标有分离胶的离心管中加入去离子水、30%丙烯酰胺、1.5M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、10%十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵(AP)和四甲基乙二胺(TEMED),最后加入)。加入TEMED后漩涡混匀器混匀分离胶,将分离胶缓慢加入玻璃板中。缓慢注入无水乙醇封顶(注意不要把胶冲散),待分离胶凝结后倒出乙醇,残留乙醇可用滤纸吸尽。
3)按照说明书制备5%浓缩胶(按1.25mL/玻璃板配制):依次向标有浓缩胶的离心管中加入去离子水、30%丙烯酰胺、1M Tris-HCl、10%SDS、AP和TEMED(促凝剂,最后加入),加入TEMED后立即用漩涡混匀器混匀浓缩胶,将浓缩胶缓慢加入玻璃板中,将齿梳插入浓缩胶中,同时避免气泡产生,待浓缩胶凝固后取下玻璃板,置于4℃冰箱备用。
4)上样跑胶:于4℃冰箱取出玻璃板,拔出齿梳,将厚玻璃板侧朝外,固定在电泳架上。将电泳架放进电泳槽中,向内槽中缓慢加入1×电泳内液(约150mL),向外槽倒入缓慢电泳外液。
5)按10μL/孔的量将蛋白依次加入到SDS-PAGE凝胶加样孔,其中第一个孔先加入5μL的蛋白Marker,再加入5μL的1×蛋白上样缓冲液。初始75V恒压电泳,待蛋白到达分离胶时加压至120V,继续电泳。
6)提前配制转膜液,置于4℃冰箱中预冷。同时根据所需大小裁剪PVDF膜。
7)电泳结束后取出凝胶,裁掉多余部分并将凝胶放入转膜液中。将夹板左右摊开,两边各铺上海绵和滤纸,铺平后润湿,夹板的黑色面(负极)朝右。将凝胶平铺在黑色面的滤纸上,大分子量侧朝内。将PVDF膜做好标记后,在甲醇中浸泡1min并覆盖在凝胶上,注意各层之间不留气泡,合上夹板。
8)将夹板固定在转膜槽中,缓慢倒入转膜液。将转膜槽置于盛有碎冰的泡沫盒中,0.2A恒流转膜约1.5h(可根据蛋白分子量调整转膜时间)。
9)转膜结束后,取出PVDF膜,TBST液洗膜3次,每次5min。之后将PVDF膜置于提前配制好的封闭液中,在脱色摇床上缓慢摇动,室温封闭1h。
10)封闭结束后,TBST液洗膜3次,每次5min。将PVDF膜放入孵育盒中,加入适量的一抗(Bax,Bcl-2,clever-caspase3,GAPDH)。将孵育盒置于摇床上缓慢摇动,4℃条件下孵育过夜。
11)一抗孵育后,TBST液洗膜3次,每次5min,同时回收一抗。将PVDF膜放入孵育盒中,加入适量的二抗,室温条件下避光孵育1h。
12)二抗孵育后,TBST液洗膜3次,每次5min,同时回收二抗。使用Odyssey双色红外成像系统扫描PVDF膜,分析目的条带的表达情况。
2、TUNEL测定心肌细胞凋亡
TUNEL试剂盒:货号11684817910,Roche,Switzerland。
(1)石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
(2)修复:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走),在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织,37℃温箱孵育25min。将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。
(3)破膜:切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织,常温下孵育20min,将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。
(4)加试剂1、2:按片子数量和组织大小取TUNEL试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按1:9混合,加到圈内覆盖组织,切片平放于湿盒内,37℃温箱孵育2小时,湿盒内加少量水保持湿度。
(5)血清封闭:将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后,在圈内滴加山羊血清室温孵育30min。山羊血清可结合组织中的非特异性结合位点,防止对POD的吸附作用,以及非特异性产生。
(6)阻断内源性过氧化物酶:将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片放入3%双氧水溶液,室温避光孵育15min,将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。
(7)加试剂3:切片稍甩干后,每张切片加适量试剂3(converter-POD)覆盖组织,切片平放于湿盒内,37℃温箱孵育30min。将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。
(8)DAB显色:切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为细胞核呈棕黄色,自来水冲洗切片终止显色。
(9)复染细胞核:苏木素复染3min左右,自来水洗,苏木素分化液分化数秒,自来水冲洗,苏木素返蓝液返蓝,流水冲洗。
(10)脱水封片:将切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。
(11)荧光镜下观察,拍照。若需保存,于暗湿盒中4℃保存。在荧光显微镜下观察,拍照,计数凋亡神经元细胞。
心脏组织梗死交界区心肌细胞凋亡情况测定结果如图3所示。Bax和clever-caspase3(c-caspase3)是促凋亡蛋白,而Bcl-2是抑制凋亡蛋白。研究发现培西达替尼能够抑制Bax和c-caspase3的表达,抑制凋亡发生(图3A-E)。同时TUNEL结果表明,培西达替尼能够降低心肌细胞凋亡比率(图3F、G)。因此小培西达替尼可以减轻心肌细胞凋亡,改善心肌梗死后心室重构。
研究结果表明,在急性心肌梗死模型中,培西达替尼能够明显减小梗死面积,减轻心肌损伤,抑制病理性心肌重构,改善心脏功能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

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1.培西达替尼在制备预防心肌梗死的药物中的应用。
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