CN117298127A - 苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及苦杏仁苷的医药用途，具体涉及苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中的应用。研究发现苦杏仁苷能够显著下调CUMS斑秃小鼠血清和皮肤组织中炎症因子IL‑6、IFN‑γ和TNF‑α的含量。通过抑制JAK2/STAT3/SOCS3信号通路，升高CD4+T细胞及CD4+CD25+FOXP3细胞的表达水平、抑制CD8+T细胞的表达水平，促进毛发再生。

Description

苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及苦杏仁苷的医药用途，具体涉及苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中的应用。

背景技术

斑秃(alopecia areata,AA)是一种常见的良性、复发性、非瘢痕性脱发。临床表现为头皮突发边界清楚的斑状脱发，多无自觉症状，严重的可发展成为全秃、普秃。AA患者虽无生命危险，但由此引发的心理压力,严重影响患者的工作和生活，是一个严重的临床问题。目前斑秃全球发病率为0.57-3.8％,我国为0.27％，全球个人终生患病风险为2％。传统的治疗方法主要是糖皮质激素、免疫抑制剂、局部免疫疗法等。随着研究的深入，当前小分子药物JAK激酶抑制剂在中重度斑秃的治疗中显示出较好的系统用药疗效。但总体上，该病创新疗法的临床发展远远落后于其他自身免疫性疾病。

糖皮质激素有三种给药途径：1.系统使用，副作用包括体重增加、类固醇痤疮、肌肉疼痛、头痛、胃溃疡、腹痛、行为改变、库欣综合征、高眼压、膨胀纹、痛经、黑棘皮病和多毛，并易发生生长迟缓，代谢失调和骨矿物质密度降低。2.皮损内注射，可导致疼痛、皮肤萎缩凹陷、色素减退。眶周注射可能产生眼内压增高、青光眼、白内障和视网膜血管闭塞。3.局部外用，可诱发皮肤感染、色素沉着、皮肤萎缩以及毛细血管扩张。免疫抑制剂主要是系统使用，主要的副作用为肝肾损害，骨髓抑制，胃肠道反应等，且疗效不肯定。局部免疫疗法因至今仍属于未经许可的治疗方法，在临床上难以推广应用。

随着研究的深入，当前小分子药物JAK激酶抑制剂在中重度斑秃的治疗中显示出较好的系统用药疗效。但长期服用JAK抑制剂可削弱机体的肿瘤监测功能，可能会增加肿瘤的风险，外用JAK抑制剂的安全性较口服给药高，并发症少，但疗效显著降低。因此，寻找新的治疗药物实现更好的治疗效果并减少并发症势在必行。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术存在的传统治疗斑秃的用药方式存在的副作用多，效果微弱的技术缺陷，提供一种新型的治疗斑秃的药物。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中的应用。

发明人在研究的过程中偶然发现，苦杏仁苷能够显著下调CUMS斑秃小鼠血清和皮肤组织中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。薛定谔分子对接和体内表面等离子体共振结果显示：苦杏仁苷是与IL-6、IL-1β、TNF-α亲和度最高的化学成分。高度提示苦杏仁苷是缓解斑秃的有效成分。进一步的研究发现：所述苦杏仁苷活性成分能够抑制JAK2/STAT3/SOCS3信号通路，下调炎症因子IFN-γ、IL-6、和TNF-α的含量，升高CD4⁺T细胞及CD4+CD25+FOXP3细胞的表达水平、抑制CD8⁺T细胞的表达水平，促进斑秃小鼠的毛发再生。

作为本发明的优选技术方案，所述治疗斑秃的药物中包含苦杏仁苷活性成分及任何一种或多种药学可接受的载体。

作为本发明的优选技术方案，所述的药物根据需要能够被制成任何一种药学可接受的剂型。其中剂型包括口服、注射、以及外用涂敷。

作为本发明的优选技术方案，所述苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中应用的有效浓度为1-100μmol/L。

作为本发明的优选技术方案，所述苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中应用的有效浓度为5-80μmol/L。

作为本发明的优选技术方案，所述苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中应用的有效浓度为20-50μmol/L。

根据小鼠的口服剂量，当有效浓度为1-100μmol/L时，每天摄入的含苦杏仁苷成分的溶液为60mg/(kg·d)-120mg/(kg·d)时，通过21天观测法，能够对比出，在小鼠身上，具有明显的效果。

作为本发明的优选技术方案，所述苦杏仁苷和其他药物的活性成份配伍作为组合物治疗斑秃。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明发现苦杏仁苷能够通过下调CUMS斑秃小鼠血清和皮肤组织中炎症因子IL-6、IFN-γ和TNF-α的含量，抑制JAK2/STAT3/SOCS3信号通路，调节斑秃小鼠CD4+、CD8+T细胞及CD4+CD25+FOXP3细胞的表达水平，促进毛发再生。

本发明的技术方案中，苦杏仁苷能能够实现治疗斑秃的有效剂量为120mg/(kg·d)。

附图说明

图1是设计的6组实验小鼠在肉眼观察状态的比较示意图；

图2是设计的6组实验小鼠在皮肤镜下的观察对比示意图；

图3是HE染色评估小鼠皮肤组织病理观察比较图；

图4ELISA法检测小鼠血清和皮肤组织中IL-6、TNF-α和IFN-γ的表达水平对比图。

图5Western blot和RT-qPCR分析苦杏仁苷对斑秃小鼠IFN-γ、IL-6和TNF-α表达的影响对比图。

图6免疫组化染色分析苦杏仁苷对斑秃小鼠皮肤组织中CD4+CD25+FOXP3细胞表达水平的影响对比图。

图7免疫组化染色分析苦杏仁苷对斑秃小鼠皮肤组织中CD4+、CD8+T细胞表达水平的影响对比图。

图8 Westernblot和RT-qPCR分析苦杏仁苷对斑秃小鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS3表达的影响对比图。

图9免疫组化染色分析苦杏仁苷对斑秃小鼠皮肤组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS3表达水平的影响对比图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

苦杏仁苷：CAS29883-15-6，公司名称：Arkpharm

分子式：C20H27NO11

实施例1

1、苦杏仁苷溶液的配制

将苦杏仁苷溶于无菌水中，制成浓度为60g/L的溶液备用，并设置苦杏仁苷干预组、鲁索利替尼干预组以及对照组。

苦杏仁苷干预组(包括低剂量、中剂量、高剂量三种)，每日中午灌胃给予苦杏仁苷1次，连续21天，低剂量为60mg/(kg·d)；中剂量为90mg/(kg·d)；高剂量分别为120mg/(kg·d)。鲁索利替尼组每日给药鲁索利替尼60mg/(kg·d)，分2次灌胃。以上干预组的小鼠每周称重2次，根据小鼠的体重变化及时调整灌胃剂量组的剂量，对应的，对照组根据体重变化每日中午予以等剂量的生理盐水。

实施例2

2、小鼠的培养

选择48只6-8周龄健康的SPF级C3H/HeJ雌性小鼠，要求外观毛发完好。上述实验动物购入后进行一周适应性饲养。期间自由进食，任意饮水，温度为17-23℃、湿度为45％-55％，明暗周期依次各12小时。一周后，将上述48只小鼠随机分为6组，每组8只，六组小鼠分别为对照组(Control组)、咪喹莫特诱导+慢性温和非预期性应激模型组(alopecia areata组)、苦杏仁苷低剂量干预组(amygdalin 60mg/kg/d)、苦杏仁苷中剂量干预组(amygdalin90mg/kg/d)、苦杏仁苷高剂量干预组(amygdalin 120mg/kg/d)、鲁索利替尼干预组(ruxolitinib 60mg/kg/d组)。

选择40只C3H/HeJ雌性小鼠用于分别建立咪喹莫特诱导+慢性温和非预期性应激模型(IS)：

①咪喹莫特诱导实验具体按照如下方式进行：第1周开始，在小鼠项部涂敷5％咪喹莫特乳膏，每周3次，连续进行3周，共计21天。对照组每日外搽空白赋形剂0.05g，(空白赋形剂具体为凡士林和羊毛脂按照1:1配合而成)，涂抹操作过程中，每次先用清洁的医用棉签蘸少许咪喹莫特约0.05g均匀涂抹，范围约为1.5cm×1.5cm，要求每次涂抹前均使用生理盐水清洗患处。21天后，涂抹咪喹莫特乳膏的部位附近即形成面积大于1cm×1cm的脱毛斑，表明斑秃模型制备成功。造模期间出现皮肤红肿反应的小鼠，暂停给药3-7天后该现象自行消退，无需特殊处理，消退后继续用药，详细记录其毛发脱落情况。

②慢性温和非预期性应激实验：第1周开始，同时接受21天慢性温和非预期应激，应激因子包括：行为限制(2h)、4℃冰水游泳(2min)、禁食(24h)、禁水(24h)、夹鼠尾悬挂(1min)、昼夜颠倒(24h)、电击足底(电流强度1mA，电压30V，每次10s,间隔1min)、鼠笼倾斜45°(24h)、潮湿垫料(10h)、45℃高温(5min)、噪音(3h)。每天随机给予1种应激，每种应激抽签随机出现，出现的时间也随机，每种应激出现的几率平均，使小鼠无法预见发生的刺激，以避免产生适应。

实施例3

3、苦杏仁苷对斑秃小鼠的生发作用研究

3.1、定期拍照和皮肤镜检测

实验开始的前1天，以及实验开始后的第7天、第14天、第21天，观察所有实验小鼠毛发情况并拍照，具体如图1所示。同时对所有小鼠进行皮肤镜检测，观察脱毛区皮肤、毛囊开口及毛发生长情况，得到如图2所示的观察图。

如图1所示，对照组(Control组)小鼠毛发正常。与对照组相比，模型组(alopeciaareata组)的小鼠毛发脱落，最初的表现为毛发散乱，排列不规整，之后出现松动，轻触便可脱落，拉发试验(+)，涂药中央部位脱落明显。其后可在小鼠活动中自行脱落，面积不断扩大，继而形成明显的斑秃样病损。局部皮肤脱毛轻微潮红脱屑，无瘢痕、硬结等现象。鲁索利替尼阳性药物对照组、苦杏仁苷低剂量组、苦杏仁苷中剂量组、苦杏仁苷高剂量组均在第14天左右开始出现毛发新生，皮肤潮红脱屑情况改善，拉发试验(-)。其中苦杏仁苷高剂量组疗组疗效最显著，与鲁索利替尼阳性药物对照组改善情况相当。

如图2所示，皮肤镜下，对照组(Control组)小鼠毛发正常，皮肤无潮红。与对照组相比，模型组(alopecia areata组)的小鼠可见大量空毛囊，毛发脱落面积逐渐逐扩大，脱毛区皮肤潮红脱屑。鲁索利替尼阳性药物对照组，苦杏仁苷低剂量组、苦杏仁苷中剂量组、苦杏仁苷高剂量组均在第14天左右开始出现新生毳毛，皮肤潮红脱屑情况于21天左右改善。其中高剂量组疗效最显著，与鲁索利替尼阳性药物对照组改善情况相当。

3.2、苏木素伊红(HE)染色实验

分别对6组小鼠的项部皮肤进行苏木素伊红(HE)染色实验，具体的，在4％甲醛溶液中固定。洗涤脱水透明固定后，常规用石蜡浸渍包埋，4μm厚度切片。二甲苯脱蜡后，依次经过不同浓度的乙醇和蒸馏水水化。蒸馏水洗2分钟，重复3次，PBS浸泡10分钟，苏木素染色5-15分钟后自来水洗15秒，1％盐酸酒精分化1秒钟，自来水洗2分钟。0.1-0.25％碳酸锂饱和溶液显兰1分钟，自来水洗2分钟，蒸馏水洗15秒，0.5％水溶性伊红染液5分钟。自来水洗2分钟。再常规脱水、透明。滴加中性树胶后用盖玻片封片。注意封片时避免气泡的产生。干燥箱干燥后，在显微镜下观察。通过HE染色评估小鼠皮肤组织病理学变化。

如图3所示，分别为HE 200×，比例尺200μM，HE 400×，比例尺100μM的图像。其中，可以明显观察到：

对照组(Control组)小鼠皮肤表皮层较薄，颗粒层及棘层细胞数目少，角质层较薄，真皮层及皮下组织结构正常，多数毛囊处于生长期，毛囊及血管周围浸润淋巴细胞数目较少，真皮层内仅见少许纤维组织。

模型组(alopecia areata组)表皮层增厚，皮肤内处于生长期的毛囊数目明显减少，退行期和休止期毛囊增多，毛囊萎缩，毛球、毛母质及毛乳头缩小，毛乳头上移，毛球及血管周围可见以淋巴细胞为主的浸润。此外，可见皮肤表皮明显增生，颗粒层和棘层肥厚，细胞层数明显增多，伴角化过度，部份毛囊口亦可见大量角质栓伸入其内；同时，真皮内成纤维细胞浸润增多，胶原纤维合成增加，但未见明显的疤痕样结构形成。

鲁索利替尼阳性药物对照组，苦杏仁苷低、中、高剂量组表皮增生减轻，角化过度减少，真皮层炎性细胞浸润数量明显减少，生长期毛囊数量增多。其中高剂量组疗效最显著，与鲁索利替尼阳性药物对照组改善情况相当。

实施例4

4、苦杏仁苷对斑秃小鼠的免疫调节作用研究

4.1、ELISA检测小鼠血清及皮肤组织中炎症因子IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量

从室温平衡20min后的铝箔袋中取所需板条；设置标准品孔、样本孔和空白孔；向待测样本孔中先加样本稀释液40μL，再加待测样本10μL；分别加入检测IFN-γ抗体、TNF-α抗体、IL-6抗体各100μL，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；所有孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

图4ELISA法检测小鼠血清和皮肤组织中IL-6、TNF-α和IFN-γ的表达水平。数据以平均数±标准差(n＝8)表示。**p<0.01与对照组比较；##p<0.01与模型组比较。

4.2、Westernblot、RT-qPCR检测小鼠皮肤组织中炎症因子IFN-γ、IL-6和TNF-α的含量

总蛋白提取后，按照BCA蛋白定量试剂盒，采用BCA法测定蛋白浓度；每孔中上样量20μl，电泳条件第一阶段80V，60分钟，第二阶段120V，60分钟。转膜结束后，用5％的脱脂牛奶(TBST配制)，封闭1小时，分别加入按照说明书配制好的相应蛋白一抗，在4℃条件下孵育过夜。再加入二抗，孵育1.5小时。在化学发光成像系统下采集图像，通过勤翔化学分析软件读出面积与灰度的乘积，进行比较分析。

取皮肤组织，提取总RNA并检测RNA浓度和纯度，逆转录cDNA，进行实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)，反应体系：2μL模板cDNA，2×qPCR Mix10μL，1μL正向、反向引物,加双蒸水至总体积25μL。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸10s，40个循环，以β-肌动蛋白基因作为参考。采用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。

如图5所示，Westernblot和RT-qPCR分析苦杏仁苷对斑秃小鼠IFN-γ、IL-6和TNF-α表达的影响。IFN-γ(A、F、G)、IL-6(A、B、C)、TNF-α(A、D、E)蛋白和基因表达，数据以平均数±标准差(n＝8)表示。**p<0.01与对照组比较；#p<0.05和##p<0.01与模型组比较。

4.3、流式细胞术、免疫组化染色技术检测小鼠皮肤组织中CD4+CD25+FOXP23细胞的表达水平

流式细胞术试验具体包括如下步骤

1、将Fixation/Permeabilization Concentrate(4×)和Fixation/Permeabilization Diluent按1：3比例制备成1×Fixation/Permeabilization工作液；用蒸馏水将Permeabilization Buffer(10×)稀释1×工作液；

2、取100μl细胞悬液于流式管中，加入5μlAnti-Mouse CD4Antibody和5μlAnti-Mouse CD25 Antibody，涡旋震荡混匀，4℃避光孵育30-60min；

3、每管加入1ml 1×Fixation/Permeabilization工作液，涡旋震荡混匀；室温避光孵育30-60min；

4、每管加入2ml 1×Permeabilization Buffer。4℃300-400×g离心5min，弃上清；

5、重复步骤4；

6、用100μl 1×Permeabilization Buffer重悬沉淀；

7、细胞悬液中加入2μl正常大鼠血清进行阻断，室温避光孵育15min；

8、无需洗涤，加入5μl FOXP3 MonoclonalAntibody。震荡混匀，室温避光孵育至少30min；

9、每管加入2ml 1×PermeabilizationBuffer，室温下300-400×g离心5min，弃上清；

10、重复步骤9；

11、每管加入500μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer重悬，上机检测。

免疫组化：

1.组织置于4％甲醛中固定后常规石蜡包埋，切片厚度4μm；切片于80℃电热恒温箱烘烤3h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3％H2O2室温孵育，抗原修复，一抗(工作浓度1:50/100)4℃过夜，二抗室温孵育2小时，DAB显色，苏木素复染；1％盐酸酒精分化，氨水返蓝后封片。光镜下观片，观察皮肤组织中各指标的含量变化，进行结果判读；

2.免疫组化平均光密度值(average optical)分析方法：每组内每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD)以及组织的像素面积(AREA)。并求出平均光密度值(averageoptical,AO值)，AO＝IOD/AREA，AO值越大表明阳性表达水平越高。

如图6所示，免疫组化染色分析苦杏仁苷对斑秃小鼠皮肤组织中CD4+CD25+FOXP3细胞表达水平的影响。CD4+CD25+FOXP3细胞(A、B),数据以平均数±标准差(n＝8)表示；**p<0.01与对照组比较；##p<0.01与模型组比较。

4.4、流式细胞术、免疫组化染色技术检测小鼠皮肤组织中CD4+、CD8+T细胞的表达水平

免疫组化：

1.组织置于4％甲醛中固定后常规石蜡包埋，切片厚度4μm；切片于80℃电热恒温箱烘烤3h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3％H2O2室温孵育，抗原修复，一抗(工作浓度1:50/100)4℃过夜，二抗室温孵育2小时，DAB显色，苏木素复染；1％盐酸酒精分化，氨水返蓝后封片。光镜下观片，观察皮肤组织中各指标的含量变化，进行结果判读

2.免疫组化平均光密度值(average optical)分析方法：每组内每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD)以及组织的像素面积(AREA)。并求出平均光密度值(averageoptical,AO值)，AO＝IOD/AREA，AO值越大表明阳性表达水平越高。

如图7所示，免疫组化染色分析苦杏仁苷对斑秃小鼠皮肤组织中CD4+、CD8+T细胞表达水平的影响。CD4+T细胞(A、B)、CD8+T细胞(A、C),数据以平均数±标准差(n＝8)表示；**p<0.01与对照组比较；##p<0.01与模型组比较。

实施例5

5、苦杏仁苷对斑秃小鼠JAK2/STAT3/SOCS3信号通路的影响研究

将C3H/HeJ雌性小鼠分为Control组、IS组、苦杏仁苷最佳干预组(Amg-x组)，每组8只。

5.1、Westernblot、RT-qPCR检测小鼠皮肤组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS3 mRNA的含量

Western Blot实验步骤具体包括如下步骤：

步骤1、蛋白提取

细胞总蛋白提取：对于悬浮细胞：离心收集细胞，每10⁶个细胞加250μl RIPA裂解液(在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)，振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少RIPA裂解液体积；对于贴壁细胞：用PBS冲洗细胞2-3次；最后一次彻底吸干残留液；加入适当体积的RIPA裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养容器内；反复晃动并用移液器吹打，使RIPA裂解液与细胞充分接触；将细胞收集到1.5ml离心管中，用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解；12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

组织总蛋白提取：组织块用冷的PBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织重量的RIPA裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)，冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少RIPA裂解液体积；将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡，用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解；12000g离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。

浆蛋白核蛋白提取(细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒)：

准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM；对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白；对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。每20μl细胞沉淀加入200μl添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A；(对于2×106Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20μl或40mg)；

对于新鲜组织：把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200μl组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行；匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟；4℃1500g离心5分钟。把上清转移至预冷的离心管中(吸上清时千万不要触及沉淀)，即为抽提得到的部分细胞浆蛋白；对于沉淀，虽然已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。每20μl细胞沉淀加入200μl添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A；最高速剧烈涡旋5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开；(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长涡旋时间)冰浴10-15分钟；加入细胞浆蛋白抽提试剂B10μl。最高速剧烈涡旋5秒，冰浴1分钟；最高速剧烈涡旋5立即吸取上清至预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白；可以立即使用，也可以冻存；(不能触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀)对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50μl添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂；(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染)；最高速剧烈涡旋15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈涡旋15-30秒，共30分钟；4℃12000-16000g离心10分钟；立即吸取上清至预冷的离心管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存存。

步骤2、蛋白浓度测定：

BCA法测蛋白浓度，按需用量配制适量BCA工作液；BCA试剂A与BCA试剂B以体积比50:1混合，充分混匀；配制标准蛋白溶液，并以蒸馏水作为空白对照；将样品作适当稀释，稀释液需与标准品的稀释液一致，可用1×PBS或蒸馏水进行稀释，样品作梯度倍比稀释，如2倍、4倍、8倍等稀释；微孔板法：分别取20μl不同浓度标准蛋白溶液、待测样品以及空白对照(蒸馏水)分别置于各孔，为测定准确每个加样孔均应做复孔；每孔分别加200μlBCA工作液，轻微震荡混匀，动作不可剧烈，避免交叉污染；封上微孔板，放置37℃反应30分钟(对于低浓度样品的检测可37℃反应2小时，以提高562nm波长吸收值，增强检测灵敏度)；取出微孔板恢复至室温，采用562nm波长酶标仪比色；计算出每孔标准蛋白和待测样品的实际吸收值(即标准品吸收值－空白平均吸收值)，然后计算出复孔平均吸收值；绘制标准蛋白曲线。通过标准曲线回归公式，计算出待测样品的蛋白浓度；结果分析：见<BCA法蛋白浓度测定结果分析>表格。

步骤3、样本制备

取出蛋白样品，冰上融化。按总蛋白溶液体积：5×SDS上样缓冲液体积4:1比例加入相应量的5×SDS上样缓冲液，旋涡混匀；放入金属浴中，95℃加热5分钟；如果指标蛋白包含跨膜蛋白，则70℃加热5-10分钟；于冰上冷却。

步骤4、SDS-PAGE电泳

清洗玻璃板，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶；按实验安排配制分离胶，加入AP和TEMED后立即摇匀即可灌胶，并小心用ddH2O或者异丙醇液封；大约30分钟后，下层胶凝固，即可倒去液封液体并用吸水纸将剩余部分吸干；

按前面方法配制浓缩胶，加入AP和TEMED后立即摇匀灌胶；将剩余空间加满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，插入梳子时，梳子下不可有气泡，等浓缩胶凝固，约30分钟；将制好的胶取下，夹在电泳核心上，使短玻璃板一侧朝里，固定完成后，放入电泳槽中，加入足量的电泳液，内槽须没过薄玻璃板；将适当体积的样品及Marker加入样品孔中，即可进行电泳。浓缩胶使用电压80V，当样品进入分离胶时，调整电压至120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。

步骤5、(小于20kd的蛋白使用0.22μm的PVDF膜)

准备6张7×9cm的滤纸和合适大小的PVDF膜，PVDF膜在使用之前用100％甲醇活化；小心将分离胶从玻璃板中取出，置于转膜液中平衡；在加有转膜液的容器里放入转膜用夹子，两块海绵垫，一支玻璃棒，滤纸和经过活化的PVDF膜；

将夹子打开，使黑的一面在下，保持水平。在垫子上依次垫上海绵、三层滤纸；小心将分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，并除去气泡。在膜上盖上三张滤纸，并除去气泡，最后盖上另一个海绵垫，将夹子合上夹紧，置于转膜槽中，在夹子一侧放入冰盒，并加入足量的转膜液；

转膜条件(湿转)快转：300mA恒流转膜半小时，或者200mA恒流转膜1小时，时间可以根据指标蛋白大小略微调整，电流对应调整；慢转：转膜过夜，25V恒压转膜过夜。

步骤6、免疫反应

将转好的膜于室温下脱色摇床上用5％的脱脂牛奶(TBST配制)，封闭1h；按抗体说明书上推荐比例稀释一抗(一般用TBST配制的5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白则使用TBST配制的5％BSA)，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜(快转)，或者室温孵育抗体3小时(慢转)；室温下用TBST在脱色摇床上洗3次，每次5分钟；将二抗用TBST按说明书要求的比例稀释，室温孵育1小室后，室温下用TBST在脱色摇床上洗3次，每次5min。

步骤7、化学发光

将ECL A和ECL B两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上放在样本托盘上，与此混合液充分接触，在化学发光成像系统下采集图像。

步骤8、凝胶图像分析

使用<勤翔化学分析软件>进行灰度分析

荧光定量PCR实验包括如下步骤：

步骤1、总RNA抽提

1)使用前在Buffer RL2和Buffer RW2中加入标签所示体积的无水乙醇；

2)取10-20mg组织样本，加入550μl Buffer RL1进行匀浆；

3)12000rpm离心5min；

4)取上清液500μl转移至DNA-Cleaning Column(放入收集管)中，12000rpm离心2min，弃DNA-Cleaning Column，保留上清；

5)在上清中加入800μl的Buffer RL2；

6)用移液器将混合液吹打混匀，吸取700μl混合液转至RNA-only Column(放入收集管)中，12000rpm离心1min，弃废液；

7)纯化柱放回收集管，把剩余混合液全部转入纯化柱，12000rpm离心1min，弃废液；

8)向纯化柱中加入500μl BufferRW1，12000rpm离心1min，弃废液；

9)向纯化柱中加入700μl BufferRW2，12000rpm离心1min，弃废液；

10)重复步骤8；

11)纯化柱放回收集管，空管12000rpm离心2min，弃收集管；

12)将纯化柱转入新的离心管中，向纯化柱的膜中间滴加100μl已65℃预热的RNase-Free ddH2O，室温放置2min；12000rpm离心1min收集RNA溶液；

13)使用K2800核酸分析仪检测RNA浓度及纯度：仪器标定空白后取2μl待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，点击检测开始吸光值检测；

14)将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为500ng/μl。

步骤2、反转录

1)取PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2)加入2μl AccuRT Reaction Mix(4X)。

3)用Nuclease-free H2O补足至8μl。

4)室温放置5min。

5)加入2μl AccuRT Reaction Stopper(5X)，混匀。

6)依次加入4μl 5×All-In-One RT MasterMix，6μl Nuclease-free H2O，总体积为20μl，混匀。

7)在PCR仪上进行如下程序：首先25℃维持10min，然后42℃维持15min，最后85℃维持5min，结束后置于冰上冷却。

步骤3、定量PCR

1)稀释引物：将引物干粉4000rpm离心1min至管底，加入管身上标识体积的dd H₂O进行溶解，得到浓度为100μM的引物溶液；按下表比例配置7.5μM基因引物mix；

2)取0.2ml八连管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3个复孔

3)PCR扩增。

三、结果分析

1、对各实验组样本及对照组样本进行数据处理，用内参基因的CT值归一目的基因的CT值：

ΔCT(实验组样本)＝CT(目的基因，实验组样本)-CT(内参基因，实验组样本)；ΔCT(对照组样本)＝CT(目的基因，对照组样本)-CT(内参基因，对照组样本)；2、用对照组样本的ΔCT值归一各实验组样本的ΔCT值：

ΔΔCT＝ΔCT(实验组样本)-ΔCT(对照组样本)；

3、计算目的基因在实验组相对其在对照组表达水平比率：

实验组相对对照组的表达比值＝2-ΔΔCT。

如图8所示，Westernblot和RT-qPCR分析苦杏仁苷对斑秃小鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS3表达的影响。JAK2(A、C、D)、STAT3(A、F、G)、SOCS3(A、H、I)蛋白和基因的表达，p-JAK2(A、B)、p-STAT3(A、E)蛋白的表达。数据以平均数±标准差(n＝8)表示。**p<0.01与对照组比较；#p<0.05和##p<0.01与模型组比较。

5.2、免疫组化染色技术检测小鼠皮肤组织中JAK2、STAT3、SOCS3的表达水平

免疫组化：将小鼠的组织置于4％甲醛中固定后常规石蜡包埋，切片厚度为4μm；切片于80℃电热恒温箱烘烤3h，二甲苯脱蜡后梯度酒精脱水；3％H₂O₂室温孵育，抗原修复，一抗(工作浓度1：50/100)4℃过夜，二抗室温孵育2小时，DAB显色，苏木素复染；1％盐酸酒精分化，氨水返蓝后封片。光镜下观片，观察皮肤组织中各指标的含量变化，进行结果判读。

免疫组化平均光密度值(average optical)分析方法：每组内每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics,Inc.,Rockville，MD，USA)选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD)以及组织的像素面积(AREA)。并求出平均光密度值(average optical,AO值)，AO＝IOD/AREA，AO值越大表明阳性表达水平越高。

如图9为为免疫组化染色分析苦杏仁苷分别对斑秃小鼠皮肤组织中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS3表达水平的影响图。JAK2、p-JAK2(A、B、C)、STAT3、p-STAT3(D、E、F)，SOCS3(G、H)。数据以平均数±标准差(n＝8)表示。**p<0.01与对照组比较；##p<0.01与模型组比较。

通过上述试验研究，可以显示出：

苦杏仁苷可以通过JAK2/STAT3/SOCS3信号通路，调节斑秃小鼠CD4+、CD8+T细胞及CD4+CD25+FOXP3细胞的表达水平，抑制炎症因子IL-6、TNF-α和IFN-γ，促进斑秃小鼠毛发再生。

Claims (7)

1.苦杏仁苷在制备治疗斑秃的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗斑秃的药物中包含苦杏仁苷活性成分及任何一种或多种药学可接受的载体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗斑秃的药物根据需要能够制成任何一种药学可接受的剂型。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中应用的有效浓度为1-100μmol/L。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中应用的有效浓度为5-80μmol/L。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述苦杏仁苷在制备治疗斑秃药物中应用的有效浓度为20-50μmol/L。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苦杏仁苷和其他药物活性成份配伍作为组合物。