CN116211841A - 异丙肾上腺素在制备治疗儿童早衰症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物药领域，涉及异丙肾上腺素在心肌萎缩疾病(包括但不限于儿童早衰症)中的用途。本发明提供了异丙肾上腺素在制备抗早衰药物方面的应用，包括但不限于儿童早衰症相关的心肌萎缩症状的缓解，进而提高心功能的药物；或者成人心肌萎缩症状的缓解或者治疗药物,以及减缓儿童早衰症相关体重丢失、延迟儿童早衰症相关个体死亡的药物。本发明的研究表明异丙肾上腺素能够抑制胞内促萎缩信号，改善心肌萎缩表型，提高心功能，进而延长存活时间，为未来治疗人类心肌萎缩提供了新的选择，也在儿童早衰症的治疗中展现了良好的应用前景。

Description

异丙肾上腺素在制备治疗儿童早衰症药物中的应用

技术领域

本发明属于生物药领域，涉及异丙肾上腺素在心肌萎缩疾病(包括但不限于儿童早衰症)中的用途。

背景技术

儿童早衰症(Hutchinson-Gilford综合征)是一种罕见的早年衰老综合症，由核纤层蛋白LaminA的编码基因突变导致。突变的LaminA，即早衰素，被认为与疾病发生紧密相关。患者在1-2岁时表现出生长迟滞、脱发、皮肤褶皱、牙齿发育障碍等衰老样外貌。患者在病情的中后期常发展出严重的心肌病变。研究显示：儿童早衰症患者的平均寿命为13岁，心血管疾病是导致其死亡的首要原因。然而当前尚缺乏儿童早衰症的有效疗法，更未有报道可靶向儿童早衰症相关心脏疾病的治疗方案。

当前的针对儿童早衰症的、唯一被临床批准的治疗方案是利用法尼基转移酶抑制剂氯那法尼(Lonafarnib)阻断突变的LaminA蛋白前体的翻译后加工过程，进而减少早衰素的胞内累积。然而，长期使用法尼基转移酶抑制剂将会导致LaminA蛋白前体的大量积聚，而LaminA蛋白前体曾被报道与心肌病变密切相关。其他一些临床前的研究还发现利用mTOR通路抑制剂或二甲双胍等可改善儿童早衰症成纤维细胞的衰老相关指标，然而其对呈现萎缩表型的儿童早衰症心肌细胞而言是否存在不利影响还未被评估。因此，开发一种靶向心肌萎缩的针对性药物可以为儿童早衰症的治疗提供一种新的选择。同时，该种疗法也对生理性衰老或接受化疗的肿瘤患者提供了一种缓解心肌萎缩的可能方案。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供异丙肾上腺素的新用途。

本发明要解决的另一个技术问题是：找到治疗或者缓解心肌萎缩及儿童早衰症的新药物。

本发明在研究中发现：儿童早衰症小鼠模型表现出心肌萎缩现象，其心脏器官大小、心肌细胞大小及心脏功能等都相较于野生型小鼠出现显著下降。进一步的机制研究提示：儿童早衰症小鼠心肌细胞中DNA损伤持续积累，导致损伤应答相关蛋白激酶CHK2表达提升，进而促进对抗心肌肥大的关键蛋白AMPK的持续激活。AMPK通过上调下游促肌肉萎缩转录因子FOXO3A磷酸化，激活其下游基因如Fbxo32、Trim63的表达，进而引发心肌萎缩。值得注意的是，除儿童早衰症外，生理性衰老或化疗也可导致心肌萎缩发生，但是当前尚缺乏有效的治疗方案。

利用已在临床上广泛使用的异丙肾上腺素(isoproternol)的盐酸盐(C11H18ClNO3)可明显下调AMPK及FOXO3A磷酸化，进而促进心肌肥大性生长，提高心脏相对质量及心功能，最终有助于延长儿童早衰症小鼠寿命。本发明在上述研究基础上完成。

第一方面，本发明提供了异丙肾上腺素在制备药物方面的应用，其特征在于，异丙肾上腺素在制备治疗或者预防早衰症药物中的应用，包括异丙肾上腺素在制备治疗儿童早衰症相关心肌萎缩的药物中的应用。

所述的药物包括各种常见的片剂、注射剂、喷剂等，也可以含有核酸、多肽、小分子化合物、聚合物或者其他的物质形式。

第二方面，本发明提供了异丙肾上腺素在制备延长儿童早衰症患者寿命的药物中的应用。

优选的，所述的治疗或者预防儿童早衰症药物包括但不限于：减缓儿童早衰症相关体重丢失、延迟儿童早衰症个体死亡的药物。

第三方面，本发明提供了异丙肾上腺素在制备治疗其他类型心肌萎缩症的药物中的应用。

优选的，所述的治疗或者预防儿童早衰症药物包括但不限于：

儿童早衰症相关的心肌萎缩症状的缓解药物；

提高心功能的药物；

促进心肌或者心肌细胞增大的药物；或者

成人心肌萎缩症状的缓解或者治疗药物。

第四方面，本发明提供了异丙肾上腺素在制备抑制AMPK及FOXO3A通路的制剂中的应用。

优选的，所述异丙肾上腺素可抑制AMPK信号通路和FOXO3A信号通路的激活。

优选的，所述的应用是异丙肾上腺素作为靶标，筛选治疗或者预防心肌萎缩的药物。例如，将治疗或者预防心肌萎缩的候选药物与疾病模型或者细胞孵育，能够提升异丙肾上腺素含量或者活力的候选药物进行下一步筛选。

第五方面，本发明提供了一种治疗或者预防心肌萎缩的药物，所述药物含有异丙肾上腺素和药学上可接受的辅剂,其中异丙肾上腺素是主要活性成分。本发明的异丙肾上腺素还包括异丙肾上腺素的衍生物，例如异丙肾上腺素的盐酸盐，或者以异丙肾上腺素为主要活性基团的化合物、含有异丙肾上腺素的药学上常用的载体，以及临床上可用的、具有异丙肾上腺素活性的药物或者试剂。

第六方面，本发明提供了一种促进体外培养的儿童早衰症来源的心肌细胞增大的方法，在心肌细胞的培养基中加入异丙肾上腺素。

优选的，所述的方法包括以下步骤：

(1)分离儿童早衰症来源的心肌细胞；

(2)将心肌细胞置于含有培养基的培养容器中，贴壁培养；

(3)在心肌细胞的培养基中加入异丙肾上腺素培养2-96小时，加入异丙肾上腺素的终浓度为10-500μM；

(4)更换为不含异丙肾上腺素的心肌细胞培养基。

优选的，所述的心肌细胞是儿童早衰症来源的原代心肌细胞。

优选的，所述的细胞培养容器为96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板或者培养皿等其他常见的细胞培养容器。这些容器在使用前都经过消杀处理。

优选的，所述的异丙肾上腺素的终浓度为50-200μM，细胞处理时间为6-48小时。

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明挖掘了异丙肾上腺素的新的医疗用途，开拓了新的应用领域。

(2)本发明涉及的异丙肾上腺素已在临床上广泛使用(但未做治疗心肌萎缩症的治疗药物使用)，其安全性已得到广泛认证，可快速投入包括但不限于儿童早衰症相关的心肌萎缩的临床治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的每一幅附图针对本申请的部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：异丙肾上腺素可在体外抑制心肌AMPK及FOXO3A信号通路以促进肥大。

图2：异丙肾上腺素可改善儿童早衰症相关心肌萎缩表型。

图3：异丙肾上腺素可下调AMPK及FOXO3A信号通路。

图4：异丙肾上腺素可缓解儿童早衰症相关心功能下降现象。

图5：异丙肾上腺素可拯救儿童早衰症相关寿命缩短现象。

具体实施方式

本发明涉及一种异丙肾上腺素在儿童早衰症治疗中的应用。具体而言，本发明公开了一种利用异丙肾上腺素对儿童早衰症(Hutchinson-Gilford综合征)相关心肌萎缩症进行治疗的方法。异丙肾上腺素可抑制AMPK/FOXO3A信号通路的激活，抑制胞内促萎缩信号，改善心肌萎缩表型，提高心功能，进而延长存活时间，为未来治疗人类心肌萎缩提供了新的选择，也在儿童早衰症的治疗中展现了良好的应用前景。

下面将通过本申请的实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分优选实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动所获得的所有其他实施例，都属于本申请的保护范围。

以下实施例所用动物模型如下：

模拟儿童早衰症的儿童早衰症小鼠疾病模型(LmnaG609G/G609G)。该模型携带LmnaG609G/G609G突变，该突变与导致人类儿童早衰症发病的LaminA编码基因的G608G突变等价，是儿童早衰症领域内公认的最能模拟人类儿童早衰症的动物模型。

实施例1：异丙肾上腺素可抑制体外培养原代心肌细胞AMPK信号通路并促进心肌肥大性生长

分离新生大鼠原代心肌细胞，接种于96孔板内。待细胞贴壁后，更换培养液，并向新生大鼠原代心肌细胞的培养基中加入100μM的异丙肾上腺素，对细胞处理8小时，随后利用抗磷酸化AMPKα(Thr172)的抗体对细胞进行免疫荧光染色。通过高内涵成像系统对染色后的细胞进行信号分析。

结果如图1所示，可见异丙肾上腺素处理可显著降低新生大鼠原代心肌细胞AMPKα的Thr172位点磷酸化的信号，提示AMPK信号通路被药物成功抑制。

向新生大鼠原代心肌细胞的培养基中加入100μM的异丙肾上腺素，对细胞处理48小时，随后利用抗心肌特异性标志物α-Actinin抗体对细胞进行染色。通过高内涵成像系统对染色后的细胞进行信号分析，自动识别细胞膜位置并计算心肌细胞面积。

结果如图1所示，可见异丙肾上腺素处理可显著增大新生大鼠原代心肌细胞的细胞尺寸，提示细胞肥大性生长被药物成功激活。

实施例2：异丙肾上腺素可在动物体内改善儿童早衰症相关心肌萎缩表型

对2月龄儿童早衰症小鼠模型进行异丙肾上腺素的腹腔注射(5mg/kg/天)，注射持续2个疗程，每个疗程7天，两个疗程间停止给药7天。注射完第二疗程后7天，牺牲小鼠，解剖出心脏进行称重，解剖出胫骨测量其长度，计算心脏质量与胫骨长度的比值以反映小鼠心脏相对质量。

对取出的心脏进行石蜡切片，对切片进行H&E染色以分析其组织形态；对切片进行小麦胚芽凝集素(WGA)染色，以分析心肌细胞大小。

结果如图2所示，异丙肾上腺素可显著增加儿童早衰症小鼠心脏相对质量；异丙肾上腺素对心脏组织结构不造成明显影响，但明显增大心脏的器官尺寸。此外，异丙肾上腺素处理可明显增大儿童早衰症小鼠心肌细胞的大小。

实施例3：异丙肾上腺素可下调AMPK及FOXO3A信号通路

对2月龄儿童早衰症小鼠模型进行异丙肾上腺素的腹腔注射(5mg/kg/天)，注射持续2个疗程，每个疗程7天，两个疗程间停止给药7天。注射完第二疗程后7天，牺牲小鼠。解剖出心脏用于组织切片，后利用抗磷酸化AMPKα(Thr172)的抗体及抗磷酸化FOXO3A(Ser413)的抗体对组织进行免疫荧光染色，分析AMPK及FOXO3A信号通路激活情况。

结果如图2所示，异丙肾上腺素可显著降低儿童早衰症小鼠心脏中磷酸化AMPKα(Thr172)及磷酸化FOXO3A(Ser413)水平，提示AMPK及FOXO3A信号通路被药物成功抑制。

实施例4：异丙肾上腺素可缓解儿童早衰症相关心功能下降现象

对2月龄儿童早衰症小鼠模型进行心脏超声实验分析其基线心功能水平。随后对上述小鼠进行异丙肾上腺素的腹腔注射(5mg/kg/天)，注射持续2个疗程，每个疗程7天，两个疗程间停止给药7天。注射完第二疗程后7天，再次对小鼠进行心脏超声实验。

结果如图4所示，异丙肾上腺素可显著提升儿童早衰症小鼠的心功能。

实施例5：异丙肾上腺素可拯救儿童早衰症相关寿命缩短现象

对2月龄儿童早衰症小鼠模型进行异丙肾上腺素的腹腔注射(5mg/kg/天)，注射持续2个疗程，每个疗程7天，两个疗程间停止给药7天。饲养小鼠记录至其自然死亡，记录其寿命。结果参考图5所示，异丙肾上腺素可显著延长儿童早衰症小鼠的平均寿命(提升约17.5％)和最大寿命(提升约17.2％)，显示出其极大的临床应用价值。

以上所述的实施例仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可以不通过创造性劳动即能够联想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以本申请中权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.异丙肾上腺素在制备药物方面的应用，其特征在于，异丙肾上腺素在制备治疗或者预防早衰症药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是异丙肾上腺素作为AMPK信号通路或FOXO3A信号通路的抑制剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗或者预防儿童早衰症药物包括但不限于：

儿童早衰症相关的心肌萎缩症状的缓解药物；

提高心功能的药物；

促进心肌或者心肌细胞增大的药物；或者

成人心肌萎缩症状的缓解或者治疗药物。

4.根据权利要求1所述异丙肾上腺素的应用，其特征在于，所述的治疗或者预防儿童早衰症药物包括但不限于：减缓儿童早衰症体重丢失、延迟儿童早衰症个体死亡、延长早衰症儿童寿命的药物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是异丙肾上腺素作为靶标，筛选治疗或者预防早衰症药物；或者抑制AMPK信号通路或FOXO3A信号通路的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用是异丙肾上腺素作为靶标，筛选治疗或者预防心肌萎缩的药物：将治疗或者预防心肌萎缩的候选药物与疾病模型或者细胞孵育，能够提升异丙肾上腺素含量或者活力的候选药物进行下一步筛选。

7.一种治疗或者预防心肌萎缩的药物，其特征在于，所述药物含有异丙肾上腺素和药学上可接受的辅剂。

8.一种促进体外培养的儿童早衰症来源的心肌细胞增大的方法，其特征在于，在心肌细胞的培养基中加入异丙肾上腺素。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)分离儿童早衰症来源的心肌细胞；

(2)将心肌细胞置于含有培养基的培养容器中，贴壁培养；

(3)在心肌细胞的培养基中加入异丙肾上腺素培养2-96小时，加入异丙肾上腺素的终浓度为10-500μM；

(4)更换为不含异丙肾上腺素的心肌细胞培养基。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，

所述的心肌细胞是原代儿童早衰症来源的心肌细胞；

所述的培养容器为96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板或者培养皿；

所述的异丙肾上腺素的终浓度为50-200μM，细胞处理时间为6-48小时。

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