CN101420979A - 心肌梗塞的治疗方法 - Google Patents

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Abstract

哺乳动物中的心肌梗塞通过给予哺乳动物治疗有效量的化学性Src家族酪氨酸激酶蛋白质抑制剂而治疗以及所述抑制剂化合物用于制备治疗心肌梗塞药物的用途。心肌梗塞可通过给予哺乳动物预防量的抑制剂而预防。该抑制剂优选为Src蛋白的抑制剂，其选自Src家族酪氨酸激酶的吡唑并嘧啶类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的大环二烯酮类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的吡啶并[2，3－d]嘧啶类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的4－苯胺基－3－喹啉腈类抑制剂和其混合物。在特别优选的实施方案中，Src家族酪氨酸激酶抑制剂为具有疏水基团的ATP－竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，该基团位于接近ATP－模拟杂芳族部分处，小于约6埃大小。该Src家族酪氨酸激酶抑制剂可用于制备用于心肌梗塞治疗的药物。还公开了包含化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂的制品。

Description

心肌梗塞的治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请为2003年11月18日申请的指定美国的国际专利申请号PCT/US03/37653的部分延续，其为2002年11月18日申请的美国专利申请系列No.10/298,377的部分延续，其为2000年3月29日申请的美国专利申请系列No.09/538,248的部分延续，其为1999年12月22日申请的美国专利申请系列No.09/470,881的部分延续，现为美国专利No.6,685,938，其依次为1999年5月28日申请的指定美国的国际专利申请号PCT/US99/11780的部分延续，其要求1998年5月29日申请的美国临时申请专利系列No.60/087,220的利益。这些申请的全部公开内容在此通过引用引入。
政府权利声明
本发明在国立卫生研究院的合同号CA50286、CA45726、CA75924、CA78045、HL54444和HL09435的政府性支持下完成。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本发明一般涉及医药领域，并具体地涉及用于治疗哺乳动物中心肌梗塞的方法和组合物.
发明背景
由血管的损伤、疾病或其它创伤引起的血管通透性是组织损伤相关血管渗漏及水肿的主要原因。例如，与脑血管意外(CVA)或其它脑或脊髓组织中的血管损伤相关的脑血管疾病是神经疾病的最常见原因，也是残疾的主要来源。典型地，在CVA区域中脑或脊髓组织的破坏包括血管渗漏和/或水肿。典型地，CVA可以包括脑缺血、正常脑血流中断引起的损伤；由于血流瞬间干扰引起的脑供血不足；由于颅内或颅外动脉栓塞或血栓形成引起的梗塞；出血；和动静脉畸形。缺血性中风和脑出血可突然发生，该事件的影响一般反映了脑损伤的面积。(参见The Merck Manual，16th ed.Chp.123，1992)。
除CVA之外，中枢神经系统(CNS)感染或疾病也能影响脑和脊柱中的血管，并能引起炎症和水肿，正如以下例子，细菌性脑膜炎，病毒性脑炎和脑脓肿形成中那样。(参见The Merck Manual，16thed.Chp.125，1992)。全身性疾病状况也能弱化血管并导致血管渗漏和水肿，如糖尿病、肾病、动脉硬化、心肌梗塞等等.因此，血管渗漏和水肿是关键的病理表现，这不同于并独立于癌症，其需要与多种损伤、创伤或疾病状况相关的有效的特定治疗干预。
心肌梗塞为由于至心肌的闭塞的血液供给引起的心脏组织死亡.心肌梗塞为西方国家的住院患者中最常见的诊断之一。已报道每年在美国约110万人诊断患有急性心肌梗塞。心肌梗塞的死亡率可超过53％，并且多达66％的幸存患者未能实现完全恢复。每年仅百分之一死亡率的减少就可挽救多达3400条生命.
心肌梗塞和伴随的水肿通常在冠状动脉闭塞时发生，切断由阻塞的动脉供给的心脏组织的氧供给。当阻断血液供给时，通常由阻塞的动脉提供血液的组织变为缺血性的。最终被剥夺氧的心脏组织开始相继死亡(坏死)。Honkanen等.，在美国专利No.5,914,242中描述了用于减少心肌梗塞的方法，包括在心脏缺血发病后施用某些丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂和相关的多肽给患者。所述酶和多肽是昂贵的并且制造和纯化用于药物用途是复杂的.
我们已发现Src家族酪氨酸激酶活性的抑制提供了用于心肌梗塞治疗的有效方法，其通过降低冠状组织通常因冠状脉管系统的闭塞引起的水肿和产生的坏死，从而减轻心肌梗塞的组织损伤作用。
发明概述
本发明涉及通过抑制Src家族酪氨酸激酶活性的心肌梗塞(MI)治疗方法。该方法包括用有效量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂治疗患有冠状血管闭塞的哺乳动物的冠状组织。哺乳动物可以是人患者或非-人哺乳动物。所要治疗的冠状组织可以是心脏的任何部分，即由于冠状血管闭塞而患有缺血(即血流损失)的部分。治疗性的治疗通过将靶冠状组织与有效量的所需药物组合物接触而完成，所述组合物包括化学的(即非-肽的)Src家族酪氨酸激酶抑制剂。在接近有害的血管闭塞正出现或已出现之处的区域治疗患病的冠状组织将是有用的。该方法提供通常由于冠状血管闭塞引起的组织坏死(梗塞)的降低。
本发明进一步的方面为包括包装材料和包含于包装材料内的药物组合物的制品，其中该药物组合物能降低由于冠状血管闭塞而遭受血流损失的冠状组织的坏死。包装材料包括标签，其表明该药物组合物可用于治疗心肌梗塞，并且该药物组合物包括在药学可接受载体中的治疗有效量的Src家族酪氨酸激酶抑制剂。
用于本发明目的的合适的Src家族酪氨酸激酶抑制剂包括Src家族酪氨酸激酶的吡唑并嘧啶类抑制剂，如4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(AGL 1872)、4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(AGL1879)等等；Src家族酪氨酸激酶的大环二烯酮类抑制剂，如根赤壳素R2146、格尔德霉素、除莠霉素A(Herbimycin A)等等；Src家族酪氨酸激酶的吡啶并[2，3-d]嘧啶类抑制剂，如PD173955等等；Src家族酪氨酸激酶的4-苯氨基-3喹啉腈类抑制剂，如4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6，7-二甲氧基-3-喹啉腈、4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吗啉-4-基)丙氧基]-3-喹啉腈(SKI-606)等等；及其混合物。
特别优选的Src家族酪氨酸激酶抑制剂为具有疏水基团的ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，该基团位于接近ATP-模拟杂芳族部分(ATP-mimicing heteroaromatic moiety)处，小于约6埃大小。例证性的所述抑制剂为4-甲基苯基-和4-卤苯基-取代的吡唑并嘧啶类抑制剂如AGL 1872、AGL 1879等等，以及4-(4-卤苯氨基)-3-喹啉腈类抑制剂如SKI-606等等。
本发明的方法可用于治疗心肌梗塞。尤其是，本发明的方法可用于改善由心脏病、损伤或创伤引起的冠状血管阻塞造成的心脏组织坏死。在通过本发明的方法用小分子化学Src抑制剂(AGL1872或SKI-606)治疗的小鼠中观察到百分之40至60梗塞尺寸的降低。
附图简述
附图构成本公开的一部分；
图1为人c-Src的cDNA序列(SEQ ID NO：1)，其由Braeuninger等.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，88：10411-10415(1991)首次描述。该序列可由GenBank登录号X59932 X71157获得。该序列包含2187个核苷酸，蛋白编码区的起始和终止核苷酸位置分别是134和1486。
图2为图1中所示人c-Src编码序列编码的氨基酸残基序列(SEQID NO：2)。
图3描述了编码人c-Yes蛋白cDNA的核酸序列(SEQ ID NO：3)。该序列可由GenBank登录号M15990获得。该序列包含4517个核苷酸，蛋白编码区的起始和终止核苷酸位点分别是208和1839，并翻译成图4所示的氨基酸序列。
图4描述了c-Yes的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图5举例说明了在缺失Src、Fyn和Yes的小鼠皮肤里用改进的Miles测定VEGF对VP作用的结果。图5A为被处理耳朵的照片。图5B为刺激多种缺陷型小鼠的试验结果图.图5C表示处理后洗脱的Evan′s蓝染料量。
图6为Src+/-、Src-/-、野生型(WET)和AGL1872(即4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(t-丁基)吡唑酮[3，4-d-]嘧啶)治疗的野生型小鼠中脑梗塞相对大小的图。剂量为1.5mg/kg体重。
图7描述了对照和AGL1872治疗的小鼠脑的连续MRI扫描，其中显示AGL1872治疗的动物(右侧)比对照动物(左侧)脑梗塞更少。
图8描述了本发明优选的吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂的结构。
图9描述了本发明优选的大环二烯酮Src家族酪氨酸激酶抑制剂的结构。
图10描述了本发明优选的吡啶并[2，3-d]嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂的结构。
图11描述了活染的大鼠心脏组织显微照相图，其已受损伤而诱导心肌梗塞；该图右侧为对照，显示坏死的显著性水平；该图左侧为用化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂(AGL1872)治疗的组织，显示坏死显著降低的水平。
图12描述了作为抑制剂(AGL1872)浓度函数的心肌梗塞大小的柱状图。
图13描述了作为用抑制剂AGL1872)治疗后时间函数的心肌梗塞大小的柱状图。
图14描述了作为抑制剂(AGL1872)浓度函数的心肌水含量的柱状图。
发明详述
A.定义
如此处所用的，术语“氨基酸残基”指在肽键处对多肽化学消化(水解)而形成的氨基酸。此处所述的氨基酸残基优选是“L”异构型。然而，“D”异构型残基可取代任一个L-氨基酸残基，只要多肽还保留所需的功能特性。NH2指多肽氨基端的游离氨基.COOH指多肽羧基端的游离羧基，与标准多肽命名法(描述于J.Biol.Chem.，243：3552-59(1969)并在37CFR§1.822(b)(2)中采用)一致。
应该说明此处所有氨基酸残基序列在此通过通式表示，其从左到右方向与常规从氨基端(N-末端)到羧基端(C-末端)的方向一致。进一步，应该说明氨基酸残基序列起始或终点的破折号表示连接到一个或多个氨基酸残基的其他序列的肽键。
如此处所用的，术语“多肽”指在连续氨基酸残基的α-氨基和羧基之间由肽键互相连接的氨基酸残基的线性序列。
如此处所用的，术语“肽”指如多肽中那样互相连接的不超过约50个氨基酸残基的线性序列.
如此处所用的，术语“蛋白质”指如多肽中那样互相连接的大于50个氨基酸残基的线性序列。
B.一般性考虑
本发明一般性地涉及：(1)以下发现：VEGF诱导血管通透性(VP)特异地由酪氨酸激酶蛋白如Src和Yes介导，且VP可通过Src家族酪氨酸激酶活性的抑制而调节；和(2)发现：Src家族酪氨酸激酶抑制剂的体内给予降低由于疾病或损伤相关的血管通透性增加而导致的组织损伤。
该发现很重要，因为血管通透性在多种疾病过程中起作用。本发明涉及这样的发现，即通过Src家族酪氨酸激酶活性的抑制，可特异性地调节和改善血管通透性。尤其是，本发明涉及这样的发现，即Src家族酪氨酸激酶抑制剂的体内给予降低与癌症或血管发生无关的、疾病或损伤相关的血管通透性增加所导致的组织损伤。
血管通透性涉及多种疾病过程，其中组织损伤由对血管的创伤导致的VP突然增加而引起。因此，特异性调节VP的能力允许新型和有效的治疗以减少中风的副作用。
将受益于利用Src家族激酶抑制剂的特异抑制性调节的与疾病或损伤诱导的血管渗漏和/或水肿相关的组织的实例包括类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、炎症性疾病、再狭窄、中风、心肌梗塞等等.
已报道用VEGF受体IgG融合蛋白系统性中和VEGF蛋白可减小大脑缺血之后的梗塞大小。这种作用归因于VEGF介导的血管通透性降低。N.van Bruggen等.，J.Clin.Inves.104：1613-1620(1999)。然而，VEGF不是血管通透性增加的关键介质，而现已发现Src正是。此外，Src可由除了VEGF外的刺激物激活.参见例如，Erpel等.，CellBiology，7：176-182(1995)。
本发明尤其涉及这样的发现，即Src家族酪氨酸激酶抑制剂，尤其是Src抑制剂可通过改善由冠状血管闭塞引起的哺乳动物中的冠状组织损伤而用于治疗心肌梗塞。
C.Src家族酪氨酸激酶蛋白
如此处和附加的权利要求中所用的，术语“Src家族酪氨酸激酶蛋白”和其合乎语法的变体尤其涉及与具有N末端可变区的保守域结构、N末端肉豆蔻酰化的v-Src具有氨基酸序列同源性的蛋白质，v-Src随后为SH3结构域、SH2结构域，酪氨酸激酶催化结构域和C末端调控结构域。术语“Src蛋白”和“Src”用于泛指酪氨酸激酶Src蛋白的各种形式，其具有60kD分子量，包括2个PKC磷酸化位点和1个PKA磷酸化位点的N末端可变区，比其他Src-家族亚型的已知成员(如，Yes、Fyn、Lck和Lyn)具有和已知Src蛋白相对更高的总氨基酸序列同一性，并且其通过酪氨酸的磷酸化而激活，即对应于SEQ ID NO：2中416位的酪氨酸。术语“Yes蛋白”和“Yes”用于泛指酪氨酸激酶Yes蛋白的各种形式，其具有62kD分子量，缺乏任何磷酸化位点的N末端可变区，比其他Src-家族亚型的已知成员(如，Src、Fyn、Lck和Lyn)具有和已知Yes蛋白更高的总氨基酸序列同一性，并且其通过酪氨酸的磷酸化而激活，即对应于SEQ ID NO：4中426位的酪氨酸。
如在底下详细所述的，用于测定冠状动脉缺血的优选测定法包括通过冠状动脉结扎诱导大鼠的缺血并且通过MRI、超声波心动描记术等等技术评估心肌梗塞的大小。
D.治疗和预防心肌梗塞的方法
本发明的方法包括将缺血性冠状组织与包含至少一种化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂的药物组合物接触。
用于本发明目的的合适的Src家族酪氨酸激酶抑制剂包括Src的化学抑制剂如Src家族酪氨酸激酶的吡唑并嘧啶类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的大环二烯酮类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的吡啶并[2，3-d]嘧啶类抑制剂和Src家族酪氨酸激酶的4-苯氨基-3-喹啉腈类抑制剂。还可使用抑制剂的混合物。
优选的吡唑并嘧啶类抑制剂包括，4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(有时也称为PP1或AGL1872)、4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶(有时也称为PP2或AGL1879)等等，其详细的制备在Waltenberger，等.Circ.Res.，85：12-22(1999)中描述，其相关公开内容在此通过引用引入。AGL1872和AGL1879的化学结构在图8中阐明。AGL1872(PP1)可通过Pfizer，Inc.许可从Biomol Research Laboratories，Inc.，Plymouth Meeting，Pennsylvania，USA获得。AGL1879(PP2)可通过Pfizer，Inc.许可从Calbiochem获得。据报道AGL1872以5、6和170nM的IC50抑制Lck、Lyn和Src的酶活性(参见Hanke等.，J.Biol.Chem.271(2)：695-701(1996))。
优选的大环二烯酮抑制剂包括，例如，根赤壳素R2146、格尔德霉素、除莠霉素A等等。根赤壳素R2146、格尔德霉素和除莠霉素A的结构在图9中阐明。格尔德霉素可从Life Technologies获得。除莠霉素A可从Sigma获得.根赤壳素，其由不同的公司商业提供(例如Calbiochem、RBI、Sigma)，为抗真菌大环内酯抗生素，其也用作非特异性的蛋白酪氨酸激酶抑制剂并且显示抑制Src激酶的活性。大环二烯酮抑制剂包括12至20个碳的大环内酰胺或内酯环结构，其含有α、β、γ、δ-双-不饱和酮(即二烯酮)部分以及作为大环环一部分的氧化的芳香基部分。
优选的吡啶并[2，3-d]嘧啶类抑制剂包括，例如6-(2，6-二氯苯基)-8-甲基-2-(3-甲基硫烷基苯基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PD173955)等等。其他有用的吡啶并[2，3-d]嘧啶类抑制剂在Wisniewski等.Cancer Res.2002；62：4244-4255中公开，其相关公开的内容在此通过引用引入。由Parke Davis开发的抑制剂，PD173955的结构在图10中阐明.
优选的4-苯氨基-3-喹啉腈类抑制剂包括，例如4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6，7-二甲氧基-3-喹啉腈、4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吗啉-4-基)丙氧基]-3-喹啉腈(SKI-606；可从Wyeth-Ayerst Research获得).SKI-606，据报道在1.2nM时抑制Src(参见Boschelli等.，J Med.Chem.，2001，44；3965-3977)。可用于本发明方法中的4-苯氨基-3-喹啉腈Src抑制剂的实例在美国专利公开No.2001/0051520和No.2002/00260052中公开，其相关公开的内容在此通过引用引入。优选的4-苯氨基-3-喹啉腈Src抑制剂在Boschelli等.J.Med.Chem.，2001，44：3965-3977中描述，其相关公开的内容在此通过引用引入。特别优选的4-苯氨基-3-喹啉腈Src抑制剂具有通式(I)中所示的一般结构。
通式(I)：
其中R1为甲基或-(CH2)n-Z；X1为F、Cl、Br、I和甲基；X2为H、F、Cl、Br、I和甲基；X3为H或甲氧基；n为2、3、4或5；以及Z为4-吗啉基、4-(1-甲基哌嗪基)、4-(1-乙基哌嗪基)、4-(1-丙基哌嗪基)、1-(顺式-3、4、5-三甲基哌嗪基)、1-哌嗪基、1-(4-甲基高哌嗪基)、1-哌啶基、4-(1-羟基哌啶基)、2-(1，2，3-三唑基)、1-(1，2，3-三唑基)、1-咪唑基、-NHCH2CH2-1-吗啉基和-N(CH3)-CH2CH2-N(CH3)2；优选，R1为-(CH2)n-Z，X1和X2都为氯，X3为甲氧基，n为3以及Z为4-吗啉基(即，SKI-606)。
可用于本发明方法和组合物的其他特异性Src激酶抑制剂包括PD162531(Owens等.，Mol.Biol.Cell 11：51-64(2000))，其由Parke Davis开发，但其结构不能从该文献获得.
在一个优选的实施方案中，Src抑制剂为吡唑并嘧啶抑制剂，优选AGL1872和AGL1879，最优选AGL1872。在另一个优选的实施方案中，Src抑制剂为4-苯氨基-3-喹啉腈，优选4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6，7-二甲氧基-3-喹啉腈或4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吗啉-4-基)丙氧基]-3-喹啉腈(称为SKI-606)。
在特别优选的实施方案中，Src家族酪氨酸激酶抑制剂为具有疏水基团的ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，该基团位于接近ATP-模拟杂芳族部分处，小于约6埃大小.ATP-模拟杂芳族部分结合Src家族酪氨酸激酶的ATP-结合袋，而疏水基团大小正适于进入接近ATP-结合袋的疏水袋中。ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂例如在Dalgarno，等.，Curr.Opin.in Drug.Discovery and Devel.，2000；3(5)：549-564中描述，其相关公开的内容在此通过引用引入。
优选的ATP-模拟杂芳族部分的类别包括5-苯基-吡唑并[3，4-d-]嘧啶化合物，其中疏水基团为苯基。优选的苯基包括4-甲基苯基、4-卤苯基(例如，4-氯苯基)等等。特别优选的5-苯基-吡唑并[3，4-d-]嘧啶ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂包括AGL1872(其中疏水基团为4-甲基苯基)以及AGL1879(其中疏水基团为4-氯苯基)。
另一优选的ATP-模拟杂芳族部分的类别包括4-苯氨基-3-喹啉腈化合物，其中疏水基团为苯氨基(anilino group)。优选的苯氨基包括4-卤-代苯氨基如2，4-二氯苯氨基、2，4-二氟苯氨基、4-氯苯氨基等等。特别优选的4-苯氨基-3-喹啉腈ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂包括SKI-606等等。
另外合适的Src家族酪氨酸激酶抑制剂可利用本领域已知的标准测定法鉴定和表征。例如，已进行了针对Src或其他酪氨酸激酶的有效和选择性抑制剂的化合物的筛选并且已得到了用于Src家族酪氨酸激酶有效抑制剂的化学部分(moities)的鉴定。
例如，已鉴定儿茶酚为源自天然产物的多种酪氨酸激酶抑制剂的重要结合元件，且已在组合靶定向筛选所选择的化合物中被发现，该筛选针对c-Src的选择性抑制剂。参见Maly等.，“CombinatorialTarget-guided ligand assembly：Identification of potent subtype-selectivec-Src inhibitors”PNAS(USA)97(6)：2419-2424(2000)。基于组合化学的候选抑制化合物筛选采用对Src抑制重要的已知部分作为起点，是一种分离和鉴定Src家族酪氨酸激酶的其它化学抑制剂的有力和有效的方法。
然而，基于模仿多肽和核酸上存在的多种功能的潜力，更仔细筛选潜在的结合元件可用于组合筛选活性抑制剂。例如，O-甲基肟库特别适于此项任务，如果考虑到该库容易通过O-甲基羟胺与大量商品化醛类中的任一种缩聚制备的话。O-烷基肟的形成与宽范围功能性相容，其在生理pH下稳定。参见Maly等.，上文。
能用体现本发明的方法治疗的哺乳动物理想地是人，尽管可以明白，本发明的原理表明本发明的方法对于非-人哺乳动物也有效。本文中，应理解哺乳动物包括任何哺乳动物物种，其中需要进行血管渗漏或水肿相关的组织损伤的治疗，农业和家养哺乳动物物种，以及人.
优选的治疗方法包括给予患有心肌梗塞的哺乳动物治疗有效量的生理上可耐受的组合物，其包含化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂，尤其是Src的化学(即，非-多肽的)抑制剂。
优选的预防心肌梗塞的方法包括给予处于心肌梗塞风险中的哺乳动物预防量的生理上可耐受的组合物，其包含化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂，尤其是Src的化学(即，非-多肽的)抑制剂。
化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂的剂量范围，如AGL1872或SKI-606，可在约0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重的范围内，或者在药用载体中活性成分的溶解度限内。优选的剂量为约1.5mg/kg体重。体现本发明的药物组合物还可口服给予。用于口服的例证性剂量形式包括胶囊剂、有或无肠溶衣的片剂等等。
在急性损伤或创伤的情况下，最好尽可能快地在事故发生后立即给予治疗。然而，在急性事故中，Src家族酪氨酸激酶抑制剂的有效给药时间可以在损伤或创伤发生的约48小时内。优选在发病约24小时内给药，6小时内更好。最优选Src家族酪氨酸激酶抑制剂在损伤约45分钟内给予患者。初始损伤48小时后给药可能是适当的，以改善由于进一步血管渗漏或水肿导致的其它组织损伤，但这种情况下对初始组织损伤的有利作用可能降低。
预防性给药用于防止外科手术过程相关的血管渗漏或水肿时，或者根据诱发性诊断标准来实施时，这种给药可以在任何实际的冠状血管闭塞之前，或者在这种引起闭塞的事件期间给药，例如，经皮的心血管干预，如冠状血管成形术.为治疗导致冠状血管闭塞的慢性疾病，可以用连续给药方案给予化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂。
一般地，剂量随年龄、状况、性别和患者受损伤的程度而变化，并且可由本领域技术人员确定。如果有任何并发症，剂量也可由个别医生调节。
本发明的药物组合物优选胃肠外注射或长时间缓慢输注给药。尽管待治疗组织通常可通过全身给药而得以在体内接触到，并因此最经常通过静脉给予治疗性组合物来治疗，但在靶向组织有可能含有靶分子的情况下，其它组织和递送方法也被考虑。因而，本发明的组合物可以经以下方式给药：静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮、口服，且可以蠕动方式递送。
例如，静脉内给药通过注射单位剂量方式来进行.“当用于描述本发明治疗组合物时，术语“单位剂量”指适用作受试者的单元剂量的物理离散的单位，每个单位包含预定量的活性物质，与所需的稀释剂，即载体或赋形剂相结合，经计算产生期望的治疗效果。
在一个优选实施方案中，活性成分经单剂量静脉给药。局部给药可通过直接注射或利用解剖学分离的区隔、分离靶器官系统的微循环、再灌注入循环系统，或基于导管的临时性闭塞疾病组织相关靶区域的脉管系统来实现。
药物组合物以与剂型相适应的方式，并以治疗有效量施用。如此处和附加的权利要求中所用的涉及药物组合物的术语“治疗有效量”和“预防量”指临床医师寻求的引起受试者生物学或医疗应答的药物组合物的量(例如，组织损伤的改善或心肌梗塞的预防)。
给药量和给药时间依赖于治疗对象，受试者系统利用活性成分的能力，和希望的疗效程度。待给予的活性成分的精确给药量基于医师的判断，且每个个体需个别对待。然而，全身应用的合适的剂量范围在此处公开并且依赖于给药途径。合适的给药方案也是可变的，但初次给药随后间隔一或多个小时重复剂量的注射或其它方式给药，例如口服为典型。另外足以维持血液浓度在体内治疗规定范围内的连续静脉输注也被考虑。
本发明的方法改善由于与各种形式的冠心病有关的冠状血管闭塞或由于心脏损伤或创伤导致的组织损伤，改善疾病症状，并根据疾病类型可以有助于治愈疾病.组织坏死程度，以及因此由本方法达到的抑制程度可通过各种方法评估.尤其，本发明的方法非常适合心肌梗塞的治疗。
由冠状血管闭塞引起的组织损伤的改善可在治疗组合物给药后的短时间内出现。在急性损伤或创伤的情况下，大多数疗效可在给药24小时显现。然而长期给药的效果不会是很明显的。
时间-限制因素包括组织吸收、细胞摄取、蛋白质易位或核酸翻译(取决于治疗性的)和蛋白质靶向速率。因此，组织损伤调节作用可在短至给予抑制剂后一小时的时间内出现.用适当的条件，也可以使心脏组织另外或处长暴露于Src家族酪氨酸激酶抑制剂。因而，通过调节这些参数可以设计多种期望的治疗时间范围。
E.治疗组合物
如在此所述的，Src家族酪氨酸激酶抑制剂可用于制备用于心肌梗塞治疗的药物.该抑制剂可内含在可用于实践此处所述的治疗和预防方法的药物组合物中。本发明药物组合物包含与此处所述的化学Src家族酪氨酸激酶抑制剂一起的生理学耐受载体，抑制剂作为活性成分溶解或分散在其中。在一个优选的实施方案中，该药物组合物当用于治疗目的给药至哺乳动物患者，如人时不是免疫原性的。
如此处所用的，当术语“药学可接受的”、“生理学耐受的”及其语法变体用于组合物、载体、稀释剂和试剂时可以互换使用，且代表该材料可以给予哺乳动物，但不产生不希望的生理作用如恶心、眩晕、反胃等。
本领域熟知包含溶解或分散于其中的活性成分的药理组合物的制备，并且不必受限于剂型。通常所述组合物制成可注射的液体溶液或悬浮液。也可以制成适于使用前溶于或混悬于液体中的固体形式。也可以将制剂乳化或以脂质体组合物提供。
活性成分可与赋形剂混合，这些赋形剂是可药用的且可以与活性成分相容，其量为适用于此处所述治疗方法的量.适合的赋形剂为，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等及其组合。此外，如果需要，组合物可包含一定量的辅助物质例如能增强活性成分有效性的润湿或乳化剂、pH缓冲剂等等。
本发明的治疗组合物中可包括活性组分的药学上可接受的盐.药学可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基一起形成)，其与无机酸如盐酸或磷酸、或有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等一起形成。与游离羧基一起形成的盐也可源自无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱如异丙基胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
生理学耐受的载体为本领域公知。例证性的液体载体是无菌水溶液，其中除活性成分和水外不含其它物质，或含缓冲剂如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者都含，如磷酸缓冲盐水。更进一步地，水性载体可含一种以上缓冲盐，如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇及其它溶质。
除水以外，液体组合物也可含其它液体相.例证性的所述其它液体相为甘油、植物油如棉籽油及水油乳液。
本发明化学治疗性的组合物包含与Src家族酪氨酸激酶抑制剂一起的生理学耐受载体，抑制剂作为活性成分溶解或分散在其中。
合适的Src家族酪氨酸激酶抑制剂抑制Src家族酪氨酸激酶的生物学酪氨酸激酶活性。更合适的的Src家族酪氨酸激酶具有抑制Src蛋白活性的主要特异性，及次要地抑制最相关的Src家族酪氨酸激酶。
如上文所述，在特别优选的实施方案中，Src家族酪氨酸激酶抑制剂为具有疏水基团的ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，该基团位于接近ATP-模拟杂芳族部分处，小于约6埃大小。
F.制品
本发明涉及一种制品，其为带标签容器以提供治疗有效量的Sr家族酪氨酸激酶抑制剂。该抑制剂可以是单个包装的化学性Src家族酪氨酸激酶抑制剂，或一种以上抑制剂的组合。制品含有包装材料及包装材料中包含的药剂。该制品也可包含两个或更多亚治疗有效量的药物组合物，其一起协同作用导致冠状血管闭塞引起的组织损伤的改善。
如此处所用的，术语包装材料指玻璃、塑料、纸、金属箔等能用固定方式保持药剂的材料。因此，例如，包装材料可以是塑料或玻璃小瓶；层压封套等用于盛装包括药剂的药物组合物的容器。
在优选实施方案中，包装材料包括标签，清楚表明制品的内容物及所含药剂的用途.
制品内的药剂是本发明的任一种组合物，其适于提供Src家族酪氨酸激酶抑制剂，根据公开适应症按此处所述制成可药用的形式。用于本发明目的的合适的Src家族酪氨酸激酶抑制剂包括Src的化学抑制剂，包括Src家族酪氨酸激酶吡唑并嘧啶类抑制剂，如4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶、4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶等等；Src家族酪氨酸激酶的大环二烯酮类抑制剂，如根赤壳素R2146、格尔德霉素、除莠霉素A等等；Src家族酪氨酸激酶的吡啶并[2，3-d]嘧啶类抑制剂，如PD173955等等；Src家族酪氨酸激酶的4-苯氨基-3-喹啉腈类抑制剂，如SKI-606等等；和其混合物。制品包含一定量的药剂，以单位剂量或多剂量方式，其足以用来治疗此处指明的病情。
如上文所述，在特别优选的实施方案中，Src家族酪氨酸激酶抑制剂为具有疏水基团的ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，该基团位于接近ATP-模拟杂芳族部分处，小于约6埃大小。
包装材料含有标签，其表明其中含有的药剂的用途，例如，用于治疗由抑制血管通透提高而辅助的状况，及此处公开的类似状况。标签可进一步包括使用说明和营销需要的相关信息。包装材料可包括储存药剂的容器。
实施例
以下关于本发明的实施例是例证性的，当然不应被认为是对本发明的具体限制。进一步，现在已知或随后开发的本发明的变化形式，在本领域技术人员眼界范围内，应认为是在本发明所附的权利要求的范围内。
实施例1.VEGF介导的VP活性依赖于Src和Yes，而不是Fyn
通过检查VEGF诱导的、与Fyn或Yes等类似于Src的SFK相关的VP活性来研究VP所需的Src特异性，已知SFK在内皮细胞中表达(Bull等.，1994，FEBS Letters，361：41-44；Kiefer等.，1994，Curr.Biol.4：100-109).已经确证这三种SFK等量表达于野生型小鼠的主动脉。像src-/-小鼠，Yes缺陷的动物也缺乏VEGF诱导的VP。然而，令人惊奇的是，缺乏Fyn的小鼠对VEGF保持高VP应答，这与对照动物没有显著区别。src-/-或yes-/-小鼠中VEGF诱导的VP的破坏证明，对于导致VP活性而无血管发生的VEGF介导的信号传递事件，特异性SFK的激酶活性是必需的.
通过将盐水或VEGF(400ng)皮内注射入已静脉注射Evan’s蓝染料的小鼠，确定VEGF在Src+/-(图5A左排)或src-/-(图5A右排)小鼠皮肤中的血管通透特性。15分钟后，照相皮肤斑块(比例尺，1mm)。星号指示注射位点.切除VEGF、bFGF或盐水注射位点周围的区域，并通过用甲醛在58℃洗脱Evan’s蓝染料24小时，测量500nm处光吸收，从而定量VP(图5B左图)。炎症介质(烯丙基异硫氰酸酯)已知可诱导炎症相关的VP，其能力在src-/-或src+/-小鼠中测定(图5B右)。
用Miles测定法(图5C)比较src-/-、fyn-/-或yes-/-小鼠中VEGF诱导VP的能力。每个Miles测定的数据表示为三次重复动物的平均值±SD。与对照动物比较，src-/-和yes-/-的VP缺陷具有统计学显著性(＊p<0.05，成对t检验)，而VEGF处理的fyn-/-小鼠和烯丙基异硫氰酸酯处理的Src+/-小鼠其VP缺陷都没有统计学显著性(＊＊p<0.05)。
实施例2.与未治疗的野生型小鼠相比，Src家族酪氨酸激酶抑制剂治疗的小鼠和Src-/-小鼠表现与血管创伤或损伤相关的减少的组织损伤
在血管损伤或疾病如中风后，Src家族激酶抑制剂降低病理性的血管渗漏和通透性。血管内皮是一种动态细胞类型，对许多线索作应答，以调节肿瘤血管发生期间新血管的出芽等过程，也应答于中风诱导的水肿和组织损伤期间血管壁通透性的调节。
用药物抑制Src途径，降低两种小鼠中风模型中的血管通透性，足以通过降低局部缺血诱导的血管渗漏抑制脑损伤。进一步，在遗传缺陷Src的小鼠中，其血管渗漏/通透性已降低，梗塞体积也降低。结合合成Src抑制剂的数据和中风及其它相关模型中血管渗漏降低的支持性遗传学证据，证明在降低中风后脑损伤中该方法的生理相关性。用该信号传递级联中广泛的可用Src家族激酶抑制剂抑制这些途径，对减轻血管通透性相关组织损伤中的脑损伤具有治疗益处。
使用两种不同的方法诱导局部脑缺血。两种局部脑缺血的动物模型都已良好建立并广泛用于中风研究。除了用于测定新型抗中风药物，两种模型之前都曾用于研究脑缺血的病理生理学。
(a)用2，2，2-三溴乙醇(AVERTINTM)麻醉小鼠并将动物置于热垫上以维持体温。在右耳和右眼间作一切口。收缩颞肌暴露出颅骨，并在大脑中动脉(MCA)上区域钻出一小孔。除去脑膜并用热丝凝固以封闭右侧MCA。使动物苏醒并放回笼内。24小时后，灌注脑，取出并切成1mm切片。切片浸于2％氯化2，3，5-三苯基四唑鎓(TTC)中，梗塞脑区鉴定为未染色(白)组织，由活(红)组织围绕。梗塞体积定义为切片上未染色总面积乘以其厚度。
Src缺陷小鼠(Src-/-)用于研究Src在脑缺血中的作用。Src+/-小鼠作为对照。我们发现损伤24小时后Src-/-小鼠梗塞体积从26±10mm3减小到对照的16±4mm3。当血管闭塞后30分钟往C57B16野生型小鼠腹膜内(i.p.)注射1.5mg/kg AGL1872时，这种作用甚至更显著。梗塞尺寸从未治疗组的31±12mm3减小到AGL1872-治疗组的8±2mm3。
(b)在第二个局灶性脑缺血模型中，在MCA起始处放置一个栓子以堵塞MCA。用改良PE-50导管将单个完整的富含纤维蛋白的24小时大的同源凝块放置于MCA起始处。通过相对于对侧半球的同侧半球脑血流的降低，证实诱导脑缺血。24小时后切除脑，制备系列切片并用苏木精-伊红(HE)染色。通过加总系列HE切片上梗塞面积乘以每个切片间距离得到梗塞体积。
根据经验选择用于此研究的AGL1872剂量(1.5mg/kg i.p.)。已知脑中VEGF在脑缺血约3小时后首先表达，最大值在12到24小时后。本研究中在梗塞出现后30分钟给予AGL1872以完全阻断VEGF诱导的血管通透性增加。根据典型VEGF表达的时间曲线，给予Src抑制剂的潜在治疗窗将长至中风后12小时。在血管通透性持续性增加相关的疾病中，长期给予Src抑制性药物是适当的。
图6为描述损伤后小鼠脑中平均梗塞体积(mm3)的比较性结果图，其中小鼠是杂合Src(Src+/-)、显性失活Src突变体(Src-/-)、野生型小鼠(WT)或用1.5mg/kg AGL1872治疗的野生型小鼠。
图7表示诱导CNS损伤的处理后，分离的灌注鼠脑的样本连续MRI扫描图，其中与对照未治疗动物的扫描图排列(左)相比，AGL1872治疗动物的扫描图排列(右)清楚表明其脑梗塞更少。
实施例3.MI对环梗塞区域中血管完整性和肌细胞生存能力的作用
从VEGF注射后的或缺血后3-24小时的8-12周大的小鼠制备心脏组织，并且切片梗塞、环梗塞和远离区域。组织固定在包含4％低聚甲醛+1.5％戊二醛的0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.3)中2小时，转入5％戊二醛过夜，随后1％四氧化锇1小时。小块经洗涤、干燥、在氧化丙烯中澄清，用Epon/Araldite浸润并且包埋在树脂中。超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并且利用Philips CM-100透射电子显微镜观察。
表1提供了每组利用透射电子显微术检查的250个血管的观察概要。相比正常的心肌组织，受梗塞影响的组织中观察到环梗塞区域中的许多损伤实例。小间隙中存在溢出的血细胞(RBC、血小板和嗜中性粒细胞)，明显是从附近血管逸出的。一些内皮细胞(EC)为血管腔的肿胀和闭塞部分，常常显示电子-透明的并且包含许多膜小凹。内皮中存在大的圆空泡，常常比EC厚度大几倍。肌细胞损伤在MI后随时间增强并且在邻近的细胞之间变化，可作为线粒体破裂、失常的线粒体嵴、胞内水肿和肌丝分解而识别。最受影响的肌细胞常常接近于受损伤的血管或自由血细胞。MI后24小时我们经常观察到嗜中性粒细胞，其参与对损伤的急性应答并且有助于VEGF的产生。
表1.MI或VEGF注射后小鼠心脏组织的超微结构观察
                  EC屏蔽           血小板活化                   心脏
                  功能失调         和粘附            EC损伤     损害
3hr MI            18               36                31        22
3hr MI+AGL1872    2                11                14        2
24hr MI           5                7                 34        45
24hr MI+AGL1872   0                1                 15        9
对照              0                0                 1         0
VEGF，pp60Src+/+  24               18                33        16
VEGF，pp60Src+/+  0                0                 0         0
对于每一组，在透射电子显微镜上检查左心室组织4小时(大约250个微血管)并且观察根据下列计数和归类：
(a)EC屏障功能失调：裂隙、穿孔、溢出的血细胞；
(b)血小板活化/粘附：血小板、脱粒的血小板、血小板簇、血小板粘附至ECM；
(c)EC损伤：电子-透明的EC、肿胀的EC、大的EC空泡、闭塞的血管腔；和
(d)心脏损伤：线粒体肿胀、失常的嵴、微丝分解。
MI后三个小时，邻近的EG之间常常观察到裂隙，其可解释血细胞外渗至周围的间隙。令人惊奇的是，许多裂隙由血小板堵塞。一些血小板接触暴露于EC之间的基层，虽然在其它情况下基层也似乎是破裂的。一些血小板经脱粒并且可能加强了循环的血小板的进一步活化、粘附和聚集。虽然这些血小板塞可能防止了进一步的血管渗漏，其可能无意中通过微血栓形成而有助于小血管中减少的灌注，其可导致另外的缺血-相关的组织疾病。
实施例4.MI和全身的VEGF注射产生相似的血管应答。
为了确定VEGF对复杂病状或MI的作用，VEGF静脉内注射入正常的小鼠并且30分钟后在超微结构水平评估心脏组织。令人惊奇的是，VEGF-诱导的内皮屏障功能失调和血管损伤的程度与MI后环梗塞区域中所见的相当(表1)。观察到相当多的血小板粘附至EC基底膜以及肌细胞损伤。全身性VEGF注射后找到脑损伤的类似证据，提示该作用可能为全身性的。这些结果表明MI之后，VEGF-介导的VP与许多血管作用并行。
为了确定VEGF是否足以介导与MI有关的长期病状，小鼠在整个2小时的过程中用VEGF注射四次。该治疗产生了类似于MI后24小时所观察到的损伤。发现血小板粘附、嗜中性粒细胞和显著的肌细胞损伤，以及许多的电子-透明的EC，其许多为肿胀的而闭塞血管腔。合起来，30分钟暴露于VEGF足以诱导类似于MI3小时后观察到的超微结构，在该期间VEGF表达在环梗塞区域中明显提高。长期的VEGF暴露引起类似于MI后24小时组织中所见的血管重塑。
Src-缺陷小鼠在MI后受保护以及在局部VEGF注射后皮肤和脑中缺乏VP的事实提示Src缺陷小鼠心脏中缺乏VEGF-诱导的VP。与Src抑制剂的结果一致，相比野生型小鼠中的裂隙、血小板活性、受影响的EC和溢出的血细胞，pp60Src-/-小鼠中VEGF的注射后没有见到血管应答的迹象(表1)。任何应答的完全阻断提示VEGF-介导的Src活性起始缺血性疾病期间导致VP-诱导损伤的级联反应.
实施5.Src家族酪氨酸激酶抑制剂治疗的大鼠和Src-/-小鼠显示比未治疗的野生型小鼠降低的与冠状血管创伤或损伤有关的组织损伤
局部缺血模型。如所述的，为了梗塞面积、心肌水含量、磁共振成象、心回波描记术功能性和纤维变性组织实验的分析，我们利用具有左前下行(LAD)冠状动脉永久闭塞的急性MI大鼠模型。类似的MI小鼠模型用于评估Src对永久的LAD闭塞后梗塞面积、水肿和组织超微结构的作用。8-12周大的成熟雄性小鼠用于所有研究，除了2-岁大的C57/ByJ小鼠用作严重的MI的模型以测试Src抑制对存活率的影响。瞬时缺血期间Src抑制对梗塞面积的影响利用具有暂时LAD闭塞的大鼠局部缺血/再灌注模型测试60(SKI-606)45分钟(AGL1872)，测试试剂在60分钟后给予，并且在24小时后测定梗塞大小。
培养成熟的雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis，Indiana，USA)和C57/ByJ、pp60Src-/-以及pp60Src+/-小鼠(JacksonLaboratory，Bar Harbor，Maine，USA)并且在动物主题草案批准下使用。
梗塞面积.24小时后，在处死前静脉内注射10％伊文思蓝(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)。除去心脏并且切成三个远离闭塞LAD缝合处的同等切片并且一个近端切片。远端切片利用NIH成像软件数字化以评估处于风险中的未灌注区域。切片用2％氯化三苯基四氮唑(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)染色以描绘局部缺血的区域.该方法与组织学测量很好地关联。梗塞面积以处于风险中区域的百分比呈现以消除可变性。
水含量和心脏功能。该研究中，体内水含量用4.7-TMR扫描仪(Bruker，Billerica，Massachusetts，USA)在MI后连续对麻醉大鼠进行24小时MRI而评估。成熟的雄性大鼠在永久的LAD闭塞后45分钟给予AGL1872(5.0mg/kg i.p.)、SKI-606(5.0mg/kg i.v.)或载体。测量心肌T2值的MRI实验通过施加ECG和呼吸-触发的多回波自旋回波序列而进行(回波数，8；回波时间，6.6ms；切片厚度，1.0mm；平面分辨率，430μm2；总的切片，6-7)。选择触发延迟以在完全的心脏舒张期间捕获所有的回波而避免回波间的运动假象。正常灌注的心肌T2值为约27±6.3ms。获得每一切片相应的梯度回波象以清楚地描绘自旋回波序列目的评估区域的血/心肌边界.描绘T2>40ms的区域(超过正常灌注心肌均数的两种标准偏差)并且以总的LV心肌体积百分比计算体积。此外，近端心脏切片的体外心肌水含量以最初的湿重和80℃温育24小时后的干重间的百分比差异测定。进行经胸廓的心回波描记术(SONOS 5500，Agilent Technologies，Palo Alto，California，USA)以评估MI之前(基线)和MI后4周的LV功能。为了该分析，大鼠用0.6ml/kg氯胺酮经腹膜麻醉。如之前由Schiller等.J.Am.Soc.Echocardiogr.1989，2；358-367所述的计算局部的壁运动等级。
纤维变性的组织。为了纤维变性组织的组织病理学分析，功能分析后除去心脏并且纤维变性组织的体积和周长通过用弹性三色染色以及进行基于计算机的面积法确定。纤维变性组织的量以LV区域的百分比，以及LV周长的百分比测定以消除组中末端心脏舒张直径和肥大差异的影响。
体内渗透性模型。8-12周大的成熟小鼠在用100μl VEGF或bFGF注射前5分钟(PBS中0.2mg/kg；PeproTech，Rocky Hill，NewJersey，USA)用50μl Src抑制剂AGL1872i.v.注射(PBS/DMSO中1.5mg/kg)。在合适的时间，快速切除心脏并且在3ml RIPA裂解缓冲液中匀化并且测定蛋白质浓度(BCA Protein Assay；Pierce，Rockford，Illinois，USA)。
免疫沉淀和免疫印迹。制备用于用来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，California，USA)或Biosource，国际(Camarillo，California，USA)抗体的免疫沉淀和免疫印迹(如Eliceiri等.Mol Cell1999，4：915-924所述)的组织裂解物；Flk(sc315)、VE-钙粘蛋白(sc6458)、β-连环蛋白(sc7963)、P-酪氨酸(sc7020或sc508)、P-Src-Y418(B44-660)和P-FAK-Y861(B44-626)。呈现来自至少三个独立实验的代表性数据。
数据作为均值±SEM呈现，具有StudentsTM t检验确定的统计显著性(P<0.05)。
图11显示用曙红染料(活体染料)染色的AGL1872治疗的(左)和对照(右)大鼠心室组织的显微照相图象。对照组织(右上图象)显示该组织外周大面积的坏死。相比之下，治疗的组织(左上图象)显示极少的坏死组织。
图12显示作为抑制剂(AGL1872)浓度函数的治疗24小时后梗塞面积的柱状图(以组织毫克数)。在约1.5mg/kg的剂量时达到最佳的抑制水平。约3mg/kg的剂量不引起梗塞面积任何明显的减少。
用Src家族酪氨酸激酶抑制剂(AGL1872)的治疗以手术后24小时内剂量依赖性的方式引起梗塞面积和处于风险中的区域的减少。在缺血诱导约45分钟后投递的约1.5mg/kg抑制剂的剂量处达到梗塞面积约68％的最大抑制(p<0.05)(图13)。当缺血诱导约6小时后给予时抑制剂也是有效的，引起梗塞面积约42％的减少p<0.05)。如通过免疫组织化学分析测定的，Src通过AGL 1872的抑制并不干扰局部缺血组织中VEGF的表达。
如通过MRI检测的，减少的梗塞面积伴随降低的心肌水含量(约5％+/-1.3％；p<0.05)以及水肿组织体积的减少，表明Src抑制的有利作用与VEGF-介导的VP的预防有关(图14)。如通过心回波描记术在手术后大约4周时评估的，减少的分数在对照中为约29％以及在治疗的大鼠中为约34％(p<0.05)。显著地，相对于对照大鼠的约63％，治疗的大鼠的四周存活率出乎意料地高(100％).
为了精确监测体内的水肿，高分辨率的MRI用于评估在永久的左前下行(LAD)闭塞后用或未用Src抑制剂AGL1872或SKI-606治疗的大鼠心脏组织.由于其提高的水含量，水肿区域通常具有比未水肿区域更长的T2松弛.为了测量水肿，描绘具有T2>49ms的区域(大于超过正常灌注心肌均值的两种标准偏差).缺血发病后一小时，T2-加权的信号表明Src抑制不影响最初的细胞毒性水肿。然而，24小时后，计算的T2图揭示相比载体组，AGL1872组梗塞-相关的心肌水肿47％的减少(n＝2 AGL1872组，n＝1载体组)。该结果与利用未缺血心肌湿/干重计算的体外心肌水含量有关。AGL1872提供水肿和梗塞面积剂量-依赖的减少，1.5mg/kg时具有最大的减少(n>5每组，P<0.001).当小鼠和大鼠中永久闭塞后给予SKI-606时，还提供梗塞面积的显著减少。为了评估该应答的动力学，AGL1872在闭塞后的不同时间给予。虽然在闭塞后45分钟给药时获得最大的利益(50％更小的梗塞面积)，6小时后的治疗仍产生25％的保护(n＝5每组，P<0.05)。
心回波描记术揭示相比未治疗的大鼠，Src抑制提供超过4周的缩短分数和心脏舒张左心室(LV)直径的显著保持，表明挽救组织的收缩功能长期保持。Src抑制还提供对心脏收缩的LV直径和局部壁运动的良好作用(表2)。用SKI-606Src抑制剂的治疗还有利地影响缩短分数和局部的壁运动等级(n＝7每组，P<0.01)。为了评估MI后的存活率，我们使用2-岁大的C57黑色小鼠作为以LAD连接后显著死亡率(>40％)为特征的模型。MI后45分钟AGL1872的给予(1.5mg/kg)在第一个4周内相比对照提高了存活率(分别为91.7％对比58.3％，n＝12每组)，证实了Src抑制的长期疗效。
表2.MI之后的机能恢复：心回波描记术
                       对照          AGL1872        ％改善        P-值
LV直径，心舒期(mm)     0.93±0.02   0.82±0.02      11           0.01
LV直径，收缩期(mm)     0.71±0.03   0.59±0.04      16           0.03
缩短分数(％)           23.8±1.7    32.8±3.2       38           0.03
区域壁运动分数         26.9±0.8    24.0±0.5       9            0.01
#每组的大鼠            8            8
用SKI-606Src抑制剂的治疗在24小时后还有利地影响缩短分数和局部的壁运动等级(n＝7每组，P<0.01)。
长期的心肌纤维化随着梗塞出现并且为随着MI组织坏死程度的直接反映。为了评估大鼠中MI后4周Src抑制对纤维化的作用，利用弹性三色染色进行纤维变性组织的组织病理学分析.相比对照，Src抑制促进LV纤维变性组织52％的减少(19.1±2.2％对比40.0±3.0％，n＝4每组，P<0.01).在接受Src抑制剂的样品中观察到心肌纤维和LV构造一致的较好保留，表明Src抑制有助于对MI后心肌的长期保护作用。
为了确定随着瞬时缺血Src抑制的有效性，大鼠经闭塞，随后再灌注，并且随后评估24小时后心室的功能和梗塞面积。相比对照，Src通过AGL1872的抑制保留左心室(LV)缩短分数(fractionalshorteining)以及降低梗塞面积(n＝4每组，P<0.05)。相比其中低含氧量刺激驱动VEGF表达的永久闭塞后50％的减少，缺血-再灌注后保持了梗塞面积18％的减少.此外，缺血-再灌注模型中SKI-606(5mg/kg)提供了梗塞面积43％的减少(n＝5每组，P<0.01)。总起来说，数据证实了瞬时缺血后Src抑制的有益效果。
讨论
小鼠中，VE-钙粘蛋白抗体的全身给予引起心脏和肺中的VP、间质性水肿以及暴露的基底膜的病灶斑，其在超微结构水平上看起来和VEGF给予后观察到的损伤类似。小鼠胚胎中，β-连环蛋白-无效的血管包含与常见的出血有关的平扁的、有孔的内皮细胞.先前的体外研究暗示VEGF调节VE-钙粘蛋白的功能。EC中在流动状态下，VE-钙粘蛋白与Flk复合。为了评估体内的VE-钙粘蛋白-VEGF复合物，从注射或未注射VEGF的小鼠制备心脏裂解物。这些裂解物用抗-Flk免疫沉淀，随后针对VE-钙粘蛋白和β-连环蛋白进行免疫印迹。对照小鼠中，在血管中观察到先前存在的Flk、β-连环蛋白和VE-钙粘蛋白间的复合物。该复合物在VEGF刺激后2-5分钟内迅速瓦解，并且在体内血管中经15分钟重新装配。复合物解离的时标完全平行于Flk、β-连环蛋白和VE-钙粘蛋白的磷酸化以及β-连环蛋白从VE-钙粘蛋白的解离。这些VEGF介导的事件为Src-依赖的，因为Flk-钙粘蛋白-连环蛋白信号复合物保持完好并且在用Src抑制剂预处理的VEGF-刺激的小鼠中并不出现β-连环蛋白和VE-钙粘蛋白的磷酸化。这些事件在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)注射后未观察到，其为不促进血管通透性的类似的血管生成生长因子.
虽然单次VEGF注射产生经15分钟回到基线的可逆的、快速的和瞬时的信号应答，四次VEGF注射(每次三十分钟)产生长时间的信号应答。例如，在长时间的VEGF暴露后持续Flk-连环蛋白的解离和Erk的磷酸化。该模型适用于MI后的生理学情况，其中VEGF的表达因氧不足而提高并且持续数天。
Src在急性MI或全身VEGF给予后的VP中起着生理学和分子的作用。MI后差的结果似乎部分因梗塞区域周围灌注的心脏微血管渗透性过高引起。这些血管受VEGF的不利影响并且在导致血管闭塞或崩塌，并且最终导致周围肌细胞损伤的VP中经历Src-依赖性的提高。此与已证明的MI后尽管在再灌注期间血管打开而差的组织灌注和高死亡率的持续相一致。迟至MI后6小时的Src抑制仍提供对VEGF-诱导的VP的显著保护作用，表明该方法在临床组中的重大意义。MI后Src抑制剂的给予似乎通过防止Flk-钙粘蛋白-连环蛋白复合物的解离而限制VP，其维持内皮的屏障功能。
超微结构数据提示MI后最初的VEGF作用包括内皮连接的打开而暴露内皮基底膜。血小板，其许多去粒并且激活，粘附至这些部位。这是令人感兴趣的，因为血小板包含VEGF，其在局部释放至血小板上时可增强VP应答。事实上，有可能Src抑制的一些有益效果应归于其对血小板活化的作用。从呈现的数据显而易见的是MI后的早期事件起始了导致其随后为心脏组织纤维化和重塑的水肿、组织损伤累积的级联反应。需重点指出的是纤维变性的重塑心脏组织功能不如正常的心脏组织。因此，通过限制早期损伤的影响，可预期因重塑较小的心脏组织所需的长期好处。由于单一冠状血管的阻塞促进导致梗塞区域生长、纤维化以及有时死亡的急性损伤，该过程中早期有效的干预可能很好地提供长期的保护作用和好处。
呈现的数据揭示Src抑制剂可能起这样的作用。Src抑制维持Flk-钙粘蛋白-连环蛋白复合物并且使得内皮连接对VEGF的促进渗透性作用不应。
令人惊讶的是，MI后所见，VEGF的全身注射对心脏血管产生许多超微结构作用。单独的VEGF足以诱导体内的内皮屏障功能失调以及血管损伤.同样地，本发明的方法，包括Src用Src家族酪氨酸激酶抑制剂的阻断不仅在MI后，而且在全身的VEGF注射后抑制这些事件。Src抑制稳定Flk-钙粘蛋白-连环蛋白的复合物而不管VEGF的刺激。对VEGF-诱导的VP的其他贡献者可包括细胞膜穴样内陷或可见(visiculo)-具有液泡的细胞器(VVO)以及穿孔。这些渗透性的方式还可以为Src依赖性的，因为pp60Src-/-小鼠在VEGF注射后未表现出渗透的迹象.或者，内皮裂隙、溢出的血细胞以及暴露的基底膜可能诱导穿孔和VVO。
VEGF响应各种因素(细胞因子、致癌基因、氧不足)而在体内表达并且起作用以诱导渗透性和血管生成，以及内皮细胞增殖、迁移和凋亡的保护作用。肿瘤产生可在血流中检测的大量VEGF。事实上，肿瘤内或附近的血管共有在目前VEGF注射后的研究中所见的许多特征，如有孔的内皮、开放的内皮间连接以及成群融合的细胞膜穴样内陷。各种癌症患者中VEGF的血清水平可为100-3000pg/ml的范围，虽然局部细胞或组织的VEGF水平可为更高的10-100倍。MI后的患者中，已报道血清VEGF水平在100-400pg/ml之间，并且对比稳定心绞痛的患者，在急性MI患者中更高。至于一些原发的和转移性的肿瘤，环梗塞区域中局部的VEGF水平可能超过血清水平。呈现的数据可以解释该发现，即一些癌症患者具有提高的血栓形成疾病，因为循环中提高的VEGF累积将促使VP应答，其吸引血小板并且导致血流的损失。此外，最近所报道的观察可解释与晚期癌症有关的胸膜渗漏和浮肿.因此，阻断Src可能对癌症-相关的水肿疾病具有很深的影响。
AGL1872，虽然抑制Src家族酪氨酸激酶，也破坏大范围的其他激酶，而SKI-606据报道对Src和Yes更具选择性。这两种抑制剂均显示类似的生物学活性模式，然而，SKI-606在明显更低的剂量是是有效的.虽然小鼠中AGL 1872在22-133nM(0.5至3mg/kg)时有效，小鼠中SKI-606在12至18nM(0.5至5mg/kg)时有效。如在敲除小鼠中所见到的，给予野生型动物的药学Src抑制剂对心脏血管的组织损伤、生物化学和超微结构产生相同影响的事实提示该作用主要由EC介导的渗漏引起并且与这些动物中的遗传倾向性无关。Src和Yes，而不是Fyn，是VEGF-介导的VP应答以及脑中局部缺血损伤后梗塞组织的生长所必需的.合起来，该数据提示Src家族酪氨酸激酶抑制剂在MI后给予的有益效果实际上为Src激酶抑制的功能，并且暗示作为Src激酶的pp60Src和pp62Yes很可能参与。
MI或直接的VEGF注射后观察到基本上相同的超微结构变化。VEGF主要对内皮而不是其他细胞类型起作用的事实提示阻断EC内的Src是所观察到的超微结构的原因。此外，观察到的大多数改变直接与EC细胞间接触和血管完整性的改变有关，在用Src抑制剂处理的Src敲除动物或野生型动物中几乎见不到其中的一些。重要地，Src在VP中的作用可归于其磷酸化VE-钙粘蛋白和β-连环蛋白，以及促进这些连接的蛋白质与VEGF受体Flk的复合物解离的能力。
Src抑制剂治疗在体内剂量-依赖性地阻断VEGF-诱导地Src活性，其利用磷酸-Src-Y418抗体和Src底物磷酸-FAK-Y861评估。该生化特点与我们的发现非常相关，即Src抑制根据MI后的水肿和梗塞面积提供保护作用。
本发明的方法最适合用于VP诱导的，尤其是由心肌梗塞引起的组织损伤的特异性改善，因为Src家族酪氨酸激酶活动的靶向抑制集中对VP抑制而对其他可从损伤有效恢复的VEGF-诱导的应答无长期效应。
Src似乎通过影响VEGF-介导的血管渗透性而调节组织损伤并且因此代表了心肌缺血病理生理学中新的治疗靶标。冠状动脉闭塞后心肌损伤的程度可通过Src家族酪氨酸激酶的急性药物抑制而显著地降低。
合成的、相对小的-分子化学抑制剂的利用比相对较大的蛋白质的利用通常更安全并且更易控制。因此，前者优选作为治疗活性剂.
前述的书面说明书被认为足以使本领域技术人员实施本发明。事实上，除了此处所示和描述的以外，根据前面的描述，本发明的多种变化形式对本领域技术人员显而易见，并在所附权利要求的范围内。
<110>The Scripps Research Institute
      Cheresh，David A.
      Paul，Robert
      Eliceiri，Brian
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<130>TSRI-651.7
<150>PCT/US03/37653
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<151>2000-03-29
<150>09/470,881
<151>1999-12-22
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<151>1999-05-28
<150>60/087,220
<151>1998-05-29
<160>4
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>2187
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(134)...(1486)
<400>1
Figure A200580008431Q00351
Figure A200580008431Q00361
Figure A200580008431Q00371
Figure A200580008431Q00381
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<212>PRT
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Figure A200580008431Q00391
Figure A200580008431Q00401
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<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(208)...(1839)
<400>3
Figure A200580008431Q00402
Figure A200580008431Q00411
Figure A200580008431Q00421
Figure A200580008431Q00441
Figure A200580008431Q00451
<210>4
<211>543
<212>PRT
<213>人
<400>4
Figure A200580008431Q00452
Figure A200580008431Q00461
Figure A200580008431Q00471

Claims (40)

1.治疗患有心肌梗塞的哺乳动物的方法，包括给予该哺乳动物治疗有效量的药物组合物，其包括化学性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中该哺乳动物为人。
3.权利要求1的方法，其中该哺乳动物为非-人哺乳动物。
4.权利要求1的方法，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂选自由以下成员构成的组：Src家族酪氨酸激酶的吡唑并嘧啶类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的大环二烯酮类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的吡啶并[2，3-d]嘧啶类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的4-苯氨基-3-喹啉腈类抑制剂和其混合物。
5.权利要求1的方法，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为选自由4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d]嘧啶、4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d]嘧啶和其混合物构成的组的吡唑并嘧啶。
6.权利要求1的方法，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为选自由格尔德霉素、除莠霉素A、根赤壳素R2146和其混合物构成的组的大环二烯酮。
7.权利要求1的方法，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为6-(2，6-二氯苯基)-8-甲基-2-(3-甲基硫烷基苯基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。
8.权利要求1的方法，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为4-苯氨基-3-喹啉腈.
9.权利要求8的方法，其中4-苯氨基-3-喹啉腈具有通式(I)：
Figure A200580008431C00021
其中R1为甲基或-(CH2)n-Z；X1为F、Cl、Br、I和甲基；X2为H、F、Cl、Br、I和甲基；X3为H或甲氧基；n为2、3、4或5；以及Z为4-吗啉基、4-(1-甲基哌嗪基)、4-(1-乙基哌嗪基)、4-(1-丙基哌嗪基)、1-(顺式-3，4，5-三甲基哌嗪基)、1-哌嗪基、1-(4-甲基高哌嗪基)、1-哌啶基、4-(1-羟基哌啶基)、2-(1，2，3-三唑基)、1-(1，2，3-三唑基)、1-咪唑基、-NHCH2CH2-1-吗啉基和-N(CH3)-CH2CH2-N(CH3)2。
10.权利要求9的方法，其中R1为-(CH2)n-Z，其中X1和X2都为氯，X3为甲氧基，n为3并且Z为4-吗啉基.
11.权利要求8的方法，其中4-苯氨基-3-喹啉腈为4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6，7-二甲氧基-3-喹啉腈。
12.权利要求8的方法，其中4-苯氨基-3-喹啉腈为4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吗啉-4-基)丙氧基]-3-喹啉腈(SKI-606)。
13.权利要求1的方法，其中该药物组合物通过腹膜内注射给予该哺乳动物。
14.权利要求1的方法，其中该药物组合物通过静脉内注射给予该哺乳动物。
15.权利要求1的方法，其中该药物组合物在心肌梗塞后约6个小时内给予该哺乳动物。
16.权利要求1的方法，其中该药物组合物在心肌梗塞后约24个小时内给予该哺乳动物。
17.治疗患有心肌梗塞的哺乳动物的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的药物组合物，其包括具有疏水基团的ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，该基团位于接近ATP-模拟杂芳族部分处，小于约6埃大小。
18.权利要求17的方法，其中该ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂为5-(4-甲基苯基)取代的吡唑并[3，4-d]嘧啶化合物。
19.权利要求17的方法，其中该ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂为5-(4-卤苯基)取代的吡唑并[3，4-d]嘧啶化合物。
20.权利要求17的方法，其中该吡唑并嘧啶类Src家族酪氨酸激酶抑制剂为4-(4-卤苯氨基)-3-喹啉腈化合物。
21.包括包装材料以及包含在包装材料内的药物组合物的制品，其中该药物组合物以能减少遭受受阻碍血液供给的冠状组织中坏死的量存在，该包装材料包括表明所述药物组合物可用于心肌梗塞治疗的标签，并且其中该药物组合物包括化学性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂以及药学可接受载体。
22.权利要求21的制品，其中该化学性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂选自由以下成员构成的组：Src家族酪氨酸激酶的吡唑并嘧啶类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的大环二烯酮类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的吡啶并[2，3-d]嘧啶类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的4-苯氨基-3-喹啉腈类抑制剂和其混合物.
23.权利要求21的制品，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂选自4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶、4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶和其混合物。
24.权利要求21的制造品，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为选自格尔德霉素、除莠霉素A、根赤壳素R2146和其混合物的大环二烯酮。
25.权利要求21的制造，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为6-(2，6-二氯苯基)-8-甲基-2-(3-甲基硫烷基苯氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮.
26.权利要求21的制造品，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为具有通式(I)的4-苯氨基-3-喹啉腈：
Figure A200580008431C00041
其中R1为甲基或-(CH2)n-Z；X1为F、Cl、Br、I和甲基；X2为H、F、Cl、Br、I和甲基；X3为H或甲氧基；n为2、3、4或5；以及Z为4-吗啉基、4-(1-甲基哌嗪基)、4-(1-乙基哌嗪基)、4-(1-丙基哌嗪基)、1-(顺式-3，4，5-三甲基哌嗪基)、1-哌嗪基、1-(4-甲基高哌嗪基)、1-哌啶基、4-(1-羟基哌啶基)、2-(1，2，3-三唑基)、1-(1，2，3-三唑基)、1-咪唑基、-NHCH2CH2-1-吗啉基和-N(CH3)-CH2CH2-N(CH3)2。
27.权利要求26的制造品，其中R1为-(CH2)n-Z，其中X1和X2都为氯，X3为甲氧基，n为3并且Z为4-吗啉基.
28.权利要求21的制造品，其中该Src家族酷氨酸激酶抑制剂为选自4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6，7-二甲氧基-3-喹啉腈和4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吗啉-4-基)丙氧基]-3-喹啉腈(SKI-606)的4-苯氨基-3-喹啉腈。
29.权利要求21的制造品，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为具有疏水基团的ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，该基团位于接近ATP-模拟杂芳族部分处，小于约6埃大小。
30.处于心肌梗塞风险中的哺乳动物的预防性治疗方法，该方法包括给予哺乳动物预防量的药物组合物，其包括化学性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂。
31.权利要求30的方法，其中该哺乳动物为非-人哺乳动物。
32.权利要求30的方法，其中该哺乳动物为人。
33.权利要求30的方法，其中该药物组合物口服给予哺乳动物。
34.权利要求30的方法，其中该药物组合物肠胃外给予哺乳动物。
35.权利要求30的方法，其中该化学性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂选自Src家族酪氨酸激酶的吡唑并嘧啶类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的大环二烯酮类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的吡啶并[2，3-d]嘧啶类抑制剂、Src家族酪氨酸激酶的4-苯氨基-3-喹啉腈类抑制剂和其混合物。
36.权利要求30的方法，其中该化学性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂为选自4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶、4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d-]嘧啶和其混合物的吡唑并嘧啶。
37.权利要求30的方法，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为具有通式(I)的4-苯氨基-3-喹啉腈：
Figure A200580008431C00061
其中R1为甲基或-(CH2)n-Z；X1为F、Cl、Br、I和甲基；X2为H、F、Cl、Br、I和甲基；X3为H或甲氧基；n为2、3、4或5；以及Z为4-吗啉基、4-(1-甲基哌嗪基)、4-(1-乙基哌嗪基)、4-(1-丙基哌嗪基)、1-(顺式-3，4，5-三甲基哌嗪基)、1-哌嗪基、1-(4-甲基高哌嗪基)、1-哌啶基、4-(1-羟基哌啶基)、2-(1，2，3-三唑基)、1-(1，2，3-三唑基)、1-咪唑基、-NHCH2CH2-1-吗啉基和-N(CH3)-CH2CH2-N(CH3)2。
38.权利要求37的方法，其中R1为-(CH2)n-Z，其中X1和X2都为氯，X3为甲氧基，n为3并且Z为4-吗啉基.
39.权利要求30的方法，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为选自4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6，7-二甲氧基-3-喹啉腈和4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(吗啉-4-基)丙氧基]-3-喹啉腈(SKI-606)的4-苯氨基-3-喹啉腈。
40.权利要求30的方法，其中该Src家族酪氨酸激酶抑制剂为具有疏水基团的ATP-竞争性的Src家族酪氨酸激酶抑制剂，该基团位于接近ATP-模拟杂芳族部分处，小于约6埃大小。
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