CN101355971A

CN101355971A - 使用1-去氧野尻霉素衍生物治疗庞皮病的方法

Info

Publication number: CN101355971A
Application number: CNA2006800259950A
Authority: CN
Inventors: B·穆格拉格; G·李; X·朱; R·博伊德; K·舍斯
Original assignee: Amicus Therapeutics Inc
Current assignee: Amicus Therapeutics Inc
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2006-05-17
Publication date: 2009-01-28
Also published as: ZA200710945B

Abstract

本发明提供了通过使酶与作为特异性药用伴侣分子的1－去氧野尻霉素衍生物接触而在体外或体内增强突变体或野生型α－葡萄糖苷酶活性的方法。本发明也提供了通过施用作为小分子伴侣化合物的1－去氧野尻霉素衍生物用于治疗庞皮病的方法。该1－去氧野尻霉素衍生物在N或C1的位置上被取代。还提供了使用替代的α－葡萄糖苷酶基因或酶的联合疗法。

Description

使用1-去氧野尻霉素衍生物治疗庞皮病的方法

相关申请的交叉参考

本申请要求基于2005年5月17日提交的临时申请序号为60/682,241和2005年10月21日提交的60/729,329的美国申请在35 U.S.C.§119下的优先权，其全部内容在此引入作为参考。

发明领域

本发明提供了增强α-葡萄糖苷酶活性的方法和治疗庞皮病(Pompedisease)的方法，其包括对个体施用有效量的1-去氧野尻霉素(1-DNJ)和1-DNJ的衍生物，包括例如N-丁基-1-去氧野尻霉素(NB-DNJ)。这些化合物出乎意料地显示出增强引起庞皮病病理学的酸性α-葡萄糖苷酶的活性。

发明背景

庞皮病

庞皮病是多种溶酶体贮积病之一。溶酶体贮积病是由于缺乏水解酶引起细胞鞘糖脂、糖原或粘多糖类的积累所造成的一组常染色体隐性疾病。溶酶体疾病的实例包括但不限于戈谢病(Beutler等人，遗传病的代谢和分子基础，第8版，2001 Scriver等人修订，3635-3668页，McGraw-Hill，纽约)、G_M1-神经节苷脂沉积症(同前，3775-3810页)、岩藻糖代谢病(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 1995.Scriver，C.R.，Beaudet，A.L.，Sly，W.S.和Valle，D.编辑，2529-2561页，McGraw-Hill，纽约)、粘多糖代谢病(同前，3421-3452页)、庞皮病(同前，3389-3420页)、赫尔勒氏病(Weismann等人，Science.1970；169，72-74)、尼曼病A和B(遗传病的代谢和分子基础，第8版，2001.Scriver等人修订，3589-3610页，McGraw-Hill，纽约)和法布里病(Fabry disease)(同前，3733-3774页)。

庞皮病由酸性α-葡萄糖苷酶(Gaa)的缺损引起。Gaa将糖原(用于能量的糖的贮存形式)代谢成葡萄糖。认为糖原的积累导致体内进行性的肌病，其影响各种身体组织，尤其是心脏、骨骼肌、肝脏和神经系统。依照国立神经病学与中风研究所估计，每出生40,000人出现一例庞皮病。

有三种已知类型的庞皮病：婴儿起始发病、幼年起始发病和成人起始发病。婴儿型是最严重的，表现为包括肌紧张的严重缺乏、虚弱、肝脏和心脏扩大以及心脏病的症状。吞咽变得困难并且舌突出及变大。大多数孩子两岁前死于呼吸和心脏并发病。幼年起始的庞皮病首先在童年早期到晚期出现并包括躯干、膈膜中的呼吸肌和下肢的进行性衰弱，以及运动不耐受。大多数幼年起始的庞皮病患者不能活到20或30岁。成年起始的症状包括全身肌肉无力和躯干中的呼吸肌、下肢和膈膜消瘦。一些成人患者缺少主要症状或运动缺陷。

目前疗法

庞皮病的目前疗法包括心脏和呼吸症状的对症治疗。没有潜在遗传缺陷的认可疗法。最近美国F.D.A.批准了替代Gaa的应用(Myozyme；Genzyme，Inc.)。然而，在婴儿型庞皮病患者中使用酶替代疗法来替代缺损Gaa的临床评价是仅能适度改善心脏和骨骼功能(Klinge等人，Neuropediatrics.2005；36(1)：6-11)。研究表明重组Gaa在解决心肌病方面比解决骨骼肌肌病更有效(Raben等人，Mol Ther.2005；11(1)：48-56)，这主要因为重组酶不能穿透结缔组织。用重组Gaa治疗庞皮病的方法具体描述在Canfield的U.S.6,537,785中。

由于所注入的酶迅速降解，采用酶替代疗法(ERT)的主要复杂性之一是获得并维持治疗有效量的酶。因此，ERT需要大量的、高剂量的输注并且昂贵耗时。ERT疗法具有多个其它局限，如难以大规模产生、纯化以及贮存正确折叠的蛋白质、难以获得糖基化的天然蛋白质以及产生抗蛋白质的免疫反应，而且蛋白质不能以充足的量穿过血脑屏障来影响显著涉及中枢神经系统的疾病。此外，重组酶不能穿过器官例如肾周围的屏障，也不能穿透结缔组织，并因此不能有效恢复大量受损组织的功能。

基因治疗也用于治疗蛋白质缺损和其它得益于蛋白质替代的疾病，所述的基因治疗使用含编码功能性蛋白质的核酸序列的重组载体或表达功能性蛋白质的经遗传修饰的人细胞。虽然有希望，但是这种方法也受限于技术困难，如载体不能感染和转导分裂细胞、靶基因的低表达以及基因被递送后对表达的调节(例如许多病毒载体需要细胞分裂来发挥效能)。

第三种相对较近的治疗酶缺损的方法涉及用小分子抑制剂减少缺损酶蛋白质的天然底物，从而改善所观察到的病理。这种“底物剥夺”方法已经具体描述用于治疗一些包括糖脂积累在内的溶酶体贮积病(参见美国专利5,798,366、6,291,657和6,660,749)。建议用作治疗剂的小分子抑制剂包括N-烷基-去氧野尻霉素(N-烷基-DNJ)衍生物，并且被报道为特异性地抑制参与糖脂合成的酶，从而降低需要由缺损酶降解的细胞糖脂的数量。这种方法也有局限，因为糖脂是生物功能所必需的并且过度剥夺可引起副作用。具体而言，大脑用糖脂从一个神经元的神经节苷脂发送信号到另一个神经元。如果糖脂过少或过多，神经元发送信号的功能就会被阻碍。

第四种方法是特异伴侣分子的策略，其大概是使突变的蛋白质免于在内质网(ER)和其它细胞蛋白质的降解/处理系统中降解。以前的专利和公开物描述了使内源酶蛋白质(包括错误折叠的溶酶体酶)免于被ER质量控制机制降解的治疗策略。在具体实施方案中，这种策略利用了特异性结合特定溶酶体疾病有关的缺损溶酶体酶的小分子药用伴侣分子。没有治疗时，该突变蛋白质在ER中不稳定(Ishii等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1996；220：812-815)，在其成熟为终产物中受到阻滞，并且随后在ER中降解。伴侣分子策略包括使用辅助折叠并提高突变蛋白质稳定性的化合物，以防止被ER质量控制系统的过度或异常降解。这些特异伴侣分子被称为活性部位特异性的伴侣分子或者也称为特异性的药用伴侣分子。

该策略的基本理论如下：既然突变体蛋白质在ER中不正确折叠(Ishii等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1996；220：812-815)，那么酶蛋白质被阻滞于正常的转运通路中(ER→高尔基体→内含体→溶酶体)并被迅速降解。因此，辅助突变体蛋白质正确折叠的化合物将用作突变体蛋白质活性部位特异性的伴侣分子，促进其从ER质量控制系统安全逃逸。已知一些酶抑制剂在体外占据催化中心导致酶构象稳定。

对参与溶酶体贮积病的大量酶已经证实特异药用伴侣分子策略，如Fan等人的美国专利号6,274,597、6,583,158、6,589,964、6,599,919和6,916,829，其在此全部引入作为参考。例如一种半乳糖的小分子衍生物即1-去氧乳野尻霉素(DGJ)，其是突变体法布里酶(Fabry enzyme)α-半乳糖苷酶A(α-Gal A；Gla)的有效的竞争性抑制剂，在中性pH下有效地增强人突变体α-Gal A(R301Q)的体外稳定性，并且其增强从带有R301Q或Q279E突变的法布里病患者建立的淋巴母细胞中突变体酶的活性。此外，对过量表达突变体(R301Q)α-Gal A的转基因小鼠口服DGJ基本上提高了主要器官中的酶活性(Fan等人，Nature Med.1999；5：112-115)。在美国专利序号6,916,829中描述了使用另一种亚氨基糖isofagomine(IFG)及其衍生物，以及使用(2004年11月12日提交的美国专利申请序号为10/988,428和10/988,427的未决申请中所描述的)其它对葡萄糖脑苷脂酶特异的化合物对来自戈谢病患者细胞的葡萄糖脑苷脂酶(酸性β-葡萄糖苷酶，Gba)进行的类似解救。上述U.S.6,583,158公开了预期在解救Gaa来治疗庞皮病中发挥作用的多种小分子化合物，包括1-去氧野尻霉素(DNJ)、α-高野尻霉素和澳粟精胺。

本发明基于使用DNJ衍生物例如N-丁基DNJ所获得的意外结果，发现其为突变体Gaa的有效的特异性药用伴侣分子。

发明概述

本发明提供了通过使酶和去氧野尻霉素(DNJ)衍生物，例如1-去氧野尻霉素(1)或N-丁酰基DNJ(5)接触来诱导或稳定细胞中α-葡萄糖苷酶(Gaa)的正确构象的方法。优选在提供最大Gaa活性的DNJ衍生物浓度下，存在DNJ衍生物的Gaa活性与不含DNJ衍生物的Gaa活性的比例至少是1.5。在另一个实施方案中，Gaa活性增加至少5倍。

在一个实施方案中，DNJ衍生物具有如下结构：

其中R₁为H或含有1-12个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、链烯基、烷氧基烷基或氨基烷基，含5-12个环原子的芳基、烷基芳基、杂芳基或杂芳基烷基，其中R₁任选地被一个或多个-OH、-COOH、-Cl、-F、-CF₃、-OCF₃、-O-C(＝O)N-(烷基)₂取代；

R₂为H；含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、链烯基、烷基芳基或烷氧基烷基，或含5-12个碳原子的芳基，其中R₂任选地被-OH、-COOH、-CF₃、-OCF₃或杂环所取代；并且R₁和R₂至少一个不为H；或其可药用盐。在提供细胞中最大Gaa活性的DNJ衍生物浓度下，优选存在DNJ衍生物的Gaa活性比不含DNJ衍生物的Gaa活性增加至少1.5倍，条件是DNJ衍生物不是1-去氧野尻霉素或α-高野尻霉素。

在另一个实施方案中，DNJ衍生物具有如下结构：

其中R₁为H或含1-12个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、烷氧基烷基或氨基烷基，其任选地被-OH、-COOH、-Cl、-F、-CF₃、-OCF₃、-O-C(＝O)N-(烷基)₂所取代；

R₂为H或含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基或烷氧基烷基；且

R₁和R₂至少一个不为H；或其可药用盐。

在提供细胞中最大Gaa活性的DNJ衍生物浓度下，优选存在DNJ衍生物的Gaa活性与不含DNJ衍生物的Gaa活性的比例至少为1.5，条件是DNJ衍生物不是1-去氧野尻霉素或α-高野尻霉素。

细胞中的最大Gaa活性可如实施例中所述在体外或体内测定，并且对任何DNJ衍生物来说，可使用任何例举的测定法显示此活性比例。

在特别实施方案中，R₁为含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基或烷氧基烷基，其任选地被-OH、-COOH、CF₃、OCF₃或-C(O)N-(Me)₂所取代；且R₂为H。在另一个实施方案中，R₁为n-甲基、n-乙基、n-丁基、n-环丙基甲基或n-壬基。在另外一个实施方案中，其中R₁为被-OH、-COOH、CF₃、OCF₃或-C(O)N-(Me)₂取代的n-乙基或n-丁基。

在一个实施方案中，R₁为

在另一个实施方案中，R₁为H并且R₂为任选地被-CF₃或杂环所取代的直链或支链烷基、链烯基、芳基或醚。

在一个实施方案中，R₂为n-壬基基团。

在权利要求的方法的进一步实施方案中，化合物选自N-甲基-DNJ、N-丁基-DNJ、N-环丙基甲基-DNJ、N-(2-(N，N-二甲基氨基甲酰基)乙氧基-DNJ、N-4-叔丁基氧羰基-哌啶基甲基-DNJ、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ、N-(2-(2，2，2-三氟乙氧基)乙基-DNJ、N-2-甲氧基乙基-DNJ、N-2-乙氧基乙基-DNJ、N-4-三氟甲基苄基-DNJ、N-α-氰基-4-三氟甲基苄基-DNJ、N-4-三氟甲氧基苄基-DNJ、N-4-正戊氧基苄基-DNJ和N-4-正丁氧基苄基-DNJ或Cl-壬基DNJ。

在另一个实施方案中，化合物在抑制肠Gaa的IC₅₀值的浓度下或低于IC₅₀值的浓度下增强溶酶体Gaa活性。

在一个实施方案中，Gaa酶为突变体α-葡萄糖苷酶。在具体的实施方案中，突变体α-葡萄糖苷酶选自D645E、D645H、R224W、S619R、R660H、T1064C、C2104T、D645N、L901Q、G219R、E262K、M408V、G309R、D645N、G448S、R672W、R672Q、P545L、C647W、G643R、M318T、E521K、W481R、L552P、G549R、R854X、V816I和T927I以及其组合。

在另一个实施方案中，Gaa为纯化的或重组的功能性Gaa。

在其它实施方案中，接触在体内或体外发生。

本发明也提供了通过施用有效量的去氧野尻霉素衍生物例如N-丁基DNJ来治疗庞皮病的方法。

在一个实施方案中，DNJ衍生物具有如下结构：

其中R₁为H或含1-12个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、链烯基、烷氧基烷基或氨基烷基，含5-12个环原子的芳基、烷基芳基、杂芳基或杂芳基烷基，其中R₁任选地被一个或多个-OH、-COOH、-Cl、-F、-CF₃、-OCF₃、-O-C(＝O)N-(烷基)₂取代；

R₂为H；含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、链烯基或烷氧基烷基或含5-12个碳原子的芳基，其中R₂任选地被-OH、-COOH、-CF₃、-OCF₃或杂环取代；且其中R₁和R₂至少一个不为H；或其可药用盐。

在另一个实施方案中，DNJ衍生物具有如下结构：

其中R₁为H或含1-12个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、烷氧基烷基或氨基烷基，其任选地被-OH、-COOH、-Cl、-F、-CF₃、-OCF₃、-O-C(＝O)N-(烷基)₂取代；

R₂为H或含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基或烷氧基烷基；并且其中R₁和R₂至少一个不为H；或其可药用盐。

在一个实施方案中，R₁为含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基或烷氧基烷基，其任选地被-OH、-COOH、CF₃、OCF₃或-C(O)N-(Me)₂取代；并且R₂为H。在具体的实施方案中，R₁为n-甲基、n-乙基、n-丁基、n-环丙基甲基或n-壬基。在另一个实施方案中，R₁为被-OH、-COOH、CF₃、OCF₃或-C(O)N-(Me)₂取代的n-乙基或n-丁基。还在另一个实施方案中，R₁为

在另一个实施方案中，R₁为H，且R₂为任选地被CF₃或杂环取代的直链或支链烷基、链烯基、芳基或醚。还在另一个实施方案中，R₂为n-壬基。

在特别的实施方案中，化合物选自N-甲基-DNJ、N-丁基-DNJ、N-环丙基甲基-DNJ、N-(2-(N，N-二甲基氨基甲酰基)乙氧基-DNJ、N-4-叔丁基氧羰基-哌啶基甲基-DNJ、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ、N-(2-(2，2，2-三氟乙氧基)乙基-DNJ、N-2-甲氧基乙基-DNJ、N-2-乙氧基乙基-DNJ、N-4-三氟甲基苄基-DNJ、N-α-氰基-4-三氟甲基苄基-DNJ、N-4-三氟甲氧基苄基-DNJ、N-4-正戊氧基苄基-DNJ和N-4-正丁氧基苄基-DNJ或Cl-壬基DNJ。

在另一个实施方案中，1-去氧野尻霉素衍生物的有效量为1-300毫克/天。在备选的实施方案中，有效量为大约5-150毫克/天。在另一个实施方案中，有效量为大约5-75毫克/天。

在一个实施方案中，去氧野尻霉素衍生物以口服剂型施用，如片剂或胶囊。

在另一个实施方案中，去氧野尻霉素衍生物与Gaa替代酶联合施用。

在这个实施方案中，去氧野尻霉素衍生物和Gaa替代酶可以以分开的制剂或作为单一制剂施用。

例如，在一个此类实施方案中，去氧野尻霉素衍生物以口服剂型施用，Gaa替代酶以胃肠外的剂型施用。

在备选的实施方案中，去氧野尻霉素衍生物与基因治疗联合施用。

在本发明的一个实施方案中，上述疗法缓解了庞皮病病理。

在具体的实施方案中，该疾病的特征在于存在至少下列一种：Gaa骨骼组织活性降低；心肌病；心肥大；进行性肌无力；张力减退；巨舌症；吞咽、吮吸和/或进食困难；呼吸功能不全；肝肿大；面肌松弛；无反射；运动不耐受；劳累性呼吸困难；端坐呼吸；睡眠呼吸暂停；早晨头痛；嗜睡；脊柱前凸和/或脊柱侧凸；深度腱反射降低；下腰痛和不能适应发育性的运动改变(developmental motor milestones)。

本发明也提供了通过施用有效量的去氧野尻霉素衍生物来缓解或减少庞皮病症状的方法。

在一个实施方案中，症状为至少下列一种：Gaa骨骼组织活性下降；心肌病；心肥大；进行性肌无力；张力减退；巨舌症；吞咽、吮吸和/或进食困难；呼吸功能不全；肝肿大；面肌松弛；无反射；运动不耐受；劳累性呼吸困难；端坐呼吸；睡眠呼吸暂停；早晨头痛；嗜睡；脊柱前凸和/或脊柱侧凸；深度腱反射降低；下腰痛和不能适应发育性的运动改变。

在备选的实施方案中，去氧野尻霉素衍生物与替代α-葡萄糖苷酶的蛋白质或基因联合施用。

本发明还包括DNJ衍生物、含此类DNJ衍生物的组合物和含此类DNJ衍生物的药物组合物。DNJ衍生物具有上述的结构式，条件是DNJ衍生物不为1-去氧野尻霉素或α-高野尻霉素。

附图简述

该专利或申请文件包含至少一个彩图。带有彩图的专利或专利申请公开物的副本经请求并支付必需的费用后由专利局提供。

图1.图1描述了1-DNJ、NB-DNJ和N-(环丙基)甲基DNJ亚氨基糖衍生物对庞皮病细胞系PM-11中酸性α-葡萄糖苷酶活性的影响。

图2A-D.图2显示了用不同浓度的DNJ和NB-DNJ治疗两周的正常C57BL6小鼠的脑(2A)、肝脏(2B)、腓肠肌(2C)和舌(2D)中Gaa的提高。

图3A-D.图3显示了用不同浓度的DNJ和NB-DNJ治疗两周的正常C57BL6小鼠的肾(3A)、膈膜(3B)、心脏(3C)和比目鱼肌(3D)中Gaa的提高。

图4A-D.图4显示了用不同浓度的DNJ和NB-DNJ治疗四周的正常C57BL6小鼠的脑(4A)、肝脏(4B)、腓肠肌(4C)和舌(4D)中Gaa的提高。

图5A-D.图5显示了用不同浓度的DNJ和NB-DNJ治疗四周的正常C57BL6小鼠的肾(5A)、膈膜(5B)、心脏(5C)和比目鱼肌(5D)中Gaa的提高。

图6A-H.图6描述了野生型(6C)和庞皮PM8(6A和6F)成纤维细胞中的Gaa免疫染色。此图也描述了野生型(6D)和庞皮PM8成纤维细胞(6B和6E)中溶酶体标志物LAMP-1的溶酶体染色。也显示野生型(6H)和PM8(6G)成纤维细胞的Gaa和LAMP-1染色的重叠。

图7A-F.图7显示了PM9庞皮成纤维细胞中的Gaa(7B和D)和LAMP-1(7E)的免疫荧光染色。也描述了Gaa和LAMP-1染色的重叠(7A、7C和7F)。

图8.图8描述了用DNJ或NB-DNJ处理的PM11庞皮细胞系的Gaa、LAMP-1和Gaa/LAMP-1双染色。

发明详述

本发明描述了使用在环氮上或与氮相邻的环碳上具有取代基的小分子亚氨基糖DNJ和DNJ衍生物作为特异性药用伴侣分子来解救突变体Gaa并治疗庞皮病的方法。这些分子可结合不稳定的Gaa突变的蛋白质并诱导它们折叠成稳定的分子构象。因此，Gaa前进或运输到溶酶体并对糖原具有水解活性，从而降低此疾病相关的肌肉组织中的病理积累。

定义

此说明书中所用的术语通常具有在本领域、本发明内和每一术语所用的特定背景中的常规含义。某些术语在下文或本说明书的其它地方加以讨论，为从业者提供描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用它们的额外指导。

“庞皮病”，也称为酸性麦芽糖酶缺损、II型糖原贮积病(GSDII)和II型糖原蓄积病，是特征在于代谢糖原的Gaa基因突变的遗传性溶酶体贮积紊乱。如本文所用，该术语包括婴儿、幼儿和成人起始类型的该疾病。

“酸性α-葡萄糖苷酶(Gaa)”为水解糖原、麦芽糖和异麦芽糖中存在的α-1，4-和α-1，6-连接的D-葡萄糖聚合物的溶酶体酶。备选的名称如下：葡萄糖淀粉酶、1，4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶、淀粉葡萄糖苷酶、γ-淀粉酶、1，4-α-葡萄糖苷外切酶和γ-淀粉酶。人Gaa基因定位于染色体17q25.2-25.3并具有GenBank登录号Y00839所述的核苷酸和氨基酸序列(分别在SEQID NO：1和SEQ ID NO：2中描述)。70个以上的突变与庞皮病相关。造成Gaa酶的错误折叠或错误加工的突变包括T1064C(其355位的Leu变成Pro)和C2104T(其将Arg 702替换成Cys)(Montalvo等人，Mol GenetMetab.2004；81(3)：203-8)。此外，Hermans等人(Human Mutation 2004；23：47-56)描述了影响该酶的成熟和加工的一系列Gaa突变。此类突变包括Leu405Pro和Met519Thr。本发明的方法预期用于引起内质网中α-葡萄糖苷酶不稳定折叠的突变。

如本文所用，术语“药用伴侣分子”或者有时“特异性的药用伴侣分子”(“SPC”)指特异性结合Gaa并具有一种或多种下列作用的分子：(i)促进蛋白质稳定分子构象的形成；(ii)促进蛋白质从ER到另一细胞位置、优选为天然的细胞位置的正确运送，即防止蛋白质的ER相关的降解；(iii)防止构象不稳定的，即错误折叠的蛋白质的聚集；(iv)至少部分地恢复和/或提高蛋白质的野生型功能、稳定性和/或活性；和/或(v)改进包含Gaa的细胞的表型或功能。因此，用于Gaa的药用伴侣分子是结合Gaa、引起Gaa正确折叠、运输、不聚集和活性的分子。如本文所用，此术语不是指内源性的伴侣分子(例如BiP)或对多种蛋白质已证实非特异性的伴侣分子活性的非特异性试剂(例如甘油、DMSO或重水)，即化学伴侣分子(参见Welch等人，细胞应激和伴侣分子1996；1(2)：109-115；Welch等人，Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997；29(5)：491-502；美国专利号5,900,360；美国专利号6,270,954和美国专利号6,541,195)。其包括特异性结合的分子，例如活性位点的特异性伴侣分子(ASSC)(其结合酶的活性位点)、抑制剂或拮抗剂和激动剂。

如本文所用，术语“特异性结合”指药用伴侣分子与Gaa的相互作用，具体而言是指与直接参与接触药用伴侣分子的Gaa的氨基酸残基的相互作用。药用伴侣分子特异性结合靶蛋白例如Gaa，以产生对Gaa而不是对相关或不相关的普通蛋白质的伴侣分子作用。与任何给定药用伴侣分子相互作用的Gaa氨基酸残基可以处在或不在蛋白质的“活性位点”中。如下文所述，在氨基酸残基512-520处的保守六肽WiDMNE是Gaa蛋白质活性所需要的(采用SEQ ID NO：2作为参考序列)。此外，Trp516和Asp518为Gaa催化活性所需要的(Hermans等人，J Biol.Chem.1991；266：13507-12)。可通过常规的结合测定法或通过结构研究例如共结晶、NMR等来评价特异性结合。

在一个非限制性的实施方案中，药用伴侣分子是Gaa的抑制剂或拮抗剂。在另一个非限制性的实施方案中，药用伴侣分子是Gaa的激动剂。还在另一个实施方案中，药用伴侣分子是混合的激动剂/拮抗剂。如本文所用，术语“拮抗剂”指结合蛋白质并部分或完全阻断、抑制、降低或中和Gaa活性的任何分子。术语“激动剂”指结合蛋白质并至少部分地增加、提高、恢复或模拟Gaa活性的任何分子。如下文所讨论的，已知用于Gaa的此类分子。

如本文所用，术语“提高Gaa构象稳定性”或“增加Gaa构象稳定性”指相对于不接触Gaa特异性药用伴侣分子的细胞中(优选相同的细胞类型或相同的细胞，例如更早期的细胞)的Gaa，接触Gaa特异性药用伴侣分子的细胞中增加了采取功能型构象的Gaa数量和比例。在一个实施方案中，细胞不表达构象突变体Gaa。在另一个实施方案中，细胞确实表达了编码多肽(例如构象突变体Gaa)的突变体Gaa的多聚核苷酸。

如本文所用，术语“促进Gaa运输”或“增强Gaa运输”指相对于不接触Gaa特异性药用伴侣分子的细胞中(优选相同的细胞类型或相同的细胞，例如更早期的细胞)Gaa的转运效能，接触Gaa特异性药用伴侣分子的细胞中转运Gaa到溶酶体的效率增加。

如本文所用，术语“提高Gaa活性”或“增强Gaa活性”指相对于不接触Gaa特异性药用伴侣分子的细胞中(优选相同的细胞类型或相同的细胞，例如更早期的细胞)的Gaa活性，接触Gaa特异性药用伴侣分子的细胞中如本文所述的Gaa活性增强。

如本文所用，术语“提高Gaa水平”或“增加Gaa水平”指相对于不接触Gaa特异性药用伴侣分子的细胞中(优选相同的细胞类型或相同的细胞，例如更早期的细胞)的Gaa水平，接触Gaa特异性药用伴侣分子的细胞中Gaa水平增加。

术语“稳定正确构象”指Gaa药用伴侣分子诱导或稳定与野生型Gaa蛋白质构象功能上相同的突变Gaa蛋白质构象的能力。术语“功能上相同”是指当构象略有变化(几乎所有蛋白质在其生理状态下都表现出某些构象上的柔性)时，构象上的柔性并不造成：(1)蛋白质聚集，(2)经内质网相关的降解通路的清除，(3)蛋白质功能损伤，例如Gaa活性损伤，和/或(4)相比野生型蛋白质转运更高或更低程度的细胞内不正确的转运，例如定位到溶酶体的转运。

术语“稳定的分子构象”指被药用伴侣分子诱导的蛋白质即Gaa的构象，其在细胞中至少提供部分野生型功能。例如，突变体Gaa稳定的分子构象是像野生型Gaa一样从ER中逃逸并运送到溶酶体，而不是错误折叠并被降解的构象。此外，突变Gaa的稳定分子构象也可具有全部或部分的Gaa活性，例如水解糖原、麦芽糖和异麦芽糖中的α-1，4和α-1，6连接。然而，稳定的分子构象不是必须具有野生型蛋白质的所有功能属性。

术语“野生型活性”指细胞中Gaa的正常生理功能。例如，Gaa的活性包括折叠和从ER运输到溶酶体，并且伴有水解糖原、麦芽糖和异麦芽糖中存在的α-1，4-和α-1，6-连接的D-葡萄糖聚合物的能力

术语“野生型Gaa”指编码Gaa的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)和前面提到的核苷酸序列所编码的多肽(SEQ ID NO：2)的序列(人Gaa，GenBank登录号为Y00839)以及编码Gaa多肽(具有与前面所述的多肽序列相同的功能特性和亲和性)的任何其它核苷酸序列，例如编码正常个体中的等位变体的核苷酸序列，其具有在ER中获得功能性构象并在细胞中得到正确定位并显示野生型活性(例如水解糖原)的能力。

如本文所用，术语“突变体α-葡萄糖苷酶”或“突变体Gaa”指含有造成α-葡萄糖苷酶氨基酸序列改变的遗传突变的基因所翻译的α-葡萄糖苷酶多肽。在一个实施方案中，突变造成α-葡萄糖苷酶蛋白质与野生型α-葡萄糖苷酶相比在ER中正常存在的条件下不能获得天然构象，或与野生型α-葡萄糖苷酶相比表现出稳定性或活性降低。这种类型的突变在本文称为“构象突变”并且将具有此种突变的蛋白质称为“构象突变体”。不能获得所述构象造成α-葡萄糖苷酶蛋白质被降解或聚集，而不是通过蛋白质转运系统的正常通路被转运到其在细胞中的天然位置或转入胞外环境中。在一些实施方案中，突变可出现在编码α-葡萄糖苷酶基因的非编码部分，造成蛋白质的低效表达，例如影响转录效率、剪切效率、mRNA稳定性等的突变。通过提高α-葡萄糖苷酶的野生型及构象突变体的表达水平，施用α-葡萄糖苷酶的药用伴侣分子可缓解此类低效的蛋白质表达所造成的不足。或者，对于可在ER中积累的剪切突变体或无义突变体来说，伴侣分子在不恢复溶酶体水解酶活性的情况下结合并协助突变体进入ER的能力足以改善庞皮病患者的某些细胞病理，从而改善症状。

Gaa构象突变的实例包括下列：D645E(Lin等人，Zhonghua Min Gu0Xiao Er Ke Yi Xue Hui Za Zhi 1996；37(2)：115-21)；D645H(Lin等人，Biochem Biophys Res Commun.1995 17；208(2)：886-93)；R224W、S619R和R660H(New等人，Pediatr Neurol.2003；29(4)：284-7)；T1064C和C2104T(Montalvo等人，Mol Genet Metab.2004；81(3)：203-8)；D645N和L901Q(Kroos等人，Neuromuscul Disord.2004；14(6)：371-4)；G219R、E262K、M408V(Fernandez-Hojas等人，Neuromuscul Disord.2002；12(2)：159-66)；G309R(Kroos等人，Clin Genet.1998；53(5)：379-82)；D645N、G448S、R672W和R672Q(Huie等人Biochem Biophys Res Commun.1998；27；244(3)：921-7)；P545L(Hermans等人，Hum Mol Genet.1994；3(12)：2213-8)；C647W(Huie等人，Huie等人，Hum Mol Genet.1994；3(7)：1081-7)；G643R(Hermans等人，Hum Mutat.1993；2(4)：268-73)；M318T(Zhong 等人，Am J Hum Genet.1991；49(3)：635-45)；E521K(Hermans等人，Biochem Biophys Res Commun.

1991；179(2)：919-26)；W481R(Raben等人，Hum Mutat.1999；13(l)：83-4)；以及L552P和G549R(未发表的数据)。

剪切突变体包括IVS1AS、T＞G、-13和IVS8+1G＞A。

其它Gaa突变体已经鉴定并为本领域所知。构象突变体可由本领域普通技术人员容易地鉴定。

可以通过本领域熟知的常规测定法来确定损害折叠并因此损害Gaa运输的突变，例如通过采用或不用糖苷酶处理的脉冲追踪代谢标记来确定蛋白质是否进入高尔基体，或通过荧光免疫染色确定细胞中的Gaa定位。野生型Gaa以110 kD的前体分泌，然后其经95 kD的中间体转变为76 kD的成熟Gaa。

此种功能可通过确定该蛋白质功能的任何已知方法进行检测。例如，使用荧光底物例如4-α-甲基伞形酮-D-吡喃葡萄糖苷的测定法可用于测定Gaa活性。此类测定法为本领域熟知(参见例如Hermans等人，上文)。

某些检测可评价对应于或不对应于其实际的体内活性的蛋白质性质，但尽管如此，其仍是蛋白质功能的合适的替代品，并且此类检测中的野生型行为证明了支持本发明蛋白质折叠的解救或改进技术的证据。根据本发明的这类活性之一是功能型Gaa从内质网正确地转运到溶酶体。

在体外，例如在制剂中，伴侣分子化合物也可确保野生型或突变的蛋白质保持其天然的或正确的形式。这种作用可通过一种或多种下列方式实际显示：(i)延长蛋白质贮存期限(即，用于ERT)；(ii)每单位/蛋白质质量的活性提高；或(iii)体内效率提高。可在试验中观察到表达过程中来自ER的产量增加、对于温度上升或存在促溶剂以及通过类似方法所引起的解折叠的抵抗力增强。

术语“内源性表达”和“内源性表达的”指未患有或未怀疑患有与Gaa缺损、过量表达或其它缺陷(例如庞皮病，如Gaa的核酸或多肽序列中抑制其表达、活性或稳定性的突变)相关的疾病或病症的个体细胞中Gaa的正常生理表达。此术语也指Gaa在正常表达Gaa的细胞类型中表达并且不包括其在健康个体中不表达Gaa的细胞或细胞类型(例如肿瘤)中的表达。

如本文所用，术语“转运效能”是指将突变体蛋白质从内质网转运出来到达其在细胞、细胞膜或胞外环境中的天然位置的能力。

酶的“竞争性抑制剂”可指在与酶底物的化学结构和分子几何学在结构上类似而结合到与底物大致相同的位置的化合物。因此，抑制剂竞争与底物分子相同的活性部位从而增加Km。如果有足够的底物分子替代抑制剂，那么竞争性抑制通常是可逆的，即竞争性抑制剂可以可逆地结合。因此，酶抑制的数量取决于抑制剂浓度、底物浓度与抑制剂和底物对活性部位的相对亲和力。

当抑制剂在远处结合活性部位，产生底物不能再结合活性部位的酶构象变化时，发生非典型的竞争性抑制。在非典型的竞争性抑制中，底物在活性部位的结合阻止了抑制剂在另一位点结合，反之亦然。这包括变构抑制。

酶的“线性混合型抑制剂”是一类允许底物结合但是降低其亲和力的竞争性抑制剂，所以Km升高并且Vmax降低。

“非竞争性抑制剂”指与酶形成强键并且不可以通过加入过量底物来替换的化合物，即非竞争性抑制剂可以是不可逆的。非竞争性抑制剂可结合于酶或蛋白质的活性部位、其附近或远离活性部位，并且与酶相连接，不影响Km但是降低Vmax。非竞争性抑制指抑制剂仅结合酶-底物(ES)复合物的情况。当抑制剂结合时酶变为失活。这与可在无底物条件下结合酶的非典型竞争性抑制剂不同。

术语“Vmax”指酶催化反应的最大起始速率，即在饱和的底物水平时的最大起始速率。术语“Km””是获得1/2 Vmax所需的底物浓度。

酶的“增强剂”是结合Gaa并提高酶促反应速度的化合物。

术语“治疗有效量”和“有效量”指足以促进ER中的蛋白质加工(允许功能性构象)、(在拮抗剂的情况中)不抑制已经在正确的细胞位置表达的蛋白质或(在激动剂的情况中)不诱导配体介导的来自合适的细胞位置的蛋白质受体内化作用、并且提高靶蛋白的活性从而引起个体中的治疗反应的量。治疗反应可以是使用者(例如临床医师)认为对治疗的有效反应的任何反应，包括本文所述和本领域已知的症状和任何替代性的临床标志。因此，治疗反应通常为缓解或抑制疾病或病症的一种或多种症状，例如庞皮病，例如本领域已知的疾病或病症的症状，例如Gaa活性降低和进行性肌无力。

应当说明，经纯化的治疗蛋白质的体外生产、运输或贮存过程中是抑制性的伴侣分子化合物的浓度仍可以因为体内所施用伴侣分子的稀释(和随后由于平衡改变而使结合转变)、生物利用度和代谢而形成本发明的“有效量”。

“反应者”是诊断为庞皮病并根据本文的权利要求的方法治疗的个体，其表现一种或多种临床症状的改善、缓解或预防，或者作为疾病病理学指示物的一种或多种替代性临床标志的改善或逆转。庞皮病的症状或标志包括但不限于Gaa组织活性下降、心肌病、心肥大、进行性肌无力(尤其是躯干或下肢)、严重张力减退、巨舌症(并且在一些病例中舌突出)、吞咽、吮吸和/或进食困难、呼吸功能不全、肝肿大(中度)、面肌松弛、无反射、运动不耐受、劳累性呼吸困难、端坐呼吸、睡眠呼吸暂停、早晨头痛、嗜睡、脊柱前凸和/或脊柱侧凸、深度腱反射降低、下腰痛和不能适应发育性的运动改变。

术语“酶替代疗法”或“ERT”指向该酶缺损的个体中引入非天然的经纯化的酶。所施用的蛋白质可从天然来源获得或通过重组表达(如下文更详细地描述)获得。该术语也指在其它需要或受益于施用经纯化的酶的个体中，例如在患有酶缺乏的个体中引入经纯化的酶。所引入的酶可以是纯化的体外生产的重组酶或者从分离的组织或体液例如胎盘或动物奶中纯化的蛋白质，或者从植物中分离的蛋白质。

短语“可药用的”指对人施用时生理上可耐受并且通常不产生不利反应的分子实体和组合物。如本文所用的术语“可药用的”优选地指经联邦管理局或州政府认可或者美国药典的或其它公众认可的药典中所列出的用于动物，更特别地用于人。术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物。此类药用载体可以是无菌液体，如水和油。优选水或水性盐溶液和右旋葡萄糖水溶液以及甘油溶液用作载体，尤其是用于可注射的溶液。E.W.Martin在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，第18版和其它版中描述了适合的载体。

如本文所用的术语“经纯化的”指在减少或消除无关物质(即污染物)的条件下所分离的物质，如Gaa的核酸或多肽。例如，经纯化的蛋白质优选基本上不含与其在细胞中相关的其它蛋白质或核酸。如本文所用，术语“基本上不含”可操作地用于物质分析检测中。基本上不含污染物的纯化物质优选至少是50％纯度，更优选至少90％纯度，还更优选至少99％纯度。可以通过常规方法例如色谱、凝胶电泳、免疫测定法、成分分析、生物学检验和本领域已知的其它方法来评价纯度。

术语“大约”和“大概”通常是指在给出测量性质或精确度下所测量数量的误差的可接受程度。一般地，举例性的误差程度为给定数值或数值范围的百分之二十(％)之内，优选地在10％之内，更优选地在5％之内。或者，尤其是在生物学体系中，术语“大约”和“大概”可以指量级范围内的数值，优选在给定数值的5倍之内并且更优选在给定数值的2倍之内。除非另外提到，本文给出的许多数量是大概的，意思是当没有清楚地陈述时，该术语“大约”或“大概”是可以推断的。

化学定义

术语“烷基”指仅包括碳原子和氢原子、不含不饱和并通过单键与分子的其它部分连接的直链或支链C₁-C₂₀烃基基团，例如甲基、乙基、n-丙基、1-甲基乙基(异丙基)、n-丁基、n-戊基、1，1-二甲基乙基(叔丁基)。本文所用的烷基优选地为C₁-C₈烷基。

术语“链烯基”指至少含有一个碳-碳双键并可为直链或支链的C₂-C₂₀脂肪族烃基，例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、异丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基。

术语“环烷基”表示饱和的、非芳香族的单环或多环烃环系统，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基。多环的环烷基的实例包括桥连了环基团的全氢化萘基、金刚烷基和降冰片基基团或螺二环基团，例如螺(4，4)壬-2-基。

术语“环烷基烷基”指与上面定义的烷基直接相连的如上所定义的环烷基，其导致形成稳定的结构，如环丙基甲基、环丁基乙基、环戊基乙基。

术语“烷基醚”指具有至少一个氧掺入烷基链中的如上定义的烷基或环烷基基团，例如甲基乙基醚、乙醚、四氢呋喃。

术语“烷基胺”指具有至少一个氮原子的如上定义的烷基或环烷基基团，例如n-丁基胺和四氢噁嗪。

术语“芳基”指具有大约6-14个碳原子的芳香族基团，如苯基、萘基、四氢化萘基、茚满基、联苯基。

术语“芳基烷基”指直接与如上定义的烷基相连的如上定义的芳基基团，例如-CH₂C₆H₅和-C₂H₄C₆H₅。

术语“杂环的”指包括碳原子和选自氮、磷、氧和硫的1-5个杂原子的稳定的3-15元环基团。就本发明的目的而言，杂环基团可以是单环、双环或三环的环系统，其可包括稠合的、桥连的或螺环系统，并且杂环基团中的氮、磷、碳、氧或硫原子可任选地氧化成各种氧化态。此外，氮原子可任选地被季铵化；环基团可部分地或完全饱和(即杂芳族的或杂芳基芳族的)。此类杂环基团的实例包括但不限于吖丁啶基、吖啶基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二噁烷基、苯并呋喃基、咔唑基、噌啉基、二氧杂环戊烷基、中氮茚基、二氮杂萘基、全氢化氮杂

基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、2，3-二氮杂萘基、吡啶基、蝶啶基、嘌呤基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、咪唑基、四氢异喹啉基、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮杂

基、氮杂

基、吡咯基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、噁唑啉基、噁唑烷基、三唑基、茚满基、异噁唑基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑基、噻唑啉基、噻唑烷基、异噻唑基、奎宁环基、异噻唑烷基、吲哚基、异吲哚基、吲哚啉基、异吲哚啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、喹啉基、异喹啉基、十氢异喹啉基、苯并咪唑基、噻二唑基、苯并吡喃基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、呋喃基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、噻吩基、苯并噻吩基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、二氧杂phospholanyl、噁二唑基、色满基、异色满基。

杂环基团可在导致形成稳定结构的任何杂原子或碳原子处与主要结构连接。

术语“杂芳基”指环为芳香族的杂环。

术语“杂芳基烷基”指与烷基直接相连的如上定义的杂芳基环基团。杂芳基烷基基团可在导致形成稳定结构的烷基的任何碳原子处与主要结构连接。

术语“杂环基”指如上定义的杂环基团。杂环基的环基团可在导致形成稳定结构的任何杂原子或碳原子处与主要结构连接。

术语“杂环基烷基”指与烷基直接相连的如上定义的杂环基团。杂环基烷基基团可在导致形成稳定结构的烷基碳原子处与主要结构连接。

在‘被取代的烷基’、‘被取代的链烯基’、‘被取代的炔基’、‘被取代的环烷基’、‘被取代的环烷基烷基’、‘被取代的环烯基’、‘被取代的芳基烷基’、‘被取代的芳基’、‘被取代的杂环’、‘被取代的杂芳基环’、‘被取代的杂芳基烷基’或‘被取代的杂环基烷基环’中的取代基可与选自下列的一个或多个基团相同或不同：氢、羟基、卤素、羧基、氰基、氨基、硝基、氧代(＝O)、硫代(＝S)，或任选地选自烷基、烷氧基、链烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环、-COOR^x、-C(O)R^x、-C(S)R^x、-C(O)NR^xR^y、-C(O)ONR^xR^y、-NR^xCONR^yR^z、-N(R^x)SOR^y、-N(R^x)SO₂R^y、-(＝N-N(R^x)R^y)、-NR^xC(O)OR^y、-NR^xR^y、-NR^xC(O)R^y-、-NR^xC(S)R^y、-NR^xC(S)NR^yR^z、-SONR^xR^y-、-SO₂NR^xR^y-、-OR^x、-OR^xC(O)NR^yR^z、-OR^xC(O)OR^y-、-OC(O)R^x、-OC(O)NR^xR^y、-R^xNR^yR^z、-R^xR^yR^z、-R^xCF₃、-R^xNR^yC(O)R^z、-R^xOR^y、-R^xC(O)OR^y、-R^xC(O)NR^yR^z、-R^xC(O)R^x、-R^xOC(O)R^y、-SR^x、-SOR^x、-SO₂R^x、-ONO₂的取代基团，其中每一个上面基团中的R^x、R^y和R^z可为氢原子、取代的或未取代的烷基、卤代烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环、取代的或未取代的杂环基烷基、取代的或未取代的杂芳基或者取代的或未取代的杂芳基烷基。

术语“卤素”指氟、氯、溴和碘基团。

DNJ和DNJ衍生物

已发现1-去氧野尻霉素的衍生物(化合物1，DNJ；1，5-亚氨基-1，5-双脱氧-D-山梨醇-CAS编号19130-96-2)对治疗庞皮病有效。DNJ具有分子式C₆H₁₃NO₄和163.2的分子量。DNJ在Schroder等人的美国专利4,806,650中被描述并具有如下结构：

用于本发明的DNJ衍生物可通过下式描述：

其中R₁为H或含1-12个碳原子的直链或支链烷基、链烯基、烷基醚或烷基胺，含5-12个环原子的烷基芳基、杂芳基或杂芳基烷基，其中R₁任选地被一个或多个-OH、-COOH、-Cl、-F、-CF₃、-OCF₃、-C(＝O)N-(烷基)₂(即-O-C(＝O)N-(Me)₂)取代并且R₂为H；含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、链烯基或烷基醚或者含5-12个碳原子的芳基，其中R₂任选地被-OH、-COOH、-CF₃、-OCF₃或杂环取代。

R₁和R₂至少一个不是H。

优选的DNJ衍生物包括具有1-12个碳原子的N-烷基衍生物。更优选这些衍生物为具有1-9个碳原子直链、支链或环状化合物。化合物的实例包括但不限于N-甲基-DNJ(2)、N-乙基-DNJ(3)、N-丙基-DNJ(4)、N-丁基-DNJ(5)、N-戊基-DNJ(6)、N-己基-DNJ(7)、N-庚基-DNJ(8)、N-辛基-DNJ(9)、N-壬基-DNJ(10)、N-甲基环丙基-DNJ(11)和N-甲基环戊基-DNJ(12)。

一种优选的烷基DNJ衍生物N-甲基-1-去氧野尻霉素(化合物2，N-甲基DNJ；N-甲基-1-去氧野尻霉素、1，5-(甲基亚氨基)-1，5-双脱氧-D-山梨醇)为合成的葡萄糖类似物，其可购自Toronto Research Chemicals，目录号M297000，CAS 69567-1-08。N-甲基DNJ通过抑制肝脏中糖原去分支酶的α-1，6-葡萄糖苷酶来降低糖原分解速率，并且通过阻断α-1，4-葡萄糖苷酶具有抗高血糖作用(Arai M等人，Circulation.1998年4月7日；97(13)：1290-7)。

另一种优选的烷基DNJ衍生物为N-壬基-去氧野尻霉素(化合物10，N-壬基DNJ；1，5-(壬基亚氨基)-1，5-双脱氧-D-山梨醇)，其是用于治疗戈谢病(特征为糖脂蓄积的溶酶体贮积病)的合成的葡萄糖类似物(Sawkar AR等人，Proc Natl Acad Sci USA.2002；26；99(24)：15428-33)。

具有例如-OH、-COOH或OCF₃的取代基的烷基DNJ衍生物也是优选的化合物。被取代的烷基DNJ衍生物包括但不限于：

优选的DNJ衍生物是N-2-羟基乙基-去氧野尻霉素(化合物13，N-乙氧基DNJ；1，5-(2-羟基乙基亚氨基)-1，5-双脱氧-D-山梨醇；米格列醇)，其是用于治疗2型糖尿病的合成的葡萄糖类似物。Drent等人，Diabetes NutrMetab.2002；15(3)：152-9；de Luis Roman DA，Rev Clin Esp.2004年1月；204(1)：32-4。

另一种优选的DNJ衍生物为5-N-羧基戊基去氧野尻霉素(化合物14，5-N-羧基戊基DNJ；1，5-(5-N-羧基戊基亚氨基)-1，5-双脱氧-D-山梨醇)。该合成的葡萄糖类似物可通过Bernotas RC等人，Biochem J.1990年9月1日；270(2)：539-40所述的途径进行合成。

其它的DNJ衍生物为烷基醚衍生物，例如下列化合物：

其它优选的化合物包括下式所表示的衍生物，例如N-苄基取代的DNJ衍生物：

其它优选的化合物包括下式所表示的衍生物，例如N-CH₂-Ar取代的DNJ衍生物，其中Ar为芳香族杂环：

除氮取代的DNJ衍生物之外，具有连接在邻近环氮的C-1上的取代基的DNJ衍生物也是本发明优选的化合物。这些化合物包括但不限于：

其中直链烃的类似物包括但不限于1-12个碳原子并且R包括但不限于：支链烷基、环烷基或任选地被-OH、-COOH、-CF₃、-OCF₃、NHR、NHCOR’或芳香族或杂环所取代的烷基，其中R’为烷基基团。

其中HET为杂环基团，例如四氢呋喃、吡啶、呋喃、吡咯、咪唑、三唑、四唑、噁唑、噻唑和附加的苯并类似物等等，Ar为苯基或被取代的苯基。苯基的取代基可包括作为官能团的G(例如CH₃、Cl、F或CH₂-O-CF₃)并且n为0-5的整数。

DNJ衍生物合成

在R₁处具有取代基的本发明化合物可按EP 49858、WO2005/063706、U.S.4,639,436；WO 2004/037373；WO 95/22975；U.S.5,399,567；US5,310,745；Bols等人，Journal of Carbohydrate Chemistry 2004 23(4)，223-238，Sawker等人，Chemistry and Biology，2005；12，1235-1244，Overkleef，Journal of Biological Chemistry.2005；273(41)，26522-26527；Tan等人，Journal of Bilogical Chemistry.1991，266(22)，14504-14510；Romaniouk等人，Glycobiology.2004；14(4)，301-310；Lesur，Bioorganicand Medicinal Chemistry Letters 1997；7(3)，355-360；Yoshikuni，Agric.Biol.Chem 1998；52(1)，121中所述以及通过已知的这些方法的改进从DNJ合成。

在R₂处具有取代基的本发明的化合物可以按照Anzeveno，等人，J.Org.Chem.1989；54(11)，2539；WO 00/56713；US 4,880,917；EP 0315017和US5,051,407中所述和Boshagen等人，Angewante Chemie，Int.Ed.Engl.1981；20(9)，806-807所述以及按照已报道的其它方法和WO00/56713、US5,051,407和EP 0315017中所证实的这些方法的已知改进而从DNJ合成。Davis在Angewante Chemie，Int.Ed.Engl.2003；42，3788-3792中报道了这些分子的另一种合成方法。

本发明的化合物还可以从四-OBn葡萄糖酸内酯合成。该合成法可根据Perrine等人，J.Org.Chem.1967；32，664；Matos，Lopes & Lopes，Synthesis 1999；4，571；Rao & Perlin；Can.J.Chem.1981；59，333；Hoos，Naughton and Vassella，HeIv.Chim.Acta，1993；76，1802和Baxter & Reitz，J Org.Chem.1994；59，3175中所述的合成法进行调整。

半合成方法也可用于形成本发明的DNJ衍生物。这种酶促途径使用氧化葡萄糖菌(Gluconobacter Oxydans)，并且可根据US 4,266,025、US5,695,969、US 4,246,345、US 4,806,650、0430307和Kinast & Schedel；Angew.Chem，Int.Ed.Engl.，20，805(1981)中所述方法进行调整。

用于本发明的一些化合物可以购买，例如下列化合物购自TorontoResearch Chemicals：1-去氧野尻霉素(目录号D245000)、盐酸1-去氧野尻霉素(目录号D245005)、N-丁基-1-去氧野尻霉素(目录号B691000、CAS[21011-90-0])、米格列醇(目录号M344200，CAS[72432-03-2])、N-甲基-1-去氧野尻霉素(目录号297000，CAS[69567-1-8]、N-5-羧基戊基-1-去氧野尻霉素(目录号C181200)、N-(5-金刚烷-1-基-甲氧基)-戊基-1-去氧野尻霉素(目录号A21000)；α-高野尻霉素购自TCI America(目录号H1144、CAS119557-99-2)。

可用于本发明的非限制性的化合物列表包括：DNJ、N-丁基DNJ、N-(环丙基)甲基DNJ、N-2-(四氢呋喃)甲基DNJ、N-2-氧代乙基DNJ三氟乙基醚/N-(2-(2，2，2-三氟乙氧基)乙基DNJ、N-乙氧基DNJ二甲基氨基甲酸酯/N-(2-(N，N-二甲基氨基甲酰基)乙氧基)DNJ、N-甲基-DNJ、2-甲氧基乙基DNJ、2-乙氧基乙基DNJ、4-三氟甲基-苄基DNJ、α-氰基-4-三氟甲基-苄基DNJ、4-戊氧基苄基DNJ、4-丁氧基苄基DNJ、4-t-BOC-哌啶基甲基DNJ、α-C6-n-壬基-DNJ和α-高-DNJ。在下文的表1和表2(实施例2)中给出了这些化合物在所观察到的半数最大增加下相对于1mM的DNJ所增加的百分比。

考虑用于本发明的其它化合物包括N-壬基DNJ(10)、米格列醇(13)、N-5-羧基-戊基-1-DNJ(14)、甲基-2-苯并呋喃基DNJ(30)、甲基-2-苯并硫代苯基DNJ(31)、α-C6-n-丁基-DNJ(33)、甲基-2-呋喃基DNJ(29)、N-n-己基DNJ(7)、N-乙基DNJ(3)、N-n-丙基DNJ(4)、N-n-戊基DNJ(6)和β-C6-苄基-DNJ(36)、2-(N-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)-N-甲基氨基)乙基)-DNJ(28)和N-2-(N-甲基-N-亚甲基二氧苯基氨基)乙基-DNJ(37)。

活性和定位分析

Gaa活性、稳定性和/或运送的增强可通过测量细胞Gaa多肽增加、通过测定运输到溶酶体的增多，例如或者通过测定Gaa活性或稳定性提高来测定。评价前述每一种参数的非限制性的方法实例叙述如下。

测定Gaa的细胞内表达

本领域已知测定胞内LPL蛋白质水平的方法。此类方法包括蛋白质印记、蛋白质印记后免疫沉淀(IP Western)或使用带标记的LPL蛋白质的免疫荧光。

测定Gaa的运送

通过生物合成通路来评价蛋白质运送可(例如)采用与糖苷酶连接的³⁵S标记的受体蛋白的脉冲追踪实验，或者优选地通过直接或间接的免疫荧光测定运送过程中的蛋白质修饰来实现。这些方法和其它方法在例如当前的细胞生物学方法(Current protocls in Cell Biology)2001；John Wiley &Sons中进行了描述。检测Gaa溶酶体运输的免疫荧光实验的实例在以下实施例3和实施例4中详述。

测定蛋白质运送受损的其它方法为本领域所熟知。例如，对高尔基体中N-和/或O-糖基化的蛋白质来说，使用放射性标记蛋白质的脉冲追踪代谢标记，结合糖苷酶的处理以及免疫沉淀，可用于检测蛋白质是否在高尔基体中进行了完全的糖基化，或者它们是否被阻留在内质网中而不是运输到高尔基体中进一步糖基化。

可视化检测细胞定位的灵敏方法还包括使用荧光蛋白或荧光抗体的荧光显微镜术。例如，目的LPL蛋白质可用例如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白标记，然后进行多色和延时的显微镜观察和电子显微镜观察来研究在固定细胞和活细胞中这些蛋白质的命运。荧光显像在蛋白质运输中的用途综述，参见Watson等人，Adv DrugDeliv Rev 2005；57(1)：43-61。共聚焦显微镜术用于蛋白质的细胞内共定位的用途描述，参见Miyashita等人，Methods Mol Biol.2004；261：399-410。

荧光相关光谱学(FCS)是能够进行单分子和实时解析的灵敏和非侵染性的检测方法(Vukojevic等人，Cell Mol Life Sci 2005；62(5)：535-50)。SPFI(单粒子荧光成像)使用高度灵敏性的荧光来观察用小荧光颗粒选择性标记的单个分子(Cherry等人，Biochem Soc Trans 2003；31(Pt 5)：1028-31)。活细胞成像的综述见Hariguchi，Cell Struct Funct 2002；27(5)：333-4。

荧光共振能量转移(FRET)显微术也用于研究蛋白质在生理条件下的结构和定位(Periasamy，J Biomed Opt 2001；6(3)：287-91)。

测定Gaa活性的增加

在体外可如下文实施例2所述测定Gaa活性。按Okumiya等人，MolGenet Metab.2006 May；88(1)：22-8中所述采用混合的淋巴细胞用药用伴侣分子处理后可在体内测定Gaa活性。此方法使用糖原和4-甲基伞形酮-α-d-吡喃葡萄糖苷(4MU-αGlc)作为底物测量溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶活性，并且掺入阿卡波糖以消除无关的α-葡萄糖苷酶(主要是麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶)的干扰。

制剂、剂量和施用

在一个实施方案中，伴侣分子化合物作为单一治疗剂施用，优选以口服剂型施用(在下文进一步描述)，但是也考虑其它剂量形式。在此实施方案中，考虑到用药方案应该在庞皮病患者的血浆中提供连续的稳态水平的化合物。这可以通过每日分次剂量施用，或者通过控释制剂，或者通过不常用的持续释放剂型来获得。伴侣分子化合物的制剂、剂量和给药途径在下文详述。

制剂

在本发明的一个实施方案中，伴侣分子化合物作为单一治疗剂施用，并可为适于任何给药途径的形式，这包括口服的片剂、胶囊或液体的形式，以无菌注射的水溶液形式或者为防止酶在给药前体外聚集而在重构过程中或之后立即加入到替代Gaa的制剂(见下文)中的冻干粉形式。

当伴侣分子化合物配制用于口服给药时，可通过常规方法采用可药用的赋形剂，例如粘合剂(例如，预先明胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或硅石)、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或者润湿剂(例如月桂基苯磺酸钠)来制备片剂或胶囊。片剂可用本领域已知的方法进行包衣。用于口服的液体制品可采用例如溶液、糖浆剂或混悬剂形式，或者它们可以作为在使用前用水或另一种合适载体构建的干粉产品。此类液体制品可通过常规方法用可药用的添加剂制备，如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的食用油脂)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如，甲基或丙基-p-羟基苯甲酸酯或山梨酸)。如果合适，制剂也可含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。口服制剂可适当地配制为提供活性伴侣分子化合物的控释的制剂。

是考虑用于本发明方法的伴侣分子化合物，可以硬明胶胶囊购买，每个胶囊含有100mg的DNJ、淀粉羟乙酸钠、聚乙烯吡咯烷酮(K30)和硬脂酸镁。胶囊壳包括明胶和二氧化钛。

适于胃肠外/注射用途的伴侣分子化合物的药物制剂包括用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌水溶液(在水溶性的情况下)或者分散液和无菌粉末。在所有的情况中，该形式必须无菌并且必需被流体化到具有易于注射性能的程度。其在加工和贮存条件下必须稳定并且必须被保护不受微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇等)、它们合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下保持所需粒子大小和通过使用表面活性剂来保持正常的流动性。预防微生物作用可通过多种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、苯甲醇、山梨酸等等。在许多情况中，可合理地包括等渗剂如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的制剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌注射溶液通过将所需量的纯化的Gaa和伴侣分子化合物掺入适宜溶剂(在需要时含有上文所列举的各种其它成分)中，然后过滤或最后灭菌来制备。一般地，分散液通过在将多种无菌有效成分掺入含有基本分散介质和上文所列举的所需要的其它成分的介质中来制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，该技术从先前的无菌过滤溶液中得到有效成分与任何添加的所需成分的粉末。

制剂可含有赋形剂。可包括在制剂中的可药用赋形剂是缓冲液，例如柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、氨基酸、尿素、醇类、抗坏血酸、磷脂；蛋白质，如血清白蛋白、胶原蛋白和明胶；盐类，如EDTA或EGTA和氯化钠；脂质体；聚乙烯吡咯烷酮；糖类，如葡聚糖、甘露醇、山梨醇和甘油；丙二醇和聚乙二醇(例如PEG-4000、PEG-6000)；甘油；甘氨酸或其它氨基酸；以及脂类。与制剂一起使用的缓冲体系包括柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液是优选的实施方案。

制剂也可含有非离子型去垢剂。优选的非离子型去垢剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、Triton X-100、Triton X-114、Nonidet P-40、辛基α-葡糖苷、辛基β-葡糖苷、Brij 35、Pluronic和吐温20。

给药

伴侣分子化合物的给药途径可以是口服(优选地)或胃肠外，包括静脉内、皮下、动脉内、腹膜内、眼部、肌内、含服、直肠、阴道、眼眶内、脑内、皮内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、肺内、鼻内、透过粘膜、经皮或经吸入给药。

伴侣分子化合物的上述胃肠外制剂的给药可通过定期推注注射所述制剂，或者可以从体外的贮器(例如静脉注射袋)或体内的贮器(例如生物可侵蚀的植入物)通过静脉内或腹膜内给药。参见例如编号为4,407,957和5,798,113的美国专利，二者在此引入作为参考。

肺内递送方法和装置在例如美国专利号5,654,007、5,780,014和5,814,607中描述，它们均在此引入作为参考。其它有用的胃肠外递送系统包括乙烯醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统、泵递送、包囊的细胞递送、脂质体递送、针递送注射、无针注射、喷雾器、气雾剂、电穿孔和透皮贴剂。无针注射装置描述在美国专利号5,879,327、5,520,639、5,846,233和5,704,911中，其说明书在此引入作为参考。上述任何制剂可用这些方法施用。

皮下注射具有允许自我给药的优势，但与静脉内给药相比也延长了血浆半衰期。此外，为患者方便而设计的多种装置例如可回收利用的注射笔和无针注射装置，可以采用此处所讨论的本发明制剂来使用。

剂量

有效解救内源性的突变体Gaa(和/或稳定所施用的纯化Gaa，参见下文的联合疗法部分)的伴侣分子化合物数量可在不同病例的基础上由本领域技术人员确定。可采用本领域已知的通常方法获得替代蛋白质和伴侣分子化合物的药代动力学和药效学，例如半衰期(t_1/2)、最大血浆浓度(C_max)、到达最大血浆浓度的时间(t_max)、通过曲线下面积(AUC)所测定的接触量和组织分布，以及伴侣分子/替代Gaa结合的数据(亲和常数、结合与解离常数、效价)，以确定稳定替代蛋白质而不抑制其活性所需的相容的数量并因此参考治疗作用。

细胞培养试验或动物研究的数据可用于确定用于人类和非人类动物的剂量范围。用于本发明治疗方法的化合物剂量优选地处于包括ED₅₀浓度(对50％的检测群体有效)但具有低毒性或没有毒性的血浓度范围之内。用于任何治疗的具体剂量可以取决于如所用的具体剂型、采用的给药途径、个体(例如患者)的状况等因素而在这个范围内变化。

治疗有效的剂量可从细胞培养试验开始估计并在动物模型中确定以获得包括IC₅₀的血浓度范围。化合物的IC₅₀浓度为获得症状的半数最大抑制的浓度(例如从细胞培养试验所测定)。然后，可以采用此类信息更准确地确定用于特定个体(例如人类患者)的适宜剂量。

血浆中化合物的测定可在个体(例如患者)中通过如高效液相色谱(HPLC)或气相色谱的技术常规地测量。

组合物的毒性和疗效可通过标准的药学方法测定，例如在细胞培养试验中或使用实验动物来测定LD₅₀和ED₅₀。参数LD₅₀和ED₅₀为本领域所熟知，并且分别指对50％的群体致死和对50％的群体治疗有效的化合物剂量。毒性和治疗作用的剂量比称为治疗指数并可表述为LD₅₀/ED₅₀的比例。优选显示较高治疗指数的伴侣分子化合物。

作为剂量方案的一个实例，每天以分次剂量(每天二到三次)口服施用100到300mg的N-丁基-DNJ()用于治疗戈谢病。施用100毫克之后，戈谢病患者中的t_max范围为2-2.5小时。

的半衰期为大约6-7小时，其预计在每日三次给药之后的1.5-2天会达到稳态。没有

在人类中代谢的证据。

为获得Gaa的最佳伴侣分子活性，希望抑制糖脂合成所需的DNJ衍生物的较低剂量仍然有效。例如，5-150毫克/天的剂量，尤其是5-75毫克/天的剂量对具有更高Gaa促进活性的DNJ衍生物而言是优选的。一些DNJ衍生物由于Gaa促进活性较低而需要更高的剂量。

根据稳定和诱导体内、在组织或循环中的重组蛋白质的正确构象而不影响其活性、组织或循环中的伴侣分子化合物的生物利用度以及组织或循环中伴侣分子化合物的代谢所需的数量来确定伴侣分子化合物的最佳浓度。例如，如果伴侣分子化合物为酶抑制剂，可通过计算酶的特异性伴侣分子的IC₅₀确定抑制剂浓度。考虑到化合物的生物利用度和代谢，那么可以根据对酶活性的影响(例如，增强酶活性或延长所施用的酶的活性所需要的抑制剂数量)来评价IC₅₀值附近或稍微高于IC₅₀值的浓度。作为一个实例，化合物去氧半乳糖野尻霉素(DGJ)对α-Gal A酶的IC₅₀值为0.04μM，表明DGJ是有效的抑制剂。因此，预期α-Gal A的胞内浓度大大低于所施用的α-Gal A的浓度。

使用酶替代疗法的联合疗法

酶替代疗法通过输注方式外源性地引入野生型或有生物学功能的酶来增加蛋白质数量。已经为许多遗传疾病开发了这种疗法，这包括上文提到的溶酶体贮积病戈谢病和法布里氏病。野生型酶从重组细胞表达系统(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，见Desnick等人的美国专利号5,580,757；Selden等人的6,395,884和6,458,574；Calhoun等人的6,461,609；Miyamura等人的6,210,666；Selden等人的6,083,725；Rasmussen等人的6,451,600；Rasmussen等人的5,236,838和Ginns等人的5,879,680)、人胎盘或动物奶(见Reuser等人的美国专利号6,188,045)中纯化。预期输注之后外源酶由组织通过非特异或受体特异的机制吸收。一般地，摄入效率不高并且外源蛋白质的循环时间短(Ioannu等人，Am.J.Hum.Genet.2001；68：14-25)。此外，外源蛋白质是不稳定的并且会迅速进行细胞内降解以及可能在随后治疗中发生消极免疫反应。

多个研究组描述了庞皮病的酶替代疗法但成效甚微：Klinge等人，Neuropediatrics，2005；36(1)：6-11；Klinge等人，Neuromuscul Disord.2005；15(1)：24-31；Van den Hout等人，J Inherit Metab Dis.2001；24(2)：266-74和Amalfitano等人，Genet Med.2001；3(2)：132-8。Van denHout等人，Lancet.2000；56：397-8中描述了用于人类施用的重组Gaa。

本发明通过提高在具有突变Gaa(其特征在于错误折叠)的庞皮病患者体内经纯化的蛋白质的稳定性、通过用于蛋白质的ASSC的共同给药以及在体外提高制剂或组合物中纯化蛋白质的稳定性来提高蛋白质替代疗法的效率。

在一个实施方案中，替代Gaa和伴侣分子化合物被配制在分开的组合物中。在此实施方案中，DNJ衍生物伴侣分子化合物和替代Gaa可按照相同的途径给药(例如静脉内输注)或者优选地通过不同途径给药，例如静脉输注替代酶，和口服如上所述的伴侣分子化合物。

替代Gaa按照上述施用伴侣分子的任何途径施用，但是优选地肠胃外给药。更优选地，以注射用无菌溶液静脉内施用。

在另一个实施方案中，伴侣分子化合物和替代Gaa被配制成单一组合物。此种组合物在贮存过程中和体内给药过程中提高所述酶的稳定性，从而降低费用并提高疗效。制剂优选地适用于胃肠外给药，包括静脉内、皮下和腹膜内，然而也考虑适于如口服、鼻内或经皮的其它给药途径的制剂。

施用时限当替代Gaa和伴侣分子化合物在分开的制剂中时，施用可以是同时的，或者伴侣分子化合物可在替代Gaa之前或之后施用。例如，如果替代酶静脉内施用，伴侣分子化合物可在0-6小时之后的时间内施用。备选地，伴侣分子化合物可在蛋白质施用之前0-6小时施用。

在优选的实施方案中，如果伴侣分子化合物和替代蛋白质分开施用，并且如果伴侣分子化合物循环半衰期短(例如小分子)，伴侣分子化合物可每日连续口服以在循环中保持恒定水平。此恒定水平是已经确定对患者无毒和在施用期间与靶替代蛋白质相互作用方面最佳的水平，以赋予非抑制性的疗效。

在另一个实施方案中，伴侣分子化合物在替代Gaa代谢所需时间内(其可通过施用伴侣分子化合物延长)施用。

替代Gaa的剂量根据目前的方法，替代酶的浓度通常为大约0.05-5.0毫克/千克体重，一般地每周施用一次或两周施用一次。酶可以0.1微克/千克到大约10毫克/千克的剂量施用，优选地以大约0.1-2毫克/千克的剂量施用。例如，为治疗法布莱氏病，施用的重组α-Gal A的剂量一般为0.1-0.3毫克/千克并且每周施用一次或两周施用一次。蛋白质的常规重复剂量是患者生活过程中必需的。皮下注射维持长期的全身接触药物。皮下剂量优选地为每千克体重0.1-5.0毫克α-Gal A，两周一次或一周一次。α-GalA还可静脉内施用，例如以静脉内推注、静脉内慢推注射施用或通过连续的静脉注射施用。连续的静脉输注(例如2-6小时之内)使血液中的特异水平得以保持。

由于庞皮病的靶组织-骨骼肌被内皮组织和间质组织屏蔽而无法接触所施用重组酶的事实，预期重组或纯化Gaa的有效剂量高于法布里氏病或戈谢病患者所需的剂量。目前重组Gaa(Myozyme，Genzyme，Inc.)被批准用于治疗庞皮病。其它临床实验正在杜克大学联合Synpac，Inc.以及在欧洲进行。在一项欧洲的研究中，婴儿庞皮病患者从每周15和20毫克/千克的来自兔奶的重组人Gaa剂量开始，同时在研究过程中，基于监测肌肉组织活性水平将剂量提高到每周一次静脉内输注40毫克/千克。此研究在36周中继续144次输注(Van den Hout等人，Pediatrics.2004；113：448-57)。在一个临床实验的多个晚期起始的庞皮病患者中，来自兔奶重组人Gaa以1-2毫克/毫升的含5％葡萄糖和0.1％人血清白蛋白的盐溶液静脉施用，最初每周剂量10毫克/千克，然后提高到20毫克/千克(Winkel等人，AnnNeurol.2004；55：495-502)。

使用基因治疗的联合疗法

虽然基因治疗在美国还没有批准用于治疗，但是对于大量遗传疾病的基因疗法(来自活体的和直接转移的)正在进行研究。本发明也考虑在联合基因疗法中使用伴侣分子化合物替代庞皮病的缺损Gaa。此种联合将通过在体内增强治疗性Gaa的表达水平来提高基因疗法的效率，除了促进突变酶的折叠和加工外，小分子伴侣分子还表现出促进野生型或构象稳定的对应物的折叠和加工(参见例如Fan等人的美国6,274,597，实施例3)。

最近，Sun等人(Mol Ther.2005；11(1)：57-65)用编码人Gaa(hGaa；为AAV8(AAV2/8)假型)的腺伴随病毒(AAV)载体静脉内注射到庞皮病免疫缺陷小鼠模型(Gaa敲除/SCID小鼠)中。施用AAV2/8载体后hGaa在血浆中保持24周的高水平。雄性小鼠中心脏和骨骼肌中的Gaa缺损被AAV2/8载体所矫正，而雌性小鼠中仅在心脏中被矫正。

本领域可用的或将要可用的任何基因疗法可用于递送治疗基因。下文描述了示例性的方法。基因疗法的综述见Goldspiel等人，ClinicalPharmacy 1993，12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 1991，3：87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.1993，32：573-596；Mulligan，Science.1993，260：926-932以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.1993，62：191-217；May，TIBTECH 1993，11：155-215中描述。本领域公知的重组DNA技术方法描述于Ausubel等人编辑，1993，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；Dracopoli等人编辑，1994，Current Protocols in Human Genetics，第12章和第13章，John Wiley & Sons，NY；Colosimo等人，Biotechniques 2000；29(2)：314-8，320-2，324。

用于本发明方法的Gaa基因可使用本领域技术范围内的普通分子生物学、微生物学和重组DNA技术分离和纯化。例如，编码靶蛋白的核酸可如文献所述用重组DNA表达来分离。见例如Sambrook，Fritsch &Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，冷泉港，纽约；DNA Cloning：A PracticalApproach，第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑，1985)；OligonucleotideSynthesis(MJ.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Ehiggins编辑(1985))；Transcription And Translation(B.D.Hames&SJ.Higgins编辑，(1984))；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，(1986))；Lmmobilized Cells And Enzymes(IRL Press，(1986))；B.E Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)。编码蛋白质的核酸可为全长的或截短的，只要基因编码生物活性蛋白质即可。

然后可将鉴定和分离的Gaa基因插入适当的克隆载体中。适于基因疗法的载体包括病毒如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、牛痘、疱疹病毒、杆状病毒和逆转录病毒、细小病毒属、慢病毒属、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和已经描述用于在多种真核和原核宿主中进行表达的本领域其它重组载体，并可用于基因疗法以及简单的蛋白质表达。

在优选的实施方案中，载体为病毒载体。病毒载体，尤其是腺病毒载体可与阳离子亲水脂分子如阳离子脂、多聚L-赖氨酸(PLL)和二乙基氨基乙基葡聚糖(DELAE-葡聚糖)复合，其提高靶细胞的病毒转染效率(见例如，于1997年11月20日提交的PCT/US97/21496，在此引入作为参考)。用于本发明的优选病毒载体包括衍生自牛痘、疱疹病毒、AAV和逆转录病毒的载体。特别是疱疹病毒，尤其是单纯疱疹病毒(HSV)(例如美国专利号5,672,344中公开的那些，其内容在此引入作为参考)特别是用于递送转基因到神经细胞中。AAV载体(例如在美国专利号5,139,941、5,252,479和5,753,500以及PCT专利WO 97/09441中公开的那些，其内容在此引入作为参考)也是有用的，因为这些载体整合到宿主染色体中，无需重复施用载体。基因疗法中的病毒载体的综述见McConnell等人，Hum Gene Ther.2004；15(11)：1022-33；Mccarty等人，Annu Rev Genet.2004；38：819-45；Mah等人，Clin.Pharmacokinet.2002；41(12)：901-11；Scott等人，Neuromuscul.Disord.2002；12 Suppl 1：S23-9。此外，见美国专利号5,670,488。Beck等人，Curr Gene Ther.2004；4(4)：457-67具体描述了心血管细胞的基因疗法。

待递送基因的编码序列可有效地与表达控制序列连接，例如指导基因表达的启动子。如本文所用，短语“有效地连接”指多核苷酸/基因与核苷酸的调节和效应序列(如启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其它信号序列)的功能关系。例如，核酸与启动子的有效连接指多核苷酸和启动子的这种物理和功能关系，使DNA转录由特异性识别和结合启动子的RNA聚合酶从启动子起始，并且其中启动子指导RNA从多核苷酸转录。

在一个具体的实施方案中使用这样的载体，其中编码序列和任何其它所需序列的侧翼为促进基因组中所需位点发生同源重组的区域，从而从已整合到基因组中的核酸分子表达构建体(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1989，86：8932-8935；Zijlstra等人，Nature.1989，342：435-438；Zarling等人的美国专利号6,244,113和Pati等人的美国专利号6,200,812)。

基因递送

将载体递送到患者中可以是直接的，在这种情况下患者直接暴露于载体和递送复合物；或者是间接的，在这种情况下，首先在体外用载体转化细胞，然后植入到患者中。这两种方法分别称为体内基因疗法和先体外后体内的基因疗法。

直接转移在具体的实施方案中，直接在体内施用载体，其中载体进入生物体的细胞并介导基因的表达。这可通过本领域已知和上文讨论的大量方法中的任何一种来实现，例如通过将其构建成适当表达载体的一部分并施用它以使其进入细胞，例如通过用缺损的和减毒的逆转录病毒载体和其它病毒载体转染(见美国专利号4,980,286)或通过直接注射裸DNA或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)；或者用脂类或细胞表面受体或转染试剂包被、包封入生物聚合体(例如聚-β-1-64-N-乙酰葡糖胺多糖；见美国专利号5,635,493)；包封入脂质体、微粒或微胶囊；通过将其与已知进入细胞核的肽或其它配体连接施用；或者通过将其与进行受体介导的内吞作用的配体连接施用(见例如，Wu and Wu，J Biol.Chem.1987，62：4429-4432)等等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中配体包含破坏内体以避免核酸被溶酶体降解的融合病毒肽或者可用于转移治疗DNA到细胞中的阳离子12-肽，例如衍生自控制触角的基因(Mi等人，Mol.Therapy.2000，2：339-47)。还在另一个实施方案中，通过将核酸靶向于特异性受体可以将核酸在体内靶向进行细胞特异性的摄入和表达(见例如，PCT公布号WO 92/06180、WO 92/22635、WO 92/20316和WO 93/14188)。最近，称为磁转染的技术已经用于递送载体到哺乳动物中。这种技术与含超顺磁纳颗粒载体有关，用于在磁场影响下递送。这种应用缩短了递送时间并提高了载体效率(Scherer等人，Gene Therapy.2002；9：102-9)。下文的载体描述中也考虑了其它靶向和递送方法。

在具体的实施方案中，可用脂类载体施用核酸。脂类载体可与裸核酸例如质粒DNA结合以促进穿过细胞膜。阳离子、阴离子或中性脂类可用于此目的。然而，优选的是阳离子脂类，因为已经表明其与通常带负电的DNA结合更佳。已经表明阳离子脂类介导质粒DNA的胞内递送(Feigner和Ringold，Nature.1989；337：387)。已经表明，静脉内注射阳离子脂类-质粒复合物到小鼠中引起DNA在肺中表达(Brigham等人，Am.J.Med.Sci1989；298：278)。还参见Osaka等人，J.Pharm.Sci 1996；85(6)：612-618；San等人，Human Gene Therapy.1993；4：781-788；Senior等人，Biochemicaet Biophysica Acta.1991；1070：173-179；Kabanov和Kabanov，Bioconjugate Chem.1995；6：7-20；Liu等人，Pharmaceut.Res.1996；13；Remy等人，Bioconjugate Chem.1994；5：647-654；Behr，J-P.，BioconjugateChem.1994；5：382-389；Wyman等人，Bioehem.1997；36：3008-3017；Marshall等人的美国专利号5,939,401和Scheule等人的美国专利号6,331,524。

代表性的阳离子脂类包括例如在美国专利号5,283,185和美国专利号5,767,099中公开的阳离子脂类，其内容在此引入作为参考。在优选的实施方案中，阳离子脂类是美国专利号5,767,099中公开的N4-精胺胆固醇基氨基甲酸酯(GL-67)。其它优选的脂类包括N4-亚精胺胆固醇基氨基甲酸酯(GL-53)和1-(N4-精胺)-2，3-二月桂基甘油氨基甲酸酯(GL-89)。

对体内施用病毒载体来说，优选与病毒载体(例如腺病毒载体)联合采用适当的免疫抑制治疗，以避免病毒载体和所转染细胞的免疫失活。例如，可施用免疫抑制细胞因子，如白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)或抗CD4抗体以阻断对病毒载体的体液或细胞免疫应答。在该方面，有利地使用经改造表达最小量抗原的病毒载体。

间接转移可使用上述任何一种方法用编码野生型蛋白质的构建体以先体外后体内的方式改造体细胞并回植入个体中。这种方法在Selden等人的WO 93/09222中全面描述。此外，这种技术用于在Payumo等人，Clin.Orthopaed.and Related Res.2002；403 S：S228-S242中所述的基于细胞的递送所专有的ImPACT技术中。在此种基因疗法系统中，从患者中取出体细胞(例如成纤维细胞、肝细胞或内皮细胞)、在体外培养、用目的治疗基因转染、表征并再次引入到患者中。可使用原代细胞(来源于个体或组织并在传代前改造)和继代细胞(引入体内前在体外传代)以及本领域已知的永生化的细胞系。用于本发明方法的体细胞包括但不限于如成纤维细胞、角膜细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、血液的有形成分、肌肉细胞、可培养的其它体细胞和体细胞前体。在优选的实施方案中，细胞为成纤维细胞或间充质干细胞。

核酸构建体包括外源基因和任选地编码选择标记的核酸以及对于受体原代或继代细胞中表达外源基因所必需的其它序列，可用于转染将产生编码产物的原代或次生细胞。此类构建体包括但不限于用于此目的的感染性载体，如逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、流行性腮腺炎病毒载体和脊髓灰质炎病毒载体。

经皮肤递送尤其适用于使用包括角质细胞、黑素细胞和树突细胞的表皮细胞类型的间接转移(Pfutzner等人，Expert Opin.Investig.Drugs.2000；9：2069-83)。

间充质干细胞(MSC)为骨髓中产生的非造血干细胞。可使MSC分化和增殖成特化的非血液组织。由于干细胞具有自我更新能力，所以用逆转录病毒转染的干细胞是良好的治疗候选细胞。这种能力避免了反复进行基因治疗。另一个优势是，如果注射的干细胞到达靶器官并接着分化，那么它们可替代器官中损坏的或畸形的细胞。

体外稳定性

确保存放过程中药物制剂的稳定性是主要的挑战。在开发蛋白质药物之前，必需研究和阐述有效成分的内在的和潜在的不稳定性。蛋白质和肽治疗剂的不稳定性分为化学不稳定性或物理不稳定性。化学不稳定性的实例为水解、氧化和脱酰胺作用。物理不稳定性的实例为聚集、沉淀和吸附到表面。此外，蛋白质可受到胁迫，如pH值、温度、切应力、冻/融胁迫和这些胁迫的组合。

最主要的制剂问题之一是造成生物活性损失的产物聚集。加入赋形剂可延缓这个过程但不能完全阻止该过程。活性损失通过物理分析可检测到或检测不到，并且只在具有较大(有时15-20％)变异系数的生物分析或效能测定中才是明显的，使其难以测定实际的损失。

除了稳定待施用的替代酶之外，伴侣分子化合物的存在能使药物制剂在7.0-7.5的中性pH值贮存。这对通常必需贮存在较低pH值以保持稳定性的酶有好处。例如，溶酶体酶(包括Gaa)在低pH值(例如，5.0或更低)保持稳定的构象。然而，替代酶在低pH值贮存延长可加速酶和/或制剂的降解。加入稳定的伴侣分子化合物可减少在酸性条件下贮存替代蛋白质的需要。

实施例

通过以下提供的实施例进一步描述本发明。使用此类实施例仅为举例性的并且绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和意义。同样地，本发明不受本文所述的任何特别优选实施方案的限制。实际上，对于阅读本说明书的本领域技术人员来说，本发明的许多修改和变化显而易见，并且在不偏离其主旨和范围的情况下可进行修改和变化。因此本发明仅被所附的权利要求书的术语以及权利要求书所授权等价物的全部范围所限制。

实施例1：DNJ和衍生物的合成

四-O-苄基-1-去氧野尻霉素[通用亚氨基糖制备方法-1]

将DMSO(4.4ml，0.124 mol)的无水CH₂Cl₂溶液(75 mL)置于氩气气氛下并冷却到-78℃。温度保持在-78℃，缓慢加入三氟乙酸酐(6.1 ml，0.088 mol)的无水CH₂Cl₂溶液(50 mL)。加入完成后，将反应再搅拌30分钟，滴加加入2，3，4，6-四-O-苄基山梨醇(5.4g，10mmol)的CH₂Cl₂溶液。将反应在-78℃搅拌90分钟，然后加入三乙胺(11.2ml，0.08 mol)的CH₂Cl₂(50 mL)溶液淬灭反应。将反应温热至0℃，然后用旋转蒸发仪(rotovap)浓缩。用MeOH(75mL)稀释残留物，加入2M NH₃的MeOH(10.0ml，20.0mmol)溶液，接着加入甲酸(0.77mL，20.0mmol)、

分子筛，最后加入NaCNBH₃(1.57g，25.0mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。用旋转蒸发仪蒸发溶剂。将残留物溶解于EtOAc中并用10％Na₂CO₃洗涤，然后经Na₂SO₄干燥。过滤后，将溶剂蒸发并通过快速色谱(20-40％EtOAc的己烷溶液，分级梯度)纯化产物，得到2，3，4，6-四苄基-1-去氧野尻霉素。

1-去氧野尻霉素盐酸盐(化合物1)

将2，3，4，6-四苄基-1-去氧野尻霉素(5.0g，9.5mmol)的EtOH溶液(100mL)与5N HCl的2-PrOH溶液(3.0ml，15.0mmol)一起搅拌，然后用旋转蒸发仪蒸发。将残留物溶于EtOH中并再次用旋转蒸发仪蒸发。将残留物溶于EtOH中(150 mL)并于室温在0.5 g Pd(OH)₂上氢化(50 psi)过夜。过滤除去催化剂，并用EtOH/H₂O洗涤滤饼，然后用EtOH洗涤。在旋转蒸发仪上蒸发滤液，然后与EtOH共同蒸发，得到白色固体。将该固体与EtOH一起研磨并过滤，得到白色固体。从EtOH/H₂O中重结晶得到白色固体的标题化合物。MP 212-215℃，MH⁺＝164。

N-(2-羟乙基)-1-去氧野尻霉素二甲基氨基甲酸酯(化合物15)

将N-(2-羟乙基)-四-O-苄基-1-去氧野尻霉素二甲基氨基甲酸酯(0.63g，0.99mmol)溶于50 ml甲醇中，用130μL浓盐酸(1.6mmol)和作为催化剂的20％氢氧化钯(0.2g，0.3mmol)处理。将不均匀的反应混合物置于氢气气氛下并搅拌15 h。通过另外用甲醇洗涤的硅藻土过滤除去催化剂。用旋转蒸发仪浓缩滤液，并采用快速硅胶色谱法用氯仿∶甲醇(4∶1)洗脱纯化粗产物。用旋转蒸发仪浓缩适当的流份，然后从水中冷冻干燥，得到N-(2-羟乙基)-1-去氧野尻霉素二甲基氨基甲酸酯衍生物(V，化合物14)(MS＝279.4，M+H)。

N-(2-(2，2，2-三氟乙氧基乙基)-1-去氧野尻霉素(化合物19)

将三氟乙基醚中间体(IX)(0.40g，0.62mmol)溶于150 ml甲醇中，并用130μL浓盐酸(1.6mmol)和20％的氢氧化钯(0.2g，0.3mmol)处理。将不均匀的反应物置于氢气气氛下并用Parr shaker加压至40 psi。32 h后，通过另外用甲醇洗涤的硅藻土过滤除去催化剂。用旋转蒸发仪浓缩滤液，采用快速硅胶色谱法并用氯仿∶甲醇(4∶1)洗脱，纯化粗产物。用旋转蒸发仪浓缩适当的流份，然后从水中冷冻干燥，得到N-(2-(2，2，2-三氟乙氧基乙基)-1-去氧野尻霉素，为黄色泡沫状物(MS＝290.2，M+H)。

N-(甲氧基乙基)DNJ(化合物20)

除用2-甲氧基乙胺替换NH₃外，采用通用亚氨基糖制备方法-1，制得标题化合物。MS(ES+)：222[M+1]。

N-(乙氧基乙基)DNJ(化合物21)

除用2-乙氧基乙胺替换NH₃外，采用通用亚氨基糖制备方法-1，制得标题化合物。MS(ES+)：258[M+Na]。

N-R-(-)-四氢呋喃基甲基-1-去氧野尻霉素(化合物17)

在60psi的氢气气氛和温热至60℃的条件下，用氢氧化钯在乙醇中将四氢呋喃基甲基-四-O-苄基-1-去氧野尻霉素脱苄基。采用快速硅胶色谱法用氯仿∶甲醇∶氢氧化铵(80∶20∶2)的混合物洗脱，纯化粗产物，得到标题化合物的游离碱，为白色泡沫状物。用1.0当量的无水盐酸的2-丙醇溶液处理，将上述纯化的游离碱转变成盐酸盐。用旋转蒸发仪蒸发除去溶剂，得到所需的盐酸盐，为白色固体(MS＝248.2，M+H)。

N-S-(+)-四氢呋喃基甲基-1-去氧野尻霉素(化合物18)

在60psi的氢气气氛和温热至60℃的条件下，用氢氧化钯在甲醇中将N-S-(+)-四氢呋喃基甲基-四-O-苄基-1-去氧野尻霉素脱苄基。采用快速硅胶色谱法用氯仿∶甲醇∶氢氧化铵(80∶20∶2)的混合物洗脱，纯化粗产物，得到标题化合物，为白色泡沫状物(MS＝248.2，M+H)。

N-乙基-DNJ(化合物3)[通用亚氨基糖制备方法-2]

将1-DNJ(1.0g，6.1 mmol)、甲醇(60 mL)、双蒸水(DI water)(3.0 mL)、乙醛(6.2g，141mmol)和钯黑(Pd black)(50mg)的混合物快速搅拌并在20-22℃和60 psi的H₂压力条件下氢化20 h。通过硅藻土545(Celite-545)层过滤除去催化剂。用旋转蒸发仪蒸发滤液。将非挥发性的残留物上至快速硅胶柱，并用包含二氯甲烷∶甲醇∶29％的浓NH₄OH(70∶30∶5)的混合物洗脱。将适当的流份收集、混合并用旋转蒸发仪蒸发。冷冻干燥得到所需的分离产物。MP 168.3-169.6℃，m/z 192(ES，[M+H]⁺)。

N-丙基-DNJ(化合物4)

将1-DNJ(1.0g，6.1mmol)、甲醇(60 mL)、双蒸水(10.0 mL)、丙醛(8.1，139mmol)和钯黑(100mg)的混合物迅速搅拌，并用上述制备N-乙基-DNJ的类似条件处理。制得标题化合物，为白色固体。MP：56.6-57.2℃，m/z206(ES，[M+H]⁺)。

N-戊基-DNJ(化合物6)

将1-DNJ(1.0g，6.1mmol)、甲醇(100 mL)、双蒸水(10.0 mL)、戊醛(4.22g，49mmol)和钯黑(100mg)的混合物快速搅拌，并用上述制备N-乙基-DNJ的类似条件处理。制得标题化合物，为白色固体。MP 70-71℃，m/z 234(ES，[M+H]⁺)。

N-己基-DNJ(化合物7)

将1-DNJ(1.0g，6.1mmol)、甲醇(100 mL)、双蒸水(3.0 mL)、己醛(4.3g，42.9mmol)和钯黑(50mg)的混合物快速搅拌，并用上述制备N-乙基-DNJ的类似条件处理。制得标题化合物，为白色固体。MP 64.4-65.6℃，m/z 248(ES，[M+H]⁺)。

N-庚基-DNJ(化合物8)

将1-DNJ-HCl(1.0g，5.0mmol)、甲醇(100 mL)、庚醛(4.9g，42.9mmol)和钯黑(50mg)的混合物快速搅拌，并用上述制备N-乙基-DNJ的类似条件处理。制得标题化合物，为白色固体。MP 107-108℃，m/z 262(ES，[M+H]⁺)。

N-辛基-DNJ(化合物9)

将1-DNJ-HCl(1.0g，5.0mmol)、甲醇(100 mL)、辛醛(4.9g，42.9mmol)和钯黑(50mg)的混合物快速搅拌，并用上述制备N-乙基-DNJ的类似条件处理。制得标题化合物，为白色固体。MP 193-195℃，m/z 276(ES，[M+H]⁺)。

N-((苯并呋喃-2-基)甲基)去氧野尻霉素(化合物30)

将去氧野尻霉素盐酸盐(0.5g，2.5mmol)的EtOH悬浮液(30 mL)用苯并呋喃-2-甲醛(0.55g，3.75mmol)、HOAc(0.15ml，3.75mmol)和氰基硼氢化钠(0.23g，3.75mmol)处理。将混合物在室温搅拌24-36小时。用旋转蒸发仪蒸发溶剂，将残留物溶解于9/1 MeOH/NH₄OH的混合物中，蒸发并上至硅胶上。采用快速色谱法，用0-20％(9/1 MeOH/NH₄OH)溶于CHCl₃的混合物洗脱进行纯化。合并适当的流份并蒸发溶剂，得到为白色固体的标题化合物mp 169-175℃。MH⁺＝294。

N-((苯并噻吩-3-基)甲基)去氧野尻霉素(化合物31)

除了用苯并噻吩-3-甲醛替代苯并呋喃-2-甲醛外，使用对紧邻的上面化合物所述的方法，得到为白色固体的标题化合物mp 145-149℃。MH⁺＝310.

N-((呋喃-2-基)甲基)去氧野尻霉素(化合物29)

除了用糖醛基替代苯并呋喃-2-甲醛外，使用对上面化合物所述的方法，得到无色油状的标题化合物。MH⁺＝244。

N-((1，4-苯并二噁烷-6-基)甲基)去氧野尻霉素(化合物28)

除了使用1，4-苯并二噁烷-6-甲醛替代苯并呋喃-2-甲醛外，采用上述方法，得到为无定形固体的标题化合物MH⁺＝312。

N-环丙基甲基-1-去氧野尻霉素(化合物11)[通用亚氨基糖制备方法-3]

将1-去氧野尻霉素(Toronto Research Chemicals，目录号D245000，3.0g，18.4mmol)溶于300 ml无水甲醇中并与环丙烷甲醛(Aldrich，2.5ml，33.1mmol)混合。加入分子筛(6.0 g)并将混合物搅拌15分钟。加入氰基硼氢化MP(MP-Cyanoborohydride)(Argonaut Technologies，19.2g，46.0mmol)，然后加入冰醋酸(1.1ml，18.4mmol)。将反应混合物加温到45℃，温热48 h。用旋转蒸发仪浓缩溶液，并使用快速硅胶色谱法纯化粗产物，首先用氯仿，然后用5∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10/1)，然后用3∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10/1)，最后用1∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10/1)洗脱。用旋转蒸发仪浓缩适当的流份，分离得到标题化合物，为白色泡沫状物。(MS＝218.8，M+H)。

4-三氟甲基(苄基)-DNJ(化合物23)和α-氰基-4-三氟甲基(苄基)-DNJ(化合物24)

采用通用亚氨基糖制备方法-3，将1-去氧野尻霉素(300mg，1.839mmol)、4-三氟甲基苯甲醛(Aldrich，576.2mg，3.309mmol)、氰基硼氢化MP(Argonaut Technologies，1.92g，4.596mmol)、乙酸(110.4mg，1.839mmol)混合，并如通用方法中所述进行搅拌。使用快速硅胶色谱法纯化，首先用氯仿，然后用10∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用8∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用6∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用4∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)洗脱，得到为白色固体的4-三氟甲基(苄基)-DNJ(MS＝322，M+H)和为白色固体的α-氰基-4-三氟甲基(苄基)-DNJ(MS＝347，M+H)。

4-三氟甲氧基(苄基)-DNJ(化合物25)

采用通用亚氨基糖制备方法-3，将1-去氧野尻霉素(300mg，1.839mmol)、4-三氟甲氧基苯甲醛(Aldrich，629.2mg，3.309mmol)、氰基硼氢化MP(Argonaut Technologies，1.92g，4.596mmol)、乙酸(110.4mg，1.839mmol)混合，并如通用方法所述进行搅拌。使用快速硅胶色谱法纯化，首先用氯仿，然后用10∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用8∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用6∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用4∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)洗脱，得到为白色固体的标题化合物(MS＝338，M+H，MP 101-103℃)。

4-正丁氧基(苄基)-DNJ(化合物27)

采用通用亚氨基糖制备-3，将1-去氧野尻霉素(1.0g，6.1mmol)、4-丁氧基苯甲醛(Aldrich，2.0g，11.2mmol)、氰基硼氢化MP(ArgonautTechnologies，6.4g，15.3mmol)、乙酸(0.37ml，6.4mmol)混合，并如通用方法所述进行搅拌。使用快速硅胶色谱法纯化，首先用氯仿，然后用10∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用8∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用6∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用4∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)洗脱，得到为白色固体的标题化合物(MP 153-155℃)。

4-正戊氧基(苄基)-DNJ(化合物26)

采用通用亚氨基糖制备方法-3，将1-去氧野尻霉素(1.0g，6.1mmol)、4-丁氧基苯甲醛(Alfa Aesar，2.2g，11.2mmol)、氰基硼氢化MP(ArgonautTechnologies，6.4g，15.3mmol)、乙酸(0.37ml，6.4mmol)混合，并如通用方法所述进行搅拌。使用快速硅胶色谱法纯化，首先用氯仿，然后用10∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用8∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用6∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用4∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)洗脱，得到为白色固体的标题化合物(MS＝340，M+H；MP 155-157℃)。

N-(1-(叔丁氧基羰基)-4-哌啶基甲基)-1-去氧野尻霉素(化合物16)

采用通用亚氨基糖制备方法-3，将1-去氧野尻霉素(500mg，3.064mmol)、1-(叔丁氧基羰基)-4-哌啶甲醛(CNH Technologies，1.18g，5.516mmol)、氰基硼氢化MP(Argonaut Technologies，3.19g，4.596mmol)、乙酸(184mg，3.064mmol)混合，并如通用方法所述进行搅拌。使用快速硅胶色谱法纯化，首先用氯仿，然后用10∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)洗脱，得到为灰白色固体的N-(1-(叔丁氧基羰基)-4-哌啶基甲基)-1-去氧野尻霉素(MS＝361，M+H，MP 46-50℃)。

N-环戊基甲基-1-去氧野尻霉素(化合物12)

采用通用亚氨基糖制备方法-3，将1-去氧野尻霉素(500mg，3.064mmol)、环戊烷甲醛(Aldrich，541mg，5.516mmol)、氰基硼氢化MP(Argonaut Technologies，3.19g，7.661mmol)、乙酸(184mg，3.064mmol)混合，并如通用方法所述进行搅拌。使用快速硅胶色谱法纯化，首先用氯仿，然后用8∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)，然后用4∶1的氯仿∶甲醇/氢氧化铵(10∶1)洗脱，得到N-环戊基甲基-1-去氧野尻霉素，为粘稠黄褐色油状物(MS＝246，M+H)。

C-1-α-壬基-1-去氧野尻霉素和C-1-β-壬基-1-去氧野尻霉素(化合物32)[通用亚氨基糖制备方法-4]

采用Boshagen、Geiger和Junge(Angewante Chemie，Int.Ed.Engl.，20(9)，806-807(1981)所述的类似方法。根据Marcuccio(WO00/56713)的方法制备1-α-氰基-1-去氧野尻霉素(1.0g，5.3mmol)，并将其悬浮于六甲基二硅氮烷(11mL)中。用咪唑(156.3mg，2.5mmol)处理悬浮液，在氩气气氛下加热到60℃，并加热5 h。过滤混合物以除去固体，并用旋转蒸发仪在55-60℃浓缩滤液。将残留物溶于无水THF(50mL)中，并在15-20℃加入正壬基溴化镁(1M的乙醚溶液，31.9mmol，38mL)的溶液。将混合物加温到室温并搅拌5 h。在冰浴中冷却混合物，并与1N HCl(30mL)搅拌3 h。加入2NNaOH调节混合物的pH值到8.0。除去有机层并冷冻干燥水相。将残留物溶解于甲醇(50mL)中并过滤除去固体。真空蒸发滤液到干燥。将蒸发后获得的残留物在硅胶柱上用二氯甲烷∶甲醇∶29％NH₄OH(85∶15∶1.5)层析。将含有β-异构体(Rf 0.5)的适当流份合并，用旋转蒸发仪蒸发，然后冷冻干燥，获得C-1-β-壬基-DNJ(MS＝m/z 290)。

C1-α-丁基-DNJ(化合物33)

采用通用亚氨基糖制备方法-4，将1-α-氰基-1-去氧野尻霉素(2.0g，9.5mmol)转变成C-1-α-丁基-DNJ。用比例为(85∶15∶1.5)的二氯甲烷∶甲醇∶29％NH₄OH通过硅胶色谱法纯化产物。将含α-异构体(Rf 0.3)的适当流份合并，蒸发除去溶剂并冷冻干燥，获得标题化合物(MS＝m/z 220)。

C1-α-苄基-DNJ(化合物35)

用通用亚氨基糖制备方法-4来制备四-(O-三甲基硅烷基)-1-α-氰基-1-去氧野尻霉素(2.0g，9.448mmol)。将保护的化合物溶于无水THF(20mL)中，并滴加加入苄基溴化镁(2.0M的THF溶液，20mL)。搅拌混合物并在45℃加热过夜。将混合物冷却到室温，加入2N HCl(30mL)，将混合物搅拌3h。用旋转蒸发仪蒸发溶剂，并用29％的NH₄OH溶液处理残留物以中和酸。用乙醚(2×20mL)洗涤溶液，分离水相并冷冻干燥。将固体与二氯甲烷∶甲醇∶29％NH₄OH(80∶20∶4)一起搅拌，过滤并用旋转蒸发仪蒸发滤液。用二氯甲烷∶甲醇∶29％NH₄OH(80∶20∶4)在硅胶柱上层析纯化残留物。合并含α-异构体(Rf 0.3)的适当流份，用旋转蒸发仪蒸发溶剂，然后冷冻干燥，获得标题化合物(MP＝73-74℃，MS＝m/z 254)。¹H-NMR，300 MHz(D2O)2.28(m，2H)，2.55(ddd，1H，J＝2.8，5.6，10Hz)，2.99(m，2H)，3.06(dd，1H，J＝2.8，13.6Hz)，3.11(m，1H)，3.22(dd，1H，J＝7.6，11.2Hz)，3.56(dd，1H，J＝3.2，11.6Hz)和7.2(m，5H)。

实施例2：用DNJ和DNJ衍生物提高Gaa

下文所述实验表明DNJ和DNJ衍生物N-丁基-DNJ(参与糖脂合成的酶的已知抑制剂)也可结合Gaa并提高突变体Gaa的活性而不抑制糖脂合成。

方法

细胞培养和接种：PM11(P545L)、PM8和PM12(二者均为切割缺损)、成纤维细胞的细胞系用于增强实验。这些细胞是从庞皮病患者分离的成纤维细胞。以每孔约5000个细胞在无菌黑色透明底96孔Costar板中的180μL培养基中接种细胞并在5％CO₂、37℃条件下孵育大约3-6小时。培养基由含10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM组成。

药物处理所有检测化合物以100 mM的贮存浓度溶于1∶1的DMSO∶H₂O中。用另一个无菌黑色透明底Costar板进行细胞的连续稀释如下：

1.在3-11列和第1列加入20μL 1∶1的DMSO∶H₂O和180μL培养基，在E-H行中达到5％DMSO、5％H₂O的培养基。

2.在第1列加入20μL 100 mM的DNJ和180μL培养基，在A-D行中达到10mM DNJ。

3.在第2列的适当孔中加入30μL的每种100mM待检测的贮存液以及270μL培养基以达到浓度为10 mM。

4.用多道移液器混合第1列三次。

5.如上混合第2列并从第2列转移100μL到第3列。如上所述混合第3列，4-11列的每一列依次转移100μL到下一列(12列留作空白)以产生连续的三倍稀释液。

4.根据表1从连续稀释平板上转移20μL。

5.将平板在37℃、5％CO₂条件下孵育6天，将第1天作为给药当天。

酶活性测定用200μL dPBS洗涤细胞两次然后在1-12列中加入溶于柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(30mM柠檬酸钠，40mM磷酸氢二钠，pH 4.0)的70μL底物(2.11mM 3mM 4-MU-α-D-glu)和2.5％DMSO。在5％CO₂中于37℃孵育约3 h后，在1-12列中加入70μL终止缓冲液(0.4M甘氨酸，pH 10.8)。

在Victor²多标记计数器-Wallac荧光平板读数器中对平板读数，在355nm激发波长和460nm发射波长下用每孔1秒的读数时间测定F460nm下的荧光值。从发射的荧光量计算每微克蛋白质的酶活性，其与水解的底物量直接成比例并因此与细胞溶解物中的Gaa活性成比例。所提高的比率为存在DNJ衍生物条件下的Gaa活性除以无此化合物条件下的Gaa活性。

结果

DNJ、NB-DNJ和N-(环丙基)甲基DNJ如图1所示，用DNJ(1)、N-丁基-DNJ(5)和N-(环丙基)甲基DNJ(11)处理的细胞与PM11细胞系中未处理的对照细胞相比表现剂量依赖的Gaa活性增强。与未处理细胞中的Gaa活性(数据未显示)相比，最高浓度的DNJ(1 mM)增强Gaa活性大约7.8倍。

DNJ和NB-DNJ在50μM浓度下也显著增强PM12细胞系中Gaa活性(高于2倍)。还观察到DNJ在PM8细胞系中没有增强Gaa活性(数据未显示)。DNJ和NB-DNJ增强Gaa是剂量依赖的，证实增加的活性增强在平高线前3.0-100μM范围内(数据未显示)。

其它DNJ衍生物如下文表1和表2所报道，DNJ衍生物N-甲基-DNJ、N-(2-(N，N-二甲基氨基甲酰)乙氧基-DNJ(15)、N-4-叔丁基氧羰基-哌啶基甲基-DN J(16)、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ(17)、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ(18)、N-(2-(2，2，2-三氟乙氧基)乙基-DNJ(19)、N-2-甲氧基乙基-DNJ(20)、N-2-乙氧基乙基-DNJ(21)、N-4-三氟甲基苄基-DNJ(23)、N-α-氰基-4-三氟甲基苄基-DNJ(24)、N-4-三氟甲氧基苄基-DNJ(25)、N-4-n-戊氧基苄基-DNJ(26)和N-4-n-丁氧基苄基-DNJ(27)也显著提高PM11中的Gaa活性。使用N-甲基DNJ和N-羧基戊基DNJ增强Gaa活性在约3-100μM是剂量依赖的(数据未显示)。

％E_max指与存在1 mM DNJ时观察到的活性增强相比，实验化合物的最大提高百分数。其按照用GraphPad Prism version 3.02分析的理论上的非线性回归曲线的顶点进行计算。增强被定义为标准化的多次荧光读数平均值相比存在1mM的DNJ时的平均最大读数以及相比没有化合物时的最小平均读数。荧光读数是扣除本底的。本底的定义是存在细胞时的平均读数减去没有细胞时的平均读数。EC_5O(μM)是指达到50％的E_max的化合物浓度。

不受特定机制所限，推测DNJ和DNJ衍生物结合ER中的突变体Gaa并诱导突变蛋白的正确折叠，允许该酶从ER中逸出并转运到溶酶体，在溶酶体中它可表现出一定量的酶活性。

表1：1-去氧野尻霉素的N-烷基衍生物

表2：带有C-取代基的1-去氧野尻霉素的衍生物

实施例3：用DNJ和DNJ衍生物处理的体内Gaa活性

药物施用此实施例提供了有关DNJ衍生物对小鼠的作用的信息。以0、1毫克/千克/天、10毫克/千克/天和100毫克/千克/天对小鼠施用DNJ衍生物的待测化合物；在研究开始之后的2周和4周收集器官和血浆。使用每组20只雄性C57BL6(25g)小鼠。在饮水中提供药物，因此每天监控水的消耗。

在对照组中(0毫克/千克/天)，小鼠在饮用水(无药物)中每天给药并分成两组。处理两周后处死10只动物，从降主动脉或大静脉中收集血液，收取组织然后解剖尸体。处理4周后处死剩下的10只动物并进行相同评价。

在第一个试验组中，20只小鼠每天在饮用水中以1毫克/千克-天的目标给药(假定25g小鼠每天饮水速度为5毫升/天，那么饮用水中应具有0.025毫克/5毫升或5微克/毫升的浓度)。与对照类似，处理2周后处死10只小鼠并评价。处理4周后，处死并评价剩下的10只动物。

对目标为10毫克/千克-天的测试化合物来说，20只小鼠每天在饮用水中给药(估计化合物浓度为50微克/毫升)并分成两组用于按上面的组所述进行检测。

对目标为100毫克/千克-天的测试化合物来说，20只小鼠每天在饮用水中给药(估计化合物浓度为500微克/毫升)并分成两组用于按上面的组所述进行检测。

将血样吸入肝素锂中并离心获取血浆。放血之后，取出心脏、肝脏、腓肠肌、比目鱼肌、舌、肾和脑并放入小瓶中。将小瓶放于干冰中快速冷冻。然后分析组织和血浆的Gaa和糖原的组织水平。

组织制备取出小部分组织并加到500μl裂解缓冲液中(20mM柠檬酸钠，40mM磷酸氢二钠，pH 4.0，含0.1％Triton X-100)。然后用微量匀浆器短时间匀浆组织，之后在4℃以10,000rpt离心10分钟。将上清液转移到新管中并用于酶的测定。

组织酶测定向2.5μl上清液中(在96孔板中)加入17.5 μl反应缓冲液(柠檬酸盐磷酸盐缓冲液，不含Triton)以及50μl 4-甲基伞形酮(4-MU)标记的底物、α-吡喃葡萄糖苷或者标记的阴性对照、β-吡喃葡萄糖苷和α-吡喃半乳糖苷。将平板在37℃孵育1小时，然后加入70μl终止缓冲液(0.4M甘氨酸-NaOH，pH 10.6)。通过在355nm下激发用每孔1秒的读数时间测定F460nm下的吸光度(Victor²多标记计数器-Wallac)。酶活性标准化为所加入的细胞裂解物的μl数，并估计每μl裂解物的酶活性。提高的比例等于含化合物的活性比不含化合物的活性。

结果

如图2A-D和3A-D所示，用DNJ和N-丁基-DNJ处理两周后，脑、肝脏、腓肠肌、舌(图2A-D)中以及肾、膈膜、心脏和比目鱼肌(图3A-D)中的Gaa水平提高。该结果的线性趋势显著。对DNJ来说，脑、腓肠肌、舌、肾、膈膜、心脏和比目鱼肌中的提高是剂量依赖的(线性趋势显著)。对N-丁基-DNJ来说，脑、肝脏、腓肠肌、舌和肾中的提高是剂量依赖的。

处理4周之后，在脑、肝脏、腓肠肌和舌中(图4A-D)以及肾、膈膜、心脏和比目鱼肌中(图5A-D)中也观察到用DNJ处理之后Gaa活性的提高。N-丁基DNJ的结果是相似的，但没有在膈膜、心脏和比目鱼肌中观察到活性提高。脑、腓肠肌、舌、肾(仅DNJ)、膈膜(仅DNJ)、心脏(仅DNJ)和比目鱼肌(仅DNJ)中的提高表现为剂量依赖的。

这些结果验证了特异性的药用伴侣分子可在体内增强非突变的Gaa活性。

实施例4：接触或不接触DNJ衍生物的Gaa的蓄积和定位

在此实验中，对来源于具有很低的或没有残余Gaa活性的庞皮病患者的四个细胞系与野生型成纤维细胞的Gaa蓄积和定位进行比较。

方法

细胞系评价了PM8、PM9、PM11和PM12细胞系。PM8带有导致Gaa活性残留的剪接缺陷(IVSIAS，T＞G，-13)；PM9在一个等位基因上带有无义突变(R854X)，在另一个等位基因上带有3个错义突变(D645E、V816I和T927I)并基本不具有残留的Gaa活性(＜1％)；PM11含有错义突变(P545L)并具有一些残留的Gaa活性。PM12也具有剪接缺陷(IVS8+G＞A/M519V)。

免疫荧光和显微镜观察细胞在含有或不含有NB-DNJ下培养5天，置于玻璃盖玻片上。细胞用3.7％多聚甲醛固定15分钟，用0.5％的皂苷透化处理5分钟，然后用1∶300稀释的兔抗人Gaa(Barry Byrne惠赠)和/或小鼠抗LAMP1的单克隆抗体(BD Pharmingen，目录号555798)室温下标记1小时。然后以1∶500稀释度加入第二抗体即偶联了AlexaFluor 488的山羊抗兔IgG，以及偶联了AlexaFluor 594(Molecular Probes)的山羊抗小鼠IgG，并在室温孵育1小时。将盖玻片放在有10μl Vectashield的载玻片上，用速干指甲油密封，用90i Nikon C1共聚焦显微镜观察。

结果

PM8尽管具有很低的残余Gaa活性，与野生型成纤维细胞相比PM8细胞仍显示LAMP-1和Gaa胞质染色增强，并具有不同的染色图。如图6所示，用NB-DNJ处理的野生型成纤维细胞显示LAMP-1和Gaa的点状染色模式(图6C-D)，其表明在溶酶体中共定位。与之不同，在PM8成纤维细胞中，LAMP-1和Gaa在胞质中的染色是蔓延的(图6A-B和6E-F)。LAMP-1和Gaa在汇合的野生型成纤维细胞中的重叠证明了共定位于溶酶体(图6H)，而在汇合的PM8成纤维细胞中的重叠证明了胞质中过量的LAMP-1和Gaa(图6G)。上述结果表明可能的溶酶体形成缺陷和非正常形成的内体/溶酶体结构的大聚集物存在(聚集体(aggresome))。

PM9 PM9成纤维细胞也在胞质中(图7B)显示过量的Gaa(图7B和7D)和LAMP-1(图7E)染色。重叠显示了类似聚集体的Gaa聚集物的形成(图7A、7C和7F，箭头和嵌入框显示聚集体)。预计用DNJ衍生物处理将恢复Gaa正确的溶酶体定位并减少胞质聚集体。

PM11 PM11成纤维细胞显示Gaa活性降低。当用NB-DNJ(50μM)和DNJ(100μM)处理时，PM11细胞显示如溶酶体标志物LAMP-1共标记所评价的溶酶体中Gaa标记强度的增大，表明转运的恢复(图8)。未处理的PM11成纤维细胞显示了一些Gaa染色，其很少与LAMP-1共定位。

此外，为验证PM11细胞中的缺陷是将溶酶体酶(Gaa)转运到溶酶体的缺陷，分别对野生型成纤维细胞和PM11细胞的早期溶酶体标志物EEA1和晚期溶酶体标志物M6PR染色。野生型成纤维细胞和庞皮病PM11成纤维细胞之间在早期内体和晚期内体的定位图方面没有差别(数据未显示)。

PM12在用NB-DNJ处理的PM12成纤维细胞中还观察到Gaa染色强度的显著增加(数据未显示)。

讨论

此实施例证明了本发明的药用伴侣分子可恢复带有Gaa突变的细胞的表型，所述突变不包括(和包括)造成Gaa不稳定并且不能在合成过程中从内质网中运出的突变。这支持了即使不恢复溶酶体中的Gaa水解酶活性，促进突变体Gaa从ER转运到溶酶体也足以在组织中如肌肉中缓解庞皮病的病理作用的假设。很明显糖原的周转不足以改善患者的庞皮病表型。因此，转运的改善为何可改善庞皮病病理的一个假说是缺少Gaa活性造成细胞中缺少葡萄糖，其可引起或产生自体吞噬反应(利用胞质糖原快速释放葡萄糖)。这种自体吞噬反应破坏了经内体转运通路的转运，造成稳定膜的蛋白质的错误转运和肌纤维的最终破坏。

伴侣分子疗法可解救Gaa活性、缓解葡萄糖缺乏和由葡萄糖缺乏所诱导的自体吞噬反应，最终恢复稳定膜的蛋白质的转运以防止进一步的肌肉破坏。

实施例5：DNJ衍生物对肠Gaa的影响：反向筛选

理想的特异性药用伴侣分子会在亚抑制浓度下提高溶酶体Gaa而不抑制肠Gaa。因此，在7.0的pH值下在小鼠的肠粗提物中评价肠Gaa活性。此外，建立了肠Gaa酶抑制的测定法以确定化合物(如DNJ和NB-DNJ)是否对肠Gaa有抑制作用。

方法

组织制备如上所述从C57BK6小鼠的小鼠肠中制备粗提物。将上清液转到新管中并用于酶的测定。

结果

DNJ是IC₅₀值为1μM的肠Gaa的更有效抑制剂，而NB-DNJ的抑制值IC₅₀为21μM(数据未显示)。

实施例6：用DNJ衍生物治疗庞皮病患者

考虑到上文的结果，用本发明的DNJ和DNJ衍生物治疗庞皮病患者将降低肌肉组织中糖原的病理性蓄积，从而缓解疾病状态。考虑到目前所批准的庞皮病单一疗法(ERT)由于重组酶不能穿透肌肉组织而不能有效降低骨骼肌中糖原蓄积的事实，该方法解决了本领域的长期需要。

方法

患者群体募集诊断为婴儿起始、幼年起始和/或成人起始的庞皮病患者并在口服DNJ衍生物的随机、双盲、多剂量、标签公开的临床试验中进行评价。为了合格，患者必需具有下列之一：a)心脏病，定义为通过横截面超声心动图测定的左心室体积指数(LVMI)；b)需要侵入或非侵入的通气支架，其中非侵入通气的定义为不使用器官内插管而使用的任何形式的通气支架；或c)严重的运动延迟，定义为不能完成按照丹佛发展筛选测验(DDST-2；Hallioglo等人，Pediatr Int.2001；43(4)：400-4)的90％正常年龄的同龄人所能完成的总体运动技能。

药物施用两组受试者(每组10名)每天两次接受50或100mg的DNJ或DNJ衍生物24周。这低于戈谢病中鞘糖脂的底物剥夺所示的量。

终点通过不用通气机的存活率、左心室体积指数、运动发育和骨骼肌功能(例如使用丹佛发展筛选测验和Alberta婴儿量表(Piper等人，发育中的儿童的运动评估，Philadelphia，PA，W.B.Saunders Co.，1994)、贝氏婴儿成长量表(BSIDII；Bayley等人，Bayley Scores of InfantDevelopment.第二版，San Antonio，TX：Harcourt Brace & Co.1993)进行测量)，以及肌肉活检的组织学和生化分析(即用过碘酸希弗碱(PAS)的阳性染色和酶活性检测来测定被治疗患者和未治疗患者中的糖原水平和测量来自患者的成纤维细胞的Gaa活性)来评价临床效能。临床测量每两周评价一次，而肌肉活检在第4周、第12周和第24周评价。

结果

用DNJ衍生物治疗将通过缓解一些症状和降低糖原的肌肉组织水平而对治疗庞皮病有效。例如，预期在12周内会观察到肌肉中Gaa活性的提高，并且肌肉中糖原蓄积会减少。此外，预期LVMI减少并且呼吸症状改善。最后，预期运动发育和肌紧张度改善，尤其是年轻患者的运动发育和肌紧张度改善。

结论

本发明的方法提供了在治疗庞皮病中出乎意料的益处，其中ERT为目前仅有的疗法。施用小分子伴侣分子(优选口服)是物有所值的，并且允许挽救ERT中不能穿透组织即脑部的酶。此外，用伴侣分子化合物和替代蛋白质的联合疗法可降低输注的次数和/或所需重组酶或纯化酶的数量，从而降低费用并给患者提供益处。最后，与本发明的伴侣分子化合物组合的替代Gaa制剂可稳定重组酶并且防止聚集和/或降解，从而延长酶的贮存期限。

本发明不受本文所述具体实施方案的范围限制。实际上，本领域技术人员可从前面的说明书和所附的图中了解除本文所述之外的本发明的各种修改。此类修改意欲涵盖于所附权利要求书的范围之内。

本申请引用了专利、专利申请、公开物、产品说明、登录号和方案，其内容在此全部引入作为参考，用于所有目的。

序列表

<110>阿米库斯治疗学公司(AMICUS THERAPEUTICS INC.)

<120>使用1-去氧野尻霉素衍生物治疗庞皮病的方法

<130>077376.0191

<140>待转让

<141>2006-05-17

<150>60/729,329

<151>2005-10-21

<150>60/682,241

<151>2005-05-10

<160>2

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>3624

<212>DNA

<213>人

<400>1

cagttgggaa agctgaggtt gtcgccgggg ccgcgggtgg aggtcgggga tgaggcagca 60

ggtaggacag tgacctcggt gacgcgaagg accccggcca cctctaggtt ctcctcgtcc 120

gcccgttgtt cagcgaggga ggctctgggc ctgccgcagc tgacggggaa actgaggcac 180

ggagcgggcc tgtaggagct gtccaggcca tctccaacca tgggagtgag gcacccgccc 240

tgctcccacc ggctcctggc cgtctgcgcc ctcgtgtcct tggcaaccgc tgcactcctg 300

gggcacatcc tactccatga tttcctgctg gttccccgag agctgagtgg ctcctcccca 360

gtcctggagg agactcaccc agctcaccag cagggagcca gcagaccagg gccccgggat 420

gcccaggcac accccggccg tcccagagca gtgcccacac agtgcgacgt cccccccaac 480

agccgcttcg attgcgcccc tgacaaggcc atcacccagg aacagtgcga ggcccgcggc 540

tgctgctaca tccctgcaaa gcaggggctg cagggagccc agatggggca gccctggtgc 600

ttcttcccac ccagctaccc cagctacaag ctggagaacc tgagctcctc tgaaatgggc 660

tacacggcca ccctgacccg taccaccccc accttcttcc ccaaggacat cctgaccctg 720

cggctggacg tgatgatgga gactgagaac cgcctccact tcacgatcaa agatccagct 780

aacaggcgct acgaggtgcc cttggagacc ccgcgtgtcc acagccgggc accgtcccca 840

ctctacagcg tggagttctc cgaggagccc ttcggggtga tcgtgcaccg gcagctggac 900

ggccgcgtgc tgctgaacac gacggtggcg cccctgttct ttgcggacca gttccttcag 960

ctgtccacct cgctgccctc gcagtatatc acaggcctcg ccgagcacct cagtcccctg 1020

atgctcagca ccagctggac caggatcacc ctgtggaacc gggaccttgc gcccacgccc 1080

ggtgcgaacc tctacgggtc tcaccctttc tacctggcgc tggaggacgg cgggtcggca 1140

cacggggtgt tcctgctaaa cagcaatgcc atggatgtgg tcctgcagcc gagccctgcc 1200

cttagctgga ggtcgacagg tgggatcctg gatgtctaca tcttcctggg cccagagccc 1260

aagagcgtgg tgcagcagta cctggacgtt gtgggatacc cgttcatgcc gccatactgg 1320

ggcctgggct tccacctgtg ccgctggggc tactcctcca ccgctatcac ccgccaggtg 1380

gtggagaaca tgaccagggc ccacttcccc ctggacgtcc aatggaacga cctggactac 1440

atggactccc ggagggactt cacgttcaac aaggatggct tccgggactt cccggccatg 1500

gtgcaggagc tgcaccaggg cggccggcgc tacatgatga tcgtggatcc tgccatcagc 1560

agctcgggcc ctgccgggag ctacaggccc tacgacgagg gtctgcggag gggggttttc 1620

atcaccaacg agaccggcca gccgctgatt gggaaggtat ggcccgggtc cactgccttc 1680

cccgacttca ccaaccccac agccctggcc tggtgggagg acatggtggc tgagttccat 1740

gaccaggtgc ccttcgacgg catgtggatt gacatgaacg agccttccaa cttcatcaga 1800

ggctctgagg acggctgccc caacaatgag ctggagaacc caccctacgt gcctggggtg 1860

gttgggggga ccctccaggc ggccaccatc tgtgcctcca gccaccagtt tctctccaca 1920

cactacaacc tgcacaacct ctacggcctg accgaagcca tcgcctccca cagggcgctg 1980

gtgaaggctc gggggacacg cccatttgtg atctcccgct cgacctttgc tggccacggc 2040

cgatacgccg gccactggac gggggacgtg tggagctcct gggagcagct cgcctcctcc 2100

gtgccagaaa tcctgcagtt taacctgctg ggggtgcctc tggtcggggc cgacgtctgc 2160

ggcttcctgg gcaacacctc agaggagctg tgtgtgcgct ggacccagct gggggccttc 2220

taccccttca tgcggaacca caacagcctg ctcagtctgc cccaggagcc gtacagcttc 2280

agcgagccgg cccagcaggc catgaggaag gccctcaccc tgcgctacgc actcctcccc 2340

cacctctaca cactgttcca ccaggcccac gtcgcggggg agaccgtggc ccggcccctc 2400

ttcctggagt tccccaagga ctctagcacc tggactgtgg accaccagct cctgtggggg 2460

gaggccctgc tcatcacccc agtgctccag gccgggaagg ccgaagtgac tggctacttc 2520

cccttgggca catggtacga cctgcagacg gtgccaatag aggcccttgg cagcctccca 2580

cccccacctg cagctccccg tgagccagcc atccacagcg aggggcagtg ggtgacgctg 2640

ccggcccccc tggacaccat caacgtccac ctccgggctg ggtacatcat ccccctgcag 2700

ggccctggcc tcacaaccac agagtcccgc cagcagccca tggccctggc tgtggccctg 2760

accaagggtg gagaggcccg aggggagctg ttctgggacg atggagagag cctggaagtg 2820

ctggagcgag gggcctacac acaggtcatc ttcctggcca ggaataacac gatcgtgaat 2880

gagctggtac gtgtgaccag tgagggagct ggcctgcagc tgcagaaggt gactgtcctg 2940

ggcgtggcca cggcgcccca gcaggtcctc tccaacggtg tccctgtctc caacttcacc 3000

tacagccccg acaccaaggt cctggacatc tgtgtctcgc tgttgatggg agagcagttt 3060

ctcgtcagct ggtgttagcc gggcggagtg tgttagtctc tccagaggga ggctggttcc 3120

ccagggaagc agagcctgtg tgcgggcagc agctgtgtgc gggcctgggg gttgcatgtg 3180

tcacctggag ctgggcacta accattccaa gccgccgcat cgcttgtttc cacctcctgg 3240

gccggggctc tggcccccaa cgtgtctagg agagctttct ccctagatcg cactgtgggc 3300

cggggcctgg agggctgctc tgtgttaata agattgtaag gtttgccctc ctcacctgtt 3360

gccggcatgc gggtagtatt agccaccccc ctccatctgt tcccagcacc ggagaagggg 3420

gtgctcaggt ggaggtgtgg ggtatgcacc tgagctcctg cttcgcgcct gctgctctgc 3480

cccaacgcga ccgcttcccg gctgcccaga gggctggatg cctgccggtc cccgagcaag 3540

cctgggaact caggaaaatt cacaggactt gggagattct aaatcttaag tgcaattatt 3600

ttaataaaag gggcatttgg aatc 3624

<210>2

<211>952

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

20 25 30

His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val

35 40 45

Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly

50 55 60

Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr

65 70 75 80

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

100 105 110

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser

130 135 140

Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

165 170 175

Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu

180 185 190

Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu

195 200 205

Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg

210 215 220

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

225 230 235 240

Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

245 250 255

Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

260 265 270

Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

275 280 285

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly

290 295 300

Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

305 310 315 320

Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

325 330 335

Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

340 345 350

Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

355 360 365

Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

370 375 380

Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val

385 390 395 400

Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

405 410 415

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

420 425 430

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

435 440 445

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

450 455 460

Gly Val PheIle Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro LeuIle Gly Lys Val

465 470 475 480

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

485 490 495

Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

500 505 510

Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

515 520 525

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

530 535 540

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

545 550 555 560

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

565 570 575

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

660 665 670

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

690 695 700

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

705 710 715 720

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

755 760 765

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly

770 775 780

Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

785 790 795 800

Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

805 810 815

His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

820 825 830

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr

835 840 845

Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser

850 855 860

Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910

Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr

915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly

930 935 940

Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

945 950

Claims

1.包括使酶与有效量的1-去氧野尻霉素衍生物或其可药用盐接触用于增强细胞中α-葡萄糖苷酶活性的方法，其中所述1-去氧野尻霉素衍生物包括下式的化合物：

其中R₁为H或含1-12个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、链烯基、烷氧基烷基或氨基烷基，含5-12个环原子的芳基、烷基芳基、杂芳基或杂芳基烷基，其中R₁任选地被一个或多个-OH、-COOH、-Cl、-F、-CF₃、-OCF₃、-O-C(＝O)N-(烷基)₂取代；R₂为H，含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、链烯基、烷基芳基或烷氧基烷基或者含5-12个碳原子的芳基，其中R₂任选地被-OH、-CO OH、-CF₃、-OCF₃或杂环取代；并且R₁和R₂至少一个不是H；

其中DNJ衍生物不是1-去氧野尻霉素或α-高野尻霉素。

2.包括使酶与有效量的1-去氧野尻霉素衍生物或其可药用盐接触用于增强细胞中α-葡萄糖苷酶活性的方法，其中所述1-去氧野尻霉素衍生物包含下式的化合物：

其中R₁为H或含1-12个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、烷氧基烷基或氨基烷基，其任选地被-OH、-COOH、-Cl、-F、-CF₃、-OCF₃、-O-C(＝O)N-(烷基)₂取代；R₂为H或含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基或烷氧基烷基；并且R₁和R₂至少一个不是H；

其中DNJ衍生物不是1-去氧野尻霉素或α-高野尻霉素。

3.如权利要求1的方法，其中R₁为含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基或烷氧基烷基，其任选地被-OH、-COOH、CF₃、OCF₃或-C(＝O)N-(Me)₂取代；R₂为H。

4.如权利要求3的方法，其中R₁为n-甲基、n-乙基、n-丁基、n-环丙基甲基或n-壬基。

5.如权利要求3的方法，其中R₁为被-OH、-COOH、CF₃、O CF₃或-C(＝O)N-(Me)₂取代的n-乙基或n-丁基。

6.如权利要求3的方法，其中R₁为

7.如权利要求1的方法，其中R₁为H，R₂为任选地被-CF₃或杂环取代的直链或支链烷基、链烯基、芳基或醚。

8.如权利要求7的方法，其中R₂为n-壬基基团。

9.如权利要求1的方法，其中化合物选自N-甲基-DNJ、N-丁基-DNJ、N-环丙基甲基-DNJ、N-(2-(N，N-二甲基氨基甲酰)乙氧基-DNJ、N-4-叔丁基氧羰基-哌啶基甲基-DNJ、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ、N-(2-(2，2，2-三氟乙氧基)乙基-DNJ、N-2-甲氧基乙基-DNJ、N-2-乙氧基乙基-DNJ、N-4-三氟甲基苄基-DNJ、N-α-氰基-4-三氟甲基苄基-DNJ、N-4-三氟甲氧基苄基-DNJ、N-4-n-戊氧基苄基-DNJ和N-4-n-丁氧基苄基-DNJ或Cl-壬基DNJ。

10.如权利要求9的方法，其中化合物为N-丁基-去氧野尻霉素。

11.如权利要求1的方法，其中在提供细胞中最大Gaa活性的DNJ衍生物浓度下，存在DNJ衍生物的Gaa活性比不含DNJ衍生物的Gaa活性增加至少1.5倍。

12.如权利要求1的方法，其中在提供细胞中最大Gaa活性的DNJ衍生物浓度下，存在DNJ衍生物的Gaa活性比不含DNJ衍生物的Gaa活性增加至少5倍。

13.如权利要求1的方法，其中化合物在抑制肠Gaa的IC₅₀值或低于抑制肠Gaa的IC₅₀值的浓度下增强溶酶体的Gaa活性。

14.如权利要求1的方法，其中α-葡萄糖苷酶为突变体α-葡萄糖苷酶。

15.如权利要求1的方法，其中突变体α-葡萄糖苷酶选自D645E、D645H、R224W、S619R、R660H、T1064C、C2104T、D645N、L901Q、G219R、E262K、M408V、G309R、D645N、G448S、R672W、R672Q、P545L、C647W、G643R、M318T、E521K、W481R、L552P，G549R、R854X、V816I和T927I以及它们的组合。

16.如权利要求1的方法，其中α-葡萄糖苷酶为经纯化的或重组的功能性α-葡萄糖苷酶。

17.如权利要求16的方法，其中所述接触在体内发生。

18.如权利要求16的方法，其中所述接触在体外发生。

19.包括对个体施用有效量的1-去氧野尻霉素衍生物或其可药用盐用于在需要它的个体中治疗庞皮病的方法，其中所述的1-去氧野尻霉素衍生物包含下式的化合物：

其中R₁为H或含1-12个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、链烯基、烷氧基烷基或氨基烷基，含5-12个环原子的芳基、烷基芳基、杂芳基或杂芳基烷基，其中R₁任选地被一个或多个-OH、-CO OH、-Cl、-F、-CF₃、-OCF₃、-O-C(＝O)N-(烷基)₂取代；R₂为H，含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、链烯基或烷氧基烷基或者含5-12个碳原子的芳基，其中R₂任选地被-OH、-COOH、-CF₃、-OCF₃或杂环取代；其中R₁和R₂至少一个不是H；

其中DNJ衍生物不是1-去氧野尻霉素或α-高野尻霉素。

20.包括对个体施用有效量的1-去氧野尻霉素衍生物或其可药用盐用于在需要的个体中治疗庞皮病的方法，其中所述的1-去氧野尻霉素衍生物包含下式的化合物：

其中R₁为H或任选地被-OH、-COOH、-Cl、-F、-CF₃、-OCF₃、-O-C(＝O)N-(烷基)₂取代的含1-12个碳原子的直链或支链烷基、环烷基、烷氧基烷基或氨基烷基；R₂为H或含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基或烷氧基烷基；并且R₁和R₂至少一个不是H；

其中DNJ衍生物不是1-去氧野尻霉素或α-高野尻霉素。

21.如权利要求19的方法，其中R₁为任选地被-OH、-COOH、CF₃、OCF₃或-C(＝O)N-(Me)₂取代的含1-9个碳原子的直链或支链烷基、环烷基或烷氧基烷基；且R₂为H。

22.如权利要求21的方法，其中R₁为n-甲基、n-乙基、n-丁基、n-环丙基甲基或n-壬基。

23.如权利要求21的方法，其中R₁为被-OH、-COOH、CF₃、OCF₃或-C(＝O)N-(Me)₂取代的n-乙基或n-丁基。

24.如权利要求21的方法，其中R₁为：

25.如权利要求19的方法，其中R₁为H，且R₂为任选地被CF₃或杂环取代的直链或支链烷基、链烯基、芳基或醚。

26.如权利要求25的方法，其中R₂为n-壬基基团。

27.如权利要求19的方法，其中化合物选自N-甲基-DNJ、N-丁基-DNJ、N-环丙基甲基-DNJ、N-(2-(N，N-二甲基氨基甲酰基)乙氧基-DNJ、N-4-叔丁基氧羰基-哌啶基甲基-DNJ、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ、N-2-R-四氢呋喃基甲基-DNJ、N-(2-(2，2，2-三氟乙氧基)乙基-DNJ、N-2-甲氧基乙基-DNJ、N-2-乙氧基乙基-DNJ、N-4-三氟甲基苄基-DNJ、N-α-氰基-4-三氟甲基苄基-DNJ、N-4-三氟甲氧基苄基-DNJ、N-4-n-戊氧基苄基-DNJ和N-4-n-丁氧基苄基-DNJ或Cl-壬基DNJ。

28.如权利要求27的方法，其中化合物为N-丁基-去氧野尻霉素。

29.如权利要求19的方法，其中存在DNJ衍生物的Gaa活性与不含DNJ衍生物的Gaa活性的比例为至少1.5倍。

30.如权利要求29的方法，其中存在DNJ衍生物的Gaa活性比不含DNJ衍生物的Gaa活性增加至少5倍。

31.如权利要求19的方法，其中化合物在抑制肠Gaa的IC₅₀值或低于抑制肠Gaa的IC₅₀值的浓度下提高溶酶体的Gaa。

32.如权利要求19的方法，其中有效量为每天约1-300mg。

33.如权利要求32的方法，其中有效量为每天约5-150mg。

34.如权利要求33的方法，其中有效量为每天约5-75mg。

35.如权利要求19的方法，其中1-去氧野尻霉素衍生物以口服剂型施用。

36.如权利要求35的方法，其中口服剂型为片剂或胶囊剂。

37.如权利要求19的方法，其中1-去氧野尻霉素衍生物与α-葡萄糖苷酶的替代酶联合施用。

38.如权利要求19的方法，其中α-葡萄糖苷酶与替代的α-葡萄糖苷酶基因联合施用。