CN100519755C - 发酵方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供改进的发酵过程，包括在乙醇生产过程中的应用。所述改进的发酵过程包括在发酵过程中应用酯酶(例如脂肪酶、磷酸脂酶和角质酶)、漆酶、植酸酶和/或蛋白酶。所述改进的发酵过程还包括加入刺激发酵微生物生长的多种生长刺激物，包括维生素和矿物质。

Description

发酵方法和组合物
相关申请交互参考
本申请请求于2002年9月26日提交的申请号为60/413,730的美国临时申请的优先权和利益，该文献内容在此全文引入作为参考。
发明领域
本申请涉及用于制备发酵产物的酶促方法和组合物，包括用于改进发酵过程中酵母性能的方法和组合物。
发明背景
发酵方法可用于制备各很多种商品，包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸，乙酸，甲叉丁二酸，乳酸，葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素，B12，β-胡萝卜素)；激素，以及难以合成制备的其他化合物。通常，发酵方法还用于食用乙醇(例如，啤酒和葡萄酒)，奶制品(例如，制备酸乳酪和乳酪)，皮革制品和烟草工业。
因此有必要对发酵过程和包括发酵步骤的改良过程作进一步改进。
发明概述
本发明提供了用于制备发酵产物的方法和组合物。本发明提供了用于改进发酵过程中酵母性能的的方法和组合物，包括发酵过程的速度和/或产量。本发明提供了用于制备乙醇的方法和组合物。
本发明的一个方面涉及一种发酵过程，该发酵过程中至少应用一种酯酶。在一个优选实施方案中，本发明包括让发酵中使用的发酵微生物或培养物与至少一种酯酶接触。所述酯酶可以应用于发酵过程中和/或所述酯酶可以应用于发酵之前，例如发酵微生物的增殖过程中。
尽管未限定于于任何一种工作原理，但认为在发酵过程中应用根据本发明的酯酶，可以促进发酵微生物内部和/或外部或发酵微生物细胞膜内脂类组成/浓度改变，从而导致发酵期间发酵微生物溶质向内和/或向外运动的改善，和/或提供更可代谢的能源。例如，如通过转变换发酵底物或发酵培养基的组分，例如将谷类基质中的油类转变成发酵微生物可利用的组分，如不饱和脂肪酸和甘油。
在本发明这方面的一个优选实施方案中，所述至少一种酯酶包括脂肪分解酶，更优选脂肪酶。在本发明这方面的另一个优选实施方案中，所述至少一种酯酶包括角质酶(cutinase)。在另一个优选实施方案中，所述至少一种酯酶包括磷酸脂酶。在另一个优选实施方案中，所述至少一种酯酶选自脂肪酶、角质酶、磷酸脂酶及其组合。
在一个优选实施方案中，本发明发酵过程与液化过程和/或糖化过程结合使用，其中采用另外的酶促活性例如α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性来加工基质，如淀粉底物。
在另一个优选实施方案中，发酵过程用于生产乙醇。根据该优选实施方案，应用所述至少一种酯酶可提高发酵微生物对乙醇的耐受极限，从而改善乙醇产量和/或加快发酵速度。在一个更优选的实施方案中，应用至少一种脂肪分解酶来提高发酵微生物对乙醇的耐受，从而提高乙醇产量。
在另一个优选实施方案中，可将一种或多种其他的酶活性与本发明的酯酶处理结合使用(例如之前、期间或之后)。优选的其他酶包括蛋白酶、植酸酶、木聚糖酶和麦芽糖α-淀粉酶。
本发明另一方面涉及加入发酵微生物生长刺激物，与本申请所述的酶促过程结合使用，以进一步改进发酵过程。优选的生长刺激物包括维生素和矿物质。
本发明另一方面涉及发酵过程，该发酵过程中应用至少一种漆酶。有效剂量的漆酶可在发酵期间应用，和/或在发酵之前例如在发酵微生物增殖期间应用。虽然未限定于任何一种工作原理，但是在发酵过程中通过使用至少一种漆酶，可促进抑制剂的氧化和氧气损耗，因而促进更适于发酵微生物的缺氧环境的生成。
本发明另一个方面涉及一种方法，该方法通过在至少一种蛋白酶存在条件下增殖发酵微生物生产可用于发酵过程的发酵微生物。虽然未限定于任何一种工作原理，但是确实如此：与相同条件但未加蛋白酶情况下增殖的发酵微生物相比，存在有效剂量至少一种蛋白酶存在条件下增殖的发酵微生物，在随后用于发酵过程中时，该发酵微生物的迟滞期(lag time)缩短。在增殖过程中，蛋白酶的作用直接或间接决定将发酵期间对发酵微生物有害或有益的基因分别抑制或表达，从而缩短迟滞期，加快发酵循环。
发明详述
＂发酵”或“发酵过程”指任何发酵过程或任何包括发酵步骤的过程。发酵过程(fermentation process)包括但不限于用于生产下列物质的发酵过程：醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、亚甲基丁二酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)和激素。发酵过程还包括应用于食用(consumable)乙醇工业(例如啤酒和酒剂)、乳品加工业(例如发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业。优选的发酵过程包括乙醇发酵过程，为本领域众所周知。优选的发酵过程为厌氧发酵过程，为本领域众所周知。
＂发酵介质＂或＂发酵培养基＂指进行发酵的环境，其包括发酵底物，即发酵微生物代谢的碳源。可采用例如在发酵过程之前或同步进行的粉碎、液化和糖化过程或其它需要的过程，对发酵介质，包括发酵底物以及用于发酵过程的其他原材料进行加工。因此，发酵介质可以指加入发酵微生物前的介质，例如处于或来自液化或糖化过程的介质，以及含有发酵微生物的介质，例如同步进行糖化和发酵过程(SSF)所用的介质。
发酵介质或发酵底物还可包括脱胚芽的谷类颗粒，优选脱胚(de-germed)的玉米(corn)，即胚乳和焙烤过的玉米(例如经加热处理和爆裂的玉米)或任何其它谷类。谷类颗粒可以经粉碎或以全粒形式用于发酵。
＂发酵微生物＂指适合目的发酵过程的任何微生物。根据本发明适当的发酵微生物能够发酵，即直接或间接地将糖类例如葡萄糖或麦芽糖转变成目的发酵产品。发酵微生物的实例包括真菌生物例如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces spp.)菌株，特别是酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)。商品化酵母包括，例如RedStar/Lesaffre Ethanol Red(购自美国RedStar/Lesaffre)，FALI(购自美国Burns Philp FoodInc.分公司Fleischmann′sYeast)，SUPERSTART(购自Alltech)，GERT STRAND(购自瑞典Gert StrandAB)和FERMIOL(购自DSM Specialties)。
＂酯酶＂，也称羧酸酯水解酶，指作用于酯键的酶，包括根据酶命名法分类于EC3.1.1羧酸酯水解酶类的酶(可访问http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme或参考Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，SanDiego，California，分别发表于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250；1-6和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的增刊1(1993)，增刊2(1994)，增刊3(1995)，增刊4(1997)和增刊5)。酯酶的非限制性实例包括芳基酯酶、三酰甘油酯酶、乙酰酯酶、乙酰胆碱酯酶、胆碱酯酶、茛菪碱酯酶(tropinesterase)、果胶酯酶、甾醇酯酶、叶绿素酶，L-阿拉伯乳糖酶(L-arabinonolactonase)、葡糖酸内酯酶、糖醛酸内酯酶(uronolactonase)、鞣酸酶、棕榈酸视黄酯酶、羟丁酸二聚体水解酶、脂酰甘油脂肪酶、3-氧已二酸烯醇-内酯酶(3-oxoadipate enol-lactonase)、1，4-内酯酶、半乳糖脂肪酶、4-吡哆醇内酯酶、酰基肉毒碱水解酶、氨酰-tRNA水解酶、D-阿拉伯糖内酯酶(D-arabinonolactonase)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、磷酸脂酶Al、6-乙酰葡萄糖脱乙酰基酶、脂蛋白脂肪酶、苯并二氢吡喃酮脂肪酶，柠檬苦素-D-环-内酯酶、类甾醇内酯酶、三乙酸酯内酯酶、放线菌素内酯酶、苔色酸缩酚酸水解酶、头孢菌素-C脱乙酰酶、氯原酸(chlorogenate)水解酶、α-氨基酸酯酶、4-甲基草酰乙酸酯酶、亚甲羧基丁烯醇酶(carboxymethylenebutenolidase)、脱氧柠檬苦素A-环-内酯酶(deoxylimonate A-ring-lactonase)，2-乙酰1-烷基甘油磷酸胆碱酯酶、镰孢氨酸-C鸟氨酸酯酶、芥子酸胆碱酯酶、蜡-酯水解酶、佛波醇-二酯水解酶、磷脂酰肌醇脱乙酰酶、唾液酸-O-乙酰酯酶(sialateO-acetylesterase)、乙酸基丁炔并噻吩脱乙酰基酶(acetoxybutynylbithiophenedeacetylase)、乙酰水杨酸脱乙酰基酶(acetylsalicylatedeacetylase)、甲基伞形乙酸盐脱乙酰酶(amethylumbelliferyl-acetate deacetylase)、2-吡喃-4，6-二羧酸内酯酶、N-乙酰半乳糖胺聚糖脱乙酰基酶、保幼激素酯酶、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸盐酯酶、蛋白-谷氨酸盐甲基酯酶、11-顺式棕榈酸视黄酯水解酶、全反式棕榈酸视黄酯水解酶、L-鼠李糖-1，4-内酯酶、5-(3，4-双乙酰氧基丁炔(but)-1-ynyl)2，2-并噻吩脱乙酰基酶、脂酰乙酯合成酶、木糖1，4-内酯酶、N-乙酰葡糖胺磷脂酰肌醇脱乙酰酶、cetraxate苯甲基酯酶(cetraxatebenzylesterases)、乙酰烷基甘油乙酰水解酶(acetylalkylglycerol acetylhydrolase)和乙酰木糖酯酶。
本发明所用酯酶优选脂肪水解酶，例如脂肪酶(分类为EC31.1.3，EC31.1.23，EC31.1.26)和磷酸脂酶(分类为EC31.1.4和/或EC31.1.32，包括分类于EC31.1.5的磷酸脂酶)。其它的优选酯酶为角质酶(分类于EC31.1.74)。
本发明提供用于生产发酵产品的方法和组合物，其中至少一种酯酶用于发酵过程。酯酶处理可应用于发酵过程的任一阶段。在一个优选的实施方案中，在发酵过程中，例如在发酵起始阶段加入有效剂量的酯酶(例如通过与发酵培养基作用)。在另一个优选的实施方案中，在发酵前，例如在发酵微生物增殖阶段，或液化、糖化或预糖化阶段，加入有效剂量的酯酶。在发酵过程中加入酯酶，例如可提高发酵微生物的乙醇耐受限制，从而通过发酵培养基组分转变来提高该发酵产品的产量(乙醇产量)，例如，将谷类基质中的油类转变成发酵微生物可利用的组分，例如不饱和脂肪酸和甘油。如该实例所阐述，通过根据本发明实施方案的酯酶(例如脂肪酶)处理使乙醇产量显著改善。
任何适当的基质或原料均可用于本发明的发酵过程。通常根据目的发酵产品和采用的过程来选择基质，其为本领域众所周知。适于本发明过程使用的基质实例包括：含淀粉材料例如块茎、根、全粒(whole grains)、玉米、玉米穗(cobs)、小麦、大麦、黑麦、高梁或谷类；含糖原材料例如糖浆、果料、糖、甘蔗或甜菜、马铃薯；含纤维素材料，例如木材或植物残体。适当的基质还包括碳源，具体为为可被发酵微生物代谢的低分子量糖DP1-3，其可通过直接加入发酵介质中供给。
加入有效剂量的酯酶可改善发酵，例如改变发酵微生物内部和/或外部或发酵微生物细胞膜内脂类的组成/浓度，从而导致发酵期间发酵微生物溶质向内和/或向外运动的改善，和/或提供更易代谢的能源(例如，如通过转变发酵底物或发酵培养基组分，例如将谷类基质中的油类转变成对发酵微生物可利用组分如不饱和脂肪酸和甘油)，以提高乙醇产量。有效剂量的酯酶实例包括发酵介质中0.5-1000U/g DS％(干物质百分比)，优选1-400U/g％DS，更优选1-20U/g DS％，例如1-5U/g DS％。此后可采用本领域已知标准方法进一步优化酯酶剂量。
酯酶处理条件(例如pH、温度和处理时间)取决于其应用环境(例如，在粗制淀粉水解过程中使用的酯酶处理，就不同于让淀粉底物糊化的常规淀粉水解过程)。因此选择酯酶时考虑的因素应包括处理期间所采用的条件。例如，粗制淀粉水解加工优选在32.2℃进行64h，起始pH约4.5-5.0。一些情况下下可采用分段温度以减轻对酵母的影响。发酵时间可依据预期的乙醇产量而改变。
酯酶处理还将依发酵使用的酵母的作用而改变，具体为，依酵母遗传学和酵母生理学而改变。因此，酯酶处理的最适条件(例如pH、温度、处理时间、酯酶选择和浓度)依据使用的酵母而变化。例如：尽管念珠菌(Candida)脂肪酶对SUPERSTART酵母(可从Alltech购买)和ETHANOL RED酵母(可从美国Red Star/Lesaffre购买)都有作用，念珠菌脂肪酶对SUPERSTART酵母的作用更强。此外，酯酶处理可能对较少耐受乙醇的酵母有很大作用(即提高酵母的乙醇耐受性)。例如：SUPER START酵母通常比ETHANOL RED酵母较少耐受乙醇。另一方面已知FALI酵母对乙醇相当耐受。因此，针对发酵过程所使用的酵母，可对酯酶处理采用的例如阶段性条件、酯酶浓度和酯酶的选择进行优化。优选在高乙醇浓度即浓度高达22％条件下进行酯酶处理。
在本发明的一个优选实施方案中，酯酶为脂肪分解酶，更优选脂肪酶。此处使用＂脂肪分解酶＂指脂肪酶和磷酸脂酶(包括糖磷酸脂酶(glyso-phospholipases))。脂肪分解酶优选来自微生物，具体为来自细菌、真菌或酵母。使用的脂肪分解酶可来自以下任何来源，包括，例如：犁头霉属(Absida)菌株，具体为Absidia blakesleena和伞枝犁头霉(Absidacorymbifera)；无色杆菌属(Achromobacter)菌株，具体为解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)；产气单孢菌属(Aeromonas)菌株；链格孢属(Alternaria)菌株，具体为甘蓝链格孢(Alternaria brassiciola)；曲霉属(Aspergillus)菌株，具体为黑曲霉(Aspergillus niger)和黄曲霉(Asperillusflavus)；无色杆菌属菌株，具体为解毒无色杆菌；短梗霉属(Aureobasidium)菌株，具体为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)；芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，具体为短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstrearothermophilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；白僵菌属(Beauveria)菌株；索丝菌属(Brochothrix)菌株，具体为热杀索丝菌(Brochothrixthermosohata)；念珠菌属(Candida)菌株，具体为Candidacylindracea(Brochothrix)(皱褶假丝酵母(Candida rugosa))、Candidaparalipolytica(Candida)和Candida antarctica；色杆菌属(Chromobacter)菌株，具体为粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)；鬼伞属(Coprinus)菌株，具体为Coprinus cinerius；镰孢菌属(Fusarium)菌株，具体为尖芽孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、茄病镰孢菌(Fusarium solani)、豌豆茄属镰孢菌(Fusarium solanipisi)和大刀玫瑰色镰孢菌(Fusarium roseum culmorum)；地霉属(Geotricum)菌株，具体为潘氏地霉(Geotricum penicillatum)；汉逊氏酵母属(Hansenula)菌株，具体为异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)；腐殖霉属(Humicola)菌株，具体为Humicola brevispora、Humicola brevis var、Humicola brevis var.thermoidea和Humicola insolens；Hyphozyma菌株；乳杆菌属(Lactobacillus)菌株，具体为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)；绿僵菌属(Metarhizium)菌株；毛霉属(Mucor)菌株；拟青霉属(Paecilomyces)菌株；青霉属(penicillium)菌株，具体为圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicillumcrustosum)和扩展青霉(Penicillium expansum)；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，具体为绿浓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、假单胞菌属产碱杆菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(syn.洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、荧光极毛杆菌(Pseudomonasfluorescens)，莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)，嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、Pseudomonas mephitica lipolytica、假单胞菌属产碱杆菌(Pseudomonasalcaligenes)、植物假单胞菌(Pseudomonas plantari)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoal caligenes)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和Pseudomonas wisconsinensi；丝核菌属菌株(Rhizoctonia)，具体为茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)；毛霉属(Rhizomucor)菌株，具体为Rhizomacor miehei；根霉菌属(Rhizopus)菌株，具体为日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)和结节根霉(Rhizopus nodosus)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium)菌株，具体为念珠状红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)；蔷微色酵母属(Rhodotorula)菌株，具体为粘红酵母(Rhodotorula glutinis)；掷孢酵母属(Sporobolomyces)菌株，具体为Sporobolomyces shibatanus；高温霉属(Thermomyces)菌株，具体为绵状高温霉(Thermomyces lanuginosus)(以前的Humicola lanuginosa)，Thiarosporella菌株，具体为Thiarosporella phaseolina；木霉属(Trichoderma)菌株，具体为Trichoderma harzianum、Trichoderma reesei；和/或轮枝孢菌属(Verticillium)菌株。
在一个优选的实施方案中，根据本发明所用的脂肪分解酶来自曲霉属菌株、无色杆菌属菌株、芽胞杆菌属菌株、念珠菌属菌株、色杆菌属菌株、镰孢属菌株、腐殖霉属菌株、Hyphozyma菌株、假单胞菌属菌株、毛霉属菌株、根霉菌属菌株、或高温霉属菌株。
在更多的优选实施方案中，脂肪分解酶为脂肪酶。此处可利于脂肪酶例如其能使发酵介质(包括发酵酵母)例如谷类基质中的甘油三酯油脂和脂肪的结构和组成发生改变。脂肪酶催化各种类型的甘油三酯转化，例如水解、酯化和酯基转移。适当的脂肪酶包括酸性、中性和碱性脂肪酶，为本领域众所周知，虽然在低浓度下，酸性脂肪酶(例如，如脂肪酶G AMANO 50，购自Amano)似乎比中性或碱性脂肪酶更为有效。本发明使用的脂肪酶优选包括Candida antarcitca脂肪酶和Candida cylindracea脂肪酶。更优选脂肪酶为纯化的脂肪酶例如Candida antarcitca脂肪酶(脂肪酶A)，Candida antarcitca脂肪酶(脂肪酶B)、Candida cylindracea脂肪酶，和沙门氏柏干酪青霉菌(Penicillium Camembertii)脂肪酶。
优选商品化脂肪酶包括LIPOLASE和LIPEX(购自Novozymes A/S)和GAMANO50(购自Amano)。
优选在发酵介质中加入脂肪酶的剂量大约为0.5-1000LU/g DS％，优选1-400LU/g DS，更优选1-20LU/g DS％，例如1-10LU/g DS％和1-5LU/gDS％。
在本发明的另一个优选实施方案中，至少一种酯酶为角质酶(cutinase)。角质酶是能够分解角质的酶。角质酶可从任何来源获得。在一个优选实施方案中，角质酶来自曲霉属菌株，具体为米曲霉(Aspergillus oryzae)；链格孢属(Alternaria)菌株，具体为甘蓝链格孢菌(Alternaria brassiciola)；镰孢菌属菌株，具体为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、豌豆茄属镰孢菌(Fusarium solanipisi)、大刀玫瑰色镰孢或接骨木玫瑰色镰孢(Fusarium roseum sambucium)；长入孢属(Helminthosporum)菌株，具体为蒜头长蠕孢(Helminthosporumsativum)；腐殖霉属菌株，具体为Humicola insolens，假单胞菌属菌株，具体为门多萨假单胞菌或腐臭假单胞菌；丝核菌属菌株，具体为茄属丝核菌；链霉菌属菌株，具体为疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)；或ulocladium菌株，具体为ulocladium consortiale。在一个最优选的实施方案中，角质酶来自Humicola insolens菌株，具体为Humicola insolens菌株DSM1800。Humicola insolens角质酶的描述见WO 96/13580，该文献在此引入作为参考。优选的角质酶包括JC492(购自Novozymes A/S)。
加入发酵介质中的角质酶的剂量优选为约0.5-1000U/g DS％，优选1-400U/g DS％，例如40-400U/g DS％，更优选1-20U/g DS％，例如1-10U/gDS％和1-5U/g DS％。
在另一个优选实施方案中，所述至少一种酯酶为磷脂酶。磷脂酶为具有针对磷脂活性的酶。磷脂例如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由酯化甘油组成，酯化部位为外部(sn-1)和中间(sn-2)的2个脂肪酸，第3个酯化部位为磷酸；磷酸可依次被酯化成氨基醇。磷脂酶为参与磷脂水解的酶。已鉴别出若干种类的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，其水解一个脂酰基(分别在sn-1和sn-2位置)形成溶血磷酸脂；溶血磷脂酶(磷脂酶B)可水解溶血磷脂中剩余的脂酰基。磷脂酶C和磷脂酶D(磷酸二脂酶)分别释放二酰基甘油或磷脂酸。
术语磷脂酶包括具有磷脂酶活性的酶，例如磷脂酶A(A1或A2)、磷脂酶B活性、磷脂酶C活性或磷脂酶D活性。
本申请中使用的术语＂磷脂酶A＂与本发明所述的酶结合在一起，意在将所有具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶都包括在内。磷脂酶活性可由同时具有额外活性的酶，例如，如具有磷脂酶活性的脂肪酶提供。磷脂酶活性可来自例如具有额外的磷脂酶副(side)活性的脂肪酶。在本发明另外的实施方案中，磷脂酶活性由基本上仅具有磷脂酶活性的酶提供，其中磷脂酶酶活性不属副活性。
磷脂酶可来自任何来源，例如动物来源(例如，如哺乳动物)，例如来自胰腺(例如牛或猪的胰腺)，或蛇毒或蜂毒。或者，磷脂酶也可从微生物来源获得，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如曲霉菌属或种，例如黑色曲霉；网柄菌属(Dictyostelium)，例如D.discoideum；毛霉属，例如爪哇毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)、细胞毛霉(M.Subtilissimus)；链孢霉属(Neurospora)，例如粗糙链孢霉(N.crassa)；Rhizomucor属，例如R.pusillus；根霉菌属(Rhizopus)，例如无根根霉(R.arrhizus)，日本根霉，葡枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，例如大豆核盘菌(S.libertiana)；发癣菌属(Trichophyton)，例如深红色发癣菌(T.rubrum)；Whetzelinia，例如W.sclerotiorum；芽胞杆菌属，例如巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、枯草芽胞杆菌；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如氟氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacaeEdwardsiella)、E.tarda；欧文氏菌属(Erwinnia)，例如草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌属(Proteus)，例如普通变形杆菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，例如斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如乳红化沙雷氏菌(S.liguefasciens、粘质沙雷氏菌(S.marcascens)；志贺氏菌属(Shigella)，例如氟氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，例如紫红链霉菌(S.violeceoruber)，耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolititca)。因此，磷脂酶可来自真菌，例如来自核菌纲(Pyrenomycetes)，例如镰孢菌属，例如大刀镰孢、异孢镰孢(F.heterosporum)、茄属镰孢菌株(F.solani)，或尖孢镰孢菌株(F.oxysporum)。磷脂酶还可来自曲霉属的丝状真菌属，例如泡盛曲霉菌株(Aspergillus awamori)、臭曲霉(A.foetidus)、日本曲霉(A.japonicus)、黑曲霉或米曲霉。优选的商品化磷脂酶包括LECITASE和LECITASE ULTRA(可从Novozymes A/S购买)。
在发酵介质中优选加入磷脂酶的量约为0.5-1000PLA/U/g DS％，优选1-400PLA/U/g DS％，更优选1-20PLA/U/g DS％，例如1-10LU/g DS％。
在另一个优选实施方案中，所述至少一种酯酶选自脂肪酶、角质酶、磷脂酶。在另一个优选实施方案中，组合使用酯酶，例如(1)脂肪酶和角质酶；(2)脂肪酶和磷脂酶；(3)磷脂酶和角质酶；和(4)脂肪酶，磷脂酶和角质酶。
在另一个优选实施方案中，可将一种或多种其他的酶活性与本发明的酯酶处理组合使用(例如之前、期间或之后)。除组合使用通常用于加工淀粉的酯酶外，例如α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，优选其它的酶还包括蛋白酶，植酸酶，木聚糖酶，纤维素酶，麦芽糖α-淀粉酶和β-淀粉酶。更优选其他酶为蛋白酶、植酸酶、木聚糖酶、麦芽糖α-淀粉酶和β-淀粉酶。
在一个优选实施方案中，将酯酶处理和植酸酶组合使用。根据该实施方案，可以利用植酸酶，例如促进存在于培养基中的植酸(肌醇六磷酸)或其任何盐类(植酸盐)释放无机磷酸。植酸酶可在发酵期间加入，或在发酵前例如在增殖期间或发酵前的某一阶段，例如，液化和/或糖化阶段加入。加入植酸酶，例如可改善酵母必需矿物质的生物利用度，如PCT申请WO01/62947所述，该文献内容在此引入作为参考。
＂植酸酶＂是一种能够影响使植酸(肌醇六磷酸)或其任何盐类(植酸盐)释放无机磷酸的酶。植酸酶可以根据其起始水解步骤的特异性，即第一个被水解的磷酸酯基团进行分类。本发明所用植酸酶可具有任何特异性，例如3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)，6-植酸酶(例如E.C.3.1.3.26)或5-植酸酶(无E.C.编号)特异性。
植酸酶可来自植物或微生物，例如细菌或真菌，例如酵母或丝状真菌。植物植酸酶可来自小麦麸皮、玉米、大豆或百合花粉。适当的植物植酸酶的描述见Thomlinson et al，Biochemistry，1(1962)，166-171；Barrientos等，plant.Physiol.，106(1994)，1489-1495；WO98/05785；WO 98/20139。
细菌植酸酶可来自芽胞杆菌属、假单胞菌属或埃希氏菌属，优选枯草杆菌或大肠杆菌种系。适当的细菌植酸酶的描述见Paver和Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology 151：1102-1108；Cosgrove，1970，AustralianJournal of Biological Sciences 23：1207-1220；Greiner et al，Arch.Biochem.Biophys.，303，107-113，1993；WO98/06856；WO97/33976；WO97/48812。
酵母植酸酶或肌醇单磷酸酶可来自糖酵母属(Saccharomyces)或许旺氏酵母属(Schwanniomyces)，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidantalis)。适当的酵母植酸酶的描述见Nayiniet al，1984，Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17：24-26；Wodzinskietal，Adv.Appl.Microbiol.，42，263-303；AU-A-24840/95；
丝状真菌植酸酶可来自真菌门子囊菌(Ascomycota)(子囊菌纲(ascomycetes))或担子菌门(Basidiomycota)，例如曲霉属、高温霉属(也称作腐殖霉属)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Manascus、青霉属、隔孢革菌属(Peniophora)、田头霉属(Agrocybe)、桩菇菌属(Paxillus)，或栓菌属(Trametes)，优选土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉、黑曲霉泡盛曲霉变种(var.Awamori)、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、米曲霉，T.lanuginosus(也称为H.lanuginosa)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)，Peniophora lycii、平田头菇(Agrocybe pediade)、Manascus anka、Paxilus involtus，或绒毛栓菌(Trametes pubescens)。适当的真菌植酸酶的描述见Yamada et al，1986，Agric.Biol.Chem.322：1275-1282；Piddington et al，1993，Gene 133：55-62；EP684，313；EP0 420 358；EP 0684 313；WO98/28408；WO98/28409；JP7-67635；WO98/44125；WO97/38096；WO98/13480。
经修饰的植酸酶或植酸酶变体可利用本领域已知方法获得，具体为利用公开于EP897010；EP897985；WO99/49022；WO99/48330的方法获得。商品化植酸酶包括BIO-FEEDPHYTASE TM，PHYTASENOVO CT或L(NovozymesA/S)，或NATUPHOSTM NG 5000(DSM)。
优选加入植酸酶剂量为0.005-250FYT/g DS％，优选10-100FYT/gDS％。优选适当的植酸酶剂量为0.005-25FYT/g DS％，更优选0.01-10FYT/g，例如0.1-1FYT/g DS％。此处植酸酶活性用FYT单位定义，一个FYT指在下列条件下每分钟释放1微摩尔无机ortho-磷酸盐：pH5.5；温度37℃；底物：浓度为0.0050摩尔/升的植酸钠(C6H6O24P6Na12)。
在另一个优选实施方案中，酯酶处理与蛋白酶组合使用。蛋白酶可用来，例如消化蛋白质生成游离氨基氮(FAN)。这种游离氨基酸可作为酵母的营养源，从而促进酵母的生长并因此提高乙醇产量。
此外，虽然酯酶处理引起甘油浓度增加可提高酵母的乙醇耐受并提高乙醇产量，但甘油浓度过高可能会对酵母性能产生不利影响。因此在这种情况下，可采用蛋白酶处理将甘油浓度降至或控制在优选对发酵微生物所期望的控制范围内。
蛋白酶已为本领域熟知，指的是能催化肽键裂解的酶。适当的蛋白酶包括真菌和细菌蛋白酶。优选蛋白酶为酸性蛋白酶，即蛋白酶的特征在于能够在低于pH7的酸性条件下水解蛋白。适当的酸性真菌蛋白酶包括来自曲霉属、毛霉属、根霉菌属、念珠菌属、草盖菌属(Coriolus)、疫病霉属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(zrpex)、青霉属、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别倾向使用来自黑曲霉的蛋白酶(见，例如，Koaze et al，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，Aspergillussaitoi(见，例如Yoshida(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(Hayashidaet al，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO95/02044)，或米曲霉；来自微小毛霉(Mucor pusillus)或米赫毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
商品化的蛋白酶包括GC106和SPEZYME FAN(可从Genencor购买)。适当的细菌蛋白酶，尽管不是酸性蛋白酶，包括商品化产品
Figure C03825398D00151
和
Figure C03825398D00152
(可从Novozymes A/S购买)。
蛋白酶优选为天冬氨酸蛋白酶，例如描述于蛋白水解酶手册，A.J.Barrett编辑，N.D.Rawlings and J.F.Woessner，Academic Press，SanDiego，1998，Chapter 270。适当的天冬氨酸蛋白酶实例包括例如，R.M.et al发表于Gene，96，313(1990))；(R.M.et al，Gene125，195-198(1993))；和GomietalBiosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)，在此引入作为参考。
优选可加入蛋白酶的量为10-7-10-5克活性蛋白酶蛋白/克DS％，尤其优选10-7-5×10-6克活性蛋白酶蛋白/克DS％。
在另一个优选实施方案中，将酯酶处理与生麦芽糖α-淀粉酶组合使用。＂生麦芽糖α-淀粉酶＂(葡萄糖1，4-Δ-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。生麦芽糖α-淀粉酶的实例包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌(嗜热脂肪芽孢杆菌)菌株NCIB 11837的生麦芽糖α-淀粉酶。生麦芽糖α-淀粉酶的描述见美国专利US4,598,048、US4,604,355和US6,162,628，在此引用作为参考。商品化的生麦芽糖淀粉酶有MALTOGENASETM(可从Novozymes A/S购买)。优选地，将生麦芽糖α-淀粉酶用于粗制淀粉水解过程促进退减(retrograded)淀粉的生成。优选在液化过程中酯酶与麦芽糖α-淀粉酶结合使用。优选生麦芽糖α-淀粉酶的加入剂量为0.02-1.0g/DS％。
在另一个优选实施方案中，酯酶处理与β-淀粉酶结合使用。β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)是外切(exo-acting)麦芽糖淀粉酶的传统命名，其催化直链淀粉、支链淀粉和葡萄糖相关聚合物中1，4-α-糖苷键的水解。以递进方式依次从非还原链端除去麦芽糖单元，直至该分子被分解，或就支链淀粉而言直至到达分支点。所释放的麦芽糖具有β异头构型，因此命名为β-淀粉酶。
已经从多种植物和微生物中分离出β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃-65℃的最适温度和4.5-7的最适pH值。其它的β-淀粉酶实例包括描述于美国专利号5,688,684的β-淀粉酶。商品化的β-淀粉酶包括NOVOZYM WBA(可从Novozymes A/S购买)、SPEZYMETM 1500和OPTIMALT(可从美国Genencor Int.购买)。
在另一个优选实施方案中，酯酶处理和木聚糖酶组合使用。木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)活性可从任何适当的来源获得，包括真菌和细菌生物体，例如曲霉属、Disporotrichum、青霉属、链孢霉属(Neurospora)、镰孢属和木霉属(Trichoderma)。优选包含木聚糖酶的商品化制剂包括
Figure C03825398D00161
BIOFEED 
Figure C03825398D00162
(Novozymes A/S)和
Figure C03825398D00164
(Genencor Int.)。
在另一个优选的实施方案中，处理酯酶和纤维素酶组合使用。根据本发明所用的纤维素酶活性可从任何适当的来源获得，优选纤维素酶来源于微生物，例如可来源于丝状真菌菌株(例如曲霉属、木霉属、腐殖霉属、镰孢属)。可用的包含纤维素酶的商品化制剂包括
Figure C03825398D00165
Figure C03825398D00166
和
Figure C03825398D00167
(Novozymes A/S)，LAMINEXTM和
Figure C03825398D00168
 CP(Genenco Int.)和
Figure C03825398D00169
 7069 W(来自
Figure C03825398D0016161133QIETU
 GmbH)。
本申请所述的发酵过程优选与液化或糖化过程结合使用。任何液化或糖化均可用于本发明的发酵过程。根据本发明所述与发酵过程预组合。根据本发明，糖化和液化可与发酵过程同时或分开进行。在本发明一个优选实施方案中，液化、糖化和发酵过程同时进行。
＂液化＂是粉碎(完整)的谷类原材料被分解(水解)成麦芽糖糊精(糊精)的过程。液化通常要对浆料进行三步热浆化过程。在60-95℃，优选80-85℃，加热浆料并加入酶启动液化(稀化)。然后在95-140℃，优选105-125℃温度下喷烤(jet-cooked)浆料，使浆料彻底糊化。然后将浆料冷却至60-95℃，加入更多的酶以结束水解(二级液化)。液化过程通常在pH4.5-6.5，具体为pH5-6条件下进行。粉碎并液化的全粒称为麦芽糖糊精(mash)。
液化过程通常由α-淀粉酶完成。优选α-淀粉酶来源于真菌或细菌。更优选α-淀粉酶为芽胞杆菌α-淀粉酶，例如来自菌株地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌。其它α-淀粉酶包括来自芽胞杆菌种的菌株NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM9375的α-淀粉酶，所有这些酶的详细描述见WO95/26397，以及Tsukamoto et al，Biochemical andBiophysical Research Communications，151(1988)，pp.25-31一文中描述的α-淀粉酶。其它α-淀粉酶的变体和杂化物的描述见WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467。其它α-淀粉酶包括来自曲霉属菌株的α-淀粉酶，例如米曲霉和黑曲霉α-淀粉酶。
在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶。术语＂酸性α-淀粉酶＂指在pH 3.0-7.0。优选pH3.5-6.0，更优选pH4.0-5.0条件下，加入有效剂量的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)具有活性。任何适当的酸性α-淀粉酶均可用于本发明。
在一个优选实施方案中，酸性α-淀粉酶为真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。本发明所用酸性α-淀粉酶优选来自菌株地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌。更优选酸性α-淀粉酶为真菌酸性α淀粉酶，例如SP288(可从Novozymes购买)。
优选的包含α-淀粉酶的商品组合物包括MYCOLASE(Gist Brocades)、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X和SANTMSUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASE L-40,000，DEX-LOTM、SPEYME FRED、SPEZYMETM AA和SPEZYMETM DELTAAA(Genencornt.)。
可加入α-淀粉酶的剂量为本领域众所周知。当按AAU单位计量时，优选酸性α-淀粉酶的活性为5-500000AAU/kg DS、500-50000AAU/kg DS，更优选100-10000AAU/kg DS，例如500-1000AAU/kg DS。优选加入真菌酸性α-淀粉酶10-10000AFAU/kg，500-2500AFAU/kg DS，更优选100-1000AFAU/kg DS，例如大约500AFAU/kg DS。
＂糖化＂是把麦芽糖糊精(例如由液化过程产生)变成可被发酵生物例如酵母代谢的低分子量糖DP1-3(例如碳源)。糖化过程为本领域众所周知，通常由葡糖淀粉酶酶解完成。作为选择或附加，可使用α-葡萄糖苷酶或酸性α-淀粉酶。整个糖化过程可持续约24-72小时，且通常在大约30-65摄氏温度，pH4-5，通常约pH4.5条件下进行。然而，通常优选执行预糖化步骤，其持续约40-90分钟，温度30-65℃，通常约60℃，随后在发酵期间的同步糖化和发酵过程(SSF)中进行彻底糖化。
糖化过程所用葡糖淀粉酶可从任何适当来源获得，例如来自微生物植物。优选的葡萄糖淀粉酶来自真菌或细菌，选自曲霉属葡萄糖淀粉酶，具体为黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel et al(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，例如公开于WO92/00381和WO00/04136；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或其片断。
其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强其热稳定性的变体，例如G137A和G139A(Chen et al(1996)，Prot Engng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chenet al(1995)，Prot Engng.8，575-582)；N182(Chen et al(1994)，Biochem J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobeet al(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；以及在适当位置引入Pro残基的A435和S436(Liet al(1997)，ProteinEngng.10，1199-1204。其它葡糖淀粉酶包括踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，具体为来自Talaromyces emersonii(WO99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利号Re.32，153)、Talaromyces duponti、Talaromycesthermophilus(美国专利号4,587,215)。细菌葡糖淀粉酶倾向考虑包括来自梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，具体为C.thermoamylolyticum(EP135，138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。
包含葡糖淀粉酶的商品化组合物包括AMG200L；AMG300L；SANTTMSUPER、SAN EXTRA L、SPIRIZYME PLUS和AMGTM(来自Novozymes A/S)；AMIGASE和AMIGASE PLUS(来自DSM)；OPTIDEXTM 300，G-ZYMETMG900，G-ZYMETTM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
在一个实施方案中，可加入葡糖淀粉酶的剂量为0.02-2AGU/g DS，优选0.1-1 AGU/g DS，例如0.2AGU/g DS。
用于生产乙醇最普遍的方法是同步进行糖化和发酵(SSF)过程，其中不经过糖化保温阶段，这意味着发酵生物例如酵母和酶将被一起加入。在SSF过程中，通常在发酵前引入预糖化步骤，在50℃以上进行。
更优选液化、糖化或发酵过程同步进行，即液化-糖化-发酵(LSF)过程作为单一的酶促过程，其中液化、糖化和发酵过程均在一个过程内完成，换言之，所有用于液化、糖化和发酵的酶(或可替代的或其它的非酶促试剂)和酵母，均在同一工序内加入，更优选在同一工序内同时加入。优选的LSF过程条件包括温度约26-40℃，优选约32℃，pH约4-8，优选pH约为pH5，过程时间约48-72小时，优选约72小时。
优选LSF过程或单一酶促过程为粗制淀粉水解(RSH)过程，更优选用于醇类例如乙醇的生产。＂粗制淀粉水解＂过程(RSH)不同于传统的淀粉处理过程，其中用于乙醇发酵过程的未煮过(uncooked)的粗制淀粉也指颗粒状淀粉。此处所用术语＂颗粒状淀粉＂指未煮过的粗制淀粉，即处于天然状态例如谷物、块茎或谷粒中的淀粉。淀粉在植物细胞内形成不溶于水的微小颗粒。置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀。在温度高至50-75℃时膨胀是可逆的。然而，更高的温度开始产生不可逆的膨胀，称之为糊化(gelatinization)。
术语＂起始糊化温度＂指淀粉开始糊化的最低温度。在水中加热淀粉，于50-75℃开始糊化；确切的糊化温度取决于特定的淀粉，熟练的技术人员可轻易地确定该温度。例如，起始糊化温度可能依植物种属、依植物种属的特定种类以及生长条件而改变。在本发明背景下，给定淀粉的起始糊化温度，为使用Gorinstein.S.和Lii.C.所述方法Starch/
Figure C03825398D0019171454QIETU
Vol.44(12)pp.461-466(1992)，淀粉颗粒双折射(birefringence)损失5％时的温度。
根据一个优选的实施方案，优选酯酶与淀粉酶和/或葡糖淀粉酶结合使用，以提高粗制淀粉过程中的乙醇产量。虽然未限定于任何一种工作原理，但普遍认为酯酶处理可通过下列一种或多种机制改善粗制淀粉水解过程：
a)由酯酶-生成的外源性不饱和脂肪酸补养酵母。例如：在玉米发酵中，酯酶例如脂肪酶，可通过将玉米油转换成不饱和脂肪酸，促进酵母的增殖和性能。
b)通过酯酶-生成的外源性不饱和脂肪酸抑制酯类的合成。供给酵母以外源性不饱和脂肪酸还具有另外的优势，因为外源性不饱和脂肪酸可抑制酵母的醇乙酰基转移酶，从而抑制乙酯合成，因此不饱和脂肪酸可增加乙醇产量。而且，脂肪酸例如在粗制淀粉水解过程生成的玉米来源的脂肪酸，也是很有价值的副产品。亚油酸，例如可作为维生素F和一类必需脂肪酸组份，α-亚油酸可被人体转换成具有许多重要调节功能的Ω-3脂肪酸。
c)促进淀粉释放。在粗制淀粉水解时，可使用酯酶例如脂肪酶和磷脂酶，通过作用于淀粉质体膜和淀粉脂类复合物而促进淀粉的释放。
d)甘油形成/浓缩。从葡萄糖生成乙醇是氧化还原中和过程，其中以将碳水化合物转化成乙醇为代价，生成甘油维持酵母的氧化还原平衡。作为酵母增殖的结果，大多数甘油在发酵早期生成，几乎所有NADH是在从氨和葡萄糖从头合成氨基酸时形成的。可采用酯酶处理以增加甘油浓度，这对酵母的乙醇耐受产生有益的影响。但如果甘油浓度过高，则可加入蛋白酶或其它适当的甘油还原剂以降低甘油浓度。
e)游离脂肪酸可起到泡沫破泡剂的作用。游离脂肪酸的存在与泡沫不稳定性有关，酯酶处理也可减少发酵过程中泡沫的形成。
在一个优选实施方案中，本发明涉及使用葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶、酵母和至少一种酯酶，在低于颗粒状淀粉起始糊化温度的温度下，处理颗粒状淀粉浆料。优选酵母为乙醇红(Ethanol Red)酵母。淀粉酶优选酸性α-淀粉酶，更优选真菌酸性α-淀粉酶，例如SP288(来自Novozymes)
在一个更优选的实施方案中，粗制淀粉水解过程需要在低于颗粒状淀粉起始糊化温度0-20℃的条件下，使用葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶，对颗粒状淀粉浆料进行处理，然后在10-35℃温度下用葡糖淀粉酶和/或α淀粉酶，酵母和至少一种酯酶处理浆料。
在另一个优选实施方案中，该过程需要下列连续步骤：(a)在低于颗粒状淀粉起始糊化温度0-20℃温度下，用酸性α-淀粉酶和葡糖淀粉酶处理颗粒状淀粉浆料，优选时间为5分钟-12小时，(b)在10-35℃温度下，用酸性α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酵母和至少一种酯酶处理浆料，优选时间为20-250小时，以生成乙醇。
在RSH过程中，可将其它的酶和发酵刺激物与酯酶处理结合使用。优选其它的酶选自植酸酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维素酶、麦芽糖α-淀粉酶及其组合。在RSH过程中存在大量的植酸。因此在一个优选实施方案中，如前所述，使用植酸酶可以促进存在于培养基中的植酸(肌醇六磷酸)(myo-inositol hexakisphosphate)或其任何盐类(植酸盐)释放无机磷酸。
在另一个优选实施方案中，在RSH过程中麦芽糖α-淀粉酶与酯酶处理结合使用。
本申请所述的发酵过程和组合物优选应用于醇类生产过程(例如，如用作燃料或燃料添加剂的乙醇)，更优选使用粗制淀粉水解过程的醇类生产过程。本申请所述的过程例如可提高乙醇生产的速度和/或产量。加入有效剂量的至少一种酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶、角质酶或其组合)，可提高发酵微生物的乙醇耐受性，由此通过将组分例如谷类基质中的油类组分转变成发酵微生物可利用组分，提高发酵产品中乙醇的产量。如实施方案中所阐述，根据本发明的酯酶处理可促使乙醇产量增加。
乙醇生产过程通常包括以下步骤：粉碎、液化、糖化、发酵和蒸馏。在乙醇及其他的基于淀粉的产品生产中，需要粉碎原材料例如全粒，优选谷粒，以便打破结构容许进一步加工。根据本发明优选两种方法：湿法粉碎和干法粉碎(dry milling)。优选乙醇生产中采用干法粉碎，其中将整个籽粒磨碎应用于过程其余部分。也可采用湿法粉碎，湿法粉碎可使胚芽(germ)和粗粉(淀粉颗粒和蛋白)得到较好的分离，除少数情况外湿法粉碎用于平行生产糖浆(syrup)。干湿粉碎法均为本领域众所周知。
在乙醇生产中，发酵生物优选酵母，其应用于醪液(mash)。优选酵母来源于酵母菌spp.，更优选来自酿酒酵母。在优选实施方案中，向醪液中加入酵母，发酵持续24-96小时，例如通常35-60小时。在优选实施方案中，温度通常为26-34℃，具体为约32℃，pH值通常为pH3-6，优选pH4-5左右。优选加入酵母细胞数为105-1012，优选107-1010，具体为每毫升发酵肉汤活酵母计数5×107。在乙醇生成期，优选酵母细胞计数应在107-1010，具体为在2×108左右。关于使用酵母发酵的更多指导可参见，例如＂醇类教程＂(Editors K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall，诺丁汉大学出版社，英国1999)，在此引用作为参考。
发酵后，可蒸馏醪液以提取醇类产物(乙醇)。当根据本发明过程获得的终产物为乙醇时，其可用作例如燃料用乙醇；饮用乙醇，即可饮用酒精；或工业用乙醇。
此处涉及的酯酶及其它的酶可来自任何适当来源，包括来自细菌、真菌、酵母或哺乳动物。术语＂来源＂即指该酶可以从其天然存在的生物体中分离出来，即其氨基酸序列测定与天然酶一致。所述术语＂来源＂也指酶可由宿主生物体重组产生，重组生成的酶与天然酶的氨基酸序列相一致同一性或氨基酸序列有所改变，例如具有一个或多个氨基酸缺失，插入和/或替换，即重组生成的酶为突变体和/天然氨基酸序列的片断，或通过本领域已知的核酸改组方法生成的酶。在该意义上天然的酶包括在天然变体范围内。此外，所述术语＂来源＂包括通过合成例如肽合成制备的酶。术语＂来源＂还包括在体内或体外经过修饰例如糖基化、磷酸化或其它化学修饰的酶。本文术语＂获得＂指具有与天然酶氨基酸相同序列的酶。该术语包括从其天然存在的生物体分离的酶，或从重组表达该酶的同种或不同种类的生物体中分离的酶，或通过合成例如肽合成制备的酶。就重组生成的酶而言，术语＂获得＂和＂来源＂指的是该酶本身而非生成该酶的宿主生物体的同一性。
酶也可以纯化。用于此处的术语＂纯化＂包括使酶和来自其生物体来源的其它组份分开。用于此处的术语＂纯化＂包括使酶与获得该酶的天然生物体分开。酶可以纯化至仅有少量的其它蛋白存在。表述＂其它蛋白＂具体为指其它的酶类。此处所用术语＂纯化＂也指除去其它组分，具体为存在于本发明酶的来源细胞中的其它蛋白，更具体为为其它的酶。酶可以是＂基本纯的＂，即与生成该酶的有机体例如生成重组酶的宿主生物的其它组份分开。在优选实施方案中，酶的纯度至少为75％(w/w)，更优选纯度至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在另一个优选实施方案中，酶的纯度为100％。
用于本发明的酶可采用适合此处描述方法的任何一种形式(组合物)，例如，如采用干粉或粒化、无粉尘粒化、液体、稳定液体或受保护酶的形式。粒化可通过例如，如公开于美国专利号4,106,991和美国4,661,452所述生成，并且可选择性地采用本领域已知方法包被。可根据已制定方法通过例如加入稳定剂，例如糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有机酸来稳定液体酶制剂。受保护酶可根据公开于EP238,216的方法制备。
当与使用其它酶的过程或处理结合应用时，例如淀粉酶和葡糖淀粉酶用于液化和/或糖化过程，优选酯酶组合物不抑制其它的酶，例如酯酶组合物优选不含或仅含微量的钙结合复合物。同样地，优选酯酶组合物不抑制发酵过程，例如优选酯酶组合物不含或仅含微量的甘油。
根据另一个优选实施方案，发酵刺激物可与本申请所述的任何酶促过程结合使用以进一步改善发酵过程，具体为，改善发酵微生物的性能，例如提高速度和乙醇产量。＂发酵刺激物＂指发酵微生物，具体为酵母的生长刺激物。优选发酵刺激物包括维生素和矿物质。维生素实例包括多种维生素剂(multivitamin)、生物素、泛酸(pantothenate)、烟酸、内消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和A、B、C、D、E族维生素。参见，例如，Alfenore et al.，Improving ethanol production and viability ofSaccharomy cescerevisia by a vitamin feeding strategy duringfed-batchprocess，＂Springer-Verlag(2002)，在此引用作为参考。矿物质实例包括可提供营养的无机物和无机盐，包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
本发明另一方面涉及发酵过程，其发酵过程中至少应用一种漆酶或漆酶相关的酶。可在发酵期间应用有效剂量的漆酶，和/或在发酵之前例如，在发酵生物增殖期间应用有效剂量的漆酶。
在本发明文本中，漆酶包括：任何酶分类(EC1.10.3.2)所包含的漆酶、任何酶分类(EC1.10.3.1)所包含的儿茶酚氧化酶、任何酶分类(EC1.3.3.5)所包含的胆红素氧化酶或酶分类(EC1.14.18.1)所包含的单酚单加氧酶和任何其它漆酶相关酶。
上述酶可来自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)，适当的实例包括来自下列菌属的漆酶：曲霉属；链孢霉属，例如粗糙链孢霉；束柄霉属(Podospora)；萄萄孢属(Botrytis)；金钱菌属(Collybia)；层孔菌属(Fomes)；香菇属(Lentinus)；北风菌属(Pleurotus)；栓菌属(Trametes)，例如T.villosa和T.versicolor；丝核菌属(Rhizoctonia)，例如茄属丝核菌(R.solani)；Coprinus，例如C.cinereus、C.comatus，C.friesii和C.plicatilis；Psathyrella，例如P.condelleana；Panaeolus，例如P.papilionaceus；毁丝霉属(Myceliophthora)，例如嗜热毁丝霉(M.thermophila)；Schytalidium，例如S.thermophilum；多孔菌属(Polyporus)，例如P.pinsitus；密孔菌属(Pycnoporus)，例如朱红密孔菌(P.cinnabarinus)；射脉菌属(Phlebia)，例如辐射射脉菌(P.radita)(WO92/01046)，或草盖菌属(Coriolus)，例如C.hirsutus(JP 2-238885)。
优选来自下列菌属的漆酶：Coprins、毁丝霉属、多孔菌属、密孔菌属、Scytalidium或丝核菌属，具体为来自下列菌种的漆酶：Coprins cinereus、嗜热毁丝霉、Polyporus pinsitus、朱红密孔菌、Scytalidium thermophilum或茄属丝核菌。
本发明另一方面涉及方法，通过在至少有一种蛋白酶存在时增殖发酵微生物，制备发酵过程使用的发酵微生物。虽然未限定于任何一种工作原理，但是在存在有效剂量的至少一种蛋白酶时增殖发酵微生物，当该发酵微生物随后被用于发酵过程时，同相同条件不加入该蛋白酶相比，发酵微生物的迟滞期减少。在增殖过程中蛋白酶的作用被认为是直接或间接地导致基因的抑制或表达，该基因在发酵期间对发酵微生物的性能分别有害或有益，从而降低迟滞期并加快发酵循环。
在增殖中使用的蛋白酶优选包括如上所述的蛋白酶，包括酸性蛋白酶。
实施例
实施例1
加入一种酯酶，具体为一种脂肪酶，在类似于乙醇发酵过程的厌氧发酵条件下进行实验。按照液化-糖化-发酵(LSF)同步方案，在研磨粉碎的黄色干玉米中进行实验。使用数量为0.0(对照)；0.8；1.0和1.2GAU/g DS的葡糖淀粉酶(Spirizyme Plus，购自Novozymes A/S)和数量为1.6AFAU/g DS的真菌α-淀粉酶(SP288，购自Novozymes A/S)进行实验。将其与采用脂肪酶(Candida antartica脂肪酶)的发酵相比较，后者脂肪酶277L/Ug DS结合使用1.0GAU葡糖淀粉酶(Spirizyme Plus)和1.6AFAU/g DS真菌α-淀粉酶(SP288)。所有发酵在pH＝5.0，32℃进行72小时。通过时间监控过程，并分析CO2重量损失、乙醇生成百分比和淀粉理论转换值。
表1说明使用脂肪酶和不使用脂肪酶进行发酵的差异。于32℃经72小时，加入脂肪酶可获得20％的乙醇产量且速度提高，其优于使用任何浓度葡糖淀粉酶而不使用脂肪酶处理。
表1
Figure C03825398D00241
实施例2
实施例2按照液化-糖化-发酵(LSF)同步方案，在干法研磨粉碎的黄色玉米中进行试验。使用数量为0.8GAU/g DS的葡糖淀粉酶(Spirizyme Plus，购自Novozymes A/S)和数量为2.6AFAU/g DS的真菌α淀粉酶(SP288，购自Novozymes A/S)进行实验，加入下列酶用于乙醇发酵：
(A)脂肪酶(LIPOLASE，购自Novozymes A/S)，
(B)Candida antarctica脂肪酶，
(C)角质酶(JC492，购自Novozymes A/S)
(D)磷脂酶(LECITASE购自Novozymes A/S)
(E)灭活的Candida antarctica脂肪酶(通过煮沸3小时灭活)，和
(F)对照(不使用酯酶的葡糖淀粉酶和淀粉酶)。
加入酯酶的剂量相当于200U/g DS。发酵在pH＝5.0，32℃条件下进行数小时。通过时间监控过程并分析CO2重量损失、乙醇生成百分比和淀粉理论转换值。
如表2所示，在所有活性酯酶实验中均观察到乙醇速度和产量(相应的脂肪酸增加)的提高。效率定义为每单位固体生成的乙醇量。在Candidaantarctica脂肪酶实验中观察到最佳结果。
表2
Figure C03825398D00251
实施例3
实施例3采用与实施例2相同的方法，只不过Candida antarctica脂肪酶仅部分灭活(通过煮沸10分钟实现)。如表3所示，尽管有部分失活，使用Candida antarctica脂肪酶仍然获得了显著改善。
表3
Figure C03825398D00261
实施例4
实施例4按照液化-糖化-发酵(LSF)同步方案，在干法研磨粉碎的黄色玉米中进行试验。如实施例2和3所描述，分别在有和无脂肪酶存在时，使用葡糖淀粉酶和α淀粉酶在粉碎的黄色玉米中进行乙醇发酵。发酵在pH＝5.0，32℃进行数小时。除Candida antarctica脂肪酶和灭活的Candidaantarctica脂肪酶外，还对硫酸亚铁和纯化的Candida cylindracea脂肪酶以及Candida antarctica脂肪酶A进行了比较。纯化的脂肪酶用量少4倍。
如表4所示，在所有脂肪酶实验中，具体为在2个纯化的脂肪酶(Candidacylindracea脂肪酶和Candida antarctica脂肪酶A)中，经48小时均观察到乙醇产量的显著改善。Candida antarctica脂肪酶A结果最佳，显示效率为94.9％，48小时产量为18％。Candida cylindracea脂肪酶显示效率为89.2％，48小时产量17.8％。Candida antarctica脂肪酶显示效率为89％，48小时产量17.6％。尽管酶的用量少4倍，仍然是纯化的脂肪酶性能最佳。
表4
Figure C03825398D00271
实施例5
实施例5按照液化-糖化-发酵(LSF)同步方案，在干法研磨粉碎的黄色玉米中进行试验。使用葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，在有和没有生长刺激物条件下，在粉碎的黄玉米中进行乙醇发酵实验。发酵在pH＝5.0，32℃进行数小时。
如下加入维生素和矿物质：
A：Centrum(一种多种维生素剂(multivitamin))；
B：维生素E、Mg、Zn和Cr；
C：维生素A、C、D、E和维生素B1、核黄素、烟酸、叶酸、B-12，panthenate酸；
D：葡糖胺和维生素C
E：对照，无加入
表5说明在48小时，加入维生素和矿物质可获得进一步改善。
表5
Figure C03825398D00281
实施例6
在实施例6-13中，设计25毫升一次性发酵罐用于实验。该发酵罐由购自美国Becton Dickinson Labware的50毫升聚丙烯锥形管组成。发酵闭合装置(lock)由购自美国Fisher Scientific的一次性聚乙烯移液管，连接在5毫升注射器上制作而成。注射器装有购自美国Fisher Scientific的0.45-IImWhatman PVDF注射器过滤器。
使用该25毫升一次性发酵罐，可在同一恒温水浴箱内操作多个样品，以便消除由水温变化所引起的普遍实验误差。发酵完成后不需转移样品。还能在同一试管中将待分析样品自旋沉淀下来，这大大减少了分析所需的时间。
酵母(Ethanol Red酵母，36％ DS)于有氧、500转/分钟，32.2℃，在麦芽糖糊精中增殖16小时。通过将粉碎的玉米(2-毫米筛)和水混合制备玉米浆料，然后用无机酸调整pH值。
在即将用所得培养基装填发酵罐前，将淀粉酶(1.1AFAU/g DS SP288)、葡糖淀粉酶(1.5GAU/g DS Spirizyme Plus)和酵母加入浆料中。
在装填发酵罐之前加入下列相当于200U/g DS数量的酯酶：
A)脂肪酶(lipolase)100T(脂肪酶可从Novozymes购买)，
B)Candida antarctica脂肪酶B(CALB)，
C)Lecitase 10L(磷脂酶，可从Novozymes购买)，
D)JC492(角质酶，可从Novozymes A/S购买)。
在25毫升发酵罐中发酵，不混合，于32.2℃ 72小时。于24，48和72小时测定CO2重量损失。发酵结束时，样品在20℃，以3,000转/分钟向下旋转15分钟，使其通过0.45pm的过滤器，抽取约2毫升发酵醪液级分用于HPLC分析。
如上所述进行不使用酯酶的对照实验。
如表6所示，所有酯酶实验均显著提高乙醇产量。根据CO2重量损失计算24小时和48小时的数据，72小时数据通过HPLC获得。
用纯化的酯酶处理的过程效率也显著增加，具体为，在使用Candidaantarctica脂肪酶B时达到95.1％，如下表7所示。
表6
Figure C03825398D00291
表7
 
酯酶 效率，％ CL，％
对照 88.62 0.75
角质酶 92.54 0.70
磷脂酶 91.32 0.42
脂肪酶 91.64 0.59
CALB 95.10 0.40
实施例7
实例7使用Alltech SuperStart酵母，36％ DS，1GAU/g DS SpirizymeFuel，0.8AFAU/g DS SP288进行。酵母在麦芽糖糊精内增殖。对浓度为.8LU/g DS、4LU/g DS和20LU/g DS的Candida antarctica脂肪酶A，以及浓度为.007％和.014％的蛋白酶(GC 106，购自Genencor)进行了比较。发酵在25毫升发酵罐中进行，不混合，于32.2℃持续72小时。
如表8所示，脂肪酶和蛋白酶对乙醇产量均有影响。但使用.8LU/g DS、4LU/g DS和20LU/g DS的脂肪酶效果显著优于单独使用.007％ DS和.014％DS的蛋白酶。
表8
 
处理 HPLC乙醇，％v/v
对照 12.66ρ0.27
脂肪酶，0.8LU/g DS 14.64ρ0.21
脂肪酶，4LU/g DS 14.66ρ0.07
脂肪酶，20LU/g DS 13.81ρ0.21
脂肪酶，100LU/g DS 11.00ρ0.18
蛋白酶，0.007％ DS 12.61ρ0.12
蛋白酶，0.014％ DS 13.50ρ0.17
实施例8
使用与实施例6所述相同的实验条件和酶浓度进行本实验，只不过在发酵培养基中还加入加大样品体积的蛋白酶(Novozyme 50006，0.007％ DS)样品。
同时使用灭活的CALB，以消除CALB制剂材料对获得效果产生影响的可能性。通过煮沸3小时制备灭活的CALB对照。煮沸结束后，用DI水调整体积至初始值，样品以3,000转/分钟向下旋转20分钟。由此该酶被彻底灭活。
实验数据如下表9所示。效率值为91.04％-95.87％，使用脂肪酶CALB显示最佳结果。在对照样品和灭活CALB处理样品之间，乙醇产量没有显著差异(结果未显示)。
实施例9
实施例9使用与实施例7所述相同的实验条件进行，只不过在增殖时加入蛋白酶(Novozyme 50006，0007％ DS)。
在本实验中，纯化的脂肪酶来自Candida cylindracea，纯化的脂肪酶A来自Candida Antarctica(CALA)，加入量为100LU/g DS，纯化的脂肪酶B来自Candida Antartica(CALB)，加入量为400LU/g DS。如表9所示，这些脂肪酶对乙醇产量和效率均有很大影响。
实施例10
本实施例比较了Lipolase 100T和纯化的Lipolase(两者均购自Novozymes A/S)。实验条件如下：Ethanol Red酵母，36％ DS，1.5GAU/g DSSpirizyme Fuel，0.8AFAU/g DS SP288。酵母在麦芽糖糊精和蛋白酶中增殖。发酵在25毫升发酵罐中进行，不混合，于32.2℃持续72小时。如上所述进行不使用脂肪酶的对照实验。
如表9所示，这些脂肪酶对乙醇产量也有很大影响。
实施例11
比较了酸性脂肪酶(Amano G，购自Amano Enzyme，美国)和纯化的C.cylindracea脂肪酶。实验条件如下：Ethanol Red乙醇红酵母，36％ DS，2.0GAU/g DS Spirizyme Fuel，0.8AFAU/g DS SP288。酵母在麦芽糖糊精和蛋白酶中增殖(Novozym 50006)。在25毫升发酵罐中，不混合，于32.2℃72小时实施发酵。发酵培养基中含有0.08％ DS的蛋白酶(Novozym 50006)。
如表9所示，酸性脂肪酶和纯化的C.cylindracea脂肪酶显示结果优于对照。
实施例12
本实验比较了酸性脂肪酶(Amano G，购自Amano Enzyme，美国)，纯化的磷脂酶(Lecitase Ultra，购自Novozymes)和纯化的脂肪酶(Lipex，购自Novozymes)。实验条件如下：Ethanol Red乙醇红酵母，36％ DS，2.0GAU/gDS Spirizyme Fuel，0.8AFAU/g DS SP288。酵母在麦芽糖糊精和蛋白酶Novozym 50006中增殖。在25毫升发酵罐中进行发酵，不混合，于32.2℃ 72小时。发酵培养基中加入0.02％ DS的Novozym 50006。
如表9所示，这些脂肪酶也得到优于对照的结果。
实施例13
本实验比较了酸性脂肪酶(购自Amano Enzyme，美国)、纯化的磷脂酶(Lecitase Ultra，购自Novozymes)、纯化的脂肪酶(Lipex，购自Novozymes)和脂肪酶(Lipase 100T，购自Novozymes)。实验条件如下：Ethanol Red乙醇红酵母，36％ DS，2.0GAU/g DS Spirizyme Fuel，0.8AFAU/g DS SP288。酵母在麦芽糖糊精和Novozym 50006中增殖。
发酵在25毫升发酵罐中进行，不混合，于32.2℃持续72小时。发酵培养基中加入0.02％ DS的Novozym 50006。如表9所示，这些脂肪酶对乙醇产量也有显著的影响。
表9 脂肪酶对乙醇产量和效率的影响。
 
酶 活性，LU/g DS 乙醇，％v/vinbeer 与对照相比的变化，％v/v 效率，％ 与对照相比的变化％v/v n 实施例
酸性脂肪酶 1 21.12 +0.68 98.92 +3.85 11 实施例11
酸性脂肪酶 1 20.92 +0.14 98.00 +0.83 12 实施例12
酸性脂肪酶 5 21.00 +0.56 98.25 +3.18 11 实施例11
酸性脂肪酶 10 21.16 +0.72 99.15 +4.08 12 实施例11
酸性脂肪酶 10 20.98 +0.20 98.31 +1.14 11 实施例12
酸性脂肪酶 10 19.99 +0.18 92.53 +0.90 11 实施例13
酸性脂肪酶 100 21.34 +0.90 100.53 +5.46 9 实施例11
酸性脂肪酶 100 20.99 +0.21 98.42 +1.25 12 实施例12
CALA(纯化的) 100 19.83 +1.63 98.16 +8.49 11 实施例9
C.cylindracea(纯化的) 1 20.85 +0.41 97.36 +2.29 12 实施例11
C.cylindracea(纯化的) 10 20.60 +0.16 95.96 +0.89 12 实施例11
C.cylindracea(纯化的) 100 19.06 +0.86 98.17 +8.50 11 实施例9
角质酶JC 492 200 19.94 +0.56 92.54 +3.92 12 实施例6
角质酶JC 492 200 19.62 +0.14 91.18 +1.81 14 实施例8
Lecitase 10L 200 19.63 +0.25 91.32 +2.70 12 实施例6
Lecitase 10L 200 19.59 +0.11 91.19 +1.82 12 实施例8
Lecitase Ultra(纯化的) 1 21.05 +0.27 98.74 +1.57 12 实施例12
Lecitase Ultra(纯化的) 1 20.33 +0.52 94.50 +2.87 11 实施例13
Lecitase Ultra(纯化的) 10 21.28 +0.50 100.14 +2.97 11 实施例12
Lecitase Ultra 10 19.89 +0.08 91.98 +0.35 12 实施例13
 
(纯化的)
Lipex(纯化的) 1 21.30 +0.52 100.22 +3.03 12 实施例12
Lipex(纯化的) 10 21.08 +0.30 98.95 +1.78 12 实施例12
Lipex(纯化的) 10 20.07 +0.26 92.99 +1.36 10 实施例13
脂肪酶(纯化的) 1 18.41 +0.31 84.00 +1.00 12 实施例10
脂肪酶(纯化的) 10 18.62 +0.52 83.49 +0.49 8 实施例10
脂肪酶(纯化的) 100 18.24 +0.14 83.57 +0.57 10 实施例10
脂肪酶100T 1 18.33 +0.23 84.87 +1.87 9 实施例10
脂肪酶100T 5 18.41 +0.31 83.84 +1.63 9 实施例10
脂肪酶100T 10 17.99 -0.11 81.35 -1.65 11 实施例10
脂肪酶100T 10 19.89 +0.08 91.93 +0.30 11 实施例13
脂肪酶100T 100 18.50 +0.40 84.02 +1.02 9 实施例10
脂肪酶100T 200 19.86 +0.48 91.64 +3.02 12 实施例6
脂肪酶100T 200 19.77 +0.29 91.04 +1.67 10 实施例8
CALB 200 20.25 +0.87 95.10 +6.48 12 实施例6
CALB 200 20.34 +0.86 95.87 +6.50 11 实施例8
CALB 400 19.36 +1.16 99.19 +9.52 9 实施例9
CALA 0.8 14.64 +1.98 64.00 +8.34 12 实施例7
CALA 4 14.66 +2.00 64.04 +8.40 12 实施例7
CALA 20 13.81 +1.15 59.80 +4.14 12 实施例7
实施例14
在类似于乙醇发酵实验的厌氧发酵条件下加入漆酶进行试验。按照液化-糖化-发酵(LSF)同步方案，在干法研磨粉碎的黄色玉米中进行试验。在使用和不使用漆酶的情况下，用葡糖淀粉酶(Spirizyme plus，购自NovozymesA/S)进行乙醇发酵实验。发酵在pH＝5.0，32℃进行数小时。通过时间监控过程，并分析CO2重量损失、乙醇生成百分比和淀粉理的论换算值。如表10所示，加入漆酶也能提高乙醇产量。
表10
Figure C03825398D00341

Claims (16)

1.用于生产发酵产品的方法，该方法包括发酵步骤，其中所述发酵步骤为粗制淀粉水解过程的一部分，该粗制淀粉水解过程是在低于所述淀粉的起始糊化温度下对粗制的未煮过的淀粉实施的，并且其中所述方法包括使发酵步骤中所用的发酵微生物或发酵介质与至少一种酯酶接触。
2.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶为脂肪酶。
3.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶为磷脂酶。
4.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶为角质酶。
5.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶为脂肪酶、角质酶、磷脂酶或其组合。
6.权利要求1所述的方法，其中所述微生物为酵母。
7.权利要求1所述的方法，其中所述发酵产品为乙醇。
8.权利要求1所述的方法，其中所述发酵步骤为同步糖化和发酵过程的一部分。
9.权利要求1所述的方法，其中所述发酵步骤在有淀粉酶存在时实施。
10.权利要求1所述的方法，其中所述发酵步骤在有葡糖淀粉酶存在时实施。
11.权利要求1所述的方法，其中所述发酵步骤在有α-淀粉酶存在时实施。
12.权利要求1所述的方法，其中所述发酵步骤在有葡糖淀粉酶和α-淀粉酶存在时实施。
13.权利要求1所述的方法，其中所述淀粉材料选自玉米、小麦、大麦或高粱。
14.权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基包括去胚的谷物谷粒。
15.权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基包括去胚的玉米。
16.权利要求1所述的方法，进一步包括使发酵微生物或发酵介质与选自蛋白酶、植酸酶或纤维素酶的酶接触。
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