CN100482243C - 鹰嘴豆提取物在制备降低高脂饮食引起的内脏脂肪重量增加的食品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鹰嘴豆提取物在制备防治肥胖和2型糖尿病的食品中的应用。本发明通过实验检测鹰嘴豆提取物对高脂食物喂养小鼠的影响，结果证实鹰嘴豆提取物能显著降低长期高脂饮食引起的甘油三脂、胆固醇以及低密度脂蛋白胆固醇升高。在实验中还发现鹰嘴豆提取物能纠正长期高脂饮食引起的胰岛素敏感性降低。

Description

鹰嘴豆提取物在制备降低高脂饮食引起的内脏脂肪重量增加的食品中的应用

技术领域

本发明涉及一种鹰嘴豆提取物在制备防治肥胖和2型糖尿病的食品中的应用。

背景技术

提取物是植物药应用的重要环节和方式。欧美各国25％处方至少含有1种来自高等植物的提取物或化合物。在美国，植物提取物占草药市场的95％以上，生药材和其他产品占有率不到5％。在德国，以提取物为主要形式的草药产品占全国药品市场总额的10％，占全国OTC市场近30％，可见植物药提取物在国外有着较好的应用基础和广泛的市场。在中国，中药提取物的开发方兴未艾，不少研究机构和制药公司已开发出黄芪提取物、葛根提取物、山楂提取物等上百种中药提取物，而银杏标准提取物中有效成分含量是原料中的50倍，大大提高了药物的疗效。

关于大豆的研究，目前美国市场上已经有300多种大豆异黄酮功能食品，年销售额近20亿美元。在欧洲、日本、韩国等国家和地区，以大豆异黄酮为主要成分的保健食品已成为一种新型畅销食品，含有大豆异黄酮的保健食品达数十种之多。据统计，目前国际市场对大豆异黄酮的年需求量已达1500吨，但实际年产量仅为300吨。

鹰嘴豆(Nuhut、奴乎特、诺胡提、Cicer arietinumL)，因形如鹰头、在种脐附近有喙状突起而得名，是豆科植物野豌豆属植物中的一个稀有品种，起源于亚洲西部和近东地区，主要分布在世界温暖而又比较干旱的地区，在印度为第一大食用豆类作物。鹰嘴豆在我国新疆已有2500年的生长历史，并作为维药载入《新疆维吾尔药志》。鹰嘴豆营养丰富，其中蛋白质的含量为14.9-24.6％，脂肪约6.4％，多为对人体十分有利的不饱和脂肪酸，如″喀布尔″型鹰嘴豆的脂肪中含油酸50.3％，亚油酸40％。进一步分析发现，鹰嘴豆中氨基酸含量是燕麦的三倍，且人体必须的8种氨基酸全部具有，亚油酸比大豆高20％，铁、锌、钙、磷等微量元素均高于其它豆类，这对于降低血脂和胆固醇水平，加强中老年中枢神经系统的抑制和心血管的保护有很大作用。

在我国，鹰嘴豆作为一种维药一直被应用到日常疾病的临床治疗中，也积累了不少特殊的治疗秘方，特别是对糖尿病、心血管病、肾虚等疾病作用明显，同时鹰嘴豆又是优秀的营养食品。据新疆的调查，全区有维药600余种，较常用的360种左右，其中本地产资源约160种，占维药种数的27％。常用维药中，属于民族专用的约有30种，其中包括新疆鹰嘴豆。据古代文献《饮膳正要》《本草拾遗》《救荒本草》等记载，鹰嘴豆有生津降血脂功效。

现有资料分析，早在六、七十年代就有文献陆续报道鹰嘴豆能降低实验引起的小鼠/兔子血清甘油三脂和胆固醇水平，本发明人研究采用自由进食的方法，旨在建立与人类肥胖最接近的动物模型，研究发现长期高脂饮食导致小鼠体重明显增加，而鹰嘴豆具有减轻肥胖小鼠体重的作用。进一步的研究还发现，鹰嘴豆显著降低血清LDL-C和TG，升高HDL-C，并能有效降低骨骼肌组织的脂滴沉积，改善高脂饮食引起的肝糖元含量增加和血管内膜的增厚。分子生物学水平研究还发现鹰嘴豆显著降低长期高脂饮食小鼠脂肪组织的Leptin和LPL RNA水平，升高Adiponectin水平。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究鹰嘴豆提取物的应用。

研究发现，鹰嘴豆醇提物(约0.02g/kg/day)的效果显著好于其原药材(约0.5g/kg/day)，可见该提取物中的药效物质富集程度高。同时还发现醇提物的疗效优于水提取物，说明传统的水煎剂方式不完全适合鹰嘴豆，因此运用鹰嘴豆的醇提物作为药物制剂和食品的原料，对于成品质量的提高，疗效的稳定将起着积极的意义，同时有利于加深鹰嘴豆药效物质的基础研究，拓展该药安全性。

通常，胰岛素耐量试验(ITT)是小鼠腹腔注射胰岛素后观察血糖的改变情况，可以反映机体对外源性胰岛素的敏感性，是反映胰岛敏感性的一个重要指标，本发明人通过实验发现高脂小鼠对外源性胰岛素的反应明显下降，特别是给药3小时后血糖明显高于对照组，而给予鹰嘴豆及提取物3个月后具有一定的改善胰岛素抵抗的作用，以醇提物作用最显著。因此，鹰嘴豆提取物可以用于制备防治肥胖和2型糖尿病、增加胰岛素敏感性的药物和食品。

本发明提供了鹰嘴豆提取物在制备防治肥胖和2型糖尿病食品中的应用。

本发明的鹰嘴豆提取物包括用水或醇提取得到的提取物。

本发明的鹰嘴豆提取物是采用下列方法制得的：

a、醇提物的制备

将碎成1—5mm的鹰嘴豆粉置于锥形瓶中，加入适量乙醇，用超声波提取4—5次，每次2小时，滤纸过滤，合并滤液，控制温度在40度以下，加压浓缩得到醇提物；

b、水提物的制备

将碎成1—5mm的鹰嘴豆粉置于烧杯中，加入适量去离子水，用超声波提取3次，每次3小时，纱布过滤，滤液进一步离心，取上清液，温度低于60度，减压浓缩上清液，得到水提物；

c、鹰嘴豆提取物配制：

将步骤a或b方法制得的鹰嘴豆提取物置于研钵内研细，逐渐加入助悬剂DMSO研磨，再用超声粉碎器进一步助悬，使均匀分散成混悬剂，制成10倍浓度的混悬液，其中DMSO的添加浓度为0.1％.临用前用蒸馏水稀释，制成饮用液，饮用液中的提取物浓度为4-8g/L。

附图说明

图1：鹰嘴豆提取物对高脂小鼠体重的影响(一)  鹰嘴豆醇提物能够降低高脂饮食引起的体重增加，喂养90天后有统计学差异**<0.01。Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p<0.05，**<0.01：VS.高脂饮食组1)正常饮食组，2)高脂饮食组，3)高脂饮食+鹰嘴豆食组，4)高脂饮食+鹰嘴豆水提组，5)高脂饮食+鹰嘴豆醇提组。

图2：鹰嘴豆提取物对高脂小鼠体重的影响(二)  喂养90天后高脂饮食组、正常饮食组、高脂加鹰嘴豆组、高脂饮食同时给予鹰嘴豆水提物、醇提物组的体重分别为52.13±3.0g、69.00±6.26g、63.78±11.28g、62.33±7.04g3和57.11±6.13g，说明鹰嘴豆醇提物能显著降低高脂饮食引起的体重增加(p<0.01)，而鹰嘴豆食组和水提物组虽然也有减重趋势，但尚未有统计学差异。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p<0.05，**<0.01：VS.高脂饮食组)1)正常饮食组，2)高脂饮食组，3)高脂饮食+鹰嘴豆食组，4)高脂饮食+鹰嘴豆水提组，5)高脂饮食+鹰嘴豆醇提组。

图3：空腹血糖  于小鼠开始分组喂养60天时测定空腹血糖、正常饮食组、高脂饮食组、鹰嘴豆水提取物和鹰嘴豆醇提取物分别为2.96±0.6mM、4.01±0.94mM、3.47±1.1mM和3.01±0.55mM。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p<0.05：VS.高脂饮食组)1)正常饮食组，2)高脂饮食组，3)脂饮食+鹰嘴豆水提组，4)高脂饮食+鹰嘴豆醇提组。

图4：内脏脂肪(附睾)重量  喂养100天后高脂加鹰嘴豆组、高脂饮食同时给予鹰嘴豆水提物、醇提物组的附睾脂肪重量分别为1.15±0.37g、3.28±0.59g、3.35±1.34g、3.12±0.98g和2.22±0.62g，鹰嘴豆醇提物组能显著降低高脂饮食引起的附睾脂肪重量增加(p<0.05)，而鹰嘴豆食组和水提物组的附睾脂肪重量与高脂组比无差异。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p<0.05，：VS.高脂饮食组)1)正常饮食组，2)高脂饮食组，3)高脂饮食+鹰嘴豆食组，4)高脂饮食+鹰嘴豆水提组，5)高脂饮食+鹰嘴豆醇提组。图5：糖负荷后2小时小鼠血糖水平鹰嘴豆醇提物量组显著降低高脂小鼠餐后2小时血糖水平(<0.01)，而鹰嘴豆食组和水提物组餐后血糖无明显改变。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，**<0.01：VS.高脂饮食组)1)正常饮食组，2)高脂饮食组，3)高脂饮食+鹰嘴豆食组，4)高脂饮食+鹰嘴豆水提组，5)高脂饮食+鹰嘴豆醇提组。

图6：ITT180分钟的血糖值  喂养3个月后ITT试验显示与高脂饮食组相比，鹰嘴豆组、鹰嘴豆水提物和醇提物组均显著降低小鼠腹腔注射胰岛180分钟后的血糖水平，均为p<0.01，即显著改善了高脂饮食引起的胰岛素敏感性降低。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，***<0.01：VS.高脂饮食组)1)正常饮食组，2)高脂饮食组，3)高脂饮食+鹰嘴豆食组，4)高脂饮食+鹰嘴豆水提组，5)高脂饮食+鹰嘴豆醇提组。

图7：ITT血糖变化曲线  喂养3个月后鹰嘴豆组、鹰嘴豆水提物、醇提物组均显著增加长期高脂饮食引起的胰岛素敏感性降低，均为p<0.01。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，**<0.01：VS.高脂饮食组)1)正常饮食组，2)高脂饮食组，3)高脂饮食+鹰嘴豆食组，4)高脂饮食+鹰嘴豆水提组，5)高脂饮食+鹰嘴豆醇提组。

图8、9、10、11：喂养100天后鹰嘴豆组、鹰嘴豆提取物大、小剂量组均显著改善高脂饮食引起的甘油三脂、胆固醇和低密度脂蛋白升高，其中鹰嘴豆醇提物组药效优于其余两组，同时鹰嘴豆醇提还有升高高密度脂蛋白水平的趋势，但无统计学差异。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p<0.05，**<0.01：VS.高脂饮食组)1)正常饮食组，2)高脂饮食组，3)高脂饮食+鹰嘴豆食组(图11除外)，4)高脂饮食+鹰嘴豆水提组，5)高脂饮食+鹰嘴豆醇提组。

图12：与正常饮食组相比，高脂饮食组、鹰嘴豆食组和水提物组餐后2小时胰岛素水平升高，而鹰嘴豆水醇提组升高不明显。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p<0.05，**<0.01：VS.高脂饮食组)1)正常饮食组，2)高脂饮食组，3)高脂饮食+鹰嘴豆食组，4)高脂饮食+鹰嘴豆水提组，5)高脂饮食+鹰嘴豆醇提组。

具体实施方式

本发明人通过下列实验对鹰嘴豆提取物在防治肥胖和2型糖尿病中的效果检测：

实施例1、

材料与方法：

1.昆明小鼠体重40克左右，分为5组：正常饮食组、高脂饮食组、高脂加鹰嘴豆食组、高脂饮食加鹰嘴豆醇提物组(0.2g/kg/day)、高脂加鹰嘴豆水提物组(0.4g/kg/day)，观察时间100天。

2.饮食成分：

(1)普通饲料：碳水化合物60％、蛋白质22％、脂肪10％、其它8％

(2)高脂饲料：由普通饲料加猪油、奶粉、鱼粉和白砂糖配制而成，其中碳水化合物40％、蛋白质13％、脂肪40％、其它7％

(3)高脂加鹰嘴豆食组：每50kg高脂饲料中撤去5kg的普通饲料，由同样5公斤的鹰嘴豆替代，其总热量以及碳水化合物、蛋白质和脂肪比例与高脂组相近。

3.鹰嘴豆提取物制备

a、醇提物的制备

将碎成1—5mm的鹰嘴豆粉置于锥形瓶中，加入适量乙醇，用超声波提取4—5次，每次2小时。滤纸过滤，合并滤液，控制温度在40度以下，加压浓缩得到醇提物。

b、水提物的制备

将碎成1—5mm的鹰嘴豆粉置于烧杯中，加入适量去离子水，用超声波提取3次，每次3小时。纱布过滤，滤液进一步离心，取上清液。温度低于60度，减压浓缩上清液，得到水提物。

c、鹰嘴豆提取物配制：

将鹰嘴豆提取物置于研钵内研细，逐渐加入助悬剂DMSO研磨，再用超声粉碎器进一步助悬，使均匀分散成混悬剂，制成10倍浓度的混悬液，其中DMSO的添加浓度为0.1％.临用前用蒸馏水稀释，制成饮用液自由饮用，饮用液中的提取物浓度为4-8g/L。

4、鹰嘴豆提取物的饮用方式：兑入饮用水中自由饮用(0.4-0.8％)

5、胰岛素耐量试验：按1IU/kg腹腔注射常规胰岛素，并在0、15、30、60、90、120、180分钟割尾静脉用freestyle血糖仪测定血糖值。

6、口服糖耐量试验及胰岛素释放试验(IRT)：口服糖耐量试验用20％的葡萄糖溶液，以2g/kg体重的剂量灌胃，分别于空腹及给糖后120min经尾静脉采血，胰岛素释放试验同步进行。

7、100天后小鼠断头处死，分离血清，血清甘油三脂、胆固醇、高密度及低密度脂蛋白采用生化法，由瑞金医院检验科测定。

结果：

1.鹰嘴豆提取物对高脂小鼠体重的影响

喂养100天后正常饮食组、高脂饮食组、高脂加鹰嘴豆食组、高脂饮食同时给予鹰嘴豆水提物、醇提物组的体重分别为52.13±3.0g、69.00±6.26g、63.78±11.28g、62.33±7.04g3和57.11±6.13g，说明鹰嘴豆醇提物能显著降低高脂饮食引起的体重增加(p<0.01)，而鹰嘴豆食组和水提物组虽然也有减重趋势，但尚未有统计学差异。(图1，2)

2.空腹血糖

于小鼠开始分组喂养60天时测定空腹血糖、正常饮食组、高脂饮食组、鹰嘴豆水提取物和醇提取物组的血糖值分别为2.96±0.6mM、4.01±0.94mM、3.47±1.1mM和3.01±0.55mM。(图3)

3.内脏脂肪(附睾)重量

喂养100天后五组的附睾脂肪重量分别为1.15±0.37g、3.28±0.59g、3.35±1.34g、3.12±0.98g和2.22±0.62g，鹰嘴豆醇提物组能显著降低高脂饮食引起的附睾脂肪重量增加(p<0.05)，而鹰嘴豆食组和水提物组的附睾脂肪重量与高脂组比无差异。(图4)

4.鹰嘴豆提取物对长期高脂喂养小鼠胰岛素敏感性的影响

喂养90天后鹰嘴豆食组、鹰嘴豆水提物、醇提物组均显著增加长期高脂饮食引起的胰岛素敏感性降低，三组药效作用无明显不同。(图6，7)

5.鹰嘴豆提取物对高脂小鼠脂代谢的影响

喂养100天后鹰嘴豆食组、鹰嘴豆水提物、醇提物组均显著改善高脂饮食引起的甘油三脂、胆固醇和低密度脂蛋白升高，其中鹰嘴豆醇提物组药效优于其余两组，见下图。三治疗组的高密度脂蛋白水平均高于高脂饮食组，但尚未有统计学意义。(图9-11)

               甘油三脂                         低密度脂蛋白

                              胆固醇(mmol/L)

               (mmol/L)                         (mmol/L)

正常对照组      0.52±0.16*    4.08±0.34**     1.20±0.13**

高脂饮食组      0.89±0.48     5.80±1.06       2.02±0.52

高脂+鹰嘴豆组        0.77±0.47    4.28±0.76*      1.46±0.46*

高脂+鹰嘴豆水提物组  0.63±0.40    4.60±0.62*      1.64±0.51

高脂+鹰嘴豆醇提物组  0.42±0.14*   3.44±0.46**△   1.38±0.43*

注：与高脂饮食组比*p<0.05，**p<0.01；与高脂+鹰嘴豆组比△p<0.05

6.灌服葡萄糖后2小时小鼠血糖和胰岛素水平

鹰嘴豆醇提物量组显著降低高脂小鼠餐后2小时血糖水平，而鹰嘴豆食组餐后血糖无明显改变；同时鹰嘴豆水提物组虽然有减低餐后胰岛素水平的趋势，但尚未达到统计学差别。同时，与正常饮食组相比，高脂饮食组、鹰嘴豆食组和水提物组餐后2小时胰岛素水平升高，而鹰嘴豆水醇提组升高不明显。图5，12)

                     血糖(mmol/L)        胰岛素(pg/ml)

正常对照组           6.05±0.71**        327.22±132.93

高脂饮食组           7.59±0.72          623.86±230.73△

高脂+鹰嘴豆组        7.30±1.11          532.83±82.88△

高脂+鹰嘴豆水提物组  6.86±0.95          529.63±234.77△

高脂+鹰嘴豆醇提物组  6.29±0.64**        488.83±214.54

注：与高脂饮食组比**p<0.01；与正常组比△p<0.01

实施例2、

材料与方法：

1.昆明小鼠体重40克左右，分为5组：正常饮食组、高脂饮食组、高脂加鹰嘴豆食组、高脂饮食加鹰嘴豆醇提物组(0.2g/kg/day)、高脂加鹰嘴豆水提物组(0.4g/kg/day)，观察时间100天。

2.饮食成分：

(1)普通饲料：碳水化合物60％、蛋白质22％、脂肪10％、其它8％

(2)高脂饲料：由普通饲料加猪油、奶粉、鱼粉和白砂糖配制而成，其中碳水化合物40％、蛋白质13％、脂肪40％、其它7％

(3)高脂加鹰嘴豆食组：每50kg高脂饲料中撤去5kg的普通饲料，由同样5公斤的鹰嘴豆替代，其总热量以及碳水化合物、蛋白质和脂肪比例与高脂组相近。

3.鹰嘴豆提取物的饮用方式：同实例1。

4、鹰嘴豆提取物制备：同实例1。

实验一：观察喂养期间小鼠体重变化

于小鼠分组喂养0、30、60及90天时测定体重，观察小鼠在喂养期间体重变化情况，并比较各组间体重差异是否显著，见Fig1、2。小鼠开始用于实验时体重无差异，分组喂养30天后，各组间小鼠体重出现差异，高脂饮食喂养组小鼠体重增加明显快于其他组，鹰嘴豆醇提物治疗组、水提物治疗组和正常对照组体重均低于高脂饮食喂养组，但差别无显著性，喂养90天后，鹰嘴豆醇提物治疗组疗效优于水提物组和鹰嘴豆食组，与高脂模型组相比p<0.05。提示在高脂饮食喂养的同时给予鹰嘴豆醇提物治疗可以使小鼠避免因高脂饮食导致的体重明显增加，在进食量相同的情况下体重与正常对照组接近。

实验二：喂养期间小鼠空腹血糖以及葡萄糖负荷后2h血糖水平

于小鼠开始分组喂养60天时测定空腹及葡萄糖负荷(给予小鼠50％葡萄糖注射液灌胃，剂量为2g/kg体重后2h血糖变化。小鼠试验前一日晚上开始禁食，12小时后用于试验。于试验0及2h时经尾静脉取血，用freestyle血糖仪测定血糖浓度，见图3、5。鹰嘴豆显著改善高脂喂养引起的糖耐量受损。

实验三：腹腔注射胰岛素耐量试验(ITT)

胰岛素耐量试验：按lIU/kg腹腔注射正规胰岛素胰岛素，并在0、15、30、60、90、120、180分钟割尾静脉用freestyle血糖仪测定血糖浓度。每组以0min时血糖值为基础值，求得其它时间血糖值与基础值的比值，观察血糖下降情况，见Fig6、7。180分钟后鹰嘴豆食组、水提物和醇提物治疗组血糖均显著低于模型组，提示鹰嘴豆提取物能纠正长期高脂饮食引起的胰岛素敏感性降低，以醇提物组作用最显著。

实验四：血清指标测定

测定小鼠分组喂养100天时空腹甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCh)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-Ch)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-Ch)水平，见图8、9、10、11。鹰嘴豆提取物显著降低长期高脂饮食引起的甘油三脂、胆固醇以及低密度脂蛋白胆固醇升高，以醇提物组作用最好，而对高密度脂蛋白胆固醇水平的影响不明显。

实验五：喂养期间小鼠葡萄糖负荷后2h胰岛素水平

糖负荷2小时后与正常饮食组相比，高脂饮食组、鹰嘴豆食组和水提物组餐后2小时胰岛素水平升高，而鹰嘴豆水醇提组升高不明显。

Claims (1)

1.一种鹰嘴豆提取物在制备降低高脂饮食引起的内脏脂肪重量增加的食品中的应用，其特征在于所述鹰嘴豆提取物是以下列方法制备的：

a、鹰嘴豆醇提物的制备

将碎成1—5mm的鹰嘴豆粉置于锥形瓶中，加入适量乙醇，用超声波提取4—5次，每次2小时，滤纸过滤，合并滤液，控制温度在40度以下，加压浓缩得到醇提物；

b、鹰嘴豆提取物制备

将步骤a方法制得的鹰嘴豆提取物置于研钵内研细，逐渐加入助悬剂DMSO研磨，再用超声粉碎器进一步助悬，使均匀分散成混悬剂，制成10倍浓度的混悬液，其中DMSO的添加浓度为0.1％，临用前用蒸馏水稀释，制成饮用液，饮用液中的提取物浓度为4-8g/L。

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