CN102641322A - 一种鹰嘴豆水提物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹰嘴豆水提物，通过以下步骤制备完成：（1）取鹰嘴豆种子，加10倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，取出并保留滤液；（2）在滤渣中再加8倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，保留滤液；（3）合并2次滤液，水浴干燥为粉末，制得鹰嘴豆水提物。本发明提出的鹰嘴豆水提物对二肽基肽酶Ⅳ（DPPIV）活性具有明显的抑制作用，同时，可用于制备治疗2型糖尿病的药物。

Description

一种鹰嘴豆水提物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种药物，具体地，涉及一种鹰嘴豆水提物及其制备和应用。

背景技术

糖尿病是一种胰岛素绝对、相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性减低引起的以糖代谢紊乱为主的慢性综合性疾病。其中，2型糖尿病也叫成人发病型糖尿病，多在35~40岁之后发病，占糖尿病患者90%以上。2型糖尿病病友体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素可能处于一种相对缺乏的状态。可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌，但到后期仍有部分病人需要像1型糖尿病那样进行胰岛素治疗。总之，2型糖尿病治疗的短期目标是控制血糖，长期目标是预防相关并发症的发生与发展。其基础治疗方案主要由运动和饮食构成，但是药物治疗和血糖监测往往也非常关键。

随着对糖尿病病理生理机制的深入认识，针对不同作用靶点的药物正在被不断研发。二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)是研究治疗2型糖尿病的新靶点，DPPⅣ能够迅速灭活肠促胰岛素胰高血糖素样肽1(GLP-1)和糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)等多种激素，使血糖升高。而DPPⅣ抑制剂则延长和提高了内源性GLP-1和GIP的活性，促进胰岛素分泌，降低血糖。目前，已有相关化学合成的DPPⅣ抑制剂，但是，它们的生理毒性较高、稳定性较差。

文献报道，植物鹰嘴豆有一定程度的降糖作用，但降糖机制尚不明确，其对DPPⅣ的影响也未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种鹰嘴豆水提物以及它的制备方法，该鹰嘴豆水提物具有DPPⅣ抑制剂活性，并能够用于治疗2型糖尿病，由于鹰嘴豆水提物为纯天然植物提取物，因此，它对人体的生理毒害作用几乎没有。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种鹰嘴豆水提物，通过以下步骤制备完成：

（1）取鹰嘴豆种子，加10倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，取出并保留滤液；

（2）在滤渣中再加8倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，保留滤液；

（3）合并2次滤液，水浴干燥为粉末，制得鹰嘴豆水提物。

本发明提出的鹰嘴豆水提物的制备方法，包括以下步骤：

（1）取鹰嘴豆种子，加10倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，取出并保留滤液；

（2）在滤渣中再加8倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，保留滤液；

（3）合并2次滤液，水浴干燥为粉末，制得鹰嘴豆水提物。

具体地，步骤（3）制得的鹰嘴豆水提物的得率为10-20%。

本发明提出的鹰嘴豆水提物在制备二肽基肽酶Ⅳ抑制剂中的应用。

本发明提出的鹰嘴豆水提物在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明通过鹰嘴豆种子提取了鹰嘴豆水提物，其工艺简单、易操作，无需大型仪器的介入，特别适于大规模生产利用；

（2）本发明提取的了鹰嘴豆水提物对DPPIV的活性具有明显的抑制效果，其体外实验已充分证明，鹰嘴豆水提物可以作为DPPIV抑制剂使用；

（3）通过小鼠体内实验证明，鹰嘴豆水提物对于小鼠的体重、血糖、血脂等指标都有显著的影响，可以用作治疗2型糖尿病的药物使用。

具体实施方式

产品及制备实施例

实施例1

本发明提出的鹰嘴豆水提物，通过以下步骤制备完成：

（1）取鹰嘴豆种子，加10倍重量的水，浸泡30分钟，煮沸30分钟，取出并保留滤液；

（2）在滤渣中再加8倍重量的水，浸泡30分钟，煮沸30分钟，保留滤液；

（3）合并2次滤液，水浴干燥为粉末，制得鹰嘴豆水提物。

通过以上步骤制备完成的鹰嘴豆水提物，其得率为20%，在-20℃保存，备用。

实施例2

本发明提出的鹰嘴豆水提物，通过以下步骤制备完成：

（1）取鹰嘴豆种子，加10倍重量的水，浸泡20分钟，煮沸20分钟，取出并保留滤液；

（2）在滤渣中再加8倍重量的水，浸泡20分钟，煮沸20分钟，保留滤液；

（3）合并2次滤液，水浴干燥为粉末，制得鹰嘴豆水提物。

通过以上步骤制备完成的鹰嘴豆水提物，其得率为10%。在-20℃保存，备用。

实施例3

本发明提出的鹰嘴豆水提物，通过以下步骤制备完成：

（1）取鹰嘴豆种子，加10倍重量的水，浸泡25分钟，煮沸25分钟，取出并保留滤液；

（2）在滤渣中再加8倍重量的水，浸泡25分钟，煮沸25分钟，保留滤液；

（3）合并2次滤液，水浴干燥为粉末，制得鹰嘴豆水提物。

通过以上步骤制备完成的鹰嘴豆水提物，其得率为16%。在-20℃保存，备用。

鹰嘴豆水提物在制备二肽基肽酶Ⅳ抑制剂中的应用实施例

实验一：鹰嘴豆水提物对二肽基肽酶IV活性抑制的体外实验

实验中的材料及药品：

鹰嘴豆种子采自新疆和田地区；

二肽基肽酶IV（Dipeptidyl Peptidase IV，from porcine kidney D7052-1VL，美国sigma公司）；

甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（G0513-25MG，美国sigma公司）；

Tris-HCL缓冲液PH=8.2；

抑二肽素A（IIe-Pro-IIe）美国sigma公司）。

将葫芦巴水提物配制成不同浓度梯度的溶液，观察抑制率的变化：

实验分为4个组，每组设3个复孔，分别为：

空白对照组（Tris-HCL缓冲液+甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺）；

阴性对照组（二肽基肽酶IV +Tris-HCL缓冲液+甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺）；

实验空白对照组（鹰嘴豆水提物+Tris-HCL缓冲液+甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺）；

实验组（鹰嘴豆水提物+二肽基肽酶IV +Tris-HCL缓冲液+甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺）；

由于鹰嘴豆水提物（由产品实施例的实施例1制得）为有色物，在405nm处检测时会出现自身颜色干扰，因此在检测时设置每种提取物各浓度的空白尽量避免假阳性现象。

首先，将各浓度鹰嘴豆水提物、DPPⅣ、甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺及Tris-HCL缓冲液在37℃温度下水浴15-30min，然后按照鹰嘴豆水提物、二肽基肽酶IV、Tris-HCL缓冲液、甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺的顺序依次加入96孔板中，加入量如表1：

。

加入完毕，37℃孵育30-60min，于405nm波长下测得OD值，不同浓度的鹰嘴豆水提物对DPPⅣ活性的影响如表2所示：

。

其中，抑制率的计算公式如下：

由表2可见鹰嘴豆水提物有一定的抑制DPPⅣ的活性，并且随着提取物浓度的升高对DPPⅣ活性抑制越强。鹰嘴豆水提物抑制率最高可达94.17%。

DPPⅣ活性抑制的IC₅₀值，如表3所示：

。

通过本实验说明，鹰嘴豆水提物对二肽基肽酶Ⅳ活性有抑制作用，但没有抑二肽素A抑制作用强。

实验二：鹰嘴豆水提物对小鼠的DPPⅣ的抑制及血糖等指标的影响

糖尿病模型动物的建立

小鼠禁食12小时一次性腹腔注射STZ（180㎎·㎏^-1）。3天后采用尾静脉取血，用精密血糖仪测定小鼠空腹血糖值（FPG）。若11.1 mmol/L≤FPG≤33.3 mmol/L，确定为糖尿病成模小鼠。1周后再测定血糖值，血糖值还居高不下，则证明模型较为稳定，可以用于正式实验。（鹰嘴豆水提物由产品实施例的实施例1制得）

小鼠分组：首先对造模成功的60只小鼠检测一次给药0天时的空腹血糖，实验中的6个组为（每组10只雄性糖尿病小鼠）：

正常组：给予与其余组等体积的蒸馏水进行灌胃。

模型组：给予与其余组等体积的蒸馏水进行灌胃。

西格列汀组：给予二肽基肽酶Ⅳ抑制剂即西格列汀片（默沙东有限公司，剂量0.9 g·㎏^-1）。

鹰嘴豆低剂量组：给予糖尿病小鼠鹰嘴豆水提取物1g·㎏^-1灌胃。

鹰嘴豆中剂量组：给予糖尿病小鼠鹰嘴豆水提取物2g·㎏^-1灌胃。

鹰嘴豆高剂量组：给予糖尿病小鼠鹰嘴豆水提取物4g·㎏^-1灌胃。

测定指标

（1）体重测定：从小鼠成模日开始每周记录一次实验小鼠的体重（单位：g）；

（2）空腹血糖（FPG）测定：从小鼠成膜日开始每周记录一次实验小鼠的血糖值，采用尾静脉取血用罗氏血糖仪测定的方法；

（3）血清中二肽基肽酶Ⅳ活性的测定

（4）小鼠GLP-1测定；

（5）血脂的测定；

 （6）血清中C肽的含量。

一、鹰嘴豆水提物对实验小鼠体重的影响

与正常组比较，模型组小鼠在本实验期间体重一直在下降，从造模成功1周开始模型组小鼠的体重降低，此差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组小鼠相比，鹰嘴豆低剂量组在治疗4周出现体重升高，差异有统计学意义（P<0.05），而西格列汀组，鹰嘴豆中、高剂量组在治疗4周体重出现升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果见表4：

注：与正常组比，#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比*P<0.05，**P<0.01。

二、鹰嘴豆水提物对实验小鼠血糖的影响

与正常组小鼠相比，实验中模型组小鼠的空腹血糖值升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组相比，经过2周的治疗，西格列汀组小鼠的空腹血糖值降低，差异有统计学意义（P<0.01），经过3周的治疗，发现西格列汀组，鹰嘴豆高剂量组的糖尿病小鼠的空腹血糖值降低，差异有统计学意义（P<0.01），经过4周的治疗，发现西格列汀组，鹰嘴豆高剂量组的糖尿病小鼠的空腹血糖值降低，差异有统计学意义（P<0.01），结果见表5：

注：与正常组比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01。

三、鹰嘴豆水提物干预4周后对各组实验小鼠血清中DPPIV活性的影响

鹰嘴豆干预4周后，测定各组实验小鼠血清中DPPIV的活性。与模型对照组比较，西格列汀组、鹰嘴豆中剂量组和鹰嘴豆高剂量对小鼠血清中DPPIV活性抑制率升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表6：

注：与模型组相比*P<0.05。

四、鹰嘴豆水提物干预4周后对各组小鼠门脉血GLP-1含量的测定

与正常组比较，模型组小鼠门静脉血清中的GLP-1含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，西格列汀组、鹰嘴豆中剂量组、鹰嘴豆高剂量组小鼠门脉血血清中的GLP-1含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表7：

注：与正常组比，#P<0.05；与模型组相比*P<0.05，**P<0.01。

五、鹰嘴豆水提取物干预4周后对各组实验小鼠血清中C肽含量的影响

鹰嘴豆水提取物干预4周后测定各组实验小鼠血清中C肽的含量，检测C肽结果显示，与正常组比较，模型组小鼠血清中C肽的含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组小鼠比较，西格列汀组、鹰嘴豆高剂量组小鼠血清中C肽的含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。根据实验小鼠血清样本测定的C肽结果，计算出各小鼠相应的胰岛素抵抗指数及胰岛素分泌指数，胰岛素抵抗。胰岛素抵抗指数的结果显示，与正常组比较，模型组小鼠胰岛素抵抗指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组小鼠比较，西格列汀组、鹰嘴豆高剂量组小鼠胰岛素抵抗指数下降，差异有统计学意义（P<0.01）。胰岛素分泌指数的结果显示，与正常组比较，模型组小鼠胰岛素分泌指数下降，有统计学差异（P<0.01）。与模型组小鼠比较，西格列汀组、鹰嘴豆高剂量组小鼠胰岛素分泌指数升高，差异有统计学意义（P<0.01）。结果如表8显示：

注：与正常组比，#P<0.05，##P<0.01；与模型组相比*P<0.05，**P<0.01。

六、鹰嘴豆水提物干预4周后对实验小鼠血脂的影响

与正常组相比，模型组的TC、TG、LDL-C均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），HDL-C降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，本实验中西格列汀组小鼠的TC、TG、LDL-C降低, 差异具有统计学意义（P＜0.05），HDL-C则升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，与模型组相比，鹰嘴豆低剂量组小鼠TG 、LDL-C降低，差异无统计学意义（P>0.05），TC降低，差异有统计学意义（P<0.05），HDL-C升高，差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，鹰嘴豆中剂量组小鼠TC、TG、LDL-C显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），HDL-C显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比，鹰嘴豆高剂量组小鼠TC、TG、LDL-C降低，差异有统计学意义（P＜0.05），HDL-C显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表9：

注：与正常组比，#P<0.05；与模型组相比*P<0.05。

通过实验二，我们可以预见，鹰嘴豆水提物可以降低糖尿病小鼠血糖、血脂，可能是通过抑制二肽基肽酶Ⅳ、提高GLP-1浓度实现的。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种鹰嘴豆水提物，其特征在于，通过以下步骤制备完成：

（1）取鹰嘴豆种子，加10倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，取出并保留滤液；

（2）在滤渣中再加8倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，保留滤液；

（3）合并2次滤液，水浴干燥为粉末，制得鹰嘴豆水提物。

2.权利要求1所述的鹰嘴豆水提物的制备方法，包括以下步骤：

（1）取鹰嘴豆种子，加10倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，取出并保留滤液；

（2）在滤渣中再加8倍重量的水，浸泡20-30分钟，煮沸20-30分钟，保留滤液；

（3）合并2次滤液，水浴干燥为粉末，制得鹰嘴豆水提物。

3.根据权利要求2所述的鹰嘴豆水提物的制备方法，其特征在于，步骤（3）制得的鹰嘴豆水提物的得率为10-20%。

4.权利要求1所述的鹰嘴豆水提物在制备二肽基肽酶Ⅳ抑制剂中的应用。

5.权利要求1所述的鹰嘴豆水提物在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。