CN101352493B - 具有祛脂清肝功能的中药及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种具有祛脂清肝功能的中药及其制备方法。该中药是由虎杖、山楂、大黄、茵陈和柴胡按比例制成的药剂。其制备方法为：1)取虎杖、山楂和大黄，采用乙醇分次提取，合并提取液，过滤分离出三味原料的药渣混合物，滤液则经回收乙醇后，浓缩成三味原料的稠膏；2)取茵陈、柴胡，与上述三味原料的药渣混合物合并，采用蒸馏水分次煎煮，合并煎液，过滤，所得滤液浓缩成五味原料的稠膏；3)将上述三味原料的稠膏与上述五味原料的稠膏合并，喷雾干燥，粉碎成细粉，制成散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。其可改善高脂血症、减轻肝脏中脂肪堆积和脂肪变性程度、保护肝功能、维持机体能量平衡，且疗效确切、毒副作用小、安全可靠。

Description

具有祛脂清肝功能的中药及其制备方法

技术领域

本发明涉及以中草药为原料制备而成的治疗脂肪肝的药物，特别是指一种具有祛脂清肝功能的中药及其制备方法。

背景技术

随着国民经济的高速发展、人们生活方式的改变、体力活动的减少、人口老龄化的增加、超重和肥胖现象的加剧，脂肪肝等慢性病的发病率呈现日益增高的趋势，据报道国内经济发达地区如上海市机关工作人员的脂肪肝患病率已高达12.9％。目前，影响脂肪肝的因素众多，而控制脂肪肝的干预措施却相形见拙。虽然通过控制饮食、戒酒、增加活动量在一定程度上不失为有效的干预措施，但在其治疗过程中甚至在脂肪肝缓解以后的长期生活中，要求患者规范地接受这些改变其生活方式的干预措施常常对患者的个性化生存需求影响甚大，以至大多数病人最终不得不放弃这些干预措施，转而采用药物控制。

西药降脂药物在治疗高脂血症方面已取得了显著的进展，但该降脂药物是否适合于治疗脂肪肝则争议甚多，甚至有专家认为其应用可使脂肪更易沉积于肝脏，进而加重肝脏的负担。此外，多数降脂药物本身就对肝功能有一定的损害作用。例如，改善胰岛素抵抗的药物如二甲双胍和噻唑烷二酮类可以有效减轻肝脂肪变性的程度，但是如果将这两类药物作为治疗脂肪肝的药物，那么临床上它们对肝脏不可忽视的副作用使其合理性受到了质疑。因此，尽管脂肪肝患病率的增高非常惊人，其危害也不容忽视，但现有的治疗措施却非常滞后。

为了解决上述问题，国内外医学科研工作者不约而同地将探寻的目光锁定在治疗脂肪肝的植物药的研究与开发上。日本非常重视对我国传统中医方剂的再开发，其以高科技研制而成的小柴胡颗粒具有辅助治疗脂肪肝等慢性肝胆疾病的作用，不仅满足了日本国内的需求，而且还出口到欧洲、76美国等西方国家，年销售量达5亿美元左右，但对多数脂肪肝合并有慢性肝胆疾病等基础病变的患者而言，其功能相对单一，保健作用居多，治疗效果有限。国内用于治疗高脂血症的中药方剂和中成药也甚多，但仍然存在针对性较差、作用不稳定、治疗效果不足的缺陷，且至今为止未见专门治疗脂肪肝的准字号新中药问世。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种治疗效果确切、毒副作用小、服用安全可靠的具有祛脂清肝功能的中药及其制备方法。

为实现上述目的，本发明所提出的具有祛脂清肝功能的中药，是由以下重量配比的原料制成有效成分的药剂：虎杖5～20份、山楂5～20份、大黄5～20份、茵陈2.5～15份、柴胡2.5～10份。

上述制成本发明药剂的原料的优选重量配比为：虎杖7.5～15份、山楂7.5～15份、大黄7.5～15份、茵陈5～10份、柴胡5～7.5份。

上述制成本发明药剂的原料的最佳重量配比为：虎杖10份、山楂10份、大黄10份、茵陈7.5份、柴胡5份。

上述药剂可以是药剂学中任何一种可接受的剂型，通常选用的剂型是散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂中的一种。

上述具有祛脂清肝功能的中药的制备方法，包括如下步骤：

1)按上述重量配比取虎杖、山楂和大黄，混合均匀，采用乙醇分次提取，合并提取液，过滤分离出三味原料的药渣混合物，滤液则经回收乙醇后，浓缩成三味原料的稠膏；

2)按上述重量配比取茵陈、柴胡，与步骤1)所得三味原料的药渣混合物合并，采用蒸馏水分次煎煮，合并煎液，过滤，所得滤液浓缩成五味原料的稠膏；

3)将步骤1)所得三味原料的稠膏与步骤2)所得五味原料的稠膏合并，混合均匀，喷雾干燥，粉碎成细粉，最后按常规方法将其制成散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。

本发明的中药基于祖国医学对脂肪肝机理的认识，认为其是由于过食肥甘厚味，伤食碍胃，或久卧久坐，体丰痰盛，或七情内伤致肝疏泄失职，脾运化无权，水湿内停，痰浊内生，气滞血瘀而形成，具有“痰、湿、瘀、积”的特性。针对此病的发病机理，通过大量的药理和临床实践，从祖国医药宝库中，筛选出具有治疗多种病因引起的脂肪肝的药物原料组合，协同配合，充分发挥其对肝胆系统的调节作用，进而有效防治脂肪肝、降低转氨酶、减少肝脏脂肪的堆积。本发明的中药通过调控脂肪酸代谢的基因表达、控制脂肪的储存和释放、维持机体能量平衡来治疗多种病因(酒精和肥胖)引起的脂肪肝。其优点主要体现在以下几方面：

其一，本发明的中药既可有效改善高脂血症，抑制胰岛素抵抗所引起的脂肪肝疾患，又可直接减轻肝脏中脂肪的堆积，还可降低血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的浓度，升高血清高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的浓度，降低肝脏中甘油三酯(TG)含量，减轻肝脏脂肪的变性程度。其二，本发明的中药可通过调控脂肪酸代谢的基因表达，控制脂肪的储存和释放，维持机体能量平衡，达到治疗多种病因如酒精和肥胖引起的脂肪肝的功效，并具有保护肝功能的作用。其三，本发明的中药原料组配全部源于天然植物，早已验证基本上无毒副作用，长期服用安全可靠。

附图说明

图1为非酒精性脂肪肝研究实验中各组大鼠的肝脏HE染色病理切片显微结构示意图，其中：图1a对应正常对照组大鼠，图1b对应模型对照组大鼠，图1c对应本发明低剂量组大鼠，图1d对应本发明中剂量组大鼠，图1e对应本发明高剂量组大鼠，图1f对应饮食治疗组大鼠。

图2为酒精性脂肪肝研究实验中各组大鼠的肝脏HE染色病理切片显微结构示意图，其中：图2a对应正常对照组大鼠，图2b对应模型组大鼠，图2c对应本发明组大鼠，图2d对应二甲双胍组大鼠。

图3为非酒精性脂肪肝研究实验中各组大鼠肝脏PPARγ的凝胶电泳图，图中横坐标位置M表示标号marker，标号1对应正常组，标号2对应模型组，标号3对应本发明组，标号4对应饮食治疗组。

图4为轻度非酒精性脂肪肝病患者在治疗前的¹H MRS磁共振波谱图。

图5为轻度非酒精性脂肪肝病患者在治疗后的¹H MRS磁共振波谱图。

图6为中度非酒精性脂肪肝病患者在治疗前的¹H MRS磁共振波谱图。

图7为中度非酒精性脂肪肝病患者在治疗后的¹H MRS磁共振波谱图。

图8为重度非酒精性脂肪肝病患者在治疗前的¹H MRS磁共振波谱图。

图9为重度非酒精性脂肪肝病患者在治疗后的¹H MRS磁共振波谱图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明具有祛脂清肝功能的中药及其制备方法作进一步的详细描述：

实施例1：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖10kg、山楂10kg、大黄10kg、茵陈7.5kg、柴胡5kg制备而成的药剂。

实施例2：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖7.5kg、山楂12kg、大黄12kg、茵陈5kg、柴胡6kg制备而成的药剂。

实施例3：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖11kg、山楂7.5kg、大黄7.5kg、茵陈8kg、柴胡7kg制备而成的药剂。

实施例4：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖15kg、山楂13kg、大黄13kg、茵陈9kg、柴胡7.5kg制备而成的药剂。

实施例5：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖18kg、山楂15kg、大黄15kg、茵陈10kg、柴胡4.5kg制备而成的药剂。

实施例6：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖20kg、山楂18kg、大黄16kg、茵陈12kg、柴胡8.5kg制备而成的药剂。

实施例7：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖6kg、山楂20kg、大黄7.5kg、茵陈14kg、柴胡9kg制备而成的药剂。

实施例8：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖5kg、山楂8kg、大黄5.5kg、茵陈2.5kg、柴胡2.5kg制备而成的药剂。

实施例9：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖9kg、山楂10kg、大黄9.5kg、茵陈4.5kg、柴胡10kg制备而成的药剂。

实施例10：

具有祛脂清肝功能的中药是由虎杖11kg、山楂11kg、大黄15kg、茵陈7.5kg、柴胡7kg制备而成的药剂。

上述各实施例中具有祛脂清肝功能的中药的制备方法包括如下步骤：

1)按上述重量配比取虎杖、山楂和大黄三味原料，混合均匀，采用体积百分比浓度为70～75％的乙醇回流提取两次，每次乙醇的用量为所提原料重量的6～8倍，第一次提取时间为2.0～2.5小时，第二次提取时间为1.5～2.0小时，以最大限度地提取其有效成分，合并提取液，过滤分离出三味原料的药渣混合物，滤液则经回收乙醇后，浓缩成三味原料的稠膏。

2)按上述重量配比取茵陈、柴胡二味原料，与步骤1)所得三味原料的药渣混合物合并，采用蒸馏水煎煮提取二次，每次蒸馏水的用量为所提原料重量的9～10倍，第一次煎煮时间为2.0～2.5小时，第二次煎煮时间为1.5～2.0小时，以充分获取其中的有效成分，合并煎液，过滤，所得滤液浓缩成五味原料的稠膏；

3)将步骤1)所得三味原料的稠膏与步骤2)所得五味原料的稠膏合并，混合均匀，喷雾干燥，粉碎成细粉，最后按常规方法将其制成散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。

按上述制备方法所获得的祛脂清肝中药，脂肪肝患者可根据医嘱的药量大小服用。一般而言，以每粒0.4g的胶囊剂为例，成人每日三次，每次两至三粒，温开水冲服，两个月为一疗程。

为了证实本发明在祛脂清肝方面的优异疗效，下面进一步介绍本发明的中药在各项药理学基础研究和临床实践中所取得的结果：

一、本发明中药对高脂饲养诱发的大鼠非酒精性脂肪肝的治疗效应

1.材料与方法

健康雄性SD大鼠56只，体重150±10g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，正常喂养1周后，随机分为两组：造模组46只和正常对照组10只。造模组饲以高脂高胆固醇饲料(10％猪油、2％胆固醇、0.5％胆酸钠、87.5％基础饲料)。正常对照组饲基础饲料，各组均自由进水。12周后，从造模组随机抽取6只，正常组随机抽取2只，2％戊巴比妥钠溶液进行腹腔麻醉，处死取肝脏做病理切片，验证造模成功。将所有造模组大鼠称重，按体重层次再随机分为本发明低、中、高剂量组(灌胃浸膏浓度依次为0.175g/ml、0.35g/ml、0.7g/ml)，以及模型对照组和饮食治疗组。本发明低、中、高剂量组按10ml/kg·d以混悬液灌胃，模型对照组、饮食治疗组和正常对照组以同等容积双蒸水灌胃，除模型对照组继续饲以高脂高胆固醇饲料外，其余各组均予基础饲料饲养，用药4周后取血及肝组织，检测各项指标。

2.观察指标及测定方法

(1)观察大鼠的进食量、体重、行为、状态、毛发及死亡情况，实验结束处死动物，称体重及肝重。(2)生化指标：用赖氏法测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性、酶法测定血糖(GLU)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的含量，取新鲜肝脏适量，制成组织匀浆，用抽提液(甲醇与氯仿1∶1，v/v)抽提脂质，用分光光度法测定TG的含量。(3)血清和肝组织中丙二醛：自肝右叶取1g组织，4℃下制成10％肝细胞匀浆，离心取上清，测定组织MDA含量，血清MDA检测按试剂盒说明进行。

3.组织病理学检查

将取出的肝组织用中性福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察肝组织学的改变。

4.统计学处理方法

应用SPSS10.0软件包进行统计分析，实验数据以均数±标准差(χ±s)表示，组间比较用两样本均数的t检验。

5.实验结果

(1)一般情况：体重、肝指数的变化见表1。

表1：体重、肝指数的变化(χ±s)

与正常组比较，^aP＜0.05，^bP＜0.01；与模型组比较^cP＜0.05，^dP＜0.01

如表1所示：模型对照组动物的体重、肝指数(肝湿重/体重×100％)比正常对照组显著增高(P分别＜0.05和＜0.01)。与模型对照组相比，本发明低、中、高剂量组的体重显著降低，而饮食治疗组与模型对照组比较，差异无显著性。本发明低、中、高剂量组及饮食治疗组的肝指数较模型对照组均显著降低(P＜0.01)，说明本发明的中药能有效减轻体重，且可以改善由于脂肪肝引起的肝脏肿大。

(2)血清肝酶谱变化见表2。

表2：对大鼠肝功能的影响(χ±s，u/L)

与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较cP＜0.05，dP＜0.01

如表2所示：模型对照组与正常对照组比较，血清ALT、GGT、ALP显著升高(P＜0.05)，AST有上升趋势，但差异无显著性。与模型对照组比较，饮食治疗组及本发明低、中、高剂量组血清GGT有显著性差异，本发明低、中、高剂量组血清ALT较模型对照组下降，其中本发明低剂量组与模型对照组比较ALT有极显著性差异，饮食治疗组及本发明高剂量组与模型对照组有下降趋势，但差异无显著性。本发明高剂量组ALP与模型对照组比较有显著性差异，本发明低、中剂量组及饮食治疗组有下降趋势。

说明本发明的中药具有一定的保护肝功能效果。

(3)血清和肝组织匀浆脂质变化见表3。

表3：各组大鼠血清及肝匀浆脂质的变化(χ±s)

与正常组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较cP＜0.05，dP＜0.01

如表3所示：模型对照组血清TG、TC及肝组织TG/肝湿重较正常对照组显著升高(P分别＜0.05和＜0.01)，HDL-C显著下降(P＜0.01)。本发明低、中、高剂量组中各脂质均有不同程度改善。饮食治疗组血清和肝组织匀浆脂质有改善趋势，其中HDL-C显著下降(P＜0.01)。说明本发明的中药既能改善高脂血症，又能减轻肝脏脂肪堆积。

(4)血清及肝组织MDA变化结果见表4。

表4：体重、肝指数及血清和肝MDA的变化(χ±s)

与正常组比较，^aP＜0.05，^bP＜0.01；与模型组比较^cP＜0.05，^dP＜0.01

如表4所示：模型对照组血清MDA及肝组织MDA较正常对照组显著升高(P＜0.01)，本发明低、中、高剂量组中MDA均有不同程度改善(P分别＜0.05和＜0.01)。饮食治疗组血清和肝组织MDA与模型对照组比较均无显著性差异。说明本发明的中药能减轻脂质过氧化所造成的肝脏损伤。

(5)病理学改变

对非酒精性脂肪肝研究实验中各组大鼠的肝脏HE染色切片，分别进行肉眼观察和显微镜观察。从标本的肉眼观察可知：正常对照组大鼠肝色鲜红、边缘锐利、质韧；模型对照组大鼠肝外观呈奶油黄或红黄相间，体积明显增大，边缘变钝，质地变软，切面略带油腻感；本发明低、中、高剂量组大鼠肝外观接近正常组对照组；饮食治疗组大鼠与模型对照组相似。

标本的显微镜观察见图1，从图1所示非酒精性脂肪肝研究实验中各组大鼠的肝脏HE染色病理切片显微结构可知：正常对照组大鼠肝小叶清晰，肝细胞索排列整齐，偶见小泡性脂滴空泡(图1a)；模型对照组大鼠肝小叶中心带肝细胞中出现大小不等的脂肪滴，以大泡性脂肪滴为主，一些肝细胞核则被脂肪滴挤得明显偏位，小叶内及汇管区灶性炎细胞浸润，并伴有一定程度的点片状坏死(图1b)；本发明低、中、高剂量组大鼠肝小叶和肝血窦结构清晰，细胞内有见少许小泡性脂肪滴(图1c～图1e)；饮食治疗组大鼠见较多中、小泡性脂肪滴，偶见肝细胞坏死(图1f)。

上述病理学改变结果显示本发明低、中、高剂量组大鼠的肝脏组织形态接近正常，说明本发明的中药能降低肝脏中脂肪滴的含量，保护肝脏组织。

二、本发明中药对酒精和高脂饲料诱导的大鼠酒精性脂肪肝的影响

1.材料与方法

清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重150±10g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，适应性喂养1周后，随机分为6组，即正常组、模型组、本发明低、中、高剂量组(含生药浓度依次为0.175g/ml、0.35g/ml、0.7g/ml)和二甲双胍组，每组10只。正常组予标准饲料饲养，生理盐水10ml/kg灌胃，每日两次，其余各组均高脂饲料(83.5％标准饲料+1.5％胆固醇+5％猪油+10％玉米油)饲养，60％酒精按10ml/kg灌胃，每日2次。本发明低、中、高剂量组每日下午2时分别按照低、中、高剂量给予灌胃，二甲双胍组给二甲双胍混悬液，均按10ml/kg·d灌胃，各组均正常饮水，连续8周。末次给药24小时后，2％戊巴比妥钠(30mg/kg)进行腹腔麻醉。腹主动脉取血，常规制备血清。同时摘取部分肝组织进行生化指标测试和HE染色。

2.观察指标及测定方法

观察大鼠的食欲、体重、行为、状态、毛发及死亡情况，实验结束处死动物时，称体重及肝重。用赖氏法测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性，酶法测定γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的含量。取新鲜肝脏适量，制成组织匀浆，用抽提液(甲醇与氯仿1∶1，v/v)抽提脂质，用分光光度法测定TG的含量。

3.组织病理学检查

将取出的肝组织用中性福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色，显微镜下观察肝组织学的改变、肝细胞脂肪变等情况。

4.统计学处理方法

应用SPSS10.0软件包进行统计分析，实验数据以均数±标准差(χ±s)表示，组间比较用两样本均数的t检验。

5.实验结果

(1)一般情况：体重、肝指数的检测。

模型组、本发明低剂量组、二甲双胍组大鼠毛发光泽度差，体重增长较缓慢，多数大鼠食欲差。正常组大鼠则精神状态好，食欲佳。但各组大鼠体重及肝指数均无显著性差异。将各组死亡大鼠剔除，最后共取得有效标本50份。

(2)血清肝酶谱变化见表5。

表5：脂肪肝大鼠酶活性的变化(χ±s，u/L)

^aP＜0.05vs正常组；^cP＜0.05vs模型组。

如表5所示：模型组与正常组比较，ALT与AST有升高趋势，但无显著性差异，而ALP与GGT则显著升高。与模型组比较，本发明低剂量组ALP与GGT显著降低(P＜0.05，表5)。二甲双胍组肝酶活性则无显著改善。说明本发明的中药具有一定的保护肝功能的效果。

(3)血清和肝组织匀浆脂质的变化见表6。

表6：各组大鼠血清及肝匀浆脂质的变化(χ±s)

^aP＜0.05，^bP＜0.01vs正常组；^cP＜0.05，^dP＜0.01vs模型组。

如表6所示：模型组血清TG较正常组显著升高(P＜0.05)，各治疗组中只有本发明高剂量组降低血清TG作用明显(P＜0.05)，并显示出剂量相关性。模型组肝组织TG显著升高(P＜0.01)，各治疗组均显示出降低肝组织TG的作用(P＜0.05～P＜0.01)。模型组血清TC有升高趋势，但无显著性差异。说明本发明的中药既能改善高脂血症，又能减轻肝脏脂肪堆积。

(4)病理学改变

对酒精性脂肪肝研究实验中各组大鼠的肝脏HE染色切片，分别进行肉眼观察和显微镜观察。从标本的肉眼观察可知：正常组大鼠肝色鲜红、边缘锐利、质韧；模型组大鼠肝外观呈奶油黄或红黄相间，体积明显增大，边缘变钝，质地变软，切面略带油腻感；二甲双胍组大鼠肝外观均接近模型组大鼠。

标本的显微镜观察见图2，从图2所示酒精性脂肪肝研究实验中各组大鼠的肝脏HE染色病理切片显微结构可知：正常组大鼠肝小叶清晰，肝细胞索排列整齐(图2a)，模型组大鼠肝小叶中央静脉区小泡状脂肪变，小叶内及汇管区灶性炎细胞浸润(图2b)，本发明组大鼠肝病理学改变较模型组大鼠显著减轻(图2c)，二甲双胍组大鼠较模型组大鼠亦有明显改变(图2d)。

上述病理学改变结果显示本发明组大鼠的肝脏组织形态接近正常，说明本发明的中药能降低肝脏中脂肪滴的含量，保护肝脏组织。

三、本发明中药可促进非酒精性脂肪肝大鼠肝过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达

1.实验方法

大鼠非酒精性脂肪肝动物模型的建立及药物处理参考上述高脂饲养诱发的大鼠非酒精性脂肪肝实验。用药4周后，将大鼠用2％戊巴比妥钠溶液进行腹腔麻醉，取肝脏标本，使用Tri Reagent试剂盒(宝生物工程公司)，一步法提取总RNA，以紫外分光光度仪检测RNA含量与纯度，取A260/A280在1.8～2.0之间的RNA进行实验。引物序列设计如下：

PPARγ

上游：5`AGG AGC AGA GCAAAG AGG TG 3`下游：5′ACC GTT TAT TTC CCA TCT 3′扩增片段长度为：310bp

内参照β-action

上游：5′CCTAGG CCAACC GTGAAAAG3′

下游：5′TCT TCA TGG TGC TAG GAG CCA3′

扩增片段长度为：623bp

取1μg RNA经逆转录合成单链cDNA后，继以PCR，

PCR循环如下：

①PPAR-gamma所用反应程序：94℃ 3min一个循环；94℃ 1min，60℃ 40s，72℃ 50s，共进行34个循环；末次循环72℃延伸10min。

②β-actin所用反应程序：94℃ 4min，60℃ 1min，72℃ 1min，一个循环；94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min，共进行30个循；末次循环72℃延伸10min。

扩增产物以2g·L^-1琼脂糖电泳，紫外透射分析仪观察结果，凝胶成像分析系统进行光密度扫描。以PPARγ与β-actin的光密度的比值来比较组间差异。

③统计方法：应用SPSS11.0软件对数据进行统计学分析，数据以均数±标准差(χ±s)表示并进行正态检验及方差齐检验。组间比较采用t检验，并进行相关分析，以P＜0.05为差异有显著性。

2.实验结果

非酒精性脂肪肝研究实验中，各组大鼠肝脏PPARγmRNA水平比较结果见表7；各组大鼠肝脏PPARγ的凝胶电泳图见图3。

表7：各组脂肪肝大鼠肝脏PPARγmRNA水平比较(χ±s)

与正常组比较，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01；与模型组比较³⁾P＜0.05，⁴⁾P＜0.01

如表7和图3所示：脂肪肝模型组大鼠肝脏脂肪变明显且伴小片状坏死，而PPARγmRNA表达明显降低，经过本发明中药治疗后，肝脏形态接近正常，PPARγ mRNA表达水平基本恢复正常水平。提示PPARγ的减少可能导致PPAR介导的编码脂肪代谢相关酶的目的基因表达水平降低，从而使肝内脂肪酸氧化能力下降，导致肝内脂肪酸代谢失衡，引起肝内脂质堆积。本发明中药增强了PPARγ的表达，使其恢复至接近正常的水平，从而发挥其调控脂质代谢的作用，启动了一系列与脂质代谢有关酶的基因转录，促进了脂肪氧化分解，起到治疗脂肪肝的作用。而仅仅饮食控制不能使PPARγ的表达恢复，只有结合本发明的中药才能使其表达恢复，提示本发明的中药可能含有某些激动PPARγ的成分。因此，本发明的中药促进PPARγ表达可能是其治疗脂肪肝的分子机制。

四、本发明中药用于治疗非酒精性脂肪肝病的临床研究

1.研究对象

采用中华医学会肝病学分会脂肪肝酒精性肝病学组2006年2月修定的NAFLD诊断标准，入选非酒精性脂肪性肝病患者22例，所有病例均来源于华中科技大学同济医学院同济医院体检中心，其中男性20例，女性2例，年龄39.4±15.6岁。

2.病例人选、排除和剔除标准

①人选标准：具有下列条件的患者纳入本研究：a)年龄18～65岁，性别不限；b)符合中华医学会肝病学分会脂肪肝酒精性肝病学组2006年2月制定的NAFLD诊断标准；c)人选前2周未服用过或已停用降糖、减肥、降酶、保肝、降脂药物和具有类似作用的保健品，患者在完全了解本研究的性质、本人疾病的性质、药物的特性、相关的治疗方法和参加本试验可能承担的风险后，能理解并签署了知情同意书。

②排除标准：2型糖尿病及胰腺疾病者；高血压患者；病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性等可导致脂肪肝的特定疾病；结缔组织病、甲状腺疾病、抑郁症患者；严重肝、肾功能不全患者；患严重心脏疾病、癌症及其他严重疾病患者；服用影响疗效观察的药物者(包括降糖、减肥、降酶、保肝、降脂药物和具有类似作用的保健品)；对本品过敏或不耐受者以及有其他可能影响本品疗效观察的疾病者；患者无能力表达自己的主诉，如精神病及严重神经官能症者；不能合作患者；孕妇、哺乳期妇女或准备受孕的育龄妇女；研究医师认为有任何不适合人选的情况者。

③剔除标准：试验期间未按方案要求服药，依从性差；试验期间并用其它可能影响本试验疗效观察的药物。

4.研究方法

①筛选导入期：符合入选标准而不具备排除标准者均可进入筛选导入期，进行病史采集，填写相关表格。

②观察治疗期：所有符合方案人群22例均服用本发明中药，每次3～4粒，每日3次，拟观察8周。

③观察指标和记录内容：

a)安全性指标：一般体检，包括血压(收缩压SBP和舒张压DBP)，体重，身高，以体重/身高²(公斤/米²)计算体重指数(BMI)，按照2002年中国肥胖问题工作组编写的《中国成人超重和肥胖症预防与控制指南》中的方法测量腰围、臀围，计算腰臀围比值(WHR)等。于第1周和第9周分别记录一次。

b)疗效指标：实验室检查，包括血脂全套(TC、TG)、肝功能(ALT)、空腹血糖(FBG)、尿酸(UA)，于第1周和第9周分别记录一次。

c)影像学指标：CT平扫和¹H MRS波谱检查，采用GE公司Light Speed 16排CT和GE公司1.5THD磁共振扫描仪。所有检查均由同一放射科医生施行。CT扫描同常规肝脏平扫，MRS扫描采用心脏线圈，加呼吸门控，扫描序列包括：肝脏MRI的三平面定位扫描序列，肝脏T2WI序列和肝脏单体素点分辨表面线圈波谱成像(PRESS)序列。根据T2WI序列图像，选择波谱扫描的最佳层面，所有人均选择在肝右后叶，感兴趣区大小不限定，范围尽量设定得较大，以不包含较大胆管及血管为原则。感兴趣区周边设定饱和带，正式扫描前进行预扫描。PRESS序列主要参数如下：Echo 1，NEX 8，TE 35ms，TR1500ms，扫描采用Research模式，不应用水饱和技术，主要参数display CVs：sup 0，sup-method 0。

d)记录指标：肝脏CT值，CT肝/脾比值；对所获得的原始波谱图像采用设备自带的SAGE软件进行后处理和计算，得到¹H MRS波谱值(包括水峰峰值、水峰下面积、脂峰峰值和脂峰下面积)，以脂峰下面积/(水峰下面积+脂峰下面积)×100％表示肝脏脂质含量(IHCL)。于第1周和第9周分别记录一次。

④研究药物：本发明中药，每次3～4粒，每日三次，饭后半小时用温开水送服。

⑤合并用药：所有合并用药均要记录在观察表中，记录适应症、每日剂量和服用日期。

⑤不良反应的发生和记录：发生在临床试验期间任何时间内的不良反应，无论是否与研究药物有关，均应详细记录在观察表中。

⑥资料评估：实验结果以均数±标准差(χ±s)表示，应用SPSS软件包进行统计分析，计量资料采用配对t检验。

5.研究结果

①患者一般情况：两个月之后，有三名患者依从性差没能完成治疗，成为脱失病例，予以剔除。余19例患者均完成两个月的治疗。疗程中部分患者出现不同程度的腹泻症状，在2周后可自行缓解，余未诉不适。

②非酒精性脂肪肝病(NAFLD)患者治疗前后临床特征的变化见表8。

表8：NAFLD患者治疗前后临床特征之间的差异(χ±s)

注：与治疗前比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

如表8所示：NAFLD患者治疗后BMI、SBP、DBP和血清UA、TC、FBG与治疗前比较没有显著性差异(P＞0.05)；治疗后腰围、WHR、血清TG明显下降(P＜0.05)；治疗后血清ALT明显下降(P＜0.01)。说明本发明中药治疗非酒精性脂肪肝病的机理有可能在于调节体内脂肪分布，减少内脏脂肪堆积，并不是单纯地减轻体重。

五、本发明中药在不同程度非酒精性脂肪肝病治疗前后CT肝/脾比值和¹H MRS波谱计算出的肝脏脂质含量(IHCL)之间的差异

1.研究对象、病例人选、排除和剔除标准、研究方法与上述临床研究相同。

2.研究结果

NAFLD患者治疗前后CT肝/脾比值和肝脏脂质含量(IHCL)的变化见表9；NAFLD患者治疗前后之间的¹H MRS波谱图像见图4～图9。

表9：治疗前后CT肝/脾比值和肝脏脂质含量(IHCL)之间的比较(χ±s)

注：与治疗前比较，^**P＜0.01

如表9和图4～图9所示：治疗后，NAFLD患者CT肝/脾比值均有不同程度的升高，¹H MRS波谱计算出的肝脏脂质含量(IHCL)均得到不同程度的下降，有4例轻度脂肪肝患者在治疗两个月之后恢复正常，表现在CT肝/脾比值已经大于1，IHCL小于5.5％。而治疗后NAFLD患者磁共振波谱图上脂峰都得到了不同程度的下降。说明本发明的中药可有效治疗NAFLD，表现在可以明显减少肝脏内脂肪含量，减轻肝细胞损伤上。

Claims (6)

1.一种具有祛脂清肝功能的中药，其特征在于：制成该中药有效成分的原料按重量配比组成为：虎杖5～20份、山楂5～20份、大黄5～20份、茵陈2.5～15份、柴胡2.5～10份；其制备方法包括如下步骤：

1)按上述重量配比取虎杖、山楂和大黄，混合均匀，采用乙醇分次提取，合并提取液，过滤分离出三味原料的药渣混合物，滤液则经回收乙醇后，浓缩成三味原料的稠膏；

2)按上述重量配比取茵陈、柴胡，与步骤1)所得三味原料的药渣混合物合并，采用蒸馏水分次煎煮，合并煎液，过滤，所得滤液浓缩成五味原料的稠膏；

3)将步骤1)所得三味原料的稠膏与步骤2)所得五味原料的稠膏合并，混合均匀，喷雾干燥，粉碎成细粉，最后按常规方法将其制成散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。

2.根据权利要求1所述的具有祛脂清肝功能的中药，其特征在于：制成该中药有效成分的原料按重量配比组成为：虎杖7.5～15份、山楂7.5～15份、大黄7.5～15份、茵陈5～10份、柴胡5～7.5份。

3.根据权利要求1所述的具有祛脂清肝功能的中药，其特征在于：制成该中药有效成分的原料按重量配比组成为：虎杖10份、山楂10份、大黄10份、茵陈7.5份、柴胡5份。

4.一种权利要求1所述具有祛脂清肝功能的中药的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

1)按上述重量配比取虎杖、山楂和大黄，混合均匀，采用乙醇分次提取，合并提取液，过滤分离出三味原料的药渣混合物，滤液则经回收乙醇后，浓缩成三味原料的稠膏；

2)按上述重量配比取茵陈、柴胡，与步骤1)所得三味原料的药渣混合物合并，采用蒸馏水分次煎煮，合并煎液，过滤，所得滤液浓缩成五味原料的稠膏；

3)将步骤1)所得三味原料的稠膏与步骤2)所得五味原料的稠膏合并，混合均匀，喷雾干燥，粉碎成细粉，最后按常规方法将其制成散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。

5.根据权利要求4所述具有祛脂清肝功能的中药的制备方法，其特征在于：所说的步骤1)中，采用体积百分比浓度为70～75％的乙醇回流提取两次，每次乙醇的用量为所提原料重量的6～8倍，第一次提取时间为2.0～2.5小时，第二次提取时间为1.5～2.0小时。

6.根据权利要求4或5所述具有祛脂清肝功能的中药的制备方法，其特征在于：所说的步骤2)中，采用蒸馏水煎煮提取二次，每次蒸馏水的用量为所提原料重量的9～10倍，第一次煎煮时间为2.0～2.5小时，第二次煎煮时间为1.5～2.0小时。

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