CN100430092C - 用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物及其制备方法。用于生物医药领域。本发明脂质复合物平均直径小于1000nm，其中以小于100nm为优，药物与脂质间通过静电力、疏水作用、或者配位键结合，在有机溶剂中具有反向胶束的结构，从而能溶解于氟代烷烃类抛射剂中，制备为溶液型气雾剂制剂。其制备方法：将溶解有脂质的有机溶剂和药物的水溶液两相混合，分散，分离其中的有机溶剂相，用无水乙醇替换有机相溶剂，得到药物/脂质复合物；或者：制备空白脂质体-药物混合物，缓慢滴入有机溶剂，直至油水比例超过5∶1，充分混合，分离有机溶剂相，用无水乙醇替换有机相溶剂，得到药物/脂质复合物。该复合物性质稳定，载药量高，并可有效保持所装载药物的生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂质复合物及其制备方法，具体涉及一种用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物及其制备方法。用于生物医药领域。
背景技术
多肽或者是核酸分子，与传统的小分子化合物药物相比，无论是在结构、物理性质、还是作用机理方面，都是截然不同的。因此，发展多肽以及基因药物的应用，需要解决的关键问题之一是适宜的输送载体以及输送方式，以保证此类药物的稳定性和生物利用度。与其他给药途径相比，通过粘膜进行多肽以及基因药物的输送，有突出的优势。尤其是呼吸道粘膜，对多肽和蛋白的透过性较高，且影响此类药物吸收的因素较少，有利于药物的充分吸收并保持生物活性。特别地，对于主要感染粘膜组织的病原体的疫苗，直接通过粘膜给药，能够更有效地激发机体的免疫反应，并提高粘膜部位的免疫保护能力。
但是目前蛋白和DNA疫苗的制剂大多为水溶液，常用的载体系统，如壳聚糖(利用其所带的正电荷吸附带负电的DNA，作为疫苗输送的载体)也均溶于水性溶液，而水性溶液形式的蛋白和基因制剂在给药时主要是以滴鼻剂，喷雾剂等的方式简单喷涂或滴加在鼻粘膜上以实现蛋白和基因的输送，无法到达呼吸道深处，因此吸收的面积比较有限。其他一些水性溶液的雾化吸入给药方法，由于雾化所需的强大机械力，如超声震荡等，对蛋白和基因药物的稳定性和生物活性也会有较大破坏。采用气雾剂或其他带有抛射剂的输送系统，利用抛射剂的快速汽化，迅速分散液滴并产生抛射力，使蛋白和DNA广泛分布于整个呼吸道粘膜，尤其是通常方法难以到达的下呼吸道粘膜表面，从而大大提高所输送的药物剂量。可是，气雾剂中普遍采用的、具有良好抛射性能的抛射剂属氟代烷烃类，与水不相混溶，如果加入乳化剂制成乳剂型气雾剂，则使用时内相的抛射剂迅速汽化使外层水相膨胀，形成泡沫，反而无法均匀分散到呼吸道粘膜表面。
经文献检索发现，Lisbeth Illum在《Journal of Controlled Release》2003 Feb21；87(1-3)：187-98上发表的“Nasal drug delivery--possibilities，problems andsolutions”(鼻腔给药：可能性，问题与解决方案。控释杂志，2003年第87卷第187-98页)一文，该文中介绍了一种干粉制剂的方法，即将壳聚糖和DNA的电性复合物制备为干粉状，采用特殊的吸入装置进行鼻腔粘膜给药。但由于制备复杂，可控性不强，所以也没能得到广泛使用。
发明内容
本发明针对背景技术中存在的不足，提供一种用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物及其制备方法。使其制备出一种稳定的，可将大剂量核酸或蛋白质等生物大分子分散在有机溶剂中并保持其生物活性的药物/脂质复合物，该复合物具有反向胶束结构，该复合物性质稳定，载药量高，有生物活性。
本发明是通过以下技术方案实现的，制备方法为：将溶解有脂质的有机溶剂和药物的水溶液两相混合，分散，使药物与脂质充分相互作用，分离其中的有机溶剂相，替换溶剂，得到药物/脂质复合物，其中有机溶剂是指25℃，1个大气压时在水中的溶解度为0.01-7％w/w的有机溶剂，如乙醚，氯仿，油水两相混合的体积比为2∶1-200∶1；
或者：将药物与空白脂质体混合，形成在水溶液中的脂质体-药物混合物，缓慢滴入有机溶剂如氯仿，乙醚，直至油水比例超过5∶1。分离含所述复合物的有机溶剂相，如通过分液漏斗萃取和/或-22℃冷冻分层后进行分离。
本发明制备所得的药物-脂质复合物，粒子分布均匀，平均直径小于1000nm，其中以小于100nm为优，药物与脂质间通过静电力、疏水作用、或者配位键结合，在有机溶剂中具有反向胶束的结构，从而能溶解于氟代烷烃类抛射剂中，制备为溶液型气雾剂制剂。在含有氟代烷烃类抛射剂的气雾剂制剂中，由于多肽和基因分子处于药物-脂质复合物所形成的反向胶束的核内，不直接接触有机溶剂，因此在有机溶剂中仍具有良好的生物活性以及物理稳定性。可以通过普通的气雾剂给药装置，准确输送有效治疗剂量。而且该复合物的脂质还可以作用于粘膜上皮细胞，帮助药物的输送。其中的粘膜系统包括鼻腔粘膜、口腔粘膜，呼吸道粘膜、生殖道粘膜、以及皮肤等。
本发明所获得的脂质复合物可作为下述一种或多种药物的输送载体：寡核苷酸、DNA质粒、蛋白、多肽。
上述所使用的脂质选自天然或人工合成的磷脂、糖脂、甾醇、阳离子脂质、表面活性剂以及双亲性聚合物中的至少一种。药物与脂质间通过静电力、疏水作用、或者配位键等结合，在有机溶剂中具有反向胶束的结构。
在基因药物的复合物制备中，可以采用阳离子脂质，主要是由于其在基因输送方面的安全性和有效性已被广泛认可，并且在有机溶剂中可形成反向胶束，通过电荷作用实现基因药物的装载。作用于粘膜内皮细胞还可以进一步地提高基因药物的转染效率。
本发明具有实质性特点和显著进步，本发明制备所得的药物-脂质复合物可溶解于抛射剂中，从而解决了常用的蛋白和基因药物输送系统由于是水性溶液而无法抛射雾化这一问题。同时，当药物/脂质复合物接触到粘膜细胞表面时，因外部环境由有机溶剂变为水溶液，该复合物的结构可能发生改变，反向胶束翻转，使原处于胶束内部的药物游离到胶束外表面，从而提高药物的作用浓度，并有可能促进药物向粘膜细胞的导入，特别是基因药物的导入效率。此外，这种具有反向胶束结构的药物/脂质复合物大大提高了单位质量脂质的药物携带量，使所需的脂质用量大为减少，在减少细胞毒性的同时，有利于药物输送。
具体实施方式
以下结合本发明方法的内容提供具体实施例，对本发明技术作进一步理解。
实施例1
以Luciferase基因质粒和阳离子脂质DOTAP为原料，以氯仿和乙醚为有机溶剂，制备Luciferase质粒与阳离子脂质分子的反向胶束结构的药物/脂质复合物。将1.2毫克DOTAP溶解于1毫升无水乙醚中，加入浓度为25微克/毫升的Luciferase质粒水溶液1毫升，室温条件下，用转速为10000转/分的电动匀浆器搅拌5分钟，得到不稳定的W/O乳剂。静置片刻至乙醚层澄清后，分离乙醚；再加入1毫升氯仿，相同转速下搅拌5分钟并分离有机溶剂。分离氯仿时需将制备的W/O乳剂封口后放入-22度冰箱，静置过夜，而后迅速将氯仿层倒出。合并分离得到的氯仿和乙醚，放入茄形瓶内，并在30摄氏度水浴中旋转蒸发2小时，除去有机溶剂，得到质粒-DOTAP复合物；放入真空干燥器内过夜，临用前用无水乙醇溶解。最终得到的质粒-DOTAP复合物反向胶束，其在无水乙醇中的粒径为72纳米左右。以F12为抛射剂，将所制备的质粒/DOTAP复合物乙醇溶液制成溶液型气雾剂后，收集喷出雾滴，用SDS破膜，进行琼脂糖DNA电泳。复合物DNA电泳结果表明质粒仍保持良好的稳定性。通过上述方法可有效将水溶液的质粒装载到有机溶剂中的阳离子脂质反向胶束内部，从而有效地保护质粒免受有机溶剂的破坏，并能与抛射剂混溶，制备成溶液型气雾剂，使喷出的液滴大小均匀，粒径可控，可大大增加粘摸给药时质粒与粘摸的接触面积和接触程度的均匀性。
实施例2
将多阳离子脂质DOGS与胆固醇1∶1配比，共100微克溶解于1毫升氯仿中，放入茄形瓶内，在30摄氏度水浴中旋转蒸发2小时，得到脂质薄膜；向茄形瓶内加入0.5毫升水，振荡并超声分散，使瓶壁上的脂膜充分水合，得到均匀的空白脂质体混悬液。向混悬液内加入0.5毫升浓度为24微克/毫升SARS N抗原质粒的水溶液，混匀，得到脂质体-质粒复合物。再滴加乙醚和氯仿各100毫升，将脂质体-质粒复合物解构，制备质粒/DOTAP复合物反向胶束。并进行相应的稳定性和生物活性评价。结果表明，通过上述方法可有效将90％以上的质粒装载到有机溶剂中的阳离子脂质反向胶束内部，装载效率高；复合物DNA电泳结果表明不同药物-脂质比例的复合物带有不同的正电荷，并且，质粒仍保持良好的稳定性。因此，通过调整药物-脂质比例，可以有效地调整复合物表面的正电荷，有利于提高粘摸给药时质粒与上皮细胞的结合能力以及转染能力。
实施例3
将EGG-PC/DOTAP以1∶1配比，共100微克溶解于1毫升氯仿中，放入茄形瓶内，在30摄氏度水浴中旋转蒸发2小时，得到脂质薄膜；向茄形瓶内加入1毫升水，振荡并超声分散，使瓶壁上的脂膜充分水合，得到均匀的空白脂质体混悬液。向混悬液内加入1毫升浓度为20微克/毫升的白介素-2重组蛋白水溶液，混匀，得到脂质体-蛋白复合物。再加入乙醚和氯仿各15毫升，剧烈震荡，制备蛋白/脂质复合物，并进行相应的稳定性和生物活性评价。结果表明，通过上述方法可有效将35％的白介素-2蛋白装载到有机溶剂中的脂质反向胶束内部，HPLC和ELISA检验表明蛋白结构保持了良好的稳定性。上述方法有效地保护水溶性蛋白免受有机溶剂的破坏，使之能与抛射剂混溶，将蛋白制备成溶液型气雾剂，并使喷出的液滴大小均匀，粒径可控，提供了一种新型的蛋白给药方法。
Claims (6)
1、一种用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物，作为下述一种或多种药物的输送载体：寡核苷酸、DNA质粒、蛋白、多肽，其特征在于，在有机溶剂中具有反向胶束的结构，药物与脂质间通过静电力、疏水作用、或者配位键结合，平均直径小于1000nm，能溶解于氟代烷烃类抛射剂中，制备为溶液型气雾剂制剂，其中的脂质选自天然或人工合成的磷脂、糖脂、甾醇、阳离子脂质、表面活性剂以及双亲性聚合物中的至少一种。
2、-种用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物的制备方法，其特征在于，将溶解有脂质的有机溶剂和药物的水溶液两相按照2∶1-200∶1的体积比进行混合，分散，使药物与脂质充分相互作用，分离其中的有机溶剂相，替换溶剂，得到药物/脂质复合物；
或者：将药物与空白脂质体混合，形成在水溶液中的脂质体-药物混合物，缓慢滴入有机溶剂，直至油水比例超过5∶1，充分混合，分离有机溶剂相，得到药物/脂质复合物；
其中有机溶剂是指25℃，1个大气压时在水中的溶解度为0.01-7％w/w的有机溶剂。
3、根据权利要求2所述的用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自乙醚、氯仿。
4、根据权利要求2所述的用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物的制备方法，其特征在于，通过分液漏斗萃取和/或-22℃冷冻分层法进行有机溶剂相分离。
5.一种用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物的制备方法，其特征在于，将溶解有脂质的有机溶剂和药物的水溶液两相按照2∶1-200∶1的体积比进行混合，分散，使药物与脂质充分相互作用，分离其中的有机溶剂相，得到药物/脂质复合物，其中有机溶剂是指25℃，1个大气压时在水中的溶解度为0.01-7％w/w的有机溶剂。
6、根据权利要求5所述的用于基因及多肽药物粘膜给药的脂质复合物的制备方法，其特征在于，得到药物/脂质复合物后，放入真空干燥器内过夜，临用前用无水乙醇溶解。
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