CH698144B1 - Analogue de la vitamine D3 - Google Patents

Abstract

Utilisation du 1-a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol, ou d'un sel ou d'un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, dans la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) et des symptômes qui lui sont associés.

Description

  [0001]    La présente invention concerne l'utilisation du 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol (composé A) pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) et des symptômes qui lui sont associés.

  

[0002]    L'HBP est un trouble courant chez les hommes âgés, qui se produit chez approximativement 50% des hommes âgés de 60 ans et 90% des hommes âgés de 85 ans. L'HBP est une entité histopathologique spécifique caractérisée par une hyperplasie des cellules stromales et épithéliales.

  

[0003]    Pendant plus d'un siècle, les deux facteurs étiologiques connus de la pathogénie de l'HBP ont été le vieillissement et la présence de testicules fonctionnels. Cependant, à mesure que la science concernant la prostate avance, ce concept devient insatisfaisant car il ne couvre pas tous les aspects de la pathogénie de l'HBP. Des facteurs étiologiques supplémentaires jouent un rôle significatif en régulant la croissance de la prostate. En particulier, il est apparu évident que la croissance de la prostate est sous le contrôle immédiat de facteurs de croissance spécifiques produits par les cellules prostatiques, agissant localement sur les cellules adjacentes dans un mécanisme paracrine ou sur les mêmes cellules dans un mécanisme autocrine.

   Par conséquent un large effort est actuellement fourni pour identifier des stratégies thérapeutiques visant à inhiber les facteurs de croissance intraprostatique.

  

[0004]    L'HBP est une cause courante de symptômes chroniques du tractus urinaire inférieur qui peuvent affecter les phases de remplissage (symptômes irritatifs) et d'évacuation (symptômes obstructifs) du cycle de la miction. Ces symptômes affectent la vie sociale, psychologique, domestique, professionnelle, physique et sexuelle des patients et conduisent à un impact profond et négatif sur leur qualité de vie. En plus de cela, l'HBP peut causer des complications urologiques plus aiguës, en particulier une rétention urinaire aiguë (RUA), souvent considérée comme étant la complication la plus sérieuse de l'HBP et moins fréquemment des infections récurrentes du tractus urinaire, une dilatation du tractus urinaire supérieur, la formation de calculs dans la vessie et une hématurie récurrente.

  

[0005]    La gestion de l'HBP est associée à des coûts sociaux extrêmement élevés estimés à 4 milliards de dollars en 1993 et on prévoit qu'ils seront de 26 milliards de dollars en 2003 seulement aux Etats-Unis.

  

[0006]    Le traitement médical courant de l'HBP consiste à administrer oralement des inhibiteurs de la 5-[alpha]-réductase (le finastéride et le dutastéride, récemment acceptés par la FDA) et des antagonistes des récepteurs [alpha]1 (la térazosine, la doxazosine, la tamsulosine ainsi que la silodosine, AIO-8507L, RBx-2258, etc.). Chacune de ces options thérapeutiques est associée à des avantages et des inconvénients concernant leurs différents mécanismes d'action. Tandis que les antagonistes des récepteurs [alpha]1 sont très efficaces pour réduire les symptômes liés aux symptômes du tractus urinaire inférieur (STUI), ils sont inefficaces pour réduire le volume de la prostate et par conséquent pour éviter l'intervention chirurgicale liée à l'HBP.

   Réciproquement, les inhibiteurs de la 5-[alpha]-réductase comme le finastéride et le dutastéride, en diminuant la formation de dihydrotestostérone (DHT), réduisent la taille de la prostate et la nécessité d'une intervention chirurgicale. De plus, les résultats récents de l'étude menée sur sept ans pour la prévention du cancer de la prostate (PCPT pour Prostate Cancer Prevention Trial), qui a concerné plus de 18 000 hommes âgés en bonne santé, ont démontré que le finastéride peut prévenir ou retarder l'apparition du cancer de la prostate (voir Thompson IM, et al., New England Journal of Medicine (2003) 349, p. 215-224).

   Cependant, comme on pouvait s'y attendre (voir Kassabian VS, Lancet (2003) 361, p 60-62), le finastéride n'était pas exempt d'effets indésirables anti-androgènes sur la fonction sexuelle, tels qu'une efficacité sexuelle, un désir sexuel et une gynécomastie diminués, qui affaiblissent sensiblement son attractivité en tant qu'agent préventif du cancer. De plus, le traitement par le finastéride a été associé à une plus grande détection de cancer de la prostate de grade élevé, éventuellement parce que l'état faiblement androgène induit par le finastéride a choisi les cellules malignes en phase de croissance insensibles à l'effet androgène les plus agressives (voir Scardino PT, New England Journal of Medicine (2003) 349, p. 297-299).

  

[0007]    Ainsi les besoins n'ont pas été satisfaits concernant une nouvelle classe de médicaments destinés à la thérapie médicale de l'HBP, qui devrait pouvoir prévenir la rétention urinaire aiguë, ainsi que la nécessité d'une intervention chirurgicale qui lui est liée, en diminuant la croissance de la prostate induite par un androgène mais sans interférer directement avec les récepteurs des androgènes (AR), et donc sans effets indésirables anti-androgènes au niveau de la prostate et à l'extérieur de la prostate, par exemple, des effets secondaires au niveau sexuel. De tels médicaments, en perturbant les signaux des facteurs de croissance intraprostatique, pourraient être utiles non seulement pour traiter l'HBP mais également pour prévenir le cancer de la prostate, éventuellement sans avoir à sélectionner des clones malins insensibles aux AR.

  

[0008]    Tel que décrit ici, les inventeurs ont déterminé que l'analogue de la vitamine D3 non hypercalcémique, bien toléré, le 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26, 27-bishomo-20-épi-cholécalciférol (composé A), est un exemple primordial d'un tel médicament, car il peut agir contre l'HBP d'une façon indépendante du récepteur des androgènes en ciblant des voies multiples qui contrôlent la croissance des cellules d'HBP, y compris la prolifération de la prostate induite par facteur de croissance.

  

[0009]    La 1,25-dihydroxyvitamine D3 [1,25(OH)2D3], la forme activée de la vitamine D3, est une hormone sécostéroïde qui joue non seulement un rôle central dans le métabolisme des os et du calcium, mais qui est également impliquée dans le régulation de la réponse immune et dans la différentiation et l'apoptose de nombreux types de cellules, comprenant les cellules malignes.

  

[0010]    Cependant, un problème avec l'utilisation thérapeutique du calcitriol est sa capacité naturelle à induire une hypercalcémie et une hyperphosphatémie. Par conséquent, des analogues du calcitriol maintenant l'activité biologique mais exempts d'effets secondaires hypercalcémiques ont été développés.

  

[0011]    Les brevets US 5 939 408 et EP 808 833 décrivent un certain nombre d'analogues de la 1,25(OH)2D3 comprenant le composé 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol (composé A). Les brevets US 5 939 408 et EP 808 833 décrivent que les composés induisent une différentiation et une inhibition de la prolifération dans diverses lignées cellulaires de peau et cancéreuses et sont utiles pour le traitement des maladies hyperprolifératives de la peau telles que le psoriasis, des maladies néo-plastiques telles que la leucémie, le cancer du sein et des maladies des glandes sébacées telles que l'acné et la dermatite séborrhéïque et de l'ostéoporose.

  

[0012]    On a maintenant trouvé, étonnamment, dans plusieurs études réalisées par les inventeurs que, à la différence de certains autres analogues de la 1,25 (OH)2D3, le composé analogue de la 1,25(OH)2D3, composé A:

 <EMI ID=2.1> 

Composé A

  

[0013]    réduit de manière significative la croissance des cellules humaines d'HBP in vitro par induction de leur apoptose et réduit la croissance de la prostate in vivo, sans effets sur les taux de testostérone et de dihydrotestostérone. De plus, cette inhibition de la croissance de la prostate est réalisée à des doses non hypercalcémiques. Ainsi, le composé A est un agent pharmalcologique efficace pour le traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

  

[0014]    Comme le décrivent les exemples mentionnés ici, le composé A réduit la taille de la prostate. De plus, comme on l'observe avec le finastéride, le composé A empêche l'activité proliférative in vitro et in vivo de la testostérone. De manière significative cependant, et à la différence du finastéride, le composé A n'inhibe pas l'activité de la 5-[alpha]-réductase de type 1 ou de type 2 et peut empêcher non seulement la croissance des cellules d'HBP induite par la testostérone mais aussi celle induite par la dihydrotestostérone. Ces propriétés anti-androgènes du composé A sont indépendantes de l'interaction avec l'AR, comme le montre le fait que le composé A ne peut se fixer à l'AR, ou ne peut agir en tant qu'agoniste ou antagoniste de l'AR. De plus, le composé A n'affecte pas la sécrétion des hormones sexuelles.

   De plus, dans nos études, le composé A n'a aucun effet significatif sur les taux de PSA, il apparaît ainsi qu'il n'y a aucun danger de traitement avec le composé A, masquant ainsi cet indicateur important d'éventuel cancer de la prostate.

  

[0015]    Un autre avantage significatif du composé A est que les études in vitro ont révélé que ce médicament, à la différence du finastéride, est capable d'inhiber la croissance basique et stimulée par la testostérone des cellules de la vessie et on s'attend à ce qu'il soit utile dans la prévention et/ou le traitement du dysfonctionnement de la vessie chez l'homme. Les études in vivo dans un modèle validé d'obstruction du col de la vessie chez le rat de dysfonctionnement de la vessie ont également démontré l'effet bénéfique du composé A. Ce résultat est significatif parce que le dysfonctionnement de la vessie est une séquelle courante et ennuyeuse de l'HBP.

   Ainsi le composé A est capable de réduire la taille de la prostate et d'améliorer le dysfonctionnement de la vessie c.-à-d. d'améliorer la fonction de la vessie et les symptômes de l'HBP liés à la vessie en même temps par un effet direct du composé A à la fois sur la prostate et sur la vessie. On peut s'attendre à ce que cet effet aille au-delà de l'amélioration des symptômes de la vessie qui seraient simplement attendus en conséquence de la réduction de la taille de la prostate. Les symptômes de la vessie comprennent la vessie hyperactive et les indicateurs de la fonction améliorée de la vessie comprennent la réduction des contractions vésicales et du résidu post-mictionnel.

  

[0016]    Ainsi, la présente invention propose l'utilisation du 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate. Sont également considérés dans la portée de l'invention les esters et les sels pharmaceutiquement acceptables du composé A.

  

[0017]    L'invention propose ainsi l'utilisation du 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol, ou d'un sel ou d'un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

  

[0018]    Le 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16, 23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol est un composé connu et sa préparation est décrite dans le brevet US 5 939 408, dont la description est incorporée ici par référence.

  

[0019]    Les esters comprennent les esters labiles pharmaceut iquernent acceptables qui peuvent être hydrolysés dans le corps pour libérer le composé A.

  

[0020]    Les sels du composé A comprennent les adduits et les complexes qui peuvent être formés avec des ions de métaux alcalins et alcalino-terreux tels que les ions de sodium, de potassium et de calcium et les sels de ceux-ci tels que le chlorure de calcium, le malonate de calcium et analogues.

  

[0021]    Le composé A, ou un sel ou un ester de celui-ci, peut être utilisé en monothérapie ou il peut être administré en combinaison avec des agents actifs vis-à-vis de l'HBP connus, par exemple, un agent de blocage de récepteur [alpha]-adrénergique tel qu'un antagoniste des récepteurs [alpha]1 (par exemple, la térazosine, la doxazosine, ou la tamsulosine ou bien la silodosine, AIO-8507L ou RBX-2258) ou un inhibiteur de la 5-[alpha]-réductase (par exemple le finastéride ou le dutastéride). L'expression "agent actif vis-à-vis de l'HBP" comprend les agents capables ou connus comme ayant une activité pour le traitement ou la prévention de l'HBP tels que les substances mentionnées ci-dessus en exemple.

   L'agent associé en combinaison peut être mélangé avec le composé A ou ses sels ou esters en divers rapports et peut être administré séparément, séquentiellement ou simultanément dans des formulations pharmaceutiques séparées ou combinées. Les doses appropriées d'agents thérapeutiques connus seront aisément appréciées par l'homme du métier. La combinaison de A avec deux composés actifs vis-à-vis de l'HBP ou plus, par exemple, 3 peut être envisagée par exemple, une combinaison avec un antagoniste des récepteurs [alpha]1 et un inhibiteur de la 5-[alpha]-réductase.

   Lorsqu'il est administré en combinaison avec le composé A (ou un sel ou un ester) l'agent ou les agents associé(s) en combinaison peut (peuvent) être utilisé(s) à des doses inférieures à celles utilisées lorsque l'agent associé en combinaison est administré seul, peut-être même une dose qui est en dessous du niveau thérapeutique lorsqu'elle est administrée seule.

  

[0022]    Ainsi l'invention propose également l'utilisation telle qu'elle est définie ci-dessus dans laquelle le médicament est dans des formulations pharmaceutiques séparées ou combinées avec un second agent actif vis-à-vis de l'HBP.

  

[0023]    Ainsi l'invention propose également l'utilisation du 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol, ou d'un sel ou d'un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, en combinaison avec un second agent actif vis-à-vis de l'HBP pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

  

[0024]    Les combinaisons désignées ci-dessus peuvent commodément être présentées pour être utilisées sous forme d'une formulation pharmaceutique. Les formulations pharmaceutiques ainsi produites représentent également un aspect de l'invention.

  

[0025]    Les niveaux de dosage et le temps de réponse de l'administration des substances actives dans les formulations pharmaceutiques de l'invention peuvent être changés afin d'obtenir une quantité de la substance active qui est efficace pour obtenir la réponse thérapeutique désirée pour un patient particulier, une composition, et un mode d'administration, sans être toxique pour le patient. Une gamme exemplaire de dose du composé A va cle 0,1 à 300 [micro]g par jour, par exemple, 50 à 150 [micro]g par jour, par exemple, 75 ou 150 [micro]g par jour. Une formulation de dose unitaire contient de préférence 50 à 150 [micro]g par exemple, 75 ou 150 [micro]g et est de préférence administrée une fois par jour.

  

[0026]    Spécifiquement, une dose préférée du composé A est la dose maximale que peut tolérer un patient et à laquelle il ne développera pas d'hypercalcémie ou d'autres effets secondaires indésirables tels qu'une hypercalciurie. Le composé A est administré de préférence à une concentration d'environ 0,001 [micro]g à environ 100 [micro]g par kilogramme de poids corporel, environ 0,001 à environ 10 [micro]g/kg ou environ 0,001 [micro]g à environ 100 [micro]g/kg de poids corporel. Les gammes intermédiaires inférieures aux valeurs citées sont également prévues pour faire partie de l'invention.

  

[0027]    Comme noté ci-dessus, le composé A peut être administré sous forme d'un sel ou d'un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, cependant le composé A est utilisé de préférence tel quel c.-à-d. qu'il n'est pas utilisé sous forme d'un ester ou d'un sel de celui-ci.

  

[0028]    Ce dosage peut être fourni dans une formulation pharmaceutique conventionnelle par une administration simple, par des applications multiples, ou par libération contrôlée, selon les besoins pour obtenir les résultats les plus efficaces, de préférence une fois ou deux fois par jour (particulièrement une dose quotidiennement) par exemple, par voie orale. Dans certaines situations, un dosage périodique peut s'avérer approprié pour obtenir la réponse thérapeutique désirée.

  

[0029]    Le choix de la dose et de la formulation exactes et le mode de délivrance le plus approprié seront influencés par, entre autres, les propriétés pharmacologiques de la formulation, la nature et la sévérité de l'état qui est traité, et l'état physique et l'acuité mentale du receveur.

  

[0030]    Les modes de délivrance représentatifs comprennent les voies orale, parentérale (comprenant les voies sous-cutanée, intramusculaire et intraveineuse), rectale, buccale (comprenant la voie sublinguale), pulmonaire, transdermique, et intranasale, de manière préférée entre toutes par voie orale. L'administration peut être continue ou intermittente (par exemple, par injection rapide).

  

[0031]    L'invention propose également une composition pharmaceutique comprenant le 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol, ou un sel ou un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et un support pharmaceutiquement acceptable destiné à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

  

[0032]    L'invention propose également une formulation conditionnée qui renferme une composition pharmaceutique comprenant le 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16, 23E-diène-26, 27-bishomo-20-épi-cholécalciférol, ou un sel ou un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et un support pharmaceutiquement acceptable conditionnée avec un mode d'emploi pour le traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

  

[0033]    Comme il est mentionné ci-dessus, de telles compositions peuvent être préparées pour une administration parentérale (sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse) , particulièrement sous la forme de solutions ou de suspensions liquides ; pour une administration orale ou buccale, particulièrement sous la forme de comprimés ou de capsules; pour une administration pulmonaire ou intranasale, particulièrement sous la forme de poudres, de gouttes nasales ou d'aérosols; et pour une administration rectale ou transdermique.

  

[0034]    Les compositions peuvent commodément être administrées sous forme de dose unitaire et peuvent être préparées par l'un quelconque des procédés bien connus dans l'art pharmaceutique, par exemple, comme décrit dans l'article de Remington, Pharmaceutical Sciences, 17<e> édition, Mack Publishing Company, Easton, PA, (1985). Les formulations pour une administration parentérale peuvent contenir en tant qu'excipients de l'eau stérile ou une solution saline, des alkylène glycols tels que le propylène glycol, des polyalkylène glycols tels que le polyéthylène glycol, des huiles d'origine végétale, des naphtalènes hydrogénés et des produits analogues.

   Les formulations pour une administration nasale peuvent être solides et peuvent contenir des excipients, par exemple, le lactose ou le dextrane, ou peuvent être des solutions aqueuses ou huileuses destinées à être utilisées sous forme de gouttes nasales ou d'aérosol doseur. Pour une administration buccale les excipients typiques comprennent les sucres, le stéarate de calcium, le stéarate de magnésium, l'amidon pré-gélatiné, et analogues.

  

[0035]    Les compositions administrables oralement peuvent comprendre un ou plusieurs supports et/ou excipients physiologiquement compatibles et peuvent être sous forme solide ou liquide. Les comprimés et les capsules peuvent être préparés avec des agents liants, par exemple, un sirop, l'acacia, la gélatine, le sorbitol, le tragacanthe, ou la poly-vinylpyrollidone; des agents de remplissage, tels que le lactose, le sucrose, l'amidon de maïs, le phosphate de calcium, le sorbitol, ou la glycine; des lubrifiants, tels que le stéarate de magnésium, le talc, le polyéthylène glycol, ou la silice; et des tensioactifs, tels que le laurylsulfate de sodium.

   Les compositions liquides peuvent contenir des additifs conventionnels tels que des agents de suspension, par exemple, le sirop de sorbitol, la méthylcellulose, le sirop de sucre, la gélatine, la carboxyméthylcellulose, ou des graisses alimentaires; des agents émulsionnants tels que la lécithine, ou l'acacia; des huiles végétales telles que l'huile d'amandes, l'huile de noix de coco, l'huile de foie de morue, ou l'huile d'arachide; des conservateurs tels que l'hydroxyanisole butylé (BHA) et l'hydroxytoluène butylé (BHT). Les compositions liquides peuvent être encapsulées dans, par exemple, la gélatine pour fournir une forme galénique unitaire.

  

[0036]    Les formes galéniques orales solides préférées comprennent les comprimés, les capsules à deux coques dures et les capsules de gélatine molle et élastique (SEG). Les capsules SEG présentent un intérêt particulier parce qu'elles fournissent des avantages distincts par rapport aux deux autres formes (voir Seager, H., "Soft gelatin capsules: a solution to many tableting problems"; Pharmaceutical Technology, 9, (1985)).

   Certains des avantages à l'utilisation de capsules SEG sont: a) l'uniformité du contenu de la dose est optimisée dans les capsules SEG parce que le médicament est dissous ou dispersé dans un liquide qui peut être dosé dans les capsules avec précision; b) les médicaments formulés sous forme de capsules SEG montrent une bonne disponibilité biologique parce que le médicament est dissous, solubilisé ou dispersé dans un liquide miscible à l'eau ou huileux et donc une fois libérées dans le corps les solutions se dissolvent ou sont émulsionnées pour produire des dispersions de médicament ayant une surface active élevée; et c) la dégradation des médicaments qui sont sensibles à l'oxydation pendant un stockage de longue durée est évitée parce que la coque sèche de la gélatine molle fournit une barrière contre la diffusion de l'oxygène.

  

[0037]    La formulation sous forme de coque sèche comprend typiquement une concentration en gélatine d'environ 40% à 60%, une concentration en plastifiant (tel que la glycérine, le sorbitol ou le propylène glycol) d'environ 20% à 30% et une concentration en eau d'environ 30 à 40%. D'autres matériaux tels que des conservateurs, des colorants, des opacifiants et des arômes peuvent également être présents. Le matériau de remplissage liquide comprend un médicament solide qui a été dissous, solubilisé ou dispersé (avec des agents de suspension tels que la cire d'abeille, l'huile de ricin hydrogénée ou le polyéthylène glycol 4000) ou un médicament liquide dans des véhicules ou des combinaisons de véhicules tels que l'huile minérale, les huiles végétales, les triglycérides, les glycols, les polyols et les agents de surface.

  

[0038]    Dans un exemple de formulation, les capsules de gélatine molle sont des capsules de gélatine de taille 2, blanches, opaques et ovales contenant un agent de remplissage liquide comprenant la substance active, le composé A, dissous dans le Miglyol 812 (triglycéride d'acides gras en C8-C12d'huile de noix de coco fractionnée) avec de l'hydroxytoluène butylé (BHT), et de l'hydroxyanisole butylé (BHA), en tant que conservateurs. Les capsules de gélatine molle peuvent être formulées pour contenir entre 0,01 et 25 mg, par exemple, 75 ou 150 [micro]g de composé A. Les capsules de gélatine molle doivent être stockées à une températurel de 2 à 8[deg.]C et à l'abris de la lumière.

  

[0039]    Les formulations contenant le composé A, ou un sel ou un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, éventuellement en combinaison avec un second agent actif vis-à-vis de l'HBP, peuvent être préparées en mélangeant les ingrédients.

  

[0040]    Les formulations sont de préférence préparées sous azote et sous une lumière orange.

  

[0041]    La présente invention est à présent décrite grâce aux exemples suivants non limitatifs, faisant référence aux figures, dans lesquelles:

  

[0042]    La fig. 1 montre l'inhibition de la prolifération des cellules d'HBP par le calcitriol et le composé A ("Cmpd A"). Le panel A montre qu'une incubation pendant 48 h avec des concentrations croissantes (10<-><18>à 10<-7> M) de calcitriol (cercles) ou de composé A (carrés) a résulté en une inhibition significative et dépendante de la dose de la croissance des cellules d'HBP (*P < 0,01 par rapport au témoin). L'analyse ALLFIT indique que les deux secostéroides partagent la même inhibition maximale (Imax = 43 +- 1%), mais montre une différence marquée d'activité (-logIC50 pour le composé A = 15,8 +- 0,3; -logIC50 pour le calcitriol = 10,2 +-0,6, P < 0,005). Les résultats sont exprimés en % d'inhibition (moyenne +- SEM) par rapport à leurs témoins relatifs en 3 expériences différentes effectuées en trois exemplaires.

   Le panel B montre l'effet des concentrations croissantes (10<-><18> à 10<-7> M) du composé A sur la prolifération des cellules d'HBP stimulées par T (10 nM, carrés), KGF (10 ng/ml, cercles) ou Des(1-3)IGF-I (10 ng/ml, triangles). Le composé A induit une inhibition significative (*P < 0,01 par rapport aux cellules traitées avec T ou GF) de la croissance des cellules d'HBP également en présence de tous les stimuli testés avec un Imax= 66,6 +- 7,3% similaire. Cependant, le composé A s'est montré plus efficace pour inhiber l'effet de T (-logIC50= 16,4 +- 0,6), que les deux autres GF, (-logIC50de Des(1-3) IGF-I = 12,7 +- 0,6, et -logIC50de KG F = 14,2 +- 0,6, P < 0,0001). Les résultats sont exprimés en % de la variation (moyenne +- SEM) par rapport à la stimulation maximale dans 3 expériences différentes effectuées en trois exemplaires.

  

[0043]    La fig. 2 montre l'effet du composé A, de l'acétate de cyprotérone et du finastéride sur la croissance des cellules d'HBP stimulées par un androgène. Les cellules d'HBP ont été incubées pendant 48 h avec le composé A (1 nM) ou des anti-androgènes (le finastéride, F, 1 nM; l'acétate de cyprotérone, Cyp, 100 nM) en présence de T (10 nM, panel A) ou de DHT (10 nM, panel B). Les résultats obtenus pour des cellules d'HBP non stimulées sont également montrés (panel A) . Les résultats sont exprimés en % de la variation (moyenne +- SEM) par rapport à leurs témoins relatifs en trois expériences différentes effectuées en quatre exemplaires.

   Le composé A et l'acétate de cyprotérone ont bloqué de manière significative la croissance induite par T et DHT, tandis que le finastéride n'était efficace que contre T. *P < 0,01 par rapport au témoin; [deg.]P < 0,01 par rapport aux cellules traitées avec un androgène.

  

[0044]    La fig. 3 montre que le composé A est dépourvu de propriétés agonistes ou antagonistes sur l'AR humain. La lignée cellulaire PC3 déficiente en AR transfectée de façon stable avec l'AR humain a été transférée dans une plaque de 24 puits avec une densité de 2 x 10<4>cellules/puit. Après 24 h, les cellules ont été transfectées avec le plasmide pLSPP adapté à l'AR et, 48 h plus tard, les cellules ont été incubées avec des concentrations croissantes de DHT (carrés) ou de composé A (cercles) (panel A), ou avec une concentration fixe de DHT (3 nM) en présence de bicalutamide (carrés) ou de composé A (cercles)(panel B) pendant 18 h. Les résultats (la moyenne de trois expériences de transfection) sont exprimés en pourcentage de bioluminescence par [micro]g de la totalité des protéines.

   Afin d'évaluer l'activité agoniste, une activité de 100% vis-à-vis de la luciférase a été fixée en présence de DHT à 100 nM (panel A), tandis qu'afin d'examiner l'activité antagoniste une activité de 100% vis-à-vis de la luciférase a été fixée avec DHT à 3 nM (panel B).

  

[0045]    La fig. 4 montre l'inhibition de la croissance de la prostate ventrale chez le rat par le composé A ou le finastéride. Panel A: des rats castrés, auxquels on a injecté de l'énanthate de T (30 mg/kg/semaine), ont été traités oralement pendant 5 jours/semaine durant deux semaines consécutives avec un véhicule ou avec des doses croissantes de composé A (10, 30, 100 et 300 [micro]g/kg) ou de finastéride (F, 10 et 40 mg/kg). Le poids de la prostate ventrale est exprimé en % de la variation (moyenne +- SEM) du poids des rats intacts, traités par le véhicule, (^P < 0,05, *P < 0,01 par rapport aux rats témoins, [deg.]P < 0,01 par rapport aux rats auxquels on a ajouté T).

   Panel B: des rats adultes intacts ont été traités oralement pendant un mois (5 fois/semaine pour un total de 27 administrations) avec un véhicule (témoin) ou des concentrations croissantes de composé A (10, 30, 100 et 300 [micro]g/kg) ou de finastéride (F, 10 et 40 mg/kg). Le poids de la prostate ventrale est exprimé en % de la variation (moyenne + SEM) du poids des rats témoins, traités par le véhicule (*P < 0,01 par rapport aux rats témoins).

  

[0046]    La fig. 5 montre l'effet du composé A et du finastéride sur l'expression du gène de la clustérine dans la prostate ventrale de rat. Panel A: analyse Northern de l'expression de l'ARNm de la clustérine dans la prostate ventrale de rats intacts (ligne 1) ou orchidectomisés (ligne 2) traités par un véhicule. Les lignes 3 à 6 représentent l'expression du gène de la clustérine chez des rats orchidectomisés auxquels on a ajouté pendant deux semaines de l'énanthate de T (30 mg/kg) et qui ont été traités oralement avec un véhicule (ligne 3), le composé A (300 [micro]g/kg, ligne 4 et 100 [micro]g/kg, ligne 5) ou le finastéride (40 mg/kg, ligne 6). Chaque ligne a été chargée avec 10 [micro]g d'ARN total. L'expression correspondante de la GAPDH et la coloration par le bromure d'éthidium du gel sont montrées en-dessous de la tache.

   La tache est représentative de deux expériences séparées. Panel B: analyse Northern de l'expression de l'ARNm de la clustérine dans la prostate ventrale de rats adultes intacts traités oralement pendant 1 mois (5 fois/semaine, 27 administrations) avec un véhicule (ligne 1), des concentrations croissantes de composé A (10, 30 [micro]g/kg, ligne 2 et 3) ou de finastéride (40 mg/kg, ligne 4). Chaque ligne a été chargée avec 10 pg d'ARN total. L'expression correspondante de la GAPDH et la coloration par le bromure d'éthidium du gel sont montrées en-dessous de la tache. La tache est représentative de deux expériences séparées.

  

[0047]    La fig. 6 montre les effets morphologiques du composé A sur la prostate ventrale de rats castrés et auxquels on a ajouté T. Panels A, B, C et E. Les champs représentatifs obtenus à partir de sections transversales de glandes entières de la prostate auxquelles on a appliqué une immunocoloration avec un anticorps monoclonal dirigé contre la clustérine de rat et une contre-coloration avec l'hématoxyline. Chez les rats traités par le véhicules castrés 4 jours plus tôt, le marquage à la clustérine est détectable dans le cytoplasme des cellules épithéliales cubiques atrophiques (panel A, 10x). Après deux semaines de suppléments de T (panel B, 10x), presque tout le marquage à la clustérine a disparu.

   Réciproquement, les cellules positives à la clustérine étaient toujours présentes chez les rats traités avec T et différentes doses de composé A (100 [micro]g/kg, panel C; 300 [micro]g/kg, panel E, flèches noires). Les panels D et F montrent des sections consécutives à celles utilisées dans les panels C et E, pour mettre en évidence la fragmentation de l'ADN comme l'évalue le test TUNEL de marquage final par la désoxynucleotidyl transférase terminale (TdT).

  

[0048]    Deux semaines de traitement (9 administrations) avec le composé A (100 [micro]g/kg, panel D; 300 [micro]g/kg, panel F) ont induit une apoptose massive de la majorité des cellules épithéliales et stromales. Il est à noter (flèches noires), que toutes les cellules positives à la clustérine ont subi une apoptose, tandis qu'une portion conséquente de cellules non marquées par la clustérine montre également une fragmentation nucléaire.

  

[0049]    La fig. 7 montre les effets morphologiques du composé A et du finastéride sur la prostate de rats adultes intacts. Panels A, B, D, E, F et H. Les champs représentatifs obtenus à partir de sections transversales de glandes entières de la prostate auxquelles on a appliqué une immunocoloration avec un anticorps monoclonal dirigé contre la clustérine de rat et une contre-coloration avec l'hématoxyline. Dans le panel A (10x) l'anticorps primaire a été omis. Le panel B (10x) prouve que chez les rats adultes non traités, seulement quelques cellules épithéliales peu abondantes ont été marquées dans certaines glandes (flèches noires).

   Réciproquement, dans les glandes de la prostate de rats traités avec des concentrations croissantes de composé A, des cellules épithéliales cubiques caractérisant une atrophie ont été colorées par la clustérine en fonction de la dose (voir flèches noires, 10 [micro]g/kg, panel D; 30 [micro]g/kg, panel E, 100 [micro]g/kg, panel F, 10x). Des résultats similaires ont été obtenus avec le finastéride (40 mg/kg, panel H, 10x). Les panels C, G et I montrent des tranches consécutives périodiques, à celles représentées dans les panels B, D et F, respectivement, pour mettre en évidence la fragmentation d'ADN comme l'évalue le test TUNEL de marquage par la désoxynucleotidyl transférase terminale (TdT).

   Il est à noter (flèches noires), que toutes les cellules positives à la clustérine ont subi une apoptose, tandis qu'une portion conséquente de cellules non marquées par la clustérine montre également une fragmentation nucléaire.

  

[0050]    La fig. 8 montre les résultats d'une étude de toxicité chronique chez des chiens. Une réduction apparente du poids de la prostate est montrée après 9 mois de traitement avec le composé A par rapport à un placebo.

  

[0051]    La fig. 9 montre les résultats d'une étude de toxicité chronique chez les chiens. Une réduction du poids de la prostate après guérison à l'aide d'un traitement avec le composé A par rapport à un placebo.

  

[0052]    La fig. 10 montre l'effet du composé A sur la croissance cellulaire de la vessie stimulée par la testostérone. "hB" = vessie humaine.

  

[0053]    La fig. 11 montre l'effet du composé A et d'autres composés comparateurs sur la croissance cellulaire de la vessie stimulée et basique. "T 10 nM" = testostérone; "F 1nM" = finastéride.

  

[0054]    La fig. 12 montre l'effet d'un composé de la vitamine D sur le poids de la vessie.

  

[0055]    La fig. 13 montre l'effet d'un composé de la vitamine D sur la fréquence des contractions vésicales spontanées.

  

[0056]    La fig. 14 montre l'effet d'un composé de la vitamine D sur l'amplitude des contractions vésicales spontanées.

  

[0057]    La fig. 15 montre l'effet d'un composé de la vitamine D sur la pression de la miction.

  

[0058]    La fig. 16 montre l'effet d'un composé de la vitamine D sur le résidu post-mictionnel.

  

[0059]    La fig. 17 montre l'effet d'un composé de la vitamine D sur la réponse contractile des bandes vésicales à une EFS (stimulation électrique).

Exemples

Exemple 1: Effets du composé A sur des cellules d'HBP in vitro Matériaux et méthodes Matériaux

  

[0060]    Le milieu essentiel minimum (MEM), le mélange DMEM-F12 1:1, le milieu de Ham F12, la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), la fraction V d'albumine sérique bovine (BSA), la glutamine, le généticine, la collagénase de type IV, la vitamine D3, la testostérone (T), le dihydrotestostérone (DHT), l'acétate de cyprotérone, la forme réduite de la [beta]-nicotinamide adénine dinucléotide 3-phosphate (NADPH), le dithiothréitol (DTT), le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et un kit de mesure de la calcémie ont été achetés auprès de Sigma (St. Louis, MO). Le kit de mesure des protéines a été obtenu auprès de Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Le sérum foetal de boeuf (FBS) a été acheté auprès d'Unipath (Bedford, R-U).

   L'anticorps monoclonal anti-clustérine de rat (IgG monoclonal de souris) spécifique de la chaîne bêta a été acheté auprès d'UPSTATE Biotechnology (Lake Placid, NY). Le kit Apop Tag pour le marquage terminal in situ (ISEL) a été obtenu auprès d'Oncor (MD, Etats-Unis). Les cellules CHO 1827 et CHO 1829 ont été fournies par Serono International (Genève, Suisse). Instagel plus a été acheté auprès de Packard (St. Louis, MO). Le finastéride (substance pure) (17([beta]-(N,t-butyl)carbamoyl-4-aza-5[alpha]-androst-1-èn-3-one) a été offert aimablement par Merck Sharp et Dohme Research Laboratories (Rahway, NJ). Le bicalutamide a été offert aimablement par AstraZeneca (AstraZeneca, Milan, Italie). L'analogue 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholecalciférol (composé A) a été fourni par Bioxell (Bioxell, Milan, Italie).

   Le facteur de croissance des kératinocytes (KGF) a été obtenu auprès de Pepro Tech EC (Londres, Angleterre) et le facteur de croissance proche de l'insuline de type 1, le [Des(1-3)IGF-I] humain a été acheté auprès de GroPep Limitated (Adélaïde, Australie). Le kit de détection de la mort cellulaire in situ POD pour le test de marquage terminal TUNEL par de la désoxynucléotidyl transférase terminale (TdT) a été obtenu auprès de Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN). Les articles en plastique pour les cultures cellulaires ont été achetés auprès de Falcon (Oxnard, CA). Les unités de filtration jetables pour la préparation des milieux de croissance ont été achetées auprès de PBI International (Milan, Italie).

   La lipofectamine 2000 et le milieu Opti-MEM I pour la transfection de la luciférase ont été obtenus auprès d'Invitrogen, Life Technologies (San Giuliano Milanese, Milan, Italie). Les plaques de silice de chromatographie sur couche mince ont été obtenues auprès de Merck (Darmstad, Allemagne). L'énanthate de testostérone (énanthate de T) a été obtenu auprès de Geymonat (Anagni, Italie). Le kit de détection de la testostérone totale Coat-A-Count<(R)> a été acheté auprès de Médical System (Genova Struppa, Italie). Les systèmes de dosage de l'hormone lutéinisante de rat (rLH) [<125>I] ont été obtenus auprès d'Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).

Cellules d'HBP

  

[0061]    Les cellules humaines d'HBP, préparées, maintenues et utilisées tel que décrit précédemment dans Crescioli C, et al., Journal of Clinical and Endocrinology Metabolism (2000) 85, p. 2576-2583, ont été obtenues à partir de tissus de la prostate dérivés de 5 patients, qui ont subi une adénomectomie suspubienne pour HBP, après consentement éclairé et approbation par le comité d'éthique local. Les patients n'ont reçu aucun traitement pharmacologique dans les 3 mois précédant l'intervention chirurgicale.

Lignées cellulaires CHO-1827 et CHO-1829 transfectées par la 5-[alpha]-réductase

  

[0062]    Les cellules CHO-1827 et CHO-1829, transfectées par la 5-[alpha]-réductase de type 1 (5[alpha]R-1) ou de type 2 (5[alpha]R-2), respectivement (voir Steers W. Urology (2001) 58, p. 17-24), ont été maintenues dans le milieu de Ham F12 auquel on a ajouté 5% de FCS.

Lignées cellulaires PC3 transfectées par AR

  

[0063]    Les cellules humaines PC3 d'adénocarcinome de la prostate, transfectées de façon stable par le plasmide p5HbhAR-A contenant le récepteur humain des androgènes (hAR) tel que précédemment décrit (voir Bonaccorsi L, et al. Endocrinology (2000) 141, p. 3172-3182), ont été développées dans des fioles de culture de 75 cm<2> dans un milieu de Ham F12 contenant 50 [micro]g/ml de généticine, 10% de FCS, de la pénicilline (100 U/ml) et de la streptomycine (100 mg/ml). 

Tissu de HBP

  

[0064]    Des tissus prostatiques pour un test de fixation ont été obtenus à partir de patients qui ont subi une adénomectomie suspubienne pour HBP. Aucun traitement pharmacologique n'a été effectué dans les 3 mois précédant l'intervention chirurgicale. Après l'intervention chirurgicale, les tissus ont été immédiatement placés dans de l'azote liquide et stockés à -80[deg.]C jusqu'au traitement.

Tissus de rat

  

[0065]    Des glandes de la prostate ventrale de rat ont été rapidement excisées, pesées et vite congelées dans de la glace sèche. Les expériences d'immunohistochimie ont été effectuées dans des sections cryostatiques contiguës de 14 [micro]m d'épaisseur pour une comparaison directe de la morphologie des tissus, de l'expression de la clustérine et de la localisation de l'apoptose par le test TUNEL. Pour l'extraction de l'ARN total et l'analyse de Western blot, des prostates ventrales de rat issues de 4 à 6 animaux ont été mises en commun.

Analyse de la prolifération des cellules d'HBP

  

[0066]    Pour tous les dosages de prolifération cellulaires, 4 x 10<4>cellules d'HBP ont été inoculées dans des plaques à 12 puits dans leur milieu de croissance, affamées dans un milieu rouge et sans sérum contenant 0,1% de BSA pendant 24 h, et ensuite traitées avec des stimuli spécifiques pendant 48 h. Les cellules dans un milieu rouge à base de phénol et sans sérum contenant 0,1% de BSA ont été utilisées en tant que contrôles. Ensuite, les cellules ont été trypsinisées, et chaque point expérimental a été dérivé d'une numération à l'aide d'un hémocytomètre, faisant la moyenne d'au moins six champs différents pour chaque puit, tel que précédemment rapporté (voir Crescioli C, et al. Journal of Clinical and Endocrinology Metabolism (2000) 85 p 2576-2583).

   Les expériences ont été effectuées en utilisant des concentrations croissantes (10<-><18> à 10<-><7>M) de calcitriol ou de composé A avec ou sans concentration fixe de T (10 nM), de KG F ou de Des (1-3)IGF-I (10 ng/ml). Les dosages de croissance ont été également effectués en utilisant une concentration fixe d'androgènes (10 nM) avec ou sans le composé A (1 nM, 10 nM) ou le finastéride anti-androgène (F, 1 nM) et l'acétate de cyprotérone (Cyp, 100 nM). Les dosages de croissance ont été également effectués en utilisant une concentration fixe de T (10 nM) ou de GF (10 ng/ml) avec ou sans le composé A (10 nM). Dans la même expérience, chaque point expérimental a été répété en trois ou quatre exemplaires et les expériences ont été effectuées 3 fois.

   Les résultats sont exprimés en % de la variation (moyenne +- SEM) par rapport à la stimulation maximale induite par T ou GF.

Marquage terminal in situ (ISEL)

  

[0067]    L'ISEL a été effectué sur des cellules d'HBP en utilisant la peroxydase du kit de détection de l'apoptose in situ Apop Tag en suivant les instructions du fabricant. Les cellules ont été incubées avec T (10 nM), KGF (10 ng/ml) ou Des (1-3)IGF-I (10 ng/ml) avec ou sans le composé A (10 nM). Le pourcentage de cellules apoptotiques (le nombre de cellules colorées divisé par le nombre total de cellules) a été calculé dans au moins cinq champs séparés par lame porte-objet dans cinq lames porte-objet différentes. Les résultats sont exprimés en moyenne +- SEM de trois expériences séparées.

Test d'inhibition de la 5-[alpha]-réductase

  

[0068]    Le dosage de l'inhibition de la 5-[alpha]-réductase a été effectué en utilisant des cellules CHO 1827, transfectées par 5[alpha]R-1, ou des cellules CHO 1829, transfectées par 5[alpha]R-2, tel que décrit (voir Guarna A, et al. Journal of Medicinal Chemistry (2000) 43, 3718-3735). Le composé A a été ajouté dans une gamme de concentration allant de 10<-9> à 10<-5>M, en utilisant le finastéride en tant qu'inhibiteur de contrôle dans chaque expérience.

Test de liaison

  

[0069]    Les dosages de fixation sur des fractions de cytosol de fragments d'HBP ont été effectués tel que précédemment décrit (voir Crescioli C et al. Endocrinology (2003) 144, p. 3046-3057), (concentration finale en protéine: 1,8 mg/ml). Les incubations des fractions cytosoliques ont été effectuées avec des concentrations croissantes (0,125, 0,25, 0,5, 1 nM) de [<3>H]-R1881 (activité spécifique: 83,5 Ci/mmol) en l'absence ou en présence ([<3>H]-R1881: 1 nM) de concentrations croissantes de R1881 froid (10<-><10>à 10<-6> M), de DHT (10<-10> à 10<-6>M), de T (10<-10> à 10<-6> M), de bicalutamide (10<-10> à 10<-4> M), et de composé A (10<-10> à 10<-4> M). Pour prévenir la fixation de R1881 au récepteur de la progestérone, 1 [micro]M d'acétonide de triamcinolone a été ajouté à chaque tube.

   La séparation du ligand fixé et non fixé a été effectuée tel que précédemment décrit (voir Crescioli C et al. Endocrinology (2003) 144, p. 3046-3057). La teneur en protéines a été déterminée par la méthode connue de Bradford, en utilisant le BSA en tant que standard.

Test par luciférase

  

[0070]    Des cellules PC3 transfectées de façon stable par l'AR humain ont été transférées dans des plaques de 24 puits avec une densité de 2 x 10<4> dans un milieu de Ham F12 plus 10% de FCS. Après 24 heures, les cellules ont été transfectées par 750 ng/puit de plasmide pLSPP contenant la configuration de séquence de type sauvage du MMTV-LTR fixé au gène de la luciférase de la luciole (voir Pazzagli M. et al. Analytical Biochemistry (1992) 204, p. 315-323.), en utilisant la lipofectamine 2000 (1 mg/ml) selon les instructions du fabricant. Après 48 h, les cellules ont été incubées avec le DHT (10<-12>à 10<-6> M) ou le bicalutamide (10<-9>à 10<-5> M), en présence de 3 nM de DHT, et avec une concentration équimolaire de composé A pendant 18 h. Les stéroïdes et l'analogue composé A ont été dissous dans l'éthanol.

   Les cellules transfectées incubées avec de l'éthanol seulement ont servi seulement de témoins positifs.

  

[0071]    Le dosage de la luciférase a été effectué à l'aide d'un luminomètre Berthold selon les instructions du fabricant (Luciférase Assay System, Promega, Milan, Italie). Les cellules ont été lysées directement dans la plaque avec 200 [micro]l d'une solution tampon de lyse. L'activité de la luciférase a été mesurée sur 20 [micro]l de lysat cellulaire pendant 10 s après l'addition de 100 [micro]l de luciférine. La mesure des protéines totales a été effectuée sur 20 [micro]l de lysat cellulaire. Au moins trois analyses indépendantes ont été faites en deux exemplaires.

Résultats

  

[0072]    L'incubation des cellules d'HBP avec des concentrations croissantes de calcitriol ou de composé A inhibe la croissance cellulaire (fig. 1 Panel A) . Les deux composés inhibent la prolifération cellulaire en fonction de la dose. L'analyse ALLFIT (voir De Lean A, et al. American Journal of Physiology (1978) 235, p. E97-E102) a indiqué que, bien que l'inhibition maximale du calcitriol et du composé A ("Cmpd A" sur les figures) n'était pas statistiquement sensiblement différente (Imax = 43 +- 1%), leur activité relative était, le composé A étant plusieurs unités de log plus efficace que le calcitriol, (-logIC50du composé A = 15,8 +-0,3 par rapport à -logIC50du calcitriol = 10,2 +- 0,6, P < 0,005).

  

[0073]    La prolifération des cellules d'HBP a été sensiblement augmentée (P < 0,01) par la testostérone (T) (156 +- 8%), et les facteurs de croissance (GF), tels que Des(1-3)IGF-I (194 +- 6%) ou KGF (183 +- 5%). Lorsque la croissance cellulaire a été stimulée pendant 48 h avec T ou GF (fig. 1, panel B) l'effet inhibiteur du composé A était encore bien plus prononcé (Imax = 66,6 +- 7,3%). La modélisation mathématique (voir De Lean A, et al. American Journal of Physiology (1978) 235, p. E97-E102) des courbes d'inhibition a indiqué que le composé A était plus puissant dans les cellules d'HBP stimulées avec T (-logIC50s = 16,4 +- 0,6) qu'avec les deux autres facteurs de croissance (-logIC50s = 12,7 +- 0,6, et -logIC50= 14,2 +- 0,6 pour Des(1-3)IGF-I et KGF, respectivement; P < 0,0001).

  

[0074]    Le composé A (1 nM) a antagonisé la prolifération des cellules d'HBP stimulée non seulement par T mais également par DHT dans une mesure similaire à l'acétate de cyprotérone antagoniste d'AR (Cyp, 100 nM; fig. 2panel A et B). Réciproquement, le finastéride inhibiteur de la 5-[alpha]-réductase (F, 1 nM) a antagonisé seulement la croissance cellulaire induite par T (fig. 2, panel A). De plus, le composé A a réduit la croissance même dans les cellules non stimulées par un androgène (fig. 2, panel A).

  

[0075]    Pour évaluer les propriétés anti-androgènes potentielles du composé A, en plus de l'inhibition de la croissance des cellules d'HBP, nous avons étudié son interaction avec AR. Dans un premier temps, nous avons éliminé la possibilité que le composé A se fixe à l'AR en réalisant des études de concurrence dans des homogénats humains d'HBP, en utilisant l'androgène synthétique [<3>H]-R1881 en tant que ligand marqué. L'analyse LIGAND (voir Munson PJ et al. Analytical Biochemistry (1980) 107, p. 220-239,) des données a indiqué que R1881 non marqué, DHT, T, et le bicalutamide antagoniste d'AR ont complètement déplacé la fixation de [<3>H]-R1881 (tableau I). Réciproquement, le composé A n'a pas concurrencé la fixation de [<3>H]-R1881 à n'importe quelle concentration examinée (tableau I).

   Ces résultats ont été confirmés et prolongés en utilisant un dosage du gène rapporteur de la luciférase. Dans les cellules PC3 exprimant AR pleine longueur couplées à un gène rapporteur de la luciférase, DHT a stimulé une augmentation en fonction de la dose de l'activité de la luciférase (EC50 =2 +- 1,3 nM, panel A), tandis que le bicalutamide a inhibé l'activité stimulée par DHT (IC50 = 194 +- 80 nM, panel B). Dans ce système, la concentration croissante du composé A n'a stimulé ni inhibé l'augmentation de l'activité de la luciférase induite par AR (fig. 3). Enfin, afin de vérifier si le composé A interagit ou pas avec la formation de DHT, le métabolite actif de T, nous avons effectué des expériences dans des cellules CHO transfectées par la 5-[alpha]-réductase de type 1 et de type 2.

   Les résultats ont été comparés à ceux obtenus avec le finastéride (F). Tandis que F a inhibé la conversion de T en DHT avec l'IC50s attendu, (IC50 pour la 5-[alpha]-réductase de type 1 = 659 +- 100 nM et IC50 pour la 5-[alpha]-réductase de type 2 = 53,7 +- 11 nM, n = 3). Le composé A n'a pas interféré avec l'une ou l'autre isoenzyme jusqu'à la gamme micromolaire (données non montrées).
<tb>Ligand d'AR<sep>Constantes d'affinité
(Kd nmol/L)


  <tb>R1881<sep>0,16 +- 0,06


  <tb>DHT<sep>0,07 +- 0,03


  <tb>T<sep>1,89 +- 0,94


  <tb>Bicalutamide<sep>159 +- 82


  <tb>Composé A<sep>> 100 000

Tableau I Constantes d'affinité des agonistes androgènes (R1881, DHT, T), d'un antagoniste (bicalutamide) et du composé A dans des homogénats humains de l'HBP tels que détectés par la fixation de [3H]R1881

  

[0076]    L'effet du composé A dans les cellules d'HBP était, au moins en partie, dû à l'activation de la mort programmée des cellules telle que détectée par le test ISEL (n = 3, tableau II). Le pourcentage de noyaux apoptotiques a considérablement augmenté (270%) après une exposition de 48 h au composé A à 10 nM (P < 0,01 par rapport au contrôle). Réciproquement, le traitement avec T (10 nM), ou GFs (10 ng/ml) a réduit de manière significative (P < 0,01) le nombre de cellules apoptotiques d'HBP par comparaison avec les cellules non traitées (Des(1-3)IGF-I = -42%; KGF = -54%; T = -27%). Cependant, même en présence de GFs ou de T, le composé A a induit une augmentation soutenue (plus de 250%) et significative (P < 0,01) du nombre de cellules d'HBP positives au test ISEL.

Index apoptotique (%)

  

[0077]    
<tb> <sep>Contrôle<sep>Composé A


  <tb>Contrôle<sep>18,55 +- 0,8<sep>68,44 +- 1,26<a>


  <tb>Des (1-3) IGF-I<sep>10,69 +- 0,6<a><sep>45,85 +- 0,66<a, ><b, c>


  <tb>KGF<sep>8,5 +- 0,42<a><sep>44,46 +- 0,57< a, ><b, c>


  <tb>T<sep>13,56 +- 0,72<a><sep>49,06 +- 1,87< ><a><, ><b, c>

Tableau II: Effet du composé A (10 nM) , GFs (10 ng/ml) ou T (10 nM) sur la fragmentation d'ADN dans les cellules d'HBP.

  

[0078]    L'index apoptotique (%) représente le nombre de noyaux colorés, tels que détectés par le test ISEL, sur la totalité des cellules d'HBP dans chacun d'au moins 5 champs séparés par lame porte-objet. Les résultats sont exprimés en moyenne +- SEM dans trois expériences séparées. Le composé A peut induire une apoptose dans les cellules d'HBP non traitées ainsi que dans les cellules d'HBP incubées simultanément avec GFs ou T (a : P < 0,01 par rapport au contrôle; b: P < 0,01 par rapport aux cellules traitées avec le composé A; c: P < 0,01 par rapport aux cellules traitées avec GF ou T).

Exemple 2 : Propriétés anti-prolifératives du composé A dans des modèles de croissance de la prostate in vivo Protocoles impliquant des animaux

  

[0079]    Des rats Sprague Dawley mâles (âgés de 28 jours) ont été achetés auprès de Charles River Laboratories (Calco, Lecco, Italie). Toute l'expérimentation animale décrite a été réalisée conformément aux normes admises pour la santé des animaux. La castration a été effectuée par voie scrotale sous anesthésie avec un mélange kétamine/xylazine. Trois jours après la castration, les rats (5 à 8 animaux par groupe) ont été traités ou pas avec de l'énanthate de T (30 mg/kg) par deux injections sous-cutanées séparées par semaine. Les rats ont été traités oralement pendant 5 jours la première semaine, et 4 jours la seconde semaine avec un véhicule (miglyol 812), le composé A (10, 30, 100 et 300 [micro]g/kg) ou le finastéride (10 et 40 mg/kg) pour un total de 9 administrations, et sacrifiés un jour plus tard.

  

[0080]    Alternativement, des rats mâles adultes intacts, Sprague Dawley (poids 250 g) ont été traités oralement avec un véhicule (miglyol 812), le composé A (10, 30, 100 et 300 [micro]g/kg) ou le finastéride (10 et 40 mg/kg) 5 jours/semaine pendant 5 semaines consécutives et pendant deux jours supplémentaires la 6<e>semaine, pour un total de 27 administrations, sauf indication contraire. Le sang pour les mesures de la teneur en calcium et en hormone a été obtenu à la fin de chaque protocole expérimental.

Analyse Northern de l'hybridation

  

[0081]    L'ARN total a été extrait en utilisant RNAFast obtenu auprès de Molecular System (San Diego, CA). Les conditions d'empreinte, de marquage, d'hybridation et les sondes (ADNc pleine longueur de clustérine de rat 1,5 Kb et ADNc pleine longueur de la GAPDH 1,2 Kb) ont été effectuées selon les procédures publiées (Bettuzzi et al., Biochemical Journal, (1989), 257, p. 293-296 et Marinelli et al., Biochemistry and Cell Biology (1994), 72, p. 515-521). La quantification des autoradiogrammes a été obtenue par balayage densitométrique en utilisant un densitomètre LKB Ultrascan XL.

Immunohistochimie

  

[0082]    Toutes les sections cryostatiques obtenues à partir des contrôles et des rats traités ont été transformées en parallèle tel que décrit précédemment (Astancolle et al., Journal of Endocrinology, (2000), 167, p 197-204). Pour chaque condition expérimentale, 3 sections alternées de 3 prostates différentes de rat ont été examinées. Les contrôles négatifs, effectués en excluant l'anticorps spécifique de la réaction, n'ont montré aucune coloration spécifique. La contre-coloration a été effectuée avec l'hématoxyline, et des lamelles couvre-objet ont été montées avec Eukitt (O. Kindler GmbH et Co. Allemagne). Des images numériques couleurs de fort grossissement ont été acquises par un appareil photo CCD par l'intermédiaire du microscope.

Analyse de la fragmentation d'ADN in situ (TUNEL)

  

[0083]    La fragmentation d'ADN dans les sections cryostatiques de la prostate, évaluée par le test TUNEL de marquage par la désoxynucleotidyl transférase terminale (TdT), a été effectuée en utilisant le kit de détection de la mort cellulaire in situ (POD, Roche) comme le recommande le fabricant. Les noyaux apoptotiques positifs au test TUNEL ont été documentés par des images numériques couleurs de fort grossissement acquises par un appareil photo CCD par l'intermédiaire du microscope. La contre-coloration a été effectuée avec l'éosine, et les lamelles couvre-objet ont été montées avec Eukitt (0 Kindler Gmbh et Co., Allemagne).

Mesures du calcium

  

[0084]    Les taux sériques de calcium ont été mesurés à l'aide d'une analyse colorimétrique disponible dans le commerce (Sigma), selon les instructions des fabricants.

Mesure de la testostérone et de rLH

  

[0085]    Les taux sériques des hormones T et rLH ont été déterminés à l'aide de kits disponibles dans le commerce de dosage radioimmunologique, selon les instructions des fabricants. Pour mesurer le taux sérique de T chez les rats, les échantillons ont été ajoutés dans un premier temps à 4 volumes d'éther diéthylique, mélangés par retournement doux pendant 15 min et ensuite centrifugés pendant 5 min à 2000 tr/min. La phase aqueuse a été congelée dans de la glace sèche et la phase organique a été recueillie et évaporée à sec sous un flux d'azote. L'extrait sec a été reconstitué dans la solution tampon du dosage comme suit: (1 vol:1 vol) chez les rat intacts, et (4 vol:1 vol) chez les rats castrés.

  

[0086]     Analyse statistique

  

[0087]    L'analyse statistique a été effectuée par ANOVA à un facteur et par des tests t de Student appariés ou non-appariés, si approprié. Les données de fixation ont été analysées en utilisant le programme informatisé LIGAND (Munson et al., Analytical Biochemistry (1980), 107, p. 220-139).

  

[0088]    Le programme informatique ALLFIT (De Lean et al., American Journal of Physiology (1978), 235, p. E97-E102), a été utilisé pour l'analyse des courbes dose-effet sigmoïdes afin d'obtenir les estimations des valeurs correspondant à la moitié du maximum de l'inhibition (IC50) et des valeurs correspondant à la moitié du maximum de la stimulation (EC50) ainsi que les effets de l'inhibition maximale (Imax) et de la stimulation maximale (Emax). Les données ont été exprimées en (moyenne +- SEM).

Résultats

  

[0089]    Afin d'examiner les propriétés anti-prolifératives du composé A sur des modèles de la croissance de la prostate in vivo, les rats castrés et intacts ont été traités oralement avec des concentrations croissantes de composé A (10 à 300 ug/kg) ou de finastéride (F) (10, 40 mg/kg). Comme le montre la fig. 4, panel A, la castration a nettement réduit le poids de la prostate ventrale, tandis qu'un traitement de deux semaines avec l'énanthate de testostérone (T) (30 mg/kg) a non seulement complètement reconstitué, mais aussi stimulé sa croissance. Le composé A, à n'importe quelle dose testée, a complètement émoussé la surcroissance de la prostate stimulée par T, réduisant le poids de la prostate ventrale à une valeur inférieure à celui des rats non traités. Des résultats similaires ont été obtenus avec le finastéride (10, 40 mg/kg).

   Un traitement d'un mois sur des rats adultes intacts avec le composé A a diminué de manière significative le poids de la prostate ventrale, avec une réduction maximale (30%) à la plus forte dose testée (300 [micro]g/kg). A cette dose, l'effet d'inhibition du composé A sur la croissance de la prostate était comparable à celui induit par 10 ou 40 mg/kg de finastéride (fig. 4, panel B). Dans tous les protocoles expérimentaux, l'administration orale de différentes doses du composé A a causé une hypercalcémie très modeste seulement à la plus forte dose testée (300 [micro]g/kg) (tableau III). Aucun autre effet secondaire perceptible n'a été observé.
<tb> <sep>Calcémie


  <tb>Témoin<sep>10,2 +- 0,16


  <tb>Composé A 10 [micro]g/kg<sep>10,16 +- 0,24


  <tb>Composé A 30 [micro]g/kg<sep>9,87 +- 0,15


  <tb>Composé A 100 [micro]g/kg<sep>10,55 +- 0,18


  <tb>Composé A 300 [micro]g/kg<sep>10,85 +- 0,1

Tableau III Calcémie (mg/dl) chez des rats castrés dans lesquels on a remplacé T après différentes doses (10, 30, 100, 300 [micro]g/kg) de composé A. Le composé A n'a jamais fait varier les taux sériques de calcium chez les rats castrés dans lesquels on a remplacé T par l'énanthate de T (30 mg/kg/semaine) par comparaison avec les contrôles. Des résultats similaires ont été obtenus chez les rats intacts (non montrés). Les résultats représentent la moyenne + SEM des rats/groupe.

  

[0090]    Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la réduction du poids de la prostate induite par le composé A, l'expression du gène de la clustérine et de la protéine et les caractéristiques morphologiques de l'apoptose ont été évaluées par le test TUNEL de marquage par la désoxynucleotidyl transférase terminale (TdT). La clustérine est un gène omniprésent, strictement lié à l'arrêt du cycle cellulaire et à l'atrophie, dont l'expression est diminuée par les androgènes. La fig. 5, panel A, montre l'expression prostatique de l'ARNm de la clustérine, telle que détectée par une analyse Northern, chez les rats orchidectomisés auxquels on a ajouté T ou pas. La castration a nettement augmenté l'abondance d'ARNm de la clustérine, tandis que cet effet a été complètement inversé par une administration de deux semaines de T.

   Le traitement simultané avec différentes concentrations de composé A (300 et 100 [micro]g/kg) ou de F (40 mg/kg) a partiellement émoussé la diminution de l'expression du gène de la clustérine induite par T. Chez les rats intacts (fig. 5, panel B) , une administration d'un mois de différentes concentrations de composé A (30 et 100 [micro]g/kg) a induit une augmentation soutenue de l'expression du gène de la clustérine dans la prostate, comparable, ou même supérieure, à celle induite par 40 mg/kg de F.

  

[0091]    L'expression locale de la clustérine dans la prostate de rats orchidectomisés est montrée sur la fig. 6. La castration a induit une atrophie marquée et répandue dans la glande de la prostate, et presque toutes les cellules épithéliales cubiques annexes au lumen de la glande étaient positives à la clustérine (panel A). Le remplacement de T (panel B) a inversé les caractéristiques morphologiques de l'atrophie et a réduit uniformément la coloration de la clustérine. Un tel effet a été évité par l'administration simultanée de composé A (panels C et E). Les panels D, et F montrent des résultats de test TUNEL dans des sections adjacentes à celles montrées dans les panels C et E.

   Le traitement avec le composé A (100 [micro]g/kg, panel D, et 300 [micro]g/kg, panel F) a induit une fragmentation nucléaire évidente dans les cellules épithéliales et stromales, et une apoptose était détectable à la fois dans les cellules positives et dans les cellules négatives à la clustérine. Les deux premiers panels de la fig. 7montrent la morphologie de la glande de la prostate de rats intacts traités pour la détection de clustérine, avec (panel A) ou sans (panel B) omission de l'anticorps primaire. Il est à noter que le marquage à la clustérine est presque absent dans la prostate de rats adultes non traités (panel B), car il s'agit d'une fragmentation nucléaire (TUNEL, panel C). Réciproquement, le traitement avec différentes doses de composé A a induit l'expression de la clustérine (panels D à F) et une apoptose (C, G et I).

   Le panel F montre, en comparaison, l'effet du finastéride (40 mg/kg) sur la positivité à la clustérine dans la glande de la prostate.

  

[0092]    Afin d'éliminer la possibilité que le composé A réduise la croissance de la prostate in vivo en interférant avec la fonction pituitaire ou testiculaire, les taux sériques d'hormone lutéinisante du rat (rLH) et de T ont été mesurés chez des rats castrés et intacts. Comme on pouvait s'y attendre (tableau IV, panel A), la castration a réduit de manière significative T tandis qu'elle a augmenté les taux sériques de rLH. L'administration d'énanthate de T (30 mg/kg) (deux semaines) a complètement inversé l'effet de l'orchidectomie. Le traitement oral avec le composé A (100 et 300 [micro]g/kg) de rats castrés dans lesquels on a remplacé T n'a pas affecté de manière significative les taux sériques de rLH ou de T. Des résultats similaires ont été obtenus chez les rats intacts (tableau IV, panel B) .

   En fait, l'administration chronique (1 mois) de composé A (10, 30, 100 [micro]g/kg) ou de F (40 mg/kg) à des rats intacts n'a pas modifié les taux sériques de rLH et de T.

Panel A

  

[0093]    
<tb> <sep>rLH<sep>T


  <tb>témoin (rats intacts)<sep>2,36 +- 0,46<sep>11,5 +- 2,44


  <tb>castrés<sep>20,64 +- 6*<sep>0,9 +- 0,32*


  <tb>castrés + T remplacé<sep>2,08 +- 0,36<sep>21,25 +- 4,12


  <tb>castrés + T remplacé + composé A 100 [micro]g/kg<sep>1,8 +- 0,2<sep>11,13 +- 1,02


  <tb>castrés + T remplacé + composé A 300 [micro]g/kg<sep>3,15 +- 0,65<sep>15,73 +- 2,75

Panel B

  

[0094]    
<tb> <sep>rLH<sep>T


  <tb>témoin (rats intacts)<sep>2 +- 0,16<sep>11,98 +- 2,87


  <tb>Finastéride<sep>2,2 +- 0,4<sep>18,11 +- 3,23


  <tb>Composé A 10 [micro]g/kg<sep>2,22 +- 0,25<sep>19,13 +- 3,83


  <tb>Composé A 30 [micro]g/kg<sep>2,32 +- 0,36<sep>9,39 +- 2


  <tb>Composé A 100 [micro]g/kg<sep>1,96 +- 0,13<sep>11 +- 2,14

Tableau IV Taux sériques de rLH (ng/ml) et de T (nM) chez des rats castrés dans lesquels on a remplacé T (panel A) ou intacts (panel B) après traitement avec différentes doses de composé A.

Panel A.

  

[0095]    La castration a réduit de manière significative le taux sérique de T (*P < 0,01 par rapport au contrôle) tandis qu'elle a augmenté le taux sérique de rLH (*P < 0,05 par rapport au contrôle). Après traitement avec de l'énanthate de T (30 mg/kg/semaine) les taux sériques de rLH et de T ont été rétablis. Le composé A à toutes les doses testées n'a pas affecté de manière significative les taux sériques de rLH ou de T.

Panel B. 

  

[0096]    L'administration chronique (1 mois) de F (40 mg/kg) ou de composé A (10, 30 et 100 [micro]g/kg) n'a fait varier ni le taux sérique de rLH ni le taux sérique de T chez les rats intacts.

  

[0097]    Cette étude démontre que le composé A réduit la taille de la prostate chez les rats intacts dans une mesure similaire au finastéride. De plus, comme le finastéride, le composé A supprime l'activité proliférative in vitro et in vivo de la testostérone. Cependant, à la différence du finastéride, le composé A n'inhibe pas l'activité de la 5-[alpha]-réductase de type 1 ou de type 2 et peut empêcher la croissance des cellules d'HBP induite non seulement par T mais aussi par DHT. Ces propriétés anti-androgènes du composé A sont indépendantes de l'interaction avec l'AR, comme le montre le fait que le composé A ne peut se fixer à l'AR, et ne peut agir en tant qu'agoniste AR ou antagoniste dans les cellules PC3 transfectées par AR.

   De plus, le composé A n'affecte pas la sécrétion des hormones sexuelles parce que, chez le rat, les taux plasmiques de la gonadotropine et de T ont été inchangés par une administration quotidienne de composé A pendant jusqu'à un mois. Par conséquent, le composé A agit en aval de l'interaction entre le ligand et le récepteur AR. Sans vouloir être lié par la théorie cette action se produit le plus probablement par l'intermédiaire de l'interruption du relais entre la testostérone et le facteur de croissance.

  

[0098]    Des concentrations très faibles de composé A ont pu empêcher complètement non seulement la prolifération des cellules d'HBP stimulée par T, mais également la prolifération induite par les deux facteurs de croissance intraprostatique les plus importants: IGF-I et KGF. De plus, même en présence de T ou de GFs, le composé A a induit une apoptose dans les cellules d'HBP. Le programme de mort cellulaire induit par le composé A est apparu évident également dans la prostate à la fois des rats intacts et des rats orchidectomisés dans lesquels on a remplacé T et a été caractérisé par une apparence diffuse de la fragmentation d'ADN avec une augmentation concomitante de l'expression du gène de la clustérine et de la protéine.

   La clustérine est une protéine étroitement régulée dans la prostate par les androgènes (Bettuzzi et al., Biochemical Journal (1989), 257, p. 293-296). Bien que la fonction de la clustérine ne soit toujours pas bien comprise, elle est nettement augmentée dans des conditions d'atrophie de la glande (Bettuzzi et al., Oncogene (2002), 21, p. 4328-4334, et Bettuzzi et al., Journal of Endocrinology (1992), 132, p. 361-367), et d'apoptose (Leskov et al., Journal of Biological Chemistry (2003), 278, p. 11590-11600). Ainsi, l'induction de la clustérine par traitement avec le composé A est conforme à la capacité de ce composé à inhiber la prolifération et à induire une apoptose dans les cellules de la prostate.

  

[0099]    En conclusion, cette étude indique que le composé A est efficace pour réduire la croissance des cellules de la prostate dans différents modèles expérimentaux.

Exemple 3: Réduction du poids de la prostate chez des chiens sains traités avec le composé A.

  

[0100]    Une étude de toxicité de neuf mois a été effectuée dans quatre groupes de chiens Beagle mâles, qui ont été traités quotidiennement par gavage oral avec 0,5 [micro]g, 1,5 [micro]g et 5 [micro]g/kg de poids corporel/jour de composé A (dans le véhicule Miglyol 812) ou avec le véhicule seul. Ce traitement a été suivi d'une période de guérison de deux mois pour le groupe ayant reçu la dose la plus forte, 5 [micro]g, après quoi le poids de la prostate a été mesuré. En plus des données de toxicité entièrement favorables, on a observé un poids de la prostate inférieur à la fin du traitement avec le composé A (voir fig. 8) et après guérison (voir fig. 9).

   Les résultats après guérison ont été analysés statistiquement à l'aide d'un test t de Student unilatéral et se sont avérés être sensiblement différents entre le composé A et le véhicule (P < 0,05). Ces résultats démontrent en outre la capacité du composé A à réduire la taille de la prostate in vivo.

Exemple 4: Capsule de gélatine molle en tant que forme galénique orale

  

[0101]    Une capsule destinée à une administration orale est formulée sous azote et sous une lumière orange à partir de 0,01 à 25,0 mg de composé A dans 150 mg d'huile de noix de coco fractionnée (par exemple, Miglyol 812), avec 0,015 mg d'hydroxytoluène butylé (BHT) et 0,015 mg d'hydroxyanisole butylé (BHA), remplis dans une capsule de gélatine molle.

  

[0102]    La capsule est préparée à l'aide du procédé suivant:
1. Le BHT et le BHA sont mis en suspension dans de l'huile de noix de coco fractionnée (par exemple, Miglyol 812) et chauffés à environ 50[deg.]C sous agitation, jusqu'à dissolution.
2. Le composé A est dissous dans la solution de l'étape 1 à 50[deg.]C.
3. La solution de l'étape 2 est refroidie à température ambiante.
4. La solution de l'étape 3 est versée dans des capsules de gélatine molle.

  

[0103]    Toutes les étapes de fabrication sont effectuées sous une atmosphère d'azote et protégées de la lumière naturelle.

Exemple 4A : Capsule de gélatine molle en tant que forme galénique orale

  

[0104]    Une capsule destinée à une administration orale est formulée sous azote et sous une lumière orange: 150 [micro]g de composé A dans 150 mg d'huile de noix de coco fractionnée (Miglyol 812), avec 0,015 mg d'hydroxytoluène butylé (BHT) et 0,015 mg d'hydroxyanisole butylé (BHA), remplis dans une capsule de gélatine molle.

Exemple 4B: Capsule de gélatine molle en tant que forme galénique orale

  

[0105]    Une capsule destinée à une administration orale est formulée sous azote et sous une lumière orange: 75 [micro]g de composé A dans 150 mg d'huile de noix de coco fractionnée (Miglyol 812), avec 0,015 mg d'hydroxytoluène butylé (BHT) et 0,015 mg d'hydroxyanisole butylé (BHA), remplis dans une capsule de gélatine molle.

Exemple 5: Réduction du poids de la prostate dans des essais cliniques humains

  

[0106]    Une étude randomisée en double-aveugle, contrôlée par placebo, en groupe parallèle a été réalisée pour déterminer l'effet du composé A (1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol) chez des patients atteints de HBP.

  

[0107]    Le critère principal d'inclusion était que les patients masculins étaient diagnostiqués avec l'HBP et avaient un volume de la prostate > 40 ml comme déterminé par ultrasonographie transrectale (USTR).

  

[0108]    Méthodes statistiques: les analyses primaires de l'efficacité ont été effectuées sur une population traitée conformément au protocole (Per-Protocol: PP) et, en tant que support, les mêmes analyses devaient être faites sur la population à traiter. Les patients pouvant être évalués par l'analyse conformément au protocole étaient tous des patients randomisés fidèles aux critères du protocole qui ont suivi toute la durée de l'étude sans violation majeure du protocole et qui présentent des évaluations valides du volume de la prostate. Les patients valides pour la population à traiter (ITT) étaient tous des patients randomisés qui ont reçu au moins une dose du médicament d'essai et pour qui le volume de la prostate à la base et après 12 semaines était disponible.

  

[0109]    Tous les patients randomisés qui ont pris au moins une dose du médicament d'étude ont été évalués pour une analyse d'innocuité.

  

[0110]    La comparabilité du groupe de traitement a été évaluée à la base pour tous les patients présentant la signification descriptive. Les données ont été traitées par le test du chi-carré pour les variables nominales, et par le modèle ANOVA pour les variables continues.

  

[0111]    Les statistiques descriptives ont été calculées au moyen de procédés habituels: la moyenne, l'écart type, les valeurs minimale et maximale sur des variables continues, et les fréquences absolue et relative pour les variables nominales. Les statistiques descriptives ont été faites pour chaque traitement et pour chaque visite/semaines.

  

[0112]    Les centres ayant moins de 4 patients ont été mis en commun.

  

[0113]    La variable d'efficacité primaire était le pourcentage de changement du volume de la prostate, mesuré par le balayage axial MRI centralisé. Un modèle ANOVA a été utilisé pour l'analyse, avec le traitement et le centre en tant qu'effets fixes.

  

[0114]    Les participants à l'étude ont reçu une capsule de 150 [micro]g (selon l'exemple 4A avec le médicament omis dans le cas du placebo) une fois quotidiennement le matin. La durée du traitement était de 12 semaines. Le nombre de patients impliqués était comme suit:
<tb> <sep>Composé A<sep>Placebo<sep>Total


  <tb>Patients randomisés<sep>57<sep>62<sep>119


  <tb>Patients ayant accompli le traitement<sep>56
(98,3%)<sep>60
(96,8%)<sep>116
(97,5%)


  <tb>Patients ayant interrompu ou n'ayant pas suivi le traitement<sep>0<sep>2
(3,2%)<sep>2
(1,7%)


  <tb>Effet thérapeutique insuffisant<sep>1
(1,8 %)<sep>0<sep>1
(0,8%)

Pourcentage de changement du volume de la prostate mesuré par balayage axial

  

[0115]    Le pourcentage de changement du volume de la prostate dans la population PP était de -1,89 +- 5,2 dans le groupe du composé A par rapport à 4,99 +- 5,99 dans le groupe du placebo avec une valeur de p significative < 0,0001 en faveur du composé A. L'évaluation de la différence entre les traitements (composé A moins le placebo) était de -7,24 avec une limite de confiance à 95% de -9,54 et de -4,94. L'effet du centre était également significatif (p = 0,0176). La même analyse effectuée sur la population ITT a confirmé les résultats (p = 0001), c'est-à-dire que le composé A était plus efficace que le placebo pour réduire le volume de la prostate.

  

[0116]    Dans les patients présentant un volume de base de la prostate > = 80 ml la différence entre les groupes de traitement (p = < 0,0001) était plus claire par comparaison avec les patients présentant un volume de base de la prostate < 60 ml (p = 0,0320) particulièrement dans la population PP.

  

[0117]    Chez les patients âgés entre 61 et 70 ans la différence entre les traitements, toujours en faveur du composé A, était plus évidente qu'avec les traitements des patients plus âgés (âge > 70 ans). En fait, dans la population ITT, la différence entre les traitements chez les patients ayant un âge > 70 ans a eu une signification de p = 0, 0540 par rapport à p = < 0, 0001 pour les autres classes de patients.

Répondeurs

  

[0118]    La proportion de répondeurs observés avec le composé A était de 27,5%, dans la population PP, avec une proportion inchangée de 65% et seulement 7,5% de patients n'étaient pas répondeurs. Dans le groupe du placebo la classe des répondeurs était nulle, en fait, les patients ont été équitablement répartis en une classe de patients ne présentant aucun changement et une classe de répondeurs (50% dans chaque classe). Le test du chi-carré comparant les proportions a confirmé les résultats observés pour la variable d'efficacité primaire, p = < 0,0001, c'est-à-dire que le composé A était plus efficace que le placebo pour réduire le volume de la prostate.

  

[0119]    Dans la population ITT les résultats ont été confirmés, la proportion de répondeurs dans le groupe du composé A étant de 28,8%, avec une valeur de p déterminée par le test du chi-carré < 0,0001 entre les traitements.

  

[0120]    La réduction moyenne du volume de la prostate par rapport au volume de base chez les patients répondeurs était de -6,88 +- 2,5, dans la population PP, tandis que la différence moyenne chez les patients ne présentant aucun changement est de -0,35 +- 2,3 dans le groupe du composé A par rapport à 0,40 +- 2,0 dans le groupe du placebo. Pour les patients non répondeurs la différence moyenne était de 3,93 +- 0,8 dans le groupe du composé A par rapport à 7,48 +- 4,9 dans le groupe du placebo, ce qui confirme la meilleure efficacité du composé A pour contrôler et réduire le volume de la prostate.

Pourcentage de changement du volume de la prostate mesuré par balayage paraxial et transitoire centralisé

  

[0121]    Les analyses de support avec une acquisition paraxiale et transitoire ont confirmé les résultats obtenus avec un balayage axial. En particulier, dans la population PP, pour l'acquisition paraxiale le pourcentage de changement était de -1,30 +- 6,9 dans le groupe du composé A par rapport à 2,57 +- 6,8 dans le groupe du placebo, p = 0,0172; tandis que pour le balayage transitoire le pourcentage de changement était de -0,22 +- 9,6 pour le groupe du composé A par rapport à 6,18 +- 10,9 pour le groupe du placebo, p = 0, 0028. Egalement, dans la population ITT il y avait une différence significative entre les traitements en faveur du composé A, concernant la réduction du volume de la prostate.

Taux sériques totaux de PSA et d'hormone

  

[0122]    Le changement moyen de PSA dans le groupe du composé A était de 0,23 +-1,3 par rapport à 0,43 +- 1,7 dans le groupe du placebo, pour la population PP. Aucune différence significative n'a été observée entre les traitements (p = 0,2722).

  

[0123]    Egalement, pour la testostérone, dans la population PP, il n'y avait aucune différence significative entre les groupes (p = 0,2150), avec un changement moyen de 0,07 +- 1,5 dans le groupe du composé A par rapport à 0,22 +- 1,4 dans le groupe du placebo.

  

[0124]    Il n'y avait aucune différence entre les groupes de traitement pour la dihydrotestostérone (p = 0,7257 -population PP), avec un changement moyen observé dans la population PP de -30, 77 +- 227,71 dans le groupe du composé A par rapport à -166,76 +- 490,26 dans le groupe du placebo.

  

[0125]    Il n'y avait aucune différence en hormone LH (p = 0,9320 - population PP), avec un changement moyen du composé A de -0,02 +-1,7 par rapport à -0,00 +-1,8 dans le groupe du placebo pour la population PP.

  

[0126]    Les changements moyens observés de taux de PSA et d'hormone étaient autour de zéro, excepté pour DHT, le composé A ne modifie pas les taux d'hormone.

  

[0127]    Les mêmes résultats ont été confirmés dans la population ITT.

Innocuité

  

[0128]    Le nombre de patients présentant au moins un événement indésirable était de 31 (17 dans le groupe du composé A, 14 dans le groupe du placebo); aucun patient n'a renoncé à cause d'événements indésirables, et seulement un patient dans le groupe du placebo a éprouvé un événement indésirable sérieux: une cholécystite aiguë, résolue par une hospitalisation.

  

[0129]    Le nombre de patients présentant des événements indésirables liés au traitement avec le composé A était de 3 (5,26%), tandis que le nombre de patients présentant des événements indésirables liés au traitement était de 6 (9,68%) dans le groupe du placebo. Les événements liés au composé A étaient: des vertiges, des maux de tête, une diminution de la libido et des bouffées de chaleur, tandis que les événements liés au placebo étaient: une augmentation de phosphate dans l'urine, des maux de tête, une syncope, une diminution de la libido (3 patients), une hypercalciurie, un dysfonctionnement érectile et des bouffées de chaleur.

  

[0130]    Les valeurs de calciurie surveillées sur la totalité de la durée de l'étude dans le groupe du composé A n'ont pas différé de manière significative du groupe du placebo.

Conclusion

  

[0131]    Dans cette étude courte constituant la preuve du concept de l'effet du composé A sur la taille de la prostate chez des patients ayant une HBP, le médicament s'est avéré efficace. L'analyse de la variable primaire de l'étude, à savoir l'évaluation de la taille de la prostate, a montré une différence significative entre le composé A et le placebo, confirmant de ce fait que le médicament testé peut arrêter la progression de la maladie. Le profil d'innocuité était bon, il n'y avait aucune incidence différente des événements indésirables entre le composé A et le placebo, et aucun événement indésirable grave n'a été signalé dans le groupe du composé A.

   Le médicament testé était exempt de tout effet anti-androgène, il n'a eu aucun effet sur les taux de PSA, et n'a eu aucun effet significatif sur l'homéostasie du calcium.

Exemple 6: L'activité du composé A sur la croissance et la fonction des cellules vésicales

  

[0132]    Le composé A s'est avéré efficace pour inhiber la croissance basique des cellules vésicales et celle stimulée par la testostérone. Cette activité, qui n'a jamais été signalée auparavant, est dépendante de la dose avec 1,6 +- 7 x 10<-15>pour le 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16, 23e-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol ("composé A"/"Cmpd A" sur les figures) (sur les cellules stimulées) (voir fig. 10 et fig. 11).

  

[0133]    Cet effet était sensiblement plus important que celui du finastéride anti-androgène largement utilisé dans le traitement des maladies urogénitales (fig. 11).

Exemple 7: L'effet du composé A sur le dysfonctionnement de la vessie dans un modèle d'obstruction du col de la vessie

Partie expérimentale

1. Matériaux

  

[0134]    1.1. Animaux:
Rats femelles Sprague-Dawley, pesant 200 à 250 g
1.2. Regroupement

  

[0135]    Groupe A:
rats BOO, traités avec le composé A pendant 2 semaines, commençant un jour après la création de l'obstruction (n = 12)
Groupe B: rats BOO, traités avec un véhicule pendant 2 semaines, commençant un jour après la création de l'obstruction (n = 12)
Groupe C: rats ayant subi une opération fictive, traités avec le composé A pendant 2 semaines, commençant un jour après l'intervention chirurgicale (n = 12)
1.3. Etudes:
a) Cystométrie (environ 18 heures après la dernière administration du médicament/véhicule, 12 heures après l'enlèvement de la ligature d'obstruction) dans un état conscient.
b) Mesures du poids de la vessie
c) Etudes in vitro

2. Méthodes

  

[0136]    2.1. Obstruction du col de la vessie (BOO):
La vessie et la jonction urétéro-vésicale ont été exposées à travers une incision abdominale inférieure de longueur intermédiaire. Une tige en métal de 0,9 mm a été placée à côté de l'urètre proximale et une ligature avec un fil de soie 3/0 a été attachée solidement autour de l'urètre et de la tige, qui a été ultérieurement retirée. L'intervention chirurgicale fictive a été effectuée par conséquent, sans placer la ligature. Après 13 jours, la ligature a été retirée et un cathéter a été inséré dans le dôme de la vessie et implanté en sous-cutané.
2.2. Cystométrie
Le matin suivant l'insertion du cathéter, un examen cystométrique a été effectué sans aucune anesthésie ou contrainte dans une cage métabolique.

   La quantité d'urine évacuée a été mesurée à l'aide d'un collecteur de liquide, relié à un transducteur de déplacement de force. La vessie a été remplie en continu de solution saline à température ambiante. Le cathéter a été également relié à un transducteur de pression. Après une période de stabilisation de 30 à 60 min, lorsque les modèles d'évacuation étaient reproductibles, les paramètres suivants ont été enregistrés pendant 30 min: pression à la base de la vessie, pression de la miction, pression de seuil, intervalle et volume de la miction, et contractions vésicales. La quantité de résidu post-mictionnel a été étudiée manuellement 3 fois, à la fin de la cystométrie. La capacité de la vessie a été calculée sur la base des valeurs mesurées.
2.3. Etudes in vitro
2.3.1.

   Préparations
Une fois les cystométries terminées, les rats ont été sacrifiés par asphyxie à l'oxyde de carbone suivie d'une exsanguination. L'abdomen a été examiné par une incision inférieure de longueur intermédiaire à la suite de quoi la symphyse a été ouverte. La vessie a été soigneusement disséquée librement, et immédiatement placée sous forme hachée dans une solution de Krebs, et des préparations de bande ont été disséquées.
2.3.2 Enregistrement de l'activité mécanique
La vessie et l'urètre ont été séparées au niveau du col de la vessie, et des bandes semi-circulaires ont été préparées à partir du tiers moyen du détrusor (1 x 2 x 5 mm). Toutes les préparations ont été utilisées juste après l'enlèvement.
Les bandes ont été transférées dans des bains de tissus de 5 ml contenant la solution de Krebs.

   La solution de Krebs a été maintenue à 37[deg.]C et soumise en continu à un barbotage d'un mélange de 95% d'O2 et de 5% de CO2, conduisant à un pH de 7,4. Les bandes ont été suspendues entre deux crochets en forme de L à l'aide d'une ligature au fil de soie. Un crochet a été relié à une unité mobile permettant l'ajustement de la tension passive, et l'autre à un transducteur de force Grass FT03C (Grass Instruments Co, MA, Etats-Unis). La tension isométrique a été enregistrée en utilisant un polygraphe Grass (7D) . Après montage, les bandes ont été étirées à une tension passive de 4 mN (la même tension pour toutes les préparations) et on les a laissé revenir à l'équilibre pendant 45 à 60 min avant que les autres expériences soient effectuées.
2.3.3.

   Stimulation électrique
La stimulation électrique (EFS) a été accomplie à l'aide de deux électrodes en platine placées de chaque côté des préparations, et a été effectuée en utilisant un stimulateur Grass S48 ou S88, fournissant de simples impulsions carrées à des fréquences choisies. La durée du train de stimuli était de 5 s, la durée d'impulsion de 0,8 ms, et l'intervalle de stimulation de 2 min. La polarité des électrodes a été inversée après chaque impulsion à l'aide d'une unité de changement de polarité.
2.3.4 Procédé
Chaque expérience a été débutée en exposant les préparations à une solution de Krebs à K<+> élevé (124 mM) jusqu'à ce que deux contractions reproductibles soient obtenues.

   Ensuite, les expériences suivantes ont été effectuées:
a) La stimulation électrique sur les nerfs a été effectuée et la réponse en fréquence a été obtenue, en présence et en l'absence d'atropine.
b) Les courbes concentration-réponse ont été tracées pour le carbachol et l'ATP.

Résultats

  

[0137]    Le modèle validé d'obstruction du col de la vessie chez le de rat décrit ci-dessus a été utilisé pour examiner la capacité du composé A à contrôler et traiter le dysfonctionnement de la vessie. L'objectif était d'évaluer si un analogue de la vitamine D3 (1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23e-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol - composé "A" à la dose de 150 [micro]g/kg/quotidiennement) peut prévenir l'hypertrophie de la vessie et le dysfonctionnement de la vessie tel que l'hyperactivité de la vessie.

  

[0138]    Dans ce modèle, une ligature a été chirurgicalement placée autour du col de la vessie cathétérisée, de sorte que lorsque le cathéter a été retiré, la vessie a expérimenté une résistance urétrale accrue. Les rats ont subi une cystométrie continue pour évaluer la fonction de la vessie. De plus, les propriétés contractiles d'une préparation de vessie isolée en réponse à la stimulation nerveuse et à des stimuli exogènes in vitro ont été étudiées sous une stimulation électrique (EFS).

  

[0139]    Les paramètres cystométriques suivants ont été examinés (voir fig. 12 à 16):
-  la pression de la miction (la pression maximale de la vessie pendant la miction),
- la capacité de la vessie (le volume résiduel après évacuation plus le volume de solution saline infusée pour induire l'évacuation),
- le volume de la miction (volume d'urine expulsée)
- le résidu post-mictionnel (capacité de la vessie moins le volume de la miction) et
- la fréquence et l'amplitude de changements intervenant spontanément de la pression intravésicale (contractions vésicales).

  

[0140]    Dans ce modèle, l'analogue évalué a présenté un effet bénéfique sur la fonction de la vessie. Cet effet était évident dans la vessie normale et est maintenu dans l'obstruction du col de la vessie. En particulier on a observé des différences significatives par rapport au véhicule pour:
- la fréquence et l'amplitude des contractions vésicales spontanées (fig. 13 et 14);
- le résidu post-mictionnel (absent avec le composé A, fig. 16);
- la pression de la miction (fig. 15).

  

[0141]    De plus, un effet bénéfique sur la fonction de la vessie a été confirmé dans les tests in vitro:
-  réponse K;
- réponse à l'EFS (fig. 17);
- réponse au carbachol.

  

[0142]    Enfin on a observé une légère diminution du poids de la vessie avec le composé A (fig. 12).

  

[0143]    Ces données démontrent l'utilisation du composé A (dans la gamme de dose allant de 50 à 300 [micro]g - correspondant à approximativement 0,725 à 5 [micro]g/kg de masse corporelle chez l'homme) pour la prévention et le traitement du dysfonctionnement de la vessie, par exemple, la vessie hyperactive, tel que, par exemple, démontré chez des patients ayant une HBP.

Abréviations

  

[0144]    
<tb>T:<sep>testostérone


  <tb>DHT:<sep>dihydrotestostérone


  <tb>GF:<sep>facteur de croissance


  <tb>HBP:<sep>hyperplasie bénigne de la prostate


  <tb>PP:<sep>conformément au protocole


  <tb>ITT:<sep>à traiter


  <tb>ANOVA:<sep>analyse de la variance


  <tb>USTR:<sep>ultrasonographie transrectale


  <tb>BOO:<sep>obstruction du col de la vessie


  <tb>AR:<sep>récepteurs des androgènes


  <tb>PSA:<sep>antigène spécifique de la prostate

  

[0145]    Toutes les références comprenant les brevets et les demandes de brevet cités dans cette application sont incorporées ici en référence afin de couvrir l'étendue la plus large possible.

  

[0146]    Dans la globalité de la description et des revendications qui suivent, à moins que le contexte n'indique un sens différent, le mot "comprend", et ses variations telles que "comprennent" et "comprenant" seront compris pour impliquer l'inclusion d'un nombre entier ou une étape ou un groupe de nombres entiers mais pas l'exclusion de tout autre nombre entier ou étape ou groupe de nombres entiers ou d'étapes.

  

[0147]    La demande de priorité peut être fondée sur l'application dont les présentes description et revendications font partie en respect avec toute application ultérieure. Les revendications d'une telle application ultérieure peuvent être dirigées vers toute caractéristique ou combinaison de caractéristiques décrites ici. Elles peuvent prendre la forme de produit, de composition, de procédé, ou utiliser les revendications et peuvent comprendre, à titre d'exemple et sans limitation, les revendications suivantes.

Claims (16)

1. Utilisation du 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol, ou d'un sel ou d'un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

2. Utilisation du 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 du 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol, ou d'un sel ou d'un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, en combinaison avec un second agent actif vis-à-vis de l'HBP pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

4. Utilisation selon la revendication 3 dans laquelle le second agent actif vis-à-vis de l'HBP est un agent de blocage de récepteur [alpha]-adrénergique.

5. Utilisation selon la revendication 4 dans laquelle l'agent de blocage de récepteur [alpha]-adrénergique est choisi parmi la térazosine, la doxazosine, la tamsulosine, la silodosine, AIO-8507L et RBx-2258.

6. Utilisation selon la revendication 3 dans laquelle le second agent actif vis-à-vis de l'HBP est un inhibiteur de la 5-[alpha]-réductase.

7. Utilisation selon la revendication 6 dans laquelle l'inhibiteur de la 5-[alpha]-réductase est choisi parmi le finastéride et le dutastéride.

8. Formulation pharmaceutique comprenant le 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol, ou un sel ou un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et un support pharmaceutiquement acceptable destinée à la prévention et/ou au traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

9. Formulation pharmaceutique selon la revendication 8 comprenant en outre un second agent actif vis-à-vis de l'HBP.

10. Formulation pharmaceutique selon la revendication 9 dans laquelle le second agent actif vis-à-vis de l'HBP est un agent de blocage de récepteur [alpha]-adrénergique.

11. Formulation pharmaceutique selon la revendication 10 dans laquelle l'agent de blocage de récepteur [alpha]-adrénergique est choisi parmi la térazosine, la doxazosine, la tamsulosine, la silodosine, AIO-8507L et RBx-2258.

12. Formulation pharmaceutique selon la revendication 9 dans laquelle le second agent actif vis-à-vis de l'HBP est un inhibiteur de la 5-[alpha]-réductase.

13. Formulation pharmaceutique selon la revendication 12 dans laquelle l'inhibiteur de la 5-[alpha]-réductase est choisi parmi le finastéride et le dutastéride.

14. Formulation pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 8 à 13 qui est présentée sous forme de capsule.

15. 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol ou un sel ou un ester pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, comme agent pour la prévention et/ou le traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.

16. 1-[alpha]-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diène-26,27-bishomo-20-épi-cholécalciférol comme agent pour la prévention et/ou le traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate.