JP2024521740A - ２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（ｄ２）阻害剤の新しい治療的使用 - Google Patents
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Abstract
２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害化合物の、筋消耗の治療的処置及び／又は筋肉及び／又は皮膚再生治療法における使用について記載されている。２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）阻害剤化合物を薬学的に許容される担体中に、並びに任意の賦形剤、希釈剤及びアジュバントと組み合わせて含む医薬組成物も記載されている。
Description
本発明は、筋肉及び皮膚疾患、特に筋消耗障害及び筋肉又は皮膚組織損傷の治療的処置の分野に関する。
骨格筋萎縮は筋消耗としても知られ、加齢（サルコペニア）並びに長期の不活動又は絶食後にゆっくりと発症する、又は癌（悪液質）、筋脱神経、慢性腎疾患、心不全、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、糖尿病、肝硬変、嚢胞性線維症又はジストロフィーなどの様々な病状において急速に現れる、衰弱状態である。ジストロフィーは、運動技能を制限することによって筋肉の衰弱をもたらす遺伝性疾患の群である。
筋消耗性疾患は筋肉量の大量かつ進行性の喪失を特徴とし、その結果、筋力及び筋機能が喪失する。一般に、筋肉量の減少は、姿勢の不安定性から呼吸及び心容量の障害に及ぶ患者の身体状態の悪化をもたらす。例えば、進行がん患者の約８０％は筋肉量の重度の減少を示し、この状態はがん悪液質と呼ばれる。これらの癌患者では、筋肉量の減少が予後の不良及び治療に対する応答の低下と関連している。
筋肉機能は呼吸、運動、咀嚼、及び嚥下に不可欠であるので、筋肉量及び機能の減少はより高い病的状態及び死亡率、並びに生活の質の低下と関連する。
特に悪液質及びサルコペニアによるもののような、任意の種類の筋力低下に苦しむ人々の多さにもかかわらず、筋消耗及び筋肉は依然として十分に治療されていない器官である。今日まで、筋消耗疾患における筋力の喪失の根底にある病態生理学的機序（すなわち、全身性炎症）を妨害することができることが証明されている、筋肉量及び機能を改善するために使用可能な有効な薬物はない。
悪液質－サルコペニアのための現行の治療は３つの異なった種類の薬物：グレリン受容体アゴニスト（アナモレリン）；悪液質及び筋消耗の原因となる炎症メディエータに対するモノクローナル抗体（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ミオスタチンに対する抗体）；及び選択的非ステロイド性アンドロゲン受容体モジュレーター（ＳＡＲＭ、例えば、エノボサーム）に基づく。上記の薬物は、第２相及び第３相臨床試験において試験されている(Becker C. et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2015 3(12):948-57 2015; Temel et al., Lancet Oncol. 2016; 17: 519-531)。これらは全て、筋肉喪失及び体重増加に対する薬物予防効果を示した。しかしながら、これまでのところ、筋力を増加させ、筋肉の物理的－機械的機能を改善する試験薬物の能力を示す臨床データはない。
悪液質及びサルコペニアに加えて、身体的損傷もまた、筋肉量の喪失につながり得る。筋損傷は、通常、筋挫傷及び筋裂傷などの外力の結果である。大きな筋肉損傷は限定された治癒能力した有さず、修復プロセスは、通常、瘢痕組織の形成をもたらす。筋肉内瘢痕の存在は、正常な筋肉収縮ベクトルを変化させ、強さを低下させ、疲労を増加させる。
機械的又は化学的外傷もまた、皮膚を損傷し得る。皮膚損傷は、最も一般的には火傷、裂傷、骨折、及び圧挫損傷を伴う。典型的には、そのような皮膚障害が表皮の喪失、及び多くの場合、真皮の一部、さらには皮下脂肪の喪失をもたらし得る。これらの損傷の治療は、複雑であり得、患者の機能及び審美性に重大な影響を及ぼし得る。加えて、皮膚治癒プロセスの障害は慢性創傷を引き起こす可能性があり、これは、大きな、そして増大する疾患負荷を示す。
前述のように、筋肉及び皮膚の損傷は、機能障害及び重度の身体障害、並びに美容上の変形を引き起こし得る。結果として、これらの損傷は、組織再生を可能にし及び移植の合併症を低減することを可能とするような臨床作業における、継続した再建及び再生という課題を生み出す。
筋肉及び皮膚の修復及び再生を促進するために、前世紀の間、そして特にここ数十年の間に、外科技法、理学療法、生体材料、筋組織工学、及び細胞治療を含む、異なる戦略が開発された。しかしながら、現在のアプローチの固有の限界は、代替戦略の必要性を強調する。
したがって、筋消耗、特に加齢性筋変性並びに病状に続発する筋萎縮状態を含む疾患の進行を遅延又は予防することを目的とする、新しい有効な治療戦略を提供することが強く求められている。
組織修復及び組織機能再生を促進することによって、筋肉及び／又は皮膚損傷を改善することを目的とする新しい薬理学的アプローチを提供する強い必要性もある。
これら及び他の必要性は、添付の請求項１に定義されるような治療的使用のための２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害化合物、及び添付の請求項７に定義されるようなＤ２阻害化合物を含む医薬組成物によって満たされる。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項において定義される。
添付の独立請求項及び従属請求項は、本明細書の不可欠な部分を形成する。
２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）は、甲状腺ホルモンの循環及び組織レベルの維持において重要な役割を果たす酵素である。当技術分野で知られているように、細胞内甲状腺ホルモン濃度は、３つのセレノ膜タンパク質、すなわち１型、２型、及び３型デヨージナーゼ（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）によって調節される(Gereben B. et al, Endocr Rev. 2008 29(7):898-938)。特に、Ｄ１及びＤ２は、プロホルモンであるチロキシン（Ｔ４）を活性ホルモンＴ３に変換する。逆に、Ｄ３はＴ３（トリヨードチロニン）をＴ２（ジヨードチロニン）に、Ｔ４をｒＴ３（逆位トリヨードチロニン）に変換し、これらは両方とも不活性な甲状腺ホルモン代謝産物である。
以下の実験の項でより詳細に説明されるように、本発明者らは２型デヨージナーゼ（Ｄ２）が筋肉及び皮膚の両方の有糸分裂休止幹細胞において発現されることを初めて観察し、この酵素がこれらの細胞の休止状態を維持する際に重要な役割を果たすことを示した。
当技術分野で知られているように、幹細胞は、成体組織の再生及びホメオスタシスに重要である。本発明者らによって実施されたさらなる実験は、筋肉傷害時に、特にカルディオトキシン誘導性筋肉傷害及び創傷治癒などの急性再生状態において、Ｄ２の遺伝学的インビボ枯渇が、野生型動物と比較して、筋肉及び皮膚組織の再生を改善し促進することを明らかにした。
筋肉及び皮膚における２型デヨージナーゼの役割をさらに調査することによって、本発明者らは驚くべきことに、筋萎縮の動物モデルにおいて、この酵素の発現が悪液質筋において劇的に増加することを見出した。さらに、遺伝学的Ｄ２枯渇マウスモデルにおいて、２型デヨージナーゼ活性の欠如は、骨格筋の実験的に誘導された萎縮を抑制した。
筋肉及び皮膚におけるＤ２調節の効果をさらに評価するために、並びに潜在的な臨床標的としてのこの酵素の役割を活用するために、本発明者らは、様々な阻害剤化合物を使用してＤ２活性を一過性にブロックすることによって、専用のインビトロ及びインビボ薬理学的研究を行った。図９、１０及び１１に示されるように、萎縮の前臨床モデルにおいて得られたここに含まれる結果と一致するように、Ｄ２阻害剤化合物での処理を受けたマウスは、脱神経及び癌悪液質誘導性筋喪失から保護された。特に、生存率の有意な増加が担癌マウスでも観察された（図１０Ｉ）。
さらに、筋肉又は皮膚損傷の動物モデルにおいて、Ｄ２阻害剤化合物の投与は、対照動物と比較して、処理マウスの損傷筋肉における筋線維及び活性化筋芽細胞の個数の顕著な増加（図７）、並びに皮膚損傷後の有意に迅速かつ効率的な創傷治癒プロセス（図８）をもたらした。
さらなる検証として、本発明者らは、筋ジストロフィーのショウジョウバエモデルにおいて、ハエへのＤ２阻害剤化合物の慢性投与が骨格筋収縮性の機能的回復を可能にすることを観察した（図１２及び１３）。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは２型デヨージナーゼ酵素による筋肉組織における甲状腺ホルモン（ＴＨ）作用の活性化が、複数の疾患状態において筋肉喪失を引き起こす筋肉異化の加速を誘導するのに重要であると考えている。本発明者らはさらに、Ｄ２発現が筋肉及び皮膚における静止状態の幹細胞をマークし、静止幹細胞における急激なＤ２枯渇がＧ０から、ＧＡｌｅｒｔ状態、すなわち、Ｇ０相とＧ１相との間の細胞周期の中間状態への、それらの自発的な遷移を誘導し、ここで幹細胞は傷害に応じて細胞周期により急速に進入すると考えている。
上に示したような全ての驚くべき知見に基づいて、組織レベルにおけるＤ２酵素活性の減弱は、萎縮から筋肉を保護するため、及び／又は損傷した筋肉及び／又は皮膚組織の再生を促進するための新規で非常に効果的な治療手段を提供する。
したがって、本発明の第１の態様は、筋消耗の治療的処置、及び／又は筋肉及び／又は皮膚の再生治療方法における使用のための２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害化合物である。
本明細書で使用される場合、用語「阻害剤化合物」は、酵素の活性を、このタンパク質に結合し及びこの酵素の触媒特性を修飾することによって、低下及び／又はブロックすることができる物質を指す。特定又は明らかにされない限り、「阻害剤化合物」という表現は、選択的及び非選択的２型ヨードチロニンデヨージナーゼ阻害剤の両方を包含すると理解される。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、用語「治療的処置」は、筋消耗を含む疾患状態の症状の発症後における、並びに症状の発症前の投与前における、特に疾患のリスクがある対象への、本発明による２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害化合物の投与を指す。
用語「再生治療法」は、本明細書で使用される場合、対象における損傷した又は病的な細胞、組織又は器官を再成長させる、修復する、又は置換することを目的とする治療的処置を指す。
一実施形態では、本発明に従って使用するのに適した２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物は、逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３）、アミオダロン（ＡＭＩＯ）、デスエチルアミオダロン（ＤＥＡ）、５－メチル－２－チオウラシル（ＭＴＵ）、６－ベンジル－２－チオウラシル（ＢＴＵ）、キサントフモール（ＸＴＨ）、ゲニステイン（ＧＥＮ）、６－プロピル－２－チオウラシル（ＰＴＵ）、メチマゾール（ＭＭＩ）、イオパノ酸（ＩＡｃ）、デキサメタゾン、金チオグルコース（ＧＴＧ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
本発明による好ましいＤ２阻害剤化合物は、これらの化合物による阻害に対するＤ２感受性指数及び関連する参考文献と共に表１に開示されている。
好ましくは、本発明による使用のための２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物は、逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３）、アミオダロン（ＡＭＩＯ）及びデスエチルアミオダロン（ＤＥＡ）から選択され、より好ましくは逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３）及びアミオダロン（ＡＭＩＯ）から選択される。
逆位トリヨードチロニン化合物（ｒＴ３、３，３’，５’－トリヨードチロニン、ＣＡＳ番号：５８１７－３９－０）は甲状腺ホルモンの代謝的に不活性な形態であり、３型５’－デヨージナーゼ酵素を介してＴ４の内側環中のヨウ素原子を除去することによって、チロキシン（Ｔ４）プロホルモンから生成される。
アミオダロン（ＡＭＩＯ）は、心臓疾患の治療における承認用途で主に知られているヨウ素化ベンゾフラン誘導体である。この薬物は、心臓における活動電位及び不応期の延長を誘導することができる強力なクラスＩＩＩ抗不整脈薬である。
デスエチルアミオダロン（ＤＥＡ）はアミオダロンの主要な生物活性代謝産物であり、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４によって触媒されるＮ－脱メチル化反応において産生される。
本発明による好ましい実施形態は、疾患状態、例えば悪液質、サルコペニア又は筋脱神経による筋消耗の治療的処置における使用のための逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３）である。
本発明による別の好ましい実施形態は、筋肉及び／又は皮膚の再生治療方法における使用のための逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３）である。
本発明によるさらに別の好ましい実施形態は、疾患状態、例えば悪液質、サルコペニア又は筋脱神経による筋消耗の治療的処置における使用のためのアミオダロン（ＡＭＩＯ）である。
本発明によるさらに別の好ましい実施形態は、筋肉及び／又は皮膚の再生治療方法における使用のためのアミオダロン（ＡＭＩＯ）である。
本発明によれば、上記で定義された２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物の任意の可能な組み合わせが本発明に包含されることが理解される。
例えば、本発明の一実施形態において、ｒＴ３は、６－プロピル－２－チオウラシル（ＰＴＵ）と組み合わせて使用される。有利には、この実施形態ではＰＴＵが肝臓における肝Ｄ１活性をブロックし、したがってｒＴ３の半減期を増やす。
前述のように、Ｄ２阻害剤化合物の投与に基づく治療アプローチは例えば、二次的消耗病理（悪液質）又は加齢性筋変性（サルコペニア）などの筋肉量及び筋力の喪失を含む疾患状態の処置に特に適している。
筋萎縮に対する保護に加えて、２型デヨージナーゼ活性を薬理学的にブロックすることは、筋肉及び皮膚幹細胞の増殖の刺激をもたらし、それによって、Ｄ２酵素の組織特異的調節を、再生医療についての治療という文脈における有効かつ革新的なツールにする。
限定ではなく例として、本発明による筋消耗は、サルコペニア、癌、敗血症、糖尿病、慢性心不全、慢性閉塞性肺疾患、慢性腎不全、肝硬変、嚢胞性線維症、筋脱神経、絶食、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される疾患状態に起因し得る。
本発明の好ましい実施形態は、新生物性悪液質を制御することを目的とする治療方法に関する。
筋再生治療方法に関して、本発明に従って治療することができる例示的な疾患は、限定されるものではないが、遅発性筋痛（ＤＯＭＳ）、筋挫傷、肉離れ、筋裂傷、癌悪液質、筋萎縮、筋ジストロフィー、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
皮膚再生治療方法の文脈において、例えば、潰瘍、皮膚炎、皮膚創傷、熱傷、裂傷、及びそれらの任意の組み合わせの治療的処置を挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明による使用のための２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）阻害化合物はまた、医薬組成物の形態で効果的に投与され得る。
したがって、本発明の第２の態様は筋消耗の治療的処置及び／又は筋肉及び／又は皮膚再生治療方法において使用するための医薬組成物であり、前記医薬組成物は、治療有効量の上に定義された２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の少なくとも１つの阻害剤化合物と、薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤とを含む。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、検出可能な治療効果を示すのに十分な、本発明による使用のためのＤ２阻害剤化合物の量を指す。対象についての正確な有効量は、対象のサイズ及び健康、処置される状態の性質及び重症度に依存する。
「薬学的に許容される」という用語は、活性成分の有効な活性と一貫する濃度で過度の毒性なしに哺乳動物に投与され得る化合物及び組成物を指す。
本発明の医薬組成物に適した担体、賦形剤及び／又は希釈剤の選択は、当業者の知識を使用することによって、当業者によって決定することができる。
好ましくは、本発明による使用のための医薬組成物中の２型ヨードチロニンデヨージナーゼの少なくとも１つの阻害剤化合物は、逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３）、アミオダロン（ＡＭＩＯ）、デスエチルアミオダロン（ＤＥＡ）、５－メチル－２－チオウラシル（ＭＴＵ）、６－ベンジル－２－チオウラシル（ＢＴＵ）、キサントフモール（ＸＴＨ）、ゲニステイン（ＧＥＮ）、６－プロピル－２－チオウラシル（ＰＴＵ）、メチマゾール（ＭＭＩ）、イオパノ酸（ＩＡｃ）、デキサメタゾン、金チオグルコース（ＧＴＧ）、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。
本発明による好ましい医薬組成物は逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３）を含み、これは例えば悪液質又はサルコペニアなどの疾患状態による筋消耗の治療的処置における使用に適している。
本発明による別の好ましい医薬組成物は逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３）を含み、これは筋肉及び／又は皮膚の再生治療方法における使用に適している。
本発明によるさらに別の好ましい医薬組成物はアミオダロン（ＡＭＩＯ）を含み、これは例えば悪液質及びサルコペニアなどの疾患状態による筋消耗の治療的処置における使用に適している。
本発明によるさらに別の好ましい医薬組成物はアミオダロン（ＡＭＩＯ）を含み、筋肉及び／又は皮膚の再生治療方法における使用に適している。
上記の２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）のインヒビター化合物の任意の組み合わせが、本発明の医薬組成物中に存在し得ることもまた、本発明において想定される。
一実施形態では、本発明による使用のための医薬組成物は、アミオダロン（ＡＭＩＯ）、デスエチルアミオダロン（ＤＥＡ）、６－プロピル－２－チオウラシル（ＰＴＵ）、及びイオパン酸（ＩＡｃ）のいずれかとの組み合わせで、ｒＴ３を含む。
別の実施形態では、本発明による使用のための医薬組成物は、ｒＴ３、デスエチルアミオダロン（ＤＥＡ）、６－プロピル－２－チオウラシル（ＰＴＵ）、及びイオパン酸（ＩＡｃ）のいずれかとの組み合わせで、アミオダロンを含む。
本発明による使用のための医薬組成物は、全てＤ２阻害化合物の治療的使用に関して上で定義されたように、筋肉関連及び／又は皮膚関連疾患に対する治療的処置として、及び／又は筋肉及び／又は皮膚組織損傷を修復するために、投与されるのに適している。
本発明による使用のための医薬組成物は、例えば局所、経口、経腸又は非経口経路による投与のための任意の適切な剤形に製剤化することができる。
本明細書で使用される場合、非経口投与としては皮下及び筋肉内注射による医薬組成物の投与、持続放出デポの移植、静脈内注射投与が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明による使用のための医薬組成物は、溶液、クリーム、軟膏、スプレー、ゲル又は任意の局所適用剤において、局所適用によって投与することができる。本発明の医薬組成物は薬剤溶出装置、例えば、ガーゼ、パッチ、パッド、又はスポンジのような手段によって経皮的に投与することもできる。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、シロップなどの経口投与のための剤形に製剤化することもできる。
医薬組成物において、投与される活性成分の量は、使用される特定の化合物及び投薬単位、投与の様式及び時間、処置期間、処置される対象の年齢、性別、及び全身状態、処置される状態の性質及び程度、薬物代謝及び排泄の速度、潜在的な薬物組み合わせ及び薬物－薬物相互作用などの考慮事項に従って広く変動し得る。
本発明に従う使用のための医薬組成物は、単回用量又は複数回用量として、及び所望の治療効果を達成するために必要とされる頻度で、必要とされる時間の長さで投与される。当業者は、本発明による使用のための医薬組成物を使用して、適切な処置過程を容易に決定することができる。
医薬組成物が逆位Ｔ３を含む実施形態によれば、治療レジメンは、好ましくは５０マイクログラム（μｇ）から５００μｇの間に含まれるｒＴ３の１日用量を患者に投与することに基づく。
医薬組成物がアミオダロンを含む別の実施形態によれば、好ましくは治療レジメンは、１００ｍｇから７００ｍｇの間に含まれるアミオダロンの１日用量、より好ましくは２００ｍｇから６００ｍｇの間に含まれるアミオダロンの１日用量を患者に投与することに基づく。
この実施形態による好ましい治療レジメンは、処置の最初の２週の間における６００ｍｇのアミオダロンの１日用量、処置の第３週の間における４００ｍｇのアミオダロンの１日用量、及び処置の維持期間における２００ｍｇのアミオダロンの１日用量からなるレジメンを患者に経口投与することを含む。
当技術分野で知られているように、アミオダロン療法は潜在的に、様々な副作用をもたらし得る。有利なことに、この処置レジメンは、アミオダロンの有効性に影響を及ぼすことなく、薬物関連副作用の発生を減らす。
以下の実験セクションは、単に例示のために提供され、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。以下の実験セクションでは、添付の図面を参照する。
図１は、２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）が異なる組織の静止幹細胞において高度に発現されることを示す。結果は、筋肉及び皮膚幹細胞（ＳＣ）におけるＰａｘ７－ｎＧＦＰ及びＤ２－３ｘｆｌａｇマウスに関するＩＦに基づく。（Ａ）非損傷前脛骨（ＴＡ）筋の凍結切片におけるＰａｘ７（緑）及びＤ２-ｆｌａｇ（赤）発現の代表的な免疫蛍光（ＩＦ）染色（スケールバー、５０μｍ）。（Ｂ）表皮の毛包におけるＣＤ３４（赤）及びＦｌａｇ－Ｄ２（緑）発現の代表的なＩＦ染色（スケールバー）。
図２は、筋肉におけるＤ２発現が筋消耗の異なる動物モデルにおいて誘導されることを示す。Ｄ２及びＤ３のｍＲＮＡ発現が、（Ａ）癌悪液質誘導の６、９、及び１１日後に屠殺された癌悪液質（Ｃ２６処理）動物からの、（Ｂ）除神経の６、１２、及び１５日後に屠殺された脱神経マウスからの、及び（Ｃ）６、１２、及び２４時間絶食させたマウスからの、ＴＡ筋において判定された。（Ｄ）悪液質、（Ｅ）脱神経、及び（Ｆ）絶食マウスからのＴＡ筋における、ＴＲａ、ＴＲＰ（甲状腺ホルモン受容体）、ＭＣＴ８、及びＭＣＴ１０（甲状腺ホルモントランスポーター）ｍＲＮＡの発現。
（Ｇ）悪液質、（Ｈ）脱神経、及び（Ｉ）絶食マウスからのＴＡ筋における、ＭｕＲＦ－１ ｍＲＮＡ発現。（Ｊ）悪液質、（Ｋ）脱神経、及び（Ｌ）絶食マウスからのＴＡ筋におけるアトロギン－１ ｍＲＮＡ発現。
図３は、静止幹細胞におけるＤ２枯渇が筋肉再生を加速することを示す。（Ａ）（上）実験デザインの模式図。（Ｂ）タモキシフェン誘導後の野生型（ｗｔ）及びデヨージナーゼ欠損（ｃＤ２ＫＯ）マウスからのＴＡ切片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す代表的な顕微鏡写真（下）（スケールバー、１００μｍ）。（Ｂ）Ａに示される切片において評価された中央に位置する核のパーセンテージ。（Ｃ）Ａに示されるようなＴＡ切片の断面積の定量。
（Ｄ）Ｐａｘ７／ＭｙｏＤ及びＰａｘ７／ＢｒｄＵ（３つの個々の実験において、ｗｔ ｎ＝５；ｃＤ２ＫＯ Ｎ＝５）二重染色による、ポジティブ細胞のパーセンテージの定量。（Ｅ）ＣＴＸ注射６０日間後のｃＤ２ＫＯ及びｗｔ（Ｐａｘ７ｃｒｅＥＲ－ｔｄ／ＧＦＰ）成体マウスからのＴＡ切片の断面積解析の定量。
図４は、静止幹細胞におけるＤ２枯渇が皮膚再生を促進することを示す。創傷治療実験を、ｓｃＤ２ＫＯマウス及びｗｔマウスにおいて、タモキシフェン誘導性Ｄ２枯渇後に行った。（上パネル）創傷治療の０、１、７及び１０日後の創傷エリアの代表的な画像。（下パネル）Cell*F Olympus Imaging Software（スケールバーは１ｃｍを示す）を用いて算出した創傷面積を示すグラフ。
図５は、マウスにおける全体的なＤ２枯渇が癌（悪液質）によって誘導される筋消耗を減弱させることを示す。Ｃ２６細胞注射の１２日後に屠殺したｗｔ及びＤ２ＫＯマウスからのＴＡ筋の、（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色及び（Ｂ）平均線維直径及び筋線維断面積（ＣＳＡ）の頻度分布を示すグラフを示す代表的な顕微鏡写真。
（Ｃ）Ｃ２６細胞注射後１４日間モニターされたｗｔ及びＤ２ＫＯマウスの体重変化の経時変化を示すグラフ。（Ｄ）Ｃ２６細胞注射の１５日後に屠殺したｗｔ及びＤ２ＫＯマウスの心臓重量及び生存能を示すグラフ。Ｃ２６細胞注射の６、９、及び１２日後に屠殺した動物からのＴＡ筋における（Ｅ）アトロギン－１及び（Ｆ）Ｍｕｒｆ－１ ｍＲＮＡ発現。
図６は、マウスにおける全体的なＤ２枯渇が脱神経によって誘導される筋消耗を減弱させることを示す。（Ａ）後肢除神経後１２日間モニターされたｗｔ及びＤ２ＫＯマウスの体重変化の経時変化を示すグラフ。（Ｂ）除神経の１２日後に屠殺したｗｔ及びＤ２ＫＯマウスからのＴＡ筋の筋線維ＣＳＡの頻度分布を示すグラフ。
（Ｃ）除神経の６、９、及び１２日後に屠殺した動物からのＴＡ筋における（Ｃ）アトロギン－１及び（Ｄ）Ｍｕｒｆ－１ ｍＲＮＡ発現。
図７は、Ｄ２をブロックすることによって筋肉再生中に幹細胞を活性化するｒＴ３の治療能力を示す。（Ａ）実験計画の概略図。（Ｂ）損傷の７日後に屠殺されたｒＴ３処理マウス及び未処理マウス（対照、ｃｔｒ）からのＴＡ切片のＨ＆Ｅ染色を示す代表的な顕微鏡写真（スケールバー、５０μｍ）。（Ｃ）Ｂに示される組織切片の断面積の定量。（Ｄ）ｒＴ３処理マウス及びｃｔｒマウスからのＴＡ切片に対するＰａｘ７／ＥｄＵ染色のパーセンテージを示すグラフ（２つの個々の実験において、Ｃｔｒ＝３；ｒＴ３＝３マウス）。
（Ｅ）損傷の２１日後に屠殺したｒＴ３処理マウス及びＣｔｒマウスのＨ＆Ｅ染色を示す代表的な顕微鏡写真（スケールバー、５０μｍ）。（Ｆ）Ｅに示す組織切片の断面積の定量。
図８は、Ｄ２をブロックすることによって皮膚再生中に幹細胞を活性化するｒＴ３の治療能力を示す。（Ａ）実験デザインの概略図。（Ｂ）ｒＴ３対対照の、処理したマウスにおける皮膚創傷治癒の代表的な画像。（Ｃ）創傷閉鎖の定量を示すグラフであり、初期創傷サイズのパーセントの平均として示さる（４つの独立した実験の各群でｎ＝４）（スケールバーは１ｃｍ）。（Ｄ）損傷後２８日目の動物の代表的な画像。剃毛の５日前に動物にｒＴ３を投与し、皮膚創傷は、毛髪再成長の改善を示す。データは平均±ＳＥＭで示され、２つの条件を比較する際にはマンホイットニー検定、及び多重Ｔ検定を用いて、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001である。
図９は、ｒＴ３によるＤ２活性のブロッキングがインビトロで筋萎縮を減弱させることを示す。（Ａ）ｐｐ６細胞におけるＰＡＲＰの免疫ブロットの代表的な画像。ＥＲＫはローディング対照として機能する。（Ｂ）ｐｐ６細胞において測定されたＰＡＲＰの免疫ブロットの代表的な画像。チューブリンは、ローディング対照として機能する。（Ｃ）ｒＴ３と共に又はなしに処理されたｐｐ６細胞におけるｐ６５／ＮＦＫＢの代表的なＩＦ染色。
（Ｄ）ｐｐ６細胞におけるｐ６５／ＮＦＫＢの免疫ブロットの代表的な画像。チューブリン及びＰＡＲＰは、それぞれ、細胞質及び核コンパートメントのロード対照としての役割を果たす。（Ｅ）ｐｐ６細胞におけるｐ６５／ＮＦＫＢ及びカスパーゼ８の免疫ブロットの代表的な画像。チューブリンは、ローディング対照として機能する。（Ｆ）Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＰＡＲＰの免疫ブロットの代表的な画像。チューブリンは、ローディング対照として機能する。（Ｇ）ｐｐ６細胞におけるＰＡＲＰの免疫ブロットの代表的な画像。
図１０は、アミオダロン処理が癌悪液質マウスモデルにおいて筋消耗から保護することを示す。（Ａ）実験計画の概略図。（Ｂ）Ｃ２６細胞注射後１１日間モニタリングされた、Ｃｔｒ及びアミオダロン処理マウスの体重変化の時間経過。（Ｃ－Ｅ）Ｃ２６細胞注射の１１日後に屠殺した、Ｃｔｒ及びアミオダロン処理マウスの（Ｃ）心臓重量、（Ｄ）ＴＡ、及び（Ｅ）腓腹筋（ＧＣ）重量を示すグラフ。
（Ｆ）Ｃ２６細胞注射の１１日後に屠殺した、ｃｔｒ及びアミオダロン処理マウスにおける腫瘍重量を示すグラフ。Ｃ２６細胞注射の１１日後に屠殺した動物からのＴＡ筋における（Ｇ）ＭＵＲＦ－１及び（Ｈ）アトロギン－１ ｍＲＮＡ発現。（Ｉ）Ｃ２６細胞注射後にモニターされた、Ｃｔｒ及びアミオダロン処理マウスの全生存率（％）を示すグラフ。（Ｊ）悪液質の１１日後に屠殺したＣｔｒ及びアミオダロン処理マウスからのＴＡ筋の筋線維ＣＳＡの頻度分布。
図１１は、アミオダロンが脱神経マウスモデルにおいて筋消耗から保護することを示す。（Ａ－Ｂ）アミオダロン処理された又はされていない、Ｃｔｒ（対側腓腹筋）及びＤＥＮ（マウスの坐骨神経切断後の脱神経腓腹筋）における（Ａ）ＭＵＲＦ－１及び（Ｂ）アトロギン－１の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフ。（Ｃ）腓腹筋Ｃｔｒと腓腹筋ＤＥＮの差（ΔGC WEIGHT、NN DEN/DEN）としてｍｇで表された筋肉量を示すグラフ。
図１２は、無処理及び野生型ハエと比較した、増加する濃度のアミオダロンを投与したジストロフィーＤ．メラノガスターハエのクライミング指数の経時変化を示すグラフ（Ａ、Ｂ）である。結果は、６０秒後にバイアルの１５ｃｍマークまで登ったハエのパーセンテージとして表されている。データの可視化を容易にするために、パネル（Ｂ）においては、１０ｍＭアミオダロンのハエ投与後に得られたデータのみを示す。（Ｃ）無処理及び野生型ハエと比較した、ジストロフィーＤ．メラノガスター個体群の５０％が、増加する濃度のアミオダロン処理後にそのクライミング能力を失った処理後の日数を示すグラフ。フィッテングの比較：二次多項式（二次）曲線のパラメータは、各データセットについて異なる（p＜0.001、extra sum-of-squares F test）。
図１３は、無処理及び野生型ハエと比較した、増加する濃度のアミオダロンでの１０日間（Ａ）、１５日間（Ｂ）、２０日間（Ｃ）の処理後の、ジストロフィーＤ．メラノガスターハエのクライミング能力を示す。グラフ（Ｄ）には、上記データの概要が示されている。結果は、６０秒後にバイアルの１５ｃｍマークまで登ったハエのパーセンテージとして表される。それぞれＤｙｓ＋ＤＭＳＯに対して、*p＜0.01、及び**p＜0.001である。
材料及び方法
動物
動物は、イタリア、ナポリのCEINGE Biotecnologie Avanzateの動物施設で飼育及び維持した。実験及び動物ケアは、施設のガイドラインに従って実施した。Ｔｇ：Ｐａｘ７－ｎＧＦＰ；Ｐａｘ７ＣｒｅＥＲは、Shahragim Tajbakhsh（Pasteur Institute、パリ、フランス）(Rocheteau, 2012 Cell 148(1-2): 112-125)によって提供された。Ｄｉｏ２ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ(Luongo, 2015 Endocrinology 156(2): 745-754)、Ｄ２－３ｘＦＬＡＧ(Castagna, 2017 J Clin Endocrinol Metab 102(5): 1623-1630)、ｇｌｏｂａｌ－Ｄ２ＫＯ(Christoffolete, 2007 Endocrinology 148(3): 954-960)を本研究で使用した。Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃは、Jackson Laboratory(Stock No: 000664及び000651)から購入した。実験に使用した全てのマウスは、１２～１６週齢の成体であった。示されるように、両性を実験に使用した。尾部ＤＮＡを用いてＰＣＲにより動物の遺伝子型を決定した。
動物
動物は、イタリア、ナポリのCEINGE Biotecnologie Avanzateの動物施設で飼育及び維持した。実験及び動物ケアは、施設のガイドラインに従って実施した。Ｔｇ：Ｐａｘ７－ｎＧＦＰ；Ｐａｘ７ＣｒｅＥＲは、Shahragim Tajbakhsh（Pasteur Institute、パリ、フランス）(Rocheteau, 2012 Cell 148(1-2): 112-125)によって提供された。Ｄｉｏ２ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ(Luongo, 2015 Endocrinology 156(2): 745-754)、Ｄ２－３ｘＦＬＡＧ(Castagna, 2017 J Clin Endocrinol Metab 102(5): 1623-1630)、ｇｌｏｂａｌ－Ｄ２ＫＯ(Christoffolete, 2007 Endocrinology 148(3): 954-960)を本研究で使用した。Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃは、Jackson Laboratory(Stock No: 000664及び000651)から購入した。実験に使用した全てのマウスは、１２～１６週齢の成体であった。示されるように、両性を実験に使用した。尾部ＤＮＡを用いてＰＣＲにより動物の遺伝子型を決定した。
動物試験の承認
全ての動物試験は、Ministero della Saluteのガイドラインに従って実施され、施設内動物管理及び使用委員会によって承認された（ＩＡＣＵＣ：１６７／２０１５－ＰＲ及び３５４／２０１９－ＰＲ）。
全ての動物試験は、Ministero della Saluteのガイドラインに従って実施され、施設内動物管理及び使用委員会によって承認された（ＩＡＣＵＣ：１６７／２０１５－ＰＲ及び３５４／２０１９－ＰＲ）。
細胞培養物、トランスフェクション、及び試薬
プライマリ筋培養物（ｐｐ６）は、記載されているように(Qu et al., 1998 J Cell Biol 142(5): 1257-1267)、示されているマウス系統から単離した。不死化筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）はＡＴＣＣから得た。増殖細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む３７℃の２０％ウシ胎仔血清ダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。一過性トランスフェクションは、Lipofectamine 2000(Life Technologies)を用いて、製造業者の指示に従って行った。抗ＭｙｏＤ(ｓｃ－３０４）及びチューブリン（ｓｃ－８０３５）抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。抗Ｐａｘ７抗体は、Developmental Studies Hybridoma Bankから入手した。抗ＰＡＲＰは、Cell Signaling Technologyから入手した。
プライマリ筋培養物（ｐｐ６）は、記載されているように(Qu et al., 1998 J Cell Biol 142(5): 1257-1267)、示されているマウス系統から単離した。不死化筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）はＡＴＣＣから得た。増殖細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む３７℃の２０％ウシ胎仔血清ダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。一過性トランスフェクションは、Lipofectamine 2000(Life Technologies)を用いて、製造業者の指示に従って行った。抗ＭｙｏＤ(ｓｃ－３０４）及びチューブリン（ｓｃ－８０３５）抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。抗Ｐａｘ７抗体は、Developmental Studies Hybridoma Bankから入手した。抗ＰＡＲＰは、Cell Signaling Technologyから入手した。
筋損傷
動物をケタミンキシラジンカクテルで麻酔し、１２，５μｌの６０μｇ／ｍｌ ＣＴＸ(Naja mossambica mossambica, Sigma-Aldrich)を右前脛骨筋（ＴＡ）へとその長さに沿って注射し(Yan, 2003 J Biol Chem 278(10): 8826-8836)、及び２５μｌを腓腹筋に注射した。ＣＴＸはＴａｍとは異なる日に注射した。
動物をケタミンキシラジンカクテルで麻酔し、１２，５μｌの６０μｇ／ｍｌ ＣＴＸ(Naja mossambica mossambica, Sigma-Aldrich)を右前脛骨筋（ＴＡ）へとその長さに沿って注射し(Yan, 2003 J Biol Chem 278(10): 8826-8836)、及び２５μｌを腓腹筋に注射した。ＣＴＸはＴａｍとは異なる日に注射した。
断面積（ＣＳＡ）
前脛骨筋（ＴＡ）を切開し、液体窒素中のイソペンタン中で固定し、７μｍの切片にスライスした。断面積は、CellF*Olympus Imaging Softwareを用いて分析及び定量した。
前脛骨筋（ＴＡ）を切開し、液体窒素中のイソペンタン中で固定し、７μｍの切片にスライスした。断面積は、CellF*Olympus Imaging Softwareを用いて分析及び定量した。
免疫蛍光及び組織学
切開した筋肉を液体窒素冷却イソペンタン中で急速凍結し、切片化し（厚さ７μｍ）、染色した。免疫蛍光染色のために、細胞又は切片を４％ホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で透過処理し、次いで０．５％ヤギ血清でブロックし、一次抗体と共にインキュベートした。Alexa FluorTM ５９４／６４７－結合二次抗体を使用した。IX51 Olympus顕微鏡及びCell*Fソフトウェアを用いて画像を取得した。ヘマトキシリン／エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）のために、切片を１５分間固定し、ヘマトキシリン中に５分間置いた後、洗浄し、エオシン中に５分間置いた。
切開した筋肉を液体窒素冷却イソペンタン中で急速凍結し、切片化し（厚さ７μｍ）、染色した。免疫蛍光染色のために、細胞又は切片を４％ホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で透過処理し、次いで０．５％ヤギ血清でブロックし、一次抗体と共にインキュベートした。Alexa FluorTM ５９４／６４７－結合二次抗体を使用した。IX51 Olympus顕微鏡及びCell*Fソフトウェアを用いて画像を取得した。ヘマトキシリン／エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）のために、切片を１５分間固定し、ヘマトキシリン中に５分間置いた後、洗浄し、エオシン中に５分間置いた。
創傷作成、肉眼的検査及び組織学的分析
マウスの背中の毛皮を剃毛し、皮膚を７０％アルコールで洗浄した。鉗子を使用して背側皮膚を引っ張り、皮膚引っ張りの両層を通るようにプレスすることによって、滅菌８ｍｍ円形生検パンチを使用して、２つの８ｍｍ全層皮膚創傷を正中線に沿って作製した。皮膚創傷治癒は、動物を麻酔し、創傷エリアを画像化することによって、２～３日毎に測定した。
マウスの背中の毛皮を剃毛し、皮膚を７０％アルコールで洗浄した。鉗子を使用して背側皮膚を引っ張り、皮膚引っ張りの両層を通るようにプレスすることによって、滅菌８ｍｍ円形生検パンチを使用して、２つの８ｍｍ全層皮膚創傷を正中線に沿って作製した。皮膚創傷治癒は、動物を麻酔し、創傷エリアを画像化することによって、２～３日毎に測定した。
正中線で折り畳み皮膚を引き上げ、直径８ｍｍの滅菌使い捨て生検パンチを使用して、２層の皮膚を通って穿孔することによって、切除による全層皮膚創傷を背側皮膚上に無菌的に作製した。このようにして、２つの創傷を、正中線の両側に同時に作製した。Nikon FX-35Aを用いて、各創傷部位を示された時間隔でデジタル撮影し、CellF*を用いて、創傷エリアを写真上で決定した。創傷エリアの変化を、初期創傷エリアに対するパーセンテージとして表した。
ｑＰＣＲ実験
全ＲＮＡを、Qiagen RNeasy Microキットを用いて、製造業者の指示(Qiagen, Hilden, Germany)に従って、選別された又は培養した細胞から抽出し、次いで、ＶＩＦＯ逆転写酵素(Invitrogen Fife technologies Ltd)を使用することによって、ｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＰＣＲのために、SYBR Green Master mix(Biorad)を使用した。シクロフィリンＡを、発現を正規化するために内在性対照として使用した。
全ＲＮＡを、Qiagen RNeasy Microキットを用いて、製造業者の指示(Qiagen, Hilden, Germany)に従って、選別された又は培養した細胞から抽出し、次いで、ＶＩＦＯ逆転写酵素(Invitrogen Fife technologies Ltd)を使用することによって、ｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＰＣＲのために、SYBR Green Master mix(Biorad)を使用した。シクロフィリンＡを、発現を正規化するために内在性対照として使用した。
ウエスタンブロット分析
細胞及び組織からの全タンパク質抽出物を、１０％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で泳動し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ転写膜(Millipore, Billerica, MA)に移した。次いで、膜を、リン酸緩衝生理食塩水中の５％脱脂粉乳でブロックし、一次抗体でプローブし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギ又はマウス免疫グロブリンＧ二次抗体（１：３０００）とインキュベートし、化学発光（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって検出した。徹底的な洗浄後、膜を、ローディング対照として抗チューブリン特異的又はＥＲＫ抗体（１：１０，０００；sc-8035, Santa Cruz, Dallas, TX）と共にインキュベートした。
細胞及び組織からの全タンパク質抽出物を、１０％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で泳動し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ転写膜(Millipore, Billerica, MA)に移した。次いで、膜を、リン酸緩衝生理食塩水中の５％脱脂粉乳でブロックし、一次抗体でプローブし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギ又はマウス免疫グロブリンＧ二次抗体（１：３０００）とインキュベートし、化学発光（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって検出した。徹底的な洗浄後、膜を、ローディング対照として抗チューブリン特異的又はＥＲＫ抗体（１：１０，０００；sc-8035, Santa Cruz, Dallas, TX）と共にインキュベートした。
筋消耗マウスモデル
脱神経実験
動物をケタミンキシラジンカクテルで麻酔し、左タイトスキンに小切開（＜０．５ｍｍ）を行った。坐骨神経は、小さな外科用フックの助けを借りて露出され、次いで、坐骨神経枝の分離の前で切断された。再神経支配を防ぐために、小さな（２～５ｍｍ）神経切片を除去した。ネガティブ対照として、対側後肢を用いて片側性に除神経を行った。除神経手術の２、６、１２又は１５日後に組織を採取した。
脱神経実験
動物をケタミンキシラジンカクテルで麻酔し、左タイトスキンに小切開（＜０．５ｍｍ）を行った。坐骨神経は、小さな外科用フックの助けを借りて露出され、次いで、坐骨神経枝の分離の前で切断された。再神経支配を防ぐために、小さな（２～５ｍｍ）神経切片を除去した。ネガティブ対照として、対側後肢を用いて片側性に除神経を行った。除神経手術の２、６、１２又は１５日後に組織を採取した。
脱神経＋／－アミオダロン実験では、マウスをアミオダロンで１３日間処理し、誘導脱神経後５日目に屠殺した（除神経の－７日目から＋５日目）。
筋消耗マウスモデル
悪液質マウスモデル
マウス結腸２６腺癌細胞（Ｃ２６）を、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／μｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。インビボ接種のために、生理食塩水１００μｌ中の７×１０６細胞の単一懸濁液をＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部に皮下注射した。同量の生理食塩水を対照群に注射した。
悪液質マウスモデル
マウス結腸２６腺癌細胞（Ｃ２６）を、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／μｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。インビボ接種のために、生理食塩水１００μｌ中の７×１０６細胞の単一懸濁液をＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部に皮下注射した。同量の生理食塩水を対照群に注射した。
悪液質＋／－アミオダロン実験では、マウスをアミオダロンで１８日間処理し、誘導悪液質の７日後に屠殺した。アミオダロンは－７日目から＋７日目に投与した（１日目は細胞注射の日である）。
筋消耗マウスモデル
絶食実験
Ｃ５７ＢＬ６マウスを、６、１２及び２４時間、水へのアクセスを制限せずに、絶食させた。
絶食実験
Ｃ５７ＢＬ６マウスを、６、１２及び２４時間、水へのアクセスを制限せずに、絶食させた。
ｒＴ３投与
インビボ：マウス（Ｃ５６ＢＬ６マウス）を、３０ｎｇ／μｌのｒＴ３(Sigma Aldrich)又はＰＢＳ担体対照の１００μｌ静脈内注射で、連続４日間、全身的に処理した。
インビボ：マウス（Ｃ５６ＢＬ６マウス）を、３０ｎｇ／μｌのｒＴ３(Sigma Aldrich)又はＰＢＳ担体対照の１００μｌ静脈内注射で、連続４日間、全身的に処理した。
インビトロ：Ｐｐ６又はＣ２Ｃ１２細胞をｒＴ３（３０ｎＭ）で処理した。
アミオダロン投与
マウス（Ｃ５７ＢＬ６マウス）を、誘導脱神経又は悪液質の１週前から開始して、屠殺するまで、無制限の飲料水中の０．４５ｍｇ／ｍｌアミオダロン(Sigma, A8423, St. Louis, MO, USA)(Bagchiet al., Circulation Research 1987; 60:621-625; Lee et al., Oncotarget, 2015; 6(40): 42976-42987)で処理した。
マウス（Ｃ５７ＢＬ６マウス）を、誘導脱神経又は悪液質の１週前から開始して、屠殺するまで、無制限の飲料水中の０．４５ｍｇ／ｍｌアミオダロン(Sigma, A8423, St. Louis, MO, USA)(Bagchiet al., Circulation Research 1987; 60:621-625; Lee et al., Oncotarget, 2015; 6(40): 42976-42987)で処理した。
アミオダロンの調製：４５ｍｇを１ｍｌの水に８０℃で１０分間溶解した。
ＴＮＦα処理
Ｐｐ６又はＣ２Ｃ１２細胞をＴＮＦα（４０ｎｇ／μｌ）で２４時間処理した。
Ｐｐ６又はＣ２Ｃ１２細胞をＴＮＦα（４０ｎｇ／μｌ）で２４時間処理した。
筋ジストロフィーのドロソフィラ・メラノガスターモデル
ショウジョウバエ株
ジストロフィン（ｄｙｓ）の遺伝学的機能喪失ホモ接合型ショウジョウバエ変異体ＤｙｓＥ１７(hiips://flybase.org/reports/FBal0241311.html)をデュシェンヌ型筋ジストロフィーモデルとして採用した。これは、３番染色体に、ヌクレオチド変異Ｃ１９５９０４５８Ｔ、ひいてはアミノ酸変異Ｑ２８０７ｔｅｒｍ｜Ｄｙｓ－ＰＡを引き起こす点変異を有する（位置：９２Ａ１０，３Ｒ：１９，５９０，４５８．．１９，５９０，４５８）。これは、全長ｄｙｓタンパク質が異常に短縮されることを決定する終止コドンである。対照として、野生型オレゴンＲ株を使用した。
ショウジョウバエ株
ジストロフィン（ｄｙｓ）の遺伝学的機能喪失ホモ接合型ショウジョウバエ変異体ＤｙｓＥ１７(hiips://flybase.org/reports/FBal0241311.html)をデュシェンヌ型筋ジストロフィーモデルとして採用した。これは、３番染色体に、ヌクレオチド変異Ｃ１９５９０４５８Ｔ、ひいてはアミノ酸変異Ｑ２８０７ｔｅｒｍ｜Ｄｙｓ－ＰＡを引き起こす点変異を有する（位置：９２Ａ１０，３Ｒ：１９，５９０，４５８．．１９，５９０，４５８）。これは、全長ｄｙｓタンパク質が異常に短縮されることを決定する終止コドンである。対照として、野生型オレゴンＲ株を使用した。
成体野生型動物及び変異体ショウジョウバエを、３０日間、食品中に補充された、増加する濃度のアミオダロンで処理した。
飼育：標準的なトウモロコシミール寒天培地（ｐＨ５．５）で、２５℃で、わずかな修正を加えてハエを飼育した。ハエの飼料を以下のように調製した：１００ｇの黄色コーンミール、１００ｇのビール酵母、８ｇの寒天及び７５ｇのスクロース（５％ｗ／ｖ)を混合し、ハエの水分補給源として最終容量１．５ｌまで温水を添加することによって溶解した。混合物をオートクレーブし、ゆっくりと冷却させた。ブロードスペクトル殺カビ剤ニパギン（３ｇを１６ｍｌの無水エタノールに溶解）を、温度が約５０℃に達したときに添加し、次いで混合物をバイアルに分配した。
交配：交配及び産卵のために、若い成体ハエの集団（３日齢）をバイアルに入れた。バイアルを目視検査して、交尾が起こっていることを確認した。５～３０分以内に、典型的には全ての雌が雄とペアになっていた。未処理成体の２４時間の交尾後に、個々の卵を、リンゴジュースを補充した２％寒天プレートを用いて穏やかに採取した。次いで、卵をＰＢＳ中で洗浄し、計数し、実体顕微鏡下で分離した。交配から約５日目に、食物から出現した３齢幼虫をサンプリングした。注目すべきことに、ジストロフィーのショウジョウバエの飼育集団は、ＤｙｓＥ１７についてのヘテロ接合性変異体とホモ接合性変異体の混合物である。ヘテロ接合体の個体では、３番目の染色体対立遺伝子はＴＭ６，Ｔｂバランサー染色体とバランスがとれている。バランサーは、減少した長さ及び曲がりくねった気管主幹に基づいて、幼虫（ヘテロ接合対ホモ接合）を区別することを可能にする。ホモ接合性ＤｙｓＥ１７子孫の予想される割合は、全体の約３０％である。
アミオダロン投与
ストック溶液としてアミオダロン化合物をＤＭＳＯに溶解し、－２０℃でアリコートした。
ストック溶液としてアミオダロン化合物をＤＭＳＯに溶解し、－２０℃でアリコートした。
孵化したオレゴンＲ及びホモ接合性ＤｙｓＥ１７ショウジョウバエ（成熟１～２日齢）をバイアル（１０～１５匹／バイアル）に入れ、４～５ｍｌの標準培地又は増加する用量（１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、及び５０μＭ）のアミオダロンを補充した培地のいずれかで飼育した。５日ごとに飼料を交換した。アミオダロン補充飼料は、動物に投与する直前に、アミオダロンを適切な量の標準飼料と混合することによって新たに調製した。各実験内で、群当たり少なくとも３つのバイアルを作製した。各実験を３回以上繰り返した。合計で、実験条件あたり最低６０匹の動物を分析した。
処理群：
・担体（ＤＭＳＯ １：１０００）を投与されるオレゴンＲ；
・担体（ＤＭＳＯ １：１０００）を投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・１００ｎＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・１μＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・１０μＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・２０μＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・５０μＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ。
ハエを３０日間処理し（処理は、動物が成体年齢の３０日に達した時点で終了した）、５日ごとに食物を更新した。
・担体（ＤＭＳＯ １：１０００）を投与されるオレゴンＲ；
・担体（ＤＭＳＯ １：１０００）を投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・１００ｎＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・１μＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・１０μＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・２０μＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ；
・５０μＭアミオダロンを投与されるＤｙｓＥ１７ハエ。
ハエを３０日間処理し（処理は、動物が成体年齢の３０日に達した時点で終了した）、５日ごとに食物を更新した。
クライミングアッセイ
走地性を、クライミングアッセイ（地球の重力と反対の負の重力走性反射）を用いて評価した。バイアルの底部の１５ｃｍ上に水平線を引いた。１０分間の休止期間の後、ハエをバイアルの底部に落とし、全てのハエにクライミング（垂直歩行）を始めるように強制した。６０秒後に１５ｃｍマークまで登ったハエの個数を、成功率のパーセンテージとして記録した。カメラが、実験中の飛行動作を記録した。各試験を１分間隔で３回行い、結果を平均した。クライミング能力を、成体年齢（脱皮直後）の１～２日目から開始し、３０日目に終了する５日ごとに評価した。
走地性を、クライミングアッセイ（地球の重力と反対の負の重力走性反射）を用いて評価した。バイアルの底部の１５ｃｍ上に水平線を引いた。１０分間の休止期間の後、ハエをバイアルの底部に落とし、全てのハエにクライミング（垂直歩行）を始めるように強制した。６０秒後に１５ｃｍマークまで登ったハエの個数を、成功率のパーセンテージとして記録した。カメラが、実験中の飛行動作を記録した。各試験を１分間隔で３回行い、結果を平均した。クライミング能力を、成体年齢（脱皮直後）の１～２日目から開始し、３０日目に終了する５日ごとに評価した。
統計解析
有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙ、及びスチューデントのｔ検定を用いて判定し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。全ての統計及びグラフィックはGraphPad Prism7を使用して実施され、ＳＩ付録Ｓ２０においてより詳細に示されている。全ての図において、エラーバーはＳＥＭを示す。ｐ＜０．０５の値は有意であると認識した(*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001)。
有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙ、及びスチューデントのｔ検定を用いて判定し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。全ての統計及びグラフィックはGraphPad Prism7を使用して実施され、ＳＩ付録Ｓ２０においてより詳細に示されている。全ての図において、エラーバーはＳＥＭを示す。ｐ＜０．０５の値は有意であると認識した(*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001)。
結果
実施例１：Ｄ２は、筋肉及び皮膚の静止幹細胞において発現する
本発明者らは、以前に特徴付けられた３ｘＦＬＡＧ－Ｄ２ノックインマウスにおける免疫蛍光によってＤ２発現を分析した(Castagna, 2017 J Clin Endocrinol Metab 102(5): 1623-1630)。それらの実験により、本発明者らは、Ｄ２が静止している前脛骨（ＴＡ）筋において筋幹細胞マーカーＰａｘ７＋(Seale, 2000 Cell 102(6): 777-786)と共に局在することを見出した（図１Ａ）。興味深いことに、Ｄ２発現は、静止幹細胞が局在する毛包の隆起を特異的にマークする、毛包幹細胞マーカーＣＤ３４と共に局在する（図１Ｂ）。
実施例１：Ｄ２は、筋肉及び皮膚の静止幹細胞において発現する
本発明者らは、以前に特徴付けられた３ｘＦＬＡＧ－Ｄ２ノックインマウスにおける免疫蛍光によってＤ２発現を分析した(Castagna, 2017 J Clin Endocrinol Metab 102(5): 1623-1630)。それらの実験により、本発明者らは、Ｄ２が静止している前脛骨（ＴＡ）筋において筋幹細胞マーカーＰａｘ７＋(Seale, 2000 Cell 102(6): 777-786)と共に局在することを見出した（図１Ａ）。興味深いことに、Ｄ２発現は、静止幹細胞が局在する毛包の隆起を特異的にマークする、毛包幹細胞マーカーＣＤ３４と共に局在する（図１Ｂ）。
全体として、これらの知見は、Ｄ２が静止幹細胞をマークすることを示す。
実施例２：２型デヨージナーゼは、筋消耗の異なるモデルにおいて筋肉において誘導される
さらに、本発明者らは、筋萎縮の３つの異なったモデル、すなわち脱神経、がん悪液質及び絶食、を用いて、骨格筋萎縮におけるＴＨ代謝を分析した。２か月齢のマウスで、片足の坐骨神経除去により脱神経を誘導した。対側脚を内部対照として使用した。脱神経マウスにおいて、除神経後の異なる時点で採取して、異なるＴＨモジュレーター（Ｄ２、Ｄ３、ＴＲα、ＴＲβ、ＭＣＴ８及びＭＣＴ１０）のｍＲＮＡレベルを測定した。Ｄ２ ｍＲＮＡ及び蛋白質は除神経後６日目に急激にアップレギュレートされ、その発現は１５日目まで持続した（図２Ａ、Ｄ）同様に、７×１０６個の結腸２６腺癌細胞（Ｃ２６）を皮下（ｓ．ｃ．）注射したＢａｌｂＣマウスにおいて、悪液質においてＤ２発現が増強された（図２Ｂ）。また、絶食も、飢餓の初期にＤ２発現の同様の増加を誘導した（図２Ｃ）。これらの結果は、Ｄ２の誘導、及び結果としてＴＨシグナル伝達の局所増幅が、筋萎縮の異なるモデルの共通の特徴であることを示唆する。
さらに、本発明者らは、筋萎縮の３つの異なったモデル、すなわち脱神経、がん悪液質及び絶食、を用いて、骨格筋萎縮におけるＴＨ代謝を分析した。２か月齢のマウスで、片足の坐骨神経除去により脱神経を誘導した。対側脚を内部対照として使用した。脱神経マウスにおいて、除神経後の異なる時点で採取して、異なるＴＨモジュレーター（Ｄ２、Ｄ３、ＴＲα、ＴＲβ、ＭＣＴ８及びＭＣＴ１０）のｍＲＮＡレベルを測定した。Ｄ２ ｍＲＮＡ及び蛋白質は除神経後６日目に急激にアップレギュレートされ、その発現は１５日目まで持続した（図２Ａ、Ｄ）同様に、７×１０６個の結腸２６腺癌細胞（Ｃ２６）を皮下（ｓ．ｃ．）注射したＢａｌｂＣマウスにおいて、悪液質においてＤ２発現が増強された（図２Ｂ）。また、絶食も、飢餓の初期にＤ２発現の同様の増加を誘導した（図２Ｃ）。これらの結果は、Ｄ２の誘導、及び結果としてＴＨシグナル伝達の局所増幅が、筋萎縮の異なるモデルの共通の特徴であることを示唆する。
実施例３：Ｄ２枯渇は、筋肉再生中の幹細胞増殖を増強する
損傷時の、サテライト細胞におけるＤ２枯渇の結果を決定するために、本発明者らは、カルジオトキシン（ＣＴＸ）注射の２１日後に採取したサテライト細胞特異的ｃＤ２ＫＯマウスからのＴＡ筋肉を分析した（図３Ａ）。
損傷時の、サテライト細胞におけるＤ２枯渇の結果を決定するために、本発明者らは、カルジオトキシン（ＣＴＸ）注射の２１日後に採取したサテライト細胞特異的ｃＤ２ＫＯマウスからのＴＡ筋肉を分析した（図３Ａ）。
Ｄ２枯渇は、対照と比較して、より多くの数の中央に核が位置する繊維をもたらし、より小さい繊維直径に関連していた（図３Ｂ～Ｃ）。したがって、Ｐａｘ７＋／ＭｙｏＤ＋細胞の数及び同等のＰａｘ７＋／ＢｒｄＵ＋細胞の数は増加したが、Ｐａｘ７＋／ＭｙｏＤ－及びＰａｘ７－／ＭｙｏＤ＋細胞集団の数は減少した（図３Ｄ）。これは、Ｄ２の非存在が幹細胞の増殖能力を増加させる一方で、筋原性プログラムの完了が遅れることを示唆した。
興味深いことに、ＣＴＸ損傷の６０日後、線維直径は対照と比較してｃＤ２ＫＯマウスにおいてより大きく、これは完全な成熟がＤ２の非存在下では長期間にわたって達成され得ることを示唆する（時間３Ｅ）。
実施例４：Ｄ２枯渇は、皮膚再生中に幹細胞増殖を増強する
組織再生中のインビボでのＤ２枯渇の効果を特徴付けるために、創傷治癒アッセイを本発明者らによって実施した。表皮の再生の時間経過は、創傷の閉鎖が対照皮膚よりもＤ２欠乏表皮において有意に速いことを示した（図４Ａ）。全体として、これらのデータは、制御されない活性化から毛包幹細胞を保護する際のＤ２の重要な役割を指摘している。
組織再生中のインビボでのＤ２枯渇の効果を特徴付けるために、創傷治癒アッセイを本発明者らによって実施した。表皮の再生の時間経過は、創傷の閉鎖が対照皮膚よりもＤ２欠乏表皮において有意に速いことを示した（図４Ａ）。全体として、これらのデータは、制御されない活性化から毛包幹細胞を保護する際のＤ２の重要な役割を指摘している。
実施例５：マウスにおける全体的なＤ２枯渇は、筋消耗を減弱させる
筋萎縮におけるＤ２誘導の機能的役割を評価するために、本発明者らは、Ｄ２ＫＯマウスにおいて癌悪液質研究を実施した。Ｄ２ＫＯ及び野生型（ＷＴ）マウスのマッチさせた対にＣ２６細胞を注射し、筋消耗を注射後１２日目及び１５日目にモニターした。
筋萎縮におけるＤ２誘導の機能的役割を評価するために、本発明者らは、Ｄ２ＫＯマウスにおいて癌悪液質研究を実施した。Ｄ２ＫＯ及び野生型（ＷＴ）マウスのマッチさせた対にＣ２６細胞を注射し、筋消耗を注射後１２日目及び１５日目にモニターした。
ＷＴ筋肉はヘマトキシリン及びエオシン染色、繊維断面積（ＣＳＡ）、体重及び心臓重量によって示されるように、注射後８～９日目から１５日目まで劇的な筋消耗を受けた（図５Ａ～Ｄ）。逆に、Ｄ２ＫＯ筋肉は大量の筋消耗から保護され、注射後１５日まで、萎縮プロセスはＷＴマウスと比較して減弱された（図５Ａ～Ｄ）。
重要なことに、ＷＴマウスの平均生存能は１２．７日であったが、Ｄ２ＫＯマウスはその生存能をほぼ２倍にした（２２．４日、図５Ｄ）。興味深いことに、進行中の筋萎縮の一般的な徴候であるアトロゲン誘導は、Ｄ２ＫＯマウスにおいて高度に減少した（図５Ｅ及びＦ）。
Ｄ２ＫＯマウスにおける筋脱神経研究は、ＷＴマウスと比較して、Ｄ２ＫＯマウスにおける筋消耗の減少という類似の表現型を示した。除神経後９日目及び１２日目に、ＷＴ動物の腓腹筋（ＧＣ）重量はそれぞれ３８％及び３４％減少したが、Ｄ２ＫＯマウスにおける筋肉重量の減少は４％及び６％であった（図６Ａ）。一貫して、Ｄ２ＫＯマウス線維の直径は、ＷＴマウスと比較した場合、除神経後１２日目に著しく大きかった（図６Ｂ）。
ユビキチンリガーゼＭｕＲＦ－１及びアトロギン－１はまた、脱神経されたＷＴマウスと比較して、脱神経されたＤ２ＫＯマウスにおいて強力にダウンレギュレートされ、ＵＰＳ刺激がＤ２の非存在下で劇的に減少することを示した（図６Ｃ及びＤ）。
これらのデータは、インビボで実験的に誘導された萎縮の劇的な減衰のための、Ｄ２除去の効率性及び結果としてのＴＨ作用の減少を証明する。
実施例６：幹細胞を活性化するための新規治療ツールとしての薬物誘導性Ｄ２阻害
幹細胞を活性化し、筋組織修復を促進するＤ２枯渇の能力を治療的に使用するために、マウスを、７日間（ＣＴＸ損傷に対して－５／＋２）、経口逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３、特異的Ｄ２阻害剤）で処理した（図７Ａ）。ＣＴＸの７日後のヘマトキシリン及びエオシン解析は線維数の増加の存在を示し、線維はまたｒＴ３処理マウスにおいて対照よりも小さかった（図７Ｂ及び７Ｃ）。ｒＴ３処理マウスにおいて、Ｐａｘ７＋／ＥｄＵ＋細胞は、対照よりも増加した（図７Ｄ）。重要なことに、Ｄ２阻害の限られた時間フレーム（７日間）と一致するように、損傷後２１日目には対照よりも大きな線維がｒＴ３処理マウスにおいて観察された（図７Ｅ及び７Ｆ）。
幹細胞を活性化し、筋組織修復を促進するＤ２枯渇の能力を治療的に使用するために、マウスを、７日間（ＣＴＸ損傷に対して－５／＋２）、経口逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３、特異的Ｄ２阻害剤）で処理した（図７Ａ）。ＣＴＸの７日後のヘマトキシリン及びエオシン解析は線維数の増加の存在を示し、線維はまたｒＴ３処理マウスにおいて対照よりも小さかった（図７Ｂ及び７Ｃ）。ｒＴ３処理マウスにおいて、Ｐａｘ７＋／ＥｄＵ＋細胞は、対照よりも増加した（図７Ｄ）。重要なことに、Ｄ２阻害の限られた時間フレーム（７日間）と一致するように、損傷後２１日目には対照よりも大きな線維がｒＴ３処理マウスにおいて観察された（図７Ｅ及び７Ｆ）。
同様の設定において、本発明者らはまた、Ｄ２阻害が皮膚における創傷再生に正の影響を及ぼすかどうかを試験した。実際、ｒＴ３処理マウスは、対照よりも迅速かつ効率的に創傷を修復する（図８Ａ～Ｂ）。興味深いことに、皮膚創傷後の後の時点で、ｒＴ３で処理された動物は、剃毛エリアにおいて毛髪のより完全な再成長を有することが観察された（図８Ｄ）。
まとめると、これらの結果は、ｒＴ３によるＤ２ブロッキングが、幹細胞を「活性化する」ことにより、様々な組織状況における再生を促進し、インビボで治療的に使用され得ることを実証した。
実施例７：ＴＨは、ＮＦＫＢ／ＴＮＦαシグナル伝達経路を調節する
筋萎縮の間、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、インターロイキン（ＩＬ）－１β及びＩＬ－６などのほとんどの炎症誘導性サイトカインは、増強された核内因子κＢ（ＮＦＫＢ）の活性化とともに過剰発現される(Bonaldo P. and Sandri M., Dis Model Mech. 2013 Jan;6(l):25-39)。
筋萎縮の間、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、インターロイキン（ＩＬ）－１β及びＩＬ－６などのほとんどの炎症誘導性サイトカインは、増強された核内因子κＢ（ＮＦＫＢ）の活性化とともに過剰発現される(Bonaldo P. and Sandri M., Dis Model Mech. 2013 Jan;6(l):25-39)。
本発明者らは、筋細胞のＴＮＦα処理に対するＴＨ調節の効果を試験した。細胞を正常血清中でＴＮＦαで処理すると、２４時間で細胞死が観察された（図９Ａ～Ｇ）。逆に、ＴＨの非存在下で培養された細胞（又はＴＨ活性化がｒＴ３によるＤ２ブロッキングを介して妨げられた場合）はアポトーシスから保護され、一方でＴＮＦα受容体はさらにＤ２ブロッキングの抗アポトーシス効果をさらにレスキューした（図２Ａ及びＢ）。ＴＮＦは、アポトーシスなどのその多くの生物学的効果を媒介する核内転写因子ＮＦ－κＢの最も強力な生理学的誘導因子の１つであり、ここではＮＦ－ＫＢ活性化及び結果として核へのｐ６５サブユニットの移行がｒＴ３によってブロックされたことが実証された（図９Ｃ及びＤ）。
本発明者らは総ｐ６５レベルを変化させることなく、ＴＮＦαが正常血清増殖細胞においてカスパーゼ－８活性を誘導し、この効果は、ＴＨの非存在下（又はＴＨ活性化がｒＴ３によるＤ２ブロッキングを介して防止された場合、又は細胞をチャコールストリッピングされた培地中で培養した場合）ではほとんど存在しないことを観察した（図９Ｅ）。これと一致して、筋肉細胞におけるＤ３の過剰発現はそれらをＴＮＦ誘導アポトーシスから保護し（図９Ｆ及びＧ）、一方、ＴＮＦ受容体の添加はＤ３過剰発現による保護効果をレスキューした（図９Ｇ）
まとめると、これらのデータは筋萎縮の重要なメディエータを誘導する際におけるＴＨの主要な役割を示し、萎縮誘導筋細胞死に対するＤ２不活性化の保護的役割を確認する。
実施例８：筋消耗を減弱させるための新規治療ツールとしての薬物誘導性Ｄ２阻害
大量の筋消耗からマウスを保護するＤ２ブロッキングの能力を治療的に使用するために、本発明者らは、特異的Ｄ２阻害剤であるアミオダロンを使用した。腫瘍誘導性悪液質マウスモデルにおいて、マウスを経口アミオダロンで１８日間（Ｃ２６注射に対して－７／＋１１）処理した（図１０Ａ）。アミオダロン処理マウス及び対照マウスのマッチさせた群にＣ２６細胞を注射し、筋消耗を注射後の異なる日数までモニターした。対照マウスの筋肉は線維断面積（ＣＳＡ）、身体、心臓、ＴＡ(前脛骨筋）及びＧＣ(腓腹筋）重量によって示されるように、劇的な筋消耗を受けた（図１０Ｂ～Ｅ及び１０Ｊ）。逆に、アミオダロン処理マウスの筋肉は、大量の筋消耗から保護された（図１０Ｂ～Ｅ）。さらに、アミオダロン処理マウスと対照マウスとの間で腫瘍重量に対する有意な効果はなく、アミオダロンによる処理が腫瘍増殖を阻害しなかったことが示された（図１０Ｆ）。
大量の筋消耗からマウスを保護するＤ２ブロッキングの能力を治療的に使用するために、本発明者らは、特異的Ｄ２阻害剤であるアミオダロンを使用した。腫瘍誘導性悪液質マウスモデルにおいて、マウスを経口アミオダロンで１８日間（Ｃ２６注射に対して－７／＋１１）処理した（図１０Ａ）。アミオダロン処理マウス及び対照マウスのマッチさせた群にＣ２６細胞を注射し、筋消耗を注射後の異なる日数までモニターした。対照マウスの筋肉は線維断面積（ＣＳＡ）、身体、心臓、ＴＡ(前脛骨筋）及びＧＣ(腓腹筋）重量によって示されるように、劇的な筋消耗を受けた（図１０Ｂ～Ｅ及び１０Ｊ）。逆に、アミオダロン処理マウスの筋肉は、大量の筋消耗から保護された（図１０Ｂ～Ｅ）。さらに、アミオダロン処理マウスと対照マウスとの間で腫瘍重量に対する有意な効果はなく、アミオダロンによる処理が腫瘍増殖を阻害しなかったことが示された（図１０Ｆ）。
ユビキチンリガーゼＭｕＲＦ－１及びアトロギン－１はまた、対照と比較して、アミオダロン処理マウスにおいて強力にダウンレギュレートされた（図１０Ｇ及びＨ）。重要なことに、対照マウスの生存パーセンテージは約１２．７日であったが、遺伝学的Ｄ２枯渇マウスにおける腫瘍誘導性悪液質において観察されたのと同様に、アミオダロン処理マウスはそれらの生存をほぼ２倍にした（２７日より長い、図１０Ｉ）。
脱神経マウスモデルにおいて、マウスを経口アミオダロンで１３日間処理した（除神経の－７日目から＋５日目）。Ｄ２ＫＯマウスにおける腫瘍誘導性悪液質モデルと一致して、ユビキチンリガーゼＭｕＲＦ－１及びアトロギン－１もまた、対照マウスと比較してアミオダロン処理マウスにおいて強力にダウンレギュレートされた（図１１Ａ及びＢ）。さらに、除神経後にも、アミオダロン処理マウスの筋肉は、腓腹筋質量の維持によって示されるように、大量の筋消耗から保護された（図１１Ｃ）。
これらのデータは、インビボで実験的に誘導された筋萎縮を劇的に減弱させるＤ２除去の有効性を証明する。
実施例９：骨格筋の機能回復のための新規治療ツールとしての薬物誘導性Ｄ２阻害
Ｄ２阻害剤化合物の治療可能性をさらに検証するために、本発明者らは、ジストロフィー表現型（ＤｙｓＥ１７）を特徴とするハエモデルにおいて、骨格筋に対するアミオダロンの作用を検討した。ショウジョウバエジストロフィン遺伝子は、ジストロフィン様タンパク質の３つの大型アイソフォーム（ＤＬＰ１、ＤＬＰ２、及びＤＬＰ３）並びに３つの短縮型産物（Ｄｐ１８６、Ｄｐ２０５、及びＤｐ１１７）をコードするので、その哺乳動物の対応物と同じくらい複雑である。
Ｄ２阻害剤化合物の治療可能性をさらに検証するために、本発明者らは、ジストロフィー表現型（ＤｙｓＥ１７）を特徴とするハエモデルにおいて、骨格筋に対するアミオダロンの作用を検討した。ショウジョウバエジストロフィン遺伝子は、ジストロフィン様タンパク質の３つの大型アイソフォーム（ＤＬＰ１、ＤＬＰ２、及びＤＬＰ３）並びに３つの短縮型産物（Ｄｐ１８６、Ｄｐ２０５、及びＤｐ１１７）をコードするので、その哺乳動物の対応物と同じくらい複雑である。
ショウジョウバエ、ドロソフィラ・メラノガスターでは、システム機能／機能不全の複雑な問題を、他のモデル生物よりも迅速に調べることができる。ショウジョウバエは、強力で十分に確立された遺伝学的フレームワークの文脈において、特異的発現実験を可能にする有意な強さを有する。この点において、ヒト疾患について代表的かつ高度に関連するショウジョウバエシステムは、標的同定、インビボ・リパーパシング、及び高スループット化合物スクリーニングを介した薬物発見において重要な役割を有し、したがって、ヒト治療薬へのリード化合物の移行に有利に働く。ハエの生活環において、ハエの幼虫は産卵された受精卵から孵化し、連続的に食べ、１齢及び２齢期の後に２回脱皮するためにだけ停止する。産卵後５／６日目に、３齢幼虫は食物を残し、成虫ハエへの変態（９／１０日）を起こす準備をすると「遊走」する。これらの理由から、Ｄ．メラノガスターは、受精卵から成体段階へのインビボでの慢性的な薬物送達に適した生物である。また、ショウジョウバエにおける摂食実験は、多細胞生物における生物学的効果を評価するためのステップとして、インビボでの分子の効率的な活性及び経口送達を支持するために重要である。
バリデーション研究のために、成体野生型及びＤｙｓＥ１７変異体のクライミング能力及び筋肉組織を、０～３０日間、増加する濃度のアミオダロンを伴う食餌補給後に分析した（走地性アッセイ）。ジストロフィーのショウジョウバエ変異体のクライミングの低下速度は野生型ハエよりも有意に速く、ジストロフィン様タンパク質が正常な筋肉組織に必要であることを示唆している。したがって、異なるストックを用いて、ショウジョウバエのｄｙｓ変異体は重力と反対向きの正常な移動性とともに成体の生命を開始し、その後、本発明者らのモデルに匹敵する時間依存性の筋肉欠損を示すことが、以前に実証されている。
図１２に示されるように、１：１０００のＤＭＳＯ（５０ｍＭアミオダロンについて使用した担体）のみで３０日間処理したＤｙｓＥ１７ハエのクライミング能力は、オレゴン野生型ハエよりも低かった。特に、１００ｎＭ～１０μＭの増加する用量のアミオダロンを用いた動物投与は、用量依存的なハエの運動性に対する有益な効果を誘導し、最も有効な濃度は１０μｍであった。より高い濃度のアミオダロン、すなわち２０～５０μＭは、ジストロフィー動物のクライミングの低下を変化させなかった。
ハエの５０％のみがクライミングできた処理日数の判定（図１２Ｃ）は、さらなるアミオダロン効果を示すことを可能にした。クライミング低下：オレゴン－２４．５日；Ｄｙｓ－１４．２日；Ｄｙｓ＋アミオダロン１００ｎＭ－１５．５日；Ｄｙｓ＋アミオダロン１μＭ－１６．５日；Ｄｙｓ＋アミオダロン１０μＭ－１７．５日；Ｄｙｓ＋アミオダロン２０μＭ－１２．８日；Ｄｙｓ＋アミオダロン５０μＭ－１２．３日。
異なる処理日数でのＤｙｓハエのクライミング能力の分析（図１３）は、アミオダロンで誘導される運動性の増加が１５日及び２０日の処理後に明白である（そして用量依存的傾向に従う）一方で、より短い時間では影響が観察されなかったことを示した。特に、ジストロフィーハエのクライミングの低下は、１０μＭでの１５日間の動物処理（損傷動物３５％対１８％）及び２０日間の動物処理（損傷動物５５％対３２％）後にほぼ半減した。特に、２５～３０日後、未処理及びアミオダロン処理Ｄｙｓ動物の両方が、同じ機能的欠損を示した（上記の結果を参照されたい）。これらの結果は、アミオダロンが特定の時間ウインドウ内でジストロフィーハエのクライミング能力を改善する可能性を示唆する。
実験計画の上記の結果は、１０ｍＭのアミオダロンの成体ジストロフィーハエへの慢性的投与（３０日間）が、動物のクライミング効率を有意に改善したことを示している。また、１０ｍＭ未満の濃度のアミオダロンを用いた動物では用量依存的な有益な傾向が観察されたが、２０～５０ｍＭの範囲のアミオダロン濃度では効果が見られず、いくぶん有害な閾値を示唆していることも注目に値する。アミオダロンの最も高い有益な効果は、ショウジョウバエの若齢の後、すなわち１５～２０日間の処理後に達成され、中年齢－老齢のハエ（２５日後）において消失した。Ｄ．メラノガスターのジストロフィー変異体の機能的に回復した筋肉は、構造レベルではまだ傷ついていた。
これらの結果を総合すると、アミオダロンは骨格筋収縮性に正の影響を及ぼすが、ジストロフィー筋原線維の破壊には影響を及ぼさないことが示される。
Claims (10)
- 筋消耗の治療的処置、並びに／又は筋肉及び／若しくは皮膚の再生治療方法における使用のための、２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物。
- 逆位トリヨードチロニン（ｒＴ３）、アミオダロン（ＡＭＩＯ）、デスエチルアミオダロン（ＤＥＡ）、５－メチル－２－チオウラシル（ＭＴＵ）、６－ベンジル－２－チオウラシル（ＢＴＵ）、キサントフモール（ＸＴＨ）、ゲニステイン（ＧＥＮ）、６－プロピル－２－チオウラシル（ＰＴＵ）、メチマゾール（ＭＭＩ）、イオパノ酸（ＩＡｃ）、デキサメタゾン、金チオグルコース（ＧＴＧ）、及びこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の使用のための２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物。
- 筋消耗が、サルコペニア、癌、敗血症、糖尿病、慢性心不全、慢性閉塞性肺疾患、慢性腎不全、肝硬変、嚢胞性線維症、筋脱神経、絶食、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される疾患状態に起因する、請求項１又は２に記載の使用のための２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物。
- 前記疾患状態が新生物性悪液質である、請求項３に記載の使用のための２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物。
- 遅発性筋肉痛（ＤＯＭＳ）、筋挫傷、肉離れ、筋裂傷、癌性悪液質、筋萎縮、筋ジストロフィー、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される筋疾患の治療的処置に使用するための、請求項１又は２に記載の２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物。
- 潰瘍、皮膚炎、皮膚創傷、熱傷、裂傷、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される皮膚疾患の治療的処置における使用のための、請求項１又は２に記載の２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物。
- 筋消耗の治療的処置並びに／又は、筋肉及び／又は皮膚の再生治療方法における使用のための医薬組成物であって、治療有効量の、少なくとも１つの請求項１から６のいずれか１項に記載の２型ヨードチロニンデヨージナーゼ（Ｄ２）の阻害剤化合物と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は希釈剤と、を含む医薬組成物。
- 局所、経口、経腸、又は非経口投与のための医薬剤形である、請求項７に記載の使用のための医薬組成物。
- 前記局所投与のための医薬剤形が、クリーム、軟膏、スプレー、ゲル、ガーゼ、パッド、パッチ、薬用パッチ、及びスポンジからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
- 前記経口投与のための医薬剤形が、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、及びシロップからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
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