EA010240B1 - 1α-ФТОР-25-ГИДРОКСИ-16,23Е-ДИЕН-26,27-БИСГОМО-20-ЭПИХОЛЕКАЛЬЦИФЕРОЛ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ - Google Patents

Abstract

Применение 1α-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН) и ассоциированных симптомов.

Description

Настоящее изобретение относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо20-эпихолекальциферола (соединения А) для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН) и ассоциированных симптомов. Кроме того, изобретение относится к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН) и ассоциированных симптомов введением 1αфтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола в количестве, эффективном для профилактики и/или лечения указанного заболевания, отдельно или в комбинации с другими активными агентами.

ВРН является частым заболеванием у людей пожилого возраста, которым заболевают приблизительно 50% мужчин в возрасте 60 лет и 90% в возрасте 85 лет. ВРН представляет собой специфическое гистопатологическое образование, которое характеризуется гиперплазией клеток стромы и эпителия.

Уже более ста лет считается, что двумя этиологическими факторами патогенеза ВРН являются старение организма и наличие функциональных семенников. Однако по мере накопления сведений о предстательной железе, эта концепция представляется недостаточной, поскольку она не учитывает все аспекты патогенеза ВРН. В регуляции роста предстательной железы существенную роль играют дополнительные этиологические факторы. Например, получено доказательство того, что рост предстательной железы непосредственно контролируется специальными ростовыми факторами, которые продуцируются клетками самой железы, действующими локальным образом на соседние клетки по паракринному механизму или на продуцирующие клетки железы по аутокринному механизму. Следовательно, в настоящее время много внимания уделяется разработке стратегии лечения, основанной на ингибировании внутрипростатических ростовых факторов.

ВРН является обычной причиной хронических симптомов недостаточности функции мочевого тракта, которые влияют на фазу заполнения (симптомы раздражения) и на фазу опорожнения (обструктивный синдром) цикла мочеиспускания. Эти симптомы затрагивают социальные, психологические, домашние и профессиональные, физические и сексуальные стороны жизни пациента и оказывают сильное негативное воздействие на качество жизни. Кроме того, ВРН может вызывать более острые урологические осложнения, прежде всего острую задержку мочи (АИК), часто наблюдающиеся более серьезные осложнения ВРН и не столь часто рецидивирующие инфекции мочевого тракта, дилатацию (расширение) верхней области мочевого тракта, образование камней в мочевом пузыре и рецидивирующую гематурию.

Лечение ВРН связано с чрезвычайно высоким социальными расходами, которые только в США составляли в 1993 г. 4 биллиона долларов и прогнозируются в объеме 26 биллионов долларов в 2003 г.

Современная схема лечения ВРН включает пероральный прием ингибиторов 5а-редуктазы (финастерида и дутастерида, недавно разрешенных ΕΌΑ) и антагонистов α 1-рецептора (теразозин, доксазозин, тамсулозин, а также силодозин, А1О-8507Ь, КВх-2258 и т.п.). Каждый из этих терапевтических подходов обладает как преимуществами, так и недостатками, которые связаны с различными механизмами действия. В то время как антагонисты α 1-рецептора с высокой эффективностью снижают симптомы, относящиеся к симптомам недостаточности мочевого тракта (ЬИТЗ), эти средства неэффективны в отношении снижения объема предстательной железы и, следовательно, не пригодны для предупреждения хирургического вмешательства. Напротив, ингибиторы 5а-редуктазы, такие, как финастерид и дутастерид, снижают образование дигидротестостерона (ЭНТ), снижают размер предстательной железы и позволяют исключить хирургическое вмешательство. Кроме того, последние результаты клинических испытаний (в течение 7 лет) по предупреждению рака предстательной железы, в которых принимало участие более 18000 здоровых мужчин пожилого возраста, показали, что финастерид может предотвращать или замедлять развитие рака предстательной железы (см. Тйошрзоп Ι.Μ. и др., Νο\ν Епд1ап6 1оитпа1 о£ Мебюше, 349, 215-224 (2003)). Однако, как и ожидалось (см. КаззаЫап У.8., Ьапсе!, 361, 60-62 (2003)), финастерид обладает антиандрогенными побочными действиями в отношении половой функции, такими, как снижение потенции, влечения и гинекоматия, что существенно снижает возможность его применения в качестве агента, предупреждающего развитие опухоли. Кроме того, лечение финастеридом ассоциируется с повышенным выявлением высокозлокачественного рака предстательной железы, возможно потому, что при индуцированном финастеридом низкоандрогенном состоянии происходит отбор наиболее агрессивных, андроген-нечувствительных злокачественных клеток (см. Зсатбшо Р.Т., №\ν Епд1апб 1оитпа1 о£ Мебюше, 349, 297-299 (2003)).

Таким образом, существует настоятельная необходимость в новом классе лекарственных средств для терапии ВРН, которые способны предотвратить острую задержку мочи и одновременно исключить связанное с этим хирургическое вмещательство, т. е. снижают андроген-индуцированный рост предстательной железы и не оказывают прямого воздействия на андрогенные рецепторы (АК), и, следовательно, не обладают анти-андрогенными простатическими и экстрапростатическими побочными действиями, например, побочным действием на сексуальные аспекты жизни пациента. Благодаря блокированию сигналов от местных ростовых факторов предстательной железы такие лекарственные средства могут применяться не только для лечения ВРН, но и для профилактики рака предстательной железы, возможно без отбора АК-нечувствительных злокачественных клонов.

- 1 010240

Как указано в тексте заявки, заявители установили, что не обладающий гиперкальцемическим действием, хорошо переносимый аналог витамина Б₃, 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферол (соединение А), является первым примером такого лекарственного средства, поскольку это соединение может воздействовать на ВРН независимым от андрогенного рецептора способом, оказывая влияние на многие пути, контролирующие клеточный рост ВРН, включая пролиферацию предстательной железы, опосредованную ростовыми факторами.

1,25-Дигидроксивитамин ϋ₃ [1,25(ОН)2О₃], активированная форма витамина Б₃, представляет собой секостероидный гормон, который не только играет центральную роль в формировании костной ткани и метаболизме кальция, но и принимает участие в регуляции иммунного ответа, дифференцировке и апоптозе многих типов клеток, включая злокачественные клетки.

Однако проблемой терапевтического использования кальцитриола является его природная способность индуцировать гиперкальцемию и гиперфосфатемию. В связи с этим разработаны аналоги кальцитриола, сохраняющие биологическую активность, но лишенные гиперкальцемического побочного действия.

В ϋ8 5939408 и ЕР 808833 заявлен ряд аналогов 1,25(ОНДВз, включая 1а -фтор-25-гидрокси16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол (соединение А). В ИЗ 5939408 и ЕР 808833 описано, что эти соединения индуцируют дифференцировку и ингибируют пролиферацию различных линий клеток кожи и раковых клеток и применяются для лечения гиперпролиферативных заболеваний кожи, таких, как псориаз, неопластические заболевания, такие, как лейкоз, рак молочной железы и заболевания сальной железы, такие, как угри, себорейный дерматит и остеопороз.

В последнее время в ряде работ заявителя неожиданно установлено, что в отличие от других аналогов 1,25(ОНДВ3, соединение А

существенно снижает рост клеток предстательной железы человека ίη νίΐτο благодаря индукции апоптоза и подавляет рост предстательной железы ίη νίνο, не оказывая воздействия на уровни тестостерона и дигидротестостерона. Кроме того, такое ингибирование роста предстательной железы достигается при введении доз, не вызывающих гиперкальцемию. Таким образом, соединение А является эффективным фармакологическим агентом для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

Как описано в примерах, соединение А снижает размер предстательной железы. Кроме того, аналогично финастериду соединенеие А снижает пролиферативную активность тестостерона ίη νίΐτο и ίη νίνο. Однако существенно, что в отличие от финастерида соединение А не ингибирует активность 5аредуктазы типа 1 и типа 2 и может подавлять клеточный рост при ВРН, индуцированный не только тестостероном, но и дигитротестостероном. Эти антиандрогенные свойства соединения А не зависят от взаимодействия с рецептором АР, поскольку установлено, что соединение А не связывается с АР или не проявляет активности агониста или антагониста АР. Кроме того, соединение А не оказывает влияния на секрецию полового гормона. Кроме того, как установлено в наших исследованиях, соединение А не оказывает существенного влияния на уровень РЗА и, таким образом, при лечении соединением А не возникает опасность маскировки этого важного признака возможного рака предстательной железы.

Еще одно существенное преимущество соединения А состоит в том, что при испытаниях ίη νίνο это лекарственное средство, в отличие от финастерида, способно ингибировать рост базальных клеток и стимулированный тестостероном рост клеток мочевого пузыря, и, следовательно, такое лекарственное средство может найти применение для профилактики и/или лечения дисфункции мочевого пузыря у человека. При исследованиях ίη νίνο на мочевом пузыре крысы с обструкцией выходного отверстия, как модели дисфункции мочевого пузыря, установлено лечебное действие соединения А. Такое свойство соединения А представляет несомненный интерес, поскольку дисфункция мочевого пузыря является частым и болезненным осложнением при ВРН. Таким образом, соединение А способно снижать размеры предстательной железы и уменьшать интенсивность дисфункции мочевого пузыря, т.е. вызвать улучшение функции мочевого пузыря и снижать интенсивность симптомов ВРН, ассоциированных с мочевым пузырем, при одновременном непосредственном воздействии соединения А на предстательную железу и мочевой пузырь. Предполагается, что такое действие оказывается независимо от улучшения симптомов мочевого пузыря, которое, как предполагается, является просто результатом снижения размеров предстательной железы. Симптомы мочевого пузыря включают сверхактивированный мочевой пузырь, а показатели улучшения функции мочевого пузыря включают снижение сокращений непустого пузыря и остаточной

- 2 010240 мочи.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Едиен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы. В объем изобретения включены также фармацевтически приемлемые сложные эфиры и соли соединения А.

Изобретение также относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

Изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы у пациентов, которые нуждаются в такой профилактике или лечении, включающему введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира.

Изобретение также относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

Изобретение также включает 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир для применения при профилактике и/или лечении доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

Изобретение также относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы при отсутствии антиандрогенных простатических и экстрапростатических побочных действий. Изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы при отсутствии антиандрогенных простатических и экстрапростатических побочных действий у пациентов, которые нуждаются в такой профилактике или лечении, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира.

Изобретение также относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы наряду с одновременной профилактикой и/или лечением дисфункции мочевого пузыря. Изобретение относится также к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы наряду с одновременной профилактикой и/или лечением дисфункции мочевого пузыря у пациентов, которые нуждаются в такой профилактике или лечении, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира.

1а-Фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол является известным соединением, которое получают, как описано в И8 5939408, включенном в описание заявки в качестве ссылки.

Сложные эфиры включают фармацевтически приемлемые лабильные сложные эфиры, которые гидролизуются в организме с высвобождением соединения А.

Соли соединения А включают аддукты и комплексы, которые образуются при взаимодействии с ионами щелочных и щелочно-земельных металлов и их солями, такими, как ионы натрия, калия и кальция и их соли, такие, как хлорид кальция, малонат кальция и т.п.

Соединение А или его соль или сложный эфир можно применять при монотерапии или их можно вводить в комбинации с известными агентами, активными в отношении ВРН, например, с агентом, блокирующим альфа-адренергический рецептор, с таким, как антагонист α 1-рецептора (например, теразозин, доксазозин или тамсулозин или также силодозин, АЮ-8507Ь или КВх-2258) или ингибитор 5αредуктазы (например, финастерид или дутастерид). Термин «агент, активный в отношении ВРН» включает агенты, обладающие активностью или относительно которых известно, что они обладают активностью, при лечении или профилактике ВРН, такие как соединения, указанные выше. Компоненты, входящие в состав комбинации, смешивают с соединением А или его солями или сложными эфирами в различных соотношениях и вводят раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов. Соответствующие дозы известных терапевтических агентов легко определяются спецалистом в данной области. Комбинация соединения А с двумя или более (например, тремя) соединениями, активными в отношении ВРН, может представлять собой, например, комбинацию антагониста а1-рецептора и ингибитора 5а-редуктазы. При введении в комбинации с соединением А (или его соли или сложного эфира) компоненты комбинации можно использовать в более низких дозах по сравнению с использованием такого компонента отдельно, даже при субтерапевтической дозе.

- 3 010240

Таким образом, изобретение также включает применение, указанное выше, где лекарственное средство вводят раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов, включающих второй агент, активный в отношении ВРН.

Таким образом, изобретение включает применение 1а-атор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира в комбинации со вторым агентом, активным в отношении ВРН, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

Изобретение относится также к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы у пациента, который нуждается в такой профилактике или лечении, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов, включающих второй агент, активный в отношении ВРН.

Указанные комбинации обычно получают для применения в форме фармацевтических составов. Полученные таким образом фармацевтические составы также являются объектом настоящего изобретения.

Дозы и последовательность введения активных ингредиентов в фармацевтические составы по изобретению могут изменяться таким образом, чтобы количество активного ингредиента являлось эффективным для обеспечения требуемого терапевтического ответа с учетом конкретного пациента, композиции и способа введения, причем указанное количество активного ингредиента должно быть нетоксичным для пациента. Доза соединения А может составлять от 0,1 до 300 мкг в сутки, например, 50-150 мкг в сутки, например, 75 или 150 мкг в сутки. Стандартные дозы предпочтительно содержат 50-150 мкг, например, 75 или 150 мкг и предпочтительно вводятся один раз в сутки.

Конкретно предпочтительная доза соединения А является той максимальной дозой, которая переносится пациентом и не вызывает гиперкальцемии или других нежелательных побочных действий, таких, как гиперкальциурия. Предпочтительно соединение А вводят в концентрации от приблизительно 0,001 мкг до приблизительно 100 мкг на кг массы тела, от приблизительно 0,001 до приблизительно 10 мкг/кг или от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мкг/кг массы тела. Интервалы вышеуказанных значений также являются частью настоящего изобретения.

Как отмечалось выше, соединение А можно вводить в виде фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, однако предпочтительно соединение А применяют как таковое, т. е. не в виде сложного эфира или соли.

Указанные дозы можно принимать в виде соответствующего фармацевтического состава однократным введением, многократным введением или в виде препаратов с контролируемым высвобождением для достижения наиболее эффективных результатов, предпочтительно перорально один или два раза в день (предпочтительно один раз в день), например, в течение месяца. В некоторых ситуациях для достижения требуемого терапевтического ответа может оказаться достаточной альтернативная доза.

Выбор точных доз и состава и наиболее благоприятной схемы лечения зависит от фармакологических свойств состава, природы и тяжести состояния, подлежащего лечению, и физического и умственного состояния реципиента.

Типичные способы доставки включают пероральный, парентеральный (включая подкожный, внутримышечный и внутривенный), ректальный, трансбуккальный (включая сублингвальный), легочный, чрескожный и интраназальный способы, наиболее предпочтителен пероральный способ. Введение бывает непрерывным и прерывистым (например, в виде струйной инъекции).

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей 1а-фтор-25-гидрокси16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

Изобретение также относится к упакованному составу, который включает фармацевтическую композицию, содержащую 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир, и фармацевтически приемлемый носитель, и содержит инструкции по применению композиции для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

Как отмечалось выше, такие композиции можно получать для парентерального (подкожного, внутримышечного или внутривенного) введения, прежде всего в форме жидких растворов или суспензий; для перорального или трансбуккального введения, прежде всего в форме таблеток или капсул; для легочного или интраназального введения, прежде всего в форме порошков, назальных капель или аэрозолей; и для ректального или чрескожного введения.

Композиции обычно можно вводить в форме стандартных доз и можно получать любым методом, известным в фармацевтике, например, как описано в ВетшЦоп'х Рйаттасеийса1 8с1еисе8, 17^4Ь ей., Маск РиЫщЫид Сотраиу, Еайои, РА (1985). Составы для парентерального введения могут содержать в качест

- 4 010240 ве эксципиентов стерильную воду или солевой раствор, алкиленгликоли, такие, как пропиленгликоль, полиалкиленгликоли, такие, как полиэтиленгликоль, масла растительного происходения, гидрогенированные нафталины и т.п. Составы для назального ведения являются твердыми и могут содержать эксципиенты, например, лактозу или декстран, или могут представлять собой водные или масляные растворы для применения в форме назальных капель или дозированных спреев. Типичные эксципиенты для трансбуккального применения включают сахара, стеарат кальция, стеарат магния, предварительно желатинизированный крахмал и т.п.

Композиции для перорального введения могут включать один или более физиологически приемлемых носителей и/или эксципиентов и могут находиться в твердом или жидком состоянии. Таблетки и капсулы получают с использованием связующих агентов, например, сиропа, аравийской камеди, желатина, сорбита, трагаканта или поливинилпирролидона; наполнителей, таких, как лактоза, сахароза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицин; замасливателей, таких, как стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль или оксид кремния; и ПАВ, таких, как лаурилсульфат натрия. Жидкие композиции могут содержать обычные добавки, такие, как суспендирующие агенты, например, сироп сорбита, метилцеллюлозу, сахарный сироп, желатин, карбоксиметилцеллюлозу или пищевые жиры; эмульгаторы, такие как лецитин или аравийская камедь; растительные масла, такие как миндальное масло, кокосовое масло, жир печени трески или арахисовое масло; консерванты, такие как бутилированный гидроксианизол (ВНА) и бутилированный гидрокситолуол (ВНТ). Жидкие композиции можно инкапсулировать, например, в желатин для получения стандартных форм.

Предпочтительные твердые формы для перорального применения включают таблетки, двухкамерные твердые капсулы и мягкие желатиновые капсулы (ЗЕС). Особый интерес представляют ЗЕС капсулы, поскольку они обладают явным преимуществом по сравнению с двумя другими формами (см. Зеадег Н., Зой де1айи сарки1ек: а κοίπΐίοη ίο тапу 1аЫейид ртоЫетк, Рйагтасеийса1 Тее1то1оду. 9 (1985)). К таким преимуществам ЗЕС капсул относятся : а) в ЗЕС капсулах оптимизирована однородность лекарственной формы, поскольку лекарственное средство растворяют и диспергируют в жидкости, которую затем точно дозируют по капсулам, б) лекарственные средства в виде ЗЕС капсул обладают хорошей биосовместимостью, поскольку лекарственное средство растворяется, солюбилизируется или диспергируется в водной или масляной среде и, следовательно, при высвобождении в организме эти растворы растворяются или эмульгируются с образованием дисперсий лекарственного средства с большой площадью поверхности, в) предотвращается деградация лекарственных средств, которые чувствительны к окислению при длительном хранении, поскольку сухая оболочка из мягкого желатина представляет собой барьер для диффузии кислорода.

Состав сухой оболочки обычно включает приблизительно 40-60% желатина, приблизительно 2030% пластификатора (такого, как глицерин, сорбит или пропиленгликоль) и приблизительно 30-40% воды. Кроме того, состав может также включать другие компоненты, такие как консерванты, красители, замутнители и ароматизаторы. Жидкое содержимое капсулы включает твердое лекарственное средство, растворенное, солюбилизированное или диспергированное (в смеси с суспендирующим агентом, таким, как пчелиный воск, гидрогенизированное касторовое масло или полиэтилегликоль 4000) или жидкое лекарственное средство в носителе или комбинации носителей, таких, как минеральное масло, растительные масла, триглицериды, гликоли, полиолы и ПАВ.

В типичном составе используются мягкие желатиновые капсулы 2 размера, белого цвета, непрозрачные, овальной формы, содержащие жидкий состав, включающий в качестве активного ингредиента соединение А, растворенное в миглиоле 812 (триглицерид, содержащий С₈-С₁₂жирные кислоты из фракционированного кокосового масла) в смеси с бутилированным гидроксианизолом (ВНА) и бутилированным гидрокситолуолом (ВНТ) в качестве консервантов. Мягкие желатиновые капсулы могут содержать от 0,01 до 25 мг, например, 75 или 150 мкг соединения А. Мягкие желатиновые капсулы следует хранить при температуре 2-8°С без доступа света.

Составы, содержащие соединение А или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир необязательно в комбинации со вторым агентом, активным в отношении ВРН, получают смешиванием ингредиентов.

Составы предпочтительно получают в атмосфере азота при желтом свете.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами и фигурами.

На фиг. 1 показано ингибирование пролиферации клеток ВРН кальцитриолом и соединением А (соед. А).

Фиг. 1А. Инкубация в присутствии кальцитриола (кружки) или соединения А (квадраты) при возрастающих концентрациях от 10^-18 до 10^-7 М в течение 48 ч вызывает существенное дозозависимое ингибирование роста клеток ВРН (*Р<0,01 по сравнению с контролем). Анализ по программе АБЬНТ показывает, что два секостероида проявляют одинаковое максимальное ингибирование (1_макс = 43±1%), однако характеризуются различным значением ингибирующей активности (соединение А: -1од 1С₅₀-15,8±0,5; кальцитриол: -1од 1С₅₀ = 10,2±0,6; Р<0,005). Результаты представлены в процентах ингибирования (среднее±ЗЕМ) по сравнению с относительными контролями в трех различных экспериментах при трехкрат

- 5 010240 ном повторе.

На фиг. 1Б представлено влияние соединения А при возрастающих концентрациях (от 10^-18 до 10^-7 М) на пролиферацию клеток ВРН, стимулированных Т (10 нМ, квадраты), КОР (10 нг/мл, кружки) или Ие8(1-3)1СР-1 (10 нг/мл, треугольники). Соединение А также вызывает существенное ингибирование (*Р<0,01 по сравнению с клетками, обработанными Т или СР) роста клеток ВРН в присутствии всех стимулирующих агентов с одинаковым значением I _макс = 66,6±7,3%. Однако соединение А более эффективно при ингибировании действия Т (-1од 1С₅₀ =16,4±0,6) по сравнению с двумя другими ростовыми факторами (Ое8(1-3)ЮР-1: -1од 1С₅₀ =12,7±0,6; и КОР: -1од 1С₅₀ = 14,2±0,6; Р<0,0001). Результаты представлены в % отклонения (среднее±8ЕМ) от максимальной стимуляции в трех различных экспериментах при трехкратном повторе.

На фиг. 2 показано действие соединения А, ацетата ципротерона и финастерида на рост клеток ВРН, стимулированных андрогеном. Клетки ВРН инкубировали в течение 48 ч в присутствии соединения А (1 нМ) или антиандрогенов (финастерида, Р, 1 нМ, ацетата ципротерона, Сур, 100 нМ) в присутствии Т (10 нМ, фиг. 2 А) или ΌΗΤ (10 нМ, фиг. 2В). На рисунке приведены также результаты, полученные с использованием нестимулированных клеток ВРН (фиг. 2А). Результаты представлены в процентах отклонения (среднее±8ЕМ) по сравнению с относительными контролями в трех различных экспериментах при четырехкратном повторе. Соединение А и ацетат ципротерона существенно блокируют рост клеток, индуцированный Т и ΌΗΤ, в то время как финастерид проявлял активность только в отношении клеток, стимулированных Т. *Р<0,01 по сравнению с контролем, °Р<0,01 по сравнению с клетками, стимулированными андрогеном.

На фиг. 3 показано отсутствие агонистических или антагонистических свойств у соединения А в отношении рецептора АК человека. Клетки линии РС3, недостаточные по АК, устойчиво трансфектировали АК человека и помещали в 24-луночные планшеты с плотностью 2х10⁴ клеток в лунке. Через 24 ч клетки трансфектировали АК-респонсивной плазмидой рЬ8РР и через 48 ч клетки инкубировали в присутствии возрастающих концентраций ΌΗΤ (квадраты) или соединения А (кружки) (фиг. 3А), или при фиксированной концентрации ΌΗΤ (3 нМ) в присутствии бикалутамида (квадраты) или соединения А (кружки) (фиг. 3В) в течение 18 ч. Результаты (средние значения по данным трех экспериментов) представлены в виде процента биолюминесценции на мкг общего белка. При оценке агонистической активности за 100% люциферазной активности принимали активность фермента в присутствии 100 нМ ΌΗΤ (фиг. 3А), в то время как при оценке антагонистической активности за 100% люциферазной активности принимали активность фермента при 3 нМ ΌΗΤ (фиг. 3В).

На фиг. 4 показано ингибирование роста вентральной предстательной железы крысы соединением А или финастеридом.

Фиг. 4А. Кастрированным крысам, инъецированным энантатом Т (30 мг/кг/неделя), вводили перорально в течение 5 дней в неделю (две недели подряд) носитель или соединение А в возрастающих дозах (10, 30, 100 и 300 мкг/кг) или финастерид (Р, 10 и 40 мг/кг). Массу вентральной предстательной железы представляли в % отклонения (среднее±8ЕМ) от массы железы интактных крыс, получавших носитель (^ЛР<0,05, *Р<0,01 по сравнению с контрольными крысами, °Р<0,01 по сравнению с крысами, получавшими Т).

Фиг. 4В. Интактным взрослым крысам перорально вводили в течение одного месяца (5 раз в неделю, всего 27 введений в месяц) носитель (контроль) или соединение А в возрастающих дозах (10, 30, 100 и 300 мкг/кг) или финастерид (Р, 10 и 40 мг/кг). Массу вентральной предстательной железы представляли в % отклонения (среднее±8ЕМ) от массы железы контрольных интактных крыс, получавших носитель (*Р<0,01 по сравнению с контрольными крысами).

На фиг. 5 показано действие соединения А и финастерида на экспрессию гена кластерина в вентральной предстательной железе крысы.

Фиг. 5А. Нозерн-блоттинг (гибридизация с радиоактивным зондом) экспрессии мРНК кластерина в вентральной предстательной железе интактных крыс, получавших носитель (трек 1), или орхиэктомированных крыс (трек 2). На треках 3-6 показана экспрессия гена кластерина у орхиэктомированных крыс, получавших в течение двух недель энантат Т (30 мг/кг) и получавших перорально носитель (трек 3), соединение А (300 мкг/кг, трек 4, и 100 мкг/кг, трек 5) или финастерид (40 мг/кг, трек 6). В каждый трек вносили по 10 мкг общей РНК. Соответствующая экспрессия ΟΛΡΩΗ (гель, окрашенный этидийбромидом) приводится ниже на блоте. Блот представлен для двух отдельных экспериментов.

Фиг. 5В. Нозерн-блоттинг (гибридизация с радиоактивным зондом) экспрессии мРНК кластерина в вентральной предстательной железе взрослых интактных крыс, получавших перорально в течение 1 месяца (5 раз в неделю, 27 введений) носитель (трек 1), соединение А в возрастающих дозах (10, 30 мкг/кг, треки 2 и 3) или финастерид (40 мг/кг, трек 4). В каждый трек вносили по 10 мкг общей РНК. Соответствующая экспрессия САРОЙ (гель, окрашенный этидийбромидом) приводится ниже на блоте. Блот представлен для двух отдельных экспериментов.

На фиг. 6 показаны морфологические изменения при действии соединения А на вентральную предстательную железу кастрированных крыс и крыс, получавших Т (фиг. 5А, В, С и Е). Характерные изо

- 6 010240 бражения получены с использованием поперечных срезов цельных предстательных желез, иммуноокрашенных моноклональными антителами к крысиному кластерину и вторично окрашенных гематоксилином. У крыс, кастрированных четырьмя днями ранее и получавших носитель, кластериновая метка обнаруживается в цитоплазме атрофических кубоидных эпителиальных клетках (фиг. А, 10х). После двухнедельного приема Т (фиг. В, 10х) кластериновая метка практически не обнаружена. Напротив, кластеринположительные клетки все еще присутствуют в организме крыс, обработанных Т и различными дозами соединения А (100 мкг/кг, фиг. С, 300 мкг/кг, фиг. Е, черные стрелки). На фиг. Ό и Е показаны срезы, соответствующие срезам на фиг. С и Е с целью выявления фрагментации ДНК, которую определяли методом однонитевого концевого мечения дУТФ (4ИТР) (метод ΤυΝΕΕ), опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ТбТ). При двухнедельной обработке (9 введений) соединением А (100 мкг/кг, фиг. Ό, 300 мкг/кг, фиг. Е) наблюдается индуцирование массивного апоптоза в большинстве клеток эпителия и стромы. Следует отметить (черные стрелки), что апоптозу подвергаются все кластеринположительные клетки, а в значительной части клеток, не содержащих кластерина, также наблюдается фрагментация ядра.

На фиг. 7 показаны морфологические изменения при действии соединения А и финастерина на предстательную железу интактных взрослых крыс

Фиг. 7А, В, Ό, Ε, Е и Н - характерные изображения получены с использованием поперечных срезов цельных предстательных желез, иммуноокрашенных моноклональными антителами к крысиному кластерину и вторично окрашенных гематоксилином. На фиг. 7А (10х) первичные антитела отсутствуют. На фиг. 7В (10х) показано, что у необработанных взрослых крыс только немногие, отдельные эпителиальные клетки в некоторых железах содержат метку (черные стрелки). Напротив, в предстательных железах крыс, обработанных возрастающими концентрациями соединения А, кубоидные эпителиальные клетки, имеющие признаки атрофии, содержат кластерин, который проявляется дозозависимым образом (см. черные стрелки, 10 мкг/кг, фиг. 7Ό; 30 мкг/кг, фиг. 7Е; 100 мкг/кг, фиг. 7Е, 10х). Аналогичные результаты были получены с использованием финастерида (40 мг/кг, фиг. 7Н, 10х).

На фиг. 7С, С и I показаны серийные срезы, соответствующие срезам на фиг. 7В, Ό и Е, соответственно, с целью выявления фрагментации ДНК, которую определяли методом однонитевого концевого мечения дУТФ (άυΤΡ) (метод ΤυΝΕΕ), опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ТбТ). Следует отметить (черные стрелки), что апоптозу подвергаются все кластерин-положительные клетки, и даже в значительной части клеток, не содержащих кластерина, также обнаруживается фрагментация ядра.

На фиг. 8 показаны результаты испытания на хроническую токсичность у собак. Явное снижение массы предстательной железы наблюдается через 9 месяцев лечения соединением А по сравнению в животными, получавшими плацебо.

На фиг. 9 показаны результаты испытания на хроническую токсичность у собак. Снижение массы предстательной железы после выздоровления при лечении соединением А по сравнению в животными, получавшими плацебо.

На фиг. 10 показано действие соединения А на рост клеток мочевого пузыря, стимулированный тестостероном, мч = мочевой пузырь человека.

На фиг. 11 показано действие соединения А при сравнении с другими соединениями на рост стимулированных и базальных клеток мочевого пузыря. Т 10 нМ = тестостерон, Е 1 нМ = финастерид.

На фиг. 12 показано действие витамина Ό на массу мочевого пузыря.

На фиг. 13 показано действие витамина Ό на частоту непроизвольного сокращения незаполненного (мочевого пузыря).

На фиг. 14 показано действие витамина Ό на амплитуду непроизвольного сокращения незаполненного (мочевого пузыря).

На фиг. 15 показано действие витамина Ό на давление при мочеиспускании.

На фиг. 16 показано действие витамина Ό на остаточную мочу.

На фиг. 17 показано действие витамина Ό на частоту сократительного ответа полосок мочевого пузыря при стимуляции электрическим полем.

Примеры

Пример 1. Действие соединения А на клетки ВРН ίη νίΐτο.

Материалы и методы

Материалы

Минимальная незаменимая среда (МЕМ), ΌΜΕΜ-Ρ12, 1:1, смесь, среда Хэма Е12, физиологический раствор с фосфатным буфером (РВ8), бычий сывороточный альбумин (БСА), фракция V, глутамин, генетицин, коллагеназа типа IV, витамин Ό₃, тестостерон (Т), дигидротестостерон (ИНТ), ацетат ципротерона, восстановленная форма в-никотинамидадениндинуклеотид-3'-фосфата (НАДФ), дитиотреит (ДТТ), фенилметилсульфонифторид (РМ8Е) и набор для измерения кальцемии получены на фирме 81дта (81Ьош8, МО). Набор для определения белка получен на фирме Βίο-Каб ЬаЬогаФпек, 1пс. (Негси1е§, СА). Фетальная телячья сыворотка (ЕВ8) получена на фирме υηίραΐΐι (ВеЛогб, иК). Моноклональные антитела анти-кластерин крысы (моноклональный мышиный 1дС), специфичные к бета-цепи, получены на

- 7 010240 фирме υΡδΤΆΤΕ Вю1есйпо1оду (Ьаке ΡΙαοίά. ΝΥ). Набор Арор Тад Κ11 для концевого мечения ίη κίΐη (метод 18ЕЬ) получен на фирме Опсог (МО. США). Клетки СНО 1827 и СНО 1829 получены на фирме 8егопо 1п1егпайопа1 (Женева. Швейцария). 1пк1аде1 р1ик получен на фирме Раскагб (81. Бошк. МО). Финастерид (очищенный препарат) (17в-(№трет-бутил)карбамоил-4-аза-5а-андрост-1-ен-3-он) любезно предоставлен фирмой Мегск 8йагр & Пойте йпЬогаЮпек (Райнау. Νυ). Бикалутамид любезно предоставлен фирмой Ак1та2епеса (Ак1га2епеса. Милан. Италия). Аналог 1а-фтор-25-гидрокси-16.23Е-диен-26.27бисгомо-20-эпихолекальциферола (соединения А) получен на фирме Вюхе11 (Вюхе11. Милан. Италия). Фактор роста кератиноцитов (ΚΟΕ) получен на фирме Рерго Тесй ЕС (Лондон. Англия). а инсулинподобный фактор роста-1 человека |Оек(1-3)ЮН-1| получен на фирме ОгоРер Ытйеб (Аделаида. Австралия). Набор ΡΟΌ для определения гибели клеток ш κίΐη методом однонитевого концевого мечения άυΤΡ (метод ΤυΝΕΕ). опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ΤάΤ). получали на фирме Росйе П1адпокйс8 Согрогайоп (1пЙ1апароЙ8. ΙΝ). Пластиковая посуда для клеточных культур получена на фирме Еа1соп (Охпагй. СА). Одноразовые фильтрующие модули для получения питательной среды получены из ΡΒΙ 1п1егпа1юпа1 (Милан. Италия). Липофектамин 2000 и среда Орй-Мет I для трансфекции люциферазы получены на фирме 1пуйгодеп. Ы1е Τесйηо1од^е8 (8ап ОшНапо Мйапеке. Милан. Италия). Пластинки для тонкослойной хроматографии (ТСХ) получены на фирме Мегск (ПагшкПй. Германия). Энантат тестостерона (энантат Т) получен на фирме Оеутопа1 (Ападш. Италия). Набор Соа1-АСоип1 для определения общего тестостерона получали на фирме МеФса1 8ук1ет (Оепоуа 81гирра. Италия). Систему для [¹²⁵Ι] анализа лютеинизирующего гормона крысы (гЬН) получали на фирме Атегкйат Ρйа^тас^а Вю1есй (Ρ^8са1а^ау. N1).

Клетки ВРН

Клетки ВРН человека получали. культивировали и использовали. как описано ранее в статье Сгексюй С. и др.. 1оигпа1 о! С’1пйса1 апй Епйосппо1оду Ме1аЬо11кт. 85. 2576-2583 (2000). Клетки получали из тканей предстательной железы. взятых у пяти пациентов. которые подвергались надлобковой аденомэктомии ВРН (операции по удалению аденомы предстательной железы). после обсуждения и утверждения в местном комитете по этике. Пациенты не получали какого-либо фармакологического лечения в течение трех месяцев перед проведением хирургической операции.

Клетки линии СНО-1827 и СНО-1829. трансфектированные 5а-редуктазой

Клетки СНО-1827 и СНО-1829. трансфектированные 5а-редуктазой типа 1 (5аР-1) или типа 2 (5аР-2). соответственно. (см. 81еегк ^.. Его1оду. 58. 17-24 (2001)) культивировали в среде Хема Г12. содержащей 5% ГС8.

Клетки линии РС3. трансфектированные АР

Клетки РС3 аденокарциномы предстательной железы человека. устойчиво трансфектированные плазмидой р5НЬйАР-А. содержащей андрогенный рецептор человека (йАР). как описано ранее (см. Вопассогк1 Ь. и др.. Епйосгшо1оду. 141. 3172-3182 (2000)). культивировали во флаконах площадью 75 см² на среде Хема Г-12. содержащей 50 мкг/мл генетицина. 10% ГС8. пенициллин (100 ед./мл) и стрептомицин (100 мг/мл).

Ткани ВРН

Ткани предстательной железы для анализа связывания получали от пациентов. которые подвергались надлобковой аденомэктомии ВРН (операции по удалению аденомы предстательной железы). Пациенты не получали какого-либо фармакологического лечения в течение трех месяцев перед проведением хирургической операции. После хирургической операции ткани немедленно погружали в жидкий азот и хранили при -80°С до проведения анализа.

Ткани крысы

Вентральные предстательные железы крыс быстро вырезали. взвешивали и быстро замораживали в сухом льду. Иммуногистохимические эксперименты проводили на смежных криостатических срезах толщиной 14 мкм с целью прямого сравнения морфологии ткани. экспрессии кластерина и локализации апоптоза методом ΤυΝΕΕ. Для экстрации общей ДНК и вестерн-блоттинга (гибридизации белка с меченым зондом) использовали вентральные предстательные железы. полученные из 4-6 животных.

Анализ пролиферации клеток ВРН

Для анализа клеточной пролиферации 4х 10⁴ клеток ВРН высевали в 12-луночные планшеты в соответствующей питательной среде. выдерживали в среде. не содержащей красного красителя и сыворотки и содержащей 0.1% БСА. в течение 24 ч. а затем обрабатывали стимулирующим агентом в течение 48 ч. Клетки в среде. не содержащей фенолового красного и сыворотки и содержащей 0.1% БСА. использовали в качестве контроля. Затем клетки трипсинизировали и каждую экспериментальную точку получали после измерения на гемоцитометре. вычисляя среднее значение по данным. полученным по меньшей мере в шести различных участках каждой лунки. как описано ранее (см. Сгексюй С. и др.. 1оигпа1 о! С11шса1 апй Епйосппо1оду Ме1аЬо11кт. 85. 2576-2583 (2000). Эксперименты проводили с использованием возрастающих концентраций (от 10^-18 до 10^-7 М) кальцитриола или соединения А в присутствии или в отсутствие фиксированной концентрации Т (10 нМ). ΚΟΕ или Пе8(1-3)1ОГ-1 (10 нг/мл). Анализ клеточного роста проводили также с использованием фиксированной концентрации андрогенов (10 нМ) в при

- 8 010240 сутствии или в отсутствие соединения А (1 нМ, 10 нМ) или анти-андрогенов финастерида (Г, 1 нМ) и ацетата ципротерона (Сур, 100 нМ). Анализ клеточного роста проводили также с использованием фиксированной концентрации Т (10 нМ) или СЕ (10 нг/мл) в присутствии или в отсутствие соединения А (10 нМ). В этом эксперименте каждую экспериментальную точку определяли по данным трех различных экспериментов при трехкратном или четырехкратном повторе. Результаты представлены в процентах отклонения (среднее±8ЕМ) по сравнению с максимальным стимулированием Т или СЕ.

Концевое мечение ίη кйи (метод 18ЕЬ)

Метод 18ЕЬ проводили на клетках ВРН с использованием набора реагентов Арор Тад, включающего пероксидазу, для определения апоптоза ίη δίΐιι. по методике производителя. Клетки инкубировали в присутствии Т (10 нМ), КСЕ (10 нг/мл) или Ос8(1-3)!СЕ-1 (10 нг/мл) в присутствии или в отсутствие соединения А (10 нМ). Процент апоптозных клеток (число окрашенных клеток, деленное на общее число клеток) рассчитывали по меньшей мере в пяти участках каждого среза при анализе пяти различных срезов. Результаты представлялили как среднее±8ЕМ по результатам трех различных экспериментов.

Анализ ингибирования 5а-редуктазы

Анализ ингибирования 5а-редуктазы проводили на клетках СНО-1827, трансфектированных 5аВ-1, или на клетках СНО-1829, трансфектированных 5аВ-2, как описано ранее (см. Сиагпа А. и др., 1оита1 οί Меб1сша1 Сйет1к1гу, 43, 3718-3735 (2000)). Соединение А добавляли в концентрации от 10^-9 до 10^-5 М, в качестве контрольного ингибитора в каждом эксперименте использовали финастерид.

Анализ связывания

Анализ связывания цитозольными фракциями фрагментов ВРН проводили, как описано ранее (см. Сгексюй С. и др., Епйосйпо1оду, 144, 3046-3057 (2003), (при конечной концентрации белка 1,8 мг/мл). Фракции цитозоля инкубировали в присутствии возрастающей концентрации (0,125, 0,25, 0,5, 1 нМ) [³Н]-В1881 (удельная активность 83,5 Ки/ммоль) в отсутствии или в присутствии [³Н]-В1881 (1 нМ), возрастающих концентраций немеченого В1881 (10^-1 -10^-6 М), ИНТ (10^-10-10^-6 М), Т (10^-10-10^-6 М), бикалутамида (10^-10-10^-4 М) и соединения А (10^-10-10^-4М). Для предотвращения связывания В1881 с рецептором прогестерона в каждую пробирку добавляли 1мкМ ацетонида триамцинолона. Разделение связанного и несвязанного лиганда проводили, как описано ранее (см. Сгексюй С. и др., Епйосгшо1оду, 144, 3046-3057 (2003)). Содержание белка определяли по методу Бредфорда с использованием БСА в качестве стандарта.

Анализ активности люциферазы

Клетки РС3, устойчиво трансфектированные АВ человека, помещали в 24-луночные планшеты при плотности 2х10⁴ в среде Хема Е12, содержащей 10% ЕС8. Через 24 ч клетки транфектировали (в количестве по 750 нг в лунку) плазмидой рЬ8РР, содержащей последовательность дикого типа ММТУ-ЬТВ, связанную с геном люциферазы светляка (см. РаххадН М. и др., Апа1уйса1 Вюсйет1кйу, 204, 315-323 (1992)) при использовании липофектамина 2000 (1 мг/мл) по методике производителя. Через 48 ч клетки инкубировали в присутствии ΌΗΤ (10^-12-10^-6 М) или бикалутамида (10^-9-10^-5 М) в присутствии 3 нМ ΌΗΤ и эквимолярной концентрации соединения А в течение 18 ч. Стероиды и аналог соединения А растворяли в этаноле. Трансфектированные клетки, инкубированные в присутствии этанола, использовали только в качестве положительного контроля.

Анализ активности люциферазы проводили на люминометре Бертольда по методике производителя (Ьисйегаке Аккау 8ук1ет, фирма Рготеда, Милан, Италия). Клетки лизировали непосредственно в планшете добавлением 200 мкл буферного раствора для лизиса. Активность люциферазы определяли в 20 мкл клеточного лизата через 10 с после добавления 100 мкл люциферина. Общий белок определяли в 20 мкл клеточного лизата. Проводили по меньшей мере три независимых анализа при двойном повторе.

Результаты

При инкубации клеток ВРН в присутствии возрастающих концентраций кальцитриола или соединения А наблюдается ингибирование роста клеток (фиг. 1А). Оба соединения ингибируют дозозависимым образом клеточную пролиферацию. Анализ по программе АТЬЕ1Т (см. Эе Ьеап А. и др., Атепсап 1оита1 οί РПук1о1оду, 235, Е97-Е102 (1978)) показал, что несмотря на незначительное статистическое различие величин максимального ингибирования роста клеток кальцитриолом и соединением А (соед. А на фигурах) (I _макс = 43±1%), эти соединения отличаются по относительной активности, т.е. у соединения А относительная активность на несколько единиц логарифма выше по сравнению с кальцитриолом (соединение А: -1од 1С₅₀ =15,8+0,3; кальцитриол: -1од 1С₅₀ =10,2±0,6, Р<0,005).

Пролиферация клеток ВРН существенно увеличивается (р <0,01) в присутствии тестостерона (Т) (156±8%) и ростовых факторов (СЕ), таких как (Иек(1-3)1СЕ-1 (194±6%) или КСЕ (183±5%). При стимулировании клеточного роста в присутствии Т или СЕ в течение 48 ч (фиг. 1В) ингибирующее действие соединения А становится более выраженным (I _макс = 66,6±7,3%). Математический анализ (см. Эе Ьеап А. и др., Атепсап 1оита1 οί Рйукю1оду, 235, Е97-Е102 (1978)) графиков ингибирования показывает, что соединение А более эффективно в отношении клеток ВРН, стимулированных Т (-1од 1С₅₀к=16,4±0,6), чем двумя другими ростовыми факторами (-1од 1С₅₀к-12,7±0,6 в случае Иек(1-3)1СЕ-1 и -1од 1С₅₀к=14,2±0,6 в случае КСЕ, соответственно, Р<0,0001).

- 9 010240

Соединение А (1 нМ) проявляет антагонистическое действие не только в отношении пролиферации клеток ВРН, стимулированных Т и ΌΤΗ, но и в некоторой степени в отношении клеток, стимулированных ацетатом ципротерона (Сур, 100 нМ, фиг. 2А и 2В), который является антагонистом АК. Напротив, ингибитор 5а-редуктазы финастерид (Е, 1 нМ) проявляет антагонистическое действие только в отношении клеточного роста, индуцированного Т (фиг. 2А). Кроме того, соединение А снижает рост даже тех клеток, которые не были стимулированы анти-андрогеном (фиг. 2А).

Для оценки потенциальных антиандрогенных свойств соединения А в дополнение к ингибированию роста клеток ВРН, нами исследовалось его связывание с рецептором АК. Во-первых, мы исключили возможность связывания соединения А с АК благодаря исследованию конкурентного связывания в гомогенатах ВРН человека с использованием в качестве меченого лиганда синтетического андрогена [³Η]К1881. Анализ данных по программе ΕΙΟΑΝΏ (см. Мипкоп Р.1. и др., Апа1уйса1 ВюсйешщНу, 107, 220239 (1980)) показал, что немеченый К1881, ΌΗΤ, Т и антагонист АК бикалутамид полностью подавляют связывание [³Н]-К1881 (табл. I). И, наоборот, соединение А не конкурирует за связывание (рецептора АК) с [³Н]-К1881 при любой исследуемой концентрации (табл. I). Эти результаты были подтверждены и дополнены при анализе репортерного гена люциферазы. В клетках РС3, экспрессирующих полный ген АК, связанный с репортеным геном люциферазы, ΌΗΤ стимулировал дозозависимое увеличение люциферазной активности (ЕС₅₀ =2±1,3 нМ, фиг. 3А), в то время как бикалутамид ингибировал активность, стимулированную ΌΗΤ (1С₅₀ =194±80 нМ, фиг. 3В). В этой системе увеличение концентрации соединения А не стимулирует и не ингибирует увеличение люциферазной активности, опосредованное АК (фиг. 3). Наконец, с целью выявить взаимосвязь между соединением А и биосинтезом ΌΗΤ, активного метаболита Т, были проведены эксперименты с использованием клеток СНО, трансфектированных 5а-редуктазами типа 1-й типа 2. Результаты сравнивали с данными, полученными при действии финастерида (Е). В то время как Е ингибирует конверсию Т в ΌΗΤ с ожидаемыми величинами 1С₅₀ (для 5а-редуктазы типа 1 1С₅₀ =659±100 нМ, для 5а-редуктазы типа 2 1С₅₀ =53,7±11 нМ, п=3), соединение А не конкурирует ни с одним из изоферментов вплоть до микромолярного уровня (данные не приводятся).

Лиганд АК	Константы сродства (Ка нмоль/л)
К1818	0,16±0,06
ОНТ	0,07+0,03
Т	1,89±0,94
Бикалутамид	159±82
Соединение А	>100000

Таблица I. Константы сродства агонистов андрогена (К1881, ΌΗΤ, Τ), антагониста (бикатуамида) и соединения А в гомогенатах ВРН человека по данным конкурентного связывания с радиоактивным меченым лигандом [³Н]-К1881.

По данным метода 18ЕЬ (п=3, табл. II), соединение А подавляет клетки ВРН, по меньшей мере частично, благодаря активации программированной гибели клеток. Процентное содержание апоптотических ядер существенно возрастает (270%) после инкубации в присутствии соединения А (10 нМ) в течение 48 ч (Р<0,01 по сравнению с контролем). Напротив, при обработке клеток Т (10 нМ) или факторами роста (ОЕ, 10 нг/мл) значительно (Р<0,01) снижается число апоптотических клеток ВРН по сравнению с необработанными клетками (^е8(1-3)IОЕ-I = -42%, КОЕ = -54%, Т = -27%). Однако даже в присутствии ОЕ или Т соединение А вызывает достоверный (более 250%) и значительный (Р<0,01) рост числа КЕЬположительных клеток ВРН. Апоптотический индекс (%)

	Контроль	Соединение А
Контроль	18,55±О,8	68,44±1,26а
ϋβ3(1-3)ΙΟΡ-Ι	10,69±0,6а	45,85±0,66а’б’в
КОР	8,5±0,42а	44,46±0,57а'б,в
Т	13,56±0,72а	49,0611,87^’“

Таблица II. Действие соединения А (10 нМ), ростовых факторов (ОЕ, 10 нг/мл), или Т (10 нМ) на фрагментацию ДНК в клетках ВРН. Апоптотический индекс (%) означает количество окрашенных ядер по данным ^ЕЬ в клетках ВРН в каждом из по меньшей мере пяти отдельных участков на срезе. Результаты представлены в виде среднего±8ЕМ в трех раздельных экспериментах. Соединение А способно вызывать апоптоз в необработанных клетках ВРН, а также в клетках ВРН, одновременно инкубированных в присутствии ростовых факторов (ОЕ) или Т (а: Р<0,01 по сравнению с контролем, б: Р<0,01 по сравнению с клетками, обработанными соединением А, в: Р<0,01 по сравнению с клетками, обработанными ОЕ или Т).

Пример 2. Антипролиферативные свойства соединения А на моделях роста предстательной железы ίη νίνο.

Методики испытаний на животных

Самцов крыс 8ргадие ЭаМеу (возрастом 28 сут) приобретали в Сйаг1е8 ККег ЬаЬога1опе8 (Са1со,

- 10 010240

Ьессо, Италия). Все описанные испытания на животных проводилсь в соответствии с принятыми стандартами по обращению с животными. Кастрацию проводили через мошонку при анестезии кетамином/ксилазином. Через трое суток после кастрации крыс (5-8 животных в группе) обрабатывали или не обрабатывали энантатом Т (30 мг/кг) двумя отдельными подкожными инъекциями один раз в неделю. В течение 5 дней первой недели и 4 дней второй недели крысам перорально вводили носитель (миглиол 812), соединение А (10, 30, 100 и 300 мг/кг) или финастерид (10 и 40 мг/кг), всего 9 ввведений, и через 1 сутки животных забивали.

В другом варианте интактным взрослым самцам Зртадие Эа\\'1еу (массой 250 г) вводили перорально носитель (миглиол 812), соединение А (10, 30, 100 и 300 мг/кг) или финастерид (10 и 40 мг/кг) по схеме 5 дней в неделю в течение 5 последовательных недель и двух дополнительных дней в течение шестой недели, всего 27 ввведений, если не указано иное. После завершения каждого эксперимента у животных отбирали кровь для анализа на содержание кальция и гормонов.

Анализ методом нозерн-гибридизации

Общую РНК экстрагировали с использованием набора РИАРак! фирмы Мо1еси1аг §у81еш (8ап О1едо,СА). Блотинг, введение метки, условия гибридизации и зонды (полноразмерной кДНК кластерина длиной 1,5 Ко и полноразмерной кДНК ΟΑΡΌΗ длиной 1,2 Ко) получали по описанным методикам (Ве!ΐπζζί и др., Вюсйешюа1 1оита1, 257, 293-296 (1989) и МапиеШ и др., ВюсйешШту апб Се11 Вю1оду, 72, 515-521 (1994)). Считывание авторадиограмм проводили денситометрическим сканированием на денситометре ЬКВ ИИтаксап ХЬ.

Иммуногистохимия

Все криостатированные срезы, полученные из контрольных или обработанных крыс, обрабатывали параллельно, как описано ранее (АЧапсоНе и др., 1оитпа1 о! Епбоспшпо1оду, 167, 197-204 (2000)). В каждом эксперименте анализировали три альтернативных среза предстательных желез трех разных крыс. В отрицательных контролях, полученных при отсутствии в реакционной среде специфических антител, не наблюдалось специфического окрашивания. Вторичное окрашивание проводили гематоксилином, покровные стекла обрабатывали набором Еикй! (фирма О.Кшб1ет ОшЬН&Со, Германия). Цифровые цветные снимки с большим увеличением снимали ПЗС-камерой через микроскоп.

Анализ фрагментации ДНК ίη Ши (метод ТиИЕБ)

Фрагментацию ДНК в криостатировнных срезах предстательной железы, выявленную методом однонитевого концевого мечения дУТФ (бИТР) (ΤϋΝΕΕ), опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ТбТ), проводили с использованием набора для детектирования гибели клеток ίη кйи (фирма ΡΟΌ, ВосНе) по рекомендациям производителя. Положительные по методу ТиИЕЬ апоптотические ядра регистрировали в виде цифровых цветных снимков с большим увеличением при съемке ПЗСкамерой через микроскоп.

Вторичное окрашивание проводили эозином, покровные стекла обрабатывали набором ЕикШ (фирма О.К1пб1ег ОшЬН&Со, Германия).

Определение кальция

Уровень кальция определяли с использованием коммерческого набора для колориметрического анализа (фирма ЗЦша) по методике производителя.

Определение тестостерона и тЬН

Уровни гормонов Т и тЬН определяли с использованием коммерческих наборов для радиоиммуноанализа по методикам производителя. Для измерения уровня Т в сыворотке (крови) образцы сначала добавляли к 4 объемам диэтилового эфира, перемешивали при аккуратном перевертывании пробирки в течение 15 мин и затем центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 мин. Водную фазу замораживали сухим льдом, органическую фазу отделяли и упаривали досуха в атмосфере азота. Высушенный остаток переносили в буферный раствор для анализа (1 об./1 об., пробы, взятые у интактных крыс; 4 об./1 об., пробы, взятые у кастрировнных крыс).

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ΑΝΟνΑ и в соответствующих случаях парных или непарных критериев Стьюдента. Данные по связыванию (с рецептором) анализировали с использованием программы ЬЮАИО (Мипкоп и др., Апа1убса1 ВюсйешШту, 107, 139-220 (1980)).

Компьютерную программу АБЬНТ (Эе Ьеап А. и др., Ашепсап 1оитпа1 о! Рйу8ю1оду, 235, Е97-Е102 (1978)) использовали для анализа сигмоидных кривых зависимости доза-ответ для оценки значений ингибирования на уровне половины от максимального значения (1С₅₀) и величин стимулирования на уровне половины от максимального значения (ЕС₅₀), а также максимального ингибирующего (I _макс) и стимулирующего (Е_макс) действия. Данные представляли в виде среднее±8ЕМ.

Результаты

Для анализа антипролиферативных свойств соединения А на моделях роста предстательной железы ш у1уо кастрированных и интактных крыс обрабатывали возрастающими концентрациями соединения А (10-300 мкг/кг) или финастерида (10, 40 мг/кг). Как показано на фиг. 4А, кастрация существенно снижает массу вентральной предстательной железы, в то время как двухнедельная обработка энантатом тестосте- 11 010240 рона (Т) (30 мг/кг) не только полностью восстанавливает, но даже стимулирует ее рост. Соединение А в любых испытанных дозах полностью подавляет Т-стимулированное разрастание (гипертрофию) предстательной железы, снижая массу вентральной предстательной железы до более низкого уровня, чем у необработанных крыс. Аналогичные результаты получены при использовании финастерида (10, 40 мг/кг). При обработке интактных взрослых крыс соединением А в течение одного месяца наблюдается значительное снижение массы вентральной предстательной железы, причем максимальное снижение (30%) наблюдается при наиболее высокой из использованных доз (300 мкг/мг). При этой дозе ингибирующее действие соединения А на рост предстательной железы сопоставимо с действием финастерида в дозе 10 или 40 мг/кг (фиг. 4В). Во всех экспериментах при пероральном введении различных доз соединения А очень низкая гиперкальцемия наблюдалась только при введении наиболее высокой дозы (300 мкг/мг) (табл. III). При этом не наблюдалось других заметных побочных действий.

	Кальцемия
Контроль	10,2±0,16
Соединение А 10 мкг/кг	10,16±0,24
Соединение А 30 мкг/кг	9,87±0,15
Соединение А 100 мкг/кг	10,55±0,18
Соединение А 300 мкг/кг	1О,85±О,1

Таблица III. Кальцемия (мг/дл) у кастрированных крыс с заместительной терапией тестостероном после введения различных доз (10, 30, 100, 300 мкг/кг) соединения А. Соединение А ни в одном из случаев не изменяет уровень калия в плазме (крови) у кастрированных крыс с заместительной терапией энантатом тестостерона (30 мг/кг/неделя) по сравнению с контролем. Аналогичные результаты получены на интактных крысах (данные не приводятся). Результаты представлены в виде среднего значения±ЗЕМ, полученного для крыс в данной группе.

С целью получить более полное представление о молекулярных механизмах процесса снижения массы предстательной железы, индуцированного соединением А, исследовали экспрессию гена кластерина и биосинтез белка, а также проводили анализ морфологических признаков апоптоза с использованием однонитевого концевого мечения дУТФ (ДЙТР), опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ТбТ) (метод ТОНЕЙ). Кластерин представляет собой убиквитарный (повсеместно присутствующий) продукт гена, принимающий самое непосредственное участие в остановке клеточного цикла и атрофии, экспрессия которого подавляется андрогенами. На фиг. 5А показана экспрессия мРНК кластерина в предстательной железе (по результатам нозерн-анализа) у орхиэктомированных крыс, получавших или не получавших Т. Кастрация существенно повышает относительное содержание мРНК кластерина, в то время как обратное действие вызывается при двухнедельном введении Т. Стимулирующее введение различных концентраций соединения А (300 и 100 мкг/кг) или Е (40 мг/кг) частично подавляет снижение экспресии гена кластерина, индуцированное ведением Т. У интактных крыс (фиг. 5В) введение различных концентраций соединения А (30 и 100 мкг/кг) в течение месяца индуцирует устойчивое повышение экспрессии гена кластерина в предстательной железе, которое сопоставимо или даже превышает рост экспрессии, индуцируемый при введении 40 мг/кг Е.

Местная экспрессия кластерина в предстательной железе орхиэктомированных крыс показана на фиг. 6. Кастрация вызывает заметную и широко развитую атрофию в предстательной железе и почти все кубоидные эпителиальные клетки, выстилающие просвет железы, дают положительную реакцию на кластерин (фиг. 6А). Т-заместительная терапия (фиг. 6В) обращает морфологические признаки атрофии и достоверно снижает количество окрашенного кластерина. Указанное воздействие исключается при одновременном введении соединения А (фиг. 6С и Е). На фиг. 6Ό и Е показаны результаты анализа методом ΤϋΝΕΕ срезов, соседних с теми, которые показаны на фиг. 6С и Е. При обработке соединением А (100 мкг/кг, фиг. 6Ό, и 300 мкг/кг, фиг. 6Е) наблюдается явная фрагментация ядер в клетках эпителия и стромы, а апоптоз можно обнаружить в кластерин-положительных и кластерин-отрицательных клетках. На фиг. 7А и В (два первых среза) показана морфология предстательной железы интактных крыс при окраске на присутствие кластерина в отсутствии (фиг. 7А) или в присутствии (фиг. 7В) первичных антител. Следует отметить, что в предстательной железе необработанных взрослых крыс практически отсутствует кластериновая метка (фиг. 7В), а также не наблюдается признаков фрагментации ядра (метод ТОНЕЙ, фиг. 7С). Напротив, обработка различными дозами соединения А вызывает экспрессию кластерина (фиг. 7Ό-Ε) и апоптоз (фиг. 7С, С и I). На фиг. 7Е для сравнения показано действие финастерида (40 мг/кг) на наличие кластерин-положительной окраски в срезах предстательной железы.

С целью исключить возможность снижения роста предстательной железы ίη νίνο соединением А за счет воздействия на функцию гипофиза или семенников у кастрированных и интактных крыс измеряли уровень лютеинизирующего гормона (тйН) и Т в сыворотке (крови). Как и следовало ожидать (табл. ГУА), кастрация существенно снижает уровень Т и в то же время повышает уровень тйН в сыворотке (крови). Введение энантата Т (30 мг/кг) в течение двух недель полностью обращает действие орхиэктомии. При пероральном введении соединения А (100 и 300 мкг/кг) кастрированным крысам, прошедшим курс заместительной Т-терапии, наблюдается незначительное влияние на уровни тйН и Т в сыворотке (крови). Аналогичные результаты были получены у интактных крыс (табл. IVΒ). Действительно, при

- 12 010240 длительном введении (в течение 1 месяца) соединения А (10, 30, 100 мкг/кг) или Р (40 мг/кг) у интактных крыс не наблюдается изменения уровня тЬН и Т в сыворотке (крови).

Таблица ΤΥΑ

	КЫ1	Т
Контроль (интактные крысы)	2,36+0,46	11,5+2,44
Кастрированные крысы	20,64±б’	0,9±0,32*
Кастрированные крысы + Т-терапия	2,08±0,36	21,25±4,12
Кастрированные крысы + Т-терапия + соединение А, 100 мкг/кг	1,8+0,2	11,13±1,02
Кастрированные крысы + Т-терапия + соединение А, 300 мкг/кг	3,15±0,65	15,73±2,75

Таблица ТУБ

	ИБН	т
Контроль (интактные крысы)	2±0,16	11,98+2,87
Финастерид	2,2+4	18,11±3,23
Соединение А, 10 мкг/кг	2,22±0,25	19,13±3,83
Соединение А, 30 мкг/кг	2,32±0,36	9,39±2
Соединение А, 100 мкг/кг	1,96±0,13	11+2,14

Таблица IV. Содержание тЬН (нг/мл) и Т (нМ) в сыворотке (крови) кастрированных крыс при Тзаместительной терапии (табл. 1УА) или у интактных крыс (табл. 1УБ) после терапии различными дозами соединения А.

1УА. Кастрация существенно снижает уровень Т в сыворотке (крови) ( Р<0,01 по сравнению с контролем) и одновременно увеличивает уровень тЬН ( Р<0,05 по сравнению с контролем). После введения энантата Т (30 мг/кг/неделя) уровни тЬН и Т восстанавливаются. Соединение А при всех испытанных дозах оказывает незначительное влияние на уровни тЬН и Т.

1УБ. Длительное введение (в течение 1 месяца) Р (40 мг/кг) или соединения А (10, 30, 100 мкг/кг) не приводит к изменению уровней гЬН и Т в сыворотке (крови) у интактных крыс.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что соединение А снижает размеры предстательной железы у интактных крыс в большей степени по сравнению с финастеридом. Кроме того, аналогично финастериду соединение А отменяет пролиферативную активность тестостерона ίη νίΐτο и ίη νίνο. Однако в отличие от финастерида соединение А не ингибирует активность 5а-редуктазы типа 1 или типа 2 и может предотвращать рост клеток ВРН, индуцированный не только Т, но и ОНТ. Эти анти-андрогенные свойства соединения А не зависят от взаимодействия с ΑΒ поскольку установлено, что соедидение А не связываетя с ΑΒ, а воздействует на клетки РС3, трансфектированные ΑΒ, в качестве агониста или антагониста ΑΒ. Кроме того, соединение А не оказывает влияния на секрецию полового гормона, поскольку при испытаниях на крысах уровни гонадотропина и Т в плазме (крови) не изменяются при ежедневном введении соединения А в течение до одного месяца. Следовательно, соединение А подавляет взаимодействие рецептора ΑΒ с лигандом. Не вдаваясь в теоретические аспекты, можно предположить, что такое действие осуществляется благодаря прерыванию передачи сигнала от тестостерона к ростовому фактору.

В очень низких концентрациях соединение А способно полностью подавлять (оказывать антагонистическое действие) не только Т-стимулированную пролиферацию клеток ВРН, но и пролиферацию, индуцированную двумя наиболее важными внутрипростатическими ростовыми факторами, ЮР-1 и КСР. Кроме того, даже в присутствии Т или СР соединение А индуцирует апоптоз в клетках ВРН. Запрограммированная гибель клеток, индуцированная соединением А, наблюдается также в предстательной железе как интактных, так и Т-обработанных орхиэктомированных крыс, и характеризуется диффузной картиной фрагментации ДНК с сопутствующим увеличением экспрессии гена кластерина и белка. Кластерин является белком, который в предстательной железе строго регулируется андрогенами (ΒοΙΙιιζζί и др., Βίοοΐιοιηίοαΐ .Тоита1, 257, 293-296 (1989)). Хотя функция кластерина до конца не установлена, уровень этого белка заметно увеличивается при атрофии предстательной железы (ΒοΙΙιιζζί и др., Опсодепе, 21, 43284334 (2002) и Βеΐΐиζζ^ и др., .Тоита1 οί Епбосппо1оду, 132, 361-367 (1992)) и апоптозе ^5&ον и др., Лоигпа1 οί Вю1одка1 СНетМгу. 278, 11590-11600 (2003)). Таким образом, индукция кластерина при терапии соединением А согласуется со способностью этого соединения ингибировать пролиферацию и индуцировать апоптоз в предстательной железе.

Таким образом, полученные результаты показывают, что соединение А является эффективным в отношении снижения роста клеток предстательной железы в различных экспериментальных моделях.

Пример 3. Снижение массы предстательной железы у здоровых собак, обработанных соединением А.

Испытания на токсичность проводили в течение 9 месяцев на четырех группах собак, самцов породы гончих, которым ежедневно вводили через желудочный зонд соединение А в дозах 0,5 мкг, 1,5 мкг и 5 мкг/кг массы тела/сут ( в носителе миглиол 812) или один носитель. После введения препарата у группы, получавшей максимальную дозу (5 мкг), следовал период реабилитации в течение двух месяцев, после чего измеряли массу предстательной железы. При завершении испытаний наряду с весьма благоприятными данными по токсичности после завершения курса приема соединения А (см. фиг. 8) и после реа

- 13 010240 билитации (см. фиг. 9) у животных наблюдалась более низкая масса предстательной железы. Результаты после реабилитации обрабатывали статистически с использованием однофакторного критерия Стьюдента и установили наличие существенной разницы в действии соединения А и носителя (Р<0,05). Эти результаты также демонстрируют способность соединения А снижать массу предстательной железы ίη νίνο.

Пример 4. Пероральная лекарственная форма в виде мягкой желатиновой капсулы.

Капсулы для перорального введения получали в атмосфере азота в желтом свете, при этом одну мягкую желатиновую капсулу заполняли смесью, содержащей от 0,01 до 25,0 мг соединения А в 150 мг фракционированного кокосового масла (например, миглиола 812), 0,015 мг бутилированного гидрокситолуола (ВНТ) и 0,015 мг бутилированного гидроксианизола (ВНА). Капсулы получали по следующей методике:

1) ВНТ и ВНА суспендировали в фракционированном кокосовом масле (например, миглиоле 812) и нагревали при перемешивании приблизительно при 50°С до полного растворения,

2) в полученном на стадии 1 растворе при 50°С растворяли соединение А,

3) раствор, полученный на стадии 2, охлаждали до комнатной температуры,

4) полученным на стадии 3 раствором заполняли мягкие желатиновые капсулы.

Все стадии проводили в атмосфере азота и без доступа дневного света.

Пример 4А. Пероральная лекарственная форма в виде мягкой желатиновой капсулы.

Капсулы для перорального введения получали в атмосфере азота в желтом свете, при этом одну мягкую желатиновую капсулу заполняли смесью, содержащей 150 мкг соединения А в 150 мг фракционированного кокосового масла (например, миглиола 812), 0,015 мг бутилированного гидрокситолуола (ВНТ) и 0,015 мг бутилированного гидроксианизола (ВНА).

Пример 4Б. Пероральная лекарственная форма в виде мягкой желатиновой капсулы.

Капсулы для перорального введения получали в атмосфере азота в желтом свете, при этом одну мягкую желатиновую капсулу заполняли смесью, содержащей 75 мкг соединения А в 150 мг фракционированного кокосового масла (например, миглиола 812), 0,015 мг бутилированного гидрокситолуола (ВНТ) и 0,015 мг бутилированного гидроксианизола (ВНА).

Пример 5. Снижение массы предстательной железы в организме человека при проведении клинических испытаний.

Определение действия соединения А (1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола) на пациентов с ВРН проводили методом двойного контроля при случайной выборке и методом параллельных групп при введении плацебо.

При отборе пациентов для проведения испытаний в качестве основного критерия использовали результаты диагностики взрослых пациентов на наличие ВРН и объем предстательной железы >40 мл по результатам трансректальной ультразвуковой диагностики (ТКИ8).

Статистические методы

Анализ первичной эффективности лечения планировалось провести на пациентах для протокольных исследований (РР), а для подтверждения полученных результатов аналогичные испытания предполагалось провести на волонтерах (1ТТ). Пациентов категории РР отбирали случайной выборкой, причем все пациенты соответствовали протокольным критериям, прошли полный курс обследования без нарушений основного протокола и имели достоверную оценку объема предстательной железы. Пациентов категории 1ТТ отбирали методом случайной выборки, причем все пациенты получали по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного средства, а объем предстательной железы у отобранных пациентов соответствовал базовой линии. Волонтеры проходили клинические испытания в течение 12 недель.

Все случайно выбранные пациенты, получившие по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного средства, прошли оценку на безопасность анализа.

Сравнение в группе проводили по базовой линии для всех пациентов описательным способом. Данные обрабатывали с использованием хи-квадрат критерия для категорийных переменных и дисперсионного анализа ΑΝΟνΑ для непрерывных переменных.

Описательную статистику рассчитывали обычными методами: средняя величина, стандартное отклонение, минимальные и максимальные значения непрерывных переменных и абсолютные значения и относительные частоты категорийных переменных. Описательную статистику использовали при оценке каждого введения и каждого посещения в неделю.

Учреждения, включающие менее 4 пациентов, объединяли.

За переменную величину первичной эффективности принимали изменение объема предстательной железы в процентах, который определяли методом централизованной ядерно-магнитной томографии (МК1) при аксиальном сканировании. Для анализа данных использовали метод ΑΝΟνΑ с учетом результатов лечения и учреждений, в которых зарегистрированы полученные результаты.

Пациенты получали капсулы, содержащие 150 мкг (см. пример 4 А, за исключением капсул, содержащих плацебо), один раз в сутки по утрам. Срок лечения составлял 12 недель. Количество пациентов, проходивших испытания, указано ниже.

- 14 010240

	Соединение А	Плацебо	Всего пациентов
Случайно выбранные пациенты	57	62	119
Реальное число пациентов	56 (98,3%)	60 (96,8%)	116 (97,5%)
Испытание прервано или утрачен контроль	0	2 (3,2%)	2(1,7%)
Неудовлетворительное терапевтическое действие	1 (1,8%)	0	1 (0,8%)

Изменение объема предстательной железы (%), определенное методом аксиального сканирования.

Процентное изменение объема предстательной железы у пациентов с соответствующей патологией (РР) составляло -1,89+5,2 в группе пациентов, получавших соединение А, и 4,99+5,99 у группы пациентов, получавших плацебо, с достоверным значением Р < 0,0001 в пользу соединения А. Разность между этими значениями (соединение А минус плацебо) составляет -7,24 с доверительным интервалом 95% от -9,54 до -4,94. Роль медучреждения также является существенной (р=0,0176). Аналогичный анализ испытаний на волонтерах подтверждает полученные результаты (р=0,0176), т.е. соединение А более эффективно снижает объем предстательной железы по сравнению с плацебо.

У пациентов с базовой линией объема предстательной железы >80 мл разница между группами пациентов, получавших лекарственное средство (р<0,0001), является более очевидной по сравнению с пациентами, у которых базовая линия объема предстательной железы составляет <60 мл (р=0,0320), прежде всего у пациентов категории РР.

У пациентов в возрасте 61-70 лет разница, всегда в пользу соединения А, была более очевидна по сравнению с пациентами более старшего возраста (>70 лет). Действительно, у волонтеров (ΙΤΤ) разница между группами у пациентов старше 70 лет составляет р=0,0540 по сравнению с р=0,0001 у других групп пациентов.

Пациенты, чувствительные к лекарственному средству

У категории РР процент чувствительных к соединению А пациентов составлял 27,5%, изменений не наблюдалось у 65% и только 7,5% пациентов оказались нечувствительными к лечению. В группе, получавших плацебо, число чувствительных к лечению пациентов равно нулю, фактически пациенты разделились поровну на группу, где изменений не наблюдалось, и группу нечувствтельных к лечению (50% в каждой группе). Сравнение процентных величин с использованием хи-квадрат критерия подтвердило результаты обследования, полученные в виде первичной эффективности переменного р<0,0001, что соединение А более эффективно снижает объем предстательной железы по сравнению с плацебо.

Результаты, полученные у категории ΙΤΤ, подтверждают, что процент пациентов, чувствительных к лечению в группе, получавших соединение А, составляет 28,8%, а разница по критерию хи-квадрат составляет р<0,0001.

У пациентов категории РР, чувствительных к лечению, среднее снижение объема предстательной железы по сравнению с базовой линией составляет -6,88±2,5, а среднее отклонение у пациентов без изменений составляет -0,35±2,3 в группе пациентов, получавших соединение А, по сравнению с 0,40±2,0 у группы пациентов, получавших плацебо. У пациентов, нечувствительных к лечению, среднее отклонение составляет 3,93±0,8 в группе пациентов, получавших соединение А, и 7,48±4,9 у группы пациентов, получавших плацебо, что подтверждает более высокую эффективность соединения А в отношении регулирования размеров и снижения объема предстательной железы.

Процентное изменение объема предстательной железы, определенное центрированным параксиальным и промежуточным сканированием

Контрольные анализы параксиального и промежуточного изображения подтвердили результаты, полученные при аксиальном сканировании. У контингета РР при получении параксиального изображения процент изменения составляет -1,30±6,9 в группе пациентов, получавших соединение А, по сравнению с 2,57±6,8 у группы пациентов, получавших плацебо, р=0,0172. При промежуточном сканировании процент изменения составляет -0,22±9,6 в группе пациентов, получавших соединение А, по сравнению с 6,18±10,9 у группы пациентов, получавших плацебо, р=0,0028. У волонтеров (ΙΤΤ), прошедших курс лечения, также наблюдалось существенное различие в снижении объема предстательной железы в пользу соединения А.

Общий уровень Р8А и гормона в сыворотке (крови)

У контингента РР среднее изменение содержания Р8А в группе пациентов, получавших соединение А, составляло 0,23±1,3, а у группы пациентов, получавших плацебо, 0,43±1,7. При этом между группами пациентов, прошедших курс лечения, не наблюдалось никакого существенного различия (р=0,2722).

У контингента РР также не наблюдалось существенной разницы между группами по содержанию тестостерона (р=0,2150). В группе пациентов, получавшей соединение А, среднее значение составляло 0,07±1,5, а у группы пациентов, получавших плацебо, 0,22±1,4.

У контингента РР между группами, прошедшими курс лечения, не наблюдалось разницы в содержании дигидротестостерона (р=0,7257 у контингента РР). В группе пациентов, получавшей соединение

- 15 010240

А, наблюдаемое среднее изменение составляло -30,77±227,71, а у группы пациентов, получавших плацебо -166,76±490,26.

Не наблюдалось разницы в содержании ЬН гормона (р=0,9220 у контингента РР), в группе пациентов, получавших соединение А, среднее изменение составляло -0,02±1,7, а у группы пациентов, получавших плацебо, -0,00±1,8.

Наблюдаемые средние изменения содержания Р8А и гормона приблизительно равны нулю, за исключением ΌΗΤ, т.е. соединение А не изменяет уровень гормона. Аналогичные результаты получены и в группе волонтеров (ΙΤΤ).

Безопасность

Количество пациентов, у которых наблюдалась по меньшей мере одна неблагоприятная реакция, составляло 31 (17 в группе пациентов, получавших соединение А, и 14 в группе пациентов, получавших плацебо). По этой причине из испытаний не выбыл ни один пациент, только у одного пациента из группы, получавших плацебо, наблюдался серьезный симптом в виде острого холецистита (с последующей госпитализацией).

Количество пациентов с неблагоприятными симптомами в связи с лечением соединением А составляло 3 чел. (5,26%), в то время как число пациентов с неблагоприятными симптомами в связи с плацебо составляло 6 чел. (9,68%). Симптомы в связи с соединением А включали головокружение, головную боль, снижение либидо и приливы, в то время как симптомы в связи с плацебо включали увеличение в моче фосфата, головную боль, обморок, снижение либидо (3 пациента), гиперкальциурию, эректильную дисфункцию и приливы.

Симптомы кальциурии, зарегистрированные в течение всего курса испытаний в группе, получавшей соединение А, незначительно отличались от тех, которые наблюдались в группе, получавших плацебо.

Заключение

Результаты описанного выше краткосрочного испытания концепции о воздействии соединения А на размер предстательной железы у пациентов с ВРН свидетельствуют об эффективности лекарственного средства. При анализе первичной переменной лечения, а именно при оценке размеров предстательной железы, установлено значительное различие между соединением А и плацебо, и таким образом подтверждается тот факт, что исследуемое лекарственное средство способно блокировать развитие заболевания. Профиль безопасности вполне удовлетворительный, поскольку отсутствует разница между побочными действиями в случае приема соединения А и плацебо, а в группе пациентов, получавших соединение А, не наблюдается серьезных побочных действий. У исследуемого лекарственного средства не выявлено никаких антиандрогенных свойств, оно не влияет на уровень Р8А и не оказывает существенного действия на гомеостаз кальция.

Пример 6. Активность соединения А в отношении роста и функции клеток мочевого пузыря.

Установлено, что соединение А является эффективным в отношении ингибирования роста базальных и стимулируемых тестостероном клеток мочевого пузыря. Указанная активность 1а-фтор-25гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола (соединение А или соед. А на фиг.) в отношении стимулированных клеток, ранее не описанная, является дозозависимой и составляет 1,6±7х 10¹⁵ (см. фиг. 10 и фиг. 11).

Указанное действие существенно превышает действие анти-андрогена финастерида, который находит широкое применение для лечения заболеваний мочеполового тракта (фиг. 11).

Пример 7. Действие соединения А на дисфункцию мочевого пузыря в модели обструкции выходного отверстия мочевого пузыря.

Описание эксперимента

1. Материалы.

1.1 Животные.

Самки крыс 8ргадие-Эате1еу, массой 200-250 г

1.2 Группы.

Группа А: крысы ВОО, получавшие соединение А в течение 2 недель, начиная с дня первого после создания обструкции (п=12).

Группа Б: крысы ВОО, получавшие носитель в течение 2 недель, начиная с дня первого после создания обструкции (п=12).

Группа В: ложно оперированные крысы, получавшие соединение А в течение 2 недель, начиная с дня первого после создания обструкции (п=12).

1.3 Методы обследования.

а) Цистометрия (через ~18 ч после последнего введения лекарственного средства/носителя, через 12 ч после удаления лигатуры, создающей обструкцию) животных, находящихся в сознании.

б) Измерение массы мочевого пузыря.

в) Исследования ш уйго.

2. Методы.

- 16 010240

2.1 Обструкция мочевого пузыря (ВОО).

Мочевой пузырь и уретромочепузырное соединение извлекали через разрез в нижней части брюшины по средней линии. Вдоль мочеточника помещали металлический стержень толщиной 0,9 мм и вокруг уретры и стержня обматывали шелковую лигатуру 3-0, затем стержень удаляли. Ложную хирургию проводили аналогичным образом, но без лигатуры. Через 13 суток лигатуру удаляли, в купол мочевого пузыря вводили катетер и проводили подкожную катетеризацию.

2.2 Цистометрия.

На следующее утро после введения катетера проводили цистометрическое обследование без применения анестезии или механического удерживания в камере для обследования метаболизма. Количество выходящей мочи измеряли с использованием сборника жидкости, соединенного с датчиком механического смещения. Мочевой пузырь непрерывно наполняли солевым раствором при комнатной температуре. Катетер также соединяли с датчиком давления. После периода стабилизации в течение 30-60 мин, когда достигался воспроизводимый режим мочеиспускания, в течение 30 мин регистрировали следующие параметры: базальное давление мочевого пузыря, давление мочеиспускания, пороговое давление, интервал мочеиспускания, объем и незаполненные сокращения. Количество остаточной мочи определяли вручную трижды после завершения цистометрии. Емкость мочевого пузыря рассчитывали по результатам измерений.

2.3. Исследования ίη νίΐτο.

2.3.1. Получение препаратов.

После завершения цистометрии крыс умерщвляли асфикцией моноксидом углерода с последующим обескровливанием. Брюшную полость вскрывали в нижнем отделе по разрезу ниже средней линии, а затем открывали симфиз. Мочевой пузырь осторожно отрезали, немедленно помещали в охлажденный раствор Кребса и разрезали на полоски.

2.3.2. Регистрация механической активности.

Мочевой пузырь и уретру отделяли в области шейки мочевого пузыря и среднюю треть детрузора разрезали на полукруглые полоски (1x2x5 мм). Все препараты использовали немедленно после извлечения. Полоски помещали в ванночки для тканей объемом 5 мл, содержащие раствор Кребса. Раствор Кребса поддерживали при температуре 37°С и через раствор непрерывно пропускали смесь О₂/СО₂ (95%/5%), поддерживая рН 7,4. Полоски подвешивали между двумя Ь-образными крючками с использованием шелковой лигатуры. Один крючок соединяли с подвижным устройством, позволяющим регулировать пассивное натяжение, а другой - с датчиком механического смещения Сгазз ЕТ03С (фирма Стазе 1п81гитеп18 Со, МА, США). Изометрическое натяжение регистрировали на полиграфе Стазе (7Ό). После монтажа препаратов полоски натягивали с пассивным напряжением 4 мН (одинаковым для всех препаратов) и уравновешивали в течение 45-60 мин перед проведением дальнейших экспериментов.

2.3.3. Стимуляция электрическим полем.

Стимуляцию электрическим полем (ЕЕ8) проводили при использовании двух платиновых электродов, установленных на противоположных концах полосок ткани, и источника Стазе 848 или 888, который обеспечивал подачу одиночных прямоугольных колебательных импульсов при выбранных частотах. Продолжительность серии импульсов составляла 5 с, продолжительность импульса 0,8 мс, интервал между стимуляциями составлял 2 мин. Полярность электродов меняли после каждого импульса с помощью переключателя.

Методика проведения испытаний.

Каждый эксперимент начинали с выдерживания препаратов в растворе Кребса с высокой концентрацией К⁺ (124 нМ) до получения двух воспроизводимых сокращений. Затем проводили следующие эксперименты:

а) проводили электрическую стимуляцию нервов и регистрировали ответную частотную реакции в присутствии или в отсутствие атропина;

б) получали графики концентрационной зависимости для карбахола и АТФ.

Результаты

Для анализа способности соединения А регулировать и лечить дисфункцию мочевого пузыря использовали модель искусственной обструкции выходного отверстия мочевого пузыря у крыс. Цель таких испытаний состояла в определении способности аналога витамина Ό₃ (1а-фтор-25-гидрокси-16,23Едиен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола, соединения А) в дозе 150 мкг/кг/сут предотвращать гипертрофию и дисфункцию мочевого пузыря, такую, как сверхактивность мочевого пузыря.

В этой модели вокруг выходного отверстия мочевого пузыря с вставленным катетером хирургическим способом помещали лигатуру, затем катетер удаляли и мочевой пузырь испытывали на повышенную устойчивость уретры. Крысы подвергались непрерывной цистометрии для оценки функции мочевого пузыря. Кроме того, исследовались сократительные свойства изолированных препаратов мочевого пузыря по ответной реакции на стимуляцию нерва электрическим полем (ЕЕ8) и на экзогенные стимулы ίη νίΐτο.

При этом исследовались следующие цистометрические параметры (фиг. 12-16):

- 17 010240 давление при мочеиспускании (максимальное давлением в мочевом пузыре во время мочеиспускания), емкость мочевого пузыря (остаточный объем после опорожнения плюс объем солевого раствора, который вливали, чтобы вызвать опорожнение), объем мочеиспускания (объем вытесненной мочи), остаточная моча (объем мочевого пузыря минус объем мочеиспускания), частота и амплитуда спонтанно возникающих изменений внутрипузырного давления (непустые сокращения).

В этой модели исследуемый аналог оказывал лечебное воздействие на функцию мочевого пузыря. Это действие наблюдается у нормального мочевого пузыря и сохраняется на модели обструкции выходного отверстия мочевого пузыря. Существенные различия при сравнении с введением носителя прежде всего наблюдались в следующих параметрах:

частота и амплитуда самопроизвольных непустых сокращений (фиг. 13 и 14), остаточная моча (отсутствие при введении соединения А, фиг. 16), давление мочеиспускания (фиг. 15).

Кроме того, лечебное воздействие на функцию мочевого пузыря подтверждали при следующих испытаниях ίη υιΙιό:

ответ на К⁺, ответ на ЕЕЗ (фиг. 17), ответ на карбахол.

Наконец, наблюдалось небольшое снижение массы мочевого пузыря при введении соединения А (фиг. 12).

Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения соединения А ( в дозе от 50 мкг до 300 мкг, что эквивалентно от 0,725 до 5 мг/кг) для профилактики и лечения дисфункции мочевого пузыря, например, сверхактивного мочевого пузыря, который наблюдается у пациентов с ВРН.

В примерах используются следующие сокращения:

Т тестостерон

ОНТ дигидротестостерон

ВРН доброкачественная гиперплазия предстательной железы

РР пациенты с соответствующей патологией

ΙΤΤ волонтеры

ΑΝΟνΑ дисперсионный анализ

ΤΚϋ8 трансректальное ультразвуковое исследование

ВОО обструкция выходного отверстия мочевого пузыря

АК андрогенные рецепторы

Р8А специфичный антиген предстательной железы

Все упомянутые в описании сноски, включая патенты и патентные заявки, включены в текст заявки в качестве ссылок в полном объеме.

Если не указано иное, предполагается, что слово включает и его варианты, такие, как включающий и включая используемые в описании заявки и пунктах в формулы изобретения, означают включение изложенного (заявленного) целого числа или стадии или группы целых чисел, а не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел или стадий.

Заявка, частью которой является настоящее описание и пункты формулы изобретения, может использоваться как приоритетная по отношению к любой последующей заявке. Пункты формулы изобретения такой последующей заявки могут относиться к любому описанному отличительному признаку или комбинации признаков. Они могут иметь форму продукта, композиции, способа или могут использовать пункты формулы изобретения и могут включать, например, без ограничений, следующие пункты.

Claims (25)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.
2. 2. Применение по п.1, где лекарственное средство вводят раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов со вторым агентом, активным в отношении ВРН.
3. 3. Применение 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира в комбинации со вторым агентом, активным в отношении ВРН, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.

   - 18 010240
4. 4. Применение по п.2 или 3, где второй агент, активный в отношении ВРН, означает агент, блокирующий альфа-адренергический рецептор.
5. 5. Применение по п.4, где агент, блокирующий альфа-адренергический рецептор, выбирают из ряда теразозин, доксазозин, тамсулозин, силодозин, А1О-8507Б и ВВх-2258.
6. 6. Применение по п.2 или 3, где второй агент, активный в отношении ВРН, означает ингибитор 5αредуктазы.
7. 7. Применение по п.6, где ингибитор 5а-редуктазы выбирают из ряда финастерид и дутастерид.
8. 8. Применение по любому из пп.1-7, где 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир получают в виде стандартной дозы.
9. 9. Применение по п.8, где стандартная доза 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола содержит от 50 до 150 мкг указанного соединения.
10. 10. Применение по любому из пп.1-9 для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы при отсутствии антиандрогенных простатических и экстрапростатических побочных действий.
11. 11. Применение по любому из пп.1-10 для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы одновременно с сопутствующей профилактикой и/или лечением дисфункции мочевого пузыря.
12. 12. Применение фармацевтического состава, включающего 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.
13. 13. Применение фармацевтического состава по п.12, где 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир получают в виде стандартной дозы.
14. 14. Применение фармацевтического состава по п.13, где стандартная доза 1а-фтор-25-гидрокси16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола содержит от 50 до 150 мкг указанного соединения.
15. 15. Применение состава по пп.12-14, где фармацевтический состав дополнительно включает второй агент, активный в отношении ВРН.
16. 16. Способ профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы у пациентов, нуждающихся в такой профилактике или лечении, включающий введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира.
17. 17. Способ профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы у пациентов, нуждающихся в такой профилактике или лечении, включающий введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов в смеси со вторым агентом, активным в отношении ВРН.
18. 18. Способ по п.17, где второй агент, активный в отношении ВРН, означает агент, блокирующий альфа-адренергический рецептор.
19. 19. Способ по п.18, где агент, блокирующий альфа-адренергический рецептор, выбирают из ряда теразозин, доксазозин, тамсулозин, силодозин, АЮ-8507Б и ВВх-2258.
20. 20. Способ по п.17, где второй агент, активный в отношении ВРН, означает ингибитор 5αредуктазы.
21. 21. Способ по п.20, где ингибитор 5а-редуктазы выбирают из ряда финастерид и дутастерид.
22. 22. Способ по любому из пп.16-21, где 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир получают в виде стандартной дозы.
23. 23. Способ по п.22, где стандартная доза 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола содержит от 50 до 150 мкг указанного соединения.
24. 24. Способ по любому из пп.16-23 для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы при отсутствии антиандрогенных простатических и экстрапростатических побочных действий.
25. 25. Способ по любому из пп.16-23 для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы одновременно с сопутствующей профилактикой и/или лечением дисфункции мочевого пузыря.