NL1027109C2 - Verbinding en gebruik bij behandeling. - Google Patents

Description

VERBINDING EN GEBRUIK BIJ BEHANDELING

Deze uitvinding betreft het gebruik van 1 -alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen- 26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol (Verbinding A) voor de productie van een medica-5 ment ter voorkoming en/of behandeling van "Benign Prostatic Hyperplasia" (BPH, benigne prostaathyperplasie) en bijbehorende symptomen. De uitvinding betreft verder een werkwijze voor het voorkómen en/of behandelen van BPH en bijbehorende symptomen door toediening van 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalci-ferol in een hoeveelheid die doelmatig is voor het voorkomen en/of behandelen van een 10 dergelijke aandoening, alleen of in combinatie met andere actieve middelen.

BPH is een veel voorkomende kwaal bij oudere mannen, die optreedt bij ongeveer 50% van de 60-jarige mannen en bij 90% van de 85-jarige mannen. BPH is een specifieke histopathologische entiteit, gekenmerkt door stromale en epitheliale celhyperplasie.

Het proces van veroudering en de aanwezigheid van functionele testes vormen al 15 meer dan een eeuw de twee bekende etiologische factoren voor pathogenese van BPH. Naarmate echter de Wetenschap van prostaatbiologie voortschrijdt wordt dit concept steeds minder toereikend, aangezien het niet alle aspecten van BPH-pathogenese dekt. Bijkomende etiologische factoren spelen een belangrijke rol in de regulering van de groei van de prostaat.. Met name zijn er aanwijzingen dat prostaatgroei onder directe besturing 20 staat van specifieke, door prostaatcellen geproduceerde groeifactoren, die plaatselijk inwerken op naburige cellen in een paracrien mechanisme of op dezelfde cellen in een autocrien mechanisme. Daarom wordt er op het ogenblik veel gedaan aan het identificeren van therapeutische strategieën gericht op het remmen van intraprostaat groeifactoren.

25 BPH is een veel voorkomende oorzaak van chronische symptomen in het laatste gedeelte van de urineweg, die een nadelige uitwerking kunnen hebben op zowel de vulfase (irritatieve symptomen) als de loosfase (obstructieve symptomen) van de mictie-cyclus. Deze symptomen beïnvloeden het sociale, psychologische, huiselijke, beroeps-, fysieke en sexuele leven van de patiënten en leiden tot een diepgaand negatief schok-30 effect op de kwaliteit van hun leven. Bovendien kan BPH de oorzaak zijn van meer acute urologische complicaties, met name "Acute Urinary Retention" (AUR, acute urineretentie), die dikwijls als de ernstigste complicatie van BPH wordt beschouwd en, minder vaak, terugkomende infecties van de urinewegen, dilatatie van het eerste gedeelte van de urineweg, vorming van urinestenen en terugkomende hematurie.

35 BPH-beheersing gaat gepaard met extreem hoge maatschappelijke kosten, alleen al in de VS geschat op 4 miljard dollar in 1993 en mogelijk 26 miljard dollar in 2003.

1027109 — 2

De huidige medische behandeling van BPH omvat oraal toegediende 5-alfa- reduc-tase inhibitoreh (finasteride en dutasteride, recentelijk goedgekeurd door de [Amerikaanse] FDA) en alfa-1-receptor antagonisten (terazosine, doxazosine, tamsulosine en ook silodosine, AIO-8507L, RBx-2258 enz.). Elk van deze therapeutische opties heeft zowel 5 voor- als nadelen, samenhangend met hun verschillende werkingsmechanismen. Terwijl aifa-1-receptor antagonisten zeer effectief zijn in het reduceren van Lower Urinary Tract Symptoms (LUTS, symptomen betreffende het laatste gedeelte van de urineweg), zijn ze onwerkzaam ten aanzien van het verminderen van het prostaatvolume en daarmee van het voorkomen van, met BPH samenhangende, chirurgische ingrepen. Aan de andere 10 kant reduceren 5-alfa-reductase inhibitoren, zoals finasteride en dutasteride, de prostaat-omvang en de noodzaak van chirurgische ingrepen, door vermindering van de vorming van DiHydroTestosteron (DHT). Verder hebben recente uitkomsten van de zeven jaar durende Prostate Cancer Prevention Trial (een Amerikaans prostaatkankerpreventie-onderzoek), waarbij meer dan 18.000 gezonde bejaarde mannen zijn betrokken, aan-15 getoond dat finasteride het ontstaan van prostaatkanker kan voorkomen cq vertragen (zie Thompson IM, et al. New England Journal of Mediclne (2003) 349 P 215-224). Zoals echter werd verwacht (zie Kassabian VS, Lancet (2003) 361P 60-62), bleek finasteride niet vrij te zijn van anti-androgene schadelijke invloeden op het sexuele functioneren, zoals verminderde sexuele potentie, geslachtsdrift en gynaecomastie, waardoor de aantrek-20 kelijkheid ervan als kankerpreventiemiddel aanzienlijk wordt verminderd. Bovendien werd de behandeling met finasteride in verband gebracht met een verhoogde detectie van hoog gektasserde prostaatkanker, waarschijnlijk omdat de, door de finasteride veroorzaakte, lage androgeentoestand, de meest agressieve, voor androgenen ongevoelige, kwaadaardige, groeiende cellen selecteerde (zie Scardino PT, New England Journal of 25 Medicine (2003) 349 p 297-299).

Er is zodoende een nog niet vervulde behoefte aan een nieuwe categorie medicijnen voor de medicamenteuze behandeling van BPH, die in staat moeten zijn om AUR, met de daarmee verband houdende noodzaak tot chirurgisch ingrijpen, te voorkomen, door het verminderen van, door androgenen veroorzaakte, prostaatgroei, maar zonder 30 rechtstreeks invloed uit te oefenen op androgeenreceptoren (AR) en derhalve zonder anti-androgeen prostatisch- en extraprostatisch antagonisme, bijvoorbeeld, sexuele bijwerkingen. Dergelijke medicamenten kunnen, door intra-prostatiche groeifactorsignalering te verstoren, nuttig zijn, niet alleen voor de behandeling van BPH, maar ook ter voorkoming van prostaatkanker, eventueel zonder selectie van AR-ongevoelige, kwaadaardige klonen. 35 Zoals hierin beschreven hebben de uitvinders vastgesteld dat het niet-hypercal- ciëmische, goed verdragen, vitamine D3 analogon 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen- 10271 09 ‘‘ 3 26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol (Verbinding A), een primair voorbeeld is van een dergelijk medicament, aangezien het BPH tegen kan werken op een wijze die onafhankelijk is van een androgeenreceptor, door zich te richten op een veelheid van wegen waarlangs BPH celgroei, inclusief door groeifactoren teweeggebrachte prostaatproli-S feratie, bestuurd wordt.

1,25-dihydroxyvitamine D3 [1,25(ΟΗ)203], de geactiveerde vorm van vitamine D3, is een secosteroïde hormoon dat niet alleen een centrale rol speelt in het bot- en caldum-metabolisme, maar ook betrokken is bij de regeling van de immuunreactie en de differentiatie en apoptose van veel celtypen, inclusief kwaadaardige cellen.

10 Een probleem bij het therapeutische gebruik van calcitriol is echter het natuurlijke vermogen ervan om hypercalciëmie en hyperfosfatemie te induceren. Vandaar dat analo-ga van calcitriol zijn ontwikkeld, die biologisch actief blijven maar geen hypercaldëmische bijwerkingen hebben.

Odrooischriften US 5,939,408 en EP808833 onthullen een aantal 1,25(OH)2D3 15 analoga, waaronder de verbinding 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo- 20-epi-cholecalciferol (Verbinding A). De odrooischriften US 5,939,408 en EP808833 onthullen dat de verbindingen differentiatie en inhibitie van proliferatie induceren in verscheidene huid- en kankercellenen en bruikbaar zijn voor de behandeling van hyper-proliferatieve huidaandoeningen, zoals psoriasis, neoplastische ziekten, zoals leukemie, 20 borstkanker en vetklierkwalen, zoals acné en seborrheïsche dermatitis, en osteoporose.

Op verrassende wijze is nu in een aantal door de uitvinders uitgevoerde studies aan het licht gekomen dat, in tegenstelling met bepaalde andere 1,25(OH)2D3 analoga, de 1,25(OH)2D3 analogon Verbinding A:

Verbinding A

in aanzienlijke mate de groei van menselijke BPH-cellen in vitm vermindert via inductie van hun apoptose en prostaatgroei in vivo vermindert, zonder enige uitwerking op 25 1027109 4 testosteron- en dihydrotestosteronniveaus. Verder wordt deze inhibitie van prostraatgroei bereikt bij niet-hypercalciëmische doses. Verbinding A is derhalve een effectief farmacologisch agens voor de behandeling van BPH.

Zoals beschreven in de hier gegeven voorbeelden, reduceert Verbinding A de 5 prostaatomvang. Verder gaat, zoals waargenomen wordt bij finasteride, Verbinding A de in vitro en in vivo proliferatieve activiteit van testosteron tegen. Belangrijk in dit verband is echter dat Verbinding A, anders dan finasteride, type-1 of type-2 5 alfa-reductase activiteit niet inhibeert en niet alleen testosteron, maar ook zelfs dihydrotestosteron-gelnduceerde BPH-cel groei kan tegenwerken. Deze anti-androgene eigenschappen van Verbinding A 10 zijn onafhankelijk van interactie met de AR, zoals blijkt uit het feit dat Verbinding A zowel geen verbinding met de AR aangaat, en/of niet werkt als AR-agonist of antagonist. Verder heeft Verbinding A geen (nadelige) invloed op de geslachtshormoonafscheiding. Verder heeft in onze onderzoeken Verbinding A geen substantiële uitwerking op PSA-niveaus, zodat er geen gevaar blijkt te bestaan dat behandeling met Verbinding A deze belangrijke 15 indicator van mogelijke prostaatkanker maskeert.

Nog een belangrijk voordeel van Verbinding A is dat in vitro studies hebben uitgewezen dat dit medicijn, in tegenstelling tot finasteride, in staat is basale en door testosteron gestimuleerde groei van blaascellen te inhiberen en dat dit medicijn naar verwachting nuttig is voor het voorkómen en/of behandelen van blaasstoomissen bij mensen. In 20 vivo studies in een gevalideerd blaasuitgangsobstructiemodel (BOO-model) van blaasdisfunctie bij ratten hebben ook de heilzame uitwerking aangetoond van Verbinding A. Dit is veelbetekenend omdat blaasdisfunctie een veel voorkomend en lastig gevolg is van . BPH. Verbinding A is dus in staat prostaatomvang te reduceren en blaasdisfunctie te verlichten, d.w.z. verbetering te brengen in blaasfunctie en tegelijkertijd in blaas-gerela-25 teerde symptomen van BPH, door het directe effect van Verbinding A op zowel de prostaat als de blaas. Van dit effect wordt verwacht dat dit verder reikt dan de verbetering in blaassymptomen die te verwachten is louter als gevolg van reductie in prostaatomvang. Tot blaassymptomen behoort ook een overactieve blaas en tot indicatoren van verbeterde blaasfunctie behoren ook vermindering in niet tot lozing leidende contracties en resteren-30 de urine.

De onderhavige uitvinding voorziet derhalve in het gebruik van 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol in de fabricage van een medicament ter voorkoming en/of behandeling van BPH. Ook worden binnen het bestek van de uitvinding farmaceutisch aanvaardbare esters en zouten van verbinding A in be-35 schouwing genomen.

10271 09'" 5

De uitvinding voorziet dus in het gebruik van 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen- 26.27- bishomo-20-epi-cholecalciferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan, in de fabricage van een medicament ter preventie en/of behandeling van BPH.

5 De uitvinding vóórziet tevens in een werkwijze voor het voorkomen en/of behan delen van BPH bij patiënten die behoefte hebben aan een dergelijke preventie of behandeling, omvattende het toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan.

10 De uitvinding voorziet ook in het gebruik van 1 -alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen- 26.27- bishomo-20-epi-cholecalciferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan, ter voorkoming en/of behandeling van BPH.

De uitvinding voorziet verder in 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecaldferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch 15 aanvaardbare ester daarvan, ten gebruike voor de preventie en/of behandeling van BPH.

De uitvinding voorziet ook in het gebruik van 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen- 26.27- bishomo-20-epi-cholecalciferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan, ter voorkoming en/of behandeling van BPH zonder anti-androgene prostatische en extra-prostatische bijwerkingen. De uitvinding voorziet 20 verder in een werkwijze voor de preventie en/of behandeling van BPH zonder anti-andro-gene prostatische en extra-prostatische bijwerkingen bij patiënten die behoefte hebben aan een dergelijke preventie of behandeling, omvattende het toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaard-25 bare ester daarvan.

De uitvinding voorziet verder in het gebruik van 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan, ter voorkoming en/of behandeling van BPH, in combinatie met gelijktijdige preventie en/of behandeling van blaasdisfunctie. De 30 uitvinding voorziet tevens in een werkwijze voor preventie en/of behandeling van BPH in combinatie met gelijktijdige preventie en/of behandeling van blaasdisfunctie, bij patiënten behoefte hebben aan een dergelijke preventie of behandeling, omvattende het toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen- 26.27- bishomo-20-epi-cholecalciferol of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farma- 35 ceutisch aanvaardbare ester daarvan.

1027109 6 1-Alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol is een bekende verbinding, waarvan de bereiding wordt beschreven in octrooischrift US 5,939,408 en waarnaar hier wordt verwezen.

Esters omvatten onder andere farmaceutisch aanvaardbare labiele esters die 5 gehydroliseerd kunnen zijn in de substantie voor afgifte van Verbinding A.

Zouten van Verbinding A omvatten onder andere adducten en complexen die ge* vormd kunnen worden met alkali en alkaline aardmetaalionen en metaalionzouten zoals natrium, kalium en caldumionen en zouten ervan zoals caldumchloride, calciummalonaat en dergelijke.

10 Verbinding A, of een zout of ester ervan, kan gebruikt worden als monotherapie of worden toegediend in combinatie met bekende BPH-actieve agentia, bijvoorbeeld een alfa-adrenergische receptorblokkerend agens zoals een alfa-1 receptorantagonist (bijvoorbeeld terazosine, doxazosine of tamsulosine of anders silodosine, AIO-8507L of RBx-2258) of een 5-alfa-reductase inhibitor (bijvoorbeeld finasteride of dutasteride). De uit-15 drukking “BPH-actieve agens” omvat die middelen die in staat zijn tof activiteit of waarvan bekend is dat zij activiteit ontwikkelen, bij het behandelen of voorkomen van BPH zoals de hiervoor als voorbeeld genoemde stoffen. De combinatiepartner kan worden toegevoegd aan, en gemengd met de Verbinding A of de zouten of esters ervan in uiteenlopende verhoudingen en separaat worden toegediend, sequentieel of gelijktijdig in separate of 20 gecombineerde farmaceutische vormen. Een vakman zal geen moeite hebben de geschikte doses van bekende therapeutische middelen te bepalen. Combinatie van Verbinding A met twee of meer, bijvoorbeeld drie, BPH-actieve verbindingen is denkbaar, bijvoorbeeld combinatie met alfa-1-receptorantagonist en een 5-alfa-reductase inhibitor. Bij toediening in combinatie met Verbinding A (of zout of ester) kan/kunnen de combinatie-25 partner(s) worden gebruikt in lagere dosering vergeleken met de gebruikte doses wanneer de combinatiepartner alleen wordt toegediend, mogelijk zelfs een dosis die sub-thera-peutisch is wanneer deze alleen wordt toegediend.

De uitvinding voorziet derhalve ook in het hiervoor gedefinieerde gebruik, waarbij het medicament separaat, sequentieel of gelijktijdig wordt toegediend in separate of 30 gecombineerde farmaceutische vormen met een tweede BPH-actieve agens.

De uitvinding voorziet derhalve ook in het gebruik van 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of een farmaceutisch aanvaardbare ester ervan, in combinatie met een tweede BPH-actieve agens in de bereiding van een medicament voor de preventie en/of behandeling 35 van BPH.

10271 09 7

De uitvinding voorziet verder in een werkwijze ter voorkoming en/of behandeling van BPH, bij patiënten die behoefte hebben aan een dergelijke preventie of behandeling, omvattende de toediening van een therapeutisch effectieve hoeveelheid 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol of een farmaceutisch aan-5 vaardbaar zout of een farmaceutisch aanvaardbare ester ervan separaat, sequentieel of gelijktijdig in separate of gecombineerde farmaceutische vormen (“formulations”) met een tweede BPH-actieve agens.

De bovengenoemde combinaties kunnen gemakshalve voor gebruik worden gepresenteerd in de gedaante van een farmaceutische vorm. De aldus voortgebrachte 10 farmaceutische vormen vertegenwoordigen weer een ander aspect van de uitvinding.

Doseemiveaus en toedieningstijdschema's van de actieve ingrediënten in de farmaceutische vormen van de uitvinding kunnen gevarieerd worden ten einde een hoeveelheid van het actieve ingrediënt te verkrijgen die effectief is voor het bereiken van de gewenste therapeutische reactie bij een bepaalde patiënt, samenstelling en wijze van 15 toedienen, zonder daarbij toxisch voor de patiënt te zijn. Een typisch dosisbereik van Verbinding A is bijvoorbeeld van 0,1 tot 300 pg per dag, bijvoorbeeld 50-150 pg per dag, bijvoorbeeld 75 of 150 pg per dag. Een ënkelvoudige dosis (“unit dose”) vorm bevat bij voorkeur 50-150 pg bijvoorbeeld 75 of 150 pg en wordt bij voorkeur eenmaal per dag toegediend.

20 In het bijzonder is een voorkeursdosis van Verbinding A het maximum dat een patiënt kan verdragen zonder hypercalciëmie of andere ongewenste bijwerkingen zoals hypercalcurie te ontwikkelen. Bij voorkeur wordt Verbinding A toegediend in een concentratie van ongeveer 0,001 pg tot ongeveer 100 pg per kilogram lichaamsgewicht, ongeveer 0,001 - ongeveer 10 pg/kg of ongeveer 0,001 pg - ongeveer 100 pg/kg 25 lichaamsgewicht. Bereiken tussen de bovengenoemde waarden zijn ook bedoeld als onderdeel van de uitvinding.

Zoals hierboven opgemerkt, kan Verbinding A worden toegediend als een farmaceutisch aanvaardbaar zout of als een farmaceutisch aanvaardbare ester ervan, maar bij voorkeur wordt Verbinding A gebruikt zoals hij is, d.w.z. niet als een zout of ester ervan.

30 Deze dosering kan afgegeven worden in een conventionele farmaceutische vorm door een enkele toediening, door meervoudige toepassingen, of via beheerste afgifte, naar gelang nodig om de meest effectieve resultaten te bereiken, bij voorkeur één- of tweemaal daags (speciaal eenmaal per dag) bijvoorbeeld oraal. In bepaalde situaties kan dosering om de andere dag toereikend blijken om de gewenste therapeutische reactie te 35 bereiken.

1027109 8

De keuze van de exacte dosis en vorm en het geschiktste afgifteregime zal onder andere worden beïnvloed door de farmacologische eigenschappen van de vorm, de aard en ernst van de aandoening onder behandeling en de fysieke toestand en geestelijke scherpte van de ontvanger.

5 Representatieve afgifteregimes zijn onder andere oraal, parenteraal (bijvoorbeeld subcutaan, intramusculair en intraveneus), rectaal, buccaal (bijvoorbeel sublinguaal), via de longen, transdermaal en intranasaal, waarbij oraal de meeste voorkeur geniet. Toediening kan continu zijn of met tussenpozen (bijvoorbeeld door bolusinjectie).

De uitvinding voorziet ook in een farmaceutische samenstelling omvattende 1-alfa-10 fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalclferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester ervan en een farmaceutisch aanvaardbare carrier voor de preventie en/of behandeling van BPH.

De uitvinding voorziet ook in een verpakte vorm, omvattende een farmaceutische samenstelling die 1 -alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-chole-15 calciferol omvat, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester ervan en een farmaceutisch aanvaardbare carrier, verpakt met aanwijzingen voor het gebruik bij behandeling van BPH.

Zoals hiervoor vermeld, kunnen dergelijke samenstellingen worden bereid voor parenterale (subcutane, intramusculaire of intraveneuze) toediening, met name in de vorm 20 van vloeibare oplossingen of suspensies; voor orale of buccale toediening, met name in de vorm van tabletten of capsules; voor intranasale toediening of toediening via de longen, met name in de vorm van poeders, neusdruppels of aërosols; en voor rectale of transdermale toediening.

De samenstellingen kunnen op gerieflijke wijze worden toegediend in “unit dose"-25 vorm (enkelvoudige dosis) en kunnen worden bereid volgens alle in het farmaceutische vak bekende werkwijzen, bijvoorbeeld zoals beschreven in Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Vormen voor parenterale toediening kunnen als exdpientia bevatten: steriel water of saline, alkyleenglycolen zoals propyleenglycol, polyalkyleenglycolen zoals polyethyleenglycol, oliën van plant-30 aardige oorsprong, gehydrogeneerde naftalenen en dergelijke. Vormen voor nasale toediening kunnen vast zijn en kunnen excipientia, bijvoorbeeld lactose of dextran, bevatten, of waterige of olieachtige oplossingen zijn in de vorm van neusdruppels of gedoseerde spray. Voor buccale toediening bevatten veel gebruikte excipientia onder andere suikers, calciumstearaat, magnesiumstearaat, voorgegelatineerd zetmeel en 35 dergelijke.

1027109 ' 9

Oraal toedienbare samenstellingen kunnèn een of meer fysiologisch compatibele carriers en/of1 excipientia omvatten en kunnen in vaste of vloeibare vorm voorkomen. Tabletten en capsules kunnen worden bereid met bindmiddelen, bijvoorbeeld siroop, acacia, gelatine, sorbitol, tragacant of polyvinylpyrrolidon; vulmiddelen, zoals lactose, 5 sucrose, maïszetmeel, calciumfosfaat, sorbitol of glycine; glijmiddelen, zoals magnesiumstearaat, talkpoeder, polyethyleenglycol of siliciumdioxide; en surfactanten, zoals natriumlaurylsulfaat. Vloeibare samenstellingen kunnen conventionele additieven bevatten zoals suspenderende middelen, bijvoorbeeld sorbitolsiroop, methylcellulose, suikersiroop, gelatine, carboxymethylcellulose of eetbare vetten; emulgerende middelen 10 zoals lecithine, of acacia; plantaardige oliën zoals amandelolie, kokosolie, levertraan of arachideolie; conserveringsmiddelen zoals BHA (Butylated HydroxyAnlsole, gebutyleerd hydroxyanisool) en BHT (Butylated HydroxyToluene, gebutyleerd hydroxytolueen). Vloeibare samenstellingen kunnen ingekapseld zijn in, bijvoorbeeld, gelatine om te zorgen voor een “unit dose”-doseervorm.

15 Te prefereren vaste orale doseervormen omvatten onder andere tabletten, capsules met harde tweedelige schaal, en SEG- (Soft Elastic Gelatin, zachte elastische gelatine) capsules. SEG-capsules zijn met name interessant omdat deze duidelijke voordelen hebben boven de andere twee vormen (zie Seager, H., "Soft gelatin capsules: a solution to many tableting problems" (zachte-gelatinecapsules: een oplossing voor veel tablet-20 teerproblemen); Pharmaceutical Technology, 9, (1985)). Enkele van de voordelen van SEG-capsules zijn: a) uniformiteit van dosisinhoud is geoptimaliseerd bij SEG-capsules omdat het medicijn is opgelost of colloïdaal verdeeld in een vloeistof die nauwkeurig in de capsules kan worden gedoseerd; b) medicijnen bereid als SEG-capsules geven blijk van een goede bio-beschikbaarheid omdat het medicijn wordt opgelost, oplosbaar gemaakt, of 25 colloïdaal verdeeld in een waterige-mengbare of olieachtige vloeistof, waardoor de oplossingen, wanneer zij in het lichaam worden vrijgegeven, oplossen of worden geëmulgeerd, zodat medidjnverspreiding over een groot oppervlak wordt bereikt; en c) degradatie van medicijnen die gevoelig zijn voor oxidatie tijdens langdurige opslag wordt voorkomen omdat het droge omhulsel van zachte gelatine een barrière vormt tegen diffusie van 30 zuurstof.

De droge-omhulselvorm omvat gewoonlijk een gelatinegehalte van ongeveer 40% tot 60%, een weekmakergehalte van ongeveer 20% tot 30% (zoals glycerine, sorbitol of propyleenglycol) en een watergehalte van ongeveer 30% tot 40%. Andere materialen zoals conserveringsmiddelen, kleurstoffen, opaakmakers en smaakstoffen kunnen even-35 eens aanwezig zijn. Het vloeibare vulmateriaal omvat een vast medicijn dat is opgelost, oplosbaar gemaakt of colloïdaal verdeeld (met suspenderende middelen zoals bijenwas, 1027109 10 gehydrogeneerde ricinusolie of polyethyleenglycol 4000) of een vloeibaar medicijn in oplosmiddelen of combinaties van oplosmiddelen, zoals paraffineolie, plantaardige oliën, triglyceriden, glycolen, polyolen en oppervlakte-actieve middelen.

In een als voorbeeld dienende vorm zijn de zachte-gelatinecapsules: gelatine cap-5 sules, afmeting 2, wit, opaak, ovaal, met als inhoud een vloeibaar vulmiddel bestaande uit het actieve ingrediënt, Verbinding A, opgelost in Miglyol 812 (triglyoeride van gefractio-neerde C8-C12 kokosolie-vetzuren) met BHT en BHA als conserveringsmiddelen. De zachte-gelatinecapsules kunnen een zodanige vorm hebben dat de inhoud aan Verbinding A van 0,01 tot 25 mg, bijvoorbeeld 75 of 150 pg, bedraagt. Zachte-gelatine-10 capsules dienen opgeslagen te worden bij 2 - 8 °C en beschermd te worden tegen licht.

Vormen die Verbinding A, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester ervan, optioneel in combinatie met een tweede BPH-actieve agens, bevatten, kunnen bereid worden door de ingrediënten te mengen.

Vormen worden bij voorkeur bereid onder stikstof bij amberkleurig licht.

IS De onderhavige uitvinding zal nu worden beschreven aan de hand van de volgende niet-uitsluitende voorbeelden, onder verwijzing naarde figuren, waarin:

Figuur 1 toont inhibitie van BPH-celproliferatie door alcitriol en Verbinding A (“Vbd A”/Cmpd A"). Paneel A Incubatie gedurende 48 h bij toenemende concentraties (10*ie-10‘7 20 M) calcitriol (cirkels) of Verbinding A (vierkanten) resulteerde in een aanzienlijke en dosis-afhankelijke inhibitie van BPH-celgroei (*P<0,01 vs. controle). ALLFIT-analyse geeft aan dat de twee secosteroïden dezelfde maximale inhibitie (lmax=43±1%) delen, maar een opvallend verschil laten zien in rang qua potentie (-logICso Verbinding A=15,8±0,3; -logICso calcitriol=10,2±0,6, P<0,005). De resultaten zijn uitgedrukt in % inhibitie (gemiddeld ±SEM 25 [SEMrstandaardfout vh gemiddelde]) over hun relatieve controles in 3 verschillende experimenten die in drievoud werden uitgevoerd. Paneel B Effect van toenemende concentraties (10'18-10'7 M) van Verbinding A op BPH-celproliferatie gestimuleerd door T (10 nM, vierkanten), KGF (10 ng/ml, cirkels) of Des(1-3)IGF-I (10 ng/ml, driehoeken). Verbinding A induceerde een substantiële inhibitie (*P<0,01 vs. met T of GF behandelde 30 cellen) van BPH-celgroei, ook in aanwezigheid van alle met soortgelijke lmax=66,6±7,3% geteste stimuli. Toch was Verbinding A werkzamer in het inhiberen van het effect van T (-log IC5o=16,4±0,6), dan van de andere twee GF’s, (-log IC5oDes(1-3)IGF-l =12,7±0,6, en -log IC50 KGF=14,2±0,6, P0.0001). De resultaten zijn uitgedrukt in % variatie (gemiddeld±SEM) over de maximale stimulatie in 3 verschillende experimenten die in 35 drievoud zijn uitgevoerd.

1027109 11

Figuur 2 toont het effect van Verbinding A, cyproteronacetaat en finasteride op de met androgeen gestimuleerde BPH-celgroei. BPH-cellen werden geTncubeerd gedurende 48 h met Verbinding A (1 nM) of anti-androgenen (finasteride, F, 1 nM; cyproteronacetaat, Cyp, 100 nM) in aanwezigheid van T (10 nM, Paneel A) of DHT (10 nM, Paneel B). De 5 resultaten verkregen in ongestimuleerde BPH cellen zijn ook weergegeven (Paneel A). De resultaten zijn uitgedrukt in % variatie (gemiddeld±SEM) over hun relatieve controles in drie verschillende experimenten die in viervoud zijn uitgevoerd. Verbinding A en cyproteronacetaat blokkeerden in belangrijke mate zowel de T- als de DHT-geïnduceerde groei, terwijl finasteride alleen effectief was tegen T. *P<0,01 vs. controle; °P<0,01 vs. met 10 androgeen behandelde cellen.

Figuur 3 toont het gebrek aan agonistische of antagonistische eigenschappen van Verbinding A jegens humaan AR. De AR-deficiënte PC3-cellijn, stabiel getransfecteerd met het humane AR, werd aangebracht op zgn. “24-well plates" [platen met 24 putjes] met een dichtheid van 2x104cellen/well. Na 24 h werden de cellen getransfecteerd met de AR-15 responsieve plasmide pLSPP en 48 h later werden cellen geïncubeerd met toenemende concentraties DHT (vierkanten) Verbinding A (cirkels) (Paneel A), of met een vaste concentratie DHT (3 nM) in aanwezigheid van bicalutamide (vierkanten) of Verbinding A (cirkels) (Paneel B) gedurende 18 h. De resultaten (het gemiddelde van drie transfectie-experimenten) zijn uitgedrukt in het percentage bioluminescentie per pg van het totaal aan 20 proteïnen. Voor het evalueren van agonistische activiteit werd 100% ludferase-activiteit ingesteld in aanwezigheid van DHT 100 nM (Paneel A), terwijl voor het testen van antagonistische activiteit 100% ludferase-activiteit werd ingesteld met DHT 3 nM (Paneel B).

Fiouur 4 toont inhibitie van de groei van de ventrale prostaat bij ratten door Verbinding A of finasteride. Paneel A: Gecastreerde ratten, geïnjecteerd met T-enanthaat 25 (30 mg/kg/week), werden 5 dagen/week oraal behandeld gedurende twee opeenvolgende weken met vehiculum of met toenemende doses Verbinding A (10,30,100 en 300 pg/kg) of Finasteride (F, 10 en 40 mg/kg). Ventrale-prostaatgewicht wordt uitgedrukt in % variatie (gemiddeld±SEM) van het gewicht van ongeschonden, met vehiculum behandelde, ratten (AP<0,05, *P<0,01 vs. controle-ratten, eP<0,0l vs. T-gesupplementeerde ratten). Paneel 30 B: Ongeschonden volwassen ratten werden meer dan een maand oraal behandeld (5 keer per week , totaal 27 toedieningen) met vehiculum (controle) of toenemende concentraties Verbinding A (10, 30,100 en 300 pg/kg) of finasteride (F, 10 en 40 mg/kg). Ventrale-prostaatgewicht wordt uitgedrukt in % variatie (gemiddeld±SEM) van het gewicht van controle-, met vehiculum behandelde, ratten (*P<0,01 vs. controleratten).

35 Figuur 5 toont het effect van Verbinding A en finasteride op dusterine genexpressie in ventrale prostaat van ratten. Paneel A. “Northern analyse” van dusterine mRNA- 1027109 12 expressie in de ventrale prostaat van met vehiculum behandelde ongeschonden (“lane Γ [baan 1]) of g'eorchidectomiseerde (“lane 2 [baan 2]) ratten. Banen 3-6 laten clusterine genexpressie zien in georchidectomiseerde ratten, gedurende twee weken gesupplemen-teerd met T- enanthaat (30 mg/kg) en oraal behandeld met vehiculum (baan 3), Verbin-5 ding A (300 pg/kg, baan 4 en 100 pg/kg, baan 5) of finasteride (40 mg/kg, baan 6). Elke baan werd geladen met 10 pg totaal-RNA. De corresponderende GAPDH-expressie en de ethidiumbromide verkleuring van de gel zijn te zien onder de “blot “[vlek]. De vlek is representatief voor twee afzonderlijke experimenten. Paneel B. Northern analyse van clusterine mRNA-expressie in de ventrale prostaat van volwassen ongeschonden ratten, 10 ruim 1 maand oraal behandeld (5 keer per week, 27 toedieningen) met vehiculum (baan 1), toenemende concentraties Verbinding A (10, 30, pg/kg, baan 2 en 3) of finasteride (40 mg/kg, baan 4). Eik van de banen werd geladen met 10 pg totaal-RNA. De corresponderende GAPDH-expressie en de ethidiumbromide verkleuring van de gel zijn te zien onder de viek. De vlek is representatief voor twee afzonderlijke experimenten.

15 Figuur 6 toont de morfologische effecten van Verbinding A op de ventrale prostaat van gecastreerde en T-gesupplementeerde ratten. Panelen A, B, C en E. Representatieve velden, verkregen uit doorsneden van gehele prostata, immunologisch gemerkt met een monokloon antilichaam tegen ratclusterine en contrasterend gekleurd met hematoxyline. in met vehiculum behandelde ratten die 4 dagen tevoren waren gecastreerd, is clusterine-20 labeling geconstateerd in het cytoplasma van de strofische cuboïdale epitheliale cellen (Paneel A, 10x). Na veertiendaagse T-supplementatie (Paneel B, 10x) verdween bijna de gehele clusterine-labeling. Omgekeerd waren clusterine-positieve cellen nog steeds aanwezig in ratten, behandeld met T en verschillende doses Verbinding A (100 pg/kg, Paneel O, 300 pg/kg, Paneel E, zwarte pijlen). Panelen D en F tonen secties, volgend op 25 die in Panelen C en E, om de aandacht te vestigen op DNA-fragmentatie zoals bepaald door middel van door terminale-deoxynucleotidyl-transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) [labeling van met TdT bewerkte dUTP-strengbreuk-einde]. Veertiendaagse behandeling (9 toedieningen) met Verbinding A (100 pg/kg, Paneel D; 300 pg/kg, Paneel F) induceerde omvangrijke apoptose in de meeste epitheliale en stromale 30 cellen. Merk op (zwarte pijlen), dat alle clusterine-positieve cellen apoptose ondergingen, terwijl ook een consistent deel van clusterine-ongelabelde cellen kernfragmentatie vertoont.

Figuur 7 toont de morfologische effecten van Verbinding A en finasteride op de prostaat van ongeschonden, volwassen ratten. Panelen A, B, D, E, F en H. Represen-35 tatieve velden, verkregen uit doorsneden van gehele prostata, immunologisch gemerkt met een monoklonaal antilichaam tegen ratclusterine en contrasterend gekleurd met 10271 09 " 13 hematoxyline. In Paneel A (10x) was het primaire antilichaam weggelaten. Paneel B (10x) laat zien dat in onbehandelde volwassen ratten slechts enkele schaarse epitheliale cellen gelabeld waren in enkele [voorstander]klieren (zwarte pijlen). Omgekeerd werden in prostata uit ratten, behandeld met toenemende concentraties Verbinding A cuboïdale 5 epitheliale cellen die de kenmerken van atrofie vertoonden, dosis-afhankelijk gekleurd voor clusterine (zie zwarte pijlen, 10 pg/kg, Paneel D; 30 pg/kg, Paneel E, 100 pg/kg, Paneel F, 10x). Soortgelijke resultaten werden verkregen met finasteride (40 mg/kg, Paneel H, 10x). Panelen C, G en I laten seriële, consecutieve plakken zien ten opzichte van die welke afgebeeld zijn in, respectievelijk, Panelen B, D en F, om de aandacht te 10 vestigen op DNA-fragmentatie zoals bepaald door middel van door terminale-deoxynudeotidyl-transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) [labeling van met TdT bewerkte dUTP-strengbreuk-eindej. Merk op (zwarte pijlen), dat alle dusterine-positieve cellen apoptose ondergingen, terwijl ook een consistent deel van dusterine-ongelabelde cellen kemfragmentatie vertoont.

15 Fiouur 8 geeft resultaten weer van een chronische toxidteitstudie bij honden. Bij vergelijking met een placebo werd een duidelijke vermindering van het prostaatgewicht aangetoond na 9 maanden behandeling met Verbinding A.

Figuur 9 geeft resultaten weer van een chronische toxidteitstudie bij honden. Een prostaatgewichtvermindering na herstel van behandeling met Verbinding A in vergelijking 20 met een placebo.

Figuur 10 toont het effect van Verbinding A op met testosteron gestimuleerde blaascelgroei. “hB” = human bladder (blaas bij de mens)

Fiouur 11 toont het effect van Verbinding A en andere comparatorverbindingen op gestimuleerde en basale blaascelgroei. “T10 nM” - testosteron; F 1nM” = finasteride.

25 Fiouur 12 toont het effect van een vitamine D verbinding op blaasgewicht.

Figuur 13 toont het effect van een vitamine D verbinding op spontane niet-lozende contractiefrequentie.

Fiouur 14 toont het effect van een vitamine D verbinding op spontane niet-lozende contractieamplitude.

30 Fiouur 15 toont het effect van een vitamine D verbinding op mictiedruk.

Fiouur 16 toont het effect van een vitamine D verbinding op resterende urine.

Figuur 17 toont het effect van een vitamine D verbinding op de contractiele reacties van blaasstroken op EFS (Electrical Field Stimulation, elektrisch-veldsimulatie).

10271 09 14

VOORBEELDEN

Voorbeeld 1: Effecten van Verbinding A oo BPH-cellen in vitro MATERIALEN en WERKWIJZEN 5 Materialen

Minimum Essential Medium (MEM), DMEM-F12 1:1 mengsel, Ham's F12 medium, met fosfaat gebufferd saline (PBS, Phosphate Buffered Saline), boviene serumalbumine (BSA) fractie V, glutamine, geneticine, collagenase type IV, vitamine D3, testosteron (T), dihydrotestosteron (DHT), cyproteronacetaat, β-nicotinamide adenine dinudeotide 3’-10 fosfaat gereduceerde vorm (NADPH), dithithreitol (DTT), fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en een kit voor het meten van calciëmie werden betrokken van Sigma (St. Louis, MO). De proteïne meetkit kwam van Bio-Rad Laboratories, Ine. (Hercules, CA). Foetaal bovien serum (FBS) werd aangeschaft bij Unipath (Bedford, UK). Monoklonaal anti-rat-clusterine antilichaam (muis monoklonale IgG) specifiek voor bèta-keten was afkomstig 15 van UPSTATE Biotechnology (Lake Placid, NY). Apop Tag kit voor in-situ eindlabeling (ISEL) was afkomstig van Oncor (MD, USA). CHO 1827 en CHO 1829 werden verschaft door Serono International (Genève, Zwitserland). Instagel Plus werd betrokken van Packard (St Louis, MO). Finasteride (pure stof) (17p-(N,t-butyl)carbamoyl-4-aza-5a-androst-1-en-3-one) was een mild geschenk van Merck Sharp & Dohme Research 20 Laboratories (Rahway, NJ). Bicalutamide was een cadeau van AstraZeneca (AstraZeneca, Milaan, Italië). Analogon 1-a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol (Verbinding A) werd verschaft door Bioxell (Bioxell, Milaan, Italië). Keratinocyte groeifactor (KGF) kwam van Pepro Tech EC (Londen, Engeland) en op insuline gelijkende groeifactor-l, humaan, [Des(1-3)IGF-I] werd betrokken van GroPep 25 Limited (Adelaide, Australië). In Situ Cell Death Detection Kit POD voor door terminale-deoxynucleotidyl-transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) [labeling van met TdT bewerkte dUTP-strengbreuk-einde] was afkomstig van Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN). Plastic artikelen voor celkweken werden gekocht van Falcon (Oxnard, CA). Wegwerpfiltreereenheden voor de bereiding van groeimedia werden 30 aangeschaft bij PBI International (Milaan, Italië). Lipofectamine 2000 en Opti-MEM I Medium voor luciferase transfectie kwamen van Invitrogen, Life Technologies (San Giuliano Milanese, Milaan, Italië). Siliciumdioxide platen voor dunnelaag-chromatografie (TLC) werden verkregen van Merck (Darmstad, Duitsland). Testosteronenanthaat (T-enanthaat) kwam van Geymonat (Anagni, Italië). Coat-A-Count® Totale Testosteron 35 detectiekït werd gekocht van Medical System (Genova Struppa, Italië). Rat luteïniserend 10271 09'' 15 hormoon (rLH) [125l] analysesystemen waren afkomstig van Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).

BPH-cellen

Humane BPH-cellen, geprepareerd, bewaard en gebruikt zoals eerder beschreven 5 in de literatuur door Crescioli C, et al., Journal of Cllnical and Endocrinology Metabolism (2000) 85 p 2576-2583, werden verkregen uit prostaatweefsels afkomstig van 5 patiënten die suprapubische adenomectomie voor BPH ondergingen, na verleende toestemming aan de hand van de verstrekte informatie (“informed consent”) en onder goedkeuring van de plaatselijke Ethische Commissie. De patiënten ontvingen generlei farmacologische 10 behandeling in de drie aan de chirurgische ingreep voorafgaande maanden.

5a reductase-aetransfecteerde CHO-1827 en CHO-1829 cellijnen CHO-1827 en CHO-1829 cellen, getransfecteerd met 5a reductase type 1 (5aR-1) respectievelijk type 2 (5aR-2), (zie Steers W. Urology (2001) 58 p 17-24), werden bewaard in Ham's F12 medium aangevuld met 5% FCS.

15 AR-aetransfecteerde PC3 cellijn

Humane prostaat-adenocarcinoom PC3-cellen, stabiel getransfecteerd met de plas-mide p5HbhAR-A bevattende humaan androgeenreceptor (hAR) zoals beschreven in de literatuur (zie Bonaccorsi L, at al. Endocrinology (2000) 141 p 3172-3182), werden gekweekt in 75 cm2 cultuurkolven in Ham’s F-12 medium bevattende 50 pg/ml genetidne, 20 10% FCS, penicilline (100 U/ml) en streptomycine (100 mg/ml).

BPH-weefsel

Prostaatweefsels voor analyse van het bindend vermogen werden verkregen van patiënten die suprapubische adenomectomie voor BPH ondergingen. Er werd geen farmacologische behandeling gegeven in de drie maanden voorafgaande aan de chirurgi-25 sche ingreep. Na de operatie werden de weefsels onmiddellijk in vloeibare stikstof geplaatst en opgeslagen bij -80 °C tot aan bewerking.

Rattenweefsels

Bij ratten werden ventrale prostaatklieren vlug operatief verwijderd, gewogen en snel ingevroren in droog ijs. Immunohistochemische experimenten werden uitgevoerd in 30 14 μνη dikke aanliggende cryostatische secties voor directe vergelijking van weefsel- morfologie, clusterine expressie en localisering van apoptose door TUNEL. Voor totale RNA extractie en “Western blot” analyse, werden ventrale rattenprostaten afkomstig van 4 tot 6 dieren bij elkaar gelegd.

Analyse van BPH-celproliferatie 35 Voor elke celproliferatie-analyse werden 4x104 BPH-cellen uitgezaaid op “12- wellplates” [platen met 12 putjes] in hun groeimedium, uitgehongerd in rood- en serum-vrij 10271 09 16 medium bevattende 0,1% BSA gedurende 24 h, en toen behandeld met specifieke stimuli gedurende 48 h. Cellen in fenolsulfonftaleïne- en serumvrij medium bevattende 0,1 % BSA werden als controles gebruikt. Daarna werden cellen getrypsiniseerd en elk experimenteel punt werd afgeleid van hemocytometerteliing, bij een gemiddelde van tenminste zes 5 verschillende velden voor elke “well”, zoals eerder bericht (zie Crescioli C, et al. Journal of Clinical and Endocrinology Metabolism (2000) 85 p 2576-2583). Experimenten werden uitgevoerd, onder gebruikmaking van toenemende concentraties (10*1S-10'7M) caldtriol of Verbinding A met of zonder een vaste concentratie T (10 nM), KGF of Des(1-3)IGF-I (10 ng/ml). Groeianalyses werden ook uitgevoerd met gebruikmaking van een vaste concen-10 tratie androgenen (10 nM) met of zonder Verbinding A (1 nM, 10 nM) of de anti-andro-genen finasteride (F, 1 nM) en cyproteronacetaat (Cyp, 100 nM). Groeianalyses werden ook uitgevoerd met gebruikmaking van een vaste concentratie T (10 nM) of GF’s (10 ng/ml) met of zonder Verbinding A(10 nM). In hetzelfde experiment, werd elk experimenteel punt herhaald in drievoud of viervoud en experimenten werden 3x uitgevoerd. 15 Resulten zijn uitgedrukt in % variatie (gemiddeld±SEM) over de maximale T- of GF-geïnduceerde stimulatie.

In-situ eindlabelina fISEÜ ISEL werd uitgevoerd op BPH-cellen, gebruikmakend van Apop Tag in-situ apoptose detectiekit peroxydase volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Cellen werden op 20 kweek gezet met T (10 nM), KGF (10 ng/ml) of Des(1-3)IGF-I (10 ng/ml) met of zonder Verbinding A(10 nM). Het percentage apoptose cellen (het aantal gekleurde cellen gedeeld door het totaal aantal cellen) werd berekend in tenminste vijf separate velden per objectglaasje op vijf verschillende glaasjes. Resultaten zijn uitgedrukt in gemiddeld±SEM uit drie separate experimenten.

25 5a reductase inhibitietest 5a reductase inhibitie-analyse werd uitgevoerd met gebruikmaking van CHO 1827 cellen getransfecteerd met 5aR-1, of CHO 1829 cellen getransfecteerd met 5aR-2, zoals beschreven in bestaande literatuur (zie Guarna A, et al. Journal of MedicinaI Chemistry (2000) 43 3718-3735.). Verbinding A werd toegevoegd in een concentratiebereik van 10"® 30 tot 10-5 M, waarbij finasteride gebruikt werd als controle-inhibitor in elk van de experimenten.

Bindinasanalvse

Bindingsanalyse met betrekking tot cytosolfracties van BPH-fragmenten werden uitgevoerd op de eerder beschreven wijze (zie Crescioli C et al. Endocrinology (2003) 144 35 p 3046-3057), (finale proteïneconcentratie: 1,8 mg/ml). Incubaties van cytosolische fracties werden uitgevoerd in toenemende concentraties (0,125, 0,25, 0,5, 1 nM) ^H]- 10271 09 1 17 R1881 (specifieke activiteit: 83,5 Ci/mmol) in afwezigheid of aanwezigheid (pHJ-RI 881:1 nM) van toenemende concentraties koude R1881 (10'1o-10·® M), DHT (10^-10-6 Μ), T (10* 10-10* M), bicalutamide (10'10-10“* M) en Verbinding A (10*10-10“* M). Ter voorkoming van R1881 binding aan progesteronreceptor werd 1 μΜ triamdnolone-acetonide toegevoegd 5 aan elk buisje. Separatie van gebonden en ongebonden ligand werd uitgevoerd zoals beschreven in bestaande literatuur (zie Crescioli C et al. Endocrinology (2003) 144 p 3046-3057). Proteïnegehalte werd bepaald met de bekende werkwijze van Bradförd, onder gebruikmaking van BSA als standaard.

Luciferase-analvse 10 PC3-cellen, stabiel getransfecteerd met humaan AR, werden aangebracht op “24- well plates” bij een dichtheid van 2x104 in Ham’s F12 plus 10% FCS. Na 24 h werden de cellen getransfecteerd met 750 ng/well pLSPP-plasmide, bevattende het “wild(e) type” sequentieconfiguratie van de MMTV-LTR gekoppeld met het glimworm ludferase-gen (zie Pazzagli M. et al. Analytical Biochemistry (1992) 204 p 315-323.), onder gebruikmaking 15 van Lipofectamine 2000 (1 mg/ml) volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Na 48 h werden de cellen op kweek gezet met DHT (10'12-10·® M) of bicalutamide (10^-10*® M), in aanwezigheid van 3 nM of DHT en met equimolaire concentratie van Verbinding A gedurende 18 h. Steroïden en Verbinding A analogon werden opgelost in ethanol. Getrans-fecteerde, met ethanol geïncubeerde cellen dienden slechts als positieve controles.

20 De luciferase-analyse werd uitgevoerd met een Berthold luminometer volgens de aanwijzingen van de fabrikant (Luciferase Assay System, Promega, Milaan, Italië). De cellen werden rechtstreek in de plaat gelyseerd met 200 μΙ lysis-buffer. Luciferase-activiteit werd gemeten op 20 μΙ cel-lysaat gedurende 10 s na toevoeging van 100 μΙ luciferine. Totale proteïnemeting werd uitgevoerd op 20 μΙ cel-lysaat. Tenminste drie los 25 van elkaar staande analyses werden in tweevoud uitgevoerd.

Resultaten

Incubatie van BPH-cellen met toenemende concentraties calcitriol of Verbinding A remt celgroei (Figuur 1 Paneel A). Beide verbindingen inhiberen dosis-afhankelijk 30 celproliferatie. ALLFIT (zie De Lean A, et al. American Journal of Physiology (1978) 235 p E97-E102) analyse gaf aan dat, ofschoon maximale inhibitie van calcitriol en Verbinding A (“Vbd ATCmpd A” in de Figuren ) statistisch niet substantieel verschillend was (lmax-43±1%), hun relatieve potentie dat wèl was, waarbij Verbinding A een aantal log-eenheden effectiever was dan calcitriol (-logICso Verbinding A =15,8±0,3 vs. -logICso 35 calcitriol=10,2±0,6, PO,005).

1027109 ' 18 BPH-celproliferatie werd substantieel verhoogd (P<0,01) door testosteron (T) (156+8%), ert groeifactoren (GF), zoals Des(1-3)IGF-I (194±6%) of KGF (183±5%). Toen celgroei gestimuleerd werd gedurende 48 h met T of GF’s (Figuur 1, Paneel B) was het inhiberende effect van Verbinding A nog uitgesprokener (lmax=66,617,3%). Mathematische 5 modellering (zie De Lean A, et al. American Journal of Physiology (1978) 235 p E97-E102) van inhibitiekrommen gaf aan dat Verbinding A werkzamer was in BPH-cellen gestimuleerd met T (-log ICsoS=16,4±0,6) dan met de andere twee groeifactoren (-log ICsoS=12,7iO,6, en -log 10^=14,2±0,6 voor, respectievelijk, Des(1-3)IGF-I en KGF; P<0.0001).

10 Verbinding A (1 nM) werkte niet alleen T- maar ook DHT-gestimuleerde BPH- celproliferatie tegen in soortgelijke mate als het AR antagonist cyproteronacetaat (Cyp, 100 nM; Figuur 2 Panelen A en B). Omgekeerd werkte de 5a-reductase-inhibitor finasteride (F, 1 nM) alleen T-geïnduceerde celgroei (Figuur 2 Paneel A) tegen. Bovendien verminderde Verbinding A zelfs groei in niet met androgeen gestimuleerde cellen (Figuur 15 2, PaneelA).

Ter evaluatie van potentiële anti-androgeen eigenschappen van Verbinding A naast BPH celgroei-inhibitie, hebben wij de interactie ervan met de AR onderzocht. Eerst hebben wij de mogelijkheid dat Verbinding A zich aan de AR bindt uitgesloten door competitiestudies uit te voeren in humane BPH-homogenaten, door gebruik te maken van 20 synthetisch androgeen [3H]-R1881 als gelabelde ligand. LIGAND analyse (zie Munson PJ et al. Analytical Biochemistry (1980) 107 p 220-239.) van de gegevens gaf aan dat ongelabelde R1881, DHT, T en de AR antagonist bicalutamide [3H]-R1881 binding volledig verdrong (Tabel I). Omgekeerd dong Verbinding A bij geen enkele geteste concentratie mee naar [3H]-R1881 binding (Tabel I). Deze resultaten werden bevestigd en door 25 meerdere gevolgd bij gebruikmaking van een luciferase reportergen-analyse. In PC3-cellen die de volle lengte AR tot expressie brengen, gekoppeld aan een luciferase reportgen (“rapportgen"), stimuleerde DHT een dosis-afhankelijke toename in luciferase-activiteit (ECso=2i1,3 nM, Paneel A), terwijl bicalutamide door DHT gestimuleerde activiteit remde (ICso=194±80 nM, Paneel B). In dit systeem stimuleerde, noch remde, 30 toenemende concentratie van Verbinding A door AR teweeggebrachte luciferase-activiteittoename (Figuur 3). Tenslotte, hebben we, om te verifiëren of Verbinding A wel of niet enigerlei interactie met de vorming van DHT, de actieve metaboliet van T, vertoont, experimenten uitgevoerd in met type 1 en type 2 5a reductase getransfereerde CHO-cellen. Resultaten werden vergeleken met de resultaten verkregen met finasteride (F). 35 Terwijl F conversie van T in DHT inhibeerde met de verwachte IC50S, (IC.® voor 5a 10271 09'' 19 reductase type 1 =659±100 nM en ICso voor 5a reductase type 2, =53,7111 nM, n=3), stoorde Verbinding A geen van beide isoenzymen tot aan het micromolaire bereik (gegevens niet getoond).

5 AR Ligand Affiniteitsconstanten (K<j nmol/l) R1881 0,1610,06 10 DHT 0,0710,03 T 1,8910,94

Bicalutamide 159182

Verbinding A >100000 15

Tabel I Affiniteitsconstanten van androgeen-agonisten (R1881, DHT, T), antagonist (bicalutamide) en Verbinding A in humane BPH-homogenaten zoals gedetecteerd door MR1881 binding.

20

Oe uitwerking van Verbinding A in BPH-cellen was, tenminste gedeeltelijk, toe te schrijven aan activering van geprogrammeerde celdood zoals gedetecteerd door ISEL (n=3, Tabel II). Het percentage apoptotische nuclei nam enorm toe (270%) na een 48 h durende blootstelling aan 10 nM Verbinding A (P<0,01 vs. controle). Omgekeerd 25 reduceerde behandeling met T (10 nM) of GFs (10 ng/ml) het aantal apoptotische BPH-cellen substantieel (P<0,01) in vergelijking met onbehandelde cellen (Des(1-3)IGF-I= -42%; KGF=-54%; T= -27%). Echter, zelfs in aanwezigheid van GF’s of T, Induceerde Verbinding A een duurzame (meer dan 250%) en substantiële (P<0,01) toename in het aantal ISEL-positieve BPH-cellen.

30

Apoptotische index (%) 1027109 20

Controle Verbinding A

Controle 18,55±0,8 68,44±1,26a

Des(1-3)IGF-I 10,69±0,6a 45,85±0,66a ö·c 5 "KGF 85±0,42a 44,46±0,57 ^b·c "T 13,56±0,72a 49,06±1,87a'b,c

Tabel II Effect van Verbinding A (10 nM), GF’s (10 ng/ml) of T (10 nM )op DNA-frag-mentatie in BPH-cellen. Apoptotische index (%) vertegenwoordigt het aantal gekleurde 10 nucleï, zoals gedetecteerd door ISEL, over BPH-cellen in elk van tenminste 5 separate velden per objectdrager Resultaten zijn uitgedrukt in gemiddeld±SEM in drie separate experimenten. Verbinding A is in staat apoptose te induceren in onbehandelde BPH-cellen zowel als in BPH-cellen die gelijktijdig geïncubeerd zijn met GF’s of T (a: P<0,01 vs. controle; b: P<0,01 vs. met Verbinding A behandelde cellen; c: P<0,01 vs. met GF of T 15 behandelde cellen).

Voorbeeld 2: Anti-oroliferatieve eigenschappen Verbinding A in in-vivo modellen van prostaataroei 20 Dierprotocollen

Sprague Dawley mannetjesratten (28 dagen oud) werden betrokken van Charles River Laboratories (Calco, Lecco, Italië). Alle beschreven dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de geaccepteerde dierzorgnormen. Castratie werd uitgevoerd via de scrotale route onder verdoving met ketamine/xylazine. Drie dagen na castratie, 25 werden de ratten (5-8 dieren per groep) al of niet behandeld met T enanthaat (30 mg/kg) met twee separate wekelijkse sc injecties. Ratten werden oraal behandeld gedurende 5 dagen in de eerste week en 4 dagen in de tweede week met vehiculum (miglyol 812), Verbinding A (10, 30, 100 en 300 pg/kg) of finasteride (10 en 40 mg/kg), in totaal 9 toedieningen en een dag later gedood.

30 In een alternatieve proef kregen ongeschonden, volwassen Sprague Dawley mannetjesratten (gewicht 250 g) 5 dagen/week oraal doses toegediend van vehiculum (miglyol 812), Verbinding A (10, 30, 100 en 300 pg/kg) of finasteride (10 en 40 mg/kg) gedurende 5 opeenvolgende weken plus twee extra dagen in de 6**® week, in totaal 27 toedieningen, tenzij anders aangegeven. Bloed voor calcium en hormoonmetingen werd 35 afgenomen aan het eind van elk experimenteel protocol.

1027109 21 “Northem” analyse van hvbridisate

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van RNAFast van Molecular System (San Diego, CA). Blotting, labeling, hybridisatiecondities en sondes (ratdusterine 1,5 Kb volle-lengte cDNA en GAPDH 1,2 Kb volle-lengte cDNA) werden uitgevoerd volgens de 5 gerapporteerde procedures (Bettuzzi et al, Biochemical Journal, (1989), 257. p 293-296 en Marinelli et al, Biochemistry and Cell Biology, (1994), 72, p 515-521). Quantisering van de autoradiógrammen werd verkregen door densitometrische scanning met behulp van een LKB Ultrascan XL densitometer.

Immunohistochemie 10 Alle cryostatische preparaten, verkregen uit controle- en behandelde ratten werden parallel verwerkt zoals beschreven in bestaande literatuur (Astancolle et al, Journal of Endocrinology, (2000), 167, p 197-204). Voor elke experimentele conditie werden 3 wisselende preparaten van 3 verschillende ratprostaten onderzocht Negatieve controles, gemaakt door specifieke antllichamen uit te sluiten van de reactie, lieten geen specifieke 15 verkleuring zien. Contrasterende kleuring werd verricht met hematoxyline en afdekhoesjes werden bevestigd met Eukitt (O. Kindler GmbH & Co, Duitsland). Digitale sterk vergrote kleurenbeelden werden via de microscoop verkregen door middel van een CCD-camera.

In situ DNA-fraamentatie analyse (TUNEL) DNA-fragmentatie in cryostatische preparaten van de prostaat, bepaald via door 20 terminale-deoxynudeotidyl-transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) [labeling van met TdT bewerkte dUTP-strengbreuk-einde]. werd uitgevoerd met gebruikmaking van de In Situ Cell Death Detection Kit (POD, Roche) zoals aanbevolen door de fabrikant. TUNEL positieve apoptotische nuclei werden gedocumenteerd door middel van digitale sterk vergrote kleurenbeelden, verkregen met een CCD-camera via de 25 microscoop. Contrasterende kleuring werd uitgevoerd met eosine en afdekhoesjes werden bevestigd met Eukitt (O. Kindler GmbH & Co, Duitsland).

Calciummetinaen

Serum-calciumniveaus werden gemeten met een in de handel verkrijgbaar colori-metrisch analyse-apparaat (Sigma), volgens de aanwijzingen van de fabrikant.

30 Testosteron- en rLH-metina

Serumniveaus van T en rLH-hormonen werden bepaald met in de handel verkrijgbare radioimmuno-analyse-kits, volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Voor het meten van serum T in ratten, werden monsters eerst toegevoegd aan 4 volumina diëthylether, gemengd door geleidelijke inversie gedurende 15 min en vervolgens gecentrifugeerd 35 gedurende 5 min bij 2000 omw/min. De waterige fase werd bevroren in droog ijs en de organische fase werd teruggewonnen en door verdamping gedroogd onder een stikstof- 1027109 " 22 stroom. Het gedroogde extract werd gereconstitueerd in de analysebuffer, als volgt: (1 vol: 1 vol) in ongeschonden rat en (4 vol: 1 vol) in gecastreerde ratten.

Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met enkelvoudige variantie-analyse en, indien 5 van toepassing, gepaarde of ongepaarde Student-t- toetsen. Bindingsdata werden geanalyseerd met gebruikmaking van het computer-bestuurde programma LIGANO (Munson et al, Analytical Biochemistry, (1980), 107, p 220-139).

Het computerprogramma ALLFIT (DeLean et al, American Journal of Physiology, (1978), 235, p E97-E102) werd gebruikt voor de analyse van sigmoïde dosis-responsieve 10 krommen ter verkrijging van schattingen van half-maximale inhibitiewaarden (ICso) en half-maximale stimulerende waarden (ECso) evenals maximale remmende (Uk) en stimulerende (Emax) effecten. Gegevens werden uitgedrukt als (gemiddeldlSEM).

Resultaten 15 Voor het testen van de anti-proliferatieve eigenschappen van Verbinding A in in wvo modellen van prostaatgroei, kregen gecastreerde en ongeschonden ratten toenemende concentraties van Verbinding A (10-30Ö pg/kg) or finasteride (F) (10, 40 mg/kg) oraal toegediend. Zoals Figuur 4, Paneel A, laat zien reduceerde castratie het gewicht van de ventrale prostaat aanziendlijk, terwijl een twee weken durende behandeling met 20 testosteron (T) enanthaat (30 mg/kg) de groei ervan niet alleen volledig herstelde, maar zelfs verder stimuleerde. Bij elke geteste dosis, zwakte Verbinding A door T gestimuleerde excessieve prostaatgroei volledig af, daarbij het gewicht van de ventrale prostaat reducerend tot onder dat van onbehandelde ratten. Overeenkomstige resultaten werden verkregen met finasteride (10, 40 mg/kg). Een één maand durende behandeling van 25 ongeschonden volwassen ratten met Verbinding A verlaagde het gewicht van de ventrale prostaat substantieel, met een maximale reductie (30%) bij de hoogste geteste dosis (300 pg/kg). Bij deze dosis was de remmende uitwerking van Verbinding A op prostaatgroei vergelijkbaar met die welke geïnduceerd was door 10 of 40 mg/kg finasteride (Figuur 4, Paneel B). In alle experimentele protocollen veroorzaakte orale toediening van 30 verschillende doses Verbinding A een zeer bescheiden hypercalciëmie slechts bij de hoogste geteste dosis (300 pg/kg) (Tabel III). Geen andere waarneembare neveneffecten werden gevonden.

1027109 23 calciëmie

Controle 10,2 ±0,16 :

Verbinding A10 pg/kg 10,16 ± 0,24

Verbinding A 30 μg/kg 9,87 ± 0,15

Verbinding A100 pg/kg 10,55 ± 0,18

Verbinding A 300 μg/kg 10,85 ± 0,1

Tabel III Calciëmie (mg/dl) in gecastreerde ratten met teruggeplaatst T na verschillende doses (10, 30,100, 300 pg/kg) Verbinding A. Verbinding A veranderde in geen enkel geval 5 de caicium-serumniveaus in gecastreerde ratten waarin T-enanthaat (30 mg/kg/week)was teruggeplaatst, vergeleken met controles. Overeenkomstige resultaten werden verkregen in ongeschonden ratten (niet weergegeven). Resultaten vertegenwoordigen het gemiddeld±SEM van ratten/groep.

10 Voor een beter begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de door Verbinding A geïnduceerde prostaatgewichtreductie, werden de expressie van clusterine-gen en -proteïne en de morfologische kenmerken van apoptose geëvalueerd met door door terminale-deoxynucleotidyl-transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUIMEL) [labeling van met TdT bewerkte dUTP-strengbreuk-einde]. 15 Clusterine is een alomtegenwoordig productgen, strict gerelateerd aan celcydus-stilstand en atrofre, de expressie waarvan omlaag geregeld wordt door androgenen. Figuur 5 Paneel A toont de prostaatexpressie van clusterine mRNA zoals gedetecteerd door de Northern analyse in georchidectomiseeide ratten, al of niet gesupplementeerd met T. Castratie heeft clusterine mRNA abondantie enorm omhoog geregeld, terwijl dit effect 20 volledig omgekeerd werd door een twee weken durende toediening van T. De gelijktijdige behandeling met verschillende concentraties Verbinding A (300 en 100 pg/kg) of F (40 mg/kg) heeft de door T geïnduceerde omlaagregeling van clusterine-genexpressie gedeeltelijk afgezwakt. In ongeschonden ratten (Figuur 5 Paneel B), induceerde een de toediening gedurende één maand van verschillende concentraties Verbinding A (30 en 25 100 pg/kg) een aanhoudende toename van clusterine-genexpressie in de prostaat, vergelijkbaar, of zelfs hoger, dan die welke door 40 mg/kg F werd geïnduceerd.

De loklale expressie van clusterine in de prostaat van georchidectomiseerde ratten is weergegeven in Figuur 6. Castratie induceerde een opvallende en wijdverbreide atrofie in de prostaat, en bijna alle cuboïdale epitheliale cellen tegenover de klierlumen waren 10271 09 24 clusterinepositief (Paneel A). T-terugplaatsing (Paneel B) keerde de morfologische kenmerken van atrofie om en reduceerde consistent clusterineverkleuring. Een dergelijk effect werd voorkomen door de gelijktijdige toediening van Verbinding A (Panelen C en £). Panelen D en F laten TUNEL resultaten zien in preparaten grenzend aan die welke 5 weergegeven zijn in Panelen C en E. Behandeling met Verbinding A (100 μg/kg, Paneel D en 300 μg/kg, Paneel F) induceerde een duidelijke kemfragmentatie in epitheliale en stromale cellen, en apoptose was detecteerbaar in zowel clusterine-positieve als -negatieve cellen. De eerste twee Panelen van Figuur 7 tonen de morfologie van de prostaat van een ongeschonden rat, bewerkt voor clusterinedetectie, met (Paneel A) of zonder 10 (Paneel B) weglating van het primaire antilichaaam. Let erop dat dusterine labeling nagenoeg afwezig is in de prostaat van onbehandelde volwassen ratten (Paneel B), aangezien het kemfragmentatie (TUNEL, Paneel C) is. Omgekeerd induceerde behandeling met verschillende doses Verbinding A dusterine-expressie (Panelen D-F) en apoptose (C, G en I). Paneel F toont ter vergelijking het effect van finasteride (40 mg/kg) 15 op clusterine-positiviteit in de prostaat.

Om de mogelijkheid uit te sluiten dat Verbinding A in vivo prostaatgroei reduceerde door de hypofyse- of testisfunctie te beïnvloeden, werden rat-luteïniserend hormoon-(rLH) en T-serumniveaus gemeten in gecastreerde en ongeschonden ratten. Zoals verwacht (Tabel IV, Paneel A), reduceerde castratie T substantieel terwijl het rLH-serum 20 niveaus verhoogde. Toediening van T-enanthaat (30 mg/kg) gedurende twee weken heeft het effect van orchidectomie volledig omgekeerd. Orale behandeling, met Verbinding A (100 en 300 pg/kg), van gecastreerde ratten met teruggeplaatst T heeft rLH of T-serum niveaus niet substantieel beïnvloed. Overeenkomstige resultaten werden verkregen in ongeschonden ratten (Tabel IV, Paneel 6). In feite heeft langdurige toediening (1 maand) 25 van Verbinding A (10,30,100 pg/kg) of F (40 mg/kg) aan ongeschonden ratten de rLH- en T-serumniveaus niet veranderd.

Paneel A

rLH pf controle (ongeschonden ratten) 2,36 ± 0,46 11,5 ±2,44 gecastreerd 20,64 ± 6* 0,9 ± 0,32* gecastreerd+T-teruggeplaatst 2,08 ± 0,36 21,25 ±4,12 gecastreerd+T-teruggeplaatst 1,8 ±0,2 11,13 ± 1,02 +Verbinding A100 pg/kg 10271 09 25 gecastreerd+T-teruggeplaatst 3,15 ±0,65 15,73 ±2,75 ♦Verbinding A 300 pg/kg

Paneel B

[_ Pf 1 controle (ongeschonden ratten) 2 ±0,16 11,98 ± 2,87

Finasteride 2.2 ± 0,4 18,11 ±3,23

Verbinding A10 μg/kg 2.22 ± 0,25 19,13 ±3,83

Verbinding A 30 μg/kg 2.32 ± 0,36 9,39 ± 2

Verbinding A100 μg/kg 1.96 ±0,13 11 ±2,14 5 Tabel IV rLH- (ng/ml) en T- (nM) serumniveaus in gecastreerde (Paneel A, T-terug-geplaatst) of ongeschonden (Paneel B) ratten na behandeling met verschillende doses van Verbinding A. Paneel A. Castratie heeft serum T (*P<0.01 vs. controle) substantieel gereduceerd terwijl serum rLH (*P<0.05 vs. controle) erdoor is toegenomen . Na behandeling met T-enanthaat (30 mg/kg/week) werden de rLHen T-serumniveaus 10 hersteld. Bij alle geteste doses heeft Verbinding A geen substanüële invloed gehad noch op rLH- noch op T-serumniveaus. Paneel B langdurige toediening (1 maand) van F (40 mg/kg) of Verbinding A (10, 30 en 100 pg/kg) bracht geen veranderingen teweeg, noch in rLH- noch in T-serumniveaus, in ongeschonden ratten.

15 Deze studie toont aan dat Verbinding A de prostaatomvang in ongeschonden ratten reduceert in een met finasteride vergelijkbare mate. Bovendien maakt Verbinding A, net als finasteride, een einde aan de in vitro en in vivo proliferatieve activiteit van testosteron. Maar in tegenspraak met finasteride heeft Verbinding A geen remmend effect op type-1 of type-2 5a-reductase activiteit en kan hij niet alleen door T, maar zelfs ook door DHT, 20 geïnduceerde BPH-celgroei tegengaan. Deze anti-androgene eigenschappen van Verbinding A zijn onafhankelijk van interactie met de AR, zoals blijkt uit het feit dat Verbinding A geen verbinding vormt met AR en niet optreedt als AR-agonist of antagonist in AR-getransfecteerde PC3-cellen. Verder heeft Verbinding A geen invloed op gesiachts-hormoonsecretie omdat, in de rat, gonadotropine- en T-plasmaniveaus onveranderd 25 bleven bij dagelijkse toediening van Verbinding A gedurende maximaal één maand. Bijgevolg werkt Verbinding A stroomafwaarts ten opzichte van de AR receptor-ligand 1027109 26 interactie. Zonder gebonden te willen zijn aan enige theorie geldt dat deze actie zeer waarschijnlijk plaatsvindt via de disruptie van testosteron-groeifactor overspraak.

Zeer lage concentraties Verbinding A bleken in staat om niet alleen door T gestimuleerde BPH-celproliferatie volkomen te neutraliseren, maar ook proliferatie 5 geïnduceerd door de twee belangrijkste intra-prostaat groeifactoren: IGF-I en KGF. Bovendien induceerde Verbinding A, zelfs in aanwezigheid van T of GFs, apoptose in BPH-cellen. Het door Verbinding A geïnduceerde afsterfprogramma was ook zichtbaar in de prostaat van zowel ongeschonden als met T gesupplementeerde, georchi-dectomiseerde ratten en was gekenmerkt door de diffuse verschijning van DNA-10 fragmentatie met een daarmee gepaard gaande toename in dusterine-gen- en proteïnë-expressie. Clusterine is een in de prostaat strak door androgenen gereguleerde proteïne (Bettuzzi et al, BiochemicaI Journal, (1989), 257. p 293-296). Ofschoon men de dusterinefunctie nog steeds niet goed begrijpt, wordt deze duidelijk omhoog geregeld in omstandigheden van klieratrofie (Bettuzzi et al, Oncogene, (2002), 21, p 4328-4334 en 15 Bettuzzi et al, Journal of Endocrinology, (1992), 132. p 361-367) en apoptose (Leskov et al, Journal of Biological Chemistry, (2003), 278. p 11590-11600). Daarom is dusterine-inductie door behandeling met Verbinding A consistent met het vermogen van deze verbinding om proliferatie te inhiberen en apoptose te induceren in prostaatcellen.

Concluderend wijst deze studie erop dat Verbinding A effectief prostaatcelgroei 20 reduceert in verschillende experimentele modellen.

Voorbeeld 3: Reductie van prostaatgewicht in gezonde honden, behandeld met Verbinding A.

25 Een over een periode van 9 maanden gehouden toxiciteitstudie werd uitgevoerd bij vier groepen Beagle reuen, die behandeld werden met. een dagelijkse, oraal via een buisje toegediende hoeveelheid van 0,5 //g, 1,5 μ$ en 5 //g/kg lichaamsgewicht/dag van Verbinding A (in vehiculum Miglyol 812) of met het vehiculum alleen. Deze behandeling werd gevolgd door een herstelperiode van twee maanden voor groep die de hoogste 30 doses toegediend kreeg, nl. 5 μ$, waarna het prostaatgewicht werd gemeten. Naast over de hele linie gunstige toxiciteitsdata, werd een lager prostaatgewicht waargenomen aan het eind van de behandeling met Verbinding A (zie Figuur 8) en na herstel (zie Figuur 9). De resultaten na herstel werden statistisch geanalyseerd via een Student-t-toets; zij bleken substantieel te verschillen tussen Verbinding A en vehiculum (P<0,05). Deze 35 resultaten geven nog meer blijk van het vermogen van Verbinding A tot het reduceren van de prostaatomvang in vivo.

1027109 27

Voorbeeld 4: Orale doserinasvorm: zachte gelatine capsule

Een capsule voor orale toediening wordt onder stikstof, bij amberkleurige verlichting, bereid uit 0,01 tot 25,0 mg Verbinding A in 150 mg gefractioneerde kokosolie (bijv. Miglyol 5 812), met 0,015 mg gebutyleerde hydroxytolueen (BHT) en 0,015 mg gebutyleerde hydroxyanisole (BHA), ingebracht in een zachte gelatine capsule.

De capsule wordt bereid door middel van het volgende proces: 1. BHT en BHA worden gesuspendeerd In gefractioneerde kokosolie (bijv. Miglyol 812) en al roerend verwarmd tot ongeveer 50 °C, totdat ze opgelost zijn.

10 2. Verbinding A wordt opgelost in de oplossing van stap 1, bij 50 °C.

3. De oplossing van stap 2. wordt afgekoeld tot kamertemperatuur.

4. De oplossing van stap 3. wordt als vulling aangebracht in zachte gelatine capsules.

Alle bereidingsstappen worden uitgevoerd in een stikstofatmosfeer en afgeschermd van 15 natuurlijk licht.

Voorbeeld 4A: Orale doserinasvorm:t zachte gelatine capsules

Een capsule voor orale toediening wordt samengesteld onder stikstof bij amberkleurige verlichting: 150//g Verbinding A in 150 mg gefractioneerde kokosolie (Miglyol 20 812), met 0,015 mg gebutyleerde hydroxytolueen (BHT) en 0,015 mg gebutyleerde hydroxyanisole (BHA), als vulling aangebracht in een zachte gelatine capsule.

Voorbeeld 4B: Orale doserinasvrom: zachte gelatine capsules

Een capsule voor orale toediening wordt samengesteld onder stikstof bij amber-25 kleurige verlichting: 75//g Verbinding A in 150 mg gefractioneerde kokosolie (Miglyol 812), met 0,015 mg gebutyleerde hydroxytolueen (BHT) en 0,015 mg gebutyleerde hydroxy-anisool (BHA), als vulling aangebracht in een zachte gelatine capsule.

Voorbeeld 5: Reductie in prostaataewicht bii humane klinische onderzoeken fclinical trials) 30 Een gerandomiseerde dubbelblind onderzoek met controle door placebo verstrek king aan parallel groep werd uitgevoerd ter bepaling van het effect van Verbinding A (1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalcifeiOl) op patiënten met BPH.

Het voornaamste toelatingscriterium was dat bij mannelijke patiënten BPH 35 gediagnosticeerd was en het prostaatvolume > 40 ml was volgens de bepaling met transrectaal ultrageluid (TRUS).

1027109 28

Statistische methodes: primaire werkzaamheidsanalyses werden gepland voor Per-Proto-col (PP) Populatie en ter ondersteuning dienden dezelfde analyses te worden uitgevoerd op Intent-to-treat (ITT) populatie. Voor de Per-Protocol analyse evalueerbare patiënten waren allen gerandomiseerde patiënten die voldeden aan protocolcriteria en het hele 5 traject van de studie aflegden zonder belangrijke protocol-inbreuken en op wie geldige schattingen van prostaatvolume van toepassing zijn. Patiënten die in aanmerking kwamen voor “Intent-to-treat (ITT) populatie” [zij die van plan zijn behandeling te ondergaan] waren allen willekeurige patiënten die tenminste één dosis proefmedicatie ontvingen en van wie het prostaatvolume beschikbaar was bij de start (“baseline”) en bij visite na 12 weken.

10 Alle gerandomiseerde patiënten die tenminste één dosis van het studiemedicijn werden geëvalueerd voor veiligheidsanalyse.

De vergelijkbaarheid van de behandelingsgroep werd vastgesteld bij aanvang voor alle patiënten met beschrijvende statistische inhoud. De gegevens werden verwerkt door middel van de chi-kwadraattoets voor de categorische variabelen en met het variantie-15 analysemodel (ANOVA) voor de continue variabelen.

Beschrijvende statistieken werden berekend door middel van gebruikelijke methodes: gemiddelde, standaardafwijking, minimum- en maximumwaarden met betrekking tot continue variabelen en absolute en relatieve frequenties voor categorische variabelen. Beschrijvende statistieken werden bepaald per behandeling en per bezoek/weken.

20 Centra met minder dan 4 patiënten werden (in een pool) samengebracht.

De primaire werkzaamheidvariabele was het percentage verandering in prostaatvolume, gemeten door gecentraliseerde MRI axiale scanning. Een variantieanalysemodel (ANOVA) werd gebruikt voor de analyse, met behandeling en centrum als vaste effecten.

25 Deelnemers in de studie ontvingen de150 //g capsule (als in Voorbeeld 4A, met weglating van medicijn bij placebo), eenmaal daags, in de ochtend. De behandelings-periode was 12 weken. Het aantal betrokken patiënten was als volgt: 1027109 29

Verbinding A Placebo Totaal

Gerandomiseerde patiënten 57 62 119 “Complete" patiënten 56 (98,3%) 60 (96,8%) 116 (97,5%)

Afgebroken of onbereikbaar 0 2(3,2%) 2(1,7%) voor follow-up

Onbevredigend therapeutisch 1 (1,8%) 0 1 (0,8%) effect

Percentaae-veranderina in prostaatvolume gemeten met axiale scanning

De percentage-verandering in prostaatvolume in de PP-populatie was -1,89+5,2 in 5 Verbinding-A-groep vs. 4,99 + 5,99 in de placebogroep met een substantiële p-waarde van <0,0001 in het voordeel van Verbinding A. De geschatte waarde van het verschil tussen de behandelingen (Verbinding A minus placebo) was -7,24 met 95% betrouwbaar-heidsgrens van -9,54 en -4,94. Het centrumeffect was eveneens substantieel (p=0,0176). Dezelfde analyse uitgevoerd op de ITT-populatie bevestigde de resultaten (p=0,0001), 10 d.w.z. dat Verbinding A effectiever was dan de placebo in het reduceren van het prostaatvolume.

Bij patiënten met een aanvangsprostaatvolume >=80 ml was het verschil tussen de behandelingsgroepen duidelijker (p=<0,0001) in vergelijking met patiënten met een aanvangsprostaatvolume <60 ml (p=0,0320) speciaal in de PP-populatie.

15 Bij patiënten in de leeftijd tussen 61-70 jaar was het verschil tussen de behandelingen, steeds in het voordeel van Verbinding A, was meer evident dan ten aanzien van oudere patiënten (leeftijd>70 jaar). In feite had in de ITT-populatie het verschil tussen de behandelingen bij patiënten in de leeftijdsgroep >70 een significantie van p=0,0540 vs. p=<0,0001 voor de andere patiëntcategoïieën.

20 Responderende patiënten

In de PP-populatie was het aandeel van responderende patiënten waargenomen bij Verbinding A 27,5%, met een aandeel van 65% onveranderde, en slechts een percentage van 7,5 niet-responderende patiënten. In de placebogroep was de categorie respondererende patiënten nihil; in feite waren patiënten gelijkelijk verdeeld in 25 onveranderde en niet-responderende (50% in elk van beide categorieën). De chi-kwadraat test ter vergelijking van de aandelen bevestigde de in de primaire werk-zaamheidvariabele waargenomen resultaten, p=<0,0001; d.w.z. dat Verbinding A effectiever was dan de placebo in het reduceren van het prostaatvolume.

1027109 30

In de ITT-populatie werden de resultaten bevestigd, waarbij het aandeel respon-dererende patiënten in de Verbinding-A-groep 28,8% was, met een chi-kwadraat p-waarde van <0,0001 tussen de behandelingen.

In de PP-populatie was de gemiddelde reductie van het prostaatvolume vs. het 5 aanvangsvolume bij responder-patiënten -6,88 ±2,5, terwijl het gemiddelde verschil in onveranderde patiënten -0,35±2,3 was in de Verbinding-A-groep vs. 0,40±2,0 in de place-bogroep. Bij niet-responderende patiënten was het gemiddelde verschil 3,93±0,8 in de Verbinding-A-groep vs. 7,48±4,9 in de placebogroep, hetgeen een bevestiging is van de grotere effectiviteit Verbinding A in het beheersen en reduceren van het prostaatvolume.

10 Percentaae-veranderina van prostaatvolume gemeten door middel van gecentraliseerde paraxiale en transitionele scanning

De ondersteunende analyses van paraxiale en transitionele acquisitie bevestigden de uit axiale scanning verkregen resultaten. Met name was in de PP-populatie de percentage-verandering voor paraxiale acquisitie -1,30±6,9 in de Verbinding-A-groep vs. 2,57±6,8 in 15 de placebogroep, p=0,0172; terwijl voor transitionele scanning de percentageverandering -0,22±9,6 was voor de Verbinding-A-groep vs. 6,18±10,9 voor de placebogroep, p=0,0028. Ook bestond er in de ITT-populatie een substantieel verschil tussen de behandelingen ten gunste van Verbinding A in het reduceren van het prostaatvolume. Serum totaal PSA en hormoonniveau 20 De PSA gemiddelde verandering bedroeg voor de PP-populatie in de Verbinding-A-groep 0,23±1,3 vs. 0,43±1,7 in de placebogroep. Geen substantieel verschil werd waargenomen tussen de behandelingen (p=0,2722).

Ook voor testosteron was er in de PP-populatie geen substantieel verschil tussen de groepen (p=0,2150), met een gemiddelde verandering van 0,07±1,5 in de Verbinding-A-25 groep vs. 0,22±1,4 in de placebogroep.

Er was geen verschil tussen de behandelingsgroepen voor dihydrotestosteron (p=0,7257 -PP-populatie), met een waargenomen gemiddelde verandering in de PP-populatie van -30,77±227,71 in de Verbinding-A-groep vs. -166,76±490,26 in de placebogroep.

Er was geen verschil in LH-hormoon (p=0,9320 - PP-populatie), met een gemiddelde 30 verandering in de Verbinding-A-groep van -0,02±1,7 vs. -0,00±1,8 in de placebogroep voor de PP-populatie.

De gemiddelde veranderingen waargenomen in PSA en in hormoonniveaus was circa nul, utgezonderd DHT, Verbinding A wijzigt hormoonniveaus niet.

Dezelfde resultaten werden bevestigd in de ITT populatie.

35 1027109 31

Veiligheid

Het aantal patiënten met tenminste één optredende bijwerking bedroeg 31 (17 in de Verbinding-A-groep, 14 in de placebogroep); geen van de patiënten kon niet meer meedoen vanwege optredende bijwerkingen, en slechts één patiënt in de plaoebogroep 5 kreeg te maken met een ernstig ongewenst voorval: een acute colecystitis, met succes behandeld in het ziekenhuis.

Het aantal patiënten met aan de Verbinding-A-behandeling gerelateerde bijwerkingen was 3 (5,26%), terwijl het aantal patiënten met aan de placebobehandeling gerelateerde bijwerkingen 6 bedroeg (9,68%) in de placebogroep. De aan Verbinding A gerelateerde 10 bijwerkingen waren: duizeligheid, hoofdpijn, libidodaling en opvliegers; de aan placebo gerelateerde ervaringen waren: toename van urinefosfaat, hoofdpijn, syncope, libidodaling (3 patiënten), hypercalciurie, erectiestoomis en opvliegers.

De in de loop van de studie vastgestelde calciuriewaarden in de Verbinding A groep verschilde niet in belangrijke mate van die van de placebogroep.

15

Conclusie

In dit korte conceptbeproevingsonderzoek naar de uitwerking van Verbinding A op de prostaatomvang bij patiënten met BPH is het medicament werkzaam gebleken. De analyse van de primaire variabele van de studie, namelijk de evaluatie van de pro-20 staatomvang, liet een substantieel verschil zien tussen Verbinding A en placebo, waardoor bevestigd werd dat het geteste medicijn in staat is voortschrijding van de aandoening te stoppen. Het veiligheidsprofie! was goed, er was geen verschil in het optreden van bijwerkingen tussen Verbinding A en placebo, en in de Verbinding-A-groep is geen melding gemaakt van ernstige bijwerkingen. Het onderzochte medicijn was vrij van 25 enigerlei anti-androgenisch effect, had geen effect op PSA-niveaus en geen substantiële invloed op de calciumhomeostase.

Voorbeeld 6: De activiteit van Verbinding A oo de groei en functie van blaascellen

Verbinding A is effectief gebleken in het inhiberen van de basale en door 30 testosteron gestimuleerde groei van blaascellen. Deze nooit eerder gemelde activiteit is dosis-afhankelijk met een 1,6±7x10'15 voor 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23e-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol (Verbinding A, "Vbd A7 "Cmpd A" in de figuren) (aangaande gestimuleerde cellen) (zie Figuur 10 en Figuur 11).

35 Dit effect was substantieel groter dan dat van het anti-androgeen finasteride, dat wijd en zijd gebruikt wordt in de behandeling van uro-genitale aandoeningen (Figuur 11).

1027109 32

Voorbeeld 7: Het effect van Verbinding A op blaasdisfunctie in een blaasurtaanas-obstructiemodel Experimenteel 5 1. Materialen 1.1. Dieren:

Sprague-Dawley vrouwtjesratten met een gewicht van 200 è 250 g 1.2. Groepering

Groep A: BOO ratten, behandeld met Verbinding A gedurende 2 weken, beginnend op dag 10 1 na het creëren van de obstructie (n=12)

Groep B: BOO ratten, behandeld met vehiculum gedurende 2 weken, beginnend op dag 1 na het creëren van de obstructie (n=12)

Groep C: Ratten die een schijnoperatie ondergingen, behandeld met Verbinding A gedurende 2 weken, beginnend op dag 1 na de chirurgische ingreep (n=12) 15 1.3. Studies: a) Cystometrie (—18 h na laatste toediening van het geneesmiddel/vehiculum, 12 h na verwijdering van de belemmerende ligatuur) waarbij het dier wakker was.

b) Metingen van blaasgewicht c) In vitro inderzoeken 20 2. Werkwijzen 2.1. Bladder Outlet Obstruction (BOO, blaasuitgangsobstructie):

De blaas en ureter-blaasovergang werden blootgelegd door een in het onderabdomen aangebrachte middellijnindsie. Een 0,9 mm metalen staafje werd langs de proximale urethra geplaatst en een 3-0 zijden ligatuur werd strak gebonden om de urethra en het 25 staafje, dat dus werd verwijderd. Er werd dienovereenkomstig ter Gontrole een schijnoperatie ('sham surgery”) uitgevoerd, zonder het plaatsen van de ligatuur. Na 13 dagen werd de ligatuur verwijderd en een catheter ingébracht in de blaaskoepel en subcutaan getunneld.

2.2. Cystometrie 30 Op de morgen volgend op het inbrengen van de catheter werd het cystometrische onderzoek uitgevoerd zonder enige anesthesie of insluiting in een metabolische kooi. De hoeveelheid geloosde urine werd gemeten door middel van een, op een krachtverplaatsings-opnemer aangesloten, vloeistofverzamelaar. De blaas werd doorlopend gevuld met saline (fysiologische zoutoplossing) op kamertemperatuur. De catheter werd tevens aangesloten 35 op een drukopnemer. Na een stabilisatieperiode van 30-60 min, wanneer reproduceerbare lozingspatronen bereikt zijn, werden de volgende parameters geregistreerd 1027109 33 gedurende een periode van 30 min: basale blaasdruk, mictiedruk, drempeldruk, mictie-interval en -volume en niet tot lozing leidende contracties. De hoeveelheid resterende urine werd 3 keer handmatig onderzocht, aan het eind van de cystometrische bepalingen. Blaascapaciteit werd berekend op basis van de gemeten waarden.

5 2.3. Onderzoeken in vitro 2.3.1. Preparaten.

Na voltooiing van de cystometrische bepalingen, werden de ratten opgeofferd door verstikking met koolmonoxide, gevolgd door verbloeding. Tot de buik werd toegang verkregen door een onderste middellijn incisie waarna de symphysis werd geopend. De blaas 10 werd zorgvuldig vrij gemaakt, en onmiddellijk in gekoelde Krebs-oplossing gebracht, en er werden strookpreparaten uitgesneden.

2.3.2. Het opnemen van mechanische activiteit

De blaas en urethra werden gescheiden op het niveau van de blaashals, en stroken in de vorm van halve cirkels werden geprepareerd uit het middelste derde deel van de detrusor 15 (1x2x5 mm). Alle preparaten werden onmiddellijk na verwijdering gebruikt.

De stroken werden naar 5 ml weefselbaden met Krebs-oplossing overgebracht. De Krebs-oplossing werd op 37 °C gehouden en borrelde continu met een mengsel van 95 % 02 en 5 % C02, resulterend in een pH van 7,4. De stroken werden opgehangen tussen twee L-vormige haken met behulp van zijden ligaturen. Eén haak werd verbonden met een 20 beweegbare eenheid waarmee instelling van passieve spanning mogelijk was, en de andere haak werd verbonden met een Grass FT03C (Grass Instruments Co, MA, USA) krachtopnemer. Isometrische spanning werd geregistreerd met een Grass polygraph [grafische recorder] (7D). Na installatie werden de stroken uitgerekt tot een passieve spanning van 4 mN (dezelfde spanning bij alle preparaten) en werd hun toegelaten een 25 evenwicht te bereiken gedurende 45-60 min alvorens verdere experimenten werden verricht.

2.3.3. Elektrische-veid-stimulatie

Electrical field stimulation (EFS) werd tot stand gebracht door middel van twee, aan beide kanten van de preparaten geplaatste, platina elektrodes en werd verricht onder gebruik-30 making van een Grass S48 of S88 stimulator, waarbij afzonderlijke vierkante golf impulsen met geselecteerde frequenties werden afgegeven. De duur van de impulstrain was 5 s, de impulslengte 0.8 ms, en het interval tussen stimulaties 2 min. De polariteit van de elektrodes werd na elke impuls veranderd door middel van een eenheid voor het wisselen van polariteit.

35 1027109 34 2.3.4 Procedure

Elk experiment werd gestart door de preparaten bloot te stellen aan een hoge K* (124 mM) Krebs-oplossing totdat twee reproduceerbare contracties verkregen worden. Daarna werden de volgende experimenten uitgevoerd: S a) Elektrische stimulering van zenuwen vond plaats en frequentie-reactie relaties werden verkregen, in aanwezigheid en afwezigheid van atropine, b) Er werden concentratie-reactie grafieken voor carbachol en ATP opgesteld.

Resultaten

Het hierboven beschreven, gevalideerde model voor blaasuitgangsobstructie bij 10 ratten werd gebruikt om het vermogen van Verbinding A tot het beheersen en behandelen van blaasdisfunctie te testen. Het doel was om te evalueren of een vitamine D3 analogon (1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23e-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol - verbinding “A”) bij de dosis ten bedrage van 150 pg/kg/dagelijks) blaashypertrofie en blaasdisfunctie, zoals overactiviteit van de blaas, kan voorkomen.

15 In dit model werd operatief een ligatuur geplaatst om de uitgang van de gecathe- teriseerde blaas, zodat wanneer de catheter verwijderd werd, de blaas een verhoogde weerstand van de urethra ondervond. De ratten werden voortdurend aan blaascapadteit-en -drukmeting onderworpen om de blaasfunctie te evalueren. Bovendien werden con-tractie-eigenschappen van geïsoleerde-blaaspreparaten bij reactie op neurostimulatie en 20 exogene prikkels in vitro onderzocht onder elektrische veld stimulatie (EFS, electrica! field stimulation).

De volgende cystometrische parameters werden onderzocht (zie Figuur 12-16): - mictiedruk (de maximum blaasdruk gedurende het urineren), - blaascapaciteit (resterend volume na lozing plus het volume saline, dat geïnfundeerd 25 werd om de lozing te bewerkstelligen) - mictievolume (volume van de uitgedreven urine) - resterende urine (blaascapaciteit minus mictievolume) en -frequentie en amplitude van spontaan optredende veranderingen in druk binnen de blaas 30 (non-mictiecontracties).

In dit model had het te evalueren analogon een gunstig effect op de blaasfunctie. Dit effect was evident in de normale blaas en wordt gehandhaafd bij obstructie van de blaasuitgang. In het bijzonder werden er substantiële verschillen tegenover het vehiculum waargenomen ten aanzien van: 35 - frequentie en amplitude van spontane non-mictiecontractie (Figuur 13 en 14); - resterende urine (afwezig bij Verbinding A, Figuur 16); 1(12.71 09 " 35 - mictiedruk (Figuur 15);

Bovendien is een gunstig effect op de blaasfunctie bevestigd door de in vitro testen: -K-reactie; 5 -reactie op EFS (Figuur 17); -reactie op carbachol.

Tenslotte werd er een geringe afname in het gewicht van de blaas waargenomen bij Verbinding A (Figuur 12).

Deze data demonstreren het gebruik van Verbinding A (in het dosisbereik van 50 10 pg tot 300 pg - equivalent met ongeveer 0.725 tot 5 pg/kg lichaamsmassa bij mensen) bij de preventie en behandeling van blaasdisfunctie, bijv. overactieve blaas, zoals bijvoorbeeld is aangetoond bij patiënten met BPH.

1027109 36

Afkortingen T Testosteron DHT DiHydroTestosteron GF Growth Factor (groeifactor) 5 BPH Benign Prostatic Hyperplasia (benigne prostaathyperplasie) PP Per-Protocol ITT Intent-To-Treat (van plan behandeling te ondergaan) ANOVA Analysis of Variance (variantieanalyse) TRUS Transrectal UltraSound (transrectaal ultrageluid) 10 BOO Bladder Outlet Obstruction (obstructie van blaasuitgang) AR AndrogeenReceptoren PSA Prostaat-SpedfiekAntigeen

Alle verwijzingen, waaronder octrooien en octrooiaanvragen waarnaar wordt verwezen in 15 deze aanvrage zijn, voorzover mogelijk, in volle omvang hierin opgenomen door ernaar te verwijzen.

Tenzij de context anderszins vergt, wordt overal in de specificatie en de conclusies die volgen, als vanzelfsprekend aangenomen dat het woord ‘omvatten’, en varianten zoals 20 ‘omvat’ en 'omvattend’ de insluiting van een vermeld heel getal of stap of groep hele getallen impliceert, maar dit is niet onder uitsluiting van enig ander geheel getal of stap of groep hele getallen of stappen.

De aanvraag waarvan deze beschrijving met conclusies deel uitmaakt kan gebruikt wor-25 den als basis voor de prioriteit ten opzichte van enige latere aanvraag. De conclusies van zodanige aanvraag kunnen gericht zijn op ieder hierin beschreven kenmerk of combinatie van kenmerken. Zij kunnen de vorm aannemen van product-, compositie-, proces-, of ge-bruiksconclusies, en kunnen, bij wijze van voorbeeld en zonder beperking, de volgende conclusies bevatten: 30 1027109 '

Claims (24)

1. Het gebruik van 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare 5 ester daarvan, in de fabricage van een medicament ter preventie en/of behandeling van benigne prostaathyperplasie (BPH).

2. Het gebruik volgens conclusie 1 waarbij het medicament afzonderlijk, sequentieel of gelijktijdig wordt toegediend in separate of gecombineerde farmaceutische vormen met een tweede BPH-actieve agens.

3. Het gebruik van 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi- cholecalciferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan, in combinatie met een tweede BPH-actieve agens in de fabricage van een medicament ter preventie en/of behandeling van benigne prostaathyperplasie.

4. Het gebruik volgens conclusie 2 of 3 waarbij het tweede BPH-actieve agens een 15 alfa-adrenergische receptorblokkerende stof is.

5. Het gebruik volgens conclusie 4 waarbij de alfa-adrenergische receptorblokkerende stof is geselecteerd uit terazosine, doxazosine, tamsulosine, silodosine, AIO-8507L en RBx-2258.

6. Het gebruik volgens conclusie 2 of 3 waarbij het tweede BPH-actieve agens een 20 5-alfa-reductase inhibitor is.

7. Het gebruik volgens conclusie 6 waarbij de 5-atfa-reductase inhibitor is geselecteerd uit finasteride en dutasteride.

8. Een farmaceutische vorm omvattende 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen- 26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farma- 25 ceutisch aanvaardbare ester daarvan, en een farmaceutisch aanvaardbare carrier ter preventie en/of behandeling van goedaardige prostaathyperplasie.

9. Een verpakte vorm omvattende een farmaceutische samenstelling omvattende 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dièen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan, en een farma- 30 ceutisch aanvaardbare carrier verpakt met aanwijzingen voor het gebruik ter preventie en/of behandeling van benigne prostaathyperplasie.

10. Het gebruik volgens een van de conclusies 1 tot 7 waarbij het 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol, of farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan is verschaft in "unit dose” 35 (enkelvoudige dosis) vorm. 1027109

11. Een vorm volgens conclusies 8 of 9 waarbij het 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol, of farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan is verschaft in "unit dose" vorm.

12. Een vorm volgens conclusies 8, 9 en 11 verder omvattende een tweede BPH- 5 actieve agens.

13. Het gebruik volgens conclusie 10 waarbij de “unit dose” van 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol 50 è 150 jt/g is.

14. Het gebruik volgens een van de conclusies 1 tot 7 of 10 of 13 ter preventie en/of behandeling van benigne prostaathyperplasie zonder anti-androgene prostatische en 10 extra-prostatische bijwerkingen.

15. Het gebruik volgens een van de conclusies 1 tot 7 of 10,13 of 14 ter preventie en/of behandeling van benigne prostaathyperplasie samen met gelijktijdige preventie en/of behandeling van blaasdisfunctie.

16. Een farmaceutische vorm omvattende 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen- 15 26,27-bishomo-20-epi-choleca!ciferol opgelost in gefiractioneerde kokosolie samen met een of meer conserveringsmiddelen.

17. Een vorm volgens conclusie 16 waarbij de gefractioneerde kokosolie Miglyol 812 is.

18. Een vorm volgens conclusie 16 of conclusie 17 waarbij de conserverings-20 middelen geselecteerd worden uit gebutyleerd hydroxytolueen, gebutyleerd hydroxy- anisool en mengsels daarvan.

19. Een vorm volgens conclusie 8, 11, 12 of 15 tot 17 die wordt gepresenteerd als een capsule.

20. 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol of 25 een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan, voor gebruik ter preventie en/of behandeling van benigne prostaathyperplasie.

21. 1-alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecaldferol of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan, voor gebruik ter preventie en/of behandeling van benigne prostaathyperplasie zonder anti- 30 androgene prostatische en extra-prostatische bijwerkingen.

22. 1 -alfa-fluoro-25-hydroxy-16,23E-dieen-26,27-bishomo-20-epi-cholecalciferol of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of farmaceutisch aanvaardbare ester daarvan, voor gebruik ter preventie en/of behandeling van benigne prostaathyperplasie samen met gelijktijdige preventie en/of behandeling van blaasdisfunctie.

23. Een vorm volgens conclusie 11 waarbij de “unit dose” van 1-alfa-fluoro-25- hydroxy-16,23E-dieen-26,27'bishomo-20-epi-cholecalciferol 50 tot 150 //g bedraagt. 1027109

24. De uitvinding zoals in het bovenstaande beschreven is. 1027109