CH677454A5 - - Google Patents

Description

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Besehreibung

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Trennung und Analyse von Biopolymeren durch Elektrophorese und betrifft insbesondere Apparate zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer DNS in Gel,

Stand der Technik

Die Trennung von Biopolymergemischen, speziell der Gemische von DNS-Molekülen, deren Grösse 5-104 Paare von Nukleinbasen überschreitet, beruht auf einer Pulselektrophorese, die auf eine sukzessive Erzeugung von nach der Richtung gekreuzten elektrischen Feldern in Gel mit einem in dieses eingetragenen Gemisch hochmolekularer DNS hinausläuft.

Es ist ein Apparat zur Trennung der Gemische von DNS-Molekülen (Carle G.P., Frank M. and Oison M.V. «Electroforetic séparations of largie DNA molécules by periodic invercion of the electric field», Science, v. 232, 1986, c, 65-68) bekannt, dessen elektrophoretische Kammer rechteckiger Form zwei horizontal gegenüberliegende Linienelektroden enthält, zwischen denen ein Gelblock angeordnet ist. Die Spannung einer Speisequelle wird den Elektroden über ein Schaltgerät im Laufe von 3/4 einer gewählten Zeitperiode mit einer normalen Polung und im Laufe von Va dieser Periode mit einer umgekehrten Polung zugeführt, wobei dieser Schaltzyklus mehrfach wiederholt wird. Hierbei wird die Bewegungsrichtung der DNS-Moleküle periodisch um 180® geändert. Dieser Winkel ist für einen weiten Bereich von Molekularmassen der zu trennenden DNS-Moleküle nicht optimal, weshalb es nicht möglich ist, auf dem bekannten Apparat individuelle DNS-Fraktionen abzutrennen, deren Grösse 2-106 Basenpaare übertrifft. Darüber hinaus führt eine hin- und hergehende Bewegung der Moleküle über den Gelblock zu einer Verlängerung der Dauer des Trennprozesses für das Ausgangsgemisch, d.h. zu einer Senkung der Leistung des Apparates.

Es ist ein Apparat (G. Ghy, D. Vollarth, R.W. Davids «Separation of largie DNA molecules by con-tourclamped homogencos electric fields», Science, 234, 1986, c. 1582-1585) bekannt, in dem sechs Gruppen von bezüglich der Oberfläche des Gelblocks vertikal angeordneten Pünktelektroden ein über identische Widerstände elektrisch geschlossenes Hexaeder bilden, in dessen Innerem der Gelblock angeordnet ist. Die Spannung der Speisequelle ständiger Polarität wird über ein Schattgerät mal einem, mal dem anderen Paar der gegenüberliegenden Elektrodengruppen zugeführt. Das dritte Paar der Elektrodengruppen ist passiv und dient der Erzeugung eines homogenen elektrischen Feldes zwischen den Elektroden. Hierbei bewegen sich die DNS-Moleküle mit einer Richtungsänderung bei jedem Takt der Spännungsum-schaltung um 120°. Bei den gleichen Abmessungen der Kammer wie auch im oben beschriebenen Apparat muss der Gelblock kleinere Abmessungen und also auch eine geringere Anzahl von aufgetragenen Proben aufweisen, was die Leistung des Apparates ebenfalls verringert. Ausserdem wird eine doppelte Leistung der Speisequelle benötigt, weil der die Elektroden durchfiiessende Strom nicht geringer als der Strom sein muss, der durch eine Pufferlösung fliesst, die den Gelblock bedeckt.

Es ist ein Apparat zur Trennung hochmolekularer DNS in Gel (SU, A, 4 473 452) bekannt, der es gestattet, Gemische von DNS-Molekülen mit Molekularmassen von 5-10^ bis 9-106 Basenpaare zu trennen, in seiner elektrophoretischen Kammer quadratischer Form sind vier Elektrodengruppen angeordnet, wobei an zwei anliegenden Wänden Gruppen von in jeder Gruppe miteinander elektrisch verbundenen Pünktelektroden und an den Kammerwänden des anderen Paares zwei Einfach-Punkt-elektroden angeordnet sind, die in unmittelbarer Nähe der Enden der zwei ihnen gegenüberliegenden Elektrodengruppen liegen. Von der Speisequelle wird der einen Elektrodengruppe über das Schaltgerät in gleichen Zeitabständen eine Spannung negativer Polarität und der ihr gegenüberliegenden Punktelektrode eine Spannung positiver Polarität zugeführt. Dann wird die Spannung in der gleichen Weise der zweiten Elektrodengruppe und der zweiten Punktelektrode zugeführt. Auf solche Weise werden in dem innerhalb der elektrophoretischen Kammer untergebrachten Gelblock gekreuzte krummlinige elektrische Felder erzeugt, die die DNS-Moleküle zwingen, sich auf komplizierten Bahnen zu bewegen, deren Richtung sich in dem Masse der Annäherung an die Punktelektroden unter einem Winkel von 90 bis 180° ändert.

Die Krummlinigkeit der im bekannten Apparat aufgebauten Felder führt einmal zu einer Krümmung der Bewegungsbahnen der individuellen DNS-Fraktionen im Gel, was die Bestimmung ihrer Molekularmassen wesentlich erschwierigt und spezielle Korrekturprogramme bei der automatischen Verarbeitung der erhaltenen Ergebnisse, beispielsweise bei Benutzung von Gelscannern, erfordert. Zum anderen ist die Anzahl der gleichzeitig zu trennenden Proben der DNS-Moleküle nicht gross, weil die äusseren Bahnen, indem sie sich krümmen, aus dem Gel in die Pufferlösung übergehen können.

Darstellung der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Apparat zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer DNS in Gel zu schaffen, in dem die Anordnung der Elektroden in der elektrophoretischen Kammer durch Erzeugung homogener elektrischer Felder in dieser, die für identische Bedingungen für eine Trennung über die Gesamtfläche des Gelblocks sorgen, es gestattet, lineare, zueinander parallele Bewegungsbahnen für die Moleküle und eine Linienform für die Fronten der getrennten individuellen Fraktionen zu erhalten.

Die gestellte Aufgabe wird dadurch gelöst, dass in dem Apparat zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer DNS in Gel, der eine elektrophore-

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tische Kammer mit in dieser angeordneten vier Elektrodengruppen, die über ein Schaltgerät mit einer Speisequelle verbunden sind, enthät gemäss der Erfindung die vier Elektrodengruppen identisch ausgeführt und an den Seiten eines gleichseitigen Vierecks angeordnet sind, das einen Gelblock um-schliesst, wobei die Elektroden in jeder Gruppe äquidistant angeordnet sind und jede Gruppe an einen jeweiligen Ausgang des Schaltgeräts angeschlossen ist.

Es ist zweckmässig, dass die vier Elektrodengruppen an den Seiten eines Rhombus mit der Möglichkeit einer Verschiebung der gegenüberliegenden Paare der Elektrodengruppen angeordnet sind, wobei jede Elektrodengruppe Zusatzelektroden aufweist, die in Richtung von Linien angebracht sind, die Fortsetzungen der Seiten des Rhombus über die Eckpunkte seiner grösseren Innenwinkel hinaus darstellen und deren Länge als I = h/tga definiert wird, worin a der kleinere Innenwinkel des Rhombus, h der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Seiten des Rhombus sind.

Die vorliegende Erfindung gestattet es, die Leistung bei der Trennung der Gemische der DNS-Mo-leküle durch Benutzung der Gesamtfläche des Gelblocks zu erhöhen; die Genauigkeit der Bestimmung der Molekularmassen der getrennten individuellen DNS-Fraktionen durch Einführung einer einheitlichen Marke zu steigern; die Effektivität der Trennung der Gemische der DNS-Moleküle in einem weiten Bereich der Molekularmassen durch Änderung des Winkels a im Trennprozess zu verbessern; Gelscanner zur automatischen Verarbeitung der Ergebnisse der Trennung einzusetzen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend an konkreten Ausführungsbeispielen anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 eine Blockschaltung der ersten Ausführungsform eines erfindungsgemässen Apparates zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer DNS in Gel;

Fig. 2 eine Bewegungsbahn der DNS-Moleküle im Gel, die in der ersten Ausführungsform des erfindungsgemässen Apparates erhalten wird;

Fig. 3 eine Blockschaltung der zweiten Ausführungsform des erfindungsgemässen Apparates zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer DNS in Gel;

Fig. 4 eine Bewegungsbahn der DNS-Moleküle im Gel, die in der zweiten Ausführungsform des erfindungsgemässen Apparates erhalten wird.

Bester Weg zur Ausführung der Erfindung

Der Apparat zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer DNS in Gel enthält eine elektrophoretische Kammer 1 (Fig. 1) rechteckiger Form mit vier identischen Gruppen 2, 3, 4 und 5, deren jede eine gleiche Anzahl äquidistant angeordneter Punktelektroden aufweist, die miteinander durch Dioden (in Fig. 1 nicht gezeigt) elektrisch gekoppelt sind. Diese Elektrodengruppen 2, 3, 4, 5 sind an einem als oberer Deckel der elektrophoretischen Kammer 1 dienenden Halter (in Fig. 1 nicht gezeigt) an den Seiten eines Quadrats angeordnet, das einen auf dem Boden der Kammer 1 untergebrachten Gelblock 6 mit auf eine seiner Kanten aufgetragenen Proben 7 der Gemische von DNS-Molekülen umschliesst. Der Gelblock 6 ist mit einer Schicht einer Pufferlösung gegossen, die einen Stromdurch-fluss zwischen den jeweiligen Elektrodengruppen 2, 3, 4, 5 bei der Belegung derselben mit einer Spannung ermöglicht. Die Elektrodengruppen 2 und 4 sind elektrisch mit einem Ausgang eines Schaltgeräts 8, die Elektrodengruppen 3 und 5 mit dem anderen Ausgang des Schaltgeräts 8 verbunden, dessen Eingang an den Ausgang einer Speisequelle 9 gelegt ist.

In Fig. 2 ist eine Bahn 10 gezeigt, auf der sich jedes der Moleküle der DNS-Probe 7 bei der Anordnung der Elektrodengruppen 2, 3, 4, 5, an den Seiten des Quadrats bewegt.

Um Änderungswinkel der Bewegungsbahn der DNS-Moleküle in der Probe 7 zu erhalten, die von 90° verschieden sind, werden die Elektrodengruppen 2,3,4,5 (Fig. 3) an den Seiten eines Rhombus angeordnet, dessen kleinerer Innenwinkel, beispielsweise a = 60°, im voraus gewählt wird. Jede Gruppe 2, 3, 4, 5 enthält Zusatzelektroden 11, die in Richtung von Linien angeordnet sind, die Fortsetzungen der Seiten des Rhombus über die Eckpunkte seiner grösseren Innenwinkel hinaus darstellen und eine Länge von I = h/tga aufweisen, worin h der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Seiten des Rhombus ist. In Fig. 4 ist eine Bewegungsbahn 12 der Moleküle in der DNS-Probe 7 im Gelblock 6 bei derartiger Anordnung der Elektrodengruppen 2, 3, 4,5 gezeigt.

Der erfindungsgemässe Apparat zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer DNS in Gel arbeitet wie folgt. Der Gelbiock 6 (Fig. 1) mit den aufgetragenen Proben 7 der Gemische der DNS-Moleküle wird in der elektrophoretischen Kammer 1 parallel zu deren Wänden angeordnet und mit einer Pufferlösung gegossen, die mit den Elektroden sämtlicher vier Gruppen 2, 3, 4, 5 kontaktiert wird. Dann wird die Speisequelle 9 eingeschaltet, worauf über einen Umschalter 8 an die Elektrodengruppen 4 eine Spannung positiver Polarität und an die Gruppe 2 eine Spannung negativer Polarität angelegt wird. Die DNS-Moleküle werden entlang den elektrischen Feldlinien zwischen den Gruppen 2 und 4 geordnet und beginnen sich auf die Gruppe 4 zu zu bewegen, die auf einem Pluspotential liegt. In einem vorgegebenen Zeitabstand wird die Spannung mit Hilfe des Umschalters 8 von den Elektrodengruppen 2, 4 abgeschaltet, an die Elektrodengruppe 3 wird eine Spannung positiver Polarität und an die Gruppe 5 eine Spannung negativer Polarität angelegt. Die DNS-Moleküle 7 werden entlang den elektrischen Feldlinien umgeordnet, die eine neue Richtung aufweisen, wobei für Moleküle verschiedener Grösse die Umbauzeit verschieden ist, und beginnen sich in Richtung der Elektrodengruppe 3 zu bewegen, im gleichen Zeitabstand wird die Spannung mittels Umschalter 8 von den Elektrodengrup-

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pen 3, 5 abgeschaltet und auf die Gruppen 2, 4 der gleichen Polarität wie auch im ersten Takt der Spannungszufuhr erneut gegeben. Dann schaltet der Umschalter 8 die Spannung im gleichen Zeitabstand von den Gruppen 2 und 4 ab und liefert sie erneut auf die Gruppe 3,5 bei einer Polarität, die zur Polarität im zweiten Takt der Betätigung des Umschalters 8 umgekehrt ist. Derartige vier Takte der Um-schaltung der Spannung der Speisequelle 9 werden wiederholt, bis die leichtesten individuellen DNS-Fraktionen das Ende des Gelblocks 6 erreicht haben, das der Stelle der Auftragung der Proben 7 entgegengesetzt ist. Die Bewegungsbahn 10 der DNS-Moleküle ist bei derartiger Abwechslung der dem Gelblock 6 überlagerten Felder in Fig. 2 dargestellt. Es ist zu ersehen, dass bei jeder Betätigung des Umschalters 8 die Moleküle um einen Winkel von 90° schwenken. Gerade dank den zeitlichen Unterschieden bei der Umorientierung der Moleküle verschiedener Grösse, d.h. verschiedener Molekularmasse, erfolgt eine wirksame Trennung der Ausgangsprobe 7 der DNS-Moleküle, die Moleküle mit einer Grösse von 5-104 bis 2*106 Basenpaare enthält.

Bei der Anordnung der Elektrodengruppen 2, 3, 4, 5 (Fig. 3) an den Seiten des Rhombus wird die Spannung von der Speisequelle 9 in gleichen Zeitab-ständen mal an die Gruppen 2 und 4 - Gruppe 4 positiver, Gruppe 2 negativer Polarität, mal an die Gruppen 3 und 5 - Gruppe 3 positiver, Gruppe 4 negativer Polarität - angelegt. Derartige Schaltzyklen der Spannung werden wiederholt, bis der Trennprozess beendet ist.

Um am Montageort des Gelblocks 6 ein homogenes elektrisches Feld zu schaffen, weisen alle vier Elektrodengruppen 2, 3, 4, 5 Zusatzelektroden 11 auf, die in Richtung von Linien angeordnet sind, die eine Fortsetzung der Seiten des Rhombus darstellen. Derartige Anordnung der Elektrodengruppen 2, 3, 4, 5 ergibt eine Bewegungsbahn 12 der DNS-Moleküle, die in Fig. 4 dargestellt ist.

Bei einer Trennung der Gemische der DNS-Moleküle, die sowohl relativ kleine Moleküle in der Grösse von ca. 5-1 CK Basenpaare als auch relativ grosse Moleküle von ca. 5108 Basenpaare enthalten, ist es notwendig, den Winkel a zu ändern, dessen Festwert nur für einen gewissen schmalen Bereich der Molekularmassen optimal ist.

Denkbar sind verschiedene Ausführungsformen dieser Konstruktion, die die Einstellung des erforderlichen Winkels a und eine Änderung seines Wertes im Prozess der Trennung der DNS-Gemische ermöglichen. Die einfachste davon ist die Anordnung der Elektrodengruppen 2, 4 (Fig. 1) auf dem Boden der elektrophoretischen Kammer 1 und der Gruppen 3 und 5 auf dem oberen Deckel bzw. Halter mit der Möglichkeit einer gesteuerten Schwenkung dieses Deckels.

Somit bietet die Anordnung der vier identischen Gruppen 2, 3, 4, 5, deren Elektroden an den Seiten eines gleichseitigen Vierecks äquidistant liegen, die Möglichkeit, am Montageort des Gelblocks 6 homogene elektrische Felder zu erzeugen, die unter einem Sollwinkel gekreuzt sind, d.h. identische Bedingungen für die Bewegung der DNS-Moleküle in sämtlichen Punkten der Oberfläche des Gelblocks 6 zu sichern.

Gewerbliche Verwertbarkeit

Die Erfindung kann mit Erfolg in der Biotechnologie, Molekulärbiologie und Genetik, Biochemie, Biophysik sowie in der Medizin und Landwirtschaft angewendet werden.

Claims (2)

Patentansprüche

1. Apparat zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer DNS in Gel, der eine elektrophore-tische Kammer (1) mit in dieser angeordneten vier Elektrodengruppen (2, 3, 4, 5), die über ein Schaltgerät (8) mit einer Speisequelle (9) verbunden sind, enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die vier Elektrogruppen (2, 3, 4, 5) identisch ausgefüht und an den Seifen eines gleichseitigen Vierecks angeordnet sind, das einen Gelblock (6) umschliesst, wobei die Elektroden in jeder der Gruppen (2, 3, 4, 5) äquidistant angeordnet sind und jede Gruppe (2, 3, 4, 5) an einen jeweiligen Ausgang des Schaltgeräts (8) angeschlossen ist.

2. Apparat zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer DNS in Gel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die vier Elektrodengruppen (2,3,4,5) an den Seiten eines Rhombus mit Möglichkeit einer Verschiebung der gegenüberliegenden Paare der Elektrodengruppen (2, 4 und 3, 5) angeordnet sind, wobei jede Elektrodengruppe (2, 3, 4, 5) Zusatzelektroden (11) aufweist, die in Richtung von Linien angebracht sind, die Fortsetzungen der Seiten des Rhombus über die Eckpunkte seiner grösseren Innenwinkel hinaus darstellen und deren Länge als I = h/tga definiert wird, worin a der kleinere Innenwinkel des Rhombus, h der Abstand zwischen den gegenüberliegenden Seiten des Rhombus sind.

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