NL8820474A - Inrichting voor elektroforetische scheiding van hoogmoleculair dna in gel. - Google Patents

Description

8 8 2 0 4 N.O. 35681 w υ u ^

Inrichting voor elektroforetische scheiding van hoogmoleculair DNA i n gel._

Aanvraagster noemt als uitvinders: 1. DAVID REVAZOVICH BERITASHVILI, 2. LEV VALENTINOVICH KARKLIT, 3. KONSTANTIN GEORGIEVICH SKRYABIN, 4. EVGENY NIKOLAEVICH TVERDOKHLEBOV, 5. ANDREI IGOREVICH POLETAEV.

Allen te Moskou, U.S.S.R.

Technisch gebied

De uitvinding heeft betrekking op de scheiding en analyse van bio-polymeren door de werkwijze van elektroforese en meer in het bijzonder betreft de uitvinding inrichtingen voor elektroforetische scheiding van 5 hoogmoleculair DNA in gel.

Achtergrond van de uitvinding

De scheiding van mengsels van biopolymeren, in het bijzonder van DNA-moleculen met afmetingen groter dan 5.10^ nucleïne basisparen is gebaseerd op de puls-elektroforese onder toepassing van de opeenvol-10 gende opwekking van elkaar kruisende elektrische velden in gel waarin een mengsel van hoogmoleculair DNA is ingevoerd.

In de techniek is een inrichting bekend voor de scheiding van mengsels van DNA-moleculen, Carle GP (Frank M en Olson M.V. Electrophoretic Separation of Large DNA molecules by Periodic Inversion of the 15 Electric Field", Science, deel 232, 1986, biz. 65-68), waarin een rechthoekige, zich horizontaal uitstrekkende elektroforetische kamer is voorzien van twee tegenover elkaar gelegen lineaire elektroden, waartussen een gel blok is geplaatst. De spanning van een voedingsbron wordt via een schakel keten toegevoerd aan de elektroden gedurende 3/4 van een 20 vooraf ingestelde tijdperiode in de directe polariteit en gedurende 1/4 van dezelfde tijdperiode in de omgekeerde polariteit, en deze schakel-cyclus wordt een groot aantal keren herhaald. De beweging van DNA-moleculen wordt daarom regelmatig over 180° omgekeerd. Deze hoek is geen optimale hoek voor een groot gebied van moleculaire massawaarden van 25 DNA-moleculen die gescheiden moeten worden, zodat het niet mogelijk is de afzonderlijke fracties van DNA met een afmeting groter dan 2.106 basisparen te isoleren. Bovendien resulteert het heen en weer bewegen van moleculen in het gel blok tot een toename van de scheidingstijd van het aanvankelijke mengsel of een lagere produktiviteit van de inrich-30 ting.

8820474/ 2

In de techniek is een inrichting bekend (G. Chy, D. Vollarth, R.W. Davis, Separation of Large DNA Molecules by Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields, Science, deel 234, 1986, biz. 1582-1585), waarin zes groepen van puntvormige elektroden, die zich vertikaal uitstrekken ten 5 opzichte van het oppervlak van een gel blok, een kubus vormen die elektrisch is kortgesloten via identieke weerstanden, waarbij het gel blok in de kubus is geplaatst. De spanning van een voedingsbron met constante polariteit wordt achtereenvolgens door een schakel keten toegevoerd aan respectievelijke paren van tegenover elkaar gelegen groepen elek-10 troden. Een derde paar elektrodegroepen blijft passief en dient voor het opwekken van een homogeen elektrisch veld tussen de elektroden. DNA-moleculen bewegen met een verandering in verplaatsingsrichting van 120° bij elke omschakeling van de spanning. Bij dezelfde afmetingen van de kamer in de bovenbeschreven inrichting moet het gel blok kleinere af-15 metingen bezitten, derhalve een kleiner aantal monsters bezitten, waardoor de produktiviteit van de inrichting omlaag gaat. Bovendien moet het uitgangsvermogen van de voedingsbron worden verdubbeld als de stroom door de elektroden ten minste gelijk moet zijn aan de stroom die door de buffervloei stof vloeit die het gel blok bedekt.

20 In de techniek is een inrichting bekend voor de scheiding van hoogmoleculair DNA in gel (SU,A, 4.473.452), die het mogelijk maakt mengsels te scheiden van DNA-moleculen met moleculaire massa van 5.10^ tot 9.106 basisparen. Een rechthoekig gevormde elektroforeti-sche kamer van de inrichting kan vier groepen elektroden opnemen, waar-25 bij groepen van puntvormige elektroden worden toegepast bij twee aan elkaar grenzende wanden en elektrisch met elkaar zijn verbonden binnen elke groep, en twee afzonderlijke puntvormige elektroden worden toegepast op het andere paar aan elkaar grenzende wanden van de kamer in de onmiddellijke nabijheid van de einden van de twee tegenover elkaar ge-30 legen groepen elektroden. Een spanning met negatieve polariteit wordt vanuit een voedingsbron toegevoerd via een schakel keten gedurende identieke tijdintervallen aan een groep van elektroden en een spanning met tegengestelde polariteit wordt toegevoerd aan de tegenovergelegen puntvormige elektrode. Vervolgens wordt op dezelfde wijze de spanning toe-35 gevoerd aan de tweede groep elektroden en aan de tweede afzonderlijke elektrode. Aldus worden elkaar kruisende kromlijnige elektrische velden in het gel blok opgewekt dat is geplaatst in de elektroforetische kamer, zodat DNA-moleculen langs gecompliceerde trajecten worden verplaatst, waarvan de richting wijzigt binnen het gebied van 90 tot 180° waarbij 40 zij dicht langs de puntvormige elektroden bewegen.

0020474·" 3

De kromlijnige configuratie van velden die in de bekende inrichting wordt opgewekt heeft in de eerste plaats een kromlijnig traject tot gevolg van afzonderlijke DNA-fracties in het gel, waarbij aldus de vorming van een moleculaire massa aanzienlijk wordt belemmerd, wat 5 vraagt om de toepassing van speciale correctieprogramma's voor de automatische verwerking van de resultaten, d.w.z. als gelscanners worden toegepast. In de tweede plaats is het aantal gelijktijdig gescheiden DNA-molecu!en klein aangezien de einden van de trajecten gekromd zijn, zodat zij zelfs uit het gel in de bufferoplossing treden.

10 Samenvatting van de uitvinding

De uitvinding is gebaseerd op het probleem van het verschaffen van een inrichting voor de elektroforetische scheiding van hoogmoleculair DNA in gel, waarin de positie van elektroden in een elektroforetische kamer het mogelijk maakt de sporen van de moleculen te definiëren die 15 zich onderling parallel uitstrekken en de lineaire configuratie van fronten van gescheiden afzonderlijke fracties door de opwekking van homogene elektrische velden in de kamer waardoor identieke scheidingsom-standigheden over het gehele gebied van een gel blok worden gewaarborgd.

20 Dit probleem wordt opgelost doordat in een inrichting voor de elektroforetische scheiding van hoogmoleculair DNA in gel, voorzien van een elektroforetische kamer met vier groepen elektroden verbonden met een voedingsbron via een schakel keten, volgens de uitvinding de vier groepen elektroden identiek zijn en zijn geplaatst langs de zijden van 25 een gelijkzijdige vierhoek die een gelblok omgeeft, waarbij de elektroden binnen elke groep op gelijke onderlinge afstand zijn geplaatst.

De vier groepen elektroden zijn bij voorkeur opgesteld volgens de zijden van een rombus, waarbij tegenover elkaar gelegen paren elektro-degroepen verplaatsbaar zijn en elke groep van elektroden hulpelektro-30 den omvat die zijn opgesteld volgens lijnen die verlengstukken zijn van de rombuszijden voorbij de vertex van de grotere inwendige hoeken, waarbij de lengte van de lijnen wordt bepaald als 1 = waarin α de kleinere inwendige rombushoek is en h de afstand tussen tegenover elkaar gelegen zijden van de rombus.

35 De uitvinding verschaft de mogelijkheid om de produktiviteit te verhogen van de scheiding van mengsels van DNA-moleculen tengevolge van de toepassing van het gehele gebied van het gelblok; de nauwkeurigheid te verhogen van de bepaling van de moleculaire massa van de afzonderlijke gescheiden DNA-fracties, tengevolge van het gebruik van een enke- 8820474' 4 le markeennrichting; het rendement te verbeteren van de scheiding van de mengsels van DNA-moleculen binnen een breed gebied van moleculaire massawaarden tengevolge van een verandering in de hoek α gedurende de scheiding; het gebruik maken van gel scanners voor het automatisch ver-5 werken van de gescheiden resultaten.

Korte omschrijving van de tekeningen

De uitvinding zal thans meer in detail worden beschreven aan de hand van specifieke uitvoeringsvoorbeelden die op de bijgaande tekeningen zijn aangegeven, waarin: 10 Fig. 1 een blokschema toont van een eerste uitvoeringsvorm van een inrichting voor het elektroforetisch scheiden van hoogmoleculair DNA in gel volgens de uitvinding;

Fig. 2 een bewegingstraject toont van DNA-moleculen in gel verkregen bij de eerste uitvoeringsvorm van een inrichting volgens de onder-15 havige uitvinding;

Fig. 3 een blokschema is van een tweede uitvoeringsvorm van een inrichting voor de elektroforetische scheiding van hoogmoleculair DNA in gel volgens de uitvinding;

Fig. 4 een bewegingstraject toont van DNA-moleculen in gel verkre-20 gen met de tweede uitvoeringsvorm van een inrichting volgens de uitvinding.

De beste wijze voor het uitvoeren van de uitvinding

Een inrichting voor de elektroforetische scheiding van hoogmolecu-1 air DNA in gel omvat een elektroforetische kamer 1 (fig. 1) met recht-25 hoekige vorm met vier identieke groepen 2, 3, 4 en met identieke aantallen van op onderling gelijke afstand gelegen puntvormige elektroden die elektrisch met elkaar zijn verbonden via dioden (niet weergegeven in fig. 1). De groepen 2, 3, 4, 5 van elektroden zijn gemonteerd in een houder (in fig. 1 niet weergegeven), die dient als een topdekselplaat 30 van de elektroforetische kamer 1 langs de zijden van een vierkant dat een gel blok 6 omgeeft, geplaatst op de bodem van de kamer 1 en voorzien van monsters 7 van het mengsel van DNA-moleculen geplaatst aan een van zijn randen. Het gel blok 6 wordt bedekt door een laag bufferoplossing, waardoor een stroom kan vloeien tussen respectievelijke groepen 2, 3, 35 4, 5 van elektroden als de spanning daaraan wordt toegevoerd. De groepen 2 en 4 van elektroden zijn elektrisch gekoppeld met een uitgang van een schakel keten 8, de groepen 3 en 5 van elektroden zijn gekoppeld met een andere uitgang van de schakel keten 8, waarvan de ingang is verbon den met een uitgang van een voedingsbron 9.

40 Fig. 2 toont een traject 10 waarlangs elk van de moleculen van het 88204 7 4.' 5 monster 7 van DNA beweegt als de groepen elektroden 2, 3, 4, 5 zijn geplaatst langs zijden van een vierkant.

Om een verandering te verkrijgen in de trajecten van DNA-molecu!en in het monster 7 bij een andere hoek dan 90° worden de groepen elektro-5 den 2, 3, 4, 5 (fig. 3) geplaatst langs de zijden van een rombus met zijn kleinste inwendige hoek vooraf gekozen, bijvoorbeeld α = 60°. Elke groep 2, 3, 4, 5 omvat hul pelektroden 11, opgesteld volgens lijnen, die verlengstukken zijn van de zijden van de rombus voorbij de vertex van zijn grootste inwendige hoeken en die een lengte bezitten 10 1 = £”, waarin h de afstand is tussen tegenover elkaar gelegen zijden van de rombus. Fig. 4 toont een bewegingstraject 12 van de moleculen in het monster 7 van DNA in het gel blok 6 bij deze positie van de groepen elektroden 2, 3, 4, 5.

De inrichting voor elektroforetische scheiding van hoogmoleculair 15 DNA in gel volgens de uitvinding functioneert op de volgende wijze. Het gel blok 6 (fig. 1) waaraan monsters 7 zijn toegevoegd van mengsels van DNA-molecu!en, wordt geplaatst in de elektroforetische kamer 1 zodat het zich parallel uitstrekt met de wanden daarvan en wordt bedekt met een bufferoplossing in contact met de elektroden van alle vier de groe-20 pen elektroden 2, 3, 4, 5. De voedingsbron 9 wordt dan bekrachtigd en een positieve spanning wordt toegevoerd aan de groep 4 van de elektroden en een negatieve spanning wordt toegevoerd aan de groep 2 van de elektroden via de schakel keten 8. DNA-molecu!en worden gerangschikt volgens de krachtlijnen van het elektrische veld tussen de elektrode-25 groepen 2 en 4 en beginnen te bewegen naar de groep 4, die zich op de positieve potentiaal bevindt. Na verloop van een vooraf bepaalde tijd verwijdert de schakel keten 8 de spanning van de groepen 2, 4 van de elektroden en wordt een positieve spanning toegevoerd aan de groep 3 van de elektroden en een negatieve spanning wordt toegevoerd aan de 30 groep 5 van de elektroden. De DNA-molecu!en 7 worden opnieuw gerangschikt volgens krachtlijnen van het elektrische veld die niet verschillend zijn gericht, waarbij de rangschiktijd verschillend is voor moleculen met verschillende afmetingen, en die beginnen te bewegen naar de elektrodegroep 3. Na verloop van dezelfde tijd wordt de spanning van de 35 elektrodegroepen 3, 5 verwijderd door de schakel keten 8 en weer toegevoerd aan de groepen 2, 4 met hetzelfde polariteitenpatroon als gedurende de eerste spanningstoevoercyclus. Vervolgens verwijdert de schakel keten 8 de spanning van de groepen 2 en 4 na hetzelfde tijdverloop en voert spanning toe aan de groepen 3 en 5 met een polariteit die om- 8820474.

6 gekeerd is ten opzichte van de polariteit gebruikt gedurende de tweede scheidingscyclus van de schakel keten 8. De boven beschreven schakel cycli van de spanning van de voedingsbron 9 worden herhaald totdat de lichtste afzonderlijke DNA-fracties het einde bereiken van het gelblok 5 6 tegenover de plaats van toevoer van de monsters 7. Het bewegingstra-ject 10 van de DNA-moleculen bij dergelijke afwisselende velden die worden toegevoerd aan het gelblok 6 is in fig. 2 weergegeven. Hieruit blijkt dat bij elke werking van de schakelketen 8 de moleculen over 90° draaien. Als gevolg van de verschillen tussen herrangschiktijden voor 10 moleculen met verschillende afmetingen, d.w.z. als gevolg van het verschil van moleculaire massa, wordt het aanvangsmonster 7 van DNA op effectieve wijze gescheiden als het moleculen bevat met afmetingen in het gebied van 5.104 tot 2.106 basisparen.

Als de groepen 2, 3, 4, 5 van elektroden (fig. 3) zijn geplaatst 15 langs zijden van een rombus wordt de spanning afwisselend toegevoerd aan de groepen 2 en 4 (positieve spanning aan de groep 4 en negatieve spanning aan de groep 2) en aan de groepen 3 en 4 (positieve spanning aan de groep 3 en negatieve spanning aan de groepen 5). Deze spannings-schakelcycli worden herhaald totdat het scheidingsproces is voltooid.

20 Voor het opwekken van een homogeen elektrisch veld in het punt waar het gelblok 6 is geplaatst, bezitten alle vier de elektrodegroepen 2, 3, 4, 5 hulpelektroden 11 geplaats volgens lijnen die zich langs de rombuszijden uitstrekken. Deze plaats van de elektrodegroepen 2, 3, 4, 5 waarborgt het bewegingstraject 12 van DNA-moleculen dat in fig. 4 is 25 weergegeven.

Bij het scheiden van mengsels van DNA-moleculen die zowel relatief kleine moleculen van de orde van 5.104 basisparen bevatten als relatief grote moleculen van de orde van 5.106 basisparen, is het noodzakelijk de hoek α te variëren, waarvan een vaste waarde slechts opti-30 maal is voor een bepaald smal gebied van moleculaire massawaarden.

Verschillende uitvoeringsvormen van de inrichting, die de levering waarborgen van een gewenste hoek α en zijn variaties gedurende de scheiding van DNA-mengsels zijn mogelijk. De meest eenvoudige onder hen is die waarin de elektrodegroepen 2, 4 (fig. 1) zijn geplaatst op de 35 bodem van de elektroforetische kamer 1 en de groepen 3, 5 van de elektroden zijn geplaatst op de topdekselplaat of houder, die gemonteerd is voor een bestuurde rotatie.

De plaatsing van de vier identieke elektrodegroepen 2, 3, 4, 5 met ondering gelijke elektrode-afstanden binnen deze groepen langs de zij-40 den van een gelijkzijdige rechthoek maakt het daarom mogelijk in het 882.0474 · 7 punt waar het gel blok 6 Is geplaatst homogene elektrische velden op te wekken die elkaar onder een vooraf bepaalde hoek kruisen, d.w.z. waarborgen identieke omstandigheden voor de beweging van het DNA-molecuul in elk punt van het oppervlak van het gel blok 6.

5 Industriële toepasbaarheid

De uitvinding kan met succes worden gebruikt in de biotechnologie, de moleculaire biologie en genetica, de biochemie, de biofysica alsmede op medisch gebied en op het gebied van de landbouw.

88204?^..

Claims (2)

1. Inrichting voor de elektroforetische scheiding van hoogmolecu-lair DNA in gel, voorzien van een elektroforetische kamer (1) die vier elektrodegroepen (2, 3, 4, 5) opneemt, die via een schakelketen (8) 5 zijn verbonden met een voedingsbron (9), met het kenmerk, dat de vier elektrodegroepen (2, 3, 4, 5) identiek zijn en zijn geplaatst langs de zijden van een gelijkzijdige rechthoek die een gel blok (6) omgeeft, waarbij de elektroden binnen elke groep (2, 3, 4, 5) onderling op gelijke afstanden zijn geplaatst.

2. Inrichting voor de elektroforetische scheiding van hoogmolecu- lair DNA in gel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de vier elektrodegroepen (2, 3, 4, 5) zijn geplaatst volgens zijden van een rombus, waarbij tegenover elkaar gelegen paren van groepen (2, 4 en 3, 5) van de elektroden beweegbaar zijn, en waarbij elke groep (2, 3, 4, 5) van 15 elektroden hulpelektroden (11) omvatten geplaatst langs lijnen die verlengstukken zijn van de rombuszijden voorbij de vertex van zijn grotere inwendige hoeken, waarvan de lengte wordt bepaald door 1. waarin h de afstand is tussen tegenover elkaar gelegen zijden van de rombus en α de kleinere inwendige hoek van de rombus is. +++++++ 882 0474.4 Gewijzigde conclusies voor industriële toepassing PCT/SU 88/00124 1. (gewijzigd). Inrichting voor de elektroforetische scheiding van hoogmoleculair DNA in gel, voorzien van een elektroforetische kamer (1) waarin vier elektrodegroepen (2, 3, 4, 5) zijn opgenomen, die via een 5 schakelketen (8) zijn verbonden met een voedingsbron (9), met het kenmerk, dat de vier groepen (2, 3, 4, 5) van elektroden identiek zijn en zijn opgesteld volgens zijden van een gelijkzijdige rechthoek die een gelblok (6) omgeeft, waarin de elektroden binnen elke groep (2, 3, 4, 5. op onderling gelijke afstanden zijn geplaatst, en elke groep (2, 3, 10 4, 5) is verbonden met een respectievelijke uitgang van de schakel inrichting (8). 2. (gewijzigd). Inrichting voor de elektroforetische scheiding van hoogmoleculair DNA in gel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de vier elektrodegroepen (2, 3, 4, 5) zijn geplaatst volgens zijden van 15 een rombus voor beweging van de tegenover elkaar gelegen paren elektrodegroepen (2, 4 en 3, 5), waarbij elke elektrodegroep (2, 3, 4, 5) hulpelektroden (11) omvat geplaatst volgens lijnen die verlengstukken zijn van de rombuszijden voorbij de vertex van de grotere inwendige hoek daarvan en die een lengte bezitten bepaald door L 20 1 = waarin α de kleinere inwendige hoek van de rombus is en h de afstand is tussen tegenover elkaar gelegen zijden van de rombus. +++++++ 8820474·