NL8821094A

NL8821094A - Inrichting voor het elektroforetisch scheiden van hoogmoleculaire dna's in een gel.

Info

Publication number: NL8821094A
Application number: NL8821094A
Authority: NL
Original assignee: Inst Molekularbiologie Ak
Priority date: 1988-02-02
Filing date: 1988-11-25
Publication date: 1989-12-01
Also published as: JPH02503118A; WO1989007261A1; HUT54236A; PL277505A1; US5047136A; SE8903207D0; SE465485B; HU891469D0; GB2225432A; SE8903207L; GB8921977D0

Description

N.o. 36198 1 * 88 L ί ö 9 4' * AANVRAAGSTER NOEMT ALS UITVINDERS:

1. David Revazovich BERITASHVILI

2. Lev Valentinovich KARKLIT

5 3· Evgeny Nikolaevich TVERDOKHLEBQV.

Inrichting voor het elektroforetisch scheiden van hoog-moleculaire DNA's in een gel.

10

Gebied van de uitvinding.

De uitvinding heeft betrekking op het gebied van de elektroforetische scheiding en analyse van biopolymeren en in het bijzonder op inrichtingen voor de elektroforetische scheiding van hoog-15 moleculaire DNA's in een gel.

Stand van de techniek.

De scheiding van mengsels van biopolymeren, in het bijzonder waarvan de afmetingen 5.10^ paren nucleïnebases overtreffen, is 20 gebaseerd op puls-elektroforese, waarbij achtereenvolgens elkaar kruisende elektrische velden worden opgewekt in het gel met het mengsel van hoog-moleculaire DNA’s.

Op dit gebied is een inrichting bekend voor het scheiden van een mengsel van DNA-moleculen (G.P. Carle, M. Frank and M.V. Olson.

25 Electrophoretic Separation of Large DNA Molecules by Periodic Inversion of the Electric Field.- Science, v.232, 1986, biz. 65-68), waarin de rechthoekige elektroforesekamer is voorzien van twee horizontaal geplaatste, tegenover elkaar gelegen lineaire elektroden, waartussen de gel-eenheid wordt geplaatst. De spanning van een voedingsbron wordt 30 toegevoerd aan de elektrode via een schakelaar, zodat gedurende 3/4 van het gekozen tijdinterval de electroden onder een gelijkspanning staan en 1/4 van de tijdinterval - onder een omgekeerde spanning, welke cyclus vele malen wordt herhaald. Hierdoor wordt de bewegingsrichting van het DNA-molecuul periodiek 180° gevarieerd. Een dergelijke hoek is niet 35 optimaal voor een groot gebied van moleculaire massa's van te scheiden DNA-moleculen, als gevolg waarvan afzonderlijke fracties met afmetingen boven 2.10^ nucleïne basesparen (NBP) niet in deze bekende inrichting kunnen worden gescheiden. Verder resulteert reciproke verplaatsing van de moleculen in het gel in een langere scheidingstijd van het 40 aanvangsmengsel, dat wil zeggen, dat de produktiviteit van de inrichting 8821D94.' « 2 wordt verlaagd.

Ook is een inrichting bekend (G. Chy, D. Vollrath, R.W. Davis, Separation of Large DNA Molecules by Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields, Science, v. 234, 1986, biz. I582-I585), waarin zes 5 groepen van puntelektroden, die verticaal ten opzichte van de gel-eenheid zijn geplaatst, een regelmatig zesvlak vormen en elektrisch via identieke weerstanden in een lus zijn geschakeld, de gel-eenheid omgeven. De spanning van een voedingsbron wordt afwisselend via een schakelaar aan twee paren tegenover elkaar geplaatste elektrodengroepen 10 toegevoerd. Een derde paar elektroden is passief en dient voor het opwekken van een uniform elektrisch veld tussen de elektroden. In deze inrichting bewegen de DNA-moleculen met een richtingsverandering over 120° bij elke spanningsschakeling van het klokinterval. Bij dezelfde kamerafmetingen als in de eerder genoemde inrichting moet de gel-eenheid 15 kleiner zijn en dientengevolge een kleiner aantal neergeslagen monsters bevatten, wat eveneens de produktiviteit van de inrichting benadeelt. Verder moet het vermogen van de voedingsbron worden verdubbeld, omdat de stroom door de elektroden niet lager mag zijn dan door de bufferoplossing waarmee de gel-eenheid is bedekt.

20 Verder is een inrichting bekend voor het scheiden van hoog- moleculair DNA in een gel (US, A, 4.473*452) waarmee een scheiding van DNA-moleculen mogelijk is met afmetingen in het gebied van 5*10^ tot 9 · 106 NBP. Zijn vierkante elektroforese kamer is voorzien van vier groepen elektroden, waarbij twee aangrenzende kamerwanden groepen van 25 puntelektroden dragen, die elektrisch met elkaar tot een groep zijn verbonden terwijl de andere twee aangrenzende wanden twee afzonderlijke puntelektroden dragen in de onmiddelijke nabijheid van de einden van de twee tegenover hen gelegen elektrodegroepen. De spanning van een voedingsbron wordt via een schakelaar aan de elektroden toegevoerd, 30 waarbij de spanning van negatieve polariteit wordt toegevoerd aan de groep elektroden en de spanning van positieve polariteit wordt toegevoerd aan de tegenover gelegen afzonderlijke elektrode gedurende een bepaald tijdinterval, vervolgens wordt de spanning geschakeld naar de tweede groep elektroden en de tweede afzonderlijke elektrode 35 gedurende hetzelfde tijdinterval en met dezelfde onderlinge polariteit. Hierdoor wordt een elkaar kruisende, kromlijnige elektrische velden opgewekt in de gel-eenheid geplaatst binnen deze kamer, DNA-moleculen langs complexe banen gaan bewegen, waarvan de richting varieert van 90° naar l80° terwijl het molecuul de puntelektroden nadert.

40 De kromming van de velden die in deze bekende inrichting worden 8821 094.' 3 ύ opgewekt resulteert in de eerste plaats in kromlijnige banen van de afzonderlijke DNA-fractiebeweging in het gel, wat het probleem van het bepalen van hun moleculaire massa's buitengewoon complex maakt en het gebruik vereist van speciale correctieprogramma1s voor het automatisch 5 verwerken van de resultaten, bijvoorbeeld bij gebruik van gelscanners.

Ten tweede is het aantal gelijktijdig gescheiden monsters van DNA-moleculen betrekkelijk klein, omdat de extreme banen als gevolg van de kromming het gel kunnen verlaten en de bufferoplossing kunnen binnentreden.

10 In de techniek is verder een inrichting bekend voor de elektroforetische scheiding van hoog-moleculair DNA in een gel (PCT SU, 88/00124), voorzien van een elektroforese kamer met vier afzonderlijke groepen van elektroden die op onderling gelijke afstanden in elke groep zijn geplaatst en met behulp van dioden met elkaar zijn gebonden.

15 Elektrodegroepen zijn geplaatst langs de zijden van een gelijkzijdige vierhoek (vierkant, ruit) en aangesloten op een voedingsbron via een schakelaar. Eén paar tegenover gelegen elektrodegroepen is gebonden met één uitgang van deze schakelaar, het andere paar met de andere uitgang van de schakelaar, waarvan de ingang is aangesloten op de voedingsbron.

20 Als de voedingsbron wordt ingeschakeld, wordt een groep elektroden van het paar met een positieve spanning gevoed en de andere groep van dit paar met een spanning van negatieve polariteit. DNA-moleculen worden gericht volgens de elektrische fluxvelden en beginnen te bewegen naar de elektrodegroepen met positieve potentiaal. Na een specifiek 25 tijdinterval wordt met de schakelaar de spanning aan het andere paar elektrodegroepen overgebracht en gaan DNA-moleculen zich opstellen volgens de fluxlijnen van een nieuwe richting en beginnen zij te bewegen naar de positief geladen groep elektroden. Daarna wordt de spanning weer teruggeschakeld naar de eerste groep elektroden en dezelfde polariteit 30 toegevoerd als gedurende de eerste klokperiode. Na verloop van hetzelfde tijdinterval wordt de spanning weer toegevoerd aan de tweede groep elektroden, maar met een polariteit die omgekeerd is ten opzichte van die in de tweede klokperiode. Deze vier klokperioden vormen een cyclus, die wordt herhaald tot de lichtste DNA-fracties niet het gebied bereiken 35 tegenover de neerslagzijde van de gel-eenheid.

Deze bekende inrichting laat echter geen effectieve scheiding toe van afzonderlijke DNA-fracties met afmetingen boven 2.10^ NBP.

Beschrijving van de uitvinding 40 De onderhavige uitvinding lost het probleem op van het verschaffen mi 094,* ’ 4 * van een inrichting voor elektroforetische scheiding van hoog-moleculaire DNA's in een gel met een spanningstoevoerschakeling waarmee uniforme elektrische velden kunnen worden opgewekt over de gehele dwarsdoorsnede van de gel-eenheid, met de mogelijkheid van het variëren van het 5 elektrische veld in het gebied van 90° tot 180° gedurende het scheidingsproces van het aanvangsmengsel van DNA-moleculen.

Dit wordt bereikt door de inrichting voor elektroforetische scheiding van hoog-moleculair DNA in een gel, voorzien van een elektroforese kamer met rechthoekige vorm met vier identieke groepen 10 elektroden geplaatst aan de rechthoekzijden waarbij zij een gel-eenheid omgeven, waarbij elektroden in elke groep op onderling gelijke afstand zijn geplaatst, en een schakelaar en een voedingsbron aanwezig is, welke inrichting volgens de uitvinding verder is voorzien van een aanvullende voedingsbron, waarin een paar insluitende elektrodegroepen 15 is verbonden met de uitgangen van de schakelaar, waarvan de ingangen zijn verbonden met de uitgangen van de aanvullende voedingsbron, terwijl het andere paar insluitende elektrodegroepen is verbonden met de uitgangen van de hoofdvoedingsbron.

Ook wordt dit bereikt door de inrichting voor elektroforetische 20 scheiding van hoog-moleculair DNA in een gel, voorzien van een elektroforesekamer met vier identieke elektrodegroepen opgesteld langs de zijden van een rechthoek die de gel-eenheid omgeven, waarbij elektroden in elke groep op onderling gelijke afstanden zijn geplaatst, terwijl een schakelaar en een voedingsbron aanwezig is, welke inrichting 25 volgens de uitvinding verder is voorzien van een aanvullende schakelaar verbonden met de uitgangen van de voedingsbron en met de hoofdschakelaar, waarvan de ingangen zijn aangesloten op de uitgangen van de voedingsbron, waarin een paar insluitende elektrodegroepen is verbonden met de voedingsbron via de hoofdschakelaar en het andere paar 30 insluitende elektrodegroepen is verbonden met de voedingsbron via de aanvullende schakelaar.

De uitvinding verschaft een verbeterde produktiviteit van het proces van de scheiding van DNA-moleculenmengels.

35 Korte beschrijving van de tekeningen

Deze en andere doeleinden en voordelen van de onderhavige uitvinding zullen duidelijk worden aan de hand van de hierna volgende beschrijving onder verwijzing naar specifieke uitvoeringsvormen daarvan en de bijgaande tekeningen, waarin: 40 Fig. 1 het blokschema toont van de eerste uitvoeringsvorm van de 8821094.

i 5 i inrichting voor elektroforetische scheiding van hoog-moleculair DNA in een gel volgens de onderhavige uitvinding;

Fig. 2 toont een vectordiagram van spanningen die de banen aangeven van de beweging van de DNA-moleculen in een gel-eenheid volgens 5 de onderhavige uitvinding;

Fig. 3 toont het blokschema van een tweede uitvoeringsvorm van de inrichting voor elektroforetische scheiding van hoog-moleculair DNA in een gel volgens de onderhavige uitvinding;

Fig. 4 toont het tijddiagram van de spanningen toegevoerd aan 10 elektrodegroepen van de tweede uitvoeringsvorm van de inrichting volgens de uitvinding;

Fig. 5 toont bewegingsbanen van DNA-moleculen in een gel volgens de onderhavige uitvinding.

15 Voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding

De inrichting voor elektroforetische scheiding van hoog-moleculair DNA in een gel omvat een elektroforesekamer 1 (fig. 1) van rechthoekige vorm met vier identieke elektrodegroepen 2, 3. 4, 5» elk voorzien van een gelijk aantal elektroden onderling verbonden via dioden (in de 20 figuur niet weergegeven). Elektrodegroepen 2, 3, 4, 5 zijn gemonteerd op een houder (in de figuur niet weergegeven), die gelijktijdig dient als bovendeksel van de elektroforesekamer 1, langs de zijden van een rechthoek die de in de kamer 1 geplaatst de bodemgel-eenheid 6 omgeeft waarbij één zijde daarvan de monsters 7 van de DNA-molecuulmengsels 25 draagt. De gel-eenheid 6 is ondergedompeld in een bufferoplossing die stroomdoorgang verschaft tussen passende elektrodegroepen 2, 3. 4, 5 als spanning aan hen wordt toegevoerd. Elektrodegroepen 2, 4 zijn aangesloten op de voedingsbron 8, groepen 3» 5 op de voedingsbron 10 via schakelaar 9· 30 Fig. 2 toont het vectordiagram van de elektrische veldintensiteit waardoor de banen van de beweging van de DNA-moleculen worden bepaald.

E^ is de elektrische veldintensiteit opgewekt tussen elektrodegroepen 2 en 4 (fig. 1) bij het inschakelen van voedingsbron 8; E£+ (fig. 2) is de vector van de elektrische veldintensiteit opgewekt tussen 35 elektrodegroepen 3 en 5 (fig· 1) met de spanning van de ene polariteit toegevoerd door voedingsbron 10; E2_ (fig. 2) is de vector van de elektrische veldintensiteit opgewekt tussen elektrodegroepen 3 en 5 (fig. 1) bij tegengestelde polariteit van de spanning; E' (fig. 2} is de resulterende veldintensiteitsvector, E' = + E2+; E" is de 40 resulterende veldintensiteitsvector bij een tegengestelde polariteit van 8621 09 4.' Ί 6 de spanning, Ë" = + E2_; en α is de hoek tussen de vectoren E' en E".

In de tweede uitvoeringsvorm van de inrichting zijn de elektrodegroepen 2 en 4 (fig. 3) verbonden met de uitgangen van de schakelaar 11 en zijn de elektrodegroepen 3 en 5 verbonden met de 5 uitgangen van de schakelaar 12, waarbij de ingangen van de schakelaars 11 en 12 onderling zijn verbonden en zijn aangesloten op de uitgangen van de voedingsbron 13·

Fig. 4 toont spanningsspulsen en U2 afkomstig van de voedingsbron 13 (fig. 3) bij elektrodegroepen 2, 4 respectievelijk 3i 5· 10 Fig. 5 toont bewegingsbanen voor het DNA-molecuul van monster 7 in gel-eenheid 6 (fig. 1, 3)·

De inrichting voor elektroforetische scheiding van hoog-moleculair DNA in een gel volgens de uitvinding werkt als volgt. Gel-eenheid 6 met daarin geplaatste monsters 7 (fig* 1) van het DNA-molecuulmengsel wordt 15 geplaatst in een elektroforesekamer 1 parallel aan zijn wanden en gevuld met een bufferoplossïng die in contact is met de elektroden van alle vier elektrodegroepen 2, 3t 4, 5· De spanning van de voedingsbron 8 wordt toegevoerd aan de elektrodegroepen 2 en 4 terwijl een spanning van willekeurige polariteit wordt gevoerd naar de elektrodegroepen 3 en 5 20 vanaf voedingsbron 10 via schakelaar 9· Dit heeft tot gevolg dat DNA-moleculen worden beïnvloed door twee elektrische velden: een elektrisch veld met een intensiteit Ë]_ (fig. 2) opgewekt tussen elektrodegroepen 2 en 4 (fig. 1) bij het inschakelen van voedingsbron 8 en een elektrisch veld met een intensiteit Ë2+ (fig. 2) opgewekt tussen 25 elektrodegroepen 3 en 5 door de spanning van de voedingsbron 10. De bewegingsrichting van het DNA-molecuul wordt aangegeven door vector Ë' (fig. 2), gevormd door de vectoriële som van en Ë2+. Na een bepaald tijdinterval wordt met schakelaar 9 (fig· 1) de polariteit omgekeerd van de spanning toegevoerd aan de elektrodegroepen 3 en 5, wat tot gevolg 30 heeft dat de DNA-moleculen de richting van hun verplaatsing wijzigen volgens een hoek gelijk aan a (fig. 2), waarin tga/2 = Ê2_/%, omdat Ë' E' = E^ + E2_ + E2_.

Dientengevolge definiëren op unieke wijze vaste waarden van de spanningen van voedingsbronnen 8 en 10 (fig. 1) de hoek a (fig. 2) 35 waardoor de bewegingsbanen van het DNA-molecuul worden gewijzigd gedurende de aanvangsscheiding van het mengsel 7. Door variatie van één of beide spanningen kan de hoek a (fig. 2) worden bestuurd gedurende het scheidingsproces in het gebied 9°^ a £180°, d.w.z. door het verschaffen van een aanvullende voedingsbron 10 (fig. 1) en het gelijktijdig 40 aansluiten van beide voedingsbronnen 8 en 10 op passende 8821094.

7 elektrodegroepen wordt een superpositie van uniforme elektrische velden teweeggebracht ter plaatse van de gel-eenheid 6 in de inrichting.

Voor een effectieve scheiding van een lange ketting DNA-moleculen met afmetingen die de oplossing van de werkwijze naderen (5.10^ tot 1θ7 5 NBP) wordt elektroforese met een duur van meerdere dagen toegepast bij elektrische veldintensiteiten die 4 tot 5 maal lager zijn dan gebruikelijk. Ter vermijding van vroegtijdige verarming van de bufferoplossing is het van voordeel een andere voedingswijze toe te passen, waarin de spanning voor insluitende elektrodegroepen 2, 4 en 3. 10 5 (fig. 3) afwisselend wordt toegevoerd. Dit geschiedt door toepassing van een extra schakelaar 13 (fig. 3)· Ia dit geval worden pulsen (fig. 4a) van voedingsbron 13 (fig. 3) toegevoerd aan elektrodegroepen 2 en 4 via schakelaar 11, welke pulsen van de ene polariteit zijn en een vermogensfactor 0,5 bezitten. In de pauzen tussen de pulsen worden U2 15 (fig. 4b) met willekeurige polariteit door schakelaar 12 (fig. 3) aan de elektrodegroepen 3 en 5 toegevoerd gedurende de helft van de aangegeven tijd. Daarna wordt de polariteit van de pulsen U2 bij de elektrodegroepen 3 en 5 (fig· 3) omgekeerd, welke polariteitsomkering wordt uitgevoerd gedurende de gehele periode van de aanvangsscheiding 20 van het DNA-molecuulmengsel. De bijbehorende banen van de moleculenbeweging zijn weergegeven in fig. 5· Bij toepassing van deze schakeling voor het scheiden van DNA van kleinere afmetingen wordt de resolutie niet aangetast, maar de scheidingstijd is 2*/^ maal langer.

Als dus de inrichting wordt aangevuld met een extra voedingsbron 25 10 (fig.1) of extra schakelaar 12 (fig. 3)» wordt de produktiviteit van de inrichting verbeterd terwijl het gebied wordt uitgebreid van het volgens de moleculaire massa scheiden van de DNA-moleculen. In beide uitvoeringsvormen wordt de scheiding van hoog-moleculaire DNA-moleculen in een gel bereikt met behulp van elektrodegroepen 2, 3. 4, 5 (figuren 30 1, 3) geplaatst langs de zijden van een rechthoek, met onderling gelijke afstanden van de elektroden in de groepen 2, 3» 4, 5 en parallel of in serie aangesloten op de voedingsbronnen 8, 10 (fig. 1) en 13 (fig. 3), voor het opwekken van een reeks of superpositie van uniforme elektrische velden die een specifieke hoek a (fig. 2) leveren voor het variëren van 35 de richting van de verplaatsing van het DNA-molecuul in de gel-eenheid 6 (figuren 1, 3)- Bit waarborgt een volledig gebruik van het totale oppervlak van de gel-eenheid 6 en maakt een programmeerbare variatie mogelijk van de condities van de DNA-molecuulscheiding bij experimenten.

40 8821094.

8 4

Industriële toepassing.

De uitvinding kan met succes worden gebruikt bij biomanipulaties, moleculaire biologie en in de genetica, de bio-chemie en ook op geneeskundig gebied en in de landbouw.

8821094.

Claims

9 *

1. Inrichting voor elektroforetische scheiding van hoog-moleculair DNA in een gel, voorzien van een elektroforesekamer (1) met daarin 5 geplaatst langs de zijden van een rechthoek, die een gel-eenheid (6) omgeeft, vier identieke groepen (2, 3» 4, 5) van op onderling gelijke afstand gelegen elektroden, schakelaar (9) en voedingsbron (8), met het kenmerk, dat deze verder is voorzien van een aanvullende voedingsbron (10), met een paar insluitende elektrodegroepen (3, 5) aangesloten op de 10 uitgangen van de schakelaar (9) waarvan de ingangen zijn verbonden met de uitgangen van de aanvullende voedingsbron (10), en met het andere paar insluitende elektrodegroepen (2, 4) aangesloten op de uitgangen van de hoofdvoedingsbron (8).

2. Inrichting voor elektroforetische scheiding van hoog-moleculair 15 DNA in een gel, voorzien van een elektroforesekamer (1) met daarin geplaatst langs de zijden van een rechthoek, die een gel-eenheid (6) omgeeft, vier identieke groepen (2, 3. 4, 5) van op onderling gelijke afstand geplaatste elektroden, schakelaar (11) en voedingsbron (13), met het kenmerk, dat de inrichting verder is voorzien van een schakelaar 20 (12) aangesloten op de uitgangen van voedingsbron (13) en op hoofdschakelaar (11), waarvan de ingangen zijn verbonden met de uitgangen van de voedingsbron (13), waarbij een paar insluitende elektrodegroepen (2, 4) zijn verbonden met de voedingsbron (13) via hoofdschakelaar (11) en waarbij het andere paar insluitende 25 elektrodegroepen (3, 5) is verbonden met de voedingsbron (13) via de aanvullende schakelaar (12). . „__._ . - ·' ; -.Τ'* 8821094/