CH658517A5 - In vitro-testverfahren zur bestimmung von endotoxin. - Google Patents

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CH658517A5
CH658517A5 CH2149/81A CH214981A CH658517A5 CH 658517 A5 CH658517 A5 CH 658517A5 CH 2149/81 A CH2149/81 A CH 2149/81A CH 214981 A CH214981 A CH 214981A CH 658517 A5 CH658517 A5 CH 658517A5
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hydrolyzed
endotoxin
disorder
acrylic acid
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CH2149/81A
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David L Juranas
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Endoto-xinen in vitro sowie auf ein Testreagens zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die Hämolymphe der Hufeisenkrabbe, Limulus-Poly-phemus, enthält Amöbocyten. Die Lyse dieser Amöbocyten setzt eine Substanz frei, welche mit Endotoxin unter Bildung eines Gels reagiert. Diese Reaktion zwischen Limulus-Amöbocyt-Lysat (im folgenden gelegentlich als «LAL» oder «Lysat» bezeichnet) und Endotoxin wurde als Grundlage für Verfahren zur Feststellung und/oder Bestimmung von Endotoxin in einer Vielzahl von Flüssigkeiten pharmazeutischen/ medizinischen Interessens gewählt. Wenn jedoch dieser Test verwendet wird, um die Gegenwart von Endotoxinen in gewissen Produkten, wie Lipidemulsionen, Salzlösungen und Blutplasmaprodukten zu bestimmen, können diese Produkte die Reaktion des vorhandenen Endotoxins mit dem Lysat stören. Dies führt zu ungenauen Resultaten bei der Feststellung von Endotoxin in solchen Produkten.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Beschaffung eines Verfahrens, welches geeignet ist zum Nachweis oder zur Bestimmung des Endotoxins in Produkten, welche dazu neigen, die Reaktion zwischen Endotoxin und LAL zu stören.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein verbessertes in vitro-Testverfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung eines Endotoxins mit LAL in Flüssigkeiten, welche die Reaktion zwischen Endotoxin und LAL stören und dadurch ungenaue Bestimmungen ergeben, ermöglicht. Das Verfahren ist in Patentanspruch 1 definiert.
Ein Testreagens zur Durchführung des Verfahrens ist in Patentanspruch 8 definiert.
Die zu untersuchenden Flüssigkeiten sind übliche parenterale Flüssigkeiten und umfassen Lipidemulsionen zur intravenösen Verabreichung, z.B. wässerige Emulsionen von pflanzlichen Ölen, wie Sojabohnenöl, das in Konzentrationen von 5 bis 50 Gewichtsprozent erhältlich ist; Salzlösungen, z.B. parenteral zu verabreichende Natriumchloridlösungen, einschliesslich Natriumchlorid für Injektion USP, Natriumchlorid zur Irrigation USP, Natriumchlorid zur Inhalation und laktierte Ringer-Lösung; sowie Blutderivate, z.B. normales Serumalbumin, erhältlich in 5% bis 25% Gewicht/Volumen, Plasmaproteinfraktion und antihemophiler Faktor USP, Immunglobulin, Rho(D)-Immunglobulin und antimenschliches Globulinserum.
Die für die vorliegende Erfindung nützlichen, die Störung herabsetzenden Mittel sind Polyelektrolyte mit durchschnittlichen Molekulargewichten von mindestens 1000, vorzugsweise 1600 bis 20 000 und mehr, insbesondere 1600 bis
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50 000, welche eine im wesentlichen lineare kontinuierliche Kohlenstoffkette aufweisen, abgeleitet durch die Polymerisation einer aliphatischen ungesättigten Gruppe. Die Polyelek-trolyte dieser Art sind daher äthylenische Polymere, welche zahlreiche Seitenketten, entlang einem im wesentlichen linearen kontinuierlichen Kohlenstoffatommolekül enthalten. Die Seitenketten können Kohlenwasserstoffgruppen, Carb-oxylsäuregruppen oder Derivate davon, Aminoalkylgrup-pen, Alkoxygruppen und andere organische Gruppen sein, wobei die Anzahl dieser Gruppen und das Verhältnis von hydrophilen zu hydrophoben Gruppen derart ist, dass eine wasserlösliche polymere Verbindung mit einer grossen Anzahl ionisierbaren Resten vorhanden ist. Der Ausdruck «wasserlösliches» Polymer umfasst hier auch jene, welche homogene Gemische mit Wasser bilden, sowie die schwerlöslichen Polymere, welche in Gegenwart von Wasser expandieren und sich mindestens bis zu einem gewissen Grad auflösen.
Geeignete polyelektrolytische Polymere sind die Polymere von Acrylsäurederivaten, z.B. Acrylsäure, die Alkalimetallsalze, wie z. B. Natrium- und Kaliumsalze und die Ammoniumsalze von Acrylsäure, Acrylamid, Acrylnitril, die N-alkylsubstituierten Amide, die N-Aminoalkylamide und die entsprechenden N-alkylaminoalkylsubstituierten Amide, die Aminoalkylacrylate, die Aminoalkylmethacrylamide und die N-alkylsubstituierten Aminoalkylester von Acrylsäuren. Diese polymeren Verbindungen können Homopolymere sein oder Copolymere mit anderen copolymerisierenden Monomeren, wie Äthylen, Propylen, Isobutylen, Styrol, a-Methyl-styrol, Vinylacetat, Vinylformiat, Alkyläther, Acrylonitril, Methacrylonitril, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, die Alkyl-maleate, die Alkylfumarate und andere olefmischen ungesättigten Monomere, welche befähigt sind, Copolymere mit den obigen Verbindungen zu bilden. Die oben genannten Alkyl-gruppen enthalten 1 bis 6 Kohlenstoffatome. Copolymere dieser Art, welche mindestens 20 Mol-Prozent, vorzugsweise 50 Mol-Prozent und insbesondere 80 Mol-Prozent an Acrylsäurederivaten enthalten, werden bevorzugt, und insbesondere, wenn das Comonomer hydrophob ist oder keine iono-genen Gruppen aufweist.
Polymere dieser Art können direkt durch Polymerisation oder Copolymerisation geeigneter Monomeren, z.B. solchen, welche eine hydrophile Gruppe, wie eine Carboxyl-gruppe enthalten, hergestellt werden. Andere Polyelektrolyt-polymere können durch anschliessende Reaktionen von Polymeren und Copolymeren hergestellt werden. Beispielsweise können Polymere, welche Nitrilgruppen enthalten, hydroly-siert werden, um wasserlösliche Amid- und Carboxygruppen enthaltende Polymere zu bilden, oder hydriert werden, um aminogruppenhaltige Polymere zu erhalten. Wenn solche Polymere oder Copolymere hydrolysiert werden, werden sie im allgemeinen in einem Ausmass von 25 bis 100% und vorzugsweise in einem Ausmass von mindestens 80% der hydro-lysierbaren Gruppen hydrolysiert.
Besonders bevorzugte Polymere umfassen Polyacrylsäure mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 2000, Copolymere aus 75 Mol-Prozent Acrylsäure und 25 Mol-Prozent Acrylamidnatriumsalz mit einem Molekulargewicht von 1600 sowie ein Acrylonitrilcopolymer, das zu etwa 50 Mol-Prozent hydrolysiert ist mit Säure, um ein Acrylonitril- Acrylsäurecopolymer zu bilden.
Wenn solche Polyelektrolyte in der Säureform verwendet werden, werden sie während des LAL-Testverfahrens in ein Salz umgewandelt.
Wie oben erwähnt bilden die oben genannten, die Störung herabsetzenden Mittel üblicherweise Chelate mit zweiwertigen Kationen. Deshalb ist es notwendig, ein zweiwertiges Kation zuzusetzen, um das Cheliervermögen des die Stö3 658 517
rung herabsetzenden Mittels herabzusetzen oder zu beseitigen. Üblicherweise erfolgt dies in einer genügenden Menge, um diese Chelierfahigkeit zu beseitigen, im allgemeinen beträgt diese Menge etwa 0,05 bis 1,0 Mol, vorzugsweise 0,1 5 bis 0,5 Mol pro Mol Carboxylgruppen des die Störung herabsetzenden Mittels. Diese Zugabe erfolgt zusätzlich zu jedem zweiwertigen Kation, welches verwendet wird, um die Empfindlichkeit des Lysates zu erhöhen, wie weiter unten beschrieben. Üblicherweise wird das zweiwertige Kation mit io den die Störung herabsetzenden Mitteln kombiniert. Im Falle eines Alkalimetallsalzes als die Störung herabsetzendes Mittel bildet die Kombination mit dem zweiwertigen Kation ein gemischtes Salz, z.B. das Natriumcalciumsalz eines Co-polymers aus etwa 75 Mol-Prozent Acrylsäure und etwa 25 15 Mol-Prozent Acrylamid mit einem Molekulargewicht von 1600.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagens, welches in Patentanspruch 8 definiert ist. Dieses Reagens ist vorzugsweise lyophylisiert.
20 Das im Reagens enthaltene LAL kann nach dem Verfahren, welches in der GB-PS 1 522 127 beschrieben ist, hergestellt werden.
Beispielsweise kann die Hämolymphe aus gesunden Exemplaren von Limulus polyphemus in einer Kochsalz-25 Anticoagulans-Lösung gesammelt werden, allgemein wie beschrieben von Levin und Bang «Clottable Protein in Limulus: Its Localization and Kinetics of its Coagulation by Endotoxin», Thromb. Diath. Haemorrh 19:186 bis 197 (1968). Die Amöbocyten werden gesammelt und mit der Kochsalz-30 Anticoagulans-Lösung gewaschen und sodann zentrifugiert.
Die abgetrennten Amöbocyten werden in Wasser suspendiert und die osmotische Zerstörung der Zellen durch mehrfache Einwirkung einer mechanischen Bewegung vervollständigt. Die Zellbruchstücke werden vom Lysat mit Hilfe 35 einer Zentrifuge abgetrennt, und die Lysatfraktionen werden vereint und bei 0 bis 4 °C gelagert.
Die Empfindlichkeit des Lysates gegenüber Endotoxin wird auf die gewünschte Empfindlichkeitshöhe eingestellt durch Verdünnung oder durch Vermischen mit einem ande-40 ren Lysatansatz von verschiedener Empfindlichkeit. Die Lösung wird üblicherweise auf einen pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 mit Hilfe eines geeigneten Puffers, z.B. «Tromethamin» [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan] und «Tromethamin»-Hydrochlorid gepuffert.
45 Die gepufferte Lysatlösung, welche wie oben beschrieben erhalten wurde, wird in Serumgläschen abgefüllt, welche z.B. 1,2 oder 5,2 ml der Lösung enthalten, und diese unterteilte Lösung wird lyophilisiert.
Das lyophilisierte Lysat weist die Form eines weissen so Pulvers oder eines weissen, zerbrechlichen Kügelchens auf.
Die Empfindlichkeit des Lysates gegenüber Endotoxin wird erhöht durch Einschluss niederer Konzentrationen an zweiwertigen und einwertigen Kationen. Calciumionen werden als zweiwertige Ionen bevorzugt, doch können auch an-55 dere Erdalkaliionen, wie Magnesiumionen, oder andere zweiwertige Ionen verwendet werden. Natriumionen bilden die bevorzugten einwertigen Ionen, doch können andere einwertige Ionen, insbesondere Alkalimetallionen, wie z.B. Lithiumionen, verwendet werden. Die Chloride (CaCl2, NaCl, 60 usw.) bilden zweckmässige Quellen für diese Ionen, doch können auch andere Salze verwendet werden. Vorzugsweise werden diese Elektrolyte in die Empfindlichkeit gegen Endotoxin erhöhenden Mengen zugesetzt, z.B. derart, dass wenn das lyophilisierte Lysat rekonstituiert wird, die Konzentra-65 tion an zweiwertigem Kation (z.B. Ca+2) im Bereich von 0,0001 bis 0,1 Molar liegt, und die Konzentration an einwertigem Kation (z.B. Na+) im Bereich von 0,001 bis 0,1 Molar liegt.
658 517
Alle oben erwähnten Operationen werden unter solchen Bedingungen durchgeführt, dass sichergestellt ist, dass das Endprodukt steril und endotoxinfrei ist. Methoden zur Sicherstellung der Endotoxinfreiheit sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise können anorganische Zusätze (CaCl2, NaCl) endotoxinfrei gemacht werden durch Erhitzen der trockenen Salze auf 250 °C während mindestens 120 Minuten. Organische Zusätze müssen infolge ihrer Schmelzpunkte usw. üblicherweise aufgelöst werden und die Lösung bei 121 °C während 60 Minuten oder mehr in Autoklaven erhitzt werden, um jedes vorhandene Endotoxin zu zerstören.
Eine allgemeine Beschreibung des Verfahrens zur Bestimmung der Endotoxine kann im oben genannten britischen Patent gefunden werden.
Üblicherweise wird das lyophilisierte Lysat mit genügend sterilem, pyrogenfreiem Wasser rekonstituiert. Es wird sodann in aliquoten Teilen, z.B. 0,1 ml, in Reagensröhrchen abgefüllt und mit einer gleichen Menge der auf Endotoxin zu untersuchenden Flüssigkeit vermischt. Die Bildung eines Gels zeigt die Gegenwart von Endotoxin an.
Dieses Verfahren wird durchgeführt unter Verwendung einer genügenden Menge an Lysat, z.B. 0,01 bis 1 ml rekonstituiertes Lysat von geeigneter Aktivität, z.B. 0,01 bis 0,25 ng/ml auf US-Referenz-Endotoxin EC-2. Die Verfahrensbedingungen umfassen z.B. geeignete Reaktionszeiten, z.B. 10 Minuten bis 60 Minuten, geeignete Reaktionstemperatur, z.B. 36 °C bis 40 °C, die Verwendung eines Puffers, z. B. Tris-HCl, um das pH zwischen etwa 6,0 und 8,0 während der Bestimmung zu halten.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist das die Störung herabsetzende Mittel während der Lysat-Endotoxin-Reak-tion, vorzugsweise während der ganzen Reaktion zugegen. Mit Vorteil wird das die Störung herabsetzende Mittel der zu untersuchenden Flüssigkeit vor dem Lysat zugesetzt oder in das LAL-Reagens vor der Lyophylisierung einverleibt. Es wird in die Störung herabsetzenden Mengen verwendet, z.B., wenn es dem Lysat vor der Untersuchung zugesetzt wird, in einer Menge von 0,05 bis 3,0% Gewicht/Volumen, vorzugsweise 0,4% Gewicht/Volumen, berechnet auf das Gesamtvolumen der Testprobe, und wenn es in das Reagens einverleibt und lyophilisiert wird, wird es in einer Menge von etwa 0,05 bis etwa 3,0% Gewicht/Volumen, vorzugsweise 0,4% Gewicht/Volumen, bezogen auf das Volumen der Lysatlösung, verwendet.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. Alle Teile sind, sofern nichts anderes angegeben ist, Gewichtsteile.
Sämtliche im folgenden beschriebenen Operationen wurden unter solchen Bedingungen durchgeführt, dass sichergestellt wurde, dass das Endprodukt steril und endotoxinfrei ist.
Beispiel 1
Die Hämolymphe von gesunden Exemplaren von Limu-lus polyphemus wird in einer Kochsalz-Anticoagulanslösung gesammelt, wie allgemein beschrieben von Levin und Bang (siehe oben). Die Amöbocyten werden gesammelt und mit der Kochsalz-Anticoagulans-Lösung gewaschen und zentri-fugiert.
Die abgetrennten Amöbocyten werden in Wasser suspendiert und die osmotische Zerstörung der Zellen durch mehrfache Einwirkung von mechanischer Bewegung vervollständigt. Die Zellbruchstücke werden vom Lysat mit Hilfe einer Zentrifuge abgetrennt, und die Lysatfraktionen werden vereint und bei 0 bis 4 °C gelagert.
Die Empfindlichkeit des Lysates gegenüber Endotoxin wird auf die gewünschte Empfindlichkeitshöhe eingestellt. Die Lösung wird mit Hilfe von «Tromethamin» [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan] und «Tromethin»-Hydrochlorid auf einem pH-Bereich von 6,5 bis 7,5 gepuffert und mit Calci umchlorid zu einer Konzentration von 0,01 Molar und mit Natriumchlorid zu einer Konzentration von 0,077 Molar versetzt, wobei alle diese Zusätze zuvor endotoxinfrei gemacht wurden.
5 Das gepufferte Lysat (I) wird sodann in Serumfläschchen unterteilt, von denen jedes 5,2 ml der Lösung enthält, und anschliessend diese unterteilte Lösung lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung werden die Fläschchen versiegelt und gekühlt.
io Das die Störung herabsetzende Mittel (II) wird hergestellt durch Zusatz von 5 ml sterilem Wasser für Injektion USP und 50 mg Ca(OH)2 zu 5 ml 43%iger (Gewicht/Volumen) Polyacrylsäure-Polyacrylamid-Copolymer-(75 Mol-Prozent Säure, 25 Mol-Prozent Acrylamid) -Natriumsalz in ls Wasser, Molekulargewicht 1600. Diese Lösung wird während 30 Minuten bei 121 °C im Autoklaven erhitzt, um sie pyrogenfrei zu machen und anschliessend mit 0,2 ml 12N HCl auf pH 7,5 eingestrellt. 4,0 ml der Lösung (II) wurden sodann zu 200 ml der gepufferten Lysatlösung (I), hergestellt 20 wie oben beschrieben, vor dem Lyophylisieren zugesetzt. Die erhaltene, die Störung herabsetzende Lysatlösung (III) wird sodann in Serumfläschchen unterteilt, wobei jedes 5,2 ml der Lösung enthält, und diese unterteilte Lösung wird lyophilisiert. Nach der Lyophylisierung werden die Fläschchen ver-2s siegelt und gekühlt.
Die folgenden Operationen wurden unter Bedingungen durchgeführt, welche die Asepsis und den Ausschluss der Einführung von Endotoxin von Aussen sicherstellen.
Serienmässig verdünnte Endotoxinlösungen wurden her-30 gestellt aus E. coli 055:B5-Endotoxin in jeder der folgenden Lösungen: sterilem Wasser für Injektionen USP; 20%iger Lipidemulsion («Intra Lipid», erhältlich von Cutter Labs) und Plasmaproteinfraktion (erhältlich von Cutter Labs). Diese serienmässig verdünnten Endotoxinproben wurden so-35 dann sowohl mit Lysat (I) wie mit die Störung herabsetzendem Lysat (III) untersucht. Die Tests wurden durchgeführt durch Rekonstituierung der Lysate (I) und (III) mit 5,2 ml sterilem Wasser für Injektionen USP, gefolgt von schwachem Schütteln während einiger Sekunden, um den Rück-40 stand vollständig aufzulösen. Aliquote Teile von 0,1 ml der rekonstituierten Lysate (I) und (III) wurden in 10 mm x 75 mm Reagensgläschen abgefüllt; zu jedem Gläschen wurden 0,1 ml der oben erhaltenen serienmässig verdünnten En-dotoxinlösung zugesetzt. Die Gläschen wurden leicht ge-45 schüttelt, um den Inhalt zu vermischen und anschliessend ungestört bei 37 °C während 60 Minuten inkubiert.
Nach dieser Zeit wurde ein Titer als die niederste Konzentration an Endotoxin, welche ein positives Resultat im LAL-Test ergab, festgestellt. Ein Test wurde als positiv ge-5o wertet, wenn das Lysat einen Klumpen bildet, welcher ungetrennt blieb, wenn das Gläschen um 180° gedreht wird, und negativ bewertet, wenn das Gel brach vor der vollen Umkehrung um 180°. Wie in Fachkreisen üblich, ergeben Flüssigkeiten, welche die Endotoxin-Bestimmung durch LAL nicht 55 stören, einen Titer, welcher sich vom Titer von sterilem Wasser für Injektionen USP um nicht mehr als plus oder minus eine zweifache Verdünnung unterscheidet.
Die Testresultate für Endotoxin-Konzentrationen in entsprechenden Lösungen sind unten zusammengestellt:
60 Tabelle I
Getestete Lösung Titer mit Lysat Titer mit Störung
(I) herabsetzendem Ly- sat (III)
65 steriles WFI USP 25 pg/ml 25 pg/ml
20 %ige Lipidemulsion > 100 pg/ml 50 pg/ml
Plasma-Protein- >100 pg/ml 50 pg/ml Fraktion
Beispiel 2
Lysat (I) und die Störung herabsetzendes Mittel (II) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Serienmässig verdünnte Endotoxinlösungen wurden hergestellt entweder aus E. coli 055:B5-Endotoxin oder aus US-Referenz-Endotoxin EC-2 in einer oder mehreren der folgenden Lösungen : Steriles Wasser für Injektion USP; 5% Albumin (Cutter Labs); 0,9% NaCl USP (Travenol); 10% Lipidemulsion (Cutter Labs), und Plasma-Protein-Fraktion (Cutter Labs). Eine Probe wurde von jeder der entsprechen658 517
den serienmässig verdünnten Lösungen entnommen und mit Lysat (I) untersucht. Nachdem diese Proben entfernt worden waren, wurde das die Störung herabsetzende Mittel (II) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2% Volumen/Volumen (0,1 ml (II) plus 5 ml Probe) zu ergeben. Die Lösungen wurden kräftig gemischt und dann nochmals mit Lysat (I) getestet.
Die Testresultate für Endotoxin-Konzentrationen in entsprechenden Lösungen sind unten zusammengestellt.
Tabelle!!
Getestete Lösung
055:B5 Endotoxin w/o II
w/2% II
EC-2-Endotoxin w/o II
w/2% II
steriles WFI USP 10%ige Lipidemulsion Plasma-Protein-Fraktion 5% Albumin Kochsalzlösung USP * nicht getestet.
50 pg/ml >100 pg/ml >100 pg/ml >100 pg/ml
Getestete Probe
Titer ohne (V)
Titer mit 10% (V)
25 pg/ml 25 pg/ml 25 pg/ml 25 pg/ml
60 pg/ml 30 pg/ml
> 250 pg/ml
> 250 pg/ml
> 250 pg/ml
30 pg/ml 30 pg/ml 60 pg/ml
Beispiel 3
Lysat (I) wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Polyacrylsäure-Acrylonitril-Copolymer, das zu etwa 50 Mol-Prozent hydrolysiert war (IV) wurde hergestellt durch Zusatz von 15 ml H20 und 50 ml konzentrierter H2S04 zu 2 g Polyacrylnitril in einem 100-ml-Becher. Die Lösung wurde während 20 Stunden bei 25 °C mit einem Magnetrührer vermischt. Das erhaltene Polymer (IV) wurde sodann durch Zusatz von 100 ml Äthanol ausgefallt. Der Feststoff wurde durch Zentrifugieren gesammelt und viermal mit 2Ò0 ml Äthanol gewaschen. Das erhaltene Polymer (IV) wurde sodann bei 60 °C unter Vakuum während 8 Stunden getrocknet.
Ein die Störung herabsetzendes Mittel (V) wurde hergestellt durch Auslösen von 50 mg Polymer (IV) in einer Lösung von 10 ml H20 und 0,5 ml 5N NaOH. Zu dieser Lösung wurden 25 mg Ca(OH)2 zugesetzt und das erhaltene Gemisch während 30 Minuten bei 121 °C im Autoklaven erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt und das pH mit 12N HCl auf 7,0 eingestellt.
Ein serienmässig verdünntes Endotoxin wurde hergestellt aus US-Referenz-Endotoxin EC-2 in 0,9% normaler Kochsalzlösung USP (Travenol) und sterilem Wasser für Injektionen USP. Die entsprechenden serienmässig verdünnten Endotoxinlösungen wurden sodann mit dem Lysat (I) wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Nach dieser Untersuchung wurde die Störung herabsetzendes Mittel (V) zu einer Endkonzentration von 10% Volumen/Volumen (0,6 ml (V)
plus5 ml Probe) zugesetzt. Die Lösungen wurden kräftig vermischt und einmal mehr mit Lysat (I) getestet. Die Testresultate sind die folgenden:
Tabelle III
H20, 7,5 g NaOH und 107 mg Ca(OH)2. Die Lösung wurde während 30 Minuten bei 121 °C im Autoklaven erhitzt und 25 das pH sodann mit 5N HCl auf 8,0 eingestellt.
Eine serienmässig verdünnte Endotoxinlösung wurde hergestellt aus US-Referenz-Endotoxin EC-2 in 0,9% normaler Kochsalzlösung USP und sterilem Wasser für Injektionen USP. Die entsprechend serienmässig verdünnten En-3o dotoxinlösungen wurden sodann mit Lysat (I) wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Nach dieser Untersuchung mit Lysat (I) wurde die Störung herabsetzendes Mittel (VI) zu einer Endkonzentration von 7% zugesetzt und das Gemisch wiederum mit Lysat (I) getestet.
Die Testresultate sind wie folgt:
35
Tabelle IV
Getestete Probe
Titer ohne (VI) Titer mit (VI)
45
steriles WFI USP 30 pg/ml 30 pg/ml
0,9% normale Kochsalzlösung USP 500 pg/ml 125 pg/ml
Beispiel 4
Lysat wurde hergestellt wie zuvor in Beispiel 1 beschrie- Getestete Probe ben. 65
Ein die Störung herabsetzendes Mittel (VI) wurde herge- steriles WFI USP
stellt durch Vermischen von 25 ml einer 65%igen Polyacryl- 0,9% normale Kochsalzlö-
säure-H20-Lösung (Molekulargewicht : 2000) mit 75 ml sung USP
steriles WFI USP 30 pg/ml 30 pg/ml
0,9% normale Kochsalzlösung USP 500 pg/ml 30 pg/ml
Beispiel 5
Lysat (I) wurde hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das die Störung herabsetzende Mittel (VII) wurde hergestellt durch Auflösen von 2,1 g Acrylsäure-Acrylamid-Copo-lymer (Molekulargewicht : 200 000) in einer Lösung von 19 ml Wasser für Injektionen und 100 mg Ca(OH)2. Die Lösung wurde gemischt, bis alle Feststoffe aufgelöst waren und 5" anschliessend das pH mit 0,7 ml 5N HCl auf 8,0 eingestellt.
Eine serienmässig verdünnte Endotoxinlösung wurde aus US-Referenz.Endotoxin EC-2 in 0,9%iger normaler Kochsalzlösung USP und sterilem Wasser für Injektionen USP hergestellt. Die serienmässig verdünnten Endotoxinlösungen 55 wurden sodann mit Lysat (I) wie in Beispiel 1 getestet. Nach dieser Untersuchung mit dem Lysat (I) wurde die Störung herabsetzendes Mittel (VII) zu einer Endkonzentration von 4% Volumen/Volumen (0,2 ml (VII) plus 5 ml Probe) zugesetzt. Die Lösungen wurden tüchtig vermischt und wiederum 6o mit Lysat (I) getestet.
Die erhaltenen Resultate waren die folgenden:
Tabelle V
Titer ohne (VII) Titer mit (VII)
60 pg/ml 500 pg/ml
30 pg/ml 30 pg/ml

Claims (10)

  1. 658 517
    PATENTANSPRÜCHE
    1. In vitro-Testverfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Endotoxin mit Lumulus-Amöbocyt-Lysat in Flüssigkeiten, welche die Reaktion zwischen Endotoxin und Lysat stören, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Li-pidemulsionen für Injektionen, parenteral zu verabreichende Natriumchloridlösungen, lactierter Ringer-Lösung, normalem Serumalbumin, Plasmaproteinfraktion und antihämo-philem Faktor USP, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in Gegenwart von (a) einer die Störung herabsetzenden Menge eines im wesentlichen linearen polymeren, mindestens teilweise wasserlöslichen oder mit Wasser homogen mischbaren, die Störung herabsetzenden Mittels, welches Mittel ein Molekulargewicht von mindestens 1000 aufweist und von Monomeren abgeleitet ist, die ungesättigte aliphatische Gruppen enthalten, und (b) einer genügenden Menge eines zweiwertigen Kations, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Calcium und Magnesium, um das Chelierungs-vermögen des die Störung verhindernden Mittels mindestens herabzusetzen, durchführt.
  2. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das die Störung herabsetzende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure-Acryl-amidcopolymer, Acrylsäure-Acrylonitrilcopolymer, Poly-acrylsäure, Alkalimetall- und Ammoniumsalzen von Poly-acrylsäure, hydrolysiertes Polyacrylamid, Alkalimetall- und Ammoniumsalze von hydrolysiertem Polyacrylamid, hydro-lysiertem Polyacrylonitril und Alkalimetall- und Ammo-niumsalzen von (hydrolysiertem) Polyacrylonitril.
  3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das die Störung herabsetzende Mittel in einer Menge von 0,05 bis 3% Gewicht/Volumen vorhanden ist und das zweiwertige Kation in einer Menge von 0,05 bis 1,0 Mol pro Mol Carboxylgruppen des die Störung herabsetzenden Mittels zugegen ist.
  4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das die Störung herabsetzende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylsäure, Po-lyacrylsäurenatriumsalz, einem Copolymer von Acrylsäure und Acrylamid, hydrolysiertem Polyacrylamid, dem Natrium- und Ammoniumsalz von hydrolysiertem Polyacrylamid, hydrolysiertem Polyacrylnitril und dem Natrium- und Ammoniumsalz von hydrolysiertem polyacrylnitril, und das zweiwertige Kation Calcium ist.
  5. 5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lipidemulsionen für Injektionen.
  6. 6. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus parenteral zu verabreichenden Natriumchloridlösungen.
  7. 7. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus normalem Serumalbumin, Plasmaproteinfraktion und antihämophilem Faktor.
  8. 8. In vitro-Testreagens als Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Patentansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es Limulusamöbocytlysat mit einer Empfindlichkeit von mindestens 0,25 ng/ml auf das U.S.-Referenz-Endotoxin EC-2, eine die Störung herabsetzende Menge eines im wesentlichen linearen polymeren wasserlöslichen, die Störung herabsetzenden Mittels mit einem Molekulargewicht von mindestens 1000, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure-Acrylamincopolymer, Acrylsäure-Acrylnitrilcopolymer, Polyacrylsäure, Alkalimetall- und Ammoniumsalze von Polyacrylsäure, hydrolysiertem Polyacrylamid, Alkalimetall- und Ammoniumsalze von hydrolysiertem Polyacrylamid, hydrolysiertem Polyacrylnitril und Alkalimetall- und Ammoniumsalze von (hydrolysiertem) Polyacrylnitril, sowie eine genügende Menge eines zweiwertigen Kations, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Calcium und Magnesium, enthält.
  9. 9. Reagens nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es das die Störung herabsetzende Mittel in einer Menge von 0,05 bis 3% Gewicht/Volumen enthält.
  10. 10. Reagens nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das die Störung herabsetzende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylsäure, dem Natriumsalz davon, einem Copolymer von Acrylsäure und Acrylamid, hydrolysiertem Polyacrylnitril und dem Natriumsalz davon.
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