SE445588B - Testforfarande och reagens for endotoxinbestemning med limulusamebocytlysat och ett storningsreducerande polyakrylderivat - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 08102001-8 2 väsentligen rak sammanhängande kolkedja erhållen genom polymeriseríng av en alifatisk omättad grupp. Polyelektrolyter av denna typ är således eteniska polymerer med talrika sidokedjor fördelade längs en väsentligen rak samman- hängande kolatommolekyl. Sidokedjorna kan vara kolvätegrupper, karboxylsyra- grupper eller derivat därav, aminoalkylgrupper, alkoxigrupper och andra organiska grupper, varvid antalet av dessa grupper och de relativa proportionerna av hydrofila och hydrofoba grupper är sådana att en vattenlöslig polymerförening med ett stort antal joniserbara radikaler erhålls. Uttrycket "vattenlöslig" polymer såsom det här används innefattar sådana som bildar homogena blandningar med vatten och sådana svârlösliga polymerer som sväller i närvaro av vatten och löser sig i åtminstone viss utsträckning.

Lämpliga polyelektrolytiska polymerer är polymerer av akrylsyra- derivat, t.ex. akrylsyra, alkalimetallsalter, t.ex. natrium- kalium- och ammoniumsalter av akrylsyra, akrylamid, akrylnitril, N-alkyl-substituerade amider, N-aminoalkylamider, och motsvarande N~alkylaminoalkylsubstituerade amider, aminoalkylakrylater, aminoalkylmetakrylamider och N-alkylsubstitue- rade aminoalkylestrar av akrylsyror. Dessa polymerkompositioner kan vara homopolymerer eller också kan de vara sampolymerer med andra sampolymerise- rande monomerer såsom eten, propen, isobuten, styren, alfa-metylstyrem vinylacetat, vinylformiat, alkyletrar, akrylnitril, metakrylnitril, vinylklorid, vinylidenklorid, alkylmaleater, och alkylfumarater, och andra olefiniska mono- merer kapabla att bilda sampolymerer med dessa. De ovannämnda alkylgrupperna innehåller 1-6 kolatomer. Sampolymerer av denna typ med åtminstone 20 molprocent, företrädesvis 50 molprocent och särskilt 80 molprocent av akrylsyra- derivaten, är föredragna, och särskilt när sammonomeren är hydrofob eller inte har några joniska grupper.

Polymerer av denna typ kan framställas direkt genom polymerisation eller sampoiymerisation av lämpliga monomerer, t.ex. sådana som innehåller en hydrofil grupp såsom karboxylgrupper. Andra polyelektrolytpolymerer kan fram- ställas genom efterföljande reaktioner av polymerer och sampolymerer. Exem- pelvis kan polymerer, som innehåller nitrilgrupper, hydrolyseras till att bilda vattenlösliga amid- och karboxihaltiga polymerer eller hydreras till att bilda aminohaltiga polymerer. När sådana polymerer eller sampolymerer hydrolyseras, hydrolyseras de i en omfattning av 25 till 10096, och företrädesvis till en omfattning av åtminstone 80% av grupper som kan hydrolyseras.

Speciella föredragna polymerer innefattar polyakrylsyra med en vikts- medelmolekylvikt på ca 2.000, sampolymer av 75 molprocent akrylsyra och 25 molprocent akrylamid-natriumsalt med en molekylvikt på 1600, och en akryl- nitrilsampolymer som till ungefär 50 molprocent hydrolyserats med syra till 10 15 20 25 30 35 8102001-8 3 bildning av en akrylnitril-akrylsyrasampolymer.

När sådana polyelektrolyter används i syraformen, omvandlas de till saltformen under LAL-testförfarandet.

Som angivits kelaterar vanligtvis det ovannämnda störningsreducerande medlet tvåvärda katjoner. Således är det nödvändigt att inkludera en tvåvärd katjon för att reducera eller undertrycka den Relaterande förmågan hos det reducerande medlet. Vanligtvis är detta en tillräcklig mängd för att undertrycka denna förmåga och är generellt från ca 0,05 till 1,0 mol, företrädesvis 0,1 till 0,5 mol per mol karboxylgrupper i det störningsreducerande medlet. Detta är förutom varje som helst tvåvärd katjon som används för att öka känsligheten hos det nedan diskuterade lysatet. Normalt kombineras den tvâvärda katjonen med det störningsreducerande medlet. Således bildar i fallet med ett alkalimetallsalt- störningsreducerande medel kombination med den tvåvärda katjonen ett blandat salt, t.ex. natrium-kalciumsalt av en sampolymer av ca 75 molprocent akrylsyra och ca 25 molprocent akrylamid med en molekylvikt på 1600.

I enlighet med reagenset enligt föreliggande uppfinning tillhandahållas ett reagens som innehåller LAL med lämplig känslighet på åtminstone 0,25 nanogram per ml med US referensendotoxin EC-Z-standard, en störnings- reducerande mängd av något av de ovannämnda störningsreducerande medlen och tillräckligt med tvåvärd katjon för att undertrycka kelateringsförmågan hos det reducerande medlet. Detta reagens är företrädesvis lyofiliserat.

LAL kan framställas enligt det förfarande som beskrivs i GB-PS 1 522 l27.

Exempelvis uppsamlas hemolymfan från friska exemplar av Limulus polyphemus i en antikoagulerande saltlösning som generellt beskrivs av Levin och Bang, "Clottable Protein in Limulus: Its Localization and Kinetics of Its Coagulation by Endotoxin", Thromb. Diath. Haemorrh. l_9_: 186-197 (1968).

Amebocyterna uppsamlas och tvättas med den antikoagulerande saltlösningen och centrifugeras.

De separerade amebocyterna suspenderas i vatten, och den osmotiska sprängningen av cellerna fullständigas genom att de mångfaldigt utsätts för mekanisk omrörning. Cellfragmenten separeras från lysatet med hjälp av en centrifug, och lysatfraktionerna uppsamlas och förvaras vid 0-l+°C.

Lysatets känslighet mot endotoxin justeras till önskad känslighetsnivå genom spädning eller genom blandning med en annan sats av lysat med annan känslighet. Lösningen buffras vanligtvis till pH-omrâdet 6,§-7,5 med hjälp av en lämplig buffert, t.ex. trometamin [tris-(hydroximetyUaminometan] och trometamin-hydroklorid.

Den buffrade lysatlösningen, framställd såsom beskrivits ovan, uppdelas l0 15 20 25 30 35 8102001-8 4 på serumampulier, som t.ex. innehåller 1,2 eller 5,2 ml av lösningen, och den uppdelade lösningen lyofiliseras. Efter lyofilisering försluts ampullerna och kyls.

Det lyofilíserade lysatet har formen av ett vitt pulver elleren vit, skör pellet.

Lysatets känslighet mot endotoxin ökas genom att man införlivar låga koncentrationer av tvåvärda och envärda katjoner. Kalciumjoner är föredragna tvåvärda' joner, även om andra jordalkalijoner, såsom magnesiumjoner eller andra tvâvärda joner kan användas. Natriumjoner är föredragna envärda joner, men andra envärda joner, särskilt alkalimetalljoner såsom litiumjoner kan användas.

Kloriderna (CaClz, NaCl, etc) är lämpliga källor för dessa tillsatta joner, även om andra salter kan användas. Företrädesvis tillsätts dessa elektrolyter i endotoxinkänslighetsökande mängder, t.ex. så att, när det lyofiliserade lysatet rekonstitueras, koncentrationen av den tvåvärda katjonen (t.ex. Ca2+) ligger i området 0,000l - 0,1 molar och koncentrationen av den envärda katjonen (t.ex.

Na+) ligger i omrâdet 0,001 - 0,1 molar.

Alla de ovan beskrivna operationerna utförs under sådana betingelser som säkerställer att slutprodukten är steril och endotoxinfri. Metoder för att säkerställa frihet från endotoxiner är kända på området. Exempelvis kan oorganiska tillsatser (CaClz, NaCl) göras endotoxinfria genom att man upphettar de torra salterna vid 250°C i minst 120 minuter. Organiska tillsatser måste, på grund av sina smältpunkter, etc vanligtvis upplösas, och lösningen autoklaveras vid l21°C i 60 minuter eller mer för att förstöra alla närvarande endotoxiner.

En allmän beskrivning av förfarandet för bestämning av endotoxiner kan återfinnas i den tidigare nämnda brittiska patentskriften.

Vanligtvis rekonstitueras lyofiliserat lysat med tillräckligt med sterilt, pyrogenfritt vatten. Det fördelas i alikvota portioner, t.ex. 0,1 ml, i provrör och blandas med en lika stor mängd av den vätska som testas med avseende på endotoxin. Bildning av en gel indikerar närvaro av endotoxin.

Detta förfarande utförs under endotoxinbestämningsbetingelser som utnyttjar en tillräcklig mängd av lysat, t.ex. 0,01 till l ml rekonstituerat lysat med lämplig aktivitet, t.ex. 0,01 till 0,25 ng/ml US referensendotoxin EC-2.

Sâdana betingelser innefattar lämpliga reaktionstider, t.ex. 10 minuter till 60 minuter, reaktionstemperatur, t.ex. 36°C till 40°C, och användning av en buffert, t.ex. tris-l-lCl för att hålla pil-värdet från ca 6,0 till 8,0 under bestämningen.

I enlighet med föreliggande uppfinning är det störningsreducerande medlet närvarande under lysatendotoxinreaktionen, företrädesvis under hela reaktionen. FörêträdeSviS tillsätts det störningsreducerande medlet till den vätska som skall testas före iysatet eller införlivas i LAL-reagenset före då det tillsätts lyofiliseringen. Det används i störningsreducerande mängder, t.ex. 10 15 20 25 30 35 8102001-8 5 till lysatet före testning så används det i en mängd av från 0,05 till 3,096 (vikt/vol), företrädesvis 0,496 (vikt/vol.) baserat på testprovets totalvolym, och då det införlivas i reagenset och lyofiliseras så används det i en mängd av från ca 0,05 till ca 3,096 (vikt/vol.), företrädesvis 0,496 (vikt/vol.), baserat på volymen lysatlösning.

De följande exemplen belyser uppfinningen. Såvida inte annat_anges avser alla delar vikt.

EXEMPEL Samtliga beskrivna operationer utförs under sådana betingelser som säkerställer att slutprodukten är steril och fri från endotoxin.

Exemæl l l-lemolymfa från friska exemplar av Limulus polyphemus uppsamlas ien antikoagulerande saltlösning i huvudsak som beskrivs av Levin och Bang (1969 - se ovan). Amebocyterna uppsamlas och tvättas med den antikoagulerande saltlösningen i en Centrifug. _ De separerade amebocyterna suspenderas i vatten, och den osmotiska sprängningen av cellerna fullständigas genom att de mångfaldigt utsätts för mekanisk omrörning. Cellfragmenten separeras från lysatet med hjälp av en Centrifug, och lysatfraktionerna slås samman och förvaras vid 0-4°C.

Lysatets känslighet mot endotoxin justeras till den önskade känslighets- nivån. Lösningen buffras till ett pH-område på 6,5 - 7,5 med hjälp av trometamin [tris-(hydroximetyDaminometan] och trometamin-hydroklorid och görs 0,01 molar i kalciumklorid, och 0,077 molar i natriumklorid, varvid samtliga tillsatser dessförinnan gjorts fria från endotoxiner.

Det buffrade lysatet (i) uppdelas sedan på serumampuller, som vardera innehåller 5,2 ml av lösningen, varefter den uppdelade lösningen lyofiliseras.

Efter lyofilisering försluts ampullerna och kyls.

Det störningsreducerande medlet (ll) bereds genom tillsats av 5 ml sterilt vatten för injektion USP och 50 mg Ca(OH)2 till 5 ml 4396-ig (vikt/vol.) 25 molprocent autoklaveras i 30 polyakrylsyra-polyakrylamid-sampolymerflä molprocent syra, akrylamid)~natriumsalt i vatten, MV 1.600. Denna lösning minuter vid l2l°C för depyrogenering och justeras sedan till pH 7,5 med 0,2 ml l2N HCI. 4,0 ml II sätts sedan till 200 ml av den buffrade lysat (ll-lösningen, framställd såsom beskrivits ovan, före lyofilisering. Den resulterande störnings- reducerande lysatlösningen (III) uppdelas sedan på serumampuller, som vardera innehåller 5,2 ml av lösningen, och den uppdelade lösningen lyofiliseras. Efter lyofilisering försluts ampullerna och kyls.

Följande operationer utfördes under betingelser avsedda att säkerställa 8102001-8 10 15 20 25 30 35 omvändning till l80°. 6 bakterifrihet och frihet från yttre tillförsel av endotoxin.

Serieutspädda endotoxinlösningar bereddes av E. coli O55:B5 endotoxin i var och en av följande lösningar: sterilt vatten för injektion USP, 2096j-ig lipidemulsion ("Intra Lipid" saluförd av Cutter Labs) och plasmaproteinfraktion (saluförd av Cutter Labs). Dessa serieutspädda endotoxinprov testades sedan med både lysat (I) och störningsreducerande lysat (Ill). rekonstituering av lysaten (I) och (III) med 5,2 ml sterilt vatten för injektion USP följt av försiktig omskakning under några sekunder för att helt lösa återstoden.

Alikvoter om 0,1 ml av de rekonstituerade lysaten (I) och (lll) fördelades i provrör 'festen utfördes genom ' om lO mm x 75 mm. Till varje provrör sattes 0,1 ml av lämpliga serieutspädda endotoxinlösningar som framställts ovan. Provrören omskakades försiktigt för blandning och inkuberades sedan ostörda vid 37°C i 60 minuter.

Vid slutet av denna tid bestämdes en titer som den lägsta koncentration endotoxin som gav ett positivt resultat vid LAL-testet. Ett test räknas som positivt, om lysatet bildade en klump som bibehöll sin integritet när provröret vändes upp och ned l80°, och negativt om gelen bröts sönder före full Pâ konventionellt sätt skulle vätskor som inte stör endotoxindetektering med LAL ge en titer som inte skiljer sig från sterilt vatten för injektion USP med plus eller minus en tvåfaldig utspädning.

Testresultaten för endotoxinkoncentrationer i de avsedda lösningarna anges nedan: Tabell I Titer med Titer med störnings- Testad lösning lysat (l) reducerande lysat (lll) steril: vFi UsP 25 pg/ml 25 pg/ m1 2096-ig lipidemulsíon > 100 pg/ml 50 pg/ml Plasmaproteinfraktion > 100 pg/ml 50 pg/ ml Exemæl 2 Lysat (I) och störningsreducerande medel (ll) framställdes såsom beskrivits tidigare i Exempel l.

Serieutspädda endotoxinlösningar bereddes av antingen E. coli 055035 endotoxin eller US referensendotoxin EC-2 i en eller flera BV föliande lösflïnâaf* sterilt vatten för injektion USP, 596 albumin (Cutter Labs), 0,996 NaCl USP (Travenol), l0%-ig lipidemulsion (Cutter), och plasmaproteinfraktion (Cutter).

Ett prov uttogs från var och en av de avsedda serieutspädda lösningarna och 10 15 20 25 30 35 w. 8102001-8 7 testades med lysat (I). Sedan dessa prover avlägsnats tillsattes störnings- reducerande medel (II) till en slutkoncentration på 296 (vikt/vol.) (0,1 ml av II plus 5 ml prov). Lösningarna blandades grundligt och testades sedan en gång till med lysat (I).

Testresultaten för endotoxinkoncentrationer i de avsedda lösningarna anges nedan. lâëï! 055zß5-Endotoxin EC-Z-Endotoxin Testad lösning v/o Il v/296 II v/o II v/296 II Sterilt VFI USP 50 pg/ml 25 P8/ ml 60 pg/ml 30 pg/ml l096-ig lipidemulsion >100 pg/ml 25 pg/ml x x Plasmaproteinfraktion >100 pg/ml 25 pg/ml > 250 pg/ ml 30 pg/ml 5% aibumm >1oo pg/mi 25 pg/mi > zso pg/mi ao pg/ml Saltlösning USP x x >250 pg/ml 60 P8/ ml x ej testad Exempel 3 Lysat (I) framställdes som beskrivits tidigare i Exempel l.

Polyakrylsyra-akrylnltrilsampolymer hydrolyserad till ca 50 molprocent (IV) framställdes genom tillsats av 50 ml H20 och 50 ml koncentrerad HzSOu till 2 g polyakrylnitril i en 100 ml bägare. Lösningen blandades 20 timmar vid 25°C med en rnagnetomrörningsstav. Den resulterande polymeren (IV) utfälldes sedan genom tillsats av 100 ml etanol. Den fasta substansen uppsamlades genom centrifugering och tvättades fyra gånger med 200 ml etanol. Den resulterande polymeren torkades sedan vid 60°C under vakuum i 8 timmar.

Störningsreducerande medel (V) framställdes genom upplösning av 50 mg polymer (IV) i en lösning av 10 ml H20 och 0,5 ml 5N NaOH. Till denna lösning sattes 25 mg Ca(Ol-I)2 , och därefter autoklaverades den resulterande blandningen i 30 minuter vid l2l°C. Lösningen kyldes och pH-värdet justerades till pH 7,0 med 12N NCI.

Ett serieutspätt endotoxin framställdes ur US referensendotoxin EC-2 i 0,996 normal saltlösning USP (Travenol) och sterilt vatten för injektion USP. De avsedda serieutspädda endotoxinlösningarna testades sedan med lysat (I) såsom beskrivits i Exempel l. Sedan de serieutspädda endotoxinlösningarna testats med lysat (I) tillsattes störningsreducerande medel (V) till en slutkoncentration på 1096 (voL/vol.) (0,6 ml V + 5 ml prov). Lösningarna blandades grundligt och 10 15 20 25 30 8102001-8 8 testades en gång till med lysat (I).

Testresultaten anges nedan: Tabell III Testat prov Titer utan V Titer med 1096 V steril: v1=1usP 30 pg/mi 30 pg/ml 0,996 normal saltlösning USP 500 pg/ml 125 pg/ml Exemæl ll- Lysat framställdes som tidigare beskrivits i Exempel l.

Störningsreducerande medel (Vi) framställdes genom blandning av 25 ml av en 6596-ig polyakrylsyra-l-IZO-lösning (MV 2.000) med 75 ml H20, 7,5 g NaOH och 107 mg Ca(OI-l)2. Lösningen autoklaverades i 30 minuter vid l2l°C, varefter pH-värdet justeradesrtill pH = 8,0 med SN I-ICI.

En serieutspädd endotoxinlösning bereddes av US referensendotoxin EC-Z i 0,996 normal saltlösning USP och sterilt vatten för injektion USP. De avsedda serieutspädda endotoxinlösningarna testades sedan med lysat (I) såsom beskrivits i Exempel l. Sedan de seriutspädda enotoxinlösningarna testats med lysat (I), tillsattes störningsreducerande medel (VI) till en slutkoncentration på 796 och testades en gång till med lysat (I).

Testresultaten anges nedan: Tabell IV Testat prov Titer utan VI Titer med VI steril: v1=1 usP ao pg/mi ao pg/mi 0,996 normal saltlösning USP 500 pg/ml 30 pg/ml Exemæl 5 Lysat (I) framställdes som tidigare beskrivits i Exempel l.

Störningsreducerande medel (VII) framställdes genom upplösning av 2,1 g akrylsyra-akryiamid-sampolymer (MV 200.000) i en lösning av 19 ml vatten för injektion och 100 mg Ca(Ol-I)2. Lösningen blandades tills all fast substans löst sig, och därefter justerades pI-I-värdet till pH = 8,0 med 0,7 ml 5N HCl.

En serieutspädd endotoxinlösning bereddes av US referensendotoxin EC-2 i 0,996 normal saltlösning USP och sterilt vatten för injektion USP. De avsedda serieutspädda endotoxinlösningarna testades sedan med lysat (I) såsom beskrivits i Exempel I. Sedan de serieutspädda endotoxinlösningarna testats med lysat (I), tillsattes störningsreducerande medel (VII) till en slutkoncentration på

Claims (7)

10 15 20 25 30 8 1 Û 2 Û 0 1 - 8~ 9 496 (voL/vol.) (0,2 ml VII + 5 ml prov), Lösningarna blandades noggrant och testades en gång till med lysat (I). Testresultaten anges nedan: Tabell V Testat prov Titer utan VII Titer med Vll Sterilt VFl USP 60 pg/ml 30 pg/ ml 0,996 normal saltlösning USP 500 pg/ml 30 pg/ml Patentkrav

1. Testförfarande in vitro för bestämning av endotoxin under endotoxin- bestämningsbetingelser med limulusamebocytlysat i vissa vätskor valda bland lipidemulsioner för injektion, parenteralt administrerade natriumkloridlösningar, laktaterad Ringefls lösning, normalt serumalbumin, plasmaproteinfraktion och antihemofilifaktor USP, vilka stör reaktionen mellan varje som helst närvarande endotoxin och lysatet och därigenom ger en felaktig bestämning, k ä n n e t e c k n a t av att man utför förfarandet i närvaro av (l) en störnings- reducerande mängd av ett väsentligen linjärt polymert vattenlösligt störnings- reducerande medel för att reducera störningen, varvid nämnda medel har en molekylvikt på åtminstone 1.000 och är valt bland akrylsyra-akrylamid-sampoly- mer, akrylsyra-akrylnitril-sampolymer, polyakrylsyra, alkalimetallsalter av poly- akrylsyra, hydrolyserad polyakrylamid, alkalimetallsalter av hydrolyserad poly- akrylamid, hydrolyserad polyakrylnitril och alkalimetallsalter av polyakrylnitril och (2) en tillräcklig mängd tvâvärd katjon vald bland kalcium och magnesium för att undertrycka kelateringsförmägan hos det störningsreducerande medlet.

2. För-farande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att det störningsreducerande medlet är närvarande i mängd av från ca 0,05 till ca 396, och den tvåvärda katjonen är närvarande i en mängd från ca 0,05 till 1,0 mol per mol karboxylgrupper hos det störnings- reducerande medlet.

3. Förfarande enligt patentkravet l eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att det störningsreducerande medlet är valt bland polyakrylsyra, polyakrylsyra-natriumsalt, en sampolymer mellan akrylsyra och akrylamid, hydrolyserad polyakrylamid, natrlumsaltet av hydrolyserad polyakryl- lO 15 20 25 8102001-8 10 amid, hydrolyserad polyakrylnitril och natriumsaltet av hydrolyserad polyakryl- nitril, och att den tvåvärda katjonen är kalcium.

4. Förfarande enligt patentkravet l, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t av att vätskan är vald bland llpidemulsioner för injektion.

5. Förfarande enligt patentkravet 1, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t av att vätskan är vald bland parenteralt administrerade natriumkloridlösningar. i

6. Förfarande enligt patentkravet 1, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t av att vätskan är vald bland normalt serumalbumin, plasmaproteinfraktion och antlhemoíilifaktor.

7. In vitro-testreagens för bestämning av endotoxin, kännetecknat känslighet på åtminstone ca 0,25 ng/ml med US referensendotoxín EC-Z, en av att det består av limulusamebocytlysat med en störningsreducerande mängd av ett väsentligen linjärt polymert vattenlösligt störningsreducerande medel med en molekylvikt på åtminstone 1.000 och valt bland akrylsyra-akrylamid-sampolymer, akrylsyra-akrylnitril-sampolymer, poly- akrylsyra, alkalimetall- och ammoniumsalter av polyakrylsyra, hydrolyserad polyakrylamid, alkalimetall- och ammoniumsalter av hydrolyserad polyakrylamid, hydrolyserad polyakrylnitril och alkalimetall- och ammoniumsalter av polyakryl- nitril och en tillräcklig mängd av en tvåvärd katjon vald bland kalcium och magnesium, varvid det störningsreducerande medlet är närvarande i en mängd från ca 0,05 till ca 396. S. Reagens enligt patentkravet 7, k ä' n n e t e c k n a t av att det störningsreducerande medlet är valt bland polyakrylsyra, natriumsaltet därav, en sampolymer mellan akrylsyra och akryl- amid, hydrolyserad polyakrylamid, natriumsaltet därav, hydrolyserad polyakryl- nitril och natriumsaltet därav.