NL8101561A - Limulus amebocyte-lysaat-procedure. - Google Patents
Limulus amebocyte-lysaat-procedure. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8101561A NL8101561A NL8101561A NL8101561A NL8101561A NL 8101561 A NL8101561 A NL 8101561A NL 8101561 A NL8101561 A NL 8101561A NL 8101561 A NL8101561 A NL 8101561A NL 8101561 A NL8101561 A NL 8101561A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- disturbance
- lysate
- endotoxin
- reducing agent
- acrylic acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
* * VO 1758
Betr.: Limulus Amebocyte-lysaat-procedure.
De uitvinding betreft een verbeterde limulus-lysaat-procednre voor het bepalen van de aanwezigheid van endotoxinen en verbeterde lysaatreagentia.
De hemolymfe van de paardehoefkrab, Limulus Polyphemus, bevat 5 bepaalde amebocyten. Lysis van deze amebocyfcen stelt een stof vrij, die reageert met een endotoxine tot een gel. Deze reactie tussen limulus amebocyte-lysaat (hieronder ook aangeduid als LAL of Lysaat) en endotoxine is als basis genomen voor methoden voor het aantonen en/of bepalen van endotoxine in een reeks vloeistoffen van farmaceutisch-10 medisch belang. Wanneer deze proef.evenwel wordt gebruikt voor het bepalen van de aanwezigheid van endotoxine in bepaalde produkten, zoals lipide-emulsies, zoutoplossingen en bloedplasmaprodukten, kunnen deze produkten de reactie van een aantal aanwezige endotoxinen wijzigen, waardoor ze minder beschikbaar zijn voor reactie met het lysaat. Dit 15 vermindert de reactiviteit en leidt tot een slechte aantoning van endotoxine in deze produkten.
De uitvinding betreft nu een LAL-procedure geschikt voor het aantonen of bepalen van de aanwezigheid van endotoxine in produkten, die de neiging hebben cm de reactie tussen endotoxine en LAL te storen.
20 Volgens de uitvinding wordt een in vitro proef procedure voor het bepalen van de aanwezigheid van een endotoxine onder endotoxine-bepalende voorwaarden door LAL in bepaalde vloeistoffen die de reactie tussen een eventueel aanwezige endotoxine en LAL storen en daardoor een slechte bepaling opleveren, verbeterd. Deze verbetering omvat het 25 uitvoeren van deze procedure bij aanwezigheid van een storings-reducerende hoeveelheid van een in water oplosbsar storing verminderend middel ter reductie van deze storing en voldoende divalent kation om de complexvormen, de capaciteit van het storingsverminderende middel tegen te gaan.
30 De bij de uitvinding toegepaste vloeistoffen worden gewoonlijk parenteraal toegediend en omvatten lipide-emulsies voor intraveneus voeden, b.v. waterige emulsies van plantaardige oliën, b.v. sojaolie, beschikbaar in concentraties van 5 tot 30 gew.5, zoutoplossingen, b.v. parenteraal toegediende natriumchlorideoplossingen met daarin 35 natriumchloride voor injectie, natriumchloride voor irrigatie, natrium- 8101561
* V
-2- chloride voor inhalatie en gelacteerde Ringer's- oplossing; alsmede bloedderivaten, b.v. noimaal serumalbumine, beschikbaar in 5-25 gew.-vol.#, plasmaproteïnefracties en anti-hemofiele factor USP, voorts immuno-globuline, Rho(D) immuno-globuline en antihumaan globuline-5 serum.
De storingsverminderde middelen geschikt voor de uitvinding zijn polyelectrolyten met gewichtsgemiddelde molecuulgewichten van tenminste 1000, liefst 1ÖO0-20O.000 en nog liever 1600-50.000 en met een nagenoeg lineaire, continue koolstofketen verkregen door een polymerisatie van 10 een alifatisch onverzadigde groep. Polyelectrolyten van dit type zijn alkeenpolymeren met een groot aantal zijketens, verdeeld over een nagenoeg lineaire continue koolstofketen. De zijketens kunnen koolwaterstof groepen, carboxylgroepen of derivaten daarvan zijn, voorts amino-alkylgroepen, alkoxygroepen en andere organische groepen, waarbij het 15 aantal van deze groepen en de relatieve verhoudingen van hydrofiele en hydrofobe groepen zodanig is, dat een in water oplosbaar polymeer ontstaat met een groot aantal ioniseerbare radicalen. De uitdrukking "in water oplosbaar" betekent hier, dat homogene mengsels met--water worden gevormd, maar cmvat ook moeilijk oplosbare polymeren, die 20 "bij aanwezigheid van water zwellen ert althans gedeeltelijk oplossen.
Passende polyelectrolyt polymeren zijn polymeren van acrylzuur-derivaten, zoals acrylzuur, de alkalimetaal, b.v. natrium-, kalium-^ en ammoniumzouten van acrylzuur, acrylamide, acrylonitrile, de R-alkyl gesubstitueerde amiden, de H-aminoalkylaminden en de overeenkomstige 25 N-alkylaminoalkyl gesubstitueerde amiden, de aminoalkylacrylaten, en de aminoalkylmethacrylamiden en de ΪΓ-alkyl gesubstitueerde amino-alkylesters van acrylzuren. Deze polymere preparaten kunnen homopoly-meren of copolymeren met andere copolymeriseerbare monomeren als etheen, propeen, isobuteen, styreen, β-methylstyreen, vinylacetaat, vinyl-30 formiaat, alkylethers, acrylonitrile, methacrylonitrile, vinylchloride, vinylideenchloride, de alkylmaleaten en de alkylfumaraten alsmede andere alkeenmonomeren dié cöpolymeren daarvan vormen,zijn,De bovengenoemde tellen 1 tot 6 koolstof atomen. Copolymeren van dit type met tenminste 20 mol.#, bij voorkeur 50 mol.# en liefst 80 mol.# van de 35 acrylzuurder!vaten genieten de voorkeur en speciaal wanneer het comono- 8101561 f -3- meer hydrofoob) is · of geen iongroepen-bezit.
Polymeren van dit type kunnen direct door een polymerisatie of copolymerisatie van geschikte moncmeren worden bereid, b.v. stoffen met een hydrofiele groep, zoals carboxylgroepen. Andere polyeleetrolyt-5 polymeren kunnen worden verkregen door verdere reacties van polymeren en copolymer en. B.v. kunnen polymeren met nitrile groepen tot in water oplosbare amiden en carboxylhoudende polymeren worden gehydrolyseerd of tot aminogroeperihoudende polymeren worden gehydrogeneerd. Wanneer dergelijke polymeren of copolymeren worden gehydrolyseerd, worden ze 10 voor 25-ΙΟΟί gehydrolyseerd, liefst voor tenminste 80# van de hydro-lyseerbare groepen.
Bijzondere voorkeur genieten polyacrylzuren met een gemiddeld molecuulgewicht van ca. 2000; copolymeren van 75# acrylzuur en 25 mol.# acrylamidenatriumzout met een molecuulgewicht van l600 en een 15 acrylontrileeopolymeer dat voor ca. 50 mol.# is gehydrolyseerd met het zuur tot een acrylontrile-acrylzuurcopolymeer.
Wanneer dergelijke polyelectrolyten worden gebruikt in de zure vormen worden ze tijdens de LAL-proefprocedure in het zout omgezet.
Als gezegd zullen de bovengenoemde storingsverminderende middelen 20 gewoonlijk complexen vormen met tweewaardige kationen. Daar cm is het nodig een tweewaardig kation toe te voegen cm het complexvormend vermogen van het verminderende middel te verlagen. Gewoonlijk is een hoeveelheid van 0,05-1,0 mol, liefst 0,1-0,5 mol per mol carboxyl-groepen in het storingsverminderende middel voldoende. Dit komt boven 25 op eventueel tweewaardig kation dat wordt gebruikt cm de gevoeligheid van het lysaat te verbeteren. Gewoonlijk wordt het tweewaardige kation gecombineerd met het storingsverminderende middel. Zo wordt bij een alkalimetaalzout storingsverminderend middel gecombineerd met een tweewaardig kation een gemengd zout gevormd, b.v. het natriumcalcium-30 zout van een copolymeer van ca. 75# acrylzuur en ca. 25 mol.# acrylamide met een molgevicht van 1600.
Volgens de uitvinding wordt aldus een reagens verkregen met . . . . 3 een LAL van geschikte gevoeligheid van tenminste 0,25 nanogram per ca bij een US endotoxine EC-2 standaard, een storingsverminderde hoeveelheid 35 van een van de genoemde storingsverminderende middelaren voldoende twee- 8101561 » , -h- waardig kation om het complexvormend vermogen van het verminderend middel tegen te gaan. Dit reagens vordt hij voorkeur gelyofiliseerd.
LAL kan h.v. worden bereid volgens de methode beschreven in het Britse octrooischrift 1.522.127· 5 B.v. wordt de hemolymfe van gezonde vertegenwoordigers van
Limulus polyphemus verzameld in een anti-coagulerende zoutoplossing, als beschreven door Levin en Bang —"Clottable Protein in Limulus: lts Localization and Kinetics of Its Coagulation by Endotoxin”, Thromb.
Diath. Haemorrh 1£, 186-197 (1968) — De amebocyten worden verzameld IQ en gewassen met de anti-coagulerende zoutoplossing en gecentrifugeerd.
De afgescheiden amebocyten worden in water gesuspendeerd en de osmotische lysis van de cellen verkregen door veelvuldig mechanisch roeren. De celresten worden van het lysaat gescheiden met een centrifuge en de lysaatfracties samengevoegd en bij 0-4°C opgeslagen.
15 De gevoeligheid van het lysaat jegens endotoxine wordt op het gewenste gevoeligheidsniveau gebracht door verdunning of mengen met een andere charge lysaat van verschillende gevoeligheid. De oplossing wordt gewoonlijk gebufferd op een pH 6,5-7,5 met een passende buffer, b.v. trcmethamine /{tris-(hydroxymethyl)amincmethaan7 en tromethamine-20 hydr ochlori de.
De gebufferde lysaatoplossing, bereid als bovenbeschreven, wordt 3 verdeeld over een aantal serumflesjes, b.v. met 1,2 of 5,2 cm van de oplossing en de verdeelde oplossing vervolgens gelyofiliseerd. Ba lyo-filisatie worden de flesjes gesloten en gekoeld.
25 Het gelyofiliseerde lysaat heeft de vorm van een wit poeder of een witte breekbare korrel.
De gevoeligheid van het lysaat jegens endotoxine wordt verhoogd door lage concentraties· aan divalente en monovalente kationen toe te voegen. Calciumionen verdienen de voorkeur als tweewaardige ionen, hoepel 30 andere aardalkaliionen, zoals magnesiumionen of andere tweewaardige ionen^êfènnen worden gebruikt. Batriumionen zijn de voorkeurs eenwaardige ionen, maar andere eenwaardige ionen, speciaal van alkalimetalen, zoals van lithium, kunnen worden gebruikt. De chloriden (CaClg, BaCl, enz.) zijn goede bronnen voor deze toegevoegde ionen, hoewel ook andere zouten 35 kunnen worden toegepast. Bij voorkeur worden deze electrolyten toegevoegd «101561 -5- in endoxine-gevoeligheid verhogende hoeveelheden, b.v. zodanig, dat indien het gelyofiliseerde lysaat vordt gereconstitueerd de concentratie aan tweevaardig kation tussen 0,0001 en 0,1 molair en die van het mono-valente kation tussen 0,001 en 0,1 molair bedraagt.
Alle bovenbeschreven handelingen vorden uitgevoerd onder zodanige voorwaarden, dat het uiteindelijke produkt steriel is en vrij van endo-toxine. Methoden die vrijheid van endotoxinen garanderen zijn bekend.
B.v. kunnen anorganische toeslagstoffen (CaClg, NaCl) endotoxinevrij vorden gemaakt door de droge zouten tenminste 120 minuten op 250°C te 10 verhitten. Organische toeslagstoffen moeten vanvege hun smeltpunten gevoonlijk vorden opgelost en deze oplossingen 60 minuten of langer vorden geautoclaveerd bij 121°C cm eventueel endotoxine te vernietigen.
Een algemene beschrijving van de procedure voor het bepalen van endotoxinenkan vorden gevonden in het meergenoemde Britse octrooi-15 schrift.
Gevoonlijk wordt gelyofiliseerd lysaat gereconstitueerd met vol- 3 doende steriel pyrogeenvrij water. Het vordt in porties, b.v. 0,1 cm in reageerbuizen ondergebracht en gemengd met een gelijke hoeveelheid van de op endotoxine te onderzoeken vloeistof. Vorming van een gel wijst 20 op de aanwezigheid van endotoxine.
Deze procedure vordt uitgevoerd onder endotoxine bepalende vcor-vaarden onder toepassing van een voldoende hoeveelheid lysaat, b.v.
3 ...
0,01-1 cm gereconstitueerd lysaat met een passende activiteit, b.v. 0,01-0,25 ng/cm US reference endotoxin EC-2. Dergelijke voorwaarden 25 omvatten een toereikende reactieduur. b.v. 10 tot 60 minuten, een passende reactietemperatuur van 36-kO°C, het gebruik van een buffer, b.v. tris HCL waarmee de pH op 6,0-8,0 tijdens de bepaling wordt gehouden.
Volgens de uitvinding is het storingsverminderende middel tijdens 30 de lysaat-endotoxinereactie aanwezig, liefst gedurende de gehele reactie. Bij voorkeur vordt het storingsverminderende middel aan de te onderzoeken vloeistof toegevoegd alvorens het lysaat vordt toegevoegd of het vordt in het LAL-reagens verwerkt alvorens te lyofiliseren. Het vordt in storingsverminderende hoeveelheden toegepast, b.v. indien 35 het vordt toegevoegd aan het lysaat alvorens te testen, wordt het 8101561 * ongebruikt in een hoeveelheid van 0,05-3,0 gew.#, liefst 0,!t gev.#, berekend op het totale volume van het proefmonster en indien het in het reagens vordt verwerkt en gelyofiliseerd wordt het toegepast in een hoeveelheid van 0,05-3,0, liefst Ö,U gew.#, berekend op het volume van 5 de lysaatoplossing.
De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe.
Alle delen zijn gewichtsdelen tenzij anders is aangegeven.
Voorbeelden
Alle beschreven handelingen werden onder zodanige voorwaarden uit-10 gevoerd, dat gegarandeerd was dat het uiteindelijke produkt steriel was en vrij van endotcocine.
Voorbeeld I:
De hemolymfe van gezonde vertegenwoordigers van Dimulus polyphemus werd opgevangen in een anti-coagulerende zoutoplossing, beschreven door 15 Levin en Bang (1969, zie boven). De amebocyten werden opgevangen en gewassen met deze anti-coagulanszoutoplossing in een centrifuge.
De afgescheiden amebocyten werden in water gesuspendeerd en de cellen osmotisch verbroken, hetgeen werd gecompleteerd door enige malen mechanisch te roeren. De celresten werden van het lysaat met een 20 centrifuge gescheiden en de lysaatfracties samengevoegd en bij 0-^°C opgeslagen.
De gevoeligheid van het lysaat jegens endotoxine werd op het gewenste gevoeligheidsniveau geregeld. De oplossing werd gebufferd op-pH 6,5-7,5 met behulp van trcmethandne en trcmethaminehydrochloride en 25 0,01 molair wat betreft calciumchloride, 0,077 molair wat betreft natrium-chloride gemaakt, waarbij alle toeslagstoffen tevoren vrij waren gemaakt van endotoxinen.
Het gebufferde lysaat (l) werd vervolgens verdeeld over serum- 3 flesjes die elk 5,2 cm oplossing kregen, waarna deze opgelosfe hoeveel-30 heden werden gelyofiliseerd. Ha deze lyofilisatie werden de flesjes afgesloten en gekoeld.
Het storingsverminderde middel (ii werd bereid door toevoeging
O O
van 5 cnr steriel water voor injectie, 50 mg CaiOH^ aan 5 cm \Z%'s poly acryl zuur-p oly acry lami de c opolymeer (75 mol.# zuur, 25 mol.# acryl-35 amide )-natriumzout in water met molgewicht l600. Deze oplossing werd 81015 61 -7- 30 minuten bij 121°C geautoclaveerd om’-hem pyrogeenvrij te maken en
O O
vervolgens met 0,2 cm 12 N zoutzuur op pH 7,5 gebracht. 1+,0 cm II
O
werd vervolgens toegevoegd aan 200 cm gebufferde lystaat (i)oplossing, bereid als bovenbeschreven, alvorens te lyofiliseren. De verkregen 5 storingsverminderende lysaatoplossing (lil) verd vervolgens verdeeld 3 over serumflesjes, waarvan elk 5S2 cm oplossing kreeg en vervolgens verd deze oplossing gelyofiliseerd. Na lyofilisatie werden de flesjes verzegeld en gekoeld.
De volgende handelingen werden uitgevoerd onder aseptische voor-10 waarden en onder uitsluiting van uitwendig endotoxine.
Serie-verdtmde endotoxineoplossingen werden bereid uit E. coli 055ïB5 endotoxine in elk van de volgende oplossingen: steriel water voor injectie, 20% lipideëmulsie; (intra Lipid van'Cutter Labs) en een plasmaproteïnefractie (eveneens van Cutter Labs). Deze serie-verdunde 15 entoxinemonsters werden vervolgens met lysaat (I) en storingsverminderende lysaat (lil) onderzocht. De proeven werden uitgevoerd door lysaten (I) o en (lil) met 5S2 car steriel water voor injectie te reconstitueren, gevolgd door enige seconden zacht schudden, om alle vaste stof volledig
O
op te lossen. Porties van 0,1 cm van de gereconstitueerde lysaten (I) 20 en (lil) werden gebracht in reageerbuizen van 10 x 75 me waarbij aan elke buis 0,1 cm van een passend serieverdund endotoxineoplossing volgens boven werd toegevoegd. De buizen werden zachtjes geschud cm de inhoud te mengen en vervolgens 60 minuten bij 3T°C geincubeerd.
Ha afloop hiervan werd de titer bepaald van de laagste concentratie 25 aan endotoxine, die nog een positieve LAL-proef gaf. Een proef wordt als positief beschouwd indien het lysaat een klont vormt, die niet uiteenviel, wanneer de buis l80° werd omgekeerd, negatief is de proef, wanneer het gel verbreekt alvorens een volledige omkering van l80° is bereikt.
Als gebruikelijk in deze techniek zullen vloeistoffen die de endotoxine-30 aandoening door LAL niet storen een titer geven, die niet verschilt van die bij steriel water voor injectie per plus of minus een tweevoudige verdunning.
De proefresultaten voor endotoxineconcentraties in de passende oplossingen volgen hieronder: 35 8101561 -8-
Tabel A
Onderzochte Titer met Titer met storingsverminderend oplossing lysaat (I) lys&at (ill)
Steriel water voor 25 pg/cm^ 25 pg/cm^ 5 injectie 50 pg/ai3
20$ lipide-emulsie ?*100 pg/cnT
3 3 plasmaproteinefractie >100 pg/cnr 50 pg/cm
Voorbeeld II:
Lysaat (i) en storingsreductiemiddel (ll) werden bereid als 10 beschreven in voorbeeld I.
Serie-verdunde endotoxineoplossingen werden bereid uit ofwel E. coli 055 :B5 endotoxine of US reference endotoxine EC-2 in een of meer van de volgende oplossingen: steriel water voor injectie; 5$ albuiaine (Cutter Labs); 0,98$ ïïaCl (Travend); 10$ lipide-emulsie (Cutter); 15 en een plasmaproteinefractie (Cutter). Een monster werd genomen uit elk van de passend serie-verdunde oplossingen en onderzocht met lysaat Gt)· Nadat deze monsters waren verwijderd werd storingsreducerend middel (II) toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 2 $ v/v 3 3 (0,1 cur II plus 5 cnr monster). De oplossingen werden goed gemengd en 20 vervolgens opnieuw onderzocht met lysaat (I).
De proefresultaten voor endotoxineconcentraties in de passende oplossingen volgen hieronder:
Tabel B
055:B5 endotoxine EC-2 Endotoxine
25 Onderzochte oplossing w/o II w/2$ II_ w/o II__w/2$ II
3 3 3 3 steriel water 50 pg/cmJ 25 pg/cm 60 pg/cm 30 pg/cm 3 3 10$ lipide-emulsie 100 pg/cm 25 pg/cm x, : x 3 3 3 3 plasmaproteinefractie 100 pg/cm 25 pg/cm 250 pg/cm 30 pg/cm 3 3 3 3 5$ albumine 100 pg/cm 25 pg/cm 250 pg/cm 30 pg/cm 3 3 30 fysiologische zout- x x 250 pg/cnr 60 pg/cm oplossing x niet onderzocht
Voorbeeld III:
Lysaat (I) werd bereid als beschreven in voorbeeld I.
35 Polyacrylzuur-polyacrylonitrilecopolymeer voor ca. 50 mol.$ ge- 8101561 -9- hydrolyseerd (IV) werd "bereid door een toevoeging van 15 cm3 Hp0 en 50 can. geconcentreerd HgSO^ aan 2 g polyacrylonitrile in een "bekerglas van 100 cm3. De oplossing werd 20 uur bij 25°C gemengd met een magnetische roer der. Het verkregen polymeer (IV) werd vervolgens neergeslagen door 3 5 toevoeging van 100 cm ethanol. Het neerslag werd af gecentrifugeerd en viermaal gewassen met 200 cm3 ethanol. Het verkregen polymeer (IV) werd vervolgens in vacuo 8 uren bij 6o°C gedroogd.
Storingsredncerendcmiddel (V) werd bereid door oplossing van O *3 50 mg polymeer (IV) in een oplossing van 10 cnr H^O en 0,5 cm 5 H 10 natronloog. Aan deze oplossing werd 25 mg Ca(0H)g toegevoegd en daarna het verkregen mengsel 30 minuten bij 121° geautoclaveerd. Deze oplossing werd af gekoeld en de pH met 12 H zoutzuur op 7,0 gebracht.
Een serie verdund endotaxine werd bereid uit US reference endotoxine EC-2 in 0,9# normale fysiologische zoutoplossing en steriel 15 water voor injectie. De passend verdunde endotcocineoplossingen werden vervolgens onderzocht met lysaat (I) als beschreven in voorbeeld I.
Hadat de serie verdunde endotoxineoplos singen waren onderzocht met lysaat (i) werd storingsverminderend middel (V) toegevoegd tot een uit-
O -O
eindelijke concentratie van 10# v/v (0,6 cnT V + 5 cnr monster). Deze 20 oplossingen werden goed gemengd en opnieuw onderzocht met lysaat (i).
De proefresultaten staan hieronder.
Tabel C
Onderzocht monster Titer zonder V Titer met 10# V
steriel water 30 pg/cm3 30 pg/cm3
O O
25 0,9# normale zoutoplossing 500 pg/cm 125 pg/cm
Voorbeeld IV:
Het lysaat werd bereid als beschreven in voorbeeld I.
Storingsverminderend middel (VI) werd bereid door mengen van 3 25 cm van een 65%'s polyacrylzuur-HgO-oplossing (molgewicht 2000) 30 met 75 cm3 HgO, 7»5 g NaOH en 107 mg Ca(0H)g. Deze oplossing werd 30 minuten bij 121°C geautoclaveerd en daarna de pH op 8,0 gebracht met 5N zoutzuur.
Een serie verdunde endotoxineqplossing werd bereid uit endotaxine EC-2 in 0,9 % zoutoplossing en in steriel water. De passend 35 verdunde endotoxineoplos singen werden onderzocht met lysaat (I) als 8101561 -10- beschreven in voorbeeld I. Nadat de serie-verdunde endotcxineoplossingen varen onderzocht met lysaat (i) werd storingsverminderend middel (VI) toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 1% en opnieuw onderzocht met lysaat (i). De proefresultaten staan hieronder.
5 label D
Onderzocht monster Titer zonder VI Titer met VI
steriel water 30 pg/cm 30 pg/cm
O O
0,9$ normale zoutoplossing 500 pg/cmr 30 pg/cm*5
Voorbeeld V: 10 lysaat (i) werd bereid als beschreven in voorbeeld I.
Storingsverminderend middel (VII) werd bereid door oplossing van 2,1 g acrylzuur-acrylamidecopolymeer (molgewicht 200.000) in een oplossing van 19 cm water voor injectie en 100 mg calciumhydroxide.
Deze oplossing werd gemengd tot alle vaste materialen in oplossing o 15 waren gegaan en hierna werd de pH met 0,7 cm 5N zoutzuur op 8,0 gebracht.
Een serie-ver dunde endotoxineoplossing werd bereid uit endo-toxine EC-2 in 0,9% zoutoplossing en steriel water voor injectie. De passend serie verdunde endotcxineoplossingen werden vervolgens onder-20 zocht met lysaat (i) als beschreven in voorbeeld I. Nadat de serie verdunde endotoxineoplossingen waren onderzocht met lysaat (i) werd storingsverminderend middel (VII) tot een uiteindelijke concentratie
O O
van k% v/v toegevoegd (0,2 cor VII + 5 cm monster). De oplossingen werden goed gemengd en opnieuw met lysaat (i) onderzocht. De proefre-25 sultaten staan hieronder.
Tabel E
Onderzocht monster Titer zonder VII Titer met VII
‘O O
steriel water βθ p.g/cmJ 30 pg/cm 3 3 0,9$ zoutoplossing 500 pg/cm 30 pg/cm 81015 61
Claims (7)
1. Bij een in vitro proefprocedure voor het bepalen van endötaxine onder endötaxine bepalende voorwaarden met limulus amebocyte -lysaat in bepaalde vloeistoffen in de vorm van lipide-emulsies voor injectie, parenteraal toe te dienen natriumehlorideoplossingen, gelacteerde 5 Binger's oplossing, normaal serumalbumine, plasmaproteïnefraetie en antihemofiliefactor USP, die de reactie tussen eventueel aanwezig en-dotaxine en lysaat storen en daarbij een slechte bepaling opleveren, de verbetering, dat deze procedure wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van (l) een storingsverminderende hoeveelheid van een nagenoeg lineair, IQ polymeer5in water oplosbaar storingsverminderend middel ter vermindering van de storing, welk middel een molecuulgewicht van tenminste 1000 bezit en is gekozen uit de acrylzuuracrylamidecopoüymeren, acrylzuuracrylo-nitrilecopolymeren, polyacrylzuur, alkalimetaalzouten van polyacryl-zuur, gehydrolyseerd polyacrylamide, alkalimetaalzouten van gghydro-15 lyseerd polyacrylamide, gehydrolyseerd polyacrylonitrile en alkalimetaalzouten van polyacrylonitrile en (2) een voldoende hoeveelheid van een tweewaardig kat ion liefst gekozen uit calcium en magnesium voor het tegengaan van de ccmplexvorming van het storingsverminderende middel.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het storings-20 verminderende middel aanwezig is in een hoeveelheid van 0,05-3% en het tweewaardig katicn aanwezig is in een hoeveelheid van 0,05-1,0 mol per mol car boxy lgroep van het storingsverminderende middel.
3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het storingsverminderende middel bestaat uit polyacrylzuur, polyacrylzuurnatriumzcut, 25 een copolymeer van acryl zuur en acrylamide, gehydrolyseerd polyacrylamide, het natriumzout van gehydrolyseerd polyacrylamide, gehydrolyseerd polyacrylonitrile en het natriumzout van gehydrolyseerd polyacrylonitrile en waarbij het tweewaardig kat ion calcium is. k. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de vloeistof 30 bestaat uit een lipide-emulsie voor injectie.
5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de vloeistof bestaat uit parenteraal toe te dienen natriumchlorideoplossingen.
6. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de vloeistof bestaat uit normaal serumalbumine, een plasmaproteïnefraetie en een 35 anti-hemofiliefactor. 8101561 -12-
7. In vitroproef reagens voor het "bepalen van endotoxine met limulus amebocyte-lysaat met de gevoeligheid van tenminste ca. 0,25 cg/cm met US reference endotoxin EC-2, een storingsverminderende hoeveelheid van een nagenoeg lineair polymeer in water oploshaar storingsverminderend 5 middel met een molecuulgewi cht van tenminste 1000 gekozen uit de acryl-zuuracrylamidecopolymeren, acrylzuuracrylonitrilecopolymeren, poly-acrylzuur, alkalimetaal en ammoniumzouten van polyaerylzuur, gehydro-lyseerd polyacrylamide, alkalimetaal en ammoniumzouten van gehydrolyseerd polyacrylamide, gehydrolyseerd polyacrylonitrile en alkalimetaal en 10 ammoniumzouten van polyacrylonitrile en een voldoende hoeveelheid - 7 tweewaardig kation gekozen uit de groep bestaande uit calcium en magnesium.
8. Reagens volgens conclusie 7, waarbij het storingsverminderende middel aanwezig is in een hoeveelheid van ca. 0,05 tot 3$. 15 9· Reagens volgens conclusie 8, waarbij het storingsverminderende middel wordt gekozen uit de groep bestaande uit polyaerylzuur, het natriumzout daarvan, een copolymeer van acrylzuur en acrylamide, gehydroi . lyseerd polyacrylamide, het natriumzout daarvan, gehydrolyseerd polyacrylonitrile en het natriumzout daarvan. 8101561
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/135,810 US4273557A (en) | 1980-03-31 | 1980-03-31 | Limulus lysate procedure for determining endotoxins |
| US13581080 | 1980-03-31 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8101561A true NL8101561A (nl) | 1981-10-16 |
| NL191340B NL191340B (nl) | 1995-01-02 |
| NL191340C NL191340C (nl) | 1995-06-01 |
Family
ID=22469790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8101561A NL191340C (nl) | 1980-03-31 | 1981-03-30 | Werkwijze en reagens voor endotoxine bepaling. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4273557A (nl) |
| JP (1) | JPS56154661A (nl) |
| AU (1) | AU541871B2 (nl) |
| BE (1) | BE888213A (nl) |
| CA (1) | CA1160549A (nl) |
| CH (1) | CH658517A5 (nl) |
| DE (1) | DE3112441A1 (nl) |
| FR (1) | FR2479262A1 (nl) |
| GB (1) | GB2073415B (nl) |
| IT (1) | IT1144806B (nl) |
| NL (1) | NL191340C (nl) |
| SE (1) | SE445588B (nl) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4322217A (en) * | 1980-06-27 | 1982-03-30 | Mallinckrodt, Inc. | Process for preparing Limulus lysate |
| US4476093A (en) * | 1980-09-30 | 1984-10-09 | The Green Cross Corporation | Kit for preparing sample for use in endotoxin test |
| US4414336A (en) * | 1981-01-28 | 1983-11-08 | The Green Cross Corporation | Method for preparing sample for use in endotoxin test |
| JPS5885162A (ja) * | 1981-11-16 | 1983-05-21 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | エンドトキシン測定法 |
| CA1236396A (en) * | 1983-04-01 | 1988-05-10 | Ryozo Numazawa | Endotoxin-detecting device |
| DE3439761A1 (de) * | 1984-10-31 | 1986-05-07 | Klaus-Peter 6800 Mannheim Becker | Verfahren zur bestimmung von endotoxinkonzentrationen |
| US5594113A (en) * | 1988-06-23 | 1997-01-14 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Endotoxin binding and neutralizing protein and uses thereof |
| DE68929334T2 (de) | 1988-06-23 | 2005-08-18 | Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth | Verfahren zumm Assay von Endotoxin-Konzentration |
| JP3242733B2 (ja) * | 1993-02-26 | 2001-12-25 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシン特異的測定剤 |
| US5637474A (en) * | 1994-10-31 | 1997-06-10 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for measuring amount of endotoxin or (1→3)-β-D-glucan by kinetic turbidimetric method |
| US6270982B1 (en) | 1997-10-09 | 2001-08-07 | Charles River Laboratories | Methods and compositions for the detection of bacterial endotoxins |
| DE19931276C2 (de) * | 1999-07-07 | 2002-10-24 | Hans-Martin Seipp | Verfahren zur Herstellung von Probenkörpern mit Biofilmbeladung und Verfahren zur Quantifizierung der Beladung von Probenkörpern mit Biofilm sowie die Verwendung der mit dem Herstellverfahren geschaffenen Probenkörpern |
| US6391295B1 (en) | 1999-10-25 | 2002-05-21 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Artificial bait |
| DE602004024769D1 (de) * | 2003-03-17 | 2010-02-04 | Charles River Lab Inc | Methoden und zusammensetzungen für den nachweis mikrobieller verunreinigungen |
| US20050048655A1 (en) * | 2003-04-18 | 2005-03-03 | Novitsky Thomas J. | Kit for detecting endotoxin |
| US20050026239A1 (en) * | 2003-04-18 | 2005-02-03 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Kit for detecting endotoxin in aqueous solutions |
| EP1842069A2 (en) * | 2004-12-02 | 2007-10-10 | Charles River Laboratories, Inc. | Methods and compositions for the detection and/or quantification of gram positive bacterial contaminants |
| JP5096166B2 (ja) | 2005-01-13 | 2012-12-12 | チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | 生体サンプル中の微生物を分類する方法 |
| JP4077507B2 (ja) * | 2005-05-30 | 2008-04-16 | 第一三共株式会社 | エンドトキシン試験法 |
| US20090286692A1 (en) * | 2008-04-15 | 2009-11-19 | Wainwright Norman R | Cartridge and Method for Sample Analysis |
| MY155541A (en) * | 2010-10-29 | 2015-10-30 | Universiti Malaysia Terengganu | Process for the preparation of amoebocyte lysate from the haemolymph of the horseshoe crab |
| US11061015B2 (en) | 2015-08-28 | 2021-07-13 | Sharp Life Science (Eu) Limited | Droplet microfluidic device and methods of sensing the results of an assay therein |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2625471A (en) * | 1952-02-20 | 1953-01-13 | Monsanto Chemicals | Fertilizing compositions |
| US4096091A (en) * | 1974-07-17 | 1978-06-20 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Limulus lysate having improved capacity to precipitate in the presence of low endotoxin concentrations, and reconstituting solutions therefor |
| US3944391A (en) * | 1974-12-27 | 1976-03-16 | Preventive Systems, Inc. | In vitro process for detecting endotoxin in a biological fluid |
| US3959128A (en) * | 1974-12-27 | 1976-05-25 | Preventive Systems, Inc | Process for removing endotoxin from biological fluids |
| US4107077A (en) * | 1975-07-14 | 1978-08-15 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Limulus lysate of improved sensitivity and preparing the same |
| US4038029A (en) * | 1976-01-20 | 1977-07-26 | Worthington Biochemical Corporation | Limulus lysate turbidity test for pyrogens |
| GB1522127A (en) | 1976-07-23 | 1978-08-23 | Mallinckrodt Inc | Limulus amebocyte lysate reagent compositions |
-
1980
- 1980-03-31 US US06/135,810 patent/US4273557A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
- 1981-03-27 GB GB8109637A patent/GB2073415B/en not_active Expired
- 1981-03-28 DE DE19813112441 patent/DE3112441A1/de active Granted
- 1981-03-30 CH CH2149/81A patent/CH658517A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-03-30 SE SE8102001A patent/SE445588B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-03-30 NL NL8101561A patent/NL191340C/nl not_active IP Right Cessation
- 1981-03-30 AU AU68916/81A patent/AU541871B2/en not_active Ceased
- 1981-03-30 CA CA000374179A patent/CA1160549A/en not_active Expired
- 1981-03-30 FR FR8106293A patent/FR2479262A1/fr active Granted
- 1981-03-31 IT IT67446/81A patent/IT1144806B/it active
- 1981-03-31 BE BE0/204327A patent/BE888213A/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-03-31 JP JP4836081A patent/JPS56154661A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS56154661A (en) | 1981-11-30 |
| JPS648789B2 (nl) | 1989-02-15 |
| NL191340C (nl) | 1995-06-01 |
| NL191340B (nl) | 1995-01-02 |
| AU541871B2 (en) | 1985-01-24 |
| AU6891681A (en) | 1981-10-08 |
| IT1144806B (it) | 1986-10-29 |
| US4273557A (en) | 1981-06-16 |
| DE3112441A1 (de) | 1982-02-18 |
| SE445588B (sv) | 1986-06-30 |
| BE888213A (fr) | 1981-07-16 |
| FR2479262A1 (fr) | 1981-10-02 |
| GB2073415B (en) | 1983-12-21 |
| DE3112441C2 (nl) | 1989-12-07 |
| SE8102001L (sv) | 1981-10-01 |
| CA1160549A (en) | 1984-01-17 |
| FR2479262B1 (nl) | 1983-03-04 |
| IT8167446A0 (it) | 1981-03-31 |
| CH658517A5 (de) | 1986-11-14 |
| GB2073415A (en) | 1981-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL8101561A (nl) | Limulus amebocyte-lysaat-procedure. | |
| US3857931A (en) | Latex polymer reagents for diagnostic tests | |
| NL192139C (nl) | ||
| KR890001703B1 (ko) | 라텍스 제조방법 | |
| US4096091A (en) | Limulus lysate having improved capacity to precipitate in the presence of low endotoxin concentrations, and reconstituting solutions therefor | |
| JPS6244609B2 (nl) | ||
| US4221865A (en) | Method for determining endotoxin concentration | |
| EP0379133B1 (de) | Verwendung von zweiwertigen Kationen in immunchemischen Tests | |
| JPH06249849A (ja) | 血液の相分離における凝固促進剤としてのアミンポリマー類 | |
| US3990947A (en) | Composition for detecting fibrinogen, fibrinogen split products and fibrin split products | |
| Lancaster et al. | Studies on the pathogenesis of acute inflammation. VII. The influence of osmolality upon the phagocytic and clumping activity by human leukocytes. | |
| JPS61274261A (ja) | 免疫学的診断試薬 | |
| US5637452A (en) | Kit for an initial screen for abnormal platelet condition comprising propyl gallate or tannin and a metal ion | |
| CA1094930A (en) | Limulus amebocyte lysate reagent compositions | |
| JP2654181B2 (ja) | ヒトヘモグロビンの検出方法 | |
| GB2033081A (en) | Optical method for determining endotoxin | |
| JP2902095B2 (ja) | ヒトヘモグロビンを含有する被検液の保存方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 | |
| JPH02168162A (ja) | 免疫測定法 | |
| JPS61155957A (ja) | 免疫学的診断試薬 | |
| JPH073424B2 (ja) | 免疫学的診断試薬 | |
| JPS61159166A (ja) | 免疫学的診断試薬 | |
| KR20130012124A (ko) | 글리세로 인지질의 안정화 방법 및 그것을 이용한 시약 | |
| JPH0564743B2 (nl) | ||
| JP3004162B2 (ja) | ヘモグロビン検出系 | |
| JPH0420859A (ja) | 免疫学的凝集反応試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: WHITTAKER CORPORATION |
|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: BIOWHITTAKER, INC. |
|
| V1 | Lapsed because of non-payment of the annual fee |
Effective date: 19991001 |