SU603320A3 - Раствор лизата - Google Patents

Description

(54) РАСТВОР ЛИЗАТА

Изобретение относитс  к области и может быть использовано дл  диагностических целей. Известен раствор лизата на основе растворимых кров ных клеток Zimulus 1. Однако известный раствор не обладайi высокш чувствительностью к эндотоксину. Целью изобретени   вл етс  повышение чувствительное™ к эндотоксину. Эта цель достигаетс  тем, что он дополнительно содержит по крайней мере один компонент- выбранный КЗ следующих групп: HOHoretiHoe соединение магни , лити , строшщ , бари , имидазола, цис теина в концентрации 0,005-0,3 моль/п раствора. Эти KOMiioHCHTM могут 1,рисутствовать в ртство ре лизата в следующих концентраци х: имидазол 0,004-0,4 моль/л, предпочтительно 0,01-0,3 моль/л, марганец, предпочтительно в виде ионов ( ) в количестве 0,005-0,1 моль/л, ионы стронци  (Sr) обычно 0,005-0,4 мол1./л, предпочтительно 0,01-0,3 моль/л ноны бари  () обычно 0,0050 ,5 моль/л в присутствии буфера дл  создани  рН 7-10, цистеин - обычно в концентрации 0,0050 ,3 моль/л, ионы лити  ( Ь ) 0,005--0,3 моль/л, предпочтительно 0,3-0,15 моль/л. Ионы магни  сами но себе обеспечивают хорошую чувствительность протеина Limulus, если они присутствуют совместно с ионами натри  ( не более чем 0,1 моль/л ионов натри ), которые про вл ют чувствительность ;шзатного протеина по отношению к эндотоксину, даже в присутствии других катализаторов. Предпочтительно, чтобы в литре {иствора присутствовало от 0,5 до 0,3 моль/л Мд t Предпочтительно имидазол использовать в растворе .пизата совместно с ионами Li , ионами Мд , ТИОГШ1КОЛЯТ ионами (которые мо.ут быть добав1гены в виде тиогликол та щелочного металла, например тиогликол та натри ) или ионами Sr . Комбинаци  этих ионов с имиддзолом, действующа  как буферный агент, обеспечивает высокую чувствительность лизата на присутствие эндотоксина. Например, при использовании совместно с имидазолбм , вз том в предпочтительном интервале кон- центраций ,, приведенном выше, хорошие результаты нол чают в результате добавлени  0,005-03 моль/л ионов Lf , предпочтительно 0,2--0,15 моль/л ионов L или 0,005-0,3 моль/л ионов Мд , предпочтительно 0,01-0.1 моль/л HOFiOB Mg Хорошую комби1Ю1ШЮ пол чатт, сс.чи и тидазол и ионы Мд добавл ют в их прошочтитгльны

концентоаци х, а ионы таюгликол ха добавл ю с концентращей 0,005-ОДЮ8 моль/л растаора.

Хорошие результаты получают при добавлении к имидазольному раствору ионы стронци  концентрации 0,02-0,15 моль/д.

Приведенные вьпое положительно зар женные ионы можно добавл ть к раствору в виде соо1вет етвуюидах хлорвдов.

Ионы стронци  обычно добавл ют в виде хлорида стронци , ионы бари  (Ва используют совместно с буфером и эквивалентными буферньцуш агентами, особенно в тоМ: случае, когда буфер присутствует в такси концентрации, чтобы обешечнть рН 7-ю.

Известны и эквивалентные сульфопщрильньц соединени , такие как глютатион, гаогликол т щелочного металла или тиоурацил, про вл ющие спо собность повышать чувствительность лизата. Хорошие результаты получают тогда, когда гицрохлорид цистеина нейтрализуют до рН 6-10 щелочным веЩеством , таким как гидроокись натри , карбонат кали , гидроокись тетрабутиламмони , а так № при использовании в растворе лизата 0,02-0,2 вес.% сульфопщрилсодержащего соединени , такого кап цистеин или шоглико;штна  соль щелочного металла , 0,2-2 вес.% воднорастворимой соли магни , такой как хлористый магний.

Ионы лити  ввод т с хлористым лигием или подобными сол ми лити , имеющими растворимый aifflOH, дл  повышени  чувствительности.

Каталитические или повьшиющие чувствительность агенты используют путем первоначального растворени  в дистиллированной воде в желаемых концентраци х. После этого полуаднные растворы используют дл  перестройки лиоф1ишзировашюго лизата путем растворени  лизата в этом растворе.

Растаоры лизата обычно готов т непосредственно перед использованием из-за их повышенной чувствительности по отношению к эндотоксину, котора  повьшиет веро тность их осаждени  наличи  случайных примесей, что имеет место при длительном хранении.

Р&створ гшзата - это водный раствор, свободный от пирогенов, использование которого позвол ет избежать преждевременного осаждени  лизата, однако могут быть использованы и неводные растворители , такие как метанол, этанол, изопропанол, ацетон, этиленгликоль и другие, которые также использоватьс  в смеси с водой, при необходимости .

Пример. Собирают Атдантических ме«хвостов (Limulus Polyphemus) и помещают их в штатив таким образом, чтобы удерживать в положении , при котором их брюшные стороны наход тс  сверху. Стьпс между двум  первыми сегментами крабов (простома и опситома) подготавливают в результате протирани  спиртом. Затем в место сошенени  ввод т иглу дл  отбора крови, которую устагавливают на конце сосуда дл  крови, ио модифицированной таким образом, что трубка дл 

4

отбора крови имела длину в 5 дюймов (12,5см). Сосуд содержит 300 мл 3%-ного раствора хлористо го натри , в котором растворено 2,87 г этилеьздиаминтетраацетата (ЕДТА).

Из мечехвостов отбирают в сосуд дл  сбора крови100 мл крови.

сосуда выбирают и балансируют, если это нвобходимо по весам и затем помещают в цетрифуту на 7 мин при 17.800 об/мин дл  того, чтобы отделить клетки амебоцита от крови. В тех случа х когда кровь хорощо седиментироваш, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 7 мин.

Вслед за стадией центрифугировани  клепси каждьш сосуд с кровью помещают на наклонную плоскость с углом наклона 10° таким образом,, чтобы закупоренный конец трубки дл  сбора крови бьш направлен вниз и трубку дл  сбора крови еще раз открьтают, разреза  ее. Верхний слой тщательно декантируют, оставл   осажденные клетки в сосуде. Вслед за стадией декантации трубку дл  сбора снова за1шивают.

Затем в одну из i двух стерильных дфполнительных частей сосудов с кровью ввод т с поыощью инъекционной иглы 6 вес.ч. дистиллированной , непирогенной воды на каждую 1 вес.ч. ктюток присртствующих в сосуде дл  осуществлени  лизиса клеток. Вес клеток может быть определен в результате вычитани  ставдартного сухого веса сосуда дл  крови от действительного веса сосуда и клеток, которые содержатс  в нем.

Дистил;шрованкую воду перемешивают в сосуде дл  крови и затем дают сто ть в течение 24 ч при 4° С. Затем сосуд центрифугируют в течение 7 мин. После этого жидкое содержимое каждого из сосудов пропускают через 170-микрончый фильтр дл  отделени  его от осажденных таердых веществ и помещают в заморахашающую среду дл  нолучеНИН твердого замороженного состо ни .

Замороженный l.imutus лизаткьв раствор затем тщательно оттаивают, обеспездта  такой рейсим , чтобы раствор оставалс  холодным (т.е. 20°С). После оттаиваш1  лизатный раствор перефильтров ьшают Е колбу через дополнительный 1 0 микрошо ш фильтр.

Осадок на фильтре, остающийс  после фильтровани , представл ет собой нежелательньш материал, который осаждаетс  во врем  стадии рыморажива1ш . Затем фильтрат обычно отфильтровьюают еще раз через другой фильтр {имеющий номинальный размер пор пор дка 1,5 мкм с последующей фильтрацией через мембрашП)Ш фильтр, который имеет абсолютный размер пор пор дки 1,2 мкм и номитльный размер пор менее этого значени .

Перед использованием все фильтры промьюали I л стерильной непирогениой воды. Последние стадии фильтращ-ш осуществл ют в результате сжг ти  лизатного раствора в направлении течени  через фильтр при помощи давлени  газообразного азота, равного приблизительно 0,9 кг/см. С друг( стороны, в сборном сосуде можно примен ть вакуумирование дл  облегчени  фильтрации. После последней стади  фильтрации раствор раздел ют иа 2,0 аликвоты, которые помещают в б мл акшулы или испьпательные пробирки, которые тщательно промывают стерильней, не содержащей пнрогенсга водсж, и депирогенируют при температуре 245° С в течение 4 ч. Ишытательные пробирки затем запаивают, подвергают полочному вымора живанию в машине дл  лиофи изации и сушат иа холоду до образовани  сухото порошка. Р д испытательных пробирок, приготовленных как описано вьпие, подвергают перестройке в виде раствора в результате добавлени  S мл одного из раствс кт, описанных 1шже. В каждой серии пустых нтытательных пробирок , за искли ением первст пробирки каждой серии , добавл ют0,1 мл непирогенной воды. В первую пробирку добавл ют 0,2 мл Е .coEt стандартною эндотоксишюгр раствора. Концентраци  исполь зуемогоЁ оЕ эндотоксииа (Составл ет 100 нанограмм зндотоксина на 1 мл. После этого О, мл раствора из пер9ой пробирки добавл ют во вторую пробирку; 0,1 мл раствора из второй пробирки добавл ют в третью пробирку; и такое добавление продол жаюг до образовани  серий последовательных испытательных растворов, каждьш из которых содержит половину концешрацш предыдущих иохытатель ных растворов таким образом, что двадцатью и по Используемый перестраивающий раствор,

09 NaCt (контроль)

0,085 цистеиш НС

0,1 цистеина

0.001 реагента Клеланда

0,2 2-тио-6-амино)фацила

Смесь равных объемов: 1

раствора Мд Clj и 0,85

цистеина НС

Смесь равных объемов: 1

раствора Мд Clj и 0,1

цистеина

Смесь равных объемов: 1

MgClj и 0,1 раствора

тиогликол та натри 

Смесь (3:2):1 раствора

Мд Clj и 0,1 раствора

тиогликол та натри 

Смесь (2:1:1):1 раствора

Мд Clj, 0,9 раствора

CaClj и 0,85 раствора

и-:иистеина HCI

Смесь равных объемов:

Мд SO4, 0,2 2-тао-6-аминоурацила и 0,1 тиогликол та

натри 

1,56 (растаор N 7) 0,39 (раствор N« 9) 0,195 (раствор N Ш) 0,39 (раствор W 9) 0,195 (растаор ff 10).

0,097 (раствор № 11)

0,097 (раствор N 11)

0,097 (раствор N 11) иногда 0,048 (раствор № 12)

0,195 (раствор N 10)

0,195 (раствор N 10)

0,195 (раствор № 10) 0,39 (раствор N 9) следний испытательный раствор содержал 0,00019 нанограмм эндотоксина на 1 мл. К К1 ждому выбранному интервалу раствора в полученных пробирках добавл ют 0,1 мл перестроенного лизатонного раствора. Серии пробирок затем инкубируют прт температуре 37 С в течение 60 мин. Затем каждую пробирку переворачивают и отмечают наличие кли отсутствие неповрежденного тромба протеина. Наличие протеинового тромба, способного оставатьс  неразрушенным в результате м гкой инверсии испытательной пробирки, служит указанием положительной чувствительности реакции лизета на эвдотоксин . Ниже показано, что природа перестра1шанщего раствора в значительной степени вли ет на чувствительность лизата по отношению к эндотс ссину представлены различные перест аиваницие расгеоры , которые подвергают испытанию и перечислены дл  каждого случа  максимально разбавленные растворы зидотоксмка, которые способны вызывать положительную реакцию на прочность тромба Limukis лизатом : после перестройки в специальных растворах , перечисленных ниже. В цел х сравне1Ш , при испытании IB кролике дн  паренгеральньЕХ растворов больщих объемов обычный предел детектировани  составл ет 0,097 наиограмм эндотоксиш на 1 мл. (1 створ 11). --, .- Низша  концентраци  зндотоксиниого раствора, способна  давать положительную реакцию иа прочность тротйба, (нан«грамм/мл)

7

П р и м е р 2. Образцы различной партии лиофилизироваиного Limulus лйзата, полученного в примере 1, подвергают перестройке по способу, описанному в примере 1, с помощью 2 мл перестраиваюДобавки в используемый перестраивающий раствор

Стерильна  вода (контроль) бе

и шдазола

Без добавок - только имидазол

0,1 м LiCI

0,5 М LiCI

0,025М LiCI

0,0125М LiCI

0,2М LiCI

0,Ш Мд СЬ

0,05М Мд Clj

0,025М Мд

0,12SMMgCl2

0,00625М Мд Clj

Повторение этого эксперимента с использованием 12М стерильного имидазольного раствора (рН 7,07) привело в результате к положительной реакции на тромб при концентрации эндотоксина пор дка 0,048 нанограмм/мл (раствор № 12).

0,2М SrClj 0,1 М SrCli 0,05М SrClj 0,025М SrCb 0,0125М ЗгСЦ

Примерз. Образцы лиофилизированного Limulus лйзата, полученные согласно примеру 1, подвергают перестройке способом примера с помощью 2 мл перестраивающего раствора, включаюДополнительнью инградиенты перестраивающего раствора

Без добавок - только имидазол

0,005М тиогликол та натри  0,0025М тиогликол та натри  0,00125М тиогликол та натри 

щего раствора, состо щего из 80 06.% стерильной воды и 20 об.% 0,13 имидазольного .буфера (рН6,8). и включающего также дополнительные добавки в концентращшх, указанных ниже.

Низша  концентраци  раствора эндотоксина , способна  давать положительную реакцию на прочность тромба, нанограмм/мл

3,12 (раствор № 6) и и

1,56 (раствор № 7)

0,195 (раствор W 10)

0,097 (раствор № 11) и

0,048 (раствор N 12)

0,097 (раствор N415

0,097 (раствор №11)

0,097 (раствор № II)

0,097 (раствор № 11)

0,097 (раствор № II)

0,048 (раствор № 12)

0,048 (раствор N 12)

0,048 (раствор № 12)

3,097 (раствор №11)

0,097 (раствор № 0,048 (раствор № 0,048 (раствор № 0,097 (раствор № 0,048 (раствор №

щего в свой состав 0,12М имидазола (рН 7,04), а также включающий дополнительные инградиенты в ко1Щ(нтраци х, указанных 1шже.

Низща  концентраци  эндотоксина, способна  давать положительную реакцию на прочность тромба, ианограмм/мл

0,097 (раствор № 11) 0,048 (раствор № 12) 0,048 (раствор № 12) 0,048 (раствор № 12),

П р и м е р 4. Образцы лиофилизировашюго Limulus гшзата, полученные как описано в примере 1, подвергают перестройке способом примера 1 с

Используемый перестраивающий раствор

Стерильна  вода

0,1М Мд Cl2 0,1М имидазола и

0,005М тиогликол та натри ,

0,05М Мд Cli, 0,05М имидазола,

0,0025М тиогликол та натри 

0,02 5М Мд Cl2, 0,025М имидазола

и 0,00125М тиогликол та натри 

0,0125М MQ СЬ ; 0,0125М имидазо

и 0,000625М тиогликол та натри 

0,05М 0,05М LiClj и

0,05М имидазола

0,025М MgClj; 0,025М LiCij и

0,025М имидазола

0,Ш Мд Clj; 0,1М

0,1М имидазола и 0,005 М

шогликол та натри 

0,05М IVfe СЬДОЗМ LiClj; 0,05М

имидазола и 0,0005М тиогликол т

натри 

0,025М Мд CI2, 0,025М LiCI, 0,02

имидазола и 0,00125М тиогликол 

натри 

0,1М LiCl2, 0,1М имидазола и

0,0051Й тиогликол та натри 

0,0005М то же

0,00025М то же

0,0000625 то же

0,2М SrClj

0,5М SrClj

0,0125М SrClj

0,2М SrCl2 в растворе трис-буфера при рН 9,3

0,Ш SrClj в растворетрис-буфера с рЦ 9,3

Раствор трис-буфера (контроль

дл  данных по вли нию SrClj

(рН 9,3)

0,2М BaCl2

0,05М ВаСЬ в растворе трис-буфера (рН 9,55)

10

помощью 2 мл различных перестраивающих растворов, как описано киже.Эндотоксинна  чувствительность по лученных в результате продуктов представлена ниже

Низша  концентраци  эндотоксина, способна  давать положительную реакцию на прочность тромба, нанограмм/мл

П

При концентрации 0,78 (раствор № 8) не удало положительную реакцию

0,195(раствор N 10)

0,097(раствор №11)

0,048(раствор № 12)

0,195(раствор № 10)

0,097(раствор N 11)

0,097(расгвор № 11)

0,097 (раствор № 11) 0,097 (раствор № 11)

0,097 (раствор )

0,097(раствор №11)

0,195(раствор №10)

0,097(раствор )

0,195(раствор NMO)

0,097(раствор №II)

0,097(раствор )

0,097(раствор №11)

0,048 (раствор NM2) 0.048 (раствор N 12)

0,39 (раствор ) ОЛ95 (раствор № 10)

0,097 (раствор № 11)