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PATENTANSPRÜCHE 1. Das monocyclische Peptid der Formel I.
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2. Verfahren zur Herstellung des monocyclischen Peptids der Formel I nach Anspruch 1 durch Züchtung eines dieses Peptid produzierenden Stammes der Pilzspecies Tolypocladium infiatum Gams in Gegenwart eines Nährmediums, dadurch gekennzeichnet, dass man das Peptid aus der Fermentationsbrühe durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
3. Heilmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es das monocyclische Peptid der Formel I nach Anspruch 1 enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft das monocyclische Peptid der Formel I,
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im folgenden auch als neues Antibiotikum Cyclosporin F bezeichnet.
Man gelangt zum monocyclischen Peptid der Formel I, indem man einen dieses Peptid produzierenden Stamm der Pilzspecies Tolypocladium infiatum Gams in Gegenwart eines Nährmediums züchtet und das Peptid aus der Fermen
tationsbrühe durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
Ein bevorzugter Cyclosporin F produzierender Stamm ist der frei zugängliche Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams. Eine Kultur davon wurde beim United States Department of-Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, I11., USA, deponiert.
Dieser Stamm wurde vormals der Pilzspecies Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) zugeordnet und ist z.B. in der DOS 2455859 beschrieben.
Für die Herstellung von Cyclosporin F lassen sich auch Stämme der Pilzspecies Tolypocladium infiatum Gams verwenden, wie sie z.B. durch Selektion oder Mutation des Pilzstammes NRRL 8044 unter der Einwirkung von Ultraviolettoder Röntgenstrahlen oder durch Anwendung anderer Massnahmen, z.B. durch Behandlung von Laboratoriumskulturen mit geeigneten Chemikalien, gewonnen werden können.
Cyclosporin F kann auf an sich bekannte Weise isoliert werden, z.B. wie in Beispiel 1 beschrieben. Hierbei kann Cyclosporin F abgetrennt werden von gleichzeitig vorhandenen Naturprodukten, z.B. das Cyclosporin D, das etwas polarere Cyclosporin A (auch bekannt als S 7481/F-1), das polarere Cyclosporin B (auch bekannt als S 7481/F-2) und das noch polarere Cyclosporin C.
Charakterisierung von Cyclosporin F
Farblose Polyeder (krist. aus Äther/Petroläther 1:1) Smp.183-184" [oilD = -290" (c = 1,15 in CHCI3) -218 (c= l,00inCHOH) UV-Spektrum in CHOH: Endabsorption IR-Spektrum in CH2CI2: siehe Fig. 1 'H-NMR-Spektrum in CDCl3, 90 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard: siehe Fig. 2.
'3C-NMR-Spektrum in CDCl3, 22,63 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard. Instrument: Bruker HX-90 E. Aufnahme bei 22,63 MHz. Spektrenbreite (sweep width): 6000 Hz: siehe folgende Tabelle 1.
Tabelle I O(ppm) 8 (ppm) 8 (ppm) 8 (ppm) 173,15 55,4 36,0 23,8 172,89 55,1 31,7 23,8 172,62 54,9 31,6 23,8 172,62 54,3 31,2 23,5 171,72 49,9 31,2 21,9 170,87 48,7 29,9 21,9 170,58 48,3 29,9 21,3 170,26 47,9 29,9 20,9 170,14 44,7 29,6 20,4 169,74 40,5 29,6 20,1 169,53 40,5 24,9 19,7 129,4 39,2 24,8 18,5 126,6 39,2 24,8 18,3
58,4 37,3 24,5 17,8
57,3 36,7 24,3 17,8
15,1
9,9 Massenspektrum: Peak bei m/e 1187 (Molekularpeak von C62HXlNxlOt) Elementaranalyse (im Hochvakuum 3 Stunden bei 80" getrocknet) Bruttoformel: C62HIllNllO Analyse: Ber.: C 62,8; H 9,4; N 13,0; 0 14,8% Gef.: C 62,8; H 9,5; N 13,0; 0 14,8%
Verhalten im Dünnschichtchromatogramm
Kieselgel-Fertigplatten Merck , Schichtdicke 0,25 mm, aufgetragene Substanzmenge: 40 y.
Rf-Werte: siehe folgende Tabelle 2. (Die Detektion erfolgt mit Joddampf oder Dragendorff-Sprühreagenz nach Munier.)
Tabelle 2 Metabolit Chloroform-Meth- Aceton-Hexan 1:1 Essig-ester anol 96:4 a) a) b) Cyclosporin FC) 0,51 0,45 0,50 Cyclosporin D 0,47 0,43 0,58 Cyclosporin A 0,40 0,35 0,39 a) Laufstrecke: 1 x 10 cm b) Laufstrecke: 3 X 10 cm c) Anfärbung in Jod schwächer als Cyclosporin A.
Aminosäureanalyse: Im Hydrolysat, das man durch Erhitzen von Cyclosporin F mit 6N Salzsäure während 16 Stunden bei 115 erhält, können mittels eines Aminosäureanalysators aufgrund der Retentionszeiten die Aminosäuren Alanin, or-Aminobuttersäure, Valin und Sarcosin nachgewiesen werden.
Löslichkeit: Cyclosporin F ist leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton und chlorierten Kohlenwasserstoffen; mässig löslich in Äther; praktisch unlöslich in Wasser und gesättigten Kohlenwasserstoffen.
Das neue Antibiotikum Cyclosporin F zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmt es das Wachstum von Aspergillus niger und Curvularia lunata.
Insbesondere zeichnet sich die Substanz durch eine immunosuppressive Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung kann wie folgt gezeigt werden: a) Im Lymphozytenstimulationstest nach Jänossy wird in vitro in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0 Fg/ml eine starke Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus, der Proliferationsrate und der Blastogenese von mit Concanavalin A stimulierten Lymphozyten aus Mäusemilz festgestellt.
b) Oxazolon-Test an der Maus:
Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver Index (SI) ausgedrückt; SI = 0,62 nach 5 x70 mg/kg p.o.
Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung kann die Substanz zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen, angewandt werden.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes.
Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 60 bis 300 mg/kg Körperge wicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden. Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 300 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 150 bis 300 mg des neuen Antibiotikums Cyclosporin F neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.
Als Heilmittel kann das neue Antibiotikum Cyclosporin F allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutert, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel
Cyclosporin F
500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 2,0 g Natriumcaseinat, 2,5 g Ammoniumphosphat, 5 g MgSO4- 7H20, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO3, 0,5 g KCI, 0,01 g FeSO4 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27 inkubiert (siehe DOS 2455 859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3-stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9:1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5- bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Die Spitzenfraktionen werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck), mit Hexan Aceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C.
Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin Aund D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,5fachen Menge Aceton bei - 15 kristallisiert und anschliessend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck), weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexan-Aceton (2:1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese werden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei - 15 kristallisieren gelassen. Das dabei erhaltene Rohkristallisat besteht aus sehr stark angereichertem Cyclosporin D, die Mutterlauge enthält neben Cyclosporin D noch weitere Komponenten, so Cyclosporin F.
Zur Gewinnung von Cyclosporin F wird die zur Trockne verdampfte Mutterlauge an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck), mit wassergesättigtem Essigester chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D enthalten und die später eluierten Fraktionen Cyclosporin F im Gemisch neben weiteren Komponenten. Zur weiteren Anreicherung wird das Gemisch zuerst an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck), mit Chloroform-Methanol (98:2) und anschliessend zur Auftrennung mit Hexan-Aceton (2:1) chromatogrpahiert; dabei enthalten die zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin F in sehr stark angereicherter Form.
Zur Reingewinnung werden die Cyclosporin F-Anteile zweimal aus Äther Petroläther (1:4) bei Raumtemperatur kristallisiert, wobei dünnschichtchromatographisch-einheitliches, reines Cyclosporin F in Form farbloser Polyeder vom Smp. 183-184 erhalten wird.