CH634104A5 - Process for the preparation of the novel antibiotic MSD 890A10 - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums MSD 890Aio in Form der Verbindung der Formel

OSO-H

I 3

0

CH3~CH'

II

S-CH2-CH2-NHC-CH3

0

X

COOH

oder von deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen, dadurch züchtet und das Antibiotikum gewinnt.

gekennzeichnet, dass man einen 890Aio bildenden Stamm von is 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Streptomyces flavogriseus in einem wässrigen Nährmedium, dass der kultivierte Mikroorganismus Streptomyces flavogri-das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anor- seus NRRL11 020 ist.

ganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren turai Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peo-zur Herstellung des neuen Antibiotikums MSD 890Aio (im fol- 25 ria, III, hinterlegt und ist unter der Hinterlegungsnummer genden als «Antibiotikum 890Aio» bezeichnet), das sowohl NRRL 11 020 verfügbar.

gegenüber gram-positiven als auch gegenüber gram-negativen Streptomyces flavogriseus MA4638 ergibt das Antibioti-Bakterien aktiv ist. Das Antibiotikum wird durch Züchten von kum 890Aio, das im wesentlichen in reiner Form aus der Fer-Species von Streptomyces auf geeigneten Fermentationsme- mentationsbrühe isoliert wird.

dien gebildet. 30 Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von

Die Feststellung der bemerkenswerten antibiotischen Streptomyces flavogriseus MA-4638 werden in der folgenden

Eigenschaften von Penicillin hat ein grosses Interesse auf die- Tabelle aufgeführt.

sem Gebiet stimuliert. Daraufhin wurden viele andere, wertvolle, antibiotische Substanzen gefunden. Im allgemeinen Morphologie umfasst die antibakterielle Aktivität jeder dieser Antibiotika 35 Die Sporenträger sind verzweigt, geradkettige bis nicht bestimmte, klinisch wichtige pathogene Bakterien. Bei- gekrümmte Sporenketten, die Büschel bilden. Die Ketten sind spielsweise sind einige hauptsächlich nur gegenüber gram-posi- mehr als 10 Sporen lang. Die Sporen sind kugelförmig bis oval -

tiven Arten von Bakterien aktiv. Die entstandene Beständigkeit 0,9x 1,2 \x. (970x).

im Verlauf der weitverbreiteten Verwendung der vorhandenen

Antibiotika bei der Behandlung bakterieller Infektionen hat 40 Kultureigenschaften bewirkt, dass ein ernstes Resistenzproblem entstanden ist. Hafermehlagar (ISP Medium 3): vegetatives Wachstum -

Dementsprechend haben die Nachteile der bekannten Anti- umgekehrt-gelb-dunkelgelb gesäumt mit Braun, gekräuselt; biotikadie weitere Forschung nach anderen Antibiotika stimu- Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Mittelgrau; lösliches Pig-liert, die gegenüber einem grossen Bereich von Pathogenen ment - keines;

wie auch gegenüber resistenten Stämmen besonderer Mikroor- 45 Czapek Dox Agar (Saccharosenitratagar): vegetatives ganismen aktiv sind. Wachstum - umgekehrt-braun gesäumt mit Dunkelbraun; Luft-

Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung des mycélium - mittelgrau, samtartig; lösliches Pigment - leichtes Antibiotikums in verdünnter Form als rohes Konzentrat und in Braunwerden des Mediums;

reiner Form. Eialbuminagar: vegetatives Wachstum - umgekehrt-gelb-

Der Erfindung liegt somit das Ziel zugrunde, ein Verfahren 50 dunkelgelb gesäumt mit Braun; Luftmycelium - mittelgrau, ver-zur Herstellung eines neuen und wertvollen Antibiotikums auf- mischt mit gelblichem Grau (2dc) und gräulichem Gelb (2db); zuzeigen, das bei der Inhibierung des Wachstums verschiede- lösliches Pigment - hellgelbliches Dunkelgelb; Glycerin-Aspa-ner gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen raginagar: vegetatives Wachstum - umgekehrt-braun; Luftmy-

hochwirksam ist. Es soll ein Verfahren zur Herstellung der celium - samtartig, hellgrau mit gelblichem Ton (2dc); lösliches neuen antibiotischen Substanz durch Fermentierung von Nähr- 55 Pigment - helles Dunkelgelb;

medien mit Species von Streptomyces geschaffen werden. Anorganische Salze-Stärkeagar (ISP Medium 4) vegetati-

Die neue antibiotische Verbindung wird durch Züchten ves Wachstum - umgekehrt-grünlich-gelblich-dunkelgelb; Luft-eines neuen Stamms von Streptomyces flavogriseus bei kon- mycélium - samtartig, mittelgrau mit gelbem Ton (3fe); lösli-trollierten Bedingungen gebildet. ches Pigment - sehr helles Dunkelgelb;

Aufgrund ausgedehnter taxonomischer Untersuchungen eo Hefeextrakt-Dextrose + Salzeagar: vegetatives Wachstum wurde der Stamm des Mikroorganismus, der bei der vorliegen- - umgekehrt-dunkelbraun; Luftmycelium - dunkelgrau, den Erfindung verwendet wurde, als zu der Species Streptomy- gemischt mit einem helleren Grau; lösliches Pigment - keines; ces flavogriseus gehörig identifiziert und bei der Hinterle- Hefeextrakt-Malzextraktagar (ISP Medium 2): vegetatives gungsstelle von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., als MA4638 Wachstum - umgekehrt-braun; Luftmycelium - samtartig, dunbezeichnet. Seine Kultur wurde am 15. September 1976 perma- es kelgrau gesäumt mit einem helleren Grau; lösliches Pigment -nent ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbarkeit an der keines;

Hinterlegungsstelle der Northern Regional Laboratories, Nor- Magermilchagar: vegetatives Wachstum - dunkelgelb; thern Utilization Research and Development Division, Agricul- Luftmycelium - spärlich, weisslich; lösliches Pigment - leichtes

Braunwerden des Mediums; Hydrolyse von Casein - gut;

Lackmusmilch: vegetatives Wachstum - mässiges Ringwachstum, dunkelgelb; Luftmycelium - keines; Farbe - purpur; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptoni-sierung; Alkalischwerden;

Magermilch: vegetatives Wachstum - mässiges Ringwachstum, dunkelgelb; Luftmycelium - keines; lösliches Pigment -hellbraun; Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden;

Nährtyrosinagar: vegetatives Wachstum - umgekehrt-dunkelbraun; Luftmycelium - dunkelgrau gesäumt mit gräulichem Weiss; lösliches Pigment - leichtes Braunwerden des Mediums; Zersetzung von Tyrosin - positiv;

Pepton-Eisen-Hefeextraktagar: vegetatives Wachstum -dunkelgelb; Luftmycelium - weisslich, mässig; lösliches Pigment - keines; Melanin - keines; HîS-Bildung - negativ;

Nähragar: vegetatives Wachstum - umgekehrt-hellgräulich Braun; Luftmycelium - hellgrau gesäumt mit Dunkelgrau; lösliches Pigment - keines;

Nährstärkeagar: vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau; Luftmycelium - mittelgrau; lösliches Pigment - keines; Stärkehydrolyse - gut;

Nährgelatineagar: vegetatives Wachstum - dunkelgelb gesäumt mit Grau; Luftmycelium - gräulich-weiss; lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - gut;

Kartoffelstich bzw. -zapfen: vegetatives Wachstum - dunkelgelb; Luftmycelium - mittel- bis dunkelgrau; lösliches Pigment - keines;

Loefflers Blutserum: vegetatives Wachstum - cremegefärbt; Luftmycelium - keines; lösliches Pigment - keines; Verflüssigung - keine;

Gelatinestich: vegetatives Wachstum - dunkelgelb; Luftmycelium - keines; lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - vollständig.

Alle oben aufgeführten Ablesungen erfolgen nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 °C, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien ist etwa neutral, nämlich pH 6,8 bis 7,2. Die Farbbezeichnungen, die bei der Beschreibung verwendet werden, entsprechen den Definitionen von Color Harmony Manual, 4. Ed. (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus MA-4638 wird ebenfalls auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlenhydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wird der Mikroorganismus auf einem synthetischen Grundmedium (Pridham und Gottlieb), das l°/o Kohlenhydrate enthält, 3 Wochen bei 28 °C gezüchtet. Der pH-Wert der bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien ist etwa neutral (6,8 bis 7,2). In Tabelle I ist die Ausnutzung dieser Kohlenhydratquellen durch Streptomyces flavogriseus MA4638 aufgeführt, wobei + Wachstum, ± schlechtes oder fragliches Wachstum und - kein Wachstum bedeuten, verglichen mit der negativen Kontrolle (keine Kohlenstoffquelle).

Tabelle I

Glucose

+

Maltose

+

Arabinose

+

Mannit

+

Cellulose

-

Mannose

+

Fructose

+

Raffinose

-

Inosit

-

Rhamnose

+

Lactose

+

Saccharose

±

Xylose

+

Die Stärke des Wachstums wird sich mit der Temperatur und dem Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus wie folgt ändern:

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Temperaturbereich (Hefeextrakt - Dextrose + Salzeagar) 28 °C - gutes vegetatives Wachstum und Luftwachstum 37 °C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 50 °C - kein Wachstum.

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose + Salzeagar) aerob.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf den Organismus Streptomyces flavogriseus oder auf Organismen, die die obigen Wachstums- und mikroskopischen Eigenschaften vollständig erfüllen, beschränkt; diese sind nur zur Erläuterung aufgeführt. Von der vorliegenden Erfindung soll insbesondere auch die Verwendung von Mutanten mitumfasst werden, die aus dem beschriebenen Organismus durch verschiedene Mittel, wie Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung, Stickstofflost, Bakterio-phageneinwirkung u.ä, gebildet werden.

890Aio wird während der aeroben Fermentation bei kontrollierten Bedingungen geeigneter wässriger Nährmedien, die mit einem Stamm des Organismus Streptomyces flavogriseus inokuliert sind, gebildet. Wässrige Medien, wie solche, die für die Bildung anderer Antibiotika verwendet werden, sind für die Bildung von 890Aio geeignet. Solche Medien enthalten Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, die von dem Mikroorganismus assimilierbar sind.

Im allgemeinen können Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Dextrose, Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit u.ä, und Stärken, wie Dextrin, oder Granulate bzw. Körner, wie z.B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl u.ä, entweder allein oder zusammen mit Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Die Menge an Kohlenhydrat variiert normalerweise zwischen etwa 1 und 6 Gew.-%, bezogen auf das Medium. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können in dem Medium vermischt bzw. vereinigt werden. Im allgemeinen kann man viele protein-haltige Materialien als Stickstoffquellen bei dem Fermentationsverfahren verwenden. Geeignete Stickstoffquellen umfassen z.B. Hefehydrolysate, primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maiseinweichflüssigkeit, lösliche Stoffe der Branntweinherstellung bzw. Schlempen u.ä.; die bevorzugte Quelle sind lösliche Stoffe, die bei der Branntweinherstellung anfallen, bzw. Schlempen. Die Quellen für Stickstoff, entweder allein oder zusammen, werden in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.-%, bezogen auf das wässrige Medium, verwendet.

Unter den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingearbeitet werden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen ergeben. Ebenfalls mitumfasst werden Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen.

Die in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele für eine grosse Vielzahl von Medien, die verwendet werden können.

Die Fermentation wird zweckmässig bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 37 °C durchgeführt; für optimale Ergebnisse ist es jedoch bevorzugt, die Fermentation bei einer Temperatur von 23 bis 28 °C durchzuführen. Der Anfangs-pH-Wert der Nährmedien, die für das Wachstum der Stämme von Streptomyces flavogriseus-Kultur und zur Bildung des Antibiotikums 890Aio geeignet sind, kann von 6,0 bis 8,0 variieren.

Eine Fermentation des Antibiotikums in kleinem Massstab wird zweckdienlich durchgeführt, indem man ein geeignetes Nährmedium mit der das Antibiotikum liefernden Kultur inokuliert und nach der Übertragung in das Produktionsmedium die Fermentation bei konstanter Temperatur von etwa 24 °C mehrere Tage au einer Schüttelvorrichtung ablaufen lässt.

Die Fermentation wird in einem sterilisierten Kolben von Nährmedium über eine oder mehrere Stufen der Impfmaterial3

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entwicklung initiiert. Das für die Impf stuf e verwendete Nährmedium kann irgendeine geeignete Kombination aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sein. Der Impfkolben wird in einer Kammer mit konstanter Temperatur bei etwa 28 °C einen Tag oder bis zu einem ausreichenden Wachstum geschüttelt, und ein Teil des entstehenden Wachstums wird zur Inokulierung entweder eines Impfmaterials der zweiten Stufe oder des Produktionsmediums verwendet. Kolben mit Impfmaterial der Zwischenstufe werden, wenn sie verwendet werden, auf ähnliche Weise entwickelt, d.h. ein Teil des Kolbeninhalts aus der letzten Impfstufe wird zur Inokulation des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt, und gegen Ende der Inkubationszeit wird der Kolbeninhalt zentrifugiert oder filtriert.

Beim Arbeiten in grossem Massstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und einer Einrichtung zur Belüftung des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Entsprechend diesem Verfahren wird das Nährmedium in einem Tank zubereitet und durch Erhitzen bei einer Temperatur bis zu etwa 120 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit dem zuvor gezüchteten Impfmaterial der produzierenden Kultur inokuliert, und die Fermentation kann während einer Zeit von z.B. 1 bis 6 Tagen unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Aufrechterhalten der Temperatur bei etwa 22 bis 26 °C durchgeführt werden. Dieses Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 890Aio ist besonders für die Herstellung von grossen Mengen an Antibiotikum geeignet.

Physikalische und chemische Eigenschaften des Antibiotikums 890Aio

Antibiotikum 890Aio ist eine saure Verbindung, die in Richtung auf den positiven Pol bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert migriert. Bei einem Gradienten von 50 V/cm in 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,1, bewegt sich das Antibiotikum 8,0 cm in 30 min, verglichen mit einer Bewegung von 4,0 cm für 890Ai. Das Dinatriumsalz ist ein weisses oder hellgelbes Pulver nach der Lyophilisierung aus wässriger Lösung. Bei sauren Bedingungen in wässriger Lösung ist das Antibiotikum instabil, und die freie Säureform wurde nicht isoliert.

Das Dinatriumsalz des Antibiotikums 890Aio besitzt ein Absorptionsmaximum bei 299 nm und ein Minimum bei 243 nm bei neutralem pH-Wert in Wasser. Die E% bei 300 nm der am besten gereinigten Zubereitung des Dinatriumsalzes beträgt 214. Das Verhältnis A300/A250 beträgt 3,33 für die reinste Probe, und das Verhältnis A300/a220 beträgt 2,05. Das Auftreten von geringen Verunreinigungen in dieser Probe lässt vermuten,

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dass die entsprechenden Verhältnisse für eine Probe mit vollständiger Reinheit etwas höher wären. Mehr als 94% der Absorption bei 300 nm können durch Umsetzung mit Hydroxy-lamin bei neutralem pH-Wert ausgelöscht werden. Die Absorption bei 250 nm nimmt ebenfalls bei der Umsetzung mit Hydro-xylamin ab, und das Verhältnis der Absorptionsabnahme bei 250 nm zu der Abnahme bei 300 nm beträgt etwa 0,16. Die Umsetzung mit Hydroxylamin, auf die die A3oo-Abnahme bei den in dem Teil «Hydroxylamine Reaction» beschriebenen Bedingungen folgt, scheint erster Ordnung zu sein, mit einer Halbwertszeit bei Zimmertemperatur von 23 bis 60 Sekunden.

Bestimmt gegenüber einem Standard des Antibiotikums 890Ai, besitzt das Antibiotikum 890Aio 174 Bioassay-Einheiten pro HAEA3oo-Einheit. HAEA300 wird unter der Überschrift «Hydroxylaminreaktion» beschrieben.

In Tabelle II sind die 100-MHz-Signale im kernmagnetischen Resonanzspektrum von 890Aio in d2o bei 32 °C angegeben. Die chemischen Verlagerungen werden in ppm, relativ zu HOD, bei 4,70 S bei 32 °C angegeben und die Kupplungskonstanten werden in Hertz aufgeführt.

Tabellen cfchch chsco c(6)-h c(5)-h c(8)-h c(,)-h2

-ch2nh -ch2-S-

1,55 (3H, D, 6,5 Hz)

2.02 (3H,S)

3,89 (1H, D, D, J6.5 = 5,4 Hz, J6.8 = 9,2 Hz)

- 4,34 (1H, D,T, J5-6 = 5,5 Hz, j5-1 = 9,5 Hz)

- 4,80 (teilweise bedeckt durch HOD-Linie)

- 3,14 (1H, D, D, ~ 9,2 + ~ 18 Hz)

- 3,33 (1H, D, D, ~ 10 + 18 Hz)

3,43(2H,T, 7 Hz)

3.03 (2H,M)

Das Massenspektrum von TMSi-890Aio zeichnet sich durch die in Tabelle III aufgeführten Fragmente aus.

Tabelle III

m/e 86

227,0224

241

300/1

339,1325

342,1444

368

440

458

C5H15SO4SÌ2, berechnet 227,0230

C13H25NO4SÌ2, berechnet 339,1322 C15H26N2O3S Si, berechnet 342,1433

tur:

Das Antibiotikum 890Aio besitzt die folgende Molekülstruk-

oso^h ch3-Ìh ooh s-ch2-ch2

(I)

?

-nh-c-ch-

Das Antibiotikum 890Aio zeichnet sich weiter durch die folgen- biotikums auf die Oberfläche einer lOOx 15 mm Petrischale, die den antibiotischen Spektrumprofile aus. 65 5 ml angeimpften Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt enthält,

Der Test zur Bestimmung der antibiotischen Spektrumpro- bestimmt, wobei bei 25 °c inkubiert wird. Die Ergebnisse, aus-file des Antibiotikums 890Aio wird durch Anwendung eines gedrückt als Durchmesser in Millimeter der Hemm- bzw. Inhi-0,015 ml Tröpfchens einer 9,5 ng/ml wässrigen Lösung des Anti- bierungszone sind in Tabelle IV aufgeführt.

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Tabelle IV

Organismus Hemmzone,

Durchmesser, mm

Bacillus sp. MB Nr. 633 30

Proteus vulgaris MB Nr. 1012 19

Pseudomonas aeruginosa MB Nr. 979 . 0

Serratia marcescens ATCC 890 15

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 20

Bacillus subtilis ATCC 6633 30

Sarcina lutea ATCC 9341 33

Staphylococcus aureus MB Nr. 698 23

Streptococcus faecalis MB Nr. 753 0

Alcaligenes faecalis ATCC 213 24

Brucella bronchiseptica ATCC 4617 0

Salmonella gallinarum MB Nr. 1287 28

Vibrio percolans ATCC 8461 33

Xanthomonas vesicatoria MB Nr. 815 20

Proteus vulgaris ATCC 21100 30

Escherichia coli MB Nr. 1418 25

Pseudomonas stutzeri ATCC 11607 0

Klebsiella pneumoniae MB Nr. 1264 19

Aerobacter aerogenes MB Nr. 835 22

Erwinia atroseptica ATCC 4446 10

Pseudomonas aeruginosa MB Nr. 2824 0

Corynebacterium pseudodiph. ATCC 9742 12

Escherichia coli ATCC 9637 17

Streptococcus faecium MB Nr. 2820 0

Strep'ococcus agalactiae MB Nr 2875 29

Vibrio percolans MB Nr. 2566 (res. ceph C) 22

Proteus vulgaris MB Nr. 2112 (Episom) 30

Proteus mirabilis MB Nr. 3126 29

Vibrio percolans ATCC 8461+2 x 10S jx/ml 25 Penicillinase

Vibrio percolans ATCC 8461+ß-Lactamase von 34 Enterobacter clacae MB 2646

Antibiotikum 890Aio ist gegenüber verschiedenen grampositiven und gram-negativen Bakterien aktiv und es ist ein potenter Inhibitor bakterieller ß-Lactamasen; es kann in der Human- und Veterinärmedizin Verwendung finden. 890Aio kann allein oder zusammen mit anderen antibakteriellen Arzneimitteln für die Behandlung von Infektionen, die durch grampositive oder gram-negative Bakterien hervorgerufen werden, verwendet werden, z.B. gegen Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Salmonella schottmuelleri.

Die beschriebene Verbindung kann zusammen mit ß-Lac-tam-Antibiotika, die gegenüber ß-Lactamasen empfindlich sind, verwendet werden, um die Wirkung solcher ß-Lactam-Antibio-tika zu inhibieren, indem die Lactamase-Aktivität inhibiert und somit die Gebrauchsdauer der Antibiotika verlängert wird.

Ein Gemisch aus Antibiotikum 890Aio mit einem lactamase-empfindlichen ß-Lactam-Antibiotikum wird bei der Behandlung von Infektionen mit ß-Lactamase liefernden Bakterien wirksamer sein, als es die gleiche Menge an ß-lactamase-empfindli-chem Antibiotikum allein wäre.

Das Antibiotikum 890Aio kann als Zusatzstoff für Tierfutter, zur Konservierung von Nahrungsmitteln und Futter und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Es kann in wässrigen Zusammensetzungen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung oder bevorzugt in Konzentrationen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Teilen Antibiotikum/Million Teile Lösung zur Zerstörung und Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Vorrichtungen bzw. Geräten und als Bakterizide bei industriellen Anwendungen verwendet werden.

Das Antibiotikum 890Aio kann in pharmazeutischen Zubereitungen als einziger aktiver Bestandteil oder zusammen mit s einem oder mehreren anderen Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden.

Das Antibiotikum kann oral, topisch, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Die für die Verabreichung ver-io wendeten Verfahren können irgendwelche auf diesem Gebiet übliche Verfahren sein oder irgendwelche Verfahren, die dem hierin beschriebenen Antibiotikum angepasst werden können.

Zusätzlich zu einem Träger können die beschriebenen Zubereitungen andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindeis mittel, Antioxydantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskositätsmittel oder Aroma- bzw. Geschmacksmittel, enthalten, wie sie gut bekannt sind und normalerweise verwendet werden.

Bei der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von 20 Geflügel, Rindern bzw. Kühen, Schafen, Schweinen u.ä., können die Zubereitungen z.B. in Form intramammarer Präparationen, entweder in langwirkenden oder schnell freisetzenden Grundstoffen, formuliert werden.

Die zu verabreichende Dosis hängt in grossem Massstab 25 von dem Zustand des zu behandelnden Subjekts, dem Gewicht des Wirts und der Art der Infektion, dem Weg und der Frequenz der Verabreichung ab. Für generalisierte Infektionen ist der parenterale Weg bevorzugt, und für intestinale Infektionen ist der orale Weg bevorzugt.

30 Bei der Behandlung bakterieller Infektionen bei Menschen bzw. Lebewesen können die beschriebenen Verbindungen gleichzeitig mit einem ß-Lactamase-empfindlichen Antibiotikum oral oder parenteral nach an sich bekannten Verfahren für die Antibiotikaverabreichung verabreicht werden. Das Anti-35 biotikum 890Aio wird in einer Menge von etwa 2 bis 600 mg/ kg/Tag verabreicht und bevorzugt in einer Menge von etwa 5 bis 100 mg/kg/Tag, bevorzugt in unterteilter Dosis, z.B. drei oder vier Mal am Tag. Es kann in Dosiseinheiten verabreicht werden, die z.B. 100,330,400 oder 1000 mg aktiven Bestandteil 40 mit geeigneten, physiologisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten liegen in Form flüssiger Zubereitungen, wie als Lösungen oder Suspensionen, oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die optimale Dosis, die bei irgendeinem speziellen Fall verabreicht wird, 45 wird natürlich von der Art und der Stärke der zu behandelnden Infektion abhängen. Kleinere Dosen werden in der Kinderheilkunde verwendet, wobei alle diese Einstellungen und Anpassungen dem Fachmann geläufig sind.

Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst auch die Her-5o Stellung der nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Salze von 890Aio, z.B. die pharmakologisch annehmbaren Salze, die mit anorganischen und organischen Basen gebildet werden, beispielsweise Metallsalze, die sich von Alkalimetalloder Erdalkalimetallhydroxiden, -carbonaten oder -bicarbona-55 ten ableiten, wie solche, die sich von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium ableiten, und Salze, die sich von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie Monoalkylaminen, Dialkylaminen, Trialkylaminen, niedrig- Alkanolaminen, Di-niedrig-alkanolaminen, niedrig-Alkylendiaminen, N,N-Diaral-60 kyl-niedrig-alkylendiaminen, Aralkylaminen, Amino-subst.-nied-rig-alkanolen, N,N-Di-niedrig-alkylamino-subst.-niedrig-alkano-len, Amino-polyamini- und Guanidino-subst-niedrig-alkansäu-ren und Stickstoff enthaltenden heterocyclischen Aminen, ableiten. Spezielle Beispiele sind Salze, die sich von Natriumhy-65 droxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicar-bonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin, N-Äthylpiperidin, Mor-pholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Athanolamin,

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Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N'-Dibenzyläthylen-diamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, Theophyllin, N-Methylglucamin u.ä. ableiten.

Die Salze der beschriebenen Verbindung können entweder direkt aus dem Fermentationsmedium unter Verwendung geeigneter Eluierungsmittel während der Ionenaustauschchroma-tographie isoliert werden, oder sie können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können die Disalze, wie das Dinatriumsalz, durch Behandlung von 2 Äquiv. Natriumhydroxid mit 1 Mol des Produktes (I) in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. Gemischte Salze mit einwertigen Kationen können durch Vermischen von 1 Mol einer einwertigen Base mit 1 Mol des Produktes (I) plus 1 Äquiv.

einer anderen Base hergestellt werden. Alternativ können monobasische Salze durch Behandlung von 1 Äquiv. einer Base mit einem einwertigen Kation mit 1 Mol des Produktes (I) hergestellt werden. Die Salze können ebenfalls durch Behandlung von 1 Mol des Produktes mit 1 Mol einer Base mit einem zweiwertigen Kation hergestellt werden. Die erfindungsgemäs-sen Salze sind pharmakologisch annehmbare, nicht-toxische Derivate, die als aktiver Bestandteil in geeigneten pharmazeutischen Formen in Dosiseinheiten verwendet werden können. Sie können ebenfalls mit anderen Arzneimitteln unter Erzeugung von Zubereitungen mit einem breiten Aktivitätsspektrum hergestellt werden.

Fermentationsbrühen, die das Antibiotikum 890Aio enthalten und die nach den erfindungsgemässen Verfahren hergestellt wurden, besitzen Aktivitäten im Bereich von etwa 2 bis 170 Einheiten/ml, wenn sie nach dem Scheiben-Diffusionsassay-bzw. -analysenverfahren unter Verwendung von Vibrio percolans (ATCC 8461) analysiert werden. Das in diesen Fermentationsbrühen enthaltene Antibiotikum 890Aio kann nach einer Reihe von Verfahren isoliert und gereinigt werden. Bei einem solchen Verfahren wird das Antibiotikum 890Aio an einem stark basischen Anionenaustauschharz adsorbiert. Beispiele für solche stark basischen Anionenaustauschharze sind solche mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix, z.B. das Polystyrolharz «Dowex» 1x2 mit quaternären Ammoniumgruppen am Kern (hergestellt von Dow Chemical Co., Midland, Michigan) im Chloridzyklus. Andere Beispiele von dieser Klasse von stark basischen Austauschharzen umfassen die folgenden: «Duolite» A-40, A-42, A-101, A-102 und A-l 14 (hergestellt von Chemical Process Co., Redwood City, California); «Amberlite» IRA-400, IRA-401 und IRA-410. Alternativ kann ein schwach basisches Anionenaustauschharz, wie «Amberlite» IRA-68, verwendet werden. («Amberlite»-Harze werden von Rohm und Haas, Washington Square, Philadelphis 5, Pennsylvania, hergestellt.)

Das adsorbierte Antibiotikum kann leicht aus dem Anionenaustauschharz mit Salzlösungen in 80%igem (Vol/Vol) wäss-rigem Methanol eluiert werden. Das so erhaltene Eluat kann weiter durch andere Reinigungsverfahren gereinigt werden. Das Eluat kann durch seine Konzentration und Durchleiten durch eine mit Polystyrol, einem nichtpolaren, hydrophoben, vernetzten Divinylbenzolpolymeren, wie XAD-1,2 und 4, oder mit Polyacrylamidharzen, wie XAD-7 und 8, gepackte Säule gereinigt werden. XAD-2 ist bevorzugt. (XAD-1,2,4,7 und 8 werden von Rohm and Haas, Philadelphia 5, Pennsylvania, hergestellt.)

Ein Verfahren zur Herstellung von weiter gereinigtem Antibiotikum 890Aio ist die Verwendung von Gelfiltration durch Polyacrylamid-Gel mit einer Porengrösse, durch die Moleküle mit einem Molekulargewicht über 1800 ausgeschlossen werden, wie «Bio-Gel» P-2 (hergestellt von Bio. Rad, Richmond, California). Andere Gele, wie «Sephadex» G-10, können ebenfalls für die Entsalzung verwendet werden.

Das bevorzugte Verfahren, gemäss dem das Antibiotikum 5 890Aio in hoher Reinheit aus einer Brühe erhalten wird, besteht in dem Zentrifugieren oder Filtrieren der Brühe zur Entfernung der Feststoffe; die Adsorption und Elution des Filtrats von einem Anionenaustauschharz, wie «Dowex»-l x2, im Chloridzyklus mit 3% NaCl in 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol, io wodurch das Antibiotikum sowohl konzentriert als auch gleichzeitig teilweise gereinigt wird; Durchleiten über eine Säule von geeignet zubereitetem XAD-2, wodurch das Antibiotikum zurückgehalten wird und das «Dowex»-1 x2-Eluat gereinigt und entsalzt wird. Die mit 890Aio angereicherten Fraktionen i5 werden vereinigt und weiter gereinigt. Bei der Chromatographie an einem «Dowex»-l x2,Teilchengrösse max. —0,037 mm, Harz unter Eluierung mit NaCl und/oder NH4CI in 80%igem wässrigem Methanol erhält man ein Produkt, das von vielen der ursprünglichen, UV-absorbierenden Verunreinigungen 20 befreit ist (das NH4CI wird zur Erreichung einer gewissen Pufferkapazität in dem Eluierungsmittel verwendet). Das 890Aio wird dabei von anderen Antibiotika abgetrennt. Durch eine Entsalzung an «Bio-Gel» P-2 oder «Sephadex» G-10 wird die Hauptmenge des Salzes, die bei der «Dowex-l»x2-Chromato-25 graphie eingeführt wurde, entfernt.

Die restlichen Verunreinigungen können durch zusätzliche Chromatographiezyklen an «Dowex-l»x2, (-0,037 mm) mit Eluierung durch eine Lösung, die Natriumchlorid und 30%iges Methanol enthält, gefolgt durch ein Entsalzen entfernt werden. 30 Bei der Reinigung durch Säulenchromatographie werden im allgemeinen nur solche Fraktionen des eluierten Volumens, die das Antibiotikum mindestens 30% so rein wie die reinste Fraktion enthalten, für die weitere Reinigung vereinigt. Die Kriterien für die Reinheit sind die Verhältnisse Bioaktivität/ 35 a220, A300/A250 und HAEA300/22O und bei den Entsalzungsverfahren die Leitfähigkeit. Bei jeder Chromatographiestufe werden daher a220, A2S0, A300 und die Bioaktivität geeigneter Fraktionen bestimmt. Wenn möglich, wird auch HAEA300 gemessen und bei der Entsalzung werden die Leitfähigkeiten bestimmt. Die « Kriterien für die Entscheidung, welche Fraktionen für die nachfolgenden Behandlungen vereinigt werden, können etwas eingestellt werden, so dass man höhere Ausbeuten auf Kosten der Reinheit und umgekehrt eine höhere Reinheit auf Kosten der Ausbeute erhält.

45 Beim Arbeiten im Labormassstab (weniger als 201 Probenvolumen) werden alle Chromatographiestufen, mit Ausnahme der XAD-2-Chromatographie, in einem Kühlraum bei 2 bis 5 °C durchgeführt. Die XAD-2-Chromatographie wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der pH-Wert der zu lagernden Anti-50 biotikalösungen wird durch sorgfältige Zugabe von verdünnten NaOH- oder HCl-Lösungen eingestellt. Wässrige Lösungen werden in einem Kühlschrank oder bevorzugt in Eis-Wasser und 50- bis 80%ige Methanollösungen bei -20 bis -60 °C gelagert.

55 Bei den Reinigungsstufen vor der XAD-2-Chromatographie werden die Lösungen im allgemeinen auf 25 p,M in EDTA durch Zugabe von Vaooo Volumen einer Lösung aus 0,1 M Na2 EDTA eingestellt, die auf einen pH-Wert von 7,0 durch Zugabe von Natriumhydroxid (0,1 M «neutrales EDTA») neutralisiert 60 wurde.

Nachstehend ist ein Fliessschema für das Reinigungsverfahren zur Herstellung des Antibiotikums 890Aio dargestellt.

7

Schema des Reinigungsverfahrens für Antibiotikum 890Aio

634

Fermentierte 890A-J0 enthaltende Brühe

1.Kühlen

2.Zentri-

Zentrifu-$ gierte Brühe

1.Adsorb. an "Dowex"-lx2(Cl ) (0,297-0,149 mm)

2.Waschen mit 0,15M NaCl+0,01 M

fugieren 3.Zugabe v

EDTA

tris-HCl+25 /UM EDTA in 50#igem MeOH '

3.Waschen mit Wasser

4.Eluieren mit 3% NaCl+0,01 M tris-HCl,pH 7,+25 /UM neutr.

v EDTA in 8056 Methafcol

"Dowex"-lx2 >

80»0H

Eluat

Ì1.Konzentrieren

2.Adsorbieren an XAD-2

3.Eluieren mit Wasser

XAD-2 Eluat

1 .Konzentrieren der 890A>jo enthaltenden Fraktionen

2.Verdünnen mit MeOH _

3.Adsorb. an "Dowex"-lx4(Cl ) (0,037 mm)

^.Eluieren mit 0,26M NaCl + V 0,005M NHaCl+0,00005M NH3 in 80% Methanol

"Dowex"-lx4 Eluat 890A10

1.Verdünnen mit Wasser _

2.Adsorb. an "Dowex"-lx2(Cl ) (0,037 mm)

3.Eluieren mit 0,26M NaCl + 0,005M NH4C1+0,00005M NH,

w in 30% Methanol D

"Doi*ex"-lx2 Eluat

1.Konzentrieren

2.Adsorbieren an "Bio-Gel" P-2

3.Eluieren mit 0,02 mM NH^

"Bio-Gel" P-2 Eluat

1.Konzentrieren

2.Lyophilisieren

634104 8

Analysen- bzw. Assayverfahren für Antibiotikum 890Aio mm angenommen und (Potenz des Standards) wird als 1 Ein-

I. Bioassay bzw. -analyse heit/ml angenommen, bestimmt mit Vibrio percolans ATCC

Ein Agarplattenscheiben-Diffusionsverfahren wird unter 8461. Reines 890Ai wird als solches mit einer Potenz von 250 Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganis- Einheiten pro Hydroxylamin auslöschbaren Absorptionseinhei-mus verwendet. Eine gereinigte Probe des Antibiotikums 890Ai 5 ten bei 300 nm definiert, wenn es als Standard verwendet wird, wird als Standard verwendet. Das Antibiotikum 890Ai wird entsprechend dem nachstehend beschriebenen Verfahren her- n. Analysever/ahren für die Bestimmung der «890 Assayeinhei-gestellt. ten»

Platten, die Vibrio percolans ATCC 8461 enthalten, werden Ein an sich bekanntes Agarplattenscheiben-Diffusionsver-folgendermassen hergestellt. io fahren wird unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC

Eine lyophilisierte Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 8461 als Testorganismus verwendet. Cephaloridin wird als wird in 15 ml eines sterilisierten Mediums suspendiert, das 8 g/1 Standard verwendet. Die Vibrio percolans ATCC 8461 enthal-Difco Nährbrühe und 2 g/1 Hefeextrakt in destilliertem Wasser tenden Platten werden wie folgt hergestellt. Eine Kultur von enthält, «Nährbrühe-Hefeextrakt» (im folgenden als NBYE Vibrio percolans ATCC 8461 wird in Nährbrühe-Hefeextrakt bezeichnet). Die Kultur wird über Nacht auf einer Rotations- is über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 28 °C schüttelvorrichtung bei 28 °C inkubiert. Diese Kultur wird zur inkubiert und dann auf eine Dichte von 60%iger Durchlässig-Inokulierung der Oberfläche von Schrägkulturen verwendet, keit bei 660 nm verdünnt. Ein 33,2 ml Teil dieser verdünnten die 1,5% Agar in NBYE enthalten. Die inokulierten Schrägkul- Kultur wird zu 11 eines Mediums zugegeben, das aus Nähragar turen werden über Nacht bei 28 °C inkubiert und dann in einem plus 0,2% Hefeextrakt besteht und bei 46 °C gehalten wird. Das Kühlschrank gelagert. 20 inokulierte, Agar enthaltende Medium wird in 100 x 15 mm

Die gekühlten Schrägkulturen, die aus einer einzigen, lyo- Kunststoff-Petrischalen, 10 ml/Schale, gegossen, gekühlt und philisierten Kultur hergestellt werden, werden bis zu 4 Wochen bei 2 bis 4 °C bis zu 5 Tage vor der Verwendung gehalten, von ihrer Herstellung folgendermassen verwendet. Eine Öse Die Konzentration an Cephaloridin, die äquivalent zu 1 Ein-

von Inokulum aus der Schrägkultur wird in 50 ml NBYE, enthal- heit/ml 890Ai ist, wird durch Analyse an Platten, die wie oben ten in einem 250 ml Erlenmeyerkolben, dispergiert. Die Kultur 25 beschrieben hergestellt wurden, die jedoch 5 ml inokuliertes wird über Nacht auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei Medium/Platte enthalten, wie folgt bestimmt. Vier Konzentra-28 °C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die eine tionen an Cephaloridin ergeben den Standard - 3,12,6,25,12,5

50%ige Durchlässigkeit bei 660 nm ergibt. Ein 33,2 ml Teil die- und 25 (ig/ml, wobei 12,5 (ig/ml als Vergleichslösung genom-ser verdünnten Kultur wird zu 11 NBYE gegeben, der 15 g men wird. Die Zonendurchmesser auf einer 5 ml Platte für den

Agar enthält, und bei 46 °C gehalten. Das inokulierte, Agar ent- 30 Standard sind wie folgt:

haltende Medium wird auf lOOx 15 mm Kunststoff-Petrischalen, 5 ml/Schale, gegeben, abgekühlt und bei 2 bis 4 °C bis zu 5 Konzentration (|ig/ml) Zonendurchmesser (mm) Tagen vor der Verwendung gehalten. 3,12 16,8 Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 1,27 cm 6,25 22,3 werden in die zu analysierende Lösung eingetaucht und auf das 35 12,5 25,0 Agar gelegt. Alternativ können die Scheiben durch Aufpipettie- 25 29,6 ren von V10 ml Lösung auf eine trockene Scheibe beladen werden, und dann kann die Scheibe auf das Agar gestellt werden. Eine Einheit wird als die Menge an Antibiotikum/ml defi-

Der Durchmesser der Hemmzone wird nach geeigneter Inku- niert, die eine 25 mm Hemmzone auf einer 5 ml Platte, wie in bierung (12 bis 24 h bei 25 °C) gemessen. Gegebenenfalls kön- 40 Teil I oben beschrieben, ergibt. Bei dieser Analyse wird daher nen Verdünnungen der zu untersuchenden Lösungen in 0,05 M eine Konzentration von 12,5 ng/ml Cephaloridin als äquivalent Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, «Kaliumphosphatpuffer» (im zu 1 Einheit 890Ai/ml genommen. Da die Neigung der Linie für folgenden als KPB bezeichnet), oder in entionisiertem Wasser Cephaloridin 4,0 beträgt, erfolgen die Berechnungen der durchgeführt werden. Potenz einer Probe einer Verwendung einer Neigung von 4,0.

Die Potenzen bzw. Stärken werden folgendermassen 45 berechnet. Eine Neigung wird bestimmt, indem man die Zonen- III. Hydroxylaminreaktion durchmesser einer Lösung aus Antibiotikum 890Aio und einer Antibiotikum 890Aio reagiert mit Hydroxylamin und ergibt vierfachen Verdünnung (in KPB) dieser Lösung misst. Zwei eine Substanz, bei der die Absorption bei 300 nm stark verrin-Scheiben von jeder Konzentration werden auf einer einzigen gert ist. Dies ergibt eine Grundlage für die quantitative Analyse Platte analysiert und die durchschnittliche Zonengrösse bei 50 des Antibiotikums 890Aio.

jeder Konzentration wird bestimmt. Die Neigung ist gleich der Die zu analysierende Lösung wird auf 0,05 M in Kaliumphos-Hälfte des Unterschieds der durchschnittlichen Zonengrösse. phat gebracht, pH 7,4, indem man Vio Volumen einer Lösung,

die 0,8 M K2HPO4 enthält, zugibt. Dann werden V100 Volumen 1 M Hydroxylamin-hydrochlorid zugegeben und die Absorp-55 tion wird bei 300 nm in Intervallen von Vi bis 2 min bestimmt. Die Umsetzung wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Man nimmt kinetische Werte erster Ordnung an und schätzt die Halbwertszeit aus der Absorptionsabnahme während der ersten 10 min. Aus dieser Halbwertszeit wird der Zeitpunkt 60 geschätzt, nach dem keine weitere Absorptionsabnahme beobachtet werden sollte, und die Beobachtungen werden über diesen Zeitpunkt hinaus weitergeführt. Beobachtet man über diesen Zeitpunkt hinaus keine weitere Abnahme, so wird die worin D der durchschnittliche Durchmesser der von der Unbe- gesamte Absorptionsabnahme (wobei für die Verdünnungswir-kannten gebildeten Zonen, Ds der durchschnittliche Durchmes- 65 kung und die Absorption des Hydroxylamins korrigiert wird) ser der Standardzonen und «Verdünnung» der Grad bzw. die als die «Hydroxylamin auslöschbare Absorption bei 300 nm Stärke, auf den die Unbekannte vor der Analyse verdünnt (HAEA300)» angenommen. Wenn die Absorption über diesen wurde, bedeuten. Wird kein Standard verwendet, wird Ds als 25 Zeitpunkt hinaus abnimmt, wird die Rate der Hintergrundsab-

Die Potenzen werden entsprechend der folgenden Formel berechnet:

[D-Da] log 2

Potenz (Einheiten/ml) = \ 1

(Potenz des Standards) x Verdünnung x 10

9

634104

sorptionsabnahme berechnet und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt wird durch die Hintergrundsabnahme korrigiert, wobei angenommen wird, dass die Hintergrundsabnahme im Verlauf der Zeit linear verläuft. Der korrigierte Wert wird dann als HAEA300 aufgezeichnet. 5

Die Anzahl der HAEA3oo-Einheiten ist gleich dem HAEA300, multipliziert mit dem Volumen in ml.

Die folgenden Beispiele erläutern die Verfahren, gemäss denen die beschriebenen Produkte hergestellt werden. Diese Beispiele dienen nur zur Erläuterung, und irgendwelche Modifi-10 kationen der beschriebenen Verfahren, gemäss denen man die Produkte erhält, sollen als analoge Verfahren angesehen werden und werden von der vorliegenden Erfindung mitumfasst.

Die Herstellung des Antibiotikums 890Ai wird in der US-Anmeldung mit der Serial Nr. 634 300 beschrieben. Auf diese 15 Veröffentlichung wird expressis verbis Bezug genommen.

Beispiel 1

Eine MA-4638 enthaltende Schrägkultur wird zur Inokulierung von 250 ml Erlenmeyerkolben mit Ablenkelementen, die 50 ml Medium enthalten, verwendet.

Medium A Dextrose

Hefeautolysat («Ardamine»)* MgSOWHîO Phosphatpuffer**

destilliertes Wasser pH 6, j

*«Ardamine»: Yeast Products, Inc.

**Phosphatpufferlösung:

KH2PO4

N32HP04

destilliertes Wasser

10,0 g 10,0 g 0,05 g 2,0 ml 1000 ml

91,0 g 95,0 g 1000 ml

Dieser Kolben wird bei 28 °C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, 2 Tage lang geschüttelt, bis das Wachstum ausreichend ist. Nach 2 Tagen wird dieses Impf produkt zur Inokulierung von drei 250 ml Erlenmeyerkolben, die 40 ml Medium B enthalten, unter Verwendung von 2 ml/Kolben (5%) verwendet.

Medium B

Tomatenpaste bzw. -mark ganzer Hafer (gemahlen)

destilliertes Wasser pH: unter Verwendung von NaOH auf 7,0 eingestellt

20,0 g 20,0 g 1000 ml tisch in zwei Impfkolben, die je 500 ml C-Medium enthalten, überführt. Die Impfkolben, 21, Schüttelkolben mit drei Ablenkelementen, sind mit einem Seitenarm ausgerüstet, der mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen wird.

C-Medium

Autolysierte Hefe (Ardamine*) 10,0 g

Glucose 10,0g MgS04.7H20 0,05 g Phosphatpuffer** 2,0 ml destilliertes Wasser 100 ml der pH-Wert wird vor der Sterilisierung mit NaOH auf 6,5 eingestellt *«Ardamine»: Yeast Products, Inc. **Phosphatpufferlösung:

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0

destilliertes Wasser 1000 ml

20

30

35

45

Diese Produktionskolben werden ebenfalls bei 28 °C auf einer 220 U/min Schüttelvorrichtung bis zu 4 Tagen lang geschüttelt, wobei Analysenversuche während der Fermentation durchgeführt werden. Im Alter von 3 Tagen wird ein aliquoter Teil der überstehenden Lösung von der zentrifugierten Brühe für Klassifizierungs- und Identifizierungsuntersuchungen verwendet. Unter Verwendung von 0,65 cm Analysenscheiben auf Standardanalysenplatten ergibt diese Brühe 22 mm Hemmzone gegenüber Proteus vulgaris und eine 15 mm Hemmzone gegenüber Salmonella gallinarum. Die Bioautographie eines Elektrophoretogramms der zentrifugierten Brühe zeigt zwei Komponenten. Der sich schneller bewegende, kleinere Fleck enthält 890Aio.

Beispiel 2

Zwei gefrorene Ampullen, die je 2 ml MA-4638-Inokulum enthalten, werden langsam aufgetaut, und der Inhalt wird asep55

60

65

Die inokulierten Impfkolben werden 24 bis 30 h lang bei 28 °± 1 °C auf einer 210 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt. Das Wachstum aus den Impfkolben wird zur Inokulation von zwei 141 Glasfer-i mentationsbehältern, die 101 Produktionsmedium (D-Medium plus 0,15% Sojabohnenöl, Vol/Vol) enthalten, verwendet.

D-Medium

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 1 40,0 g

Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

C0CI2 • 6H2O 50,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml vor der Sterilisierung wird der pH-Wert mit HaOH auf 7,3 eingestellt

Die Fermentationsreaktoren werden bei 24 °C unter Verwendung einer Rührrate von 640 U/min (etwa Kd 5,5) und einer Luftströmung von 0,5 WM während 72 h betrieben. Entschäu-mungsmittel, «Hodag»-MF (Hodag Chemical Corp.) wird je nach Bedarf, aber nicht über 0,1%, verwendet.

Der Inhalt der beiden Fermentationsbehälter wird nach dem Fermentations versuch vereinigt; man erhält etwa 201.

200-ml-Teile des Ansatzes werden in einer «Servali» RC-2B-Zentrifuge bei 9000 U/min 20 min zentrifugiert. Das überstehende Material wird durch eine 1 cm Schicht von «Hyflo Super-Cel» in einem 33,02 cm Lapp-Trichter mit einem Filtertuch filtriert. Das Filtrat besitzt eine Bioaktivität von 20 Einheiten/ml.

Die filtrierte Brühe (181) wird auf eine Säule (8,2 x 29 cm) aus «Dowex»-l x 2(C1~), 0,297 bis 0,149 mm, bei 150 ml/min angewendet. Die Säule wird dann mit 11 entionisiertem Wasser und anschliessend mit 1510,15 M NaCl + 0,01 M tris-HCl-Puf-fer, pH 7,0 + 25 (iM neutr. EDTA in 50% MeOH mit 150 ml/min gewaschen.

Das Antibiotikum 890Aio wird dann mit 3,2% NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0 + 25 jxM neutral. EDTA in 80% MeOH mit 100 ml/min eluiert. Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 11, vier Fraktionen von je 500 ml und zwölf Fraktionen von je 11. Die Bioaktivität und die Absorption bei 220 nm werden von jeder Fraktion bestimmt, und solche Fraktionen, die Bioktivität/A22o-Verhältnisse über 0,6 Einheiten/ A22o-Einheit ergeben und die mehr als 10% der gesamten gewonnenen Aktivität/Fraktion enthalten, werden für die weitere Reinigung vereinigt. Es werden so die Fraktionen 4 bis 8 vereinigt, die insgesamt 22% der angewandten Bioaktivität enthalten.

634104

10

Die gesammelten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 190 ml konzentriert. Das ausgefällte Salz wird mit entionisiertem Wasser gewaschen und das Waschwasser wird zu der überstehenden Lösung gegeben. Dadurch wird das Gesamtvolumen auf 220 ml gebracht. Der pH-Wert des Kon- s zentrats wird mit HCl auf 6,5 eingestellt und das Eluat wird auf eine Säule (6,0x59 cm) aus «Amberlite» XAD-2 aufgebracht, die zuvor mit 8160%igem wässrigem Aceton und anschliessend mit 161 entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Nach Beendigung der Aufbringung wird die Säule mit 5x 10 ml Teilen ent- "> ionisiertem Wasser gespült, und die Antibiotika werden mit entionisiertem Wasser mit 35 ml/min eluiert. Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 500 ml, dann sieben Fraktionen von je 250 ml, anschliessend vier Fraktionen von 500 ml. i5

Die Bioaktivitäts- und HAEA304-Werte der Fraktionen 3 bis 12 werden gemessen. Die Fraktionen 4 bis 9 besitzen HAEA304/ A22o-Verhältnisse über 0,01 und werden für die weitere Reinigung vereinigt. Die Fraktion 3, die etwa Vs des aufgebrachten Salzes enthält, wird ebenfalls zu diesem vereinigten Material 20 gegeben. Das vereinigte Material enthält 469 HAEA304-Einhei-ten.

Die vereinigten Fraktionen werden auf 4,11 verdünnt, und sie werden auf eine Säule (2,15x42 cm) aus «Dowex»-l x4 (Cl~), (-0,037 mm) mit 2 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 100 25 ml 50%igem Methanol gewaschen, und das Antibiotikum wird mit 0,25 M NaCl + 0,01 M NH4C1 + 0,0001 M NH3 in 80%

MeOH mit etwa 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 2 bis 12 ml werden gesammelt.

Die Bioaktivität und die Absorption bei 220 nm, 260 nm und 30 300 nm werden für jede fünfte Fraktion bestimmt und HAEA300 wird bei den bioaktiven Peakfraktionen gemessen. Die 890Aio-Bioaktiviät tritt bei den Fraktionen 85 bis 150 mit einem Maximum bei der Fraktion 120 auf. Fraktionen mit HAEA3oo/A3oo-Werten über 0,05 werden vereinigt und weiter 35 gereinigt. Es werden so die Fraktionen 105 bis 133, die insgesamt 130 HAEA3oo-Einheiten enthalten, vereinigt. Die vereinigten Fraktionen 105 bis 133 werden auf 1900 ml mit entioniertem Wasser verdünnt und der pH-Wert wird auf 7,6 eingestellt. Die Probe wird auf eine Säule (2,15x42 cm) auf «Dowex»-l x2 40 (Cl~), (-0,037 nm), aufgebracht, die zuvor mit 313%igem NaCl in 50%igem Methanol, gefolgt von 50 ml 50%igem Methanol gewaschen wurde. Nach Aufbringen der gesamten Probe wird die Säule mit 100 ml 30%igem Methanol gewaschen und mit 2 ml/min mit 0,26 M NaCl + 0,005 M NH4CI + 0,0002 M NH3 in 45 30%igem Methanol eluiert. Fraktionen von 10 bis 12 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Aio tritt bei den Fraktionen 230 bis 290 mit einem Maximum bei der Fraktion 260 auf. Die Fraktionen mit einem A300/A250-Verhältnis über 1,10 50 und einem A3oo/A22o-Verhältnis über 0,83 werden für die weitere Reinigung gesammelt. Es werden so die Fraktionen 240 bis 275 vereinigt, die 91,6 HAEAsoo-Einheiten enthalten.

Die vereinigten Fraktionen 240 bis 275 werden bei vermindertem Druck auf 10 ml konzentriert und das Konzentrat wird 55 von dem ausgefällten Salz durch Pipettieren abgetrennt. Das Salz wird mit 2 ml entionisiertem Wasser gewaschen und das Waschwasser wird zu dem Konzentrat zugegeben. Die vereinigten 12 ml Konzentrat und Waschwasser werden auf eine Säule(2,15X76cm)aus«Bio-Gel»P-2(0,074bis0,037mm)auf- 60 gebracht, die zuvor mit 30 ml gesättigtem NaCl in entionisiertem Wasser, gefolgt von 1500 ml entionisiertem Wasser und 50 ml 0,05 mMol NH3 in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Nach Beendigung der Anwendung wird die Säule mit 3x 1 ml 0,05 mM NH3 in entionisiertem Wasser gespült. Das Antibioti- 65 kum wird mit 0,05 mM NH3 in entionisiertem Wasser mit 0,73 ml/min eluiert. Fraktionen von je 3,651 werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Aio tritt bei den Fraktionen 29 bis 50 mit einem Maximum bei der Fraktion 36 auf. Die Fraktionen mit einem A3oo/A25o-Verhältnis über 1,9 und ebenfalls mit einem A3oo/A22o-Verhältnis über 1,45 werden für die Lyophilisierung und NMR-Analyse vereinigt. Es werden so die Fraktionen 36 bis 45 vereinigt, die 50,8 A3oo-Einheiten enthalten, von denen 45,1 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen 36 bis 45 werden bei vermindertem Druck auf 1 ml konzentriert und 5 ml D2O werden zugegeben. Die Probe wird erneut auf 0,835 ml konzentriert, und 0,825 ml davon werden in eine Glasampulle überführt, gefriergetrocknet und lyophilisiert. Die lyophilisierte Probe enthält 48,2 A3oo-Einheiten und 4,6 mg Feststoffe. Sie wird als Probe 9441-154 bezeichnet.

Die Nebenfraktionen 31 bis 34 und 46 bis 49 werden vereinigt; man erhält eine «Nebenprobe», die dann auf 1 ml konzentriert wird, schnell gefroren und lyophilisiert wird. Diese Fraktionen enthalten 24 A3oo-Einheiten, von denen 17 durch Hydroxylamin auslöschbar sind. Diese Probe wird als Probe 9441-155 bezeichnet.

Beispiel 3

Eine gefrorene Ampulle, die 2 ml MA-4638 Inokulum enthält, wird langsam aufgetaut und der Inhalt wird aseptisch in einen 500 ml C-Medium enthaltenden Impfkolben überführt. Der Impfkolben, 21, ein Schüttelkolben mit dreifachen Ablenkelementen, der mit seinem Seitenarm ausgestattet ist, wird mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen.

C-Medium autolysierte Hefe («Ardamine»)* 10,0 g

Glucose 10,0g

MgS04 • 7H2O 0,05 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml destilliertes Wasser 1000 ml vor der Sterilisierung wird der pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt *«Ardamine»: Yeast Products, Inc.

**Phosphatpufferlösung:

KH2PO4 91,0g

NaîHP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Der inokulierte Impfkolben wird 36 h lang bei 28 °C+1 °C aus einer 210 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt.

Das Wachstum aus diesem Impfkolben wird zur Inokulierung eines 141 Glasfermentationsbehälters verwendet, der 101 Produktionsmedium (D-Medium plus 0,15% Sojabohnenöl, Vol/ Vol) enthält.

D-Medium

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g

Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

C0CI2 • 6H2O 50,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml vor der Sterilisierung wird der pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

Der Fermentationsbehälter wird bei 24 °C unter Verwendung einer Rührrate von 550 U/min (Kd 3,0 bis 3,5) und einer Luftströmung von 0,5 WM betrieben. Entschäumungsmittel, «Hodag»-MF (Hodag Chemical Corp.), wird gegebenenfalls verwendet, aber nicht über 0,1%.

Die Kulturbrühe wird nach 72stündiger Fermentation geerntet.

11

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200-ml-Teile des Ansatzes werden auf einer «Servali» RC-2-Zentrifuge mit 9000 U/min zentrifugiert. Das überstehende Material enthält 71 mit 39 Bioassayeinheiten/ml.

Das überstehende Material wird durch einen Lapp-Trich-ter, der eine 1-cm-Schicht aus «Hyflo Super-Cel» auf einem Filtertuch enthält, filtriert. Zu 6,51 Filtrat gibt man 3,25 ml 0,1 M neutr. EDTA, und das Filtrat wird dann auf eine Säule (8,2 x 21,5 cm) aus «Dowex»-l x 2(C1~), (0,297 bis 0,149 mm), mit 60 ml/min aufgebracht. Nach der Anwendung wird die Säule mit 11 entionisiertem Wasser gespült und dann mit 1210,15 M NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,08, + 25 (j.M EDTA in 50% MeOH mit 50 ml/min gewaschen. ,

Das Antibiotikum 890Aio wird dann mit 12,313%igem NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,1, + 25 p,M EDTA in 80% MeOH mit 60 ml/min eluiert.

Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 500 ml, vier Fraktionen von je 200 ml, zwölf Fraktionen von je 500 ml und fünf Fraktionen von je 11. Bioaktivität tritt bei den Fraktionen 3 bis 17 mit einem Maximum bei den Fraktionen 6,7 und 8 auf. Die Fraktionen mit Bioaktivität/A22o-Werten über 0,9 Einheiten/A22o-Einheit, die'ebenfalls mehr als 8% der gesamten wiedergewonnenen Aktivität/Fraktion enthalten, werden für die weitere Reinigung gesammelt. Es werden so die Fraktionen 6 bis 12 vereinigt, die 106 000 Bioassay-Einheiten oder 41% der angewendeten Bioaktivität enthalten. Diese vereinigten Fraktionen werden bei -60 °C gehalten, bis sie mit den Fraktionen 6 bis 13 aus einer zweiten Dowexsäule, wie in Beispiel 4 beschrieben, vereinigt sind.

Beispiel 4

Zwei gefrorene Ampullen, die je 2 ml MA-4638-Inokulum enthalten, werden langsam aufgetaut. Der Inhalt wird aseptisch in zwei Impfkolben überführt, die je 500 ml C-Medium enthalten. Die Impfkolben, 21 Schüttelkolben mit dreifachen Ablenkelementen und einem Seitenarm, werden mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen.

C-Medium autolysierte Hefe («Ardamine»)* 10,0 g

Glucose 10,0g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml destilliertes Wasser 1000 ml vor der Sterilisierung wird der pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt *«Ardamine»: Yeast Products, Inc.

**Phosphatpufferlösung:

KH2PO4 91,0 g

NazHPOt 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Die inokulierten Impfkolben werden 36 h lang bei 28° ± 1 °C auf einer 210 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt.

Das Wachstum aus den Impfkolben wird zur Inokulierung von zwei 141 Glasfermentationsbehältern verwendet, die je 101 D-Produktionsmedium enthalten.

D-Medium

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g

Schlempe 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

C0CI2 • 6H2O 50,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml vor der Sterilisierung wird der pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

Zwei Fermentationsbehälter werden beladen und bei 24 °C unter Verwendung einer Rührrate von 550 U/min (Kd 3,0 bis 3,5) und einer Luftströmung von 0,5 WM betrieben. Gewünschtenfalls wird ein Entschäumungsmittel, Polyglykol s 2000, verwendet, aber nicht mehr als 0,1%.

Die Kulturbrühen aus den beiden Fermentationsbehältern werden nach 72 h geerntet.

200-ml-Teile der 10-1-Ansätze werden in einer «Servall»-Zentrifuge bei 9000 U/min zentrifugiert. Man erhält 91 überste-10 hendes Material aus jedem Ansatz. Die Bioanalysen zeigen, dass der Ansatz 123,4 Einheiten/ml und der Ansatz II 31,8 Einheiten/ml enthalten.

Die Ansätze werden vereinigt, gekühlt und durch eine 1-cm Schicht aus «Hyflo Super-Cel» auf einem 33,02 cm «LabTek»-15 Porzellanbüchnertrichter filtriert. Zu den 151 Filtrat gibt man 7,5 ml 0,1 M neutr. EDTA.

Das Filtrat wird auf eine Säule (13,4x 16 cm) aus «Dowex»-l x2 (Cl~), (0,297 bis 0,149 mm), mit 100 ml/min aufgebracht. Nach Beendigung der Anwendung wird die Säule mit 21 20 entionisiertem Wasser und dann mit 2010,15 M NaCl + 0,01 M tris-HCl-Puffer, pH 7,01, + 25 p.M EDTA in 50% MeOH mit 40 bis 80 ml/min gewaschen.

Das Antibiotikum 890Aió wird dann mit 24,41 einer Lösung eluiert, die 3% NaCl + 0,02 M tris-HCl, pH 7,0, + 25 |xM EDTA 25 in 80% MeOH enthält, und zwar mit 100 ml/min. Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 800 ml, vier Fraktionen von je 400 ml, zwölf Fraktionen von je 1000 ml und fünf Fraktionen von je 2000 ml.

Die antibiotische Aktivität tritt bei den Fraktionen 5 bis 16 30 mit einem Maximum bei den Fraktionen 7 und 8 auf. Die Gesamtaktivität in diesen Fraktionen beträgt 212 000 Einheiten, entsprechend 51% der angewendeten Aktivität. Die Fraktionen 6 bis 13 werden für die weitere Reinigung vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen 6 bis 13 aus der Dowexsäule 35 werden zu den vereinigten Fraktionen 6 bis 12 aus der Dowexsäule von Beispiel 3 gegeben und bei vermindertem Druck in einem Verdampfer mit langem Rohr und Dampfmantel auf 2,61 konzentriert. Dieses Konzentrat wird weiter durch Verdampfen bei vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer auf 40 300 ml reduziert, und die ausgefallenen Salzkristalle werden abfiltriert.

Durch Zugabe von 1,7 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure wird der pH-Wert des Konzentrats auf 6,48 eingestellt. Das Konzentrat wird dann auf eine Säule (8,1 x 59 cm) aus 45 «Amberlite» XAD-2 gegeben, und die Säule wird mit 3x20 ml Chargen von entionisiertem Wasser gespült. Das Antibiotikum wird mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 60 ml/min eluiert. Folgende Fraktionen werden gesammelt: eine Fraktion von 11, sieben Fraktionen von je 500 ml und acht Frak-5o tionen von je 1000 ml. Diese werden unmittelbar nach dem Sammeln in Eis gekühlt.

Die Bioanalysen- und die HAEA3oo-Werte wie auch die A220-, A260- und Ä3oo-Werte für jede Fraktion werden bestimmt. Die Fraktionen mit HAEA3oo/A3oo-Werten über 0,075 werden 55 für die weitere Reinigung vereinigt. Man vereinigt so die Fraktionen 5 bis 9, die 164 000 Bioassayeinheiten enthalten.

Die gesammelten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 100 ml konzentriert, und 200 ml Methanol werden zugegeben. Die Probe wird dann auf eine Säule (2,15x38 cm) 60 aus «Dowex»-l x4(Cl"), (-0,037 mm), mit 2 ml/min aufgebracht.

Nach der Anwendung wird die Säule mit 100 ml 80%igem Methanol gewaschen, und das Antibiotikum wird mit 0,26 M NaCl + 0,005 M NH4C1 + 0,00005 M NH3 in 80% MeOH mit 2ml/min eluiert. Fraktionen von ie 10 ml werden 65 gesammelt.

Die Bioaktivitäten und die Werte für A300, A250, A220 und HAEA300 werden von jeder fünften Fraktion bestimmt. Die Fraktionen mit HAEA3oo/A2oo-Verhältnissen über 0,07 werden

634104

12

25

30

für die weitere Reinigung vereinigt. Es werden so die Fraktionen 125 bis 150 vereinigt.

Zu den vereinigten Fraktionen 125 bis 150 aus der «Dowex»-l x4-Säule gibt man die lyophilisierte Probe 9441-155 von Beispiel 2, wieder aufgelöst in 1,0 ml entionisiertem Was- 5 ser. Diese vereinigte Probe wird auf 1900 ml mit entionisiertem Wasser verdünnt und auf eine «Dowex»-l x 2(C1~)-Säule (2,15x40 cm), (-0,037 mm), mit 2 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 150 ml 30%igem Methanol gespült. Das Antibiotikum wird dann mit 610,25 M NaCl + 0,005 M NH4CI + 0,00005 M 10 NH3 in 30%igem MeOH mit 2 ml/min eluiert. Fraktionen von je 11,1 ml werden gesammelt.

Die Absorption bei 300 nm, 250 nm und 220 nm wird von jeder fünften Fraktion gemessen. Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Aio tritt bei den Fraktionen 360 bis 430 mit einem '5 Maximum bei den Fraktionen 394 bis 400 auf. Alle Fraktionen mit einem A3oo/A22o-Verhältnis über 1,30 werden für die weitere Reinigung vereinigt. Es werden so die Fraktionen 380 bis 420 vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen enthalten 202 A3oo-Ein-heiten, von denen 197 durch Hydroxylamin auslöschbar sind. 20

Zu den vereinigten Fraktionen 380 bis 420 gibt man die Probe 9441-154 von Beispiel 2, die in 1 ml D2O plus 4 ml entionisiertem Wasser gelöst wurde und die 30,5 HAEA3oo-Einhei-ten enthält. Die vereinigte Probe wird auf 2,01 mit entionisiertem Wasser verdünnt und auf eine Säule (2,15 x41 cm) aus «Dowex»-l x 2 (Cl~), (0,074 bis 0,037 mm), mit 0,6 bis 2 ml/min angewendet. Die Säule wird mit 360 ml 30%igem Methanol gespült. Das Antibiotikum 890Aio wird mit 0,25 M NaCl + 0,005 M NH4CI + 0,00005 M NH3 in 30%igem MeOH bei 1,9 ml/min eluiert. Fraktionen von 9,7 ml werden gesammelt.

Die Absorption bei 300 nm, 250 nm und 220 nm wird von jeder fünften Fraktion bestimmt. Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Aio, bestimmt durch die Absorption bei 300 nm, tritt bei den Fraktionen 270 bis 358 mit einem Maximum bei der Fraktion 315 auf. Die Fraktionen mit A3oo/A22o-Verhältnissen 35 über 1,75 werden für die weitere Reinigung gesammelt. Es werden so die Fraktionen 295 bis 335 vereinigt, die 145 A3oo-Einhei-ten enthalten, von denen 137 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen 295 bis 335 werden bei vermin- 40 dertem Druck auf 10 ml konzentriert. Das Konzentrat wird mit 1 M NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule (2,15x75 cm) aus «Bio-Gel» P-2 (0,074 bis 0,037 mm) angewendet, und die Säule wird mit 3x 1 ml Chargen von entionisiertem Wasser gespült. Das Antibiotikum wird 45 mit entionisiertem Wasser mit 0,6 ml/min eluiert. Fraktionen von je 6,4 ml werden gesammelt.

Die Absorptionswerte bei 300 nm, 250 nm und 220 nm wie auch die Leitfähigkeiten jeder zweiten Fraktionen werden bestimmt. Der Hauptabsorptionspeak bei 300 nm tritt bei den 50 Fraktionen 9 bis 27 mit einem Maximum bei der Fraktion 14 auf. Die Fraktionen 11 bis 16 besitzen Leitfähigkeiten, die proportional zu dem A3oo-Wert sind, und diese Fraktionen werden für die massenspektrometrische und NMR-Analyse vereinigt. Dieses vereinigte Material enthält 75,4 A3oo-Einheiten in 38,7 55 ml. Davon werden 34,7 ml auf 1,22 ml konzentriert. Ein 1,20-ml-Teil davon wird gefroren und für die NMR-Analyse lyophilisiert. Man erhält 2,84 mg Feststoffe. Die restlichen 4 ml werden in die NH4+-Form durch Durchleiten durch eine Säule (0,7 x 15 cm) aus «Dowex»-50W x 2(NH4+), (0,074 bis 0,037 mm), über- 60 führt. Das entstehende Ammoniumsalz wird auf 0,11 ml konzentriert, 10 (xl werden entfernt, 100 |il entionisiertes Wasser werden zugegeben, und vier Proben von je 40 ml werden entfernt und einzeln für die massenspektrometrische Analyse gefroren und lyophilisiert [9441 -209-2]. 65

Die Biogel-Fraktionen 17 bis 23, die 29,4 A3oo-Einheiten enthalten, werden ebenfalls auf 1 ml konzentriert, gefroren und lyophilisiert; man erhält 1,80 mg Feststoffe.

Beispiel 5

Zwei gefrorene Ampullen, die je 1 ml MA-4638-Kultur-brühe enthalten, werden langsam aufgetaut, und der Inhalt wird aseptisch in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben mit dreifachen Ablenkelementen überführt, die je 50 ml C-Impfmedium enthalten. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen.

C-Medium autolysierte Hefe («Ardamine»)* 10,0 g

Glucose 10,0g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** ' 2,0 ml destilliertes Wasser 1000 ml vor der Behandlung im Autoklaven wird der pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt *«Ardamine»: Yeast Products, Inc.

**Phosphatpufferlösung:

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Die beiden Impfkolben werden 20 bis 24 h lang bei 28°+1 °C auf einer 210 U/min Gyrotationsvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt. Dann wird der Inhalt gesammelt und zur Inokulierung der Produktionskolben verwendet.

Zehn 21 Schüttelkolben mit Ablenkelementen, die je 300 ml D-Produktionsmedium enthalten, werden mit 10 ml/Kolben mit der Brühe aus dem Impfkolben inokuliert. Die obigen Produktionskolben werden mit Mull verschlossen.

D-Medium

Dextrin (CPC modifizierte Stärke) 40,0 g Schlempe 7,0 g Hefeextrakt 5,0 g

C0CI2 • 6H2O 50,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml vor der Behandlung im Autoklaven wird der pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben bei

24 ± 1 °C 3 Tage lang unter Schütteln auf einer 210 U/min Gyrotationsvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, inkubiert. Die Kolben werden geerntet, der Inhalt wird gesammelt und die Brühe wird auf ihre Aktivität untersucht.

Erntealter (h) 72

pH-Wert 6,5

890-Assay (Einheiten/ml) 30,45

21 der gesamten Brühe aus den obigen D-Produktionskolben werden in 200-ml-Teilen bei 9000 U/min zentrifugiert; man erhält 1,71 überstehendes Material mit einem pH-Wert von 6,8.

Das überstehende Material wird auf eine Säule aus «Dowex»-l x 2 (CI"), (0,297 bis 0,149 mm), Schichtdimensionen 3,9 cm x 25 cm, mit einer Strömungsrate von 5 bis 10 ml/min aufgebracht. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser, gefolgt von 21 0,15 M NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0 +

25 (xM neutr. EDTA in 50%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol gewaschen.

Das Produkt wird dann mit 30 g/1 NaCl + 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, + 25 |iM EDTA in 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol mit einer Strömungsrate von 5 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Bioaktivität tritt bei den Fraktionen 5 bis 180 mit einem Maximum bei den Fraktionen 25 bis 70 auf. Die Fraktionen 12 bis 105 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 15 ml konzentriert. Der pH-Wert wird mit 1 M HCl auf 6,5 eingestellt.

13

634104

Das Konzentrat wird auf eine Säule (3,4 x 55 cm) aus XAD-2 aufgebracht, die mit je 2,5160%igem (Vol/Vol) wässrigem Acet-ion, entionisiertem Wasser und 5%igem NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Säule wird mit 3x5 ml-Teilen entionisiertem Wasser gespült und mit entionisiertem Wasser mit 10 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Bioaktivität tritt bei den Fraktionen 32 bis 270 mit einem Maximum bei den Fraktionen 42 bis 62 auf. Die Gesamtbioaktivität, die eluiert wird, beträgt 25% der Aktivität der ursprünglichen Brühe. Die Fraktionen 40 bis 240 werden vereinigt und die gelagerten, vereinigten Fraktionen 12 bis 34 aus der XAD-2-Säule von Beispiel 1 werden zugegeben. Die gesamten, vereinigten Fraktionen werden bei vermindertem Druck auf 50 ml konzentriert, sie enthalten 120 HAEA304-Einheiten.

Das Konzentrat wird mit 200 ml Methanol verdünnt und mit 2 ml/min auf eine Säule (2,15x40 cm) aus «Dowex»-l x4, (-0,037 mm), aufgebracht, die zuvor mit 21 von 30 g/1 NaCl in 80%igem wässrigem Methanol und 1180%igem wässrigem Methanol gewaschen wurde. Nach Anwendung der Probe wird die Säule mit 100 ml 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol gewaschen und mit 2,510,22 M NaCl + 0,01 M NH4CI + 0,0002 M NH3 in 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol, gefolgt von 310,31 M NaCl + 0,01 M NH4CI + 0,0002 M NHs in 80%igem (Vol/Vol) wässrigem Methanol eluiert. Die Strömungsrate beträgt 2 ml/min. Fraktionen von je 10 ml werden gesammelt.

Das Antibiotikum 890Aio wird an der «Dowex»-l x4-Säule getrennt, eluiert in den Fraktionen 155 bis 195, bestimmt durch Analyse an ATCC 8461.

Antibiotikum 890Ai

Ein Rohr aus lyophilisierter Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4600 NRRL 8140 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium E der folgenden Zusammensetzung enthält.

Medium E

Hefeextrakt 10,0g

Glucose 10,0g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml destilliertes Wasser 1000 ml **Phosphatpufferlösung:

KH2PO4 91,0g

NazHPCh 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird zur Inokulierung eines 250 ml Erlen-meyer-Impfkolbens mit dreifachen Ablenkelementen verwendet, der 54 ml Impfmedium C der folgenden Zusammensetzung enthält.

Medium C

autolysierte Hefe 10,0 g («Ardamine»)*

Glucose 10,0g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH auf 6,5 eingestellt *«Ardamine»: Yeast Products Corporation

**Phosphatpufferlösung:

KH2PO4 91,0 g

N32HPÛ4 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Der Impfkolben wird mit Baumwolle bzw. Watte verschlossen und 30 h lang bei 28°± 1 °C auf einer 220 U/min Gyrota-tionsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, geschüttelt.

Fünfzig 250 ml Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Ablenkelemente, die je 40 ml Produktionsmedium F enthalten, werden mit 1 ml/Kolben der Brühe aus dem Impfkolben inokuliert. Die Produktionskolben werden mit Baumwolle verschlossen.

Medium F

T omatenpaste bzw. -mark 20,0 g primäre Hefe 10,0g

Dextrin («Amidex») 20,0 g

CoCl2-6H20 5,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt.

Nach der Inokulierung werden die Produktionskolben 3 Tage lang bei 28° ± 1 °C unter Schütteln auf einer 220 U/min Gyrotationsschüttelvorrichtung, 5,08 cm Schwingungsamplitude, inkubiert. Die Kolben werden auf ihre Aktivität gegenüber Standard Vibrio percolans ATCC 8461-Analysenscheiben geprüft, wobei man 1,27 cm Analysenscheiben verwendet, die in Proben der zentrifugierten Fermentationsbrühe eingetaucht sind. Die Proben werden mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

Erntealter (h) 72

pH-Wert 6,4 Vibrio percolans

('/ioo Verdünnung) Assay 23 mm

890 Assay, Einheiten/ml 103

Die gesamte Brühe wird in 200-ml-Teilen in Polycarbonat-flaschen 15 min bei 9000 U/min zentrifugiert; man erhält 1600 ml vereinigtes überstehendes Material mit einer Potenz von 104 Einheiten/ml. Dazu gibt man 0,5 ml 0,1 M neutr. EDTA.

Die zentrifugierte Brühe wird an einer Säule aus «Dowex»-l x 2 (Cl~), (0,297 bis 0,149 mm), Schichtdimensionen 3,8 x 22 cm, mit einer Strömungsrate von 6 bis 20 ml/min adsorbiert. Die Säule wird mit 100 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 11 entionisiertem Wasser, das 50 g Natriumchlorid enthält, 0,02 M tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 n,M neutr. EDTA bei einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt.

Das Antibiotikum 890Ai tritt bei den Fraktionen 13 bis 81 mit einem Maximum in den Fraktionen 25 bis 33 auf, wenn man vom Beginn der ersten Anwendung des Salzeluats an zählt. Die Fraktionen 24 bis 41 mit den höchsten Biopotenz/a220-Verhält-nissen werden für die weitere Behandlung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 29 000 Einheiten oder 17% der angewandten Bioaktivität.

Das «Dowex»-Eluat wir dauf 10 ml konzentriert, der pH-Wert wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat wird auf eine Säule aus XAD-2, Schichtdimensionen 3,3x36 cm, aufgebracht, die zuvor mit je 2160%igem wässrigem Aceton, entionisiertem Wasser und 5%igem (Gew/Vol) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Die Probe wird mit entionisiertem Wasser mit einer Strömungsrate von 6 ml/min eluiert. Fraktionen von 40 bis 260 ml werden gesammelt.

Die antibiotische Aktivität tritt bei den Fraktionen 6 bis 14 auf, die sich von 220 bis 2560 ml eluiertem Volumen erstrecken. Der Peak tritt bei den Fraktionen 9 und 10 auf, die sich von 370

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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14

bis 590 ml eluiertem Volumen erstrecken. Die Fraktionen 9 bis 12, die sich von 370 bis 1060 ml eluiertem Volumen erstrecken, besitzen die höchsten HAEAaoo/Azzo-Verhältnisse und werden für die weitere Behandlung vereinigt. Diese Fraktionen besitzen 36 600 Einheiten, und dies entspricht 126% der offensichtlichen, angewandten Aktivität.

Die vereinigten Fraktionen 9 bis 12 werden auf 100 ml konzentriert, und das Konzentrat wird mit einer Strömungsrate von 2 ml/min auf eine Säule aus «Dowex»-l x4 (Cl~), (-0,037 mm), Schichtdimensionen 2,2x41 cm, aufgebracht. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gespült und mit 310,07 M NaCl + 0,005 M NH4CI + 0,0001 M NH3 in entionisiertem Wasser mit einer Rate von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 10,8 ml werden gesammelt, beginnend von der ersten Anwendung des Eluierungsmittels.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Ai tritt bei den Fraktionen 181 bis 217 mit einem Maximum bei der Fraktion 198 auf. Die Fraktionen 186 bis 210, die insgesamt 114 Absorptionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden gesammelt.

Die gesammtelten Fraktionen werden auf 4,0 ml konzentriert, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 16 jxl 1 M NaOH auf 7,3 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus «Bio-Gel» P-2, (0,0074 bis 0,031 mm), Schichtdimension 5 2,15 x 70 cm, aufgebracht und mit 3 x 1 ml Teilen entionisiertem Wasser gewaschen und mit entionisiertem Wasser mit 0,96 ml/min eluiert. Fraktionen von 3,85 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums 890Ai tritt bei den Fraktionen 24 bis 44 mit einem Maximum bei den Fraktionen 33 und 10 34 auf. Die Fraktionen 27 bis 38 mit den höchsten A3oo/A245-Ver-hältnissen werden für die Lyophilisierung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen besitzen insgesamt 72 A3oo-Einheiten.

Zur Durchführung der Lyophilisierung werden die vereinigten Fraktionen auf 3,0 ml konzentriert, und der pH-Wert des 15 Konzentrats wird durch Zugabe von 10 jxl 0,1 M NaOH auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile von je 1,50 ml geteilt, und die Teile werden getrennt schnell gefroren und aus 14 ml Ampullen mit Glasschraubverschluss lyophilisiert, jede Probe enthält 1,73 mg 890Ai, dies entspricht 35,8 A3oo-Einheiten.

G