CH633674A5

CH633674A5 - Stable emulsion of fluorocarbon compounds which are suitable for transferring oxygen, for the preservation and for flushing organs to be transplanted - process for their preparation

Info

Publication number: CH633674A5
Application number: CH869676A
Authority: CH
Inventors: Kazumasa Yokoyama; Kouichi Yamanouchi; Ryoichiro Murashima; Yoshio Tsuda
Original assignee: Green Cross Corp
Priority date: 1976-02-03
Filing date: 1976-07-07
Publication date: 1982-12-31
Also published as: NO770324L; DE2630586C2; NL7607514A; IL51325A; FI58071B; LU76698A1; DD132231A5; CA1072446A; NZ183096A; NO145370C; NO145370B; JPS5296722A; DK307276A; DE2630586A1; AR218864A1; ZA77229B; SE442706B; BE850992A; AU1550576A; FI58071C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile Emulsion aus zur Sauerstoffübertragung geeigneten Perfluoro-kohlenstoffverbindungen mit einer Teilchengrösse von etwa 0,05 bis 0,3 pm, die zum Konservieren und Durchspülen von für Transplantationen bestimmten Organen vorgesehen ist sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Einige Forscher haben bereits berichtet, dass Emulsionen von Fluorokohlenstoffverbindungen möglicherweise als künstlicher Blutersatz für Säugetiere und als Perfusionsflüssigkeit zur Konservierung von zur Transplantation bestimmter innerer Organe verwendet werden können, und insbesondere als eine Ersatzinfusionsflüssigkeit zur Sauerstoffübertragung [Leland C. Clark, Jr., F. Becattini und S. Kaplan: «Die Physiologie von synthetischem Blut», Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery, 60,757-773 (1970); R.P. Geyer: «Fluorokohlenstoffpolyol als künstlicher Blutersatz», New England Journal of Medicine, 289,1077-1082 (1973)].

Diese Emulsionen können jedoch nicht als zufriedenstellend für die praktische Anwendung erachtet werden; dies im Hinblick auf ihre pharmazeutische Stabilität. Damit Fluoro-kohlenstoffemulsionen für die praktische Anwendung geeignet werden, muss ein Präparat gefunden werden, das ohne Änderung der Teilchengrösse während langer Lagerungszeit genügend stabil bleibt.

Bei Emulsionen von Fluorokohlenstoffverbindungen spielt die Teilchengrösse eine wichtige Rolle bezüglich der

Toxizität und Wirksamkeit der Emulsion. K. Yokoyama, K. Yamanouchi, M. Watanabe, R. Murashima, T. Mat-45 sumoto, T. Hamano, H. Okamoto, T. Suyama, R. Watanabe und R. Naito: Herstellung von Perfluorodecalin-Emul-sion, ein Weg zum Ersatz von roten Zellen, Fédération Pro-ceedings, 34,1478-1483 (May, 1975). [Japanische Patentanmeldung Kokai (bekanntgegeben) Nr. 22612/73]. so Zusätzlich haben einige Mitarbeiter an der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die feine und stabile Fluoro-kohlenstoffverbindungs-Emulsion aus diesen ausgewählten Fluorokohlenstoffverbindungen mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen dadurch hergestellt werden kann, dass diese Verbin-55 düngen mit einer Mischung aus Eidotter- oder Sojabohnen-phospholipoiden und einer geringen Menge von Fettsäuren mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen, deren Salzen oder Mono-glyceriden emulgiert werden. Japanische Patentanmeldung Kokai Nr. 69219/75.

60 Verglichen mit einer Perfluorotributylamin-Emulsion, stabilisiert mit einem Emulgator von hochmolekularem Polyoxyäthylen/Polyoxypropylen-Copolymer (R.P. Geyer, loc. cit.) ist die oben erwähnte mit Phospholipoiden und Fettsäuren stabilisierte Emulsion in bezug auf die Exkre-65 tionsgeschwindigkeit zwar überlegen, aber weniger stabil im zirkulierenden Blutstrom nach intravenöser Injektion, für welche die halbe Zirkulationsdauer etwa 2/3 der Zirkulationsdauerhälfte der erstgenannten Emulsion beträgt.

633674

Im weiteren kann eine Fluorokohlenstoffverbindungs-Emulsion wie Perfluorotributylamin-Emulsion, hergestellt mit einem hochmolekularen nichtionogenen oberflächenaktiven Mittel, als Mischung im beliebigen Verhältnis mit einem handelsüblichen Plasmaverdünner wie Dextran, Hydro-xyäthylstärke oder modifizierte Gelatinelösung angewendet werden, während die Perfluorodecalinemulsion der Beschreibung in der japanischen Patentanmeldung Nr. 69219/ 75 von Kokai nicht zusammen mit den genannten Plasmaverdünnern angewendet werden kann, weil sich bei deren Mischung Niederschläge bilden. Es scheint, dass der Niederschlag auf die Zerstörung der emulgierten Teilchen zurückzuführen ist, verursacht durch die Reaktion zwischen den in hoher Konzentration in der Emulsion vorhandenen Pho-spholipoide mit dem Plasmaverdünner wie Dextran oder Hydroxyäthylstärke, welche hochmolekulare kolloidale Substanzen sind.

Im Hinblick auf diese Umstände haben die Erfinder ausgedehnte pharmazeutische Forschungen betrieben, um Emulsionen dieser durch das Perfluorodecalin vertretenen Fluorokohlenstoffverbindungen mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, welche eine hohe Exkretionsgeschwindigkeit aufweisen, im Blutkreislauf stabil sind und ohne Zerstörung der emulgierten Teilchen mit dem Plasmaverdünner mischbar sind, herzustellen. Als Ergebnis wurde die vorliegende Erfindung von vollendet.

Gemäss der vorliegenden Erfindung wird eine stabile Emulsion einer sauerstoffübertragenden Perfluorokohlenstoffverbindung von einer Teilchengrösse von etwa 0,05 bis 0,3 um in einem physiologisch annehmbaren wässrigen Medium geschaffen, welche die folgenden Bestandteile enthält: (A) mindestens eine 9 bis 11 Kohlenstoffatome enthaltende Perfluorokohlenstoffverbindung, ausgewählt aus Perfluorodecalin, Perfluoromethyldecalin, Perfluoroalkylcyclo-hexanen mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen im Alkyl, Perfluoro-alkyltetrahydrofuranen mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl, Perfluoroalkyltetrahydropyranen mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl und Perfluoroalkanen mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen; (B) mindestens ein Perfluorotertiäramin mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, ausgewählt aus Perfluoro-tertiäralkylaminen mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, Per-fluoro-N-alkylpiperidinen mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl und Perfluoro-N-alkylmorpholinen mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl; ein hochmolekulares nichtionogenes oberflächenaktives Mittel mit einem Molekulargewicht von etwa 2000 bis 20 000; ein Phospholipoid und mindestens eine fettsaure Verbindung, ausgewählt aus Fettsäuren mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen, physiologisch annehmbaren Salzen und Monoglyceriden dieser Fettsäuren; wobei das Verhältnis der unter (A) erwähnten Perfluorokohlenstoffverbindung zum unter (B) erwähnten Perfluorotertiäramin 95-50:5-50 Gewichtsteile beträgt.

Das hier erwähnte «hochmolekulare nichtionogene oberflächenaktive Mittel» weist ein Molekulargewicht von 2000 bis 20 000 auf und umfasst Polyoxyäthylen/Polyoxypropy-len-Copolymere, Polyoxyäthylenalkyläther und Polyoxy-äthylenalkylaryläther. Die Konzentration dieses oberflächenaktiven Mittels in der Emulsion beträgt etwa 2,0 bis 5,0 und vorzugsweise 3,0 bis 3,5% (Gew./Vol.).

Die Bezeichnung «% (Gew./Vol.)» in der Beschreibung und in den Ansprüchen dieser Anmeldung bedeutet die Substanzmenge nach Gewicht (Gramm) bezogen auf ein Volumen von 100 ml der resultierenden Emulsion.

Beispiele für Perfluorokohlenstoffverbindungen (A) mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen sind Perfluorocycloalkane oder Perfluoroalkylcycloalkane, welche u.a. einschliessen: Per-fluoro-c3_5-alkylcyclohexane wie Perfluoromethylpropyl-cyclohexan, Perfluorobutylcyclohexan, Perfiuorotrimethyl-

cyclohexan, Perfluoroäthylpropylcyclohexan, Perfluorodecalin und Perfluoromethyldecalin; Perfluoro-C^g-alkyl-tetrahydropyrane wie Perfluorohexyltetrahydropyran; Per-fluoro-c5_7-alkyltetrahydrofurane wie Perfluoropentyltetra-hydrofuran, Perfluorohexyltetrahydrofuran und Perfluoro-heptyltetrahydrofuran; Perfluoroalkane mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen wie Perfluorononan und Perfluorodecan.

Beispiel für Perfluorotertiäramine (B) mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen sind Perfluorotertiäralkylamine mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen welche u.a. einschliessen: Perfluoro-trialkylamine wie Perfluoro-N,N-dibutylmonomethylamin, Perfluoro-N,N-diäthylpentylamin, Perfluoro-N,N-diäthyl-hexylamin, Perfluoro-N,N-dipropylbutylamin und Per-fluorotripropylamin; Perfluoro-N,N-dialkylcyclohexylamine mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen wie Perfluoro-N,N-diäthyl-cyclohexylamin; Perfluoro-N-C^-alkylpiperidin wie Per-fluoro-N-pentylpiperidin, Perfluoro-N-hexylpiperidin und Perfluoro-N-butylpiperidin; und Perfluoro-N-c5_7-alkyl-morpholine wie Perfluoro-N-pentylmorpholin, Perfluoro-N-hexylmorpholin und Perfluoro-N-heptylmorpholin.

Für ihre Verwendung beträgt das Gewichtsverhältnis der Verbindung (A) zur Verbindung (B) 50-95:50-5 Gewichtsprozent, und die gesamte Menge von (A) und (B) in der Emulsion beträgt etwa 10 bis 50% (Gew./Vol.).

Die als Emulgierhilfsmittel verwendeten Phospholipoide sind die gebräuchlichen. Von diesen werden Eidotter-Phos-pholipoid oder Sojabohnen-Phospholipoid bevorzugt. Deren Gehalt in der Emulsion beträgt etwa 0,1 bis 1,0% (Gew./ Vol.) und vorzugsweise etwa 0,4 bis 0,6% (Gew./Vol.).

Die als Emulgierhilfsmittel verwendeten Fettsäureverbindungen sind Fettsäuren mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen, physiologisch annehmbare Salze, wie Natrium- oder Kaliumsalze oder Monoglyceride derselben, welche u.a. Caprylsäure, Caprinsäure, Laurylsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Behensäure, Palmoleinsäure, Oleinsäure, Linolsäure, Arachidonsäure sowie deren Natrium- und Kaliumsalze und Monoglyceride einschliessen. Diese fettsauren Verbindungen können einzeln oder als Mischung von zwei oder mehr Arten in so geringen Mengen wie 0,004 bis 0,1% (Gew./Vol.) und vorzugsweise etwa 0,02 bis 0,04% (Gew./Vol.) verwendet werden. Die fettsauren Verbindungen mit 14 bis 20 Kohlenstoffatomen werden bevorzugt. Von den physiologisch annehmbaren Salzen sind Kaliumpalmitat und Kaliumoleat in Anbetracht ihrer guten Löslichkeit und Leichtigkeit der Emulsionsbereitung am meisten bevorzugt.

Die erfindungsgemässe Emulsion der Fluorokohlenstoffverbindungen wird als grobe Emulsion durch homogenes Vermischen der vorgeschriebenen Mengen der vorstehend aufgeführten Bestandteile in beliebiger Reihenfolge in einem physiologisch annehmbaren wässrigen Medium wie destilliertes Wasser oder eine isotone Lösung hergestellt. Diese rohe Emulsion wird durch einen Druck von etwa 100 bis 500 kg/cm2 bei einer Temperatur bis zu 55 °C durch einen Spalt eingespritzt und dabei der Scher- und Mischwirkung bei hoher Geschwindigkeit ausgesetzt, bis die vorerwähnte gewünschte Teilchengrösse erreicht ist.

Das homogene Vermischen der verwendeten Substanzen erfolgt mittels herkömmlichen Mischvorrrichtungen wie «Homoblender» oder Propellerrührer.

Das Emulgieren der rohen Emulsion erfolgt mittels einer Hochdruck-Homogenisierungsvorrichtung, einer Hochdruckpumpe, die ein Gemisch von zwei unmischbaren Flüssigkeiten unter hohem Druck mit sehr grosser Geschwindigkeit durch einen Spalt einspritzt, um die Flüssigkeiten der Scher- und Mischwirkung zu unterwerfen. Die typische Homogenisierungsvorrichtung auf dem Markt ist der «Homo-genizer» vom Manton-Gaulintyp (Handelsmarke dieser Ho4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

633674

mogenisierungsvorrichtung von Manton-Gaulin Manufacturing Co., Inc., USA), der ein mehrstufiges Ventil in Kombination von zwei oder mehreren Ventilen besitzt, von denen jedes mit einer Feder versehen ist, durch welche die Spalten gebildet werden.

Um die stabile Emulsion dieser Erfindung zu erhalten, wird die Mischung in einem solchen Homogenizer mehrere Male unter einem Druck von etwa 500 kg/cm2 in Umlauf gebracht. Die Betriebstemperatur liegt im Bereich bis zu 55 °C und wird vorzugsweise auf 25-40 °C gehalten.

Die vorliegende Emulsion hat einen ultrafeinen Dispersionsgrad von Teilchen, deren Durchmesser unter 0,2 |am oder mindestens unter 0,3 jxm liegt. Ferner ist sie stabil, indem sie selbst beim Erhitzen und langdauernder Lagerung keine Vergrösserung der Teilchen zeigt. Daher schützt die vorliegende Emulsion die Lebewesen, denen sie verabreicht wird, im hohen Masse gegen die schädliche Wirkung zufolge Agglomeration der Emulsionsteilchen.

Im weiteren besitzt diese Emulsion eine lange Reten-tionszeit im zirkulierenden Blutstrom, so dass ihre Fähigkeit Sauerstoff zu tragen während einer langen Zeitspanne aufrechterhalten bleibt.

Im Vergleich beispielsweise mit einer Fluorokohlenstoff-verbindungs-Emulsion, hergestellt unter Verwendung von Phospholipoiden als Emulgatoren gemäss der japanischen Patentanmeldung Nr. 69219/75 von Kokai verweilt die erfin-dungsgemässe Emulsion viel länger im tierischen Blutstrom. Die Exkretion der vorliegenden Emulsion aus dem Körper erfolgt viel schneller als dies bei einer Perfluorotributylamin-Emulsion der Fall ist.

Die vorliegende Emulsion kann, nachdem sie physiologisch isotonisch gemacht wurde, als Infusionsflüssigkeit verwendet werden. Sie kann auch mit einem handelsüblichen Plasmaverdünner wie Dextran, Hydroxyäthylstärke oder modifizierte Gelatine gemischt verwendet werden. Ferner kann sie als Blutersatz für Säugetiere und als Perfusat zur Konservierung innerer Organe Verwendung finden.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiterhin erläutert.

Die Teilchengrössen wurden in den Beispielen gemäss der Zentrifugalsedimentationsmethode gemessen, wie sie von K. Yokoyama, A. Suzuki, I. Utsumi und Naito [Chem. Pharm. Bull. 22 (12), 2966-2971 (1974)] vorgeschlagen wurde.

Beispiel 1

In 81 destilliertem Wasser wurden 300 g Polyoxyäthylen/ Polyoxypropylen-Copolymer (Molekulargewicht: 8360) gelöst. Der Lösung wurden 40 g Sojabohnen-Phospholipoide, 2 g Kaliumoleat und eine Mischung aus 3 kg Perfluorodecalin und 300 g Perfluorotripropylamin zugesetzt. Die erhaltene Mischung wurde in einem Mischer zu einer rohen Emulsion vermischt. Diese rohe Emulsion wurde in den Flüssigkeitstank eines Düsenemulgierapparats (hergestellt von Manton-Gaulin Co.) gefüllt und durch 12maliges Durchtreiben durch ein Ventil bei Hochdruck von 200-500 kg/cm2 und einer Flüssigkeitstemperatur von 35 ± 5 °C emulgiert. Die erhaltene Emulsion enthielt 30,5% (Gew./Vol.) Perfluorodecalin und 2,9% (Gew./Vol.) Perfluorotripropylamin. Der durchschnittliche Teilchendurchmesser betrug 0,09-0,1 |im, gemessen nach der Zentrifugal-sedimentationsmethode. Die Emulsion zeigte im wesentlichen keine Vergrösserung der Teilchen, wenn sie in ein In-jektionsröhrchen eingeschlossen und während 12 Minuten in einem speziell konstruierten, rotierenden Sterilisator auf 115 °C erhitzt worden war. In Tabelle 1 ist die Grössenverteilung der Teilchen dieser Emulsion und einer Emulsion, die mit Perfluorodecalin ohne Zusatz von Perfluorotripropylamin bereitet wurde, aufgeführt.

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, zeigte die vorliegende Emulsion nach 6monatiger Lagerung bei 4 °C keine Zusammenballungen, d.h. die Teilchendurchmesser sind praktisch unverändert geblieben.

Der obige Vorgang wurde wiederholt, nur wurde anstelle von Perfluorodecalin Perfluoropentyltetrahydrofuran verwendet und ähnliche Resultate wie oben wurden erhalten.

Beispiel 2

In 81 destilliertem Wasser wurden 330 g Polyoxyäthylen-octyläther (durchschnittliches Molekulargewicht: 3500) gelöst. Dieser Lösung wurde 40 g Sojabohnenlipoid und 2 g Kaliumoleat zugesetzt und die erhaltene Mischung wurde in einem Mischer zu einer Dispersion gerührt. Der Dispersion wurde eine Mischung aus 3 kg Perfluoromethyldecalin und 600 g Perfluoro-N-pentylpiperidin zugesetzt und durch Rührer in einem Mischer eine rohe Emulsion bereitet.Die rohe Emulsion wurde wie im Beispiel 1 gründlich emulgiert und sodann in ein Röhrchen gefüllt. Im Röhrehen wurde diese Emulsion während 12 Minuten in einem Sterilisierapparat wie im Beispiel 1 durch Erhitzen auf 115 °C sterilisiert. Die Emulsion enthielt 29,7% (Gew./Vol.) Perfluoromethyldecalin und 5,8% (Gew./Vol.) Perfluoro-N-pentylpiperidin. Die Grössenverteilung der Teilchen nach der Sterilisation und der durchschnittliche Teilchendurchmesser nach 6monatiger Lagerung bei 4 °C sowie jene Werte der Vergleichsemulsion von Perfluorodecalin allein werden in der Tabelle 1 aufgeführt.

Beispiel 3

In 21 destilliertem Wasser wurden 100 g Polyoxyäthylen/ Polyoxypropylen-Copolymer vom durchschnittlichen Molekulargewicht 10800 gelöst und der Lösung 20 g Eidotter-lipoide und 0,5 g Ölsäure zugesetzt. Die Mischung wurde in einem Mischer zu einer Dispersion gerührt. Der Dispersion wurde eine Mischung aus 640 g Perfluorodecalin und 250 g Perfluorodibutylmonomethylamin zugesetzt und durch Rühren in einem Mischer eine rohe Emulsion erhalten, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 zu einer feinen Emulsion weiterverarbeitet und in einem rotierenden Sterilisator während 12 Minuten bei 115 °C sterilisiert wurde. Die Emulsion enthielt 25,3% (Gew./Vol.) Perfluorodecalin und 9,8% (Gew./ Vol.) Perfluorodibutylmonomethylamin. Der durchschnittliche Teilchendurchmesser und die Grössenverteilung der Teilchen der vorliegenden Emulsion und die entsprechenden Werte der mit Perfluorodecalin allein hergestellten Emulsion werden in der Tabelle 1 aufgeführt. Auch die durchschnittliche Teilchengrösse der vorliegenden Emulsion nach 6monatiger Lagerung bei 4 °C ist dort angegeben.

Beispiel 4

In 800 ml destilliertem Wasser wurden 35 g Polyoxy-äthylen/Polyoxypropylen-Copolymer vom durchschnittlichen Molekulargewicht 15800 gelöst. Der Lösung wurden 4 g Eidotterlipoid und 0,1 g Laurinsäuremonoglycerid zugesetzt und die erhaltene Mischung unter Rühren in einem Mischer zu einer Dispersion verarbeitet. Der Dispersion wurde eine Mischung von 350 g Perfluorohexyltetrahydropyran und 40 g Perfluoro-N,N-diäthylcyclohexylamin zugesetzt und das Gemisch sodann in einem Mischer roh emulgiert. Die rohe Emulsion wurde wie im Beispiel 1 weiter emulgiert, die erhaltene Emulsion in kleine Portionen geteilt und diese in Röhrchen eingeschlossen. Eines dieser die Emulsion enthaltenden Röhrchen wurde während 12 Minuten in einem rotierenden Sterilisator bei 115 °C sterilisiert. Die Emulsion ent5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

633674

6

hielt 35,7% (Gew./Vol.) Perfluorohexyltetrahydropyran und 4,1% (Gew./Vol.) Perfluoro-N,N-diäthylcyclohexylamin.

Der durchschnittliche Teilchendurchmesser dieser Emulsion und jener einer Vergleichsemulsion, hergestellt unter

Verwendung von Perfluorohexyltetrahydropyran allein nach Sterilisation, werden in der Tabelle 1 aufgeführt. Die vorliegende Emulsion zeigte nach 6monatiger Lagerung bei 4 °C keine Änderung der Teilchengrösse.

Tabelle 1

Teilchengrössenverteilung verschiedener Emulsionen

Beispiel

(A) Fluorokohlenstoff-

% (Gew./

(B) Fluorokohlenstoff-

% (Gew./

Emulgator

% (Gew./

Nr.

verbindung

Vol.)

tertiäramin

Vol.)

1

Perfluorodecalin

30,5

Perfluorotripropyl-amin

2,9

Ax*

3,0

30

-

Aj*

3,0

2

Perfluoromethyldecalin

29,7

Perfluoro-N-pentylpiperidin

5,8

B*

3,3

30

-

B*

3,3

3

Perfluorodecalin

25,3

Perfluorodibutylmonomethylamin

9,8

A2*

4,0

25

-

a2*

4,0

4

Perfluorohexyltetrahydropyran

35,7

Perfluoro-N,N-di-äthylcyclohexylamin

4,1

a3*

3,5

35

-

a3*

3,5

Anmerkung:

*A: Polyoxyäthylen/Polyoxypropylen-Copolymer, durchschn. Molekulargew.: Aj 10 800, A2 8350 A315 800. B: Polyoxyäthylenoctyläther, durchschn. Molekulargew.: 3500.

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Beispiel Emulgierhilfsmittel Nr. % (Gew./Vol.)

Durchschn. Teilchen- Teilchengrössenverteilung nach durchmesser n Sterilisation,

nach Steri- nach Lage- Gew.-%

lisation rung(4C Teilchendurchmesser Jim

6 Monate

<0,1

0,1-0,2

0,2-0,3

>0,3

1

Sojabohnenphospholipoid 0,4 K-Oleat 0,02

0,097

0,099

58,3

39,1

2,6

0

Sojabohnenphospholipoid 0,4

0,395

>0,4

3,9

11,7

24,1

60,3

K-Oleat 0,02

2

Sojabohnenphosphoüpoid 0,4 K-Oleat 0,02

0,088

0,090

63,6

35,9

0,5

0

Sojabohnenphospholipoid 0,4

0,273

>0,4

10,6

20,5

42,0

26,9

K-Oleat 0,02

3

Eidotterphospholipoid 0,8 Ölsäure 0,02

0,090

0,091

61,9

37,2

0,9

0

Eidotterphospholipoid 0,8

0,245

>0,4

11,9

18,7

46,4

23,0

Ölsäure 0,02

4

Eidotterphospholipoid 0,4 Laurinsäuremonoglycerid 0,01

0,102

0,112

49,0

43,2

7,8

0

Eidotterphospholipoid 0,4

0,298

0,4

9,3

18,6

25,4

46,7

Laurinsäuremonoglycerid 0,01

Versuchsbeispiel 1 Test zum Mischen mit Plasmaverdünner Für klinische Anwendung als Infusionsflüssigkeit wird die Emulsion der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zusammen mit einem Plasmaverdünner verwendbar sein, um den Mangel an onkotischem Druck auszugleichen. Beim Mischen dieser Emulsion mit einem Plasmaverdünner wurde kein reversibler Niederschlag beobachtet, welcher durch Reaktion zwischen den beiden kolloidalen Lösungen hätte auftreten können, was bedeutet, dass eine der Schwierigkeiten, welcher man bei Anwendung der erfindungsgemässen Emulsion als eine Infusionsflüssigkeit hätte begegnen können, eliminiert wurde.

Die im vorliegenden Versuch verwendeten Emulsionen waren Perfluorodecalin/Perfluoro-N,N-dibutylmethylamin

(5:2) Emulsionen verschiedener Konzentrationen, herge-55 stellt gemäss Beispiel 3 [Polyoxyäthylen/Polyoxypropylen-Copolymer 3,4% Eidotterphospholipoid 0,6%, Kaliumoleat 0,04% (Gew./Vol.)] und als Vergleich Perfluorodecalin-Emulsionen verschiedener Konzentrationen, hergestellt gemäss der japanischen Patentanmeldung Nr. 69219/75 von 60 Kokai [Eidotterphospholipoid 4%, Kaliumoleat 0,02% (Gew.-/Vol.)]. Jede der Emulsionen wurde entweder mit milchsaurer Ringer-Lösung oder mit Krebs-Ringer-Bicarbo-nat-Lösung isotonisch gemacht und mit einem Plasmaverdünner in Konzentrationen von 1-6% (Gew./Vol.) ver-65 mischt. Sodann wurde das Auftreten von Niederschlägen während 6 Stunden bei Raumtemperatur mit freiem Auge beobachtet. Als Plasmaverdünner wurde Hydroxyäthylstär-ke (HES) (durchschnittliches Molekulargewicht: 200000 in

7

633 674

20%iger Konzentration in wässriger Kochsalzlösung, hergestellt von Ajinomoto Co., Ltd.) und Dextran 40 (Dextran vom durchschnittlichen Molekulargewicht 40000, in 10%iger Konzentration in wässriger Kochsalzlösung, geliefert von Green Cross Corp.) verwendet.

Die Resultate sind in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.

Tabelle 2

Gehalt in der fertigen Emulsion % (Gew./Vol.)

Fluorokohlen- erfindungsgemässe Emulsion der jap.

stoffverbdg. Emulsion Pat.anm. 69219/75

Dextran 40 10% 20% 30% 10% 20% 30%

0,5

1,0

— —

—

+

1,5

— —

—

+

2,0

— —

—

+

2,5

- +

+

3,0

+ +

+

Tabelle 3

Gehalt in der fertigen Emulsion % (Gew./Vol.)

Fluorokohlen- erfindungsgemässe Emulsion der jap.

stoffverbdg. Emulsion Pat.anm. 69219/75

HES 10% 20% 30% 10% 20% 30%

+

—

+

—

+

—

+

Anmerkung: Kein Niederschlag: —

Niederschlagsbildung: +

Aus den oben aufgeführten Resultaten ging hervor, dass die erfindungsgemässe Emulsion durch die Gegenwart von Plasmaverdünnern viel weniger beeinflusst wird als die gemäss der japanischen Patentanmeldung Nr. 69219/75 herge-5 stellte, was besagt, dass die vorliegende Emulsion mit Dextran 40 und HES durch deren Beimischung von 2% (Gew./ Vol.), beziehungsweise 3% (Gew./Vol.) physiologisch kolloidal isotonisch gemacht werden kann.

Ähnliche Resultate, wie die vorstehend aufgeführten, er-10 hielt man für Emulsionen, die gemäss den Beispielen 1,2 und 4 hergestellt worden waren.

Versuchsbeispiel 2 15 In diesem Versuch wurde die Wirksamkeit erfindungsge-mässer Emulsionen durch Austausch-Transfusion in Ratten bewertet.

Zu diesem Zweck wurden zwei Emulsionen von Fluoro-2o kohlenstoffverbindungen verwendet, und zwar die erfindungsgemässe Emulsion des Beispiels 3, der Mischung von Perfluorodecalin mit Perfluorodibutylmonomethylamin und eine mit Eidotter-Phospholipoid stabilisierte Perfluoro-decalin-Emulsion, gemäss der japanischen Patentanmeldung 25 Nr. 69219/75 von Kokai.

Die Bestandteile der beiden Emulsionen sind in der Tabelle 4 aufgeführt.

Um die Emulsionen elektrolytisch und kolloidal isoto-30 nisch zu machen, wurde je ein Volumenteil hypertonischer Elektrolyten in Lösung zu je 9 Volumenteilen der Emulsionen beigemischt und sodann je 1 Volumen der Elektrolyten enthaltenden Emulsionen mit 3 Volumenteilen 6%iger Hydroxyäthylstärke (Molekulargewicht: 40000-50000) in 35 milchsaurer Ringer-Lösung oder als Vergleichspräparat mit Rattenplasma vor der Anwendung vermischt, wie in Tabelle 4 gezeigt.

eile 4

Bestandteile % (Gew./Vol.)

vorliegende Emulsion

Emulsion nach

Patentanmeldung Jap. 69219/75

Fluorokohlenstoff-Emulsion (9 Vol.)

Elektrolyt (1 Vol.)

pH

Fluorokohlenstoff-verbindung oberfl. aktives Mittel

Perfluorodecalin

25,3

28

Perfluorodibutyl

9,8

-

monomethylamin

Pluronic F68*

3,4

—

Eidotterphospho

0,6

4,0

lipoid

Kaliumoleat

0,004

0,02

NaCl

6,00

NaHC03

2,1

—

KCl

0,336

Natriumlactat

-

3,10

MgCl2 ■ 6H20

0,427

CaCl2 • 2H20

0,356

D-Glucose

1,802

1.0

8,0

6,0

' Polyoxyäthylen/Polyoxypropylen-Copolymer (Mol,gew. 8350)

Ratten (Wistar-Rasse vom Gewicht 200-250 g) wurden der Austausch-Transfusion mit der Elektrolyten und Hydroxyäthylstärke oder Plasma enthaltenden Emulsion unterworfen. Dies erfolgte durch wiederholtes Aderlassen von der Arteria carotis und Ersatz-Transfusion durch die

Schwanzvene alternierend bis zum Hämokrit 1,4 und 7% 65 beziehungsweise unter 100%iger Sauerstoffatmosphäre. Sodann wurde die Überlebensdauer der mit Austausch-Transfusion behandelten Ratten bestimmt.

633 674

8

Die Resultate sind in der Tabelle 5 aufgeführt. Wie da- glichen mit der mit Eidotter-Phospholipoid stabilisierten raus ersichtlich, ist die erfindungsgemässe Emulsion viel wir- Perfluorodecalin-Emulsion.

kungsvoller im Lebenretten von stark blutenden Tieren, verTabelle 5

Hämatokrit mit Plasma mit HES

Endwert % Überlebensdauer

Std. Min. Std. Min erfindungsgemässe Emulsion

7

>72

4

50

00

>72

1

29

02

61

00

Emulsion der japanischen

7

23

10

5

53

Patentanmeldung Nr. 69219/75

4

11

5

2

1

8

10

2

56

Bemerkung: Die Werte wurden in beiden Gruppen von je 5 Ratten erhalten.

Versuchsbeispiel 3 Die erfindungsgemässe Fluorokohlenstoffverbindungs-Emulsion gemäss Beispiel 3 und die gemäss der japanischen Patentanmeldung Nr. 69219/75 von Kokai hergestellte Emulsion wurden auf ihre akute Toxizität geprüft.

Um diese Emulsionen isotonisch zu machen, wurde vor deren Anwendung zu 9 Volumenteilen Emulsion ein Volumenteil Elektrolyten zugesetzt. Die Bestandteile dieser Emulsionen sind in der Tabelle 4 aufgeführt. Als Versuchs-

20 tiere wurden männliche Ratten der Wistar-Rasse mit 100-120 g Körpergewicht verwendet. Die Emulsion wurde den Ratten intravenös injiziert und die Überlebensrate während einer Woche nach der Injektion beobachtet. Die Resultate sind in der Tabelle 6 aufgeführt. Wie aus Tabelle 6 her-25 vorgeht, betrug die semilethale Dosis beider Emulsionen etwa 130 ml/kg Körpergewicht, was eine recht niedrige Toxizität bedeutet.

Tabelle 6

Akute Toxizität der Fluorokohlenstoff-Emulsionen

Muster

Dosis Überlebensrate = Anzahl überlebende Ratten ml/kg Anzahl Versuchsratten

Tage nach der Injektion 12 3 5

ld50

(während einer

Woche

Emulsion gemäss

87

10/10

Beispiel 3

100

10/10

9/10

115

10/10

9/10

8/10

7/10

132

9/10

8/10

6/10

152

6/10

4/10

3/10

1/10

Emulsion gemäss

87

10/10

japan. Patentanm.

100

10/10

9/10

69219/75

115

10/10

9/10

7/10

132

9/10

8/10

7/10

6/10

5/10

152

7/10

6/10

4/10

3/10

1/10

135 ml/kg

131 ml/kg

Versuchsbeispiel 4

Um die hämolytische Wirkung der Fluorokohlenstoff-präparate im extrakorporalen Kreislaufsystem zu prüfen, wurden Versuche in Vitro unter Verwendung roter Kaninchenblutzellen ausgeführt.

Zwei Emulsionspräparate, wie sie im Versuchsbeispiel 2 gemäss Tabelle 4 verwendet wurden, wurden mit milch-saurer Ringer-Lösung vermischt, um sie isotonisch zu machen. Die so erhaltenen isotonischen Emulsionen wurden mit heparinisiertem Kaninchenblut in den Verhältnissen von 3:1,1:1 und 1:3 vermischt, um auf diese Weise Musterlösungen für die Proben zu erhalten. Die Bewertung der hämolytischen Wirkung erfolgte durch Messen des Gehalts an freiem Hämoglobin in 8 ml Blut, nachdem dieses während 6 Stunden auf 37 °C gehalten worden war. Die Bestimmung des hämolysierten Hämoglobin wurde nach der Cyanome-thämoglobin-Methode (Kampen E.J., und Ziilstram W.J., Clin. Chim. Acta 6, 538,1961) vorgenommen.

Die erhaltenen Resultate sind in der Tabelle 7 aufgeführt, so Tabelle 7

Freies Hämoglobin, mg

Fluorokohlenstoff : Blut 55 Verhältnis Erfindungsgemässe Emulsion

Emulsion gemäss japan.

Patentanm. 69219/75 60 Milchsaure Ringerlsg.

(Vergleich)

Wie aus der Tabelle 7 ersichtlich wird, ist die hämolytische Wirkung der erfindungsgemässen Emulsion bei weitem geringer als jene der bisherigen Präparate dieser Art und 65 nicht sehr verschieden von der Wirkung der zum Vergleich verwendeten milchsauren Ringer-Lösung.

1:3

1: 1

3:1

36

81

180

298,5

>4000

3380

36

128

141

Claims

633 674

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Stabile Emulsion aus zur Sauerstoffübertragung geeigneten Perfluorokohlenstoffverbindungen mit einer Teil-chengrösse von 0,05 bis 0,3 um, die zum Konservieren und Durchspülen von für Transplantationen bestimmten Organen vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgenden Bestandteile enthält:

(A) Mindestens eine 9 bis 11 Kohlenstoffatome enthaltende Perfluorokohlenstoffverbindung, ausgewählt aus Perfluorodecalin, Perfluoromethyldecalin, Perfluoroalkylcyclo-hexan mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen im Alkyl, Perfluoro-alkyltetrahydrofuran mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl, Perfluoroalkyltetrahydropyran mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl und Perfluoroalkanen mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen;

(B) mindestens ein Perfluorotertiäramin mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, ausgewählt aus Perfluorotertiär-alkylaminen mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, Perfluoro-N-alkylpiperidinen mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl und Perfluoro-N-alkylmorpholinen mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl;

ein hochmolekulares, nichtionogenes, oberflächenaktives Mittel vom Molekulargewicht von 2000 bis 20 000;

ein Phospholipoid;

mindestens eine Fettsäure mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen oder ihr physiologisch annehmbares Salz oder Mo-noglycerid;

und das Gewichtsverhältnis der Perfluorokohlenstoffverbindung (A) zum Perfluorotertiäramin (B) 95-50:5-50 beträgt.
2. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfluorokohlenstoffverbindung (A) ein Perfluoroalkylcyclohexan mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen im Alkyl, Perfluorodecalin oder Perfluoromethyldecalin ist.
3. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfluorokohlenstoffverbindung (A) ein Perfluoroalkyltetrahydropyran mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl oder ein Perfluoroalkyltetrahydrofuran mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl und das Amin (B) ein Per-fluoroalkylpiperidin mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl oder ein Perfluoroalkylmorpholin mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl ist.
4. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Perfluorotertiäramin ein Perfluorotertiär-alkylamin ist.
5. Emulsion nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Perfluorotertiäramin ausgewählt wird aus Perfluoro-N,N-dibutylmethylamin, Perfluoro-N,N-diäthyl-pentylamin, Perfluorodiäthylhexylamin, Perfluorodipropyl-butylamin, Perfluorotripropylamin oder Perfluoro-N,N-di-äthylcyclohexylamin.
6. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie als physiologisch annehmbares, wässriges Medium Wasser oder eine isotonische Lösung enthält.
7. Emulsion nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die isotonische Lösung eine milchsaure Rin-ger-Lösung oder eine Glucose enthaltende Ringer-Lösung ist.
8. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Summe der Mengen der Perfluorokohlenstoffverbindung und des Perfluorotertiäramins 10 bis 50% (Gew./Vol.), die Menge des hochmolekularen, nicht-ionogenen, oberflächenaktiven Mittels 2,0 bis 5,0% (Gew./ Vol.), die Menge des Phospholipoids 0,1 bis 1,0% (Gew./ Vol.) und die Menge der Fettsäureverbindung 0,004 bis 0,1% (Gew./Vol.) betragen.
9. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure Caprylsäure, Caprinsäure,

Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Behensäure, Palmoleinsäure, Oleinsäure, Linolsäure oder Arachidonsäure ist.
10. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekenn-5 zeichnet, dass das fettsaure Salz ein Alkalimetallsalz einer

Fettsäure des Patentanspruchs 9 ist.
11. Emulsion nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetallsalz einer Fettsäure Kalium-oleat oder Natriumoleat ist.

io 12. Emulsion nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetallsalz einer Fettsäure Kaliumoder Natriumpalmitat ist.
13. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Monoglycerid einer Fettsäure jenes einer

15 Fettsäure des Patentanspruchs 9 ist.
14. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Phospholipoid Eidotterphospholipoid oder Sojabohnenphospholipoid ist.
15. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekenn-20 zeichnet, dass diese zwecks Isotonie ihres onkotischen

Drucks mit jenem des Blutes einen Zusatz von Plasma oder Plasmaverdünner enthält.
16. Emulsion nach Patentanspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Plasmaverdünner Hydroxyäthylstärke,

25 modifizierte Gelatine oder Dextran ist.
17. Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das hochmolekulare, nichtionogene, oberflächenaktive Mittel ein Polyoxyäthylen/Polyoxypropylen-Co-polymer vom Molekulargewicht 2000 bis 20 000 oder ein

30 Polyoxyäthylenalkyläther vom Molekulargewicht 2000 bis 20 000 oder Polyoxyäthylenalkylaryläther vom gleichen Molekulargewicht ist.
18. Emulsion nach Patentanspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polyoxyäthylen/

35 Polyoxypropylen-Copolymers 8350 bis 15 800 beträgt.
19. Emulsion nach Patentanspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Polyoxyäthylenalkyläther Polyoxyäthylen-octyläther vom Molekulargewicht 3500 ist.

40 20. Verfahren zur Herstellung einer stabilen Emulsion nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Perfluorokohlenstoffverbindung (A) mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, ausgewählt aus Perfluorodecalin, Perfluoromethyldecalin, Perfluoroalkylcyclohexan mit 3 bis 5 45 Kohlenstoffatomen im Alkyl, Perfluoroalkyltetrahydrofuran mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl, Perfluoroalkyltetrahydropyran mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl und Perfluoroalkanen mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, mindestens ein Perfluorotertiäramin (B) mit 9 bis 11 Koh-50 lenstoffatomen, ausgewählt aus Perfluorotertiäralkyl-aminen mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, Perfluoro-N-alkyl-piperidinen mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl und Per-fluoro-N-alkylmorpholin mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl, ein hochmolekulares, nichtionogenes, oberflächenak-55 tives Mittel vom Molekulargewicht von 2000 bis 20 000, ein Phospholipoid und mindestens eine Fettsäure mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen oder ihr physiologisch annehmbares Salz oder Monoglycerid im physiologisch annehmbaren, wässrigen Medium im Gewichtsverhältnis der Verbindung 60 (A):(B) von 95-50:5-50 zu einer homogenen, rohen Emulsion vermischt werden und diese rohe Emulsion durch Einspritzen durch einen Spalt bei einer Temperatur bis 55 °C unter einem Druck von 100 bis 500 kg/cm2 weiteremulgiert wird, wobei die Emulsion verursacht durch einen starken 65 Geschwindigkeitsgradient der Scher- und Mischwirkung unterworfen wird, bis eine Teilchengrösse von 0,05 bis 0,3 um der Fluorokohlenstoffverbindungen in der erhaltenen Emulsion erreicht wird.

3

633 674
21. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Perfluorokohlenstoffverbindung (A), ausgewählt aus Perfluoroalkylcyclohexan mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen im Alkyl, Perfluorodecalin und Perfluoromethyldecalin, verwendet wird.
22. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Perfluorokohlenstoffverbindung (A) ein Perfluoroalkyltetrahydropyran mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl oder Perfluoroalkyltetrahydrofuran mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl und als Perfluorotertiäramin (B) ein Perfluoroalkylpiperidin mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkyl oder ein Perfluoroalkylmorpholin mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen im Alkyl verwendet werden.
23. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Perfluorotertiäramin ein Perfluoroalkyl-amin verwendet wird.
24. Verfahren nach Patentanspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Perfluorotertiäramin, ausgewählt aus Per-fluoro-N,N-dibutylmethylamin, Perfluoro-N,N-diäthyl-pentylamin, Perfluorodiäthylhexylamin, Perfluorodipropyl-butylamin, Perfluorotripropylamin und Perfluoro-N,N-di-äthylcyclohexylamin, verwendet wird.
25. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als physiologisch annehmbares, wässriges Medium Wasser oder eine isotonische Lösung verwendet wird.
26. Verfahren nach Patentanspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die isotonische Lösung eine milchsaure oder glucosehaltige Ringer-Lösung ist.
27. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Mengen (Gew./Vol.) verwendet werden: Die Summe der Perfluorokohlenstoffverbindung mit dem Perfluorotertiäramin 10-50%, die Menge von hochmolekularem nichtionogenen oberflächenaktiven Mittel 2,0-5,0%, Phospholipoid 0,1-1,0% und die fettsaure Verbindung 0,004-0,1 %.
28. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fettsäure, ausgewählt aus Caprylsäure,

Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Behensäure, Palmoleinsäure, Oleinsäure, Linolsäure und Arachidonsäure, verwendet wird.
29. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekenn-5 zeichnet, dass ein Alkalisalz einer der Fettsäuren des Patentanspruchs 28 verwendet wird.
30. Verfahren nach Patentanspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass Kalium- oder Natriumoleat verwendet wird.
31. Verfahren nach Patentanspruch 29, dadurch gekenn-io zeichnet, dass Kalium- oder Natriumpalmitat verwendet wird.
32. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fettsäure-Monoglycerid einer im Patentanspruch 28 aufgeführten Fettsäure verwendet wird.

15 33. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Phospholipoid Eidotter-Phospholipoid oder Sojabohnen-Phospholipoid verwendet wird.
34. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Emulsion hinsichtlich ihres onkotischen

2o Drucks durch Zusetzen von Plasma oder Plasmaverdünner mit dem Blut isotonisch gemacht wird.
35. Verfahren nach Patentanspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass als Plasmaverdünner Hydroxyäthylstärke, modifizierte Gelatine oder Dextran verwendet wird.

25 36. Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als hochmolekulares nichtionogenes oberflächenaktives Mittel ein Polyoxyäthylen/Polyoxypropylen-Co-polymer mit einem Molekulargewicht von 2000-20 000 oder ein Polyoxyäthylenalkyläther oder Polyoxyäthylenalkylaryl-30 äther vom Molekulargewicht 2000-20 000 verwendet wird.
37. Verfahren nach Patentanspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass ein Poyloxyäthylen/Polyoxypropylen-Copoly-mer mit einem Molekulargewicht von 8350-15 800 verwendet wird.

35 38. Verfahren nach Patentanspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass als Polyoxyäthylenalkyläther Polyoxyäthylen-octyläther vom Molekulargewicht 3500 verwendet wird.