FI58071C - Foerfarande foer framstaellning av en stabil emulsion av en syre transporterande perfluorkolvaete - Google Patents

Description

2 58071 Käytännön kannalta näitä emulsioita ei voida pitää tyydyttävinä farmaseuttisen stabiliteettinsa ja kehon turvallisuuden kannalta. Jotta fluorihiilivety-emulsiot olisivat käytännössä kelvollisia verenkorvikkeita on välttämätöntä kehittää valmiste, joka on riittävän pysyvä varastoitavaksi pitkähkön ajan ilman hiuk-kaskoon muutoksia.

Fluorihiilivetyemulsioiden hiukkaskoko näyttelee tärkeää osaa emulsion myrkyllisyydessä ja tehokkuudessa (K. Yokoyama, K. Yamanouchi, M. Watanabe, R. Murashima, T. Matsumoto, T. Hamano, H. Okamoto, T. Suyama, R. Watanabe ja R.

Naito, Preparation of perfluorodecalin emulsion, an approach to the red cells substitute, Federation Proceedings, 3^, 1^78-1^83 (toukokuu, 1975))· Suurempia hiukkasia sisältävä emulsio on myrkyllisempi ja hiukkasten retentioaika verenkiertojärjestelmässä on lyhyempi. Käytettäessä fluori hi i li vetyemulsiota synteettisenä verenkorvikkeena voimakkaasta verenvuodosta kärsivän potilaan hengen pelastamiseksi on keskimääräisen hiukkaskoon oltava halkaisijaltaan 0,3 pm tai pienempi, edullisesti 0,2 pm tai pienempi (US-patenttijulkaisu 3 958 01U).

Jotta fluorihiilivetyemulsiot olisivat käyttökelpoisia synteettisinä veren-korvikkeina on hiukkaskoon ohella välttämätöntä, että intravenoosisti ruiskutetun fluorihiili. vety-yhdisteen on verivirrasta poistuttuaan poistuttava kehosta mahdollisimman nopeasti. Eräät tämän keksinnön tekijät ovat aikaisemmin tutkineet useiden fluorihiilivetyemulsioiden poistumisnopeutta ja myrkyllisyyttä ja havainneet, että 9-11 hiiliatomia sisältävät perfluorihiilivedyt ovat keinotekoisen verenkorvikkeen käyttökelpoista ainesta. Paras on perfluoridekaliini (K. Yokoyama, K. Yamanouchi ja R. Murashima, Excretion of perfluor- chemicals after intravenous injection of their emulsion, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 23, 1368-1373 (kesäkuu, 1975))-

Lisäksi edellä mainitut keksijät ovat myös havainneet, että hienojakoinen ja pysyvä fluorihiilivetyemulsio voidaan valmistaa näistä 9~11 hiiliatomia sisältävistä fluorihiilivety-yhdisteistä emulgoimalla mainittuja fluorihiilivetyjä, munanruskuaisfosfolipidien tai soijapapufosfolipidien seosta ja pientä määrää 8-22 hiiliatomia sisältäviä rasvahappoja tai niiden suoloja tai monoglyserideja (US-patenttijulkaisu 3 962 U39).

Verrattaessa suurimolekyylisellä polyoksietyleenipolyoksipropyleeni seka- polymeeriemulgaattorilla stabiloituun perfluoritributyyliamiiniemulsioon (R. P.

\

Geyer, loc. cit.) on edellä mainittu sekä fosfolipideillä että rasvahapoilla stabiloitu emulsio parempi poistumisnopeuden suhteen, mutta sen stabiliteetti verenkierrossa intravenoosisen ruiskeen jälkeen on huonompi eli puoliintumisaika on noin kaksi kolmasosaa edellisestä.

3 58071

Lisäksi fluorihiilivetyemulsiota, joka on valmistettu suuri molekyyli sen, ei.-ioni sen pinta-aktiivi sen aineen, esimerkiksi perfluori tri butyyli arai ini emulsion avulla, voidaan kaikissa suhteissa käyttää seoksena kaupallisten plasma-lisäaineiden, esimerkiksi dekstraanin tai hydroksietyyli tärkkelyksen tai modifioidun gelatiiniliuoksen kanssa, kun taas US-patenttijulkaisussa 3 962 1+ 39 kuvattua perfluoridekaliiniemulsiota ei voida käyttää mainittujen plasmalisä-aineiden kanssa, koska muodostuu saostuma. Näyttää siltä, että saostuminen johtuu emulgoitujen hiukkasten hajoamisesta, minkä syynä on emulsiossa suurena pitoisuutena esiintyvien fosfolipidien ja plasmalisäaineen, esimerkiksi dekstraanin tai suurimolekyylisen, kolloidaalisen hydroksietyyli tärkkelyksen välinen vuorovaikutus.

Aiottaessa käyttää fluorihiilivetyemulsiota infuusionesteenä tai synteettisenä verenkorvikkeena voimakkaasta verenvuodosta kärsivän potilaan hengen pelastamiseksi yhdessä plasmalisäaineen kanssa on isotonisuuden kannalta tärkeää, että molempien kolloidaalisten liuosten eli emulsion ja veren onkoottiset paineet tasataan. Fluorihiilivetyemulsio luovuttaa happea ja plasmalisäaine mahdollistaa kiertävän veren tilavuuden pitämisen vaadittavalla tasolla. On suositeltavaa käyttää suurimolekyylistä, ei-ionista pinta-aktiivista ainetta, joka on inertti plasmalisäaineen suhteen valmistettaessa keinotekoisena verenä käytettävää fluorihiilivetyemulsiota. Joskin nämä suuri molekyyli set, ei-ioni set pinta-aktiiviset aineet ovat tehokkaita emulgaattoreita eräiden fluorihiili vetyjen, esimerkiksi perfluoritributyyliamiinin ja muiden amiinityyppi Sten fluorihiili vetyjen suhteen, ne eivät sovi 9—11 hiiliatomia sisältäville fluorihiili vety-yhdisteille, esim. perfluoridekaliinilie, joiden erittymisnopeus on suuri.

Nämä seikat huomioonottaen on nyt suoritettu laajoja tutkimuksia emulsioiden valmistamiseksi 9“11 hiiliatomia sisältävistä fluori hiilivedyistä kuten perfluori dekali i ni sta, joilla on suuri erittymisnopeus. Nämä emulsiot ovat pysyviä verenkierrossa ja ne sekoittuvat plasmalisäaineeseen ilman, että emulgoituneet hiukkaset hajoavat.

Keksinnön kohteena on menetelmä sellaisen happea kuljettavan perfluori-hi ili vedyn stabi ili n emulsi on valmi stami seksi fysi ologi sesti hyväksyttävään vesi -pitoiseen väliaineeseen, jonka hiukkaskoko on noin 0,05-0,3 Jim.

Keksinnölle on tunnusomaista, että sekoitetaan homogeeniseksi seokseksi 10-50 % (paino/1ilavuus) (A + B):tä, jolloin A käsittää perfluoridekaliinin 11 58071 ja B käsittää vähintään yhden seuraavista perfluori-tert-amiineista: perfluori-Ν,Ν-dibutyyli-metyyliamiini, perfluoritripropyyliamiini; 2,0-5,0, edullisesti 3,0- 3,5 % (paino/tilavuus) suurmolekyylistä ionitonta pinta-aktiivista ainetta C, jonka molekyylipaino on noin 2000-20 000 ja joka on polyoksietyleeni-polyoksipropylee-nikopolymeeri; 0,1-1,0 % (paino/tilavuus) fosfolipidiä ja 0,004"0,1 % (paino/ti-lavuus) vähintään yhtä rasvahappoa E, joka on 8-22 hiiliatomia sisältävä rasvahappo tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola tai monoglyseridij jolloin perfluori-hiilivedyn A ja perfluori-tert-amiinin B välinen suhde on noin 1-9 paino-osaa A:ta 1 paino-osaa kohden B:tä, fysiologisesti hyväksyttävässä vesipitoisessa väliaineessa raakaemulsion saamiseksi, raakaemulsio emulgoidaan edelleen puristamalla se lämpötilassa enintään 55°C raon läpi paineessa noin 100-500 kp/cm^, jolloin se suuren nöpeusgradientin johdosta alistetaan leikkausvoiman ja sekoitusvaikutuksen alaiseksi, kunnes perfluorihiilivedyn hiukkaskoko saadussa emulsiossa saavuttaa arvon 0,05-0,3 pm.

Merkintä "(paino/tilavuus)" tarkoittaa aineen painomäärää (g) 100 ml:ssa muodostunutta emulsiota.

Keksinnössä emulgoimisapuaineina käytettävät fosfolipidit ovat alalla tunnettuja ja suositeltavia ovat ruskuaisfosfolipidi tai soijapapufosfolipidi. Määrä emulsiossa on noin 0,1-1,0, edullisesti noin 0,4-0,6 % (paino/tilavuus).

Emulgointiapuaineena käytetty rasvahappoyhdiste on 8-22 hiilitomia sisältävä rasvahappo tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola, esimerkiksi natrium- tai kaliumsuola tai monoglyseridi. Esimerkkejä ovat kapryylihappo, kapriinihappo, lau-riinihappo, myristiinihappo, palmitiinihappo, steariinihappo, behenihappo, palmito-öljybappo linolihappo, arakidonihappo ja niiden natrium- tai kaliumsuola ja monoglyseridi. Näitä rasvahappoyhdisteitä voidaan käyttää yksinään tai kahden tai useamman seoksena määrän ollessa 0,004-0,1, edullisesti noin 0,02-0,04 % (paino/tilavuus). Suositeltavia ovat 14-20 hiiliatomia sisältävät rasvahappoyhdisteet ja niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat ja erityisen suositeltavia ovat kaliumpalmitaatti ja kaliumoleaatti hyvän liukoisuutensa ja emulsion valmistuksen helppouden ansiosta.

Tämän keksinnön mukainen fluorihiilivetyemulsio valmistetaan sekoittamalla edellämainitut komponentit valinnanvaraisessa järjestyksessä fysiologisesti hyväksyttävässä vesivällaineessa, esim. tislatussa vedessä tai isotonisessa liuoksessa

raakaemulsion saamiseksi, joka emulgoidaan puristamalla lämpötilassa enintään 55°C

2 ' raon läpi paineessa noin 100-500 kp/cm , jolloin siihen kohdistuu leikkausvoima ja sekoitusvaikutus voimakkaan nöpeusgradientin ansiosta. Ruiskutusta jatketaan kunnes edellä mainittu hiukkaskoko on saavutettu.

5 58071

Ainesten homogenointi sekoitus suoritetaan tavanomaisessa sekoittimessa, esim. homogenoi ntisekoittimessa tai lapasekoittimessa.

Raakaemulsion emulgointi suoritetaan korkeapainehomogenaattorissa. Tämä on korkeapainepumppu, joka homogenoi, kahden sekoittumattoman nesteen seosta puristamalla sitä korkeassa paineessa ja hyvin suurella nopeudella raon läpi, jolloin nesteisiin kohdistuu leikkausvoima ja sekoitusvaikutus. Tyypiliinen kaupallinen homogenisaattori on Manton-Gaulintyyppi (myyjä Manton-Gaulin Manufacturing Co., Inc., USA). Siinä on kahteen tai useampaan hanaan yhdistetty monitievent-tiili, joiden jouset muodostavat raot.

Tässä homogenisaattorityypissä seosta kierrätetään useita kertoja koko-naispaineessa noin 500 kg/cm keksinnön mukaisen pysyvän emulsion saamiseksi. Käyttölämpötila on enintään 55°C saakka ja edullisesti 25_1»0°C.

Ko. emulsion dispergoidun faasin ultrahienojen hiukkasten halkaisija on pienempi kuin 0,2 pm ja enimmäkseen pienempi kuin 0,3 pm. Lisäksi se on pysyvä ja hiukkaskoko ei kasva kuumennettaessa eikä pitkällisen varastoinnin aikana.

Siten käsiteltävänä oleva emulsio suojaa potilasta emulsiohiukkasten kokkaroi-tumi sen hai ttavaikutuksilta.

Lisäksi keksinnön mukaisen emulsion retentioaika verenkierrossa on pitkä, joten hapenkuljetuskyky säilyy pitkään.

Verrattaessa esimerkiksi fluorihiilivetyemulsioon, joka on valmistettu käyttäen emulgaattorina fosfolipidejä US-patentin 3 962 1+39 mukaan, käsiteltävänä olevan emulsion retentioaika potilaan verenkierrossa on paljon pidempi. Keksinnön mukaisen emulsion poistuminen kehosta on paljon nopeampaa kuin perfluoritritutyyliamiini emulsi on.

Keksinnön mukaista emulsiota voidaan käyttää infuusionesteenä fysiologisesti isotoniseksi tekemisen jälkeen. Sitä voidaan myös käyttää seoksina kaupallisten plasmalisäaineiden, esimerkiksi dekstraanin, hydroksietyyli tärkkelyksen ja modifioidun gelatiinin kanssa. Lisäksi sitä voidaan käyttää imettäväisten verenkorvikkeena ja perfuusionesteenä säilytettäessä siirrettäviä sisäelimiä.

Seuraavat esimerkit selventävät keksintöä.

Esimerkeissä hiukkaskoko mitattiin keskipakosedimentointimenetelmän avulla, jota ovat ehdottaneet K. Yokoyama, A. Suzuki , I. Utsumi ja R. Naito (Chem.

Pharm. Bull., 22 (12), 2966-2971 (1971*)).

Esimerkki 1

Liuotettiin 8 litraan tislattua vettä 300 g polyoksietyleenipolyoksipro-pyleenisekapolymeeriä (molekyylipaino 10 800). Liuokseen lisättiin Uo g soija-papufosfolipidejä, 2 g kaliumoleaattia ja seosta, jossa oli 3 kg perfluorideka- 58071 liinia ja 300 g perfluoritripropyyliamiinia. Muodostunutta seosta sekoitettiin sekoittimessa raakaemulsion saamiseksi. Muodostunut raakaemulsio panostettiin suihkuemulgaattorin nestesäiliöön (valmistaja Manton-Gaulin Co.) ja emulgoitiin 2 johtamalla kaksitoista kertaa venttiilin läpi paineessa 200-500 kp/cm ja lämpötilassa 35° - 5°C. Muodostunut emulsio sisälsi 30,5 % (paino/tilavuus) perfluori-dekallinia ja 2,9 % (paino/tilavuus) perfluoritripropyyliamiinia. Keskimääräinen hiukkaskoko oli 0,09~0,1 ;jm mitattuna keskipakosedimentointimenetelmän avulla.

Emulsion hiukkaskoko kasvoi tuskin lainkaan suljettaessa injektioampulliin ja lämpösteriloitaessa 12 minuuttia 115°C:ssa tätä varten suunnitellussa pyörivässä sterilaattorissa.

Taulukosta 1 käy ilmi, että varastoitaessa kuusi kuukautta l°C:ssa ei keksinnön mukainen emulsio kokkaroitunut ja sen keskimääräinen hiukkashalkaisija oli lähes muuttumaton.

Toistettiin yllä oleva menetelmä käyttäen perfluoridekaliinin asemesta perfluoripentyylitetrahydrofuraania ja saatiin samanlaisia tuloksia kuin yllä.

Esimerkki 2

Liuotettiin 2 litraan tislattua vettä 100 g polyoksietyleenipolyoksipropy-leeniä, jonka keskimääräinen molekyylipa!no oli 8 350. Muodostuneeseen liuokseen lisättiin 20 g ruskuaisfosfolipidejä ja 0,5 g öljyhappoa ja seosta sekoitettiin sekoittimessa dispersion valmistamiseksi. Dispersioon lisättiin seos, jossa oli 6U0 g perfluoridekaliinia ja 250 g perfluoridibutyylimonometyyliamiinia ja muodostunutta seosta sekoitettiin sekoittimessa raakaemulsion saamiseksi. Raakaemulsio emulgoitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja kuumasteriloitiin 12 minuuttia 115°C:ssa pyörivässä sterilaattorissa. Emulsio sisälsi 25,3 % (paino/ tilavuus) perfluoridekaliinia ja 9,8 (paino/tilavuus) perfluoridibutyylimono-metyyliamiinia. Saadun emulsion keskimääräinen hiukkashalkaisija ja hiukkas-kokojakautuma ja perfluoridekaliinin avulla valmistetun emulsion vertailu-näytteen vastaavat arvot ilmenevät taulukosta 1. Taulukosta 1 ilmenee myös saadun emulsion keskimääräinen hiukkashalkaisija kuuden kuukauden varastoinnin jälkeen U°C:ssa.

Taulukko 1. Eri emulsioiden hiukkaskokojakautuma

Esimerkki (A) (B) n:o Fluorihiilivety-yhdiste Perfluori-tert.-amiini Emulgaattori ' % (paino/tilavuus) % (paino/tilavuus) % (paino/tilavuus) 30,5 Perfluoritripropyyli- 3,0 amiini 2,9 1 Perfluoride- ____ kaliini 30 - A* 3,0

25,3 Perfluoridibutyyli- A^ Q

monometyyli amiini 9,8 * 2 Perfluorideka- liini 25 - k* U’° j atkuu 7 58071

Taulukko 1 (jatkoa)

Keskimääräinen hiuk- Hiukkaskokojakautuma kashalkaisija, jm steriloinnin jälkeen

Esi- Eraulgoimisapuaine paino-%_ merkki t (paino/tilavuus) steri. Hiukkaa- loinnin toinnin halkaisija jälkeen jälkeen <0,1 ^um 0,1- 0,2- <0,3/^ ____(ä°C,6 kk)___0,2 Aim 0.3 rum__

Soijapapufosfo- lipideja 0,U o ,097 0,099 58,3 39,1 2,6 0 1 K-oleaatti 0,02

Soi j apapufos fo- lipideja 0,H 0,395 <0,4 3,9 11,7 2U,1 60,3 K-oleaatti 0,02

Mun an rusk uai s- fosfolipideja 0,8 ^ 0>09, 37>2 0y9 0 2 öljyhappo 0,02

Munanruskuais- | fosfolipidejä 0,8 0>21(5 „>9 ,8>7 U6yk 23>0 \ Öljyhappo 0,02 i--—1-----

Huom. A: Polyoksietyleeni-polyoksipropyleenisekapolymeeri. Keskimääräinen molekyylipaino; = 10 800, A2 = 8 350, A^ = 15 800.

8 58071

Koe-esimerkki 1

Sekoitus plasmalisäaineen kanssa

Kliinisessä käytössä infuusionesteenä keksinnön mukaista emulsiota käytetään mieluiten plasmalisäaineen kanssa onkoottisen paineen vajavuuden korjaamiseksi. Sekoitettaessa keksinnön mukainen emulsio ja plasmalisäaine ei havaittu kolloidiliuosten saostumista, mikä osoittaa, että eräs keksinnön mukaisen emulsion käyttöön infuusionesteenä mahdollisesti liitty- f vistä vaikeuksista on poistettu.

Kokeessa käytetyt emulsiot olivat perfluoridekaliini-perfluori-N,N-dibutyy-limetyyliaminoemulsioita (5:2) vaihtelevin konsentraatioin. Ne valmistettiin kuten esimerkissä 2 (3,1* % (paino/tilavuus) polyoksietyleenipolyoksipropyleeni-sekapolymeeriä, 0,6 % (paino/tilavuus) ruskuaisfosfolipidejä, 0,0U % (paino/tila-vuus) kaliumoleaattia ja vertailun vuoksi valmistettiin perfluoridekaliiniemulsioita vaihtelevin konsentraatioin US-patentin 3 962 U39 mukaan (U% (paino/tilavuus) ruskuaisfosfolipidiä, 0,02 % (paino/tilavuus) kaliumoleaattia). Emulsiot tehtiin isotonisiksi laktaattipitoisella Ringerin liuoksella, joka valmistettiin neutraloimalla 60 ml puhdistettua maitohappoa kyllästetyllä natriumhydroksidivesiliuoksella käyttämällä fenolipunaista indikaattorina, lisäämällä liuokseen 150 g NaCl, 10 g KC1, 5 g CaClg ja 5 g MgCl^, lisäämällä sitten vettä kokonaistilavuuteen 1 000 ml, keittämällä ja suodattamalla ja laimentamalla suodos 25 kertaiseen tilavuuteen ennen injektoi nti a, tai Krebs-Ringerin bikarbonaatti liuoksella. Sekoitettiin plasma lisäaineeseen siten, että jälkimmäisen lopullinen konsentraatio 011 1-6 % (paino/tilavuus) ja saostuman muodostusta tarkkailtiin visuaalisesti kuuden tunnin aikana huoneen lämpötilassa sekoittamisen jälkeen. Käytetyt plasma-lisäaineet olivat hydroksietyyli tärkkelys (HES), (keskimääräinen molekyyli paino 200 000) 20 % (paino/tilavuus) ruokasuolaliuoksessa (valmistaja Ajinomoto Co.,

Ltd.) ja Dextran U0 (keskimääräinen molekyylipaino Uo 000) 10 % (paino/tilavuus) ruokasuolavesiliuoksessa (valmistaja The Green Cross Corp.).

Tulokset ilmenevät taulukoista 2 ja 3.

C

9 58071

Taulukko 2 \. Lopullinen fluori hiili- ” ~ vetypitoisuus % Keksinnön mukainen emulsio Emulsio %(paino/tilavuus) US-patentti

Lopullinen\ -—--liSMB- dekstraani äO-pitoisuus % \.

(pai.no/tilavuus) \_< 10 %_20 %_30 % 10 % 20 % 30 % 0,5 - 1,0 - - + 1.5 ___+ + + 2,0 - - - + + + 2.5 - + + ! + + + 3,0 + + + j + + +

Taulukko 3

Lopullinen fluorihiili- n. vetypitoisuus % Keksinnön mukainen emulsio US-patentti nXpai no /t i lavuus)__3 962 U39_

MS-pitoi-^^v 10 % 20 % 30 % 10 ^ 20 % 30 5S

SUUS % (pai no/t ilavuus) ___ 2 - + 3 - + + 1+ - + + + 5 - + + + + +

Huom.

- = ei sakkaa + = sakanmuodostusta

Yllä olevista tuloksista ilmenee selvästi, että plasmalisäaineena vaikuttaa paljon vähemmän keksinnön mukaisesti valmistettuun emulsioon verrattuna US-patentin 3 9β2 U39 mukaiseen emulsioon. Tämä osoittaa, että keksinnön mukaisesti valmistettu emulsio voidaan sekoittaa Dextran U0:n ja HES-valmisteen kanssa kaikissa suhteissa fysiologisesti kolloidaalisen isotonisuuden saavuttamiseksi, joka saavutetaan lisäämällä Dextran liO ja HES lopullisena konsentraationa 2 % (paino/tilavuus) ja 3 % (paino/tilavuus).

Yllä mainittuja vastaavia tuloksia saavutettiin myös esimerkissä 1 valmistetulla emulsiolla.

'° 58071

Koe-es5 merkki 2

Keksinnön mukaisesti valmistetun emulsion tehokkuuden selvittämiseksi suoritettiin transfuusio rotilla.

Tässä kokeessa käytettiin kahta fluorihiilivetyemulsiota. Ne olivat keksinnön mukaisesti valmistettu emulsio eli esimerkin 2 mukaan valmistettu perfluo-ridekaliinin ja perfluoridibutyylimonometyyliamiinin seos sekä ruskuaisfosfolipi-deillä stabiloitu perfluoridekaliiniemulsio US-patentin 3 962 1+39 mukaan.

Molempien emulsioiden komponentit ilmenevät taulukosta k. '

Emulsion tekemiseksi elektrolyyttipitoi seksi ja kolloidaalisesti isotoni-seksi lisättiin 1 tilavuusosa taulukon h elektrolyytti liuoksia 9 tilavuusosaan emulsiota ja sitten sekoitettiin ennen käyttöä 1 tilavuusosa muodostunutta elekt-rolyyttipitoista emulsiota ja 3 tilavuusosaa 6-%:ista hydroksietyylitärkkelystä (molekyylipaino Uo 000 - 50 000) Ringerin laktaattipitoisessa liuoksessa tai rotan plasmassa vertailun vuoksi.

Rottien (Wistar-kanta, paino 200-250 g) veri vaihdettiin elektrolyyttejä ja hydroksietyylitärkkelystä tai plasmaa sisältävään emulsioon vuodattamalla verta toistuvasti yhteisestä päänvaltimosta ja transfundoimalla häntälaskimoon verisolujen tilavuusarvoon 1 %, 1* % ja 7 % 100 )J:ssa happikehässä. Sitten määritettiin kuinka kauan tranfundoidut rotat vielä elivät.

Tulokset ilmenevät taulukosta 5· Kuten taulukosta 5 huomataan, keksinnön mukaisesti valmistettu emulsio oli paljon tehokkaampi pelastettaessa voimakkaasta verenvuodosta kärsivän eläimen henki verrattuna ruskuaisfosfolipideillä stabiloi tuun perfluori dekali i ni emulsioon.

Taulukko 1+

Komponentti Keksinnön mukainen Emulsio emulsio US-patentti _______3 962 1*39_

Fluori hiili- Perfluorideka- 25,3 % 2d %

Fluorihiili- vety liini, perfluo- (paino/tilavuus) (paino/tilavuus) . . . ri di butyyli vetyemul s 1 o_______i___-_ (9 til. osaa)

Pinta-aktii- Pluronic F68 x 3,1* vinen aine Ruskuaisfosfo- Λ c . .

lipidi, Kalium- * ___oleaatti__0,00U_j_0,02_

NaCl 6,00 6,00 1

NaHC03 2,1 KC1 0,336 0,336

Elektrolyytti Na-laktaatti - ; 3,10 (1 til.-osa) MgCl2.6H20 0,1*27 | 0,1*27

CaCl2.2H20 0,356 j __D-glukoosi__1 ,802_|_1_i0_| _gH_8^0_j 6,0_j x Polyoksietyleeni-polyoksipropyleenisekapolymeeri (mp. 8350) 11 58071

Taulukko 5

Verisolujen Plasman kera HES:n kera tilavuus % — . ..

______Eloonj aamJ sa3 ka_

Ko. emulsio 7 yli 72 h yli 72 h 1* 50 h 00 min yli 72 h 1 29 h 02 min 61 h 00 min ' Emulsio, US-pat.

' 3 962 ^39 7 23 h 10 min 5 h 53 min k 11 h 5 mi n 5 h 2 mi n 1 8 h 10 min 2 h 56 min ^uom‘Arvot saatu viiden rotan ryhmillä.

Koe-esimerkki 3

Akuutti myrkyllisyys kokeiltiin esimerkissä 3 saadulla fluori hiili vety-emulsiolla ja US-patentin 3 962 1+39 mukaan saadulla emulsiolla.

Näiden emulsioiden tekemiseksi isotonisiksi lisättiin ennen käyttöä 1 tila-vuusosa elektrolyyttejä 9 tilavuusosaan emulsiota. Näiden emulsioiden komponentit ilmenevät taulukosta H. Koe-eläiminä käytettiin Wistar-kannan koirasrottia, paino 100-120 g. Emulsio ruiskutettiin rottien laskimoon ja eloonjäämissuhdetta tarkkailtiin viikko ruiskeen jälkeen. Saadut tulokset ilmenevät taulukosta 6. Taulukosta 6 ilmenee, että molempien emulsioiden LD^ oli n. 130 ml/kg kehonpainoa eli niiden myrkyllisyys on varsin pieni.

Taulukko 6. Fluorihiilivetyemulsion akuutti myrkyllisyys

Eloonjäämissuhde eloonjääneiden ! rottien määrä_ LD^Q (1 vi ikon ^nnos Koerottien määrä_ kuluttua) ! Näyte ml/kg Päivää ruiskeen jälkeen_ _;_ 1 2 3 5_7__ 87__10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 100_ 10/10 10/10 9/10 9/10 9/10

Keksinnön emulsio ,,λ/.λλ/.λο/.λο/.« „ . . ! 115_ 10/10 9/10 8/10 8/10 7/10 135 ml/kg 132__9/10 8/10 6/10 6/10 6/10 ___152__6/10 >4/10 3/10 3/10 1/10__ 87__10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 100__10/10 10/10 9/10 9/10 9/10 I Emulsio 115__10/10 9/10 9/10 7/10 7/10 131 ml/kg jUS-pat. 3 962 1+39 132__9/10 8/10 7/10 6/10 5/10 j

1_152_ 7/10 6/10 1+/10 3/10 1/10 _I

12 5 80 71

Koe-esimerkki H

Fluori hiilivetyvalmisteiden punasoluja liuottavan vaikutuksen tutkimiseksi kehon ulkopuolisessa verenkiertojärjestelmässä suoritettiin in vitro-kokeita käyttäen kaniinin veren punasoluja.

Sekoitettiin kaksi koe-esimerkissä 2 käytettyä ja taulukossa k esitettyä emulsiovalmistetta ja laktaattipitoista Ringerin liuosta fysiologisesti lähes iso- , tonisiksi. Sekoitettiin muodostuneita isotonisia emulsiovalmisteita ja kaniinin

W

hepariinisoitua verta suhteessa 3:1, 1:1 ja 1:3 koenäyteliuosten valmistamiseksi. ·

Punasolujen liuotusvaikutus määritettiin mittaamalla vapaa hemoglobiinipitoisuus % 8 ml:ssa verta kuusi tunti sen 37°C:ssa seisottamisen jälkeen. Hemoglobiinin puna-soluliukoisuus määritettiin syanomethemoglobiinimenetelmällä (Kampen, E.J. ja Ziilstram, W.J., Clin. Chim. Acta, 6, 538, 1961).

Tulokset ilmenevät taulukosta 7·

Taulukko 7 _Vapaa hemoglobiini mg_

Fluorihiilivedyn ja veren suhde 1:3 1:1 3:1 Tämän keksinnön emulsio 36 81 180

Emulsio, US-pat. 3 962 1+39 298,5 yli 1+,000 3,380

Laktaattipitoinen Ringerin liuos (vertailu) 36 128 1U1

Kuten taulukosta ilmenee keksinnön mukaisesti valmistetnn emulsion punasoluja liuottava vaikutus on paljon pienempi kuin aikaisemmin ko. alalla ja eroaa vain vähän vertailuna käytetystä laktaattipitoisesta Ringerin liuoksesta.

Keksinnön mukaisesti valmistettua emulsiota verrattiin US-patenteista 3 911 138 ja 3 962 1+39 tunnettuihin emulsioihin. Tutkittavat emulsiot valmistettiin käyttämällä perfluoridekaliinia kuten edellä esimerkissä 1. Tutkittavien emulsioiden koostumus ja saadut tulokset on esitetty taulukossa 8. Emulsioiden stabiliteetti määritettiin hiukkasten halkaisijana mittaamalla painokeskimääräinen hiukkaskoko sentrifugaalisedimentointimenetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Yokoyama, K. & ai., Chem. Pharm. Bull., 22 (12), 2966-2971 (197M· l.

'3 58071 ο β to co σ\ •rt :o β p oo on ta e <u +> · i- · -=r

H e S to p -P

P *r-l *ri ·Η cd «“ CO OJ

S m ei = a ft'- ftvo (¾ Ai M f! 0) I On I rn

Φ 2 d O CQ CQ

Ai S > Ai Don r> on "ils ~l Ö · P " β Ai ai ti •O O β VO ^ ON λ a ia •rt -P O 3 ON ' Λ on to en a> «ρ o _=f· •rl Ιί Äl U P " *> - «·

3 β HO 3 O O O O

-id 3 :d -3- 3 ft > ·ι-3^ ,¾

Λ 3 β ft C

0) ft -rt e 3 g β •n s 2 β • d 3 P -rt

β -Ρ Φ O β t— IA IA IA

S3 β -P ft 0) ON ON LA OJ

:nj (L) *rt -rt o o on on «- S S β β Λ " Λ " •r-ι 2 Ο <D ft O o o o

Ai 2 P P tee tn w m tn ·<-: ω______

Ai----- •rt β β -Ρ Φ CD to en •P «g Λ

M S P LA O O O

a5 :0 -P β On <- On O

Ai -P tn Φ O T- o ·—

Ai -P -rt Φ " ·> - *·

2 -rt S Ai O O O O

•rt ft ft I—f te :3 3 :3 !> > ·ο CO------ I *rt *rt O -rt -rt l ft -rt I Ό -rt ^ *rt

Aj-P-P 2 -rt ^ p p-rt^P P

Atf β -P ftftpOJ ft ft p OJ P

2 -rt g aJ.rt-d-alo «J-rtftcöO I (0¾¾ ft O 3 ft ft " 3 Λ ft ft " 3 " 3

PbOi> 3 o o φ o 3 o o φ o a> -s d ft P ft H ft ft ft *> ft P "-3 -rt to O -rt to o o o

S 'P O O I O O I I

Wee CQftW CQftW iej . ” : a> ωιι β 1) O !>) •n ft β ft - 3 >j ft o o -rt •rt -P *rt ft O I Ό P 010000¾¾¾¾ p.rt β "rt Ai Ai ft ft rt (OO-rtOO O LA Vi. — 0 AiSP'-'1 « »ftft to bD Oftai-rton=on = on 3003 ft !>> o φ f-t · •’-j ft ·* p P ft ft ft φ ft TL to n ? B o-rtSoS o o d

W ft β ft S·— cnftH

•ri ---—*------------+j 1 *rt o •rt I Ö c M * n »ri «fi Ο β -rt tö 2 -P g ft ft !>» -rt 3 «— ft -P β -rt tÄ β <D O ft ·6® φ > P fn on i i i * ft *rt r-1 p> CÖ :3 ft ft ft cö to ·η β O ρ •n *rt φ β p w Ä ft ft .rt

, ______O

< I tl •rt p* *rt ‘rt p β -Ρ β β O <D O -rt

P > 2-,-1¾¾ 15¾ IA IA

ft *rt ft ft z z z .

ftft ft 3 o on m on s β *rt β on on on ono <D · il o ai p ft JS__ft ft_____S3 n 58071

Tuloksista ilmenee, että US-patentista 3 911 138 tunnetun perfluorihiili -vetyemulsion lämpö- ja varastoi ntistabiliteetit ovat huomattavasti huonommat kuin keksinnön mukaisesti valmistetun emulsion vastaavat arvot. US-patentista 3 962 1*39 tunnettu perfluori hi i li vetyemulsi o on hieman huonompi kuin keksinnön mukai sesti valmi stettu emulsi o.

«I

V

«, <i 1 l l

Claims (1)

15 S 80 71 Pat entt ivaatimus: Menetelmä sellaisen happea kuljettavan perfluorihiilivedyn stabiilin emulsion valmistamiseksi fysiologisesti hyväksyttävään vesipitoiseen väliaineeseen, jonka hiukkaskoko on noin 0,05~0,3 Jim, tunnettu siitä, että sekoitetaan homogeeniseksi seokseksi 10-50 % (paino/tilavuus) (A + B):tä, jolloin A käsittää 1 perfluoridekaliinin ja B käsittää vähintään yhden seuraavista perfluori-tert-amii- neista: perfluori-N,N-dibutyyli-metyyliamiini, perfluoritripropyyliamiini; 2,0- 5,0 % (paino/tilavuus) suurimolekyylistä ionitonta pinta-aktiivista ainetta C, jonka molekyylipaino on noin 2000-20 000 ja joka on polyoksietyleeni-polyoksipropylee-nikopolymeeri, 0,1-1,0 % (paino/tilavuus) fosfolipidiä D; ja 0,001+-0,1 % (paino/ti-lavuus) vähintään yhtä rasvahappoa E, joka on 8-22 hiiliatomia sisältävä rasvahappo tai sen fysiologisesti hyväksyttävä suola tai monoglyseridi; jolloin perfluorihiilivedyn A ja perfluori-tert-amiinin B välinen suhde on noin 2,5-10 paino-osaa A:ta 1 paino-osaa kohden B:tä, fysiologisesti hyväksyttävässä vesipitoisessa väliaineessa raakaemulsion saamiseksi, raakaanulsiota emulgoidaan edelleen puristama!.-la se lämpötilassa enintään 55°C raon läpi paineella noin 100-500 kp/cm , jolloin emulsio suuren nopeusgradientin johdosta alistetaan leikkausvoiman ja sekoitus-vaikutuksen alaiseksi kunnes perfluorihiilivedyn hiukkaskoko saadussa emulsiossa saavuttaa arvon 0,05~0,3 pn.