FI65009C - Perfusionsvaetska foer konservering av ett organ som skall transplanteras och konserveringsfoerfaras - Google Patents

Description

I- -ι:-n r-, „„ KUULUTUSJULKAISU ^ Λ Λ Λ M (11) UTLÄCGNINGSSKIIIPT 65009 ^ ^ (51) iCv.Hu/tat.ct3 A 01 N 1/02 SUOMI—FINLAND (21) P»t*ntUh.k««m»—te.non.ftknini 80017^ m»-—“-01·" ' ' (23) AMmpUv·—GtklglMCadac 22.01.80 (41) Tullut JulklMkfl — Mvtt dM| 23.07.8l

Pmtantti- ja r.kl.t.H Killitti. >.|hT^ .. ___ och nglrtwrtyflwn ' * Amatoi ud^d od> 30.11.83 (32)(33)(31) *ΤΤ*«*Τ weMw.-*efcd prtoriMc (71) The Green Cross Corporation, 1-1+7, Chuo-l-chcme, Joto-ku, Osaka,

Japani-Japan(JP) (72) Kazumasa Yokoyama, Toyonaka-shi, Masakazu Ivai, Fujiidera-shi,

Hiroyuki Okamoto, Akashi-shi, Noboru Yamada, Ashiya-shi, J apani-Japan(JP) (7I+) Oy Kolster Ab (5I+) Perfuusioneste transplantoitavan elimen säilöntäa varten ja säilöntämenetelmä - Perfusionsvätska för konservering av ett organ som skall transplanteras och konserveringsförfarande

Keksinnön kohteena on neste transplantoitavan elimen per-fuusionaalista säilyttämistä varten sisältäen modifioitua Ringer' in liuosta, menetelmä tämän nesteen valmistamiseksi sekä menetelmä transplantoitavan elimen säilyttämiseksi käyttäen perfusaatti-na seosta, joka sisältää perussuolaliuoksena käytettävää Ringer' in liuosta, albumiinia ja perfluorihiililiemulsiota.

Viime vuosina on teknillinen kehitys elimen säilyttämiseksi transplantaatiota varten ollut merkittävä: erikoisesti kehitys menetelmissä munuaisten säilyttämiseksi on voimakkaasti edistänyt vainajilta saatuja munuaisten siirtoa. Tätä kehitystä on edistänyt huomattavasti parannukset perfusaattien suhteen. Esimerkiksi kliiniset menetelmät munuaisten säilyttämiseksi siirtoa varten jaetaan periaatteessa kahteen luokkaan, toisen ollessa hypotermi-nen varastointi (upottamalla) (Lancet 2 (1969) 1219-122 ja toisen hypotermisen jatkuvan perfuusion (Lancet 2 (1967) 536).Varsinaisessa 2 65009 käytännössä ensinmainittua käytetään lyhytaikaiseen säilöntään ja jälkimmäistä pitkäaikaiseen säilöntään. Vainajilta saatavien munuaisten siirron edelleen kehittyessä pitkäaikaisen säilytyksen, so. perfusaattisäilytyksen, tärkeys kasvaa.

Vainajilta saatujen munuaisten siirrossa, koska useimmat munuaiset saadaan lahjoituksina onnettomuuksiin joutuneilta henkilöiltä, tarvittaviin vaiheisiin vainajan munuaisen poistamisen ja transplantaation välisenä aikana kuuluvat vainajan munuaisen ja potilaan väliset histologiset yhteensopivuustestit, sopivan vastaanottajan valinta, lahjoitetun munuaisen siirto ja valmistelut siirtoa varten. Näistä syistä on tarpeen säilyttää lahjoitettu munuainen mahdollisimman kauan. Itse asiassa, osana vainajilta saatujen munuaisten siirtoon liittyvissä tutkimuksissa, on tähän mennessä tehty useita yrityksiä vainajan munuaisen säilyttämiseksi pitkän aikaa. Eräs näiden pyrkimysten pääkohde on perfusaattien kehittäminen ja parantaminen.

Hypotermisen jatkuvan perfuusion yhä laajeneva kliininen käyttö perustuu tutkimustyöhön, jonka ovat suorittaneet Belzer et ai (Lancet 536 (1967)). He onnistuivat säilyttämään koiran munuaisen 72 tuntia käyttämällä perfusaattina mahdollisimman perusteellisesti fibrogeenista puhdistettua plasmaa valmistettuna jäädyttämällä ja sulattamalla kryo-saostettua plasmaa. Heidän tutkimustulostensa julkaisemisen jälkeen kryo-saostettua plasmaa on pääasiassa käytetty perfusaattina munuaisia varten.

Vuonna 1974 Toledo-Pereyra et ai (Surg, Gynecol. Obstet 138 (1974) 901 - 905) kehittivät uuden perfusaatin piigeelillä käsitellystä kryo-saostetusta plasmasta, jossa ei esiinny fibrinogee-nin /3 —-lipoproteiinia, mutta joka kuitenkin säilyy tavanomaisena kryo-saostettuna plasmana ja jossa liukenemattoman rasvajakeen, so. triglyseridien, osuus on alentunut kolmannekseen. Tavanomainen kryo-saostettu plasma aiheuttaa suuren veritulppien muodostumisen vaaran perfuusion aikana, mikä aiheutuu fibrinogeenin, lipoproteiinin tai neutraalien rasvapallosten jäänteistä, kun taas tämä vaara alenee huomattavasti piigeelillä käsitellyn, kryo-saostetun plasman vaikutuksesta, jonka ovat kehittäneet Joledo-Pereyra et ai. Näissä kryo-saostetuissa plasmoissa esiintyy kuitenkin vielä vaka- 65009 via haittoja. Ensinnäkin preparatiivinen menettely ei vielä ole täysin vakiintunut ja käsitellyn plasman koostumus pyrkii vaihtelemaan, jolloin on vaikea saada valmisteita, joissa proteiinipitoisuus ja elektrolyytin koostumus ovat vakioita. Toiseksi esiintyy vielä hieman vaaraa rasvatulppien muodostumiseksi perfuu-sion aikana liukenemattoman rasvajakeen epätäydellisen poistumisen vuoksi. Tämän vaaran vähentämiseksi on välttämätöntä käyttää kallista membraanihapetinta. Kolmanneksi, tärkeä ja oleellinen haitta on sopivan deaktivointikäsittelyn puuttuminen hepatitis-virusta vastaan, mistä aiheutuu hepatitis-viruksen aiheuttama mahdollinen infektiovaara. Vaikka kryo-saostettu plasma on erinomainen perfu-saatti munuaisten säilyttämiseksi, esiintyy siinä useita, edellä-esitettyjä haittoja.

On esitetty, että kryo-saostettuun plasmaan liittyvien, edellämainittujen vaikeuksien voittamiseksi on pyritty käyttämään albumiiniliuosta perfusaattina ja että eläinkokeissa on saavutettu tuloksia. Grundman et ai (Transpl., 17, 299-305) perfu-soivat koiran munuaisen 6-prosenttisella albumiiniliuoksella ja säilyttivät munuaisen onnistuneesti 96 tuntia. Heidän perfusaat-tinsa oli Krebs Ringer'in liuos, joka sisältää 6 % (paino/tilav.) ihmisen albumiinia. Koiran munuainen perfusoituna 96 tuntia matalassa lämpötilassa autotransplantoitiin ja siirron onnistuminen oli suurempi kuin 80 % osoittaen, että albumiiniliuos on erinomainen perfusaatti ja voidaan sitä edullisesti verrata kryo-saostettuun plasmaan.

Munuaisen pitkäaikainen säilyttäminen vaatii perfusaatin, jossa on määrätty kolloidinen osmoottinen paine matalissa lämpötiloissa sekä jonka elektrolyyttikoostumus on sopiva ja lisäksi se sisältää määrätyn määrän happea. Matalissa lämpötiloissa säilytettäessä munuainen kuluttaa huomattavasti vähemmän happea kuin huoneenlämpötilassa, mutta se vaatii kuitenkin määrätyn määrän happea toimintansa säilyttämiseksi. Levy'n klassillisten tutkimusten mukaan (American Journal Physiology 197 (1959) 1111-1114 munuaisen hapenkulutus 8-10°C lämpötilassa on noin 3 ^,ul/g/mi-nuutti, mikä vastaa noin 20 % kulutuksesta huoneenlämpötilassa. Täten munuaisen säilyttämiseksi on yleinen käytäntö perfusoida se, jolloin perfusaattia hapetetaan.

4 65009

Kyllästetty orgaaninen perfluoriyhdiste (kutsutaan tämän jälkeen lyhenteellä PFC) on neste, joka pystyy liuottamaan huomattavan tilavuusmäärän happea ja toimii hapen kantajana käytettäessä emulsiona. Kehitystutkimuksia on käynnissä keinotekoisen veren suhteen, jossa käytetään hyödyksi PFC-emulsion edellämainittua luonteenomaista ominaisuutta. PFC-emulsio toimii hyvin hapen kantajana joko in vivo tai in vitro (kehon ulkopuolisessa systeemissä kuten perfuusiosysteemissä). Tämä ominaisuus antaa aiheen olettaa, että PFC-emulsiota voidaan käyttää edullisesti hapenkan-tajana munuaisen säilytyksessä. Paitsi että se on hyvä hapen liuotin, valittu PFC on biologisesti inertti eikä se aiheuta suoria myrkyllisyysvaikutuksia kudoksiin. Siten käytettynä perfusaattina munuaisen säilyttämiseksi ei aiheudu mitään myrkyliisyysvaikeuksia.

Tutkimukset munuaisen säilyttämiseksi käyttäen PFC-emulsiota ovat alkaneet aivan äskettäin ja ne perustuvat Nakaya et ai'ien työhön (Proceedings of Symposium on Perfluorichemical Blood, Kyoto 1976, 187-201). He tutkivat munuaisen elinvoimaisuutta biologisesti perfusoimalla koiran munuaista FC-43-emulsiolla (perfluoritri-butyyliamiini-emulsio) 9 tuntia huoneenlämpötilassa. Verrattaessa Ringer'in liuoksella perfusoituun vertailuryhmään FC-43-emulsiolla perfusoitu munuainen säilytti hyvin mitokondrioiden toiminnan ja glykolyyttisten ja glukoneogeneettisten avainentsyymien suuren ak-tiivisuustason osoittaen, että hapen kuljetus FC-43-raateriaalin avulla vaikuttaa tehokkaasti perfusoidun munuaisen toimintojen säilymiseksi. Edellämainitut tutkijat kohdistivat kuitenkin tutkimuksensa pääasiassa biologiseen näkökohtaan, mutta eivät säilytetyn munuaisen transplantaatioon. Bercowitz oli henkilö, joka julkaisi tulokset kanin munuaisen siirrosta säilytettynä perfuusion avulla käytettäessä PFC-emulsiota (J. Surg. Res. 20 (1976) 595-600). Hän perfusoi koiran munuaista 24 tuntia alhaisessa lämpötilassa PFC-emulsiolla, joka sisälsi albumiinia ja kryo-saostettua plasmaa. Säilytetty munuainen autotransplantoitiin ja sen jälkeen tutkittiin elimen siirron onnistuminen. Tämän havaittiin olevan 100-prosent-tisen kaikissa viidessä tapauksessa, kun taas onnistuminen oli 62 * viidessä vertailutapauksessa kahdeksasta, jolloin perfusaat-ti ei sisältänyt FC-43-emulsiota, mikä osoittaa selvästi FC-43-systeemin avulla saavutettavan edun.

5 65009 Nämä edelläesitettyä julkaisua osoittivat, että PFC-emulsio on tehokas perfusaatti munuaisen säilyttämisessä sekä matalissa lämpötiloissa että huoneenlämpötiloissa. Kummassakin julkaisussa esitetyt säilytysajat eivät kuitenkaan ole riittävän pitkiä säily-tysmenetelmän käyttökelpoisuuden osoittamiseksi. Erikoisesti albumiinia sisältävä FC-43-emulsio ei ole riittävän stabiili normalisoidun valmistuksen sallimiseksi.

Edellämainituissa olosuhteissa tämän keksinnön tekijät suorittivat tutkimuksia PFC-43-pitoisella perfusaatilla elinten, erikoisesti munuaisten pitkäaikaiseksi säilyttämiseksi transplantaatiota varten. Näihin tutkimusten perusteella saatiin esiteltävä keksintö.

Tämän keksinnön mukaiselle nesteelle transplantoitavan elimen perfuusionaalista säilyttämistä varten, joka perfusaatti sisältää Ringer'in liuosta, on tunnusomaista, että se sisältää kaliumioneja pitoisuudella 8-20 meg/litra, siihen liuotettua albumiinia pitoisuudella 1-8% (paino/tilavuus), siihen emulgoitua nestemäistä 9-12 hiiliatomia sisältävää perfluorihiiliyhdistettä pitoisuudella 7,5-12,5% (paino/tilavuus) ja emulgoivaa ainetta.

Tässä keksinnössä käytetyssä modifioidussa Ringer'in liuoksessa olevaan perus-Ringer1 in liuokseen ei kohdistu mitään erikoisia vaatimuksia, vaan voi se olla tavanomainen tai Locke'n, Tyrode'n, Earle'n, Hanks'in tai Krebs'in modifioima. Tavanomainen Ringer'in liuos on injektoitava vesiliuos (pH 5,0-7,5), joka sisältää 0,53-0,58% (paino/tilavuus) klooria ja 0,030-0,036% (paino/ tilavuus) kalsiumkloridia (Pharmacopoeia of Japan, 10. painos, 1981, s. 1262). Keksinnön mukainen modifiointi muodostuu siitä, että kaliumionipitoisuus on nostettu tavallisesta arvosta 4-6 meq/ litra arvoon 8-20 meq/litra, edullisesti arvoon 8-15 meq/litra.

Tätä nostettua kaliumionipitoisuutta käytettiin kaliumionitason saamiseksi vastaamaan tarkemmin solun ulkopuolisessa nesteessä olevaa kaliumionipitoisuutta. Valitsemalla tämä kaliumionipitoisuus on mahdollista saada hyppäyksellinen kasvu elinten siirron onnistumismäärään, erikoisesti munuaisen, jota on säilytetty pitkän aikaa perfuusion avulla. Tämän keksinnön mukaisen modifioidun Ringer'in liuoksen osmolariteetti on 290-300 m Osm/litra ja sen pH-arvo on 7,1-7,7 20°C lämpötilassa. Taulukossa I on esitetty vertailun vuoksi eräiden tyypillisten Ringer'in liuosten suola- 6 65009 koostumukset modifioituina tämän keksinnön mukaisesti yhdessä normaalin plasman kanssa, joka on tavanomaisen Ringer'in liuoksen prototyyppi.

Taulukko 1

Esimerkkejä modifioidun Ringer'in liuoksen elektrolyytti-koostumuksesta. Yksikkö meq/litra

Keksinnön mukaan modifioitu Ringer'in Normaali liuos___ plasma no.

Ioni 1 2 3

Na + 112 142 116 142 K+ 11 8 10 5

Mg++ 7 2 6 2

Ca++ 5

Cl" 118 103 15 103 HC03“ 3 27 10 27 HP04" 2 2 101 2 S04" 7 6

Glukoosi 33 139

Laktoosi 5 5 Tämän keksinnön mukainen perfuusioneste elimen säilyttämiseksi valmistetaan sekoittamalla keskenään PFC-emulsio modifioidun Ringer'in liuoksen ja albumiinin kanssa siten, että PFC-materi-aalin ja albumiinin pitoisuudet saavat vastaavasti etukäteen määrätyt arvot.

Keksinnössä käytetty PFC-emulsio valmistetaan nestemäisestä perfluorihiiliyhdisteestä, joka pystyy absorboimaan happea, tunnetun menetelmän avulla, jollainen on esitetty esimerkiksi US-paten-tissa 3 958 014, 3 911 138, 3 962 439 tai DE-hakemusjulkaisussa 2 630 586. Näissä patenttijulkaisussa on osoitettu, että stabiili, keinotekoisena verenä käytettäväksi sopiva emulsio voidaan valmistaa emulgoimalla perfluorihiiliyhdistettä emulgoivana aineena käytetyn fosfolipidin (US-patentti 3 958 014), fosfolipidin ja Cg 22~rasva^aPon kanssa lisäaineina (US-patentti 3 962 439); tai käyttäen polyoksietyleeni-polyoksi- 7 65009 propyleeni-kopolymeeriä (molekyylipaino 2000-20 000) ei-ionisena emulgoivana aineena (US-patentti 3 911 138); tai käyttäen poly-oksietyleenialkyylieetteriä tai polyoksialkyyliallyylieetteriä tai käyttäen yhdessä edellämainittuja rasvahappoja, ei-ionista emul-goivaa ainetta ja edellämainittua lisä-emulgointiainetta (DE-hakemusjulkaisu 2 630 589) .

Emulgoitavat perfluorihiiliyhdisteet ovat sellaisia, jotka eivät aiheuta haitallisia vaikutuksia elimiin tai kudoksiin ja ovat ne kyllästettyjä perfluorihiiliyhdisteitä, joissa on edullisesti kaikkiaan 9-12 hiiliatomia, joista jotkut tai kaikki muodostavat vähintään yhden kyllästetyn alisyklisen renkaan, hetero-syklisen renkaan heterotyppiatomin ja/tai happiatomin kanssa, ali-faattisen tertiäärisen amiinin yhdessä typpiatomin kanssa tai ali-faattisen eetterin yhdessä happiatomin tai -atomien kanssa.

Keksinnössä käytettävien perfluoriyhdisteiden yhden ryhmän muodostavat perfluorialkaanit, perfluorisykloalkaanit ja perfluori(alkyylisykloalkaanit), joihin kuuluvat esimerkiksi per-fluori(Cg_^2”alkaanit)| kuten perfluoridekaani ja perfluoridodekaa-ni? perfluori(C^_g-alkyylisykloheksaanit)/ kuten perfluori(metyyli-propyylisykloheksaanit, perfluori(butyylisykloheksaanit), perfluori (trimetyylisykloheksaanit), perfluori(etyylipropyylisykloheksaa-nit) ja perfluori(pentyylisykloheksaani^; perfluoridekaliini, per-fluorj^inetyylidekaliinit) ja perfluori (dimetyylidekaliinit) .

Toinen ryhmä käsittää perfluori(alkyyli-kyllästetyt-hetero-sykliset) yhdisteet, joihin kuuluvat esimerkiksi perfluori(alkyyli-tetrahydropyraanit), kuten perfluori(butyylitetrahydropyraanit), perfluori(pentyylitetrahydropyraanit) ja perfluori(heksyylitetra-hydropyraanit); perfluorialkyylitetrahydrofuraanit, kuten perfluori (pentyylitetrahydrofuraanit), perfluori(heksyylitetrahydrofuraa-nit) ja perfluori(heptyylitetrahydrofuraanit); perfluori(N-alkyyli-piperidiinit),, kuten perf luori (N-pentyylipiperidiinit) , perfluori-(N-heksyylipiperidiinit) ja perfluori(N-butyylipiperidiinit); ja perfluori(N-alkyylimorfoliinit), kuten perfluori(N-pentyylimorfo-liinit), perfluori(N-heksyylimorfoliinit) ja perfluori(N-heptyyli-morfoliinit).

8 65009

Kolmas ryhmä käsittää perfluori(tert.-amiinit), joihin kuuluvat esimerkiksi perfluori(tributyyliamiini), perfluori(di-etyyliheksyyliamiini), perfluori(dipropyylibutyyliamiini) ja perfluori(dietyylisykloheksyyliamiini); ja perfluori(dioksa-alkaa-nit) , so. perfluori(alkyleeniglykolidialkyylieetterit^ kuten perfluori (3,8-dioksa-2,9-dimetyylidekaani) tai perfluori(tetramety-leeniglykolidi-isopropyylieetteri), perfluori(3,7-dioksa-2,8-di-metyylinonaani) tai perfluori(trimetyleeniglykolidi-isopropyyli-eetteri) ja perfluori(4,6-dioksa-5,5-dimetyylinonaani) tai perfluori (isopropyleeniglykoli-di-n-propyylieetteri).

Täten valmistetun PFC-emulsion osaskoko modifioidussa Ringer'in liuoksessa on 0,05-0,3 mikrometriä, se sisältää 10-50 % (paino/tilav.) PFC-materiaalia, 2,0-5 % (paino/tilav.) emulgoi-vaa ainetta ja tarvittaessa 0,1-1,0 % (paino/tilav.) lisäemulgoin-tiainetta ja voidaan sitä varastoida stabiilissa tilassa pitkiä aikoja.

Esiteltävä perfusaatti elimen säilyttämiseksi transplantaatiota varten valmistetaan ennen käyttöä sekoittamalla keskenään edellämainittua PFC-emulsiota, kaupallista häränseerumialbumiinia tai ihmisen albumiinia sekä edellämainittua modifioitua Ringer'in liuosta niin, että saatu neste sisältää 7,5-12,5 % (paino/tilav.) PFC-materiaalia, 1-8 % (paino/tilav.) albumiinia. Tarvittaessa voidaan lisätä farmaseuttisia aineita kuten prokaiinihydroklori-dia, hepariinia, fenoksibentsamiinia, insuliinia, deksametasonia ("Decadron"), metyyliprednisolonia, antibiootteja ja urokinaaseja. Edelläesitetyt PFC-pitoisuuden rajat on asetettu elimensiirron onnistumisen takaamiseksi, silloin kun elintä ennen elimensiirtoa on säilytetty nesteperfuusion avulla. Albumiinin pitoisuus edellä-mainituissa rajoissa soveltuu kolloidin osmoottisen paineen säätämiseksi siten, että perfuusioneste voidaan pitää fysiologisesti isotonisena.

Siirrettävän elimen säilytys suoritetaan tavanomaisella tavalla hapettaen hapella tavanomaisen laitteen avulla. Esimerkiksi 400 ml 25-prosenttista (paino/tilav.) PFC-emulsiota, 360 ml modifioitua Ringer*in liuosta ja 240 ml 25-prosenttista (paino/tilav.) ihmisen albumiiniliuosta modifioidussa Ringer'in liuoksessa sekoitetaan keskenään kaikkiaan 1 litran saamiseksi. Saatu seos 9 65009 johdetaan perfusaattisäiliöön ja perfusoidaan siirrettävän elimen lävitse hapettaen samalla kaasuseoksella (95-98 % happea ja 5-2 % hiilidioksidia) tai pelkästään hapella membraanityyppisen tai kuplivaa tyyppiä olevan hapetuslaitteen avulla. Perfusaatin kier-rätysnopeus on 15-50 ml/g munuaista/tunti ja perfusaattia hapetettiin kaasuseoksella, joka sisältää 95 % O2 ja 5 % CC^, virtausnopeuden ollessa 1500 ml/min. Tarvittaessa edellämainittuja farmaseuttisia aineita voidaan lisätä perfusaattiin vaikuttamatta vahingollisesti perfusaattiin. Perfuusiosäilytyksessä on myös mahdollista kierrättää sykkivän pumpun avulla perfusaattia syötettynä elimen säilytyslaitteen valtimon puoleiseen säiliöön. Pitkäaikaisessa säilytyksessä on edullista tuorestaa sopivasti perfusaattia. Tämän keksinnön mukaista perfusaattia voidaan käyttää perfuusio-säilytyksen lisäksi leikkauspöytäkirurgiassa.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä antaa mahdollisuuden elimen säilyttämiseen erittäin turvallisesti pitkän aikaa aina transplantaatiohetkeen asti. Koska elinten siirron onnistumis-määrä on erittäin suuri, esiteltävä menetelmä takaa elimensiirron kaupallisen menestymisen käytännön lääketieteellisessä hoidossa.

Seuraavassa esitetään kuvaavia esimerkkejä menetelmistä esiteltävän perfusaatin jokaisen aineosan valmistamiseksi sekä menettelystä perfusaatin valmistamiseksi. Merkinnällä "% (paino/-tilav.)" tässä esitteessä ja patenttivaatimuksissa tarkoitetaan materiaalin paino-osuutta grammoina laskettuna 100 ml kohti saatua nestettä.

Valmistusesimerkki 1

Fluorihiiliemulsion valmistus:

Kahdeksaan litraan modifioitua Ringer'in liuosta (esitetään myöhemmin) liuotettiin 300 g polyoksietyleeni-polyoksipropyleeni-kopolymeeriä (molekyylipaino 8350). Lisättiin 3 kg perfluorideka-liinia ja saatua seosta sekoitettiin sekoituslaitteessa karkean emulsion muodostamiseksi. Karkea emulsio syötettiin suihkutustyyp-pisen emulgointilaitteen säiliöön (Monton-Gaulin tyyppinen homogenisoi ja) emulsion kierrättämiseksi. Emulgointi suoritettiin 35-5°C

O

lämpötilassa 200-500 kp/cm paineessa. Perfluoridekaliinin pitoisuus saadussa hienojakoisessa emulsiossa oli 31,3 % (paino/tilav.) ja osasten keskimääräinen läpimitta oli 0,09-0,1 mikrometriä mitat- 10 65009 tuna keskipakoissedimentoitumista käyttävän menetelmän avulla. Emulsion 6 kuukauden varastoinnin jälkeen 4°C:ssa ei osasten yh-teenkasvamista havaittu ja osasten keskimääräinen läpimitta säilyi oleellisesti muuttumattomana.

Albumiiniliuoksen valmistus;

Ihmisen seerumin albumiinin kaupallista valmistetta liuotettiin 25 % (paino/tilav.) pitoisuuteen edelläesitettyyn modifioituun Ringer'in liuokseen.

Modifioidun Ringer'in liuoksen valmistus:

Modifioitu Ringer'in liuos valmistettiin liuottamalla tislattuun veteen grammoina litraa kohti 6,51 NaCl, 0,4 MgSO^, 0,8 KC1, Q,24 NaHC03, 0,14 Na2HP04 ja 6,0 glukoosia, jolloin saatiin seuraavan elektrolyyttikoostumuksen omaava liuos ilmoitettuna meq/litra yksikköinä: 112 Na+, 11 K+, 7 Mg++, 118 Cl , 3 HCO-j , 2 HPO^ , 33 glukoosia.

Aineosaliuosten sekoittaminen: 57Q ml modifioitua Ringer*in liuosta ja 330 ml fluorihiili-emulsiota sekoitettiin keskenään huolellisesti. Seos steriloitiin kuumentamalla sterilointilaitteessa 115°C:ssa 12 minuutin ajan. Steriloitu seos sekoitettiin 100 ml kanssa albumiiniliuosta, joka oli johdettu bakteerisuodattimen lävitse. Saatu seos varastoitiin kylmässä tilassa 1-10°C lämpötilassa ja sitä käytettiin tarvittaessa perfuusionesteenä elimen säilyttämiseksi transplantaatiota varten .

Valmistusesimerkki 2

Perfluorihiili-emulsion valmistus:

Kahdeksaan litraan modifioitua Ringer*in liuosta liuotettiin 330 g polyoksietyleenioktyylieetteriä, jonka keskimääräinen molekyylipaino oli 3500. Liuokseen lisättiin 40 g soijapapu-fosfoli-pidiä ja 2 g kaliumoleaattia. Seosta sekoitettiin sekoittimessa suspension muodostamiseksi. Suspensioon sekoitettiin 3 kg perfluo-ri(tributyyliamiinia) ja sekoitettiin sekoittimessa karkean emulsion muodostamiseksi. Karkeaa emulsiota emulgoitiin edelleen esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Täten saatu hienojakoinen emulsio jaettiin pulloihin ja steriloitiin kuumentamalla pyörivässä sterilointilaitteessa 115°C:ssa 12 minuutin aikana. Perfluorihiilen pitoisuus steriloidussa emulsiossa oli 29,7 % (paino/tilav.).

11 65009

Varastoitaessa 4°C:ssa 6 kuukautta ei havaittu osasten yhteen-kasvua.

Aineosanesteiden sekoitus;

Sekoitettiin keskenään 550 ml valmistusesimerkissä 1 käytettyä modifioitua Ringer'in liuosta, 100 ml albumiiniliuosta ja edelläesitettyä fluorihiili-emulsiota. Sekoitettu neste säilytettiin kylmässä tilassa 1-1Q°C lämpötilassa ja sitä käytettiin tarvittaessa perfuusionesteenä elimen säilyttämiseksi siirtoa varten.

Valmistusesimerkki 3

Valmistusesimerkin 1 mukaiset menettelyt toistettiin paitsi, että perfluorimetyylipropyylisykloheksaania käytettiin per-fluoridekaliinin asemesta. Saadun perfuusionesteen ominaisuudet olivat vastaavat valmistusesimerkin 1 mukaan saadun perfuusionesteen kanssa.

Valmistusesimerkki 4

Esimerkin 1 mukaiset menettelyt toistettiin paitsi, että perfluoributyylisykloheksaania, perfluoritrimetyylisykloheksaania, perfluorimetyylipropyylisykloheksaania, perfluorimetyylidekaliinia, perfluoriheksyylitetrahydropyraania, perfluoripentyylitetrahydro-furaania, perfluoriheptyylitetrahydrofuraania ja perfluoridekaa-nia käytettiin kutakin perfluoridekaliinin asemesta. Saatujen per-fuusionesteiden ominaisuudet olivat vastaavat esimerkissä 1 saatujen kanssa.

Valmistusesimerkki 5

Valmistusesimerkin 1 menettelyt toistettiin paitsi, että perfluori-N,N-dibutyylimonometyyliamiinia, perfluori-N,N-dietyyli-pentyyliamiinia, perfluori-N,N-dipropyylibutyyliamiinia, perfluo-ritripropyyliamiinia, perfluori-N,N-dietyylisykloheksyyliamiinia, perfluori-N-pentyylipiperidiiniä, perfluori-N-heksyylipiperidiiniä, perfluori-N-butyylipiperidiiniä, perfluori-N-pentyylimorfOliinia, perfluori-N-heksyylimorfoliinia ja perfluori-N-heptyylimorfOliinia kutakin käytettiin perfluoridekaliinin asemesta. Saadut perfuusio-nesteet olivat samanlaisia kuin valmistusesimerkissä 1 saatu.

Valmistusesimerkki 6

Valmistusesimerkin 1 mukaiset menettelyt toistettiin paitsi, että perfluoritributyyliamiinia käytettiin perfluoridekaliinin ase- 12 6 5 0 0 9 masta. Saadun perfuusionesteen ominaisuudet olivat samanlaiset kuin valmistusesimerkissä 1.

Valmistusesimerkki 7

Valraistusesimerkin 1 mukainen menettely toistettiin paitsi, että polyoksietyleeni-polyoksipropyleeni-kopolymeeriä, jonka mo-lekyylipaino oli 15 800 käytettiin kopolymeerin asemesta, jonka molekyylipaino oli 8350. Saadun perfuusionesteen ominaisuudet olivat samanlaiset kuin esimerkin 1 mukaan saadun nesteen.

Seuraavassa on esitetty esimerkkejä vertailukokeista tämän keksinnön mukaisten perfuusioliuosten tehokkuuden osoittamiseksi eläinkokeissa perfuusion avulla säilytettyjen munuaisten siirrossa. Elimensiirron onnistuminen tai sen epäonnistuminen määrättiin tarkkailemalla siirretyn munuaisen toimintaa, kun kontralateraalisesti toimiva normaali munuainen oli poistettu. Taulukoissa termillä "varhainen toiminta" tarkoitetaan, että virtsaneritystä havaittiin kahden vuorokauden kuluessa kontralateraalisen munuaisenpois-ton jälkeen; termillä "myöhäinen toiminta" tarkoitetaan, että virtsaneritystä ei havaittu kahden vuorokauden aikana kontralateraalisen munuaisenpoiston jälkeen, mutta myöhemmin munuaisen toiminta parani vähitellen, kunnes havaittiin virtsaneritystä ja tutkittava eläin oli pelastunut; termillä "nekroosi" tarkoitetaan kudosten tuhoutumista paikallisissa alueissa siirretyssä munuaisessa ennen kontralateraalisen munuaisen poistoa (koe keskeytettiin); ja "A.T.N." (akuuttinen tubulaari-nekroosi) tarkoittaa, että kont-ralateriaalisen munuaisen poiston jälkeen eläin kärsi anuriasta, ruokahalun puutetta ja toistuvasta oksentamisesta, kunnes eläin kuoli akuuttiin munuaisen vajaatoimintaan.

Koe-esimerkki 1

Optimaalinen PFC-pitoisuus säilytysnesteessä.

On välttämätöntä ja oleellista määrätä sopivin PFC-pitoi-suus perfuusiota varten, koska PFC-emulsion PFC-pitoisuuden kasvaessa emulsion hapensiirtokyky kasvaa, kun taas toisaalta viskositeetti kasvaa huomattavasti matalissa lämpötiloissa. Optimaalisen PFC-pitoisuuden määrittämiseksi perfuusion aikana valmistettiin sarja perfuusionesteitä, joiden PFC-pitoisuudet vaihteli-vat käyttäen perussuolaliuoksena modifioitua Collin'sin liuosta (M.C.S.) (The Lancet 2 (1966) 1219-1222 ) f jonka sanotaan olevan 6 5 009 edullisimman elinten hypotermistä varastointia varten ja jonka elektrolyyttikoostumus vastaa solunsisäistä nestettä. Vaihtelevia määriä fluorihiili-emulsiota saatuna valmistusesimerkin 2 mukaisesti lisättiin M.C.S.-liuokseen siten, että tällöin saadut lopulliset PFC-pitoisuudet perfuusionesteissä ovat 5, 7,5 10, 12 ja 15 % (paino/tilav.). Suoritettiin kokeita koirien munuaisten säilömiseksi transplantaatiota varten perfusoimalla edellämainituilla nesteillä 5-80°C:ssa perfuusioliuosten virtausnopeuksien ollessa 15-18 ml/g/tunti 24 tunnin aikana hapetettaessa happipitoisella kaasulla (95 % C^, 5 % CC^) virtausnopeudella 300-500 ml/min. Käytettiin 5 koiraa ryhmää kohti ja munuaiset autotransplantoitiin. Seitsemäntenä vuorokautena autotransplantaation jälkeen jokaisen koiran kontralateraalinen normaali munuainen poistettiin ja jokaisen koiran tätä seuraavat elinpäivät laskettiin. Jos koira eli 4 viikkoa tai kauemmin, elimensiirtoa pidettiin onnistuneena, koska tällaisessa tapauksessa BUN- (veri urea typpi) ja kreatiini-tasot pysyivät normaaleina ja todettiin virtsaneritystä. Saaduista arvoista määritettiin optimaalinen PFC-pitoisuus perfusaa-tissa.

Kokeet suoritettiin tavanomaisesti seuraavaa toimenpide-kaavaa noudattaen:

Nukutus: Natriumpentobarbitaali (30 mg/kg, i.v. injektio), j halotaanin ja hapen endotrakeaalinen annostus.

Vatsanpohjan keskiviivan viilto.

Vasemman munuaisen kirurginen eristys.

Kannulaatio (virtsanjohdin, munuaisen valtimo ja laskimo).

Allcupesu kylmällä M. C. S .-liuoksella tai kylmällä Ringer'in laktaattiliuoksella.

Yhdistäminen perfuusiopiiriin. Perfuusiosäilytys hapetetulla | perfusaatilla 5-8°C:ssa 24 tunnin aikana.

Pesu (M.C.S. tai Ringer'in laktaattiliuos).

Autotransplantaatio reisionteloon.

Viivästetty kontralateriaalinen munuaisenpoisto.

14 65009

Taulukko 2 PFC-pitoisuuden vaikutus perfusaatissa elimensiirron onnistumiseen_

Koira Perfusaatti Elinaika Onnistuminen Huomautuksia n: o (vrk) 1 Elossa Varhainen toiminta 2 - Nekroosi 3 M.C.S. 5 2/5 A.T.N.++ (Anuria) 4 Elossa Varhainen toiminta 5 4__A.T.N. (Anuria)_ 6 - Nekroosi 7 Elossa Myöhästynyt toiminta 8 5 % PFC 5 3/5 A.T.N. (Anuria) M.C.S:ssä 9 Elossa Varhainen toiminta 10 Elossa Myöhästynyt toiminta_ 11 Elossa Varhainen toiminta 12 Elossa Varhainen toiminta 13 7,5 % PPC Elossa 4/5 Varhainen toiminta M.C.S:ssä 14 7 A.T.N. (Anuria) 15 Elossa__Varhainen toiminta_ 16 Elossa Varhainen toiminta 17 5 A.T.N. (Anuria) 18 10 % PPC Elossa 4/5 Varhainen toiminta M.C.Srssä 19 Elossa Varhainen toiminta 20 Elossa Varhainen toiminta 21 Elossa Varhainen toiminta 22 Elossa Varhainen toiminta 23 12,5 % PFC Elossa 4/5 Varhainen toiminta M.C.S.:ssä 24 5 A.T.N. (Anuria) 25 Elossa Varhainen toiminta ~26 8 A.T.N. (Hematuria) 27 Elossa Varhainen toiminta (Hema) 28 15 % PPC 4 2/5 A.T.N. (Anuria) 29 M.C.S..ssä Elossa Varhainen toiminta (Hema) 30 7 A.T.N. (Anuria) 15 65009 + Elossa. Eli kauemmin kuin 4 viikkoa.

| | A.T.N. (akuuttinen tubulaarinekroosi)

Saadut tulokset on esitetty taulukossa 2. Kuten taulukosta 2 voidaan havaita, suuri elimensiirron onnistumismäärä saatiin PFC-pitoisuudella 7,5-12,5 % (paino/tilav.). Jos PFC-pitoisuus on suurempi kuin 12,5 % (paino/tilav.) ja saavuttaa arvon 15 % (paino/tilav.) havaittiin hematuriaa kaikissa tapauksissa verenkierron palauttamisen jälkeen elimensiirron suorittamisen jälkeen. Kahdessa koirassa, jotka elivät yli 2 viikkoa, ilmeni hematuriaa useiden päivien aikana kontralateraalisen munuaisen poiston jälkeen, minkä jälkeen ne paranivat ja jäivät eloon. Edelläesitetyistä tuloksista pääteltiin, että perfuusioneste, jonka PFC-pitoisuus on säädetty arvoon 10 % (paino/tilav.), on tehokkain poistetun munuaisen perfuusiosäilytystä varten.

Koe-esimerkki 2

Perussuolaliuos:

Pitkäaikaisia, matalassa lämpötilassa suoritettuja perfuusio-säilytyskokeita tehtiin sopivan perussuolaliuoksen valitsemiseksi. Tutkitut suolaliuokset olivat M.C.S. (esitetty edellä), Ringer'in liuos ja modifioitu Ringer'in liuos (M.R.S) valmistettuna valmis-tusesimerkin 1 mukaan. Perfuusionesteet säilytystä varten valmistettiin lisäämällä valmistusesimerkin 2 mukaista perfluorihiili-emulsiota ja härän seerumialbumiinia suolaliuokseen siten, että lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 10 % (paino/tilav.) PFC ja 6 % (paino/tilav.) albumiinia. Perfuusio suoritettiin koiran munuaisilla (5 yksilöä ryhmässä) 5-8°C:ssa 72 tunnin aikana koe-esimerkin 1 mukaista menettelyä seuraten. Transplantaation ja verenkierron palauttamisen jälkeen suoritettiin tutkimuksia veren liikkumisesta munuaisen lävitse, munuaisen väristä ja ulkonäöstä, virtsanerityksestä ja kontralateraalisen munuaisen poiston aiheuttamista oireista suoritettuna 7. päivänä transplantaation jälkeen. Perfu-saattia (kaikkiaan 2000 ml) ei tuorestettu 72 tunnin perfuusion aikana, vaan sitä kierrätettiin nopeudella 15-18 ml/g/h. Paitsi tapauksissa, joissa M.R.S. käytettiin perussuolaliuoksena, tulokset transplantaatiossa olivat erittäin epäedulliset ja lähes kaikki koe-eläimet kuolivat akuuttiin munuaisen vajaatoimintaan 10 vuo- 16 65009 rokauden aikana kontralateraalisen munuaisen poiston jälkeen. Toisaalta tapauksissa, joissa M.R.S. käytettiin perussuolaliuoksena, kaikki eläimet toipuivat poikkeuksetta ilman komplikaatioita.

Koe-esimerkki 3

Albumiinipitoisuuden vaikutus perfusaatissa koiran munuaisen suhteen.

Tässä kokeessa käytetyt perfusaatit olivat 10-prosenttisia PFC-emulsioita modifioidussa Ringer'in liuoksessa valmistettuina käyttäen valmistusesimerkin 6 mukaista PFC-emulsiota ja sisältäen vaihtelevia määriä ihmisen albumiinia. Munuaisia perfusioitiin 72 tuntia 5-8°C:ssa hapettaen koe-esimerkissä 1 käytettyä happipitoista kaasua käyttäen virtausnopeudella 300-500 ml/min ja autotras-plantoitiin ne sitten koe-esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Per-fuusionesteen virtausnopeus pidettiin välillä 15-18 ml/g/h perfuu-sion aikana. Kontralateraalinen munuaisenpoisto suoritettiin yhden viikon kuluttua autotransplantaatiosta.

Tulokset on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3

Koira Albumiini- Munuaisen paino- Kontralateraalisen munuaisen poiston jälkeen ητο pitoisuus kasvu perfuusion %i]nillta Onnistuminen (%) aikana (%) 1 73,5 Ei toimintaa Kuoli 2 0 49,4 Ei toimintaa Kuoli 3 53,1 Myöhästynyt toi- Jäi eloon __minta 2 vrk__ 4 38,4 Myöhästynyt toi- Jäi eloon minta 2 vrk 5 2 52,9 Ei toimintaa Kuoli 6 49,8 Ei toimintaa Kuoli_ 7 37,6 Ei toimintaa Kuoli 8 4 20,3 Varhainen toiminta Jäi eloon 9 41,6 Varhainen toiminta Jäi eloon 10 13,7 Varhainen toiminta Jäi eloon 11 6 30,6 Varhainen toiminta Jäi eloon 12 ___34,4__Varhainen toiminta Jäi eloon 13 11,9 Varhainen toiminta Jäi eloon “ 14 8 22,8 Varhainen toiminta Jäi eloon 15 30,5 ELI toimintaa Kuoli 17 65009

Koe-esimerkki 4

Munuaisen pitkäaikainen, matalassa lämpötilassa suoritettu perfuusio transplantaatiota varten.

Koiran munuaisen transplantaatiokokeita suoritettiin koe-esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Jokaista munuaista säilytettiin yksi viikko perfuusion avulla 5-8°C:ssa ja perfuusionesteen virtausnopeus oli 15-18 mg/g/h hapettaen kaasulla, jonka virtausnopeus oli 300-500 ml/min. Perfuusioneste valmistettiin käyttäen valmistusesimerkin 1 mukaista M.R.S.-liuosta perussuolaliuoksena ja lisäämällä siihen härän seerumialbumiinia ja valmistusesimerkin 2 PFC-emulsiota tai valmistusesimerkin 2 mukaan valmistettua PFC-emulsiota paitsi, että perfluoridekaliinia käytettiin perfluori-tributyyliamiinin asemasta. Albumiinin ja PFC-materiaalin pitoisuudet perfuusionesteessä olivat 6% (paino/tilav.) ja 10% (paino/ tilav.) vastaavasti. Yhden viikon kuluttua perfuusiosäilytyksen jälkeen munuaiset autotransplantoitiin koe-esimerkin 1 mukaisesti. Kontralateraalinen munuaisen poisto suoritettiin yhden viikon kuluttua autotransplantaatiosta ja oireet havaittiin. Tulokset on esitetty taulukossa 4. Kreatiini- ja BUN-tasot plasmassa eloonjääneissä eläimissä tulivat normaaleiksi 3 viikon aikana.

18 65009

Taulukko 4 •-—-----—

Esimerkki Perfusaatti Munuaisen Kontralateriaalisen no> painonkasvu munuaisen-poiston perfuusion jälkeen__ aikana, % Toiminta Ctanistuminen 1 34,3 Varhainen Jäi eloon toiminta 2 M.R.S. 46,9 Ei toimintaa Kuoli albumiini 6%(p/t) 3 20,1 Myöhästynyt Jäi eloon toiminta 2 vrk 4 Ferf luor itr ibutyyli- 18,7 Myöhästynyt Kuoli amiini 10% (p/t) toiminta 3 vrk 5 33,5 Varhainen Jäi eloon ______toiminta__ 6 19,3 Varhainen Jäi eloon toiminta 7 M.R.S. 40,1 Myöhästynyt Kuoli albumiini 6% (p/t) toiminta 3 vrk 8 Ferfluoridekaliini 40,9 Varhainen Jäi eloon 10% (p/t) toiminta 9 23,5 Varhainen Jäi eloon toiminta 10 21,6 Ei toimintaa Kuoli

Koe-esimerkki 5 Käyttäen koiran munuaisia.suoritettiin transplantaatioko-keita koe-esimerkin 1 mukaisesti. Jokaista munuaista säilytettiin 18-22°C:ssa 12 tai 24 tuntia perfusoimalla perfuusionesteen virtausnopeuden ollessa 40-50 ml/g/h hapettaen sekakaasulla (95% C^-5% CC^) virtausnopeuden ollessa 300-500 ml/min.

Perfuusioneste valmistettiin käyttäen valmistusesimerkin 1 mukaista M.R.S.-liuosta perussuolaliuoksena ja lisäten siihen valmistusesimerkin 2 mukaista PFC-emulsiota ja härän seerumialbu-miinia. PFC- ja albumiini-pitoisuudet perfuusionesteessä olivat 10% (paino/tilav.) ja 6% (paino/tilav.) vastaavasti. 12 tai 24 tunnin säilyttämisen jälkeen munuaiset autotransplantoitiin. Kontralateraalinen munuaisenpoisto suoritettiin yhden viikon kuluttua is 65009 autotransplantaatiosta ja oireet havaittiin. Taulukossa 5 on esitetty edellä esitettyjen kokeiden tulokset yhdessä vertailu-kokeen kanssa, joissa ei käytetty PFC-materiaalia ja vertailu-kokeen kanssa, jossa M.C.S-liuosta käytettiin perussuolaliuoksena.

Taulukko 5

Esimerkki Perfusaatti Perfuusion Kontralateraalisen munuaisenpoiston no. kesto, h jälkeen

Toiminta Onnistuminen 1 M.R.S. Ei toimintaa Kuoli 2 albumiini 12 " " 6% (p/t) 3 " "

4 " H

5 M.C.S. Ei toimintaa Kuoli 6 albumiini 12 6% (p/t) 7 PFC 10% " (paino/tilav.) 8 ___" " 9 M.R.S. Varhainen toiminta Jäi eloon 10 albumiini 12 Varhainen 6% (p/t) toiminta Jäi eloon 11 PFC 10% (p/t) Varhainen toiminta Jäi eloon 12 Varhainen ____toiminta__Jäi eloon_ 13 M.R.S. Varhainen toiminta Jäi eloon 14 albumiini 24 Ei toimintaa Kuoli 15 PFC 10% (p/t) Varhainen toiminta Jäi eloon 16 Myöhäinen toiminta Jäi eloon

Claims (14)

20 65009

1. Neste transplantoitavan elimen perfuusionaalista säilyttämistä varten sisältäen modifioitua Ringer'in liuosta, tunnettu siitä, että se sisältää kaliumioneja pitoisuudella 8-20 meq/litraa, siihen liuotettua albumiinia pitoisuudella 1-8% (paino/tilavuus), siihen emulgoitua nestemäistä 9-12 hiili-atomia sisältävää perfluorihiiliyhdistettä pitoisuudella 7,5 -12,5% (paino/tilavuus) ja emulgoivaa ainetta.,

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nes^e, tunnettu siitä, että perfluorihiiliyhdiste on vähintään yksi yhdiste valittuna ryhmästä, johon kuuluvat 3-5 hiiliatomia alkyyliryhmässä sisältävät perfluorialkyylisykloheksaanit, perfluoridekaliini, perfluorimetyylidekaliini, 4-6 hiiliatomia alkyyliryhmässä sisältävät perfluorialkyylitetrahydropyraanit, 5-7 hiiliatomia alkyyliryhmässä sisältävät perfluorialkyylitetrahydrofuraanit, 4-6 hiili-atomia alkyyliryhmässä sisältävät perfluorialkyylipiperidiinit, 5-7 hiiliatomia alkyyliryhmässä sisältävät perfluorialkyylimorfo-liinit, perfluoritrialkyyliamiinit, perfluori(dietyylisyklohek-syyliamiini) ja perfluori(dioksa-alkaani).

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen neste, tunnettu siitä, että perfluorihiiliyhdiste on 3-5 hiiliatomia alkyyliryhmässä sisältävä perfluorialkyylisykloheksaani, perfluoridekaliini tai perfluorimetyylidekaliini.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen neste, tunnettu siitä, että perfluorihiiliyhdiste on 4-6 hiiliatomia alkyyliryhmässä sisältävä perfluorialkyylitetrahydropyraani, 5-7 hiiliatomia alkyyliryhmässä sisältävä perfluorialkyylitetrahydrofuraani, 4-6 hiiliatomia alkyyliryhmässä sisältävä perfluorialkyylipiperi-diini tai 5-7 hiiliatomia alkyyliryhmässä sisältävä perfluorial-kyylimorfoliini.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen neste, tunnettu siitä, että perfluorisykloalkaani on perfluoridekaliini, perfluori (metyylidekaliini) tai perfluori(dimetyylidekaliini). 21 65009

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen neste, tunnettu siitä, että periluorisykloalkaani on perfluori(butyylisykloheksaa-ni), perfluori(metyylipropyylisykloheksaani), perfluori(trimetyyli-sykloheksaani), perfluori(etyylipropyylisykloheksaani) tai perfluo-ri(pentyylisykloheksaani).

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen neste, tunnettu siitä, että perfluori-kyllästetty-heterosyklinen yhdiste on per-fluori(butyylitetrahydropyraani), perfluori(pentyylitetrahydrofu-raani), perfluori(heksyylitetrahydrofuraani) , perfluori (heptyyli-tetrahydrofuraani), perfluori(N-heksyylipiperidiini), perfluori(N-pentyylimorfoliini), perfluori(N-heksyylimorfoliini) tai perfluori-(N-heptyylimorfOliini).

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen neste, t u n n e tt u siitä, että perfluorihiiliyhdiste on perfluoritrialkyyliamiini, perfluori(dietyylisykloheksyyliamiini) tai perfluori(dioksa-alkaani).

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen neste, t u n n e tt u siitä, että perfluorihiiliyhdiste on perfluori-tert.-amiini, joka on perfluori(dietyyliheksyyliamiini), perfluori(dipropyylibutyyli-amiini), perfluori(dietyylisykloheksyyliamiini) tai perfluori(tri-butyyliamiini).

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen neste, tunnettu siitä, että perfluorihiiliyhdiste on perfluori(dioksa-alkaani), joka on perfluori (tetrametyleeniglykolidi-isopropyylieetteri), perfluori (trimetyleeniglykoli-di-isobutyylieetteri) tai perfluori-(isopropylideeniglykoli-di-n-propyylieetteri).

11- Patenttivaatimuksen 1 mukainen neste, tunnettu siitä, että emulgoiva aine on polyoksietyleeni-polyoksipropyleeni-kopolymeeri, polyoksietyleenialkyylieetteri, polyoksialkyyliallyyli-eetteri tai fosfolipidi tai näiden seos.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen neste, tunnettu siitä, että Cg_22_rasvahappoa on läsnä yhdessä emulgoivan aineen kanssa mainitun rasvahapon ollessa lisäemulgointiaine. 65009

13. Menetelmä nesteen valmistamiseksi transplantoitavan elimen perfuusio-säilyttämistä varten, tunnettu siitä, että se käsittää albumiinin, Ringer'in liuoksen, joka on modifioitu siten, että kaliumionipitoisuus on nostettu arvoon 8-20 meq/ litra, ja 9-12 hiiliatomia sisältävän perfluorihiiliyhdisteen stabiilin emulsion sekoittamisen keskenään siten, että albumiinin pitoisuus on 1-8% (paino/tilavuus) ja perfluorihiiliyhdisteen pitoisuus on 7,5 - 12,5% (paino/tilavuus).

14. Menetelmä transplantoitavan elimen säilyttämiseksi, jolloin elintä perfusoidaan perfluorihiiliyhdistettä sisältävällä perfuusionesteellä samalla hapettaen, tunnettu siitä, että perfuusioneste on seos, joka sisältää tehokkaan määrän albumiinia, Ringer'in liuosta, joka on modifioitu siten, että sen kaliumionipitoisuus on suurennettu arvoon 8-20 meq/litra ja stabiilia, 9-12 hiiliatomia sisältävän perfluorihiiliyhdisteen emulsiota, jolloin albumiinin pitoisuus on 1-8% (paino/tilavuus) ja perfluorihiiliyhdisteen pitoisuus on 7,5 - 12,5% (paino/tilavuus) perfuusioliuoksesta laskettuna. 65009