NO151769B

NO151769B - Vaeske for konservering ved perfusjon av et organ bereget for transplantering, og anvendelse av vaesken

Info

Publication number: NO151769B
Application number: NO81813251A
Authority: NO
Inventors: Kazumasa Yokoyama; Masakazu Iwai; Hiroyuki Okamoto; Noboru Yamada
Original assignee: Green Cross Corp
Priority date: 1980-01-28
Filing date: 1981-09-24
Publication date: 1985-02-25
Also published as: NO151769C; NO813251L

Abstract

Et organ som skal transplanteres, så som nyre, kan effektivt preserveres ved perfusjon i betydelig lang tid ved anvendelse av et perfusat som fremstilles ved å blande en Ringers oppløsning modifisert ved økning av kaliumion til 8-20 mekv./liter, en stabil perfluorkarbonforbindelse-emulsjon og albumin, slik at konsentrasjonen av perfluor-karbonforbindelsen er 7,5 til 12,5% (vekt/volum) og for albumin 1 til 8% (vekt/volum) basert på perfusatet.

Description

Det tekniske område

Denne oppfinnelse angår en væske for konservering ved perfusjon av et organ som skal transplanteres, og anvendelse av væsken for konservering av et organ som skal transplanteres. Væsken er en blanding inneholdende en modifisert Ringers oppløsning, anvendt som basal saltoppløsning, albumin og en perfluorkarbon-emulsjon.

Bakgrunns- teknikk

I de senere år har det tekniske fremskritt med hensyn

til å preservere et organ for transplantering, vært bemerkelses-verdig; særlig har fremskrittet med teknikken for preservering av nyrer stadig fremmet utbredelsen av nyretransplantasjon fra lik. Et slikt fremskritt skyldes mye forbedringen av perfusat. De kliniske metoder for preservering av nyrer for transplantering, kan f.eks. generelt klassifiseres i to kategorier, hvor den ene er den hypoterme lagring (ved ned-senkning) (Lancet, 2, 1219-1222 (1969)), og den annen den hypoterme, kontinuerlige perfusjon (Lancet, 2, 536 (1967)).

I virkelig praksis anvendes førstnevnte for en kort preser-veringsperiode og sistnevnte i lengere tids preservering.

Med videre utbredelse av nyretransplantasjon fra lik, vil langtids preservering, dvs. perfusjonspreservering, få økende betydning.

Ved nyretransplantasjon fra lik, eftersom de fleste nyrer doneres av individer som har vært utsatt for ulykker, vil de nødvendige trinn som må tas mellom det tidspunkt man får tak i en nyre fra lik og transplantasjonstidspunktet, omfatte vevsforlikelighetsundersøkelser mellom nyren fra liket og pasient, valg av passende mottager, transport av den donerte nyre, og klargjøring for transplantasjon. Av disse grunner er det nødvendig å preservere den donerte nyre så lenge som mulig. Som en del av undersøkelsene med hensyn til nyretransplantasjon fra lik, har således mange forsøk tidligere vært gjort på å preservere nyre fra lik i lengere tid. Et av

hovedmålene ved disse forsøk er utvikling og forbedring av

j perfusater.

Den stadig mer utbredte kliniske anvendelse av den hypoterme, kontinuerlige perfusjon stammer fra forsøks-arbeidet fra Belzer et al. (Lancet 536 2 (1967)). De lykkedes i å bevare en hundenyre i 72 timer ved at det som perfusat ble anvendt et plasma befridd fra fibrinogen, i størst mulig utstrekning fremstilt ved å fryse og smelte et kryopresipitert plasma. Efter publiseringen av deres rapport, har hovedsakelig det kryopresipiterte plasma vært anvendt som et perfusat for nyrer.

I 1974 utviklet Toledo-Pereyra et al. (Surg. Gynecol. Obstet, 138, 901-905 (1974)) et nytt perfusat av silikagel-behandlet kryopresipitert plasma som er befridd for S-lipoprotein fra fibrinogen som fremdeles er til stede i vanlig kryopresipitert plasma, og hvor innholdet av uoppløselig fettfraksjon, dvs. triglycerider, er redusert til en tredjedel. Det vanlige kryopresipiterte plasma medfører en stor risiko for emboli-dannelse under perfusjonen, hvilket forårsakes av gjenværende fibrinogen, lipoprotein eller nøytrale fett-globuler, mens risikoen reduseres sterkt med kryopresipitert plasma behandlet med silikagel, som er utviklet av Toledo-Pereyla et al. Slike kryopresipiterte plasma medfører imidlertid fremdeles flere problemer. For det første er fremstillingsmåten ikke fastlagt perfekt, og sammensetningen av den fremstilte plasma har en tendens til å variere, hvilket gjør det vanskelig å oppnå preparater med konstant protein-innhold og konstant elektrolytt-sammensetning. For det annet eksisterer fremdeles en viss frykt for fett-emboli-dannelse under perfusjonen på grunn av ufullstendig fjernelse av den uoppløselige fettfraksjon. For å redusere denne risiko er det nødvendig å anvende en kostbar membran-oksygenator.

For det tredje er et viktig og vesentlig problem mangelen på tilstrekkelig inaktiveringsbehandling mot hepatitt-virus, som fører til frykt for mulig infeksjon med hepatitt-virus.

Selv om den kryopresipiterte plasma er et utmerket perfusat for preservering av nyrer, har den flere mangler som nevnt ovenfor.

Det er rapportert at for å avhjelpe de ovennevnte vanskeligheter i tilknytning til kryopresipitert plasma, er det gjort forsøk på å anvende en albumin-oppløsning som perfusat, og dette har vært vellykket ved dyreforsøk. Grundman et al (Transpl., 17, 299-305 (1974)) perfuserte en hundenyre med en 6% albuminoppløsning og oppbevarte nyren med hell i 96 timer. Deres perfusat var en Krebs Ringers oppløsning inneholdende 6% (vekt/volum) av menneskealbumin. Hundenyren som var perfusert i 96 timer ved lav temperatur, ble auto-transplantert, og overlevelsen ved overføringen var over 80%, hvilket viser at albuminoppløsningen er et utmerket perfusat som er forholdsvis gunstig sammenlignet med kryopresipitert plasma.

Langtidspreservering av en nyre krever et perfusat som

har et visst kolloid-osmotisk trykk ved lave temperaturer så vel som en passende elektrolytt-sammensetning, og, dessuten, en viss mengde oksygen. Ved preservering ved lave temperaturer forbruker nyren mye mindre oksygen enn ved romtemperatur,

men krever allikevel en viss mengde oksygen for å opprettholde sin funksjon. I henhold til en klassisk undersøkelse av Levy (American Journal Physiology 197, 1111-1114 (1959)),

er oksygenforbruket for en nyre ved 8 til 10°C ca. 3 yl/g/min., hvilket svarer til ca. 20% av forbruket ved romtemperatur.

Ved preservering av en nyre er det således vanlig praksis å perfusere den med et perfusat mens den oksygeneres.

En mettet perfluor-organisk forbindelse (i det følgende referert til som PFC) er en væske som er i stand til å oppløse en betydelig volummengde oksygen og virker som en oksygenr bærer når den anvendes i form av emulsjon. Forsknings-prosjekter er i gang vedrørende et kunstig blod som utnytter den ovennevnte karakteristiske egenskap for PFC-emulsjonen. PFC-emulsjonen virker som en oksygenbærer enten in vivo eller in vitro (i et utenfor-legemlig system så som et perfusjons-system). En slik egenskap tyder på at en PFC-emulsjon med fordel kan anvendes som en oksygenbærer ved nyre-preservering. Ved siden av å være et godt oppløsningsmiddel for oksygen er den valgte PFC biologisk inert og representerer intet problem med direkte toksisitet overfor vevene. Når den anvendes som perfusat ved preservering av en nyre oppstår derfor ingen problemer med hensyn til toksisitet.

Undersøkelsene vedrørende preservering av en nyre ved anvendelse av en PFC-emulsjon startet ganske nylig og stammer fra arbeidet til Nakaya et al. (Proceedings of Symposiom on Perfluorochemical Artificial Blood, Kyoto 1976, 187-201).

De undersøkte levedyktigheten for nyre på biologisk måte ved

å perfusere en kanin-nyre med FC-43-emulsjon (en perfluortributylamin-emulsjon) i 9 timer ved romtemperatur. Sammenlignet med en kontrollgruppe som ble perfusert med Ringers oppløsning, beholdt nyren perfusert med FC-43-emulsjonen godt mitokondrie-funksjonen og høyere aktivitetsnivåer for glykolytiske og glukonogenetiske nøkkelenzymer, hvilket tyder på at oksygentransporten ved hjelp av FC-43 utøver en effektiv innvirkning på bibeholdet av funksjoner hos den perfuserte nyre. De ovennevnte forfattere rettet imidlertid sin forsknings-innsats hovedsakelig mot det biologiske aspekt, og ikke mot transplanteringen av en preservert nyre. Det er Bercowitz som rapporterte resultatene av transplantering av en hundenyre preservert ved perfusjon med en PFC-emulsjon (J. Surg. Res., 20, 595-600 (1976)). Han perfuserte en hundenyre i 24 timer ved lav temperatur med en PFC-emulsjon inneholdende albumin og en kryopresipitert plasma. Den preserverte nyre ble derefter auto-transplantert og overlevningsgraden ved overføringen ble undersøkt. Denne grad ble funnet å være 100% i alle fem tilfeller, mens graden var 62% i fem kontrolltilfeller av åtte hvor perfusatet ikke inneholdt noe FC-43 emulsjon, hvilket i betydelig grad illustrerer fordelen med FC-4 3 systemet.

De to ovenfor omtalte rapporter viste at PFC-emulsjonen er et effektivt perfusat for preservering av en nyre ved både lave temperaturer og romtemperatur. De preserveringsperioder som er beskrevet i begge rapporter, er imidlertid ikke tilstrekkelig lange til å fastslå den praktiske nytte av preserveringsmetodene. Spesielt er FC-43 emulsjonen inneholdende albumin ikke tilstrekkelig stabil til å gi et normalisert preparat. På grunnlag av de ovennevnte forhold utførte oppfinnerene undersøkelser med det PFC-43-holdige perfusat for langtidspreservering av et organ, særlig nyre, for transplantering. Basert på resultatene av slike under-søkelser har man kommet frem til foreliggende oppfinnelse.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Formålet med denne oppfinnelse er å tilveiebringe en væske som kan anvendes for effektiv langtids-konservering av organer for transplantering.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes en væske for konservering ved perfusjon av et organ beregnet for transplantering, omfattende en Ringers oppløsning hvori er oppløst albumin, minst én emulgert, flytende perfluor-karbonforbindelse og et emulgeringsmiddel. Væsken karakteriseres ved at konsentrasjonen av kaliumioner i Ringers oppløsning er 8 til 20 mekv./liter. Oppfinnelsen omfatter også konservering av et organ for transplantering ved anvendelse av nevnte væske som perfusat.

Beste utførelsesform for oppfinnelsen

Den grunnleggende Ringers oppløsning som anvendes i

den modifiserte Ringers oppløsning ifølge oppfinnelsen, er ikke gjenstand for noen spesielle begrensninger, men kan være en vanlig type eller den som er modifisert av Locke, Tyrode, Earle, Hanks eller Krebs. Modifikasjonen i henhold til foreliggende oppfinnelse består i at kaliumion-konsentrasjonen er øket fra det vanlige nivå på 4 til 6 mekv./liter til 8 til 20, fortrinnsvis 8 til 15 mekv./liter. En slik øket

konsentrasjon er benyttet for å komme nærmere kaliumion-nivået i den ekstracellulære væske. Ved valg av en slik konsentrasjon av kaliumion, blir det mulig å oppnå en kraftig økning av overlevelsesgraden ved overføring av et organ, særlig nyre, som er preservert i lengere tid ved perfusjon. Den modifiserte Ringers oppløsning ifølge oppfinnelsen har en osmolaritet på 290 til 300 mOsm/liter og en pH på 7,1 til 7,7 ved 20°C. I Tabell 1 er vist som sammenligning, saltsammensetninger for noen typiske Ringers oppløsninger modifisert i henhold til oppfinnelsen, sammen med verdiene i en normal plapma som er prototypen for en vanlig Ringers oppløsning.

V

Perfusjonsvæsken for preservering av et organ i henhold til oppfinnelsen fremstilles ved å blande sammen en emulsjon av PFC i den modifiserte Ringers oppløsning, albumin og den modifiserte Ringers oppløsning slik at konsentrasjonen av PFC og albumin hver kan nå de forhåndsbestemte verdier.

PFC-emulsjonen som anvendes ifølge oppfinnelsen, fremstilles fra en flytende perfluorkarbonforbindelse som er i stand til å absorbere oksygen ved en kjent fremgangsmåte beskrevet f.eks. i US-patenter 3.958.014, 3.911.138 og 3.962.439, eller vest-tysk patentansøkning DT-OS 2630586. Disse patent-skrifter beskriver at en stabil emulsjon som er egnet for anvendelse som kunstig blod, kan fremstilles ved emulgering av en perfluorkarbonforbindelse med et fosfolipid som emulgator (US 3.958.014), et fosfolipid og en cq_ 22 fettsYre som hjelpe-middel (US-patent 3.962.439); eller ved anvendelse av en polyoksyetylen-polyoksypropylen-kopolymer (molekylvekt 2.000 til 20.000) som ikke-ionisk emulgator (US-patent 3.911.138); eller ved anvendelse av en polyoksyetylen-alkyleter eller polyoksyalkylallyleter eller samtidig anvendelse av de ovennevnte fettsyrer, ikke-ioniske emulgatorer og det ovennevnte hjelpe-emulgeringsmiddel (vest-tysk patentansøkning DT-OS 2630589).

Perfluorkarbonforbindelsene som skal emulgeres, er de

som ikke medfører skadelige virkninger på organer eller vev, og er mettede perfluorkarbonforbindelser som fortrinnsvis inneholder ialt 9 til 12 karbonatomer, hvorav noen eller alle danner minst én mettet alicyklisk ring, heterocyklisk ring sammen med hetero-nitrogenatomet og/eller oksygenatomet, alifatisk, tertiært amin sammen med nitrogenatomet eller alifatisk eter sammen med oksygenatomet eller -atomene.

Den første gruppe av perfluorkarbonforbindelsene som anvendes ifølge oppfinnelsen, er et perfluoralkan, perfluor-cykloalkan eller perfluor(alkylcykloalkan) som omfatter f.eks. perf luor (Cg_^2-al'caner) så som perf luordekan, og perfluor-dodekan; perf luor (C^^-alkylcykloheksaner) så som perfluor-(metylpropylcykloheksaner), perfluor(butylcykloheksaner), perfluor(trimetylcykloheksaner), perfluor(etylpropylcyklo-heksaner) og perfluor(pentylcykloheksaner); perfluordekalin, perfluor(metyldekaliner\ og perfluor(dimetyldefcaliner).

Den annen gruppe er en perfluor(alkyl-mettet heterocyklisk forbindelse) som omfatter f.eks. perfluor(alkyltetrahydro-pyraner) så som perfluor(butyltetrahydropyraner), perfluor-(pentyltetrahydropyraner) og perfluor(heksyltetrahydropyraner); perfluor(alkyltetrahydrofuraner) så som perfluor(pentyl-tetrahydrofuraner), perfluor(heksyltetrahydrofuraner) og perfluor(heptyltetrahydrofuraner); perfluor(N-alkylpiperidiner) så som perfluor(N-pentylpiperidiner), perfluor(N-heksyl-piperidiner) og perfluor(N-butylpiperidin); og perfluor-(N-alkylmorfoliner) så som perfluor(N-pentylmorfoliner), perfluor(N-heksylmorfoliner) og perfluor(N-heptylmorfoliner).

Den tredje gruppe er et perfluor(tert-amin) som omfatter f.eks. perfluor(tributylamin), perfluor(dietylheksylamin), perfluor(dipropylbutylamin) og perfluor(dietylcykloheksylamin); og et perfluor(dioksaalkan), dvs. perfluor(alkylenglykol-dialkyleter), så som perfluor-(3,8-dioksa-2,9-dimetyldekan) eller perfluor(tetrametylenglykol-diisopropyleter), perfluor-

(3,7-dioksa-2,8-dimetylnonan) eller perfluor(trimetylen-glykol-diisopropyleter) og perfluor(4,6-dioksa-5,5-dimetyl-nonan), eller perfluor(isopropylenglykol-di-n-propyleter).

Den således fremstilte emulsjon av PFC i den modifiserte Ringers oppløsning har en partikkelstørrelse på 0,05 til

0,3 y, inneholder 10 til 50% (vekt/volum) av PFC, 2 til 5%

(vekt/volum) av en emulgator, og, hvis nødvendig, 0,1 til 1,0%

(vekt/volum) av en hjelpe-emulgator, og kan lagres i stabil tilstand i lengere tid.

Det foreliggende perfusat for preservering av et organ

for transplantering fremstilles, før bruk, ved å blande sammen den ovennevnte PFC-emulsjon, et kommersielt storfe- eller menneske-albumin og den ovennevnte modifiserte Ringers opp-løsning, slik at den resulterende væske kan inneholde 7,5 til 12,5% (vekt/volum) av PFC og 1 til 8% (vekt/volum) av albumin. Hvis nødvendig, kan slike legemidler som prokain-hydroklorid, heparin, fenoksybenzamin, insulin, deksametason ("Decadron"), metylprednisolon, antibiotika og urokinase tilsettes. De ovenfor angitte grenser for PFC-konsentrasjon ble satt opp for å sikre overføringsoverlevning efter transplantering av organet preservert ved perfusjon av væsken. Konsentrasjonen av albumin innenfor de ovennevnte grenser er egnet for å regulere det kolloide, osmotiske trykk slik at perfusjonsvæsken kan holdes fysiologisk isoton.

Preserveringen av et organ som skal transplanteres, utføres på vanlig måte under oksygenering med oksygen ved hjelp av vanlig utstyr. F.eks. blandes sammen 400 ml av en 25%

(vekt/volum) PFC-emulsjon, 360 ml av den modifiserte Ringers oppløsning og 240 ml av en 25% (vekt/volum) menneske-albumin-oppløsning i den modifiserte Ringers oppløsning for å gi totalt 1 liter. Den resulterende blanding innføres i et perfusat-reservoir og perfuseres gjennom organet som skal transplanteres, mens det oksygeneres med en blandet gass (95-98% oksygen og 5-2% karbondioksyd) eller oksygen alene ved hjelp av en oksygenator av membran-typen eller bobletypen. Sirkulasjons-hastigheten for perfusatet er 15 til 50 ml/g nyre/time, og perfusatet ble oksygenert med 95% 02~5% CO2 ved en strømnings-hastighet på 30 til 1500 ml/min. Hvis nødvendig kan de ovenfor angitte legemidler settes til perfusatet uten å skade

perfusatet. Ved perfusjonspreserveringen er det også mulig å resirkulere, ved hjelp av en pulserende pumpe, perfusatet som føres til arterie-sidereservoiret i et organ-preserveringsutstyr. Ved langtids preservering er det ønskelig å fornye perfusatet på passende måte. Perfusatet ifølge oppfinnelsen kan anvendes ikke bare ved perfusjonspreservering, men også på operasjonsbenken.

Fremgangsmåten gjør det mulig å preservere et organ meget sikkert i lang tid inntil transplantering finner sted. Eftersom overførings-overlevelsesgraden er meget høy, vil foreliggende fremgangsmåte sikre kommersiell suksess ved organ-transplantering ved praktisk medisinsk behandling.

Illustrerende eksempler på fremgangsmåtene for fremstilling av hver komponent i det foreliggende perfusat og fremgangsmåten for fremstilling av perfusatet, er beskrevet nedenfor. Symbolet "% (vekt/volum)" som er anvendt i beskrivelse og krav, betyr vektmengden av et materiale (gram) basert på 100 ml av den resulterende væske.

Fremstillings- eksempel 1

Fremstilling av fluorkarbon-emulsjon:

I 8 liter av en modifisert Ringers oppløsning (beskrevet senere) ble oppløst 300 g av en polyoksyetylen-polyoksypropylen-kopolymer (molekylvekt 8.350). Efter tilsetning av 3 kg perfluordekalin ble den resulterende blanding omrørt i en blander for å danne en grov emulsjon. Den grove emulsjon ble ført til beholderen i en emulgeringsanordning av jet-typen (homogenisator av Monton-Gaulin-typen) for å sirkulere emulsjonen. Emulgering ble foretatt ved 35 1 5°C under et trykk på

200 til 50O kg/cm 2. Konsentrasjonen av perfluordekalin i den resulterende, fine emulsjon var 31,3% (vekt/volum), og den gjennomsnittlige partikkeldiameter var 0,09 til 0,1 u, som målt ved sentrifugal-sedimenterings-metoden. Efter 6 måneders lagring av emulsjonen ved 4°C ble det ikke iakttatt noen sammenflytning av partiklene, og den gjennomsnittlige partikkeldiameter holdt seg tilnærmet uendret.

Fremstilling av albumin-oppløsning:

Et kommersielt preparat av menneskeserum-albumin ble oppløst i en konsentrasjon på 25% (vekt/volum) i den modifiserte Ringers oppløsning beskrevet nedenfor.

Fremstilling av modifisert Ringers oppløsning:

En modifisert Ringers oppløsning ble fremstilt ved å oppløse i destillert vann, uttrykt i g/liter, 6,51 NaCl,

0,4 MgS04, 0,8 KC1, 0,24 NaHC03, 0,14 Na2HP04, 6,0 glukose, for å danne en oppløsning med følgende elektrolytt-sammensetning, uttrykt som mekv./liter: 112 Na<+>, 11 K<+>, 7 Mg<++>, 118 Cl", 3 HC03~, 2 HP04 , 7 S04 , 33 glukose.

Blanding av komponent-væsker:

En mengde på 570 ml av den modifiserte Ringers oppløsning og 330 ml av fluorkarbon-emulsjonen ble blandet og om-hyggelig omrørt. Blandingen ble sterilisert ved oppvarmning i en sterilisator ved 115°C i 12 minutter. Den steriliserte blanding ble blandet med 100 ml av albuminoppløsningen som var ført gjennom et bakteriefilter. Den resulterende blanding ble lagret på et kjølig sted ved 1 til 10°C og anvendt efter behov som perfusjonsvæske for preservering av et organ for transplantering.

Fremstillingseksempel 2

Fremstilling av perfluorkarbon-emulsjon:

I 8 liter av den modifiserte Ringers oppløsning ble oppløst 330 g polyoksyetylen-oktyleter med en gjennomsnittlig molekylvekt på 3.500. Til oppløsningen ble satt 40 g soya-bønne-fosfolipid og 2 g kaliumoleat. Blandingen ble omrørt i en blander for å danne en suspensjon. Suspensjonen ble blandet med 3 kg perfluor(tributylamin) og omrørt i en blander for å danne en grov emulsjon. Den grove emulsjon ble emulgert videre på samme måte som i eksempel 1. Den således oppnådde fine emulsjon ble fordelt i ampuller og sterilisert ved oppvarmning i en roterende sterilisator ved 115°C i 12 minutter. Konsentrasjonen av perfluorkarbon i den. steriliserte emulsjon var 29,7% (vekt/volum). Ved lagring ved 4°C i 6 måneder viste emulsjonen ingen sammenvoksing av partiklene.

Blanding av komponent-væsker:

En mengde på 550 ml av den modifiserte Ringers oppløsning anvendt i Fremstillingseksempel 1, 100 ml av albumin-oppløsningen og 350 ml av fluorkarbon-emulsjonen oppnådd ovenfor, ble blandet. Den blandede væske ble lagret på et kjølig sted ved 1 til 10°C og anvendt efter behov som en perfusjonsvæske for preservering av et organ for transplantering.

Fremstillingseksempel 3

Fremgangsmåtene i Fremstillingseksempel 1 ble gjentatt, bortsett fra at perfluormetylpropylcykloheksan ble anvendt istedenfor perfluordekalin. Den oppnådde perfusjonsvæske hadde lignende egenskaper som den som ble oppnådd i Fremstillingseksempel 1.

Fremstillingseksempel 4

Fremgangsmåten i Fremstillingseksempel 1 ble gjentatt, bortsett fra at hver av perfluorbutylcykloheksan, perfluor-trimetylcykloheksan, perfluoretylpropylcykloheksan, perfluor-metyldekalin,' perfluorheksyltetrahydropyran, perfluor-pentyltetrahydrofuran, perfluorheptyltetrahydrofuran og perfluordekan ble anvendt istedenfor perfluordekalin. De oppnådde perfusjonsvæsker lignet på den som bie oppnådd i Fremstillingseksempel 1.

Fremstillingseksempel 5

Fremgangsmåtene i Fremstillingseksempel 1 ble gjentatt, bortsett fra at hver av perfluor-N,N-dibutylmonometylamin, perfluor-N,N-dietylpentylamin, perfluor-N,N-dipropylbutylamin, perfluortripropylamin, perfluor-N,N-dietylcykloheksylamin, perfluor-N-pentylpiperidin, perfluor-N-heksylpiperidin, perfluor-N-butyl-piperidin, perfluor-N-pentylmorfolin, perfluor-N-heksylmorfolin, og perfluor-N-heptylmorfolin ble anvendt istedenfor perfluordekalin. De oppnådde perfusjonsvæsker lignet på de som ble oppnådd i Fremstillingseksempel 1.

Fremstillingseksempel 6

Fremgangsmåtene ifølge Fremstillingseksempel 1 ble gjentatt, bortsett fra at perfluortributylamin ble anvendt istedenfor perfluordekalin. Den oppnådde perfusjonsvæske lignet på den som ble oppnådd i Fremstillingseksempel 1.

Fremstillingseksempel 7

Fremgangsmåten ifølge Fremstillingseksempel 1 ble

gjentatt, bortsett fra at en polyoksyetylen-polyoksypropylen-kopolymer med en molekylvekt på 15.800 ble anvendt istedenfor kopolymeren med en molekylvekt på 8.350. Den oppnådde perfusjonsvæske hadde lignende egenskaper som den som ble oppnådd i Fremstillingseksempel 1.

Nedenfor er vist eksempler på sammenligningsforsøk for

å demonstrere ved dyreforsøk effektiviteten av perfusjons-preserveringsvæskene ifølge oppfinnelsen ved transplantering av nyre preservert ved perfusjon.

Overlevelsen eller døden ved overføringen ble bestemt

ved å iaktta funksjonen hos den overførte nyre efter at den kontralaterale, normale nyre var fjernet. I tabellene betyr symbolet "E.F." (tidlig funksjon) at urinering ble iakttatt i 2 dager efter den kontralaterale nefrektomi;

symbolet "L.F." (sen funksjon) betyr at ingen urinering ble iakttatt i 2 dager efter den kontralaterale nefrektomi,

men derefter forbedret nyrens funksjon seg gradvis inntil urinering ble iakttatt og forsøksdyret overlevde; symbolet "N"

(nekrose" betyr at vevene i lokaliserte områder av den transplanterte nyre døde før den kontralaterale nefrektomi (forsøket ble avbrutt); og "A.T.N.(A)" (akutt tubular nekrose (Anuria)) betyr at efter den kontralaterale nefrektomi led dyret av anuria, apetitt-tap og hyppig brekning inntil det døde på grunn av akutt nyresvikt. Symbolet "A.T.N.(H)"

(akutt tubular nekrose (Hematuria)) betyr videre at forsøks-dyret døde på grunn av anuri som forårsaket hematuri.

Symbolet "N.F." (ingen funksjon) betyr ingen funksjon.

Forsøksekseropel 1

Optimal PFC konsentrasjon i preserveringsvæske:

Det er nødvendig og vesentlig å bestemme PFC-konsentrasjonen som er mest egnet for perfusjon, fordi med økning i PFC-konsentrasjonen i en PFC-emulsjon, øker emul-sjonens oksygenbærende evne, mens på den annen side øker viskositeten betydelig ved lave temperaturer. For å bestemme den optimale PFC-konsentrasjon under perfusjon ble en serie av perfusjonsvæsker med varierende PFC-konsentrasjoner fremstilt under anvendelse av som basal saltoppløsning en modifisert Collins oppløsning (M.C.S.) (The Lancet, 2, 1219-1222 (1969)) som sies å være den mest gunstige for hypoterm lagring av organer og har en elektrolytt-sammensetning som ligner på intracellular væske. Varierende mengder av fluorkarbon-emulsjonen oppnådd i Fremstillingseksempel 2 ble satt til M.C.S, slik at de endelige PFC-konsentrasjoner i de således oppnådde perfusjonsvæsker kan bli 5, 7,5, 10, 12,5 og 15%

(vekt/volum). Forsøk ble foretatt for å preservere hundenyrer for transplantering ved perfusjon med de ovennevnte væsker ved 5 til 8°C ved en perfusjons-strømningshastighet på 15 til 18 ml/g/time i 2\ timer under oksygenering med en oksygenholdig gass <*>(95%02» 5%C02> ved en s^rømnings-hastighet på 300 til 500 ml/minutt. Ved å anvende 5 hunder pr. gruppe ble de preserverte nyrer autotransplantert. På den 7. dag efter autotransplanteringen, ble den kontralaterale, normale nyre hos hver hund tatt ut, og de påfølgende over-levelsesdager for hver hund ble tellet. Når en hund overlevet i 4 uker eller lenger, ble overføringsoverlevelsen antatt å være positiv, fordi i en slik hund holdt efter 2 uker både BUN (blod-urinstoff-nitrogen) og kreatinin-nivåene seg normale og urinering ble iakttatt. Fra de oppnådde data ble den optimale PFC-konsentrasjon i perfusatet bestemt.

Forsøket ble .foretatt på vanlig måte i henhold til følgende prosessforløp:

De oppnådde resultater var som vist i tabell 2.

Som det vil sees av tabell 2, ble en høy grad av overførings-overlevelse oppnådd ved en PFC-konsentrasjon på 7,5 til 12,5%

(vekt/volum). Hvis PFC-konsentrasjonen overstiger 12,5%

(vekt/volum) og når 15% (vekt/volum) ble hematuri iakttatt

i alle tilfeller ved gjenopptagelse av blodstrømmen efter transplantering. To hunder som overlevde i over 2 uker, viste tegn på hematuri i flere dager efter kontralateral nefrektomi og kom seg derefter og overlevde. På grunnlag av de ovenstående resultater ble det konkludert at en perfusjonsvæske regulert til en PFC-konsentrasjon på 10% (vekt/volum) er mest effektiv for perfusjonspreservering av en uttatt nyre.

Forsøkseksempel. 2

Basal saltoppløsning:

Langtids lavtemperatur-perfusjonspreserveringsforsøk

ble foretatt for å velge en egnet basal saltoppløsning. De undersøkte saltoppløsninger var M.C.S, (beskrevet ovenfor), Ringers oppløsning og modifisert Ringers oppløsning (M.R.S.) fremstilt i fremstillingseksempel 1. Perfusjonsvæsker for preservering ble fremstilt ved å sette perfluorkarbon-emulsjonen ifølge Fremstillingseksempel 2 og storfeserum-albuminet til en saltoppløsning slik at den endelige konsentrasjon blir 10% (vekt/volum) av PFC og 6% (vekt/volum) av albumin. Perfusjon ble foretatt på hundenyrer (5 pr. gruppe) ved 5 til 8°C i 72 timer ved å følge fremgangsmåten ifølge Forsøkseksempel 1. Efter transplantering og gjenopptagelse av blodstrømmen, ble undersøkelser foretatt med hensyn til blod-strømmen gjennom nyren, nyrens farve og tone, urinering,

og symptomer efter kontralateral nefrektomi foretatt på den 7. dag efter transplantering. Perfusatet (totalt volum 2000 ml) ble ikke fornyet i løpet av 72 timer med perfusjon, men ble resirkulert med en hastighet på 15-18 ml/g/time. Bortsett fra de tilfeller hvor M.R.S, ble anvendt som basal saltoppløsning, var transplanteringsresultåtene meget ugunstige, og nesten alle forsøksdyrene døde på grunn av akutt nyresvikt i løpet av 10 dager efter den kontralaterale nefrektomi. I de tilfeller hvor M.R.S, ble anvendt som basal saltoppløsning kom derimot alle dyrene seg i alle tilfeller uten komplikasjoner.

Forsøkseksempel 3

Virkning av albumin-konsentrasjon i perfusat på hundenyre: Perfusatene anvendt ved dette forsøk var 10% PFC-emulsjon i modifisert Ringers oppløsning, som ble fremstilt ved å anvende PFC-emulsjon fremstilt i Fremstillingseksempel 6, og inneholdt forskjellige konsentrasjoner av menneskealbumin. Nyrene ble perfusert i 72 timer ved 5 til 8°C under oksygenering med den oksygenholdige gass anvendt i Forsøkseksempel 1,

ved en strømningshastighet på 300 til 500 ml/min. og ble derefter autotransplantert som i Forsøkseksempel 1. Perfusjons-strømningshastigheten ble holdt mellom 15 og 18 ml/g/time under perfusjonen. Den kontralaterale nefrektomi ble utført en uke efter autotransplanteringen.

Resultatene var som vist i tabell 3.

Forsøkseksempel 4

Langtids-lavtemperatur perfusjon av nyre for transplantering: Transplanteringsforsøk på hundenyrer ble utført ved en fremgangsmåte lik den som er beskrevet i Forsøkseksempel 1. Hver nyre ble preservert i 1 uke ved perfusjon ved 5 til 8°C

og en perfusjonsstrømningshastighet på 15 til 18 mg/g/time under oksygenering med gassen ved en strømningshastighet på.

300 til 500 ml/min. Perfusjonsvæsken ble fremstilt ved å anvende M.R.S. ifølge Fremstillingseksempel 1 som basal salt-oppløsning og å tilsette storfeserum-albumin og PFC-

emulsjonen ifølge Fremstillingseksempel 2 eller en PFC-emulsjon fremstilt på samme måte som i Fremstillingseksempel 2, bortsett fra at perfluordekalin ble anvendt istedenfor perfluortributylamin. Konsentrasjonene av albumin og PFC i perfusjonsvæsken var henholdsvis 6% (vekt/volum) og 10%

(vekt/volum). Efter en uke med perfusjonspreservering ble nyrene autotransplantert som i Forsøkseksempel 1. Den kontralaterale nefrektomi ble utført efter en uke fra autotransplanteringen, og symptomer ble iakttatt.

Resultatene var som vist i tabell 4. Plasma-nivåene for kreatinin og BUN for overlevende dyr ble normale efter 3 uker.

Forsøkseksempel 5

Under anvendelse av hundenyrer ble transplantasjons-forsøk utført på samme måte som i forsøkseksempel 1. Hver nyre ble preservert ved 18 til 22°C i 12 eller 24 timer ved perfusjon ved en perfusjonsstrømningshastighet på 40 til 50 ml/g/time under oksygenering med den blandede gass (9 5% 02 - 5% C02) ved en strømningshastighet på 300 til 500 ml/min. Perfusjonsvæsken ble fremstilt ved å anvende M.R.S, ifølge Fremstillingseksempel 1 som basal saltoppløsning og å tilsette PFC-emulsjonen ifølge Fremstillingseksempel 2 og et storfeserumalbumin. Konsentrasjonene av PFC og albumin i perfusjonsvæsken var henholdsvis 10% (vekt/volum) og 6% (vekt/volum). Efter 12 timer eller 24 timer med preservering ble nyrene autotransplantert. Den kontralaterale nefrektomi ble utført en uke efter autotransplanteringen, og symptomene ble iakttatt. I tabell 5 er vist resultatene fra de ovenstående forsøk, sammen med resultatene fra et kontrollforsøk hvor ingen PFC ble tilsatt, og et sammen-ligningsforsøk hvor M.C.S, ble anvendt som basal salt-oppløsning.

Claims

1. Væske for konservering ved perfusjon av et organ beregnet for transplantering, omfattende en Ringers oppløsning hvori er oppløst albumin, minst én emulgert, flytende perfluor-karbonforbindelse og et emulgeringsmiddel, karakterisert ved at konsentrasjonen av kaliumioner i Ringers oppløsning er 8 til 20 mekv./liter.

2. Anvendelse av en væske omfattende en Ringers oppløsning hvori er oppløst albumin og som har en konsentrasjon av kaliumioner på 8-20 mekv./liter, minst 1 emulgert, flytende perfluor-karbonf orbindelse og et emulgeringsmiddel, idet konsentrasjonen av albumin fortrinnsvis er 1-8% (vekt/volum) og av perfluor-karbonforbindelsen 7,5 til 12,5% (vekt/volum) basert på væsken, for konservering ved perfusjon av et organ for transplantering.