Verfahren zur Herstellung von Eisen(III)-komplexverbindungen mit hydriertem Dextran
Die Erfindung bezieht sich auf cin Verfahren zur
Herstellung von wasserlöslichen, nichtionenartigen Komplexverbindungen des dreivertigen Eisens mit hydriertem Dextran. Dem erfindungsgemässen Verfahren kann zusätzlich Zitronensäure oder deren Alkalisalze zugesetzt werden. Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen elgnen sich auf Grund ihrer Eigenschaften zur Anwendung in der Humantherapie und/oder in der Veterinänmedizin zur Bekämpfung von Krankheiten, die im Organismus durch Eisenmangel oder durch Störung des Eisenabsorptionsvermögens auftreten.
Es sind bereits ähnliche Präparate, die Verbindungen des dreiwertigen Eisens und nichthydrierten Dextrans enthalten, bekannt. Diese Präparate, vorzugsweise in Injektionsform hergestellt, finden weitghende Anwendung in der Medizin. Die Toxizität dieser Verbindungen, üblich als DL50 ausgedrückt. beträgt im Mäusetest bei intravenöser Verabreichung etwa 500 bis 700 mg pro 1 kg Lebendgewicht der Versuchstiere, Solche Werte werden von der Pharmakopea USA XVII gefordert.
Ein weiterer Fortschritt auf dem Gebiet der Eisen (III)-Dextran-Komplexverbindungen war die Herstellung von eisenhaltigen Verbindungen des hydrierten Dextrans. Diese Verbindungen behalten dieselben therapeutischen Eigenschaften bei, können aber eine beträchtlich niedrigere Toxizität haben, und sind stabiler in wässrigen Lösungen. Die Herstellung dieser Verbindungen ist jedoch schwieriger als die des nichthydrierten Dextrans, wobei ihre nützlichen Eigenschaften mit dem Herstellungsverfahren verbunden sind.
Nach einem amerikanischen Patent USA Nr. 3 234 209 werden Eisenverbindungen des hyrierten dextrans hergestellt, die eine mehrfach niedrigere Toxizität haben als Ver bindungen des nichthydrierten Dextrans oder als Verbindungen des hydrierten Dextrans, die nach bereits bekannten Verfahren hergestellt wurden (zum Beispiel nach dem Patent USA Nr. 3 022 221 derselben Autoren). Die niedrige Toxizität wird von den Autoren mit 2 ihrem Herstellungsverfahren in Zusammenhang gebracht, und zwar mit der herstellung des zur Komplexbildung nötigen Eisen(III)-hydroxyds, dass durch teilweise Neutralisierung einer Eisensalzlösung mit einer Ammoniaklösung, nachfolgend Dialyse erhalten wird und als dialisierte kolloidale Lösung zur Anwendung kommt.
Nach dem schweizerischen Patent Nr. 39 882 wird die Eisenkomplexverbindung des hydrierten Dextrans durch Elektrodialyse von eisen(III)-salzen erhalten. Bei diesem Verfahren befindet sich die Lösung des hydrierten Dextrans und des Eisen(III)-salzes während der Dialyse im Kathodenraum und eine verdünnte Natriumchloridlösung im Anodenraum des Gerätes. Im Kathodenraum entstehen Bedingungen zur Bildung von kolloidalem Eisen(III)-hydroxyd in Anwesenheit von hydriertem Dextran. Gleichzeitig wird das Anion des ursprünglich gebrauehten Eisensalzes entfernt. Die bei diesem Vorgang entstehende Mischung bildet nach dem Erhitzen eine Komplexvenbindung.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ausgefälltes, abgewaschenes und abfiltriertes Eisen(III)-hydroxyd in feuchtem Zustand mit trockenem hydriertem Dextran, das eine nach Somogyi bestimmte Reduktionskraft im Bereich von 0.02 bis 3,0 hat, zu einer homogenen Masse vermischt wird, diese mischung mit einer Alkalimetallhydroxydlösung alkalisiert und unter Rühren bis zur völligen Wasserlöslichkeit des Endstoffes erhitzt, nachfolgend abgekühlt, filtriert und mit Ionenaustauschern behandelt wird.
Die Methode zur Bestimmung der Reduktionskraft des hydrierten Dextrans nach Somogyi ist in J. Biol.
Chem. band 160, S. 61-68, 1945 beschrieben, und unter Somogyi-Bestimmungsmethode sowie unter Somogyi-Reagens versteht man die von Michael Somogyi in der erwähnten Literaturstelle angegebene Methode und das entsprechende Reagens.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann die niedrigtoxisehe Eisen(III)-kompleksverbindung des hydrierten Dextrans bedeutend einfacher und bllhger hergestellt werden, wobei es vor allem nicht notwendig ist, kolloidales Eisen(III)-hydroxyd als Ausgangs stoff zu verwenden. Dieses Verfahren bedarf keiner Dialyseoder Elektrodialysegeräte, und die Beseitigung dieser Reaktionsschritte erlaubt es insbesondere, die Synthese bei hohen Konzentrationen der Umsatzstoffe auszuführen, was wiederum die Möglichkeit bietet, das Arbeitsvolumen der Apparatur zu verringern. Dabei entfällt die Notwendigkeit, sehr verdüunte Lösungen des Endstoffes einzuengen, wie es bei anderen Methoden vorkommen kann.
Die erfindungsgemäss hergestellten Eisen(III)-kom- plexverbindungen des hydrierten Dextrans haben eine so geringe Toxizität, dass sogar Schwierigkeiten bei der Bestimmung des Wertes DL," entstehen. Die Dosisgrenze ist eher durch die verabreichten Volumina des gelösten Präparates als durch dessen Toxizität bedingt.
Die zur Infektion angefertigten Lösungen des Endstoffes zeigen gewöhnlich nach der Sterilisation weder Spuren von Eisenionen noch Änderungen in ihren Eigenschaften. Es zeigte sich, dass erfindungsgemäss Komplexverbindungen mit inden günstigen Eigenschaften durch Vermischen von ausgefälltem, gewaschenem und filtriertem Eisen(III)-hydroxyd mit trockenem hydriertem Dextran und nachfolgendem Erhitzen d,ieser Mischung in Anwesenheit von Alkalimetallbydroxyden bis zur völligen Wasserlöslichkeit des sich bildenden Endstoffes erhalten werden. Der Endstoff wh'd nachfolgend vom Überschuss des zugegebenen Alkalimetallhydroxdes durch Behandlung mit lonenaustauschern befreit.
Die mit Ionenaustauschern behandelte Lösung kann durch Zusatz der nötigen Mengen von Natriumchlorid zur Herstellung einer isotonischen Lösung, Einstellung der Konzentration des Wirkstoffes, Filtration, Vergiessen der Lösung in die nötigen Behälter und nachfolgende thermischer Sterilisation direkt in die Injektionsform gebracht werden.
Die Lösung kann ferner auf bekannte Weise technischen Operationen unterworfen werden, bei denen das Wasser entfernt und der Endstoff in fester Fonn erhalten wird. Der so erhaltene Endstoff besitzt üblicherweise, nachdem er in Wasser gelöst wird, die gleichen Eigenschaften wie die ursprüugliche Lösung.
Eine gewisse Unbequemlichkeit dieses Verfahrens liegt in der anhaltenden Erhitzungsdauer und der Notwendigkeit ein stark alkalisches Milieu anzuwenden, wie es zur Durchführung des Komplexierungsvorganges notwendige ist. Es zeigte sich, dass die Reaktionszeit bedeutend verkürzt werden kann wenn in die Reaktionsmischung eine Hydroxys äure mft Chelateigenschaften oder ihr Natriumsalz hinzugegeben wird. Von diesen Stoffen erwies sich die Zitronensäure oder deren Na triumsalz insbesondere als günstig.
Es zeigte sich weiterhin, dass der Zusatz eines sol chen Stoffes nicht nur die Bildung der Eisen(III)-kom- plexverbindungen des hydrierten Dextrans beschleunigt und erleichtert, sondern auch die Eigenschaften des erhaltenen Endstoffes verbessert.
Die Lösungen dieser Verbindungen lassen sich schneller filtrieren, sind während der Aufbewahrung beständiger und zeigen in Ampullen keine Neigung zur Bildung von Niederschlägen. Auch fliessen sie von den Glaswänden der Ampullen und Injektionsspritzen, sogar bei hohen Konzentrationen, leichter ab. Die günstigen therapeutischen Eigenschaflen bleiben dabei erhalten.
Es wurde festgestellt, dass es vor allem wesentlich ist, dass das chelatierende Mittel in die Reaktionsini- schung vor dem Erhitzen hinzugegeben wird. Dieses erleichtert die Homogenisierung der Reaktionsmasse und beschleunigt die später einsetzende Bildung der Komplexverbindung. Auf diese Weise verläuft vor al lem die Komplexbildung des Eisens und hydrierten Dextrans ebenso leicht wie bei der Umsetzung mit nichthydriertem Dextran, und die Eigenschaften des Endstoffes sind besser reproduzierbar.
Es wurde festgestellt, dass die Endstoffe, welche vorzugsweise mit einem Natriumzitratzusatz erhalten worden sind, bei nachfolgen der Behandlung mit Kationenaustauschern, im Vergleich zu den Endstoffen, die ohne diesen Zusatz erhalten waren, keinen grösseren Abfall des pH-Wertes und auch keine höhere etlektroly- tische Leitfähigkeit zeigten. Dies weist daraufhin, dass die Zitronensäure mit dem hydrierten Dextran und Eisen eine Art MischLolllplexverbindung bildet, wie das bei den bekannten Misebkomplexen von Eisen, Sorbitol und Zitronensäure, die bereits in der Therapie An wendung finden, der Fall ist.
Es zeigte sich ferner, dass im erfindungsemässen Verfahren mit Erfolg hydriertes Dextran mit einer anderen Charakteristik wie in den bekannten Verfahren angewendet wird.
Erfindungsgemäss werden günstige Resultate erzielt, wenn hydriertes Dextran mit einer nach Somogyi bestimmten Reduktionskraft im Bereich von 0,02 bis 3 % liegt. Unter Redluíktionskraft wird die in Gramm ausgedrückte Menge Glukose in 100 Gramm Dextran verstanden. In den bekannten Verfahren der weiter oben erwähnten Patente hingegen wird die Anwendung von hydriertem Dextran gefordert bei dem das Somogyi-Reagens vollständig unreduziert bleibt. Um diesen Unterschied klarer darzustellen, soll als Beispiel angegeben werden, dass nichthydriertes Dextran von etwa gleichem Molekulargewicht eine Reduktionskraft von etwa 10 O @ hat.
Das Dextran, dass sich im erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von Komplexverbindungen eignet, ist ausser durch die Reduktionskraft vorzugsweise auch durch die Grenzviskosität oder die Viskosität charakterisiert. Die Grenzviskosität, die bei 25 C bestimmt wird, soll insbesondere Werte im Bereich von 0,01 bis 0,2 haben, günstigenfalls von 0,05 bis 0,07.
Zur Herstellung von Eisen(III)-hydroxyd, welches im erfindungsgemässen Verfahren verwendet wird, kann unter Rühren zu der Lösung eines wasserlöslichen Eisensalzes vorzugsweise zur wässrigen Lösung von Eisen (111)-chlorid, stufenweise eine Alkalimetallkarbo.
natlösung hinzugegeben werden. Der Niederschlag von Eisen(III)-hydroxyd wird gewöhnlich mit destilliertem Wasser gewaschen und dekantiert, insbesondere bis zum Verschwinden der gelösten Stoffe in der dekantierten Flüssigkeit. Der Niederschlag kann sodann durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt werden. Das Mengenverhältn von Eisen (III)-hydroxyd zu hydrier tem Dextran kann im erfindungsgemässen Verfahren in einem ziemlich weiten Bereich variieren, vor allem kann die Menge des elementaren Eisens im Endstoff 5 bis 30 S betragen.
Bei Anwendung eines chelatierenden Mittels ist es insbesondere günstig, dieses in einer Menge von 1 bis 10% im Verhältnis zu der zur Um setzung angewandten hydrierten Dextranlmenge, in dieser Phase in die Mischung hineinzugeben.
Die Mischung wird gewöhnlich gerührt, bis sie einen homogenen Zustand erreicht. Sodann wird ein in Wasser gelöstes Alkalimetallhydroxyd hinzugegeben, bis die Mischung eine alkalische Reaktion aufweist.
Die Mischung wird nachfolgend unter Rühren so lange erhitzt, bis Ider Endstoff in Wasser völlig löslich ist.
Die Zeit, die zur Umsetzung nötig ist, beträgt für den Fall, wo kein chelatierendes Mittel zugesetzt wird, gewöhnlich einige Stunden. Bei dem bevorzugten Zusatz von Natriumzitrat kann die Reaktionsdauer etwa 100-150 Minuten betragen.
Die günstige Umsetzungstemperatur liegt vor al'iem im Bereich von 70-100 C.
Aus der Reaktionsmischung wird üblicherweise von Zeit zu Zeit eine Probe entnommen und in einem gro ssen Überschuss von Wasssr gelöst. Sobald die Probe in Wasser klar löslich ist, kann das Erhitzen noch während 10-20 Minuten fortgesetzt werden. Nachfolgend wird die Lösung abgekühlt, filtriert und mit dem Ionenaustauscher behandelt.
Die in die Lösung eingebrachten Alkalimetalle werden gewöhnlich entfernt, indem sie durch eine auf ein Filter oder eine Kolonne gebrachte Schicht eines schwach sauren Kationenaustauschers hindurchgelassen werden. Der Kationenaustauscher kann auch zur Lösung hinzugegeben werden, gerührt und nach gewisser Zeit durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt werden. Die Lösung wird vorzugsweise so lange mit dem Ionenaustauscher behandelt, bis sie einen im Bereich von 5,5-6,6 liegenden pHWWert erreicht hat.
Gleichzeitig sinkt die elektrolytische Leitfähigkeit der Lösung, wobei es günstig ist, diese auf einen Wert von 3 x 10-1 bis 1x10-4(Ohm-1cm-1) bei einer Temperatur von 20 C zu bringen.
Aus der hergestellten Lösung kann nach dem Filtrieren der Endstoff in fester Form gewonnen, oder auch direkt als In,jlektionslösung gebraucht werden. Im ersten Falle kann der Stoff in einem Sprühtrockner direkt getrocknet werden. Der Endstoff kann auch durch Verdampfung des Lösungsmittels im Vakuum oder durch Fällung mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie niedrige Alkohole und Azeton, abgetrennt werden.
Nach der Fällung ist es günstig, die Lösung Ides Endstoffes mit einem Überschuss des organischen Lösungsmittels zu versetzen und den ausgefällten Endstoff zu filtrieren, und im Vakuum zu trocknen.
Der Endstoff kann in Trockenform gelagert wer- den. Nach dem Auflösen in Wasser weist er gewöhnlich die Eigenschaften der ursprünglichen Lösung auf.
Wenn es nicht notwendig ist, den Endstoff in fester Form abzutrennen, so kann die den -Endstoff enthaltende Lösung nach Entmineralisierung, Einstellung der nötigen Eisenkonzentration (auf Grund analytischer Bestimmungen), Zusatz von Natriumchlorid bis zur Isotonie und Klär- oder Entkeimungsfiltration direkt als Injektionslösug erhalten werden. Nach dem Abfüllen der Lösung in geeignete Behälter wie Ampullen, Fläschchen und andere, kann diese in geschlossenen Behältern bei einer Temperatur von 1150 C 30 Minuten lang sterilisiert werden.
Beispiel I
In einen vier Liter fassenden Glaskolben mit Rührer wurden 700 mi einer Eisen(III)-chloridlösung mit einem Eisengehalt von 15 mg Elementareisen pro mi gebracht und fauf 120 C abgekühlt. Getrennt wurde eine Lösung von 33 Gramm wasserfreiem Natriumkar- monat in 1500 ml destilliertem Wasser vorbereitet, filtriert und auf 120 C abgekühlt.
Die NSatriumkarbonatllösunlg wurde unter intensivem Rühren zu der Eisen(III)-chloridlösung im Verlaufe von etwa 60 Minuten eingetropft, his die Suspension den pHJWert 5,9 erreicht hat. Die Suspension des gefällten Eisen(III)-hydroxyds wurde in einen 6 Liter fassenden Glaskolben gebracht, mit destilliertem Wasser auf etwa 6 Liter verdünnt und zum Absetzen des Hydroxyd stehengelassen.
Die Flüssigkeit wurde dekantiert, der Niederschlag erneut mit destilliertem Wasser verdünnt und abermals dekantiert. Weiter wurde analog vorg gangen, bis keine positive Reaktion auf Chlorionen in der dekantierten Flüssigkeit festzustellen war.
Der Nie drerschlalg des Eisen(III)-hydroxyds wurde auf einer Nut- sche im Vakuum filtriert und nachfolgend im feuchten Zustand mit 30 Gramm trockenem hydroertem Dextran mit der Grenzviskosität von 0,058 und ,der Reduktions- kraft von 0,029 % gemischt.
Zu der homogenen Mischung wurden 15 ml einer
10%igen Natriumhydroxydlösung in destilliertem Wasser hinzugegeben und unter stetigem Rühren auf 96 bis 1000 C erhitzt. Nach 60minutigem Erhitzen wurden weitere 7,5 ml einer 10%igen Natriumhydroxydlösung hinzugegeben und der auf Grund der Verdampfung entstandene Wasserverlust ersetzt. Die nach 145 Minuten entnommene Probe war in Wasser völlig klar löslich. D'ie Lösung wurde noch 10 Minuten lang erhitzt, zum Abkühlen stehengelassen und nachfolgend durch einen Sinterfilter der Porengrösse G-3 filtriert.
Die filtrierte Lösung wurde viermal durch eine mit schwach saurem Ionenaustauscher beschickte Kolonne hindurchgelassen (70 mi einer Suspension des Katio nenaustlauschers Amberlit IRC-50 der Firma Rohm und Haas). Sobald die Lösung die elektrolytische Leit fähigkeit 1,28 x 10-3(Ohm-1cm-1) und den pH-Wert 5,6 erreicht hatte, wurde die Entmineralisierung beendet. Die Lösung wurde auf eine Konzentration von 50 mg Elementareisen pro ml verdünnt, mit 0,85 g Nattiumchlorid pro 100 ml Lösung versetzt und nach dem Auflösen durch einen Asbest-Zellulose-Klärfilter- satz von der Dichte K-5 filtriert.
Die Lösung wurde in Ampullen abgefüllt, die Ampullen wurden verschmolzen und im Autoklav 30 Minuten lang bei 1150 C sterilisiert.
Beispiel II
Eisen(III)-hydroxyd wurde auf dieselbe Art und in derselben Menge wie in Beispiel I hergestellt.
Der filtrierte, feuchte Niederschlag des Eisen(III)- hydroxyds wurde mit 36 g hydriertem Dextran mit einer Grenzviskosität von 0.059 und einer Reduktionskraft von 0,020% gründlich durchgemischt. Zu dieser Mischung wurde 1 g Natrium,zitrat hinzugegeben, es wurde gemischt, niachfciigend 20 ml einer 10 % igen Natriumhydroxydlösung hinzugefügt und unter stetigem mechanischem Rühren auf 96 bis 98 C erhitzt.
Nach 45 Minuten wurde eine Probe entnommen, die in Wasser klar löslich war. Nach Ablauf von 55 Minuten wurde das Erhitzen beendet.
Die Lösung wurde abgekühlt durch ein Glasfilter (G-3) filtriert und einige Male durch eine aus 70 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers (Amberlit I'RC-5 < )) in Wasserstoffionenform) bestehende Schicht hindurchgelassen. Sobald die Lösung den Wert 1,28x10-3 (Ohm-1cm-1) und den pH-Wert 5,6 erreicht hatte, wurde die Entionisierung beendet. Die Lösung wurde mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 50 mg Elementareisen pro ml Lösung verdünnt.
Sodann wurden 0,85 g Natriumchlorid pro 100 ml Lösung hinzugegeben, und nach dem Auflösen des Na triumchlorids wurde die Lösung durch einen Asbest Zellulose¯Klärfiltersatz K-5 filtriert. Die Lösung wurde in Ampullen abgefüllt, die Ampullen wurden verschmolzen und 30 Minuten lang im Autoklav bei 115 C sterilisiert.
Beispiel lll
Eisen(III)-hydroxyd und die Eisen (III)-komplexver- bindung des reduzierten Dextrans wurden nach dem in Beispiel II beschriebenen Verfahren hergestellt. Dazu wurden 30 g hydriertes Dextran mit der Grenzviskosität 0,059 und der Reduktionskraft 2,8% angewendet, zu dem 1,5 g Natriumzitrat zugesetzt wurde.
Nach der Entionisierung und Filtration der Lösung wurde der Endstoff als Trockenpulver durch Trocknung in einem Sprühtrockner erhalten. Die Eingangstemperatur der zur Trocknung benutzten Luft betrug 130 C und die Sprühturbine hatt eine Geschwindigkeit von etwa 15000 Umdrehungen/Minute. Es wurde ein bräunlichrotes, leicht wasserlösliches Pulver mit einem Gehalt von 28,6% komplexartig gebundenem Eisen erhalten. Es war möglich, aus diesem Pulver Lösungen mit identischen Eigenschaften als die der ursprün,glichen Lösung herzustellen.
Beispiel Iv
In einem Glaskolben mit Rührer und Tropftrichter wurden 1400 ml Eisen(III)-chloridlösung mit einem Gesamteisengehalt von 21,8 g gegeben und auf 12 C abgekühlt. Zu der mechanisch gerührten Eisen (III)-chloridlösung wurden im Verlauf von etwa 50 Minuten 2500 ml einer auf die gleiche Temperatur abgekühlte Natriumkarbonatlösung mit etwa 63 g Natriumkarbonatfeststoffgehalt hinzugegeben. Sobald die Suspension den pH-Wert 5,5 erreicht hat, wurde das Eintropfen beendet. Der Niederschlag wurde dreimal mit destilliertem Wasser durch Dekantieren gewaschen und im Vakuum filtriert. Der feuchte, filtrierte Niederschlag des Eisen(III)-hydroxyds wunde mit 84 g hydriertem Dextran mit der Grenzviskosität 0,055 und Reduktionskraft 2,32% gründlich durchgemischt.
Zu der Mischung wurden zuerst 4 g in 20 ml destilliertem Wasser gelöstes Natriumzitrat und dann 24 ml einer 10% eigen Lösun g von Natriumhydroxyd hinzugegeben.
Die mischung wurde unter mechanischem Rühren 25 Minuten lang erhitzt, bis die Temperatur 75 C erreichte, und bei dieser Temperatur hielt man 15 Minuten lang. Nachher wurde die Temperatur stufenweise erhöht, um nach 25 Minuten eine Temperatur von 95 C zu erreichen. Eine zu dieser Zeit entnommene Probe des Endstoffes war in Wasser völlig löslich. Die Mischung wurde noch weitere 15 Minuten lang bei einer Temperatur von 98 C erhitzt und nachher zum Abkühlen stehengelassen.
Nach dem Filtrieren wurde die Lösung viermal durch 90 ml einer Kationenaustauscherschicht aus Amberlit IRC-50 , bis der pH-Wert 6,0 erreicht wurde, hindurchgelassen. Die Lösung wird wie in Beispiel I in eine Injektionsform gebracht und sterilisiert.