CH404591A - Verfahren zur Gewinnung von Streptokinase - Google Patents

Description

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    Verfahren      zur      Gewinnung   von    Streptokinase   Das    vorliegende      Verfahren      betrifft   die    Gewinnung   von    Streptokinase.   Insbesondere bezieht es sich auf    Massnahmen   zur Erzielung hoher Ausbeuten an    Streptokinase   auf    biologischem   Wege. 



  Das Wachstum von Bakterien ist von vielen Faktoren abhängig. Eine    wesentliche   Rolle spielen die Zusammensetzung des, Nährbodens, der den    jeweili-      gen      Bedürfnissen   des    Bakterienstoffwechsels   angepasst    sein   muss, der    pH-Wert   des Mediums,,    der   zu    Beginn.   der    Züchtung   für das    Bakterienwachstum      optimal      sein,   muss, und    die      Konstanthaltung   der    Was-      serstoffionenkonzentration   bei    Bakterien,

     die durch Verbrauch des    Nährmediums   eine Veränderung des    pH-Wertes      herbeiführen.   So ist es z. B. bei der Züchtung von    Streptokokken,      insbesondere   des    allgemein   zur    Streptokinasebildung   verwendeten    Stammes   H 46 A notwendig,    dass   die durch die    Vergärung   des Zuckers    entstandenen      Säuren   laufend    neutralisiert   werden, um so das    Bakterienwachstum      nicht   zu    be-      einträchtigen.   



  Bei gegebenen    Nährböden   und optimalen    pH-Be-      dingungen      ist   das Wachstum eines    Bakteriums   aber noch von anderen    Bedingungen   abhängig, so z. B.    von,   der Art    der      Vorkultur.   Das    Wachstum      wird   nach    allgemein      bekannten.   Gesetzen    durch   die Zahl der in der    Einsaatkultur      befindlichen   besonders vermehrungsfähigen Keime    beeinflusst.   Es müssen zur    Ein-      saat   nach    Möglichkeit      Kulturen   verwendet werden,

      die   zahlreiche lebende Keime    enthalten.   



  Bei    Erfüllung      dieser      Vorbedingungen   erfolgt    dann   im    allgemeinen   das    Bakterienwachstum   entsprechend einer    logarithmischen   Kurve, was sich durch Trübungsmessungen laufend verfolgen lässt. 



     Die   Bildung biologisch    aktiver      Substanz   durch    Bakterien   erfolgt in    unterschiedlicher      Weise.   Bei manchen Keimen, z. B. Tetanus Bakterien,    findet   zu- nächst eine Speicherung im    Bakterienleib   statt, so dass erst nach    längerer      Bebrütungs.zeit   durch Zerfall der    abgestorbenen   Bakterien das    Endotoxin   frei und in der Nährlösung nachweisbar wird. Andere Bakterien dagegen, z.

   B.    Diphtherie-Bakterien,      sezernie-      ren   laufend biologisch    wirksame   Produkte, so    dass      diese   sich bereits kurz nach Beginn des Wachstums in zunehmendem Masse im    Kulturmedium   feststellen lassen. 



  Wie bereits    erwähnt,      wird   das Wachstum von    Bakterien,   bei konstantem    Nährmilieu   auch durch die Art der Einsaat    mitbestimmt.   Bei    vielen.      Versuchen   mit    streptokinasebildenden      Streptokokkenstämmen   fiel aber bisher auf, dass sich    trotz      gleichartiger   Einsaat    Schwankungen      im      Höchstwert   der gebildeten    Streptokinasemengen      einstellten,   obwohl das    Wachs-      tum   selbst nur wenig    gestört   war. 



  Es    wurde   nun    gefunden,      dass      man   bei der Gewinnung von    Streptokinase   zu    besonders      hohen.   Ausbeuten gelangt, wenn    man   für die Produktion in der    Hauptkultur      eine      Vorkultur      eines      streptokinasebilden-      den      Streptokokkenstammes      verwendet,      deren   Alter durch    Vorversuch      als   für die    Streptokinasebildung   in der Hauptkultur besonders günstig festgestellt    wurde.   



     Gegenstand   der    Erfindung   ist    demnach   ein    Ver-      fahren   zur    biologischen      Gewinnung   besonders    hoher      Streptokinasemengen,      welches   dadurch    gekennzeich-      net   ist,    dass   man    für   die Produktion in der Hauptkultur    eine      Vorkultur   eines    streptokinasebildenden      Streptokokkenstammes      verwendet,   deren Alter so zu    bemessen   ist,

   dass es im Bereich des    Maximums   der    StreptokinaserAusbeutekurve   in einem    Ausbeute/Vor-      kulturbebrütungszeit-Diagramm   liegt. 



     Insbesondere   wurde    gefunden,   dass es    günstig   ist, wenn man    eine   etwa 7 bis 9 Stunden alte    Vorkultur   

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 eines    streptokinasebildenden      Streptokokkenstammes   für die    Produktion   in der Hauptkultur verwendet. 



  Man    kann   zu    diesem   Zweck z. B.    das      Wachstum      von      Streptokokken   des    Stammes   H 46 A durch    Trü-      bungsmessungen      in.   der    Vorkultur   laufend verfolgen und zu    bestimmten      Zeiten,   also    in      bestimmten      Phasen   der    logarithmischen      Kurve,

     durch    Abimpfen   auf    frisches      Kulturmedium   Hauptkulturen    anlegen.   Die    günstigsten   Ausbeuten    wurden.   in dem Bereich    der      optischen      Dichten   von =    0,200-0,335   erhalten, wobei    das      Maximum:   
 EMI2.34 
 bei 0;275 liegt. Diese Phase wurde    in      der   Regel    zwischen.      61/z   und    91i2   Stunden beobachtet.

   Bei längerer    Bebzütungszeit   der    Vorkultur,   bei der    die      optische   Dichte    über      EX=1zömft   = 0,335    liegt,      nimmt   die    Fähigkeit   zur    Streptokinase-      bildung      der   in der    Hauptkultur   wachsenden    Strepto-      kokken   stark ab. In den    Hauptkulturen   kann wiederum die Wachstumskurve    ermittelt   und die    Strepto-      kinasebildung   laufend    verfolgt   werden. 



     Das   Kurvenblatt    zeigt   das    Ergebnis   des    erfin-      dungsgemässen.      Verfahrens   in graphischer    Darste#l-      lung.   Die    Kurve   I    ergab   sich aus den Trübungswerten oder sogenannten optischen Dichten    (0D)   in der Vorkultur nach    Verdünnung   1:5.    Die      Kurve      II      stellt   die optimalen    StreptokinaserWerte      verschiedener   Hauptkulturen dar, die zu    entsprechenden      Zeiten   mit der    Vorkultur      beimpft   waren. 



     Mit      Hilfe   dieser Methode der    rechtzeitigen   Übertragung der    Vorkultur   auf    die   Hauptkultur    gelingt      es   also,    maximale      Streptokinasemengen   zu erhalten. 



  Beispiel    Streptokokken   vom    streptokinasebildendenStamm   H 46 A werden in    Blutagarröhrchen   bei 37  C gezüchtet. Nach 24 Stunden    werden   von 4    Röhrchen   die    vermehrten      Keime   mit    einer   durch    pankreatische   Verdauung von    Rinderfleisch      hergestellten      Bouillon      (Mer   thode    Pops,   C. G. und M.

   L.    Smith,   J.    Path.      Bact.   35, 573, 1932)    steril      abgespült,      in   10    Liter   der gleichen Bouillon    übergeführt   und bei 37  C    bebrütet,   bis die    optische   Dichte E    _      ä      @t   = 0,28    erreicht   war.

   Das war nach 8 Stunden der Fall.    Diese   als    Vorkultur   her zeichnete Lösung wurde in 80 Liter    Müller-Medium      (WHO,      techn.      Rep.      Ser.      61,      46,      1953),      das      noch   2    %   Glucose    enthält,   gegeben, bei 37  C    erwärmt   und    un-      ter      vorsichtigem,   gegebenenfalls    automatischem.,

        mit      einem      Autotitrator   auszuführenden    Nachtitrieren   mit 1 n    Natronlauge   auf    einem      pH-Wert   von 7,0 bis 7,8    gehalten,.   Die so behandelte    Kulturlösung      lieferte   eine    Streptokinaseausbeute   von 620    Einheiten/ml      Kultur-      flüssigkeit.  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur biologischen Gewinnung besonders hoher Streptokinasemengen, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Produktion in der Hauptkultur eine Vorkultur eines streptokinasebildenden Streptokok- kenstammes verwendet, deren Alter so zu bemessen ist, dass es im Bereich des Maximums der Strepto- kinase-Ausbeutekurve in einem Ausbeute/Vorkultur- bebrütungszeit-Diagramm liegt.

   UNTERANSPRÜCHE Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn- zeichnet, dass man eine etwa 7 bis 9 Stunden alte Vorkultur eines streptokinasebildenden Streptokok- kenstammes für die Produktion in der Hauptkultur verwendet.