Verfahren zur Herstellung von N-Acylverbindungen der 6-Amino-penicillansäure
In der Schweiz. Patentschrift Nr. 382 373 ist ein Verfahren zur Herstellung von 6-Amino-penicillansäure der Formel
EMI1.1
beschrieben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein 6-Amino-penicillansäure erzeugender Schimmelpilz in einem Nährmedium kultiviert wird. Weiterhin beschreibt das Patent Massnahmen zur Isolierung der derart hergestellten 6-Amino-penicillans äure aus der Fermentationsflüssigkeit durch Ionenaustausch sowie die Herstellung zahlreicher Acylierungsprodukte der genannten Säure, wobei letztere durch direkte Umsetzung der im Nährmedium gebildeten, 6-Aminopenicillansäure oder gegebenenfalls nach Isolierung der letzteren aus der Nährlösung mittels des beanspruchten Ionenaustauschverfahrens erfolgen kann.
Das vorliegende Patent betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von Acylierungsprodukten der 6-Amino-penicillansäure, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man 6-Amino-penicillansäure mit einem Carbonsäurechlorid- oder -bromid, einem Sulfonsäurechlorid, einem Chlorcarbonsäureester, einem Carbonsäureanhydrid oder einem gemischten Anhydrid von Carbonsäuren umsetzt. Die 6-Aminopenicillansäure kann z.B. nach dem in der obengenannten Patentschrift beschriebenen Fermentationsverfahren hergestellt werden. Sie kann jedoch auch auf andere Weise erhalten werden.
Die zu wählende Temperatur bei der Acylierung sollte normalerweise 300 nicht überschreiten. In vielen Fällen ist Zimmertemperatur eine geeignete Reaktionstemperatur. Da stark saure oder alkalische Bedingungen zu vermeiden sind, werden vorzugsweise bei der Kultivierung pH-Werte von 6 bis 9 angewandt, was leicht durch Verwendung von Puffern, z.B.
Natriumbicarbonat- oder Natriumphosphatpufferlösungen, erreicht wird.
Beispiel 1
Eine Brut von Penicillium chrysogenum 5 120C (erhalten von E. B. Chain, Istituto Superiore die Sanita, Roma) wurde vorerst auf einer Glycerin Molasse-Agar-Schicht während 7 Tagen bei 260 gezüchtet. Die erhaltenen Keime wurden durch Waschen mit sterilen destilliertem Wasser entfernt und eine keimhaltige Suspension erhalten, die zur Inoculierung von 100 ml eines Kulturmediums, das in einer 500 ml konischen Flasche enthalten war, verwendet wurde.
Die Flasche und ihr Inhalt war vorgängig mit Dampf unter Druck in einem Autoklaven sterilisiert worden.
Das verwendete Kulturmedium entsprach der folgenden Zusammensetzung:
Gewichtsprozent
Wasser 100
Kornbrühflüssigkeit 8 Flüssige Glucose, zu 6
Das pH des Mediums war auf einen Wert von 5,2 bis 5,3 durch Zugabe einer Lösung von Natriumhydroxyd eingestellt worden. Die verwendete flüssige Glucose stellte eine Mischung aus Kohlehydraten, bestehend im wesentlichen aus Maltose, Glucose und niedrigmolekularen Dextrinen dar. Die inoculierte Flasche wurde während 48 Stunden bei einer konstanten Temperatur von 260 auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die einen Ausschlag von 3,4 cm zeigte und die mit 250 U/Min. arbeitete, geschüttelt.
Nach der beendigten Zeitdauer von 48 Stunden hatten sich in der Flasche eine wesentliche Menge an Mycelium gebildet. Die erhaltene Kultur wurde hierauf zur Inoculierung eines synthetischen Fermentationsmediums verwendet, ohne Zugabe von sogenannten Precursoren . Das verwendete Fermentationsmedium enthielt die folgende Zusammensetzung:
Gewichtsprozent
Wasser 100,0
Lactose 4,0
Glucose 2,0
Ammoniumlactat 0,5
Ammoniumacetat 0,3
KH2PO4 0,3 Na.2SO4 0,05 FeSO4 0,01 MgSO4.7H2O zu 7 0,025 ZnSO4 7 H2O 0,002
MnSO4 0,002 CaCl2 zu 2 2H2O 0,005 CuSO4 5 H2O 0,0005 CaCO3 1,0
Das pH des Fermentationsmediums betrug ungefähr 6.
Die Fermentation wurde in einer Flasche auf einer Schüttelmaschine bei 260 vorgenommen.
Nach Beendigung der 96stündigen Fermentationszeit wurde das erhaltene Mycelium von der Fermen tationsbrühe abfiltriert und die erhaltene Fermenta tionsflüssigkeit mit Phosphorsäure auf ein pH von 3 angesäuert und einmal mit der Hälfte ihres Volumens mit Butylacetat bei 50 extrahiert, wobei die meisten vorhandenen Penicilline entfernt wurden.
Die extrahierte Fermentationsflüssigkeit wurde mit Natriumhydroxydlösung neutralisiert und nach der bekannten Cup-plate-Methode unter Verwendung von B. subtilis als Bacterium getestet.
Eine Portion von 50 ml der extrahierten Fermentationsflüssigkeit wurde durch Zugabe von festem Natriumbicarbonat auf ein pH von 8 gebracht und bei 0 gerührt, während eine Lösung von 0,5 g Phenoxyacetylchlorid in Aceton im Laufe von wenigen Minuten zugegeben wurde. Die Mischung wurde während einer Stunde bei 0 gerührt, abfiltriert, und der Überschuss an Reagens durch Extraktion mit 3 Portionen Äther entfernt. Die Ätherextrakte wurden ihrerseits mit Wasser gewaschen und die Waschwässer der Hauptlösung zugegeben, wonach diese durch Zugabe von Salzsäure auf ein pH von 6-7 gestellt wurde.
Testversuche der erhaltenen wässrigen Lösung (die ein Volumen von 65 ml betrug) wurden gemäss oben angegebener Methode ausgeführt und es zeigte sich, dass das erhaltene Phenoxymethyl-penicillin eine beträchtliche antibiotische Wirksamkeit aufweist, die für das gesamte Volumen an Flüssigkeit 11mal grösser war, als die Ausgangslösung. Die Testversuche waren die folgenden:
Wirksamkeit (internationale Einheit) Extrahierte Fermentations flüssigkeit (Volumen 50 ml) 650 Reaktionsprodukt (Volumen 65 ml) 7,150
Mittels Papierchromatographie konnte festgestellt werden, dass das antibiotische in der wässrigen Lösung vorhandene Material einen Rf-Wert der gleichen Grössenordnung zeigte, wie Penicillin V, wobei die Stabilität der wässrigen Lösung bei einem pH-Wert 2 ebenfalls ähnlich derjenigen von Penicillin V war.
Beispiel 2
Das Beispiel 1 wurde unter Verwendung Phenylacetylchlorid anstelle von Phenoxyacetylchlorid wiederholt.
Sowohl die extrahierte Fermentationsflüssigkeit als auch die wässrige Lösung des Reaktionsproduktes wurden gemäss der Methode wie in Beispiel 1 beschrieben mit den folgenden Resultaten geprüft:
Wirksamkeit (internationale Einheit) Extrahierte Fermentations flüssigkeit (Volumen 50 ml) 350 Reaktionsprodukt (Volumen 65 ml) 8,125
Man ersieht hieraus, dass die Wirksamkeit 23mal grösser war, als die bei der Reaktion mit Phenylacetylchlorid.
Mittels Papierchromatographie konnte festgestellt werden, dass das in der wässrigen Lösung vorhandene Benzylpenicillin einen Rf-Wert der gleichen Grössenordnung zeigte, wie Penicillin G, wobei die Stabilität der wässrigen Lösung bei einem pH-Wert 2 ebenfalls ähnlich derjenigen von Penicilliit G war.
Beispiel 3
Beispiel 1 wurde wiederholt, indem a-Naphthylacetylchlorid anstelle von Phenylacetylchlorid verwendet wurde.
Sowohl die extrahierte Fermentationsflüssigkeit als auch die wässrige Lösung des Reaktionsproduktes wurden gemäss der Methode wie in Beispiel 1 beschrieben mit den folgenden Resultaten geprüft:
Wirksamkeit (internationale Einheit) Extrahierte Fermentations flüssigkeit (Volumen 50 ml) 700 Reaktionsprodukt (Volumen 56 ml) 4,032
Man ersieht hieraus, dass die Wirksamkeit 5mal grösser war, als die bei der Reaktion mit a-Naphthylacetylchlorid.
Beispiel 4
Beispiel 1 wurde wiederholt, indem ss-Naphthoxy- acetylchlorid anstelle von Phenylacetylchlorid verwendet wurde.
Die Resultate des Testens gemäss der Methode des Beispiels 1 zeigen, dass die Wirksamkeit nach der Reaktion mit fl-Naphthoxyacetylchlorid 5mal grösser war als vor der Reaktion.
Wirksamkeit (internationale Einheit) Extrahierte Fermentations flüssigkeit (Volumen 50 ml) 700 Reaktionsprodukt (Volumen 66 ml) 4,092
Beispiel 5
Beispiel 1 wurde wiederholt, indem a-Chlorphenylacetylchlorid anstelle von Phenylacetylchlorid verwendet wurde.
Sowohl die extrahierte Fermentationsflüssigkeit als auch die wässrige Lösung des Reaktionsproduktes wurden gemäss der Methode wie in Beispiel 1 beschrieben mit den folgenden Resultaten geprüft:
Wirksamkeit (internationale Einheit) Extrahierte Fermentations flüssigkeit (Volumen 50 ml) 700 Reaktionsprodukt (Volumen 62 ml) 5,332
Man ersieht hieraus, dass die Wirksamkeit 7mal grösser war, als die bei der Reaktion mit a-Chlorphenylacetylchlorid.