BRPI1013482B1

BRPI1013482B1 - Método para produzir um composto

Info

Publication number: BRPI1013482B1
Application number: BRPI1013482-4A
Authority: BR
Inventors: Yutaka Kitagawa; Makoto Imai
Original assignee: Daiichi Sankyo Company, Limited
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2021-04-13
Also published as: HK1166495A1; EP2412700A4; BRPI1013482A2; KR20110133568A; BRPI1013482B8; KR101674700B1; JP5610600B2; EP2412700B1; EP2412700A1; CA2756750C; TW201041830A; WO2010110361A1; JP2014001208A; IL215357A0; HUE031770T2; US8324425B2; CN102356061B; IL215357A; TWI462893B; US20120071685A1

Abstract

método para pruduzir um composto. è revelado um método para produzir um composto que apresenta uma excelente atividade com um ligante #2#. è especificamente revelado um método para produzir um composto representado pela fórmula geral (i), ou sal do mesmo, por meio de resolução óptida. na fórmula (i), r1 representa um átomo de hidrigênio ou um grupo alquila c1-6 e r2 representa um átomo de hidrogênio ou um protetor de carbóxi.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001]A presente invenção diz respeito a um derivado de Y-aminoácido bicíclico ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. Particularmente, a presente invenção diz respeito a um composto com atividade como um ligante de α2δ e afinidade com relação à subunidade do canal de cálcio α2δ dependente de tensão, ou um método para produzir o mesmo.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[0002] Os compostos que exibem ligação de alta afinidade com a subunidade do canal de cálcio α2δ dependente de tensão mostraram ser eficientes para tratar, por exemplo, dor neuropática (ver, por exemplo, literaturas não relacionadas à patente 1 e 2). Neste contexto, a dor neuropática refere-se a dor crônica causada por lesão do tecido nervoso ou similares, e é uma doença que prejudica significativamente a qualidade de vida de maneira tal que os pacientes sofrem de depressão em virtude de ataques severos de dor.

[0003] Vários tipos de ligantes de α2δ são atualmente conhecidos como medicamentos terapêuticos para tal dor neuropática. Exemplos de ligantes de α2δ incluem gabapentina e pregabalina. Os ligantes de α2δ tais como estes compostos são usados para tratar epilepsia e dor neuropática, ou similares (por exemplo, literatura de patente 1).

[0004] Entretanto, foi relatado que, por exemplo, com relação à gabapentina, sua eficácia no tratamento de neuralgia pós-herpética é aproximadamente 60 % de acordo com a própria avaliação dos pacientes (ver, por exemplo, literatura não associada à patente 3) e que com relação à pregabalina, sua eficácia no tratamento de neuropatia diabética dolorosa é aproximadamente 50 % de acordo com a própria avaliação dos pacientes (ver, por exemplo, literatura não associada à patente 4).

[0005] Outros compostos são revelados, por exemplo, em literaturas de patente 2, 3 e 4. LISTA DE CITAÇÃO Literatura de patente: Literatura de patente 1: Publicação internacional WO 04/006836. Literatura de patente 2: Publicação internacional WO 99/21824. Literatura de patente 3: Publicação internacional WO 01/28978. Literatura de patente 4: Publicação internacional WO 02/085839. Literatura não associada à patente: Literatura não associada à patente 1: J Biol. Chem. 271 (10): 5768-5776, 1996. Literatura não associada à patente 2: J Med. Chem. 41: 1838-18445, 1998. Literatura não associada à patente 3: Acta Neurol. Scand. 101:359-371, 2000. Literatura não associada à patente 4: Drugs 64 (24): 2813-2820, 2004.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema técnico

[0006] É um objetivo da presente invenção fornecer um método para produzir um derivado de Y-aminoácido bicíclico com excelente atividade como um ligante de α2δ e um intermediário para produzir o mesmo, e sais destes.

Solução do problema

[0007] A presente invenção será descrita a seguir.

[0008] (1) Um método para produzir um composto representado pela fórmula geral (I), ou um sal do mesmo, por resolução óptica:

em que cada substituinte é definido da maneira a seguir: R1: um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila C1-C6, e R2: um átomo de hidrogênio ou um grupo protetor para o grupo carbóxi, o método compreendendo: dissolver uma mistura de compostos representada pelas fórmulas gerais (II), (III), (IV) e (V) e um ácido orgânico opticamente ativo em um solvente:

e então depositar um cristal.

[0009] Além do mais, os aspectos da presente invenção são preferivelmente da maneira mostrada a seguir.

[00010] (2) O método para produzir um composto representado pela fórmula geral (I), ou um sal do mesmo, de acordo com (1), em que R1 é um átomo de hidrogênio, um grupo metila ou um grupo etila.

[00011] (3) O método para produzir um composto representado pela fórmula geral (I), ou um sal do mesmo, de acordo com (1) ou (2), em que R2 é um grupo t-butila.

[00012] (4) O método para produzir um composto representado pela fórmula geral (I), ou um sal do mesmo, de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que o ácido orgânico opticamente ativo é qualquer ácido orgânico ativo selecionado do grupo a seguir:

[00013] ácido D-mandélico, ácido L-mandélico, ácido Di-p-toluoil-L- tartárico, N-Boc-L-prolina, ácido (R)-a-metoxifenilacético, ácido O-acetil-L- mandélico, ácido Di-benzoil-L-tartárico, ácido O-acetil-D-mandélico, N-Boc- L-alanina, ácido (S)-2-(6-metóxi-2-naftil)propiônico, ácido diacetil-L- tartárico, ácido L-tartárico, ácido L-málico, ácido L-piroglutâmico, ácido (+)- canfórico, ácido (S)-2-metilglutâmico, ácido (+)-3-bromocanfor-8-sulfônico, ácido (-)-mentoxiacético e ácido (S)-2-fenóxipropiônico.

[00014] (5) O método para produzir um composto representado pela fórmula geral (I), ou um sal do mesmo, de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o solvente é qualquer solvente selecionado do grupo a seguir:

[00015] acetonitrila, acetato de etila, tolueno e ciclopentil metil éter.

[00016] Além disso, a presente invenção também inclui um método de produção mostrado a seguir.

[00017] (6) Um método para produzir um composto representado pela fórmula geral (X) ou um sal do mesmo:

em que cada substituinte é definido da maneira a seguir: R1: um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila C1-C6, o método compreendendo: desproteger um grupo protetor com relação ao grupo carbóxi em um composto representado pela fórmula geral (I) produzido por um método de produção de acordo com (1), ou realizar esta desproteção e formar adicionalmente um ácido ou um sal.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[00018] O método de produção de acordo com a presente invenção pode fornecer um derivado de Y-aminoácido bicíclico com excelente atividade como um ligante α2δ, um intermediário para produzir o mesmo, ou os sais destes.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[00019] Um "grupo alquila C1-C6" refere-se a um grupo alquila linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbono e inclui grupos metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila, isopentila, 2- metilbutila, neopentila, 1-etilpropila, hexila, isoexila, 4-metilpentila, 3- metilpentila, 2-metilpentila, 1-metilpentila, 3,3-dimetilbutila, 2,2- dimetilbutila, 1,1-dimetilbutila, 1,2-dimetilbutila, 1,3-dimetilbutila, 2,3- dimetilbutila e 2-etilbutila.

[00020] Uma vez que um composto representado pela fórmula geral (I), ou similar, com grupos amino e carboxila na estrutura, forma um sal por meio da reação com um ácido ou uma base, um "sal" ou um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a este sal.

[00021] Na nomenclatura dos compostos na presente especificação, "*" representa que tal composto com átomos de carbono assimétricos assim indicado é uma mistura racêmica. Entretanto, a indicação "(1S*,5R*,6R*)-" pode representar sua relação em termos da configuração relativa.

[00022] O composto representado pela fórmula geral (I), ou similar, quando deixado no ar ou recristalizado, pode se associar com a água adsorvida, por meio da adsorção de água, para formar um hidrato. Um hidrato como este também é incluído pelo sal da presente invenção.

[00023] Exemplos de um "grupo protetor para o grupo carbóxi" incluem grupos metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, t-butila, hexila, bromo-terc-butila, tricloroetila, benzila, p-nitrobenzila, o-nitrobenzila, p-metoxibenzila, p-t-butilbenzila, acetoximetila, propioniloximetila, butiriloximetila, isobutiriloximetila, valeriloximetila, pivaloiloximetila, acetoxietila, acetoxipropila, acetoxibutila, propioniloxietila, propioniloxipropila, butiriloxietila, isobutiriloxietila, pivaloiloxietila, hexanoiloxietila, isobutiriloximetila, etilbutiriloximetila,dimetilbutiriloximetila, pentanoiloxietila, metoxicarboniloximetila, etoxicarboniloximetila, propoxicarboniloximetila, t-butoxicarboniloximetila, metoxicarboniloxietila, etoxicarboniloxietila, isopropoxicarboniloxietila, t- butildimetilsilila, trimetilsilila, metoximetila, etoximetila, propoximetila, isopropoximetila, (2-metiltio)-etila, 3-metil-2-butenila, 5-indanila e 3- ftalidila. O grupo protetor é preferivelmente um grupo t-butila.

[00024] O grupo carboxila no composto representado pela fórmula geral (I) pode ser desprotegido por um método comum para desproteger grupos carbóxi, por exemplo, um método descrito em T.W. Greene e P.G. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis (3rd ed., 1999)", para produzir um composto representado pela fórmula geral (X).

[00025] O composto representado pela fórmula geral (X), ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, exibe atividade como um ligante α2δ e afinidade com a subunidade do canal de cálcio α2δ dependente de tensão, e é usado como um ingrediente ativo em uma composição farmacêutica usada para tratar e/ou prevenir dor, envolvimento do sistema nervoso central e outros distúrbios.

[00026] Uma composição farmacêutica que compreende o composto com o fórmula geral (X), ou o sal farmaceuticamente aceitável deste, quando administrada a mamíferos (por exemplo, humanos, cavalos, vaca, ou porcos, preferivelmente humanos), é administrada sistemicamente ou localmente por meio de uma via oral ou parenteral.

[00027] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparada de uma forma apropriada selecionada de acordo com o método de administração, por métodos de preparação usados em geral para várias preparações.

[00028] As formas da composição farmacêutica para administração oral incluem comprimidos, pílulas, pós, grânulos, cápsulas, soluções, suspensões, emulsões, xaropes e elixires. A composição farmacêutica em uma forma como esta é preparada de acordo com um método padrão selecionando apropriadamente, de acordo com a necessidade, aditivos entre excipientes, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, agentes espessantes, auxiliares de espessamento, agentes de revestimento, plastificantes, estabilizadores, anti-sépticos, antioxidantes, agentes de coloração, solubilizadores, agentes de suspensão, emulsificantes, adoçantes, conservantes, tampões, diluentes, agentes de umectação, etc., usados em geral.

[00029] As formas da composição farmacêutica para administração parenteral incluem injeções, emplastros, géis, cremes, cataplasmas, adesivos, aerossóis, inaladores, aspersões, colírios, gotas nasais e supositórios. A composição farmacêutica em uma forma como esta é preparada de acordo com um método padrão selecionando apropriadamente, de acordo com a necessidade, aditivos entre estabilizadores, anti-sépticos, solubilizantes, umectantes, conservantes, antioxidantes, saborizantes, agentes de gelificação, agentes de neutralização, solubilizadores, tampões, agentes de tonicidade, agentes tensoativos, agentes de coloração, agentes de tamponamento, espessantes, agentes de umectação, agentes de preenchimento, promotores de absorções, agentes de suspensão, aglutinantes, etc., usados em geral.

[00030] A dose do composto com a fórmula geral (X), ou o sal farmaceuticamente aceitável deste, difere dependendo dos sintomas, idade, peso corporal, etc., e é, para administração oral, 1 a 2.000 mg, preferivelmente 10 a 600 mg (em termos de quantidade do composto) por dose em um adulto humano (peso corporal: aproximadamente 60 Kg) e, para administração parenteral, 0,1 a 1.000 mg, preferivelmente 1 a 300 mg (em termos de quantidade do composto) por dose em um adulto.

Exemplos Preparação do exemplo

[00031] 5 g do composto com a fórmula geral (X), 90 g de lactose, 34 g de amido de milho, 20 g de celulose cristalina e 1 g de estearato de magnésio são misturados usando um misturador e então comprimidos usando uma máquina compressora para obter um comprimido.

[00032] Exemplo teste 1 - Construção de plasmídeo de expressão de gene da subunidade do canal de cálcio α2δ1 humano (daqui por diante referido como Cacna2d1 humano), e preparação de fração de membrana celular que expressa Cacna2d1 humano

a) Construção de plasmídeo de expressão de Cacna2d1 humano pRK/hCacna2d1 a-1) Preparação de fragmento de DNA

[00033] O gene humano Cacna2d1 foi obtido como dois fragmentos, os fragmentos da primeira metade e da segunda metade. A PCR foi realizada usando uma biblioteca de DNAc (QUICK-Clone cDNA Human Brain (Clontech Laboratories, Inc.)) como um molde e uma enzima KOD polimerase (TOYOBO CO., LTD.), de acordo com o protocolo incluído nesta enzima. Os oligonucleotídeos iniciadores de PCR usados foram, para o fragmento da primeira metade, oligonucleotídeos iniciadores com as sequências a seguir: Oligonucleotídeo iniciador 1: 5'-agctgcggcc gctagcgcca ccatggctgg ctgcctgctg gc-3' (SEQ ID NO: 1), e Oligonucleotídeo iniciador 2: 5'-attaggatcg attgcaaagt aataccc-3' (SEQ ID NO: 2); e Para o fragmento da segunda metade, oligonucleotídeos iniciadores com as sequências a seguir: Oligonucleotídeo iniciador 3: 5'-aatgggtatt actttgcaat cgatcc-3' (SEQ ID NO: 3), e Oligonucleotídeo iniciador 4: 5'-agtcggatcc tcataacagc cggtgtgtgc tg-3' (SEQ ID NO: 4) obtidos da SIGMA GENOSYS. A reação de PCR foi realizada tanto para os fragmentos da primeira metade quanto para os da segunda metade usando um termociclador (GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Inc.)), por meio de um processo que envolve aquecimento a 94°C por 1 minuto, e então 35 termociclos (94°C por 15 segundos, 60°C por 30 segundos e 68°C por 2 minutos), colocando a 68°C por 5 minutos e resfriando a 4°C.

[00034] Estes dois produtos de reação foram purificados usando um kit de purificação de produto de PCR (kit de purificação de PCR MiniElute (QIAGEN)), de acordo com o protocolo incluído neste kit. O fragmento da primeira metade obtido foi digerido com uma enzima de restrição Not1 (TOYOBO CO., LTD.). O fragmento da segunda metade foi digerido com enzimas de restrição Cla1 (TOYOBO CO., LTD.) e BamH1 (TOYOBO CO., LTD.). Subsequentemente, estes fragmentos foram purificados usando um kit de purificação de produto de reação (kit MiniElute Reaction Cleanup (QIAGEN)), de acordo com o protocolo incluído neste kit.

a-2) Preparação do vetor

[00035] O sítio de multiclonagem (daqui por diante referido como MCS) de um vetor de expressão pRK5 para células animais (BD Pharmingen) mudou para o MCS de um vetor pBluescript 2 (STRATAGENE) para preparar um vetor. Especificamente, pRK5 foi tratado com enzimas de restrição Cla1 (TOYOBO CO., LTD.) e Hind3 (TOYOBO CO., LTD.), e ambas as extremidades deste DNA foram então transformadas em extremidades cegas usando o fragmento Klenow (TAKARA BIO INC.). Ambas estas extremidades foram adicionalmente desfosforiladas usando fosfatase alcalina intestinal de bezerro (daqui por diante referida como CIAP; TAKARA BIO INC.), e o fragmento foi então purificado usando o kit MiniElute Reacion Cleanup (QIAGEN). A seguir, este DNA tratado com enzima foi eletroforizado em gel de agarose a 1,0 %. Após a eletroforese, o gel foi corado com brometo de etídio. A seguir, uma porção da banda que corresponde a aproximadamente 4,7 kbp foi separada em irradiação UV usando uma lâmina. O DNA foi extraído a partir desta usando um kit de extração/purificação de gel (kit de extração de gel MiniElute (QIAGEN)), de acordo com o protocolo incluído neste kit.

[00036] Para obter um fragmento de DNA que corresponde ao MCS de pBluescript 2, o pBluescript 2 foi tratado com enzimas de restrição Sac1 (TOYOBO CO., LTD.) e Kpn1 (TOYOBO CO., LTD.), e ambas as extremidades deste DNA foram então transformadas em extremidades cegas usando o fragmento Klenow (TAKARA BIO INC.). A seguir, este DNA tratado com enzima foi eletroforizado em gel de agarose a 2,0 %. Após a eletroforese, o gel foi corado com brometo de etídio. A seguir, uma porção da banda que corresponde a aproximadamente 100 bp foi separada em irradiação UV usando uma lâmina. O DNA foi extraído a partir desta usando um kit de extração/purificação de gel (kit de extração de gel MiniElute (QIAGEN)), de acordo com o protocolo incluído neste kit.

[00037] O fragmento de DNA obtido e o pRK5 já clivado foram ligados usando um kit de ligação de DNA (TAKARA BIO INC.), de acordo com o protocolo incluído no kit. Com este produto de reação, as células competentes de E. COLI DH5α (TOYOBO CO., LTD.) foram transformadas para obter colônias resistentes à ampicilina. Algumas das colônias foram coletadas, e as colônias coletadas foram então cultivadas. A partir das células bacterianas obtidas, um plasmídeo foi extraído e analisado com relação à sua sequência de nucleotídeos usando um sequenciador de DNA (Model 3700 (Applied Biosystems, Inc.)) para confirmar a introdução da sequência de MCS no pRK5. Neste contexto, um vetor no qual quando observa-se que promotor CMV está localizado à montante a sequência de MCS foi incorporada, de maneira tal que foi orientada em uma direção à jusante da maneira a seguir: 5'-ccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgat accgtcgacctcgagggggggcccg-3' (SEQ ID NO: 5), foi designado como pRK- SK, e um vetor no qual a sequência de MCS foi incorporada em uma orientação oposta a esta foi designado como pRK-KS.

a-3) Construção do plasmídeo

[00038] O pRK-SK obtido no parágrafo a-2) foi tratado com uma enzima de restrição Xba1 (TOYOBO CO., LTD.), e ambas as extremidades do DNA foram transformadas em extremidades cegas usando o fragmento Klenow (TAKARA BIO INC.). O DNA com extremidade cega foi digerido adicionalmente com uma enzima de restrição Not1 (TOYOBO CO., LTD.) e purificado da mesma maneira como no parágrafo a-2). Este pRK-SK tornado assim linear e o fragmento da primeira metade de DNA do gene humano Cacna2d1 obtido no parágrafo a-1) foram eletroforizados em gel de agarose a 1,0 %, e DNAs de aproximadamente 4,7 kbp e aproximadamente 1,5 kbp foram extraídos a partir do gel e purificados da mesma maneira como no parágrafo a-2). Os dois DNAs obtidos foram ligados da mesma maneira como no parágrafo a-2), e E. COLI foi transformada com o produto de ligação. A partir dos clones de E. COLI obtidos, um plasmídeo foi extraído e analisado com relação à sua sequência de nucleotídeos usando um sequenciador de DNA (Model 3700 (Applied Biosystems, Inc.)) para confirmar a introdução da sequência representada por SEQ ID NO: 6 aqui. A seguir, o plasmídeo obtido foi tratado com enzimas de restrição Cla1 (TOYOBO CO., LTD.) e BamH1 (TOYOBO CO., LTD.), e o tratamento e purificação com CIAP foram realizados da mesma maneira como no parágrafo a-2). Este DNA plasmidial tornado assim linear e o fragmento da segunda metade de DNA do gene humano Cacna2d1 obtido no parágrafo a-1) foram eletroforizados em gel de agarose a 1,0 %, e DNAs de aproximadamente 6,2 kbp e aproximadamente 1,8 kbp foram extraídos a partir do gel e purificados da mesma maneira como no parágrafo a-2). Os dois DNAs obtidos foram ligados da mesma maneira como no parágrafo a-2), e E. COLI foi transformada com o produto de ligação. A partir dos clones de E. COLI obtidos, um plasmídeo foi extraído e analisado com relação à sua sequência de nucleotídeos usando um sequenciador de DNA (Model 3700 (Applied Biosystems, Inc.)) para confirmar a introdução da sequência representada por SEQ ID NO: 7 no vetor pRK-SK. O plasmídeo obtido foi designado como pRK/hCacna2d1.

b) Obtenção de linhagem celular 293 que expressa Cacna2d1 humano

[00039] As células 293 foram transfectadas com o plasmídeo de expressão de Cacna2d1 humano pRK/hCacna2d1 construído no parágrafo a), e uma linhagem celular que expressa estavelmente Cacna2d1 humano foi obtida com a expressão de proteína de Cacna2d1 humano como um índice. Especificamente, 2x106 células 293 foram inoculadas em uma placa de Φ6 cm e cultivadas por 12 horas. A seguir, as células foram co-transfectadas com 5 μg de pRK/hCacna2d1 e 0,5 μg de um plasmídeo de expressão do gene resistente à neomicina, pSV2neo (Clontech), usando um reagente de transfecção Lipofectamine Plus (Invitrogen Corp.) de acordo com o protocolo incluído com o reagente.

[00040] As células assim transfectadas foram coletadas, a seguir inoculadas em uma placa de Φ15 cm após a diluição e cultivadas por 2 semanas em DMEM (Invitrogen Corp.) suplementado com soro fetal bovino a 10 % (Cansera International, Inc.) e 500 μg/mL de G418 (Invitrogen Corp.). As células resistentes à neomicina que formaram colônias satisfatoriamente foram isoladas. Após a expansão da cultura, as células foram coletadas e o lisado celular foi avaliado por ensaio Western para obter uma linhagem celular 293 que expressa Cacna2d1 humano. No ensaio Western, os anticorpos anti-hCacna2d1 (Chemicon Inc.) foram usados como anticorpos primários.

c) Preparação de fração de membrana celular de célula 293 que expressa Cacna2d1 humano

[00041] As células 293 que expressam Cacna2d1 humano obtidas no parágrafo b) foram cultivadas em grande escala em DMEM (Invitrogen Corp.) suplementado com soro fetal bovino a 10 % (Cansera International, Inc.) e 500 μg/mL de G418 (Invitrogen Corp.), e as células foram coletadas. Um inibidor da protease (sem EDTA completo (Roche Applied Science)) foi adicionado em uma quantidade recomendada pelo reagente em um tampão de ensaio de ligação (MOPS 10 mM (pH 7,4), HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM) para preparar um tampão de prepraração de fração de membrana. As células coletadas foram lavadas com o tampão de preparação de fração de membrana e então homogeneizadas usando um ultrassonicador. A seguir, o homogeneizado foi centrifugado a 12.000 rpm a 4°C por 1 hora usando uma centrífuga. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi suspenso no tampão de preparação de fração de membrana. O procedimento da ultrassonicação usando um ultrassonicador para a suspensão do precipitado após a centrifugação foi repetido adicionalmente três vezes, e a suspensão obtida foi usada como uma fração de membrana celular que expressa Cacna2d1 humano. O nível total de proteínas contidas na fração da membrana foi calculado a partir da absorbância de UV em um comprimento de onda de 280 nm.

Exemplo teste 2 - Construção do sistema de detecção para a reação de ligação entre Cacna2d1 e gabapentina (daqui por diante referida como GBP), e detecção de atividades inibitórias da ligação de Cacna2d1/GBP dos compostos teste. a) Construção de sistema de detecção para reação de ligação entre Cacna2d1 e GBP

[00042] A fração de membrana celular que expressa Cacna2d1 humano e GBP marcada com um radioisótopo 3H (daqui por diante referida como 3H- GBP; Tocris Cookson Ltd.) foram diluídas com um tampão de ensaio de ligação (MOPS 10 mM (pH 7,4), HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM ) em uma concentração final de 2,5 mg/mL em termos do nível de proteína total e uma concentração final de 3H-GBP 4,5 nM, respectivamente, para preparar 120 μL de uma solução de reação que foi mantida a 4°C por 3 horas. Este produto de reação foi adicionado aos poços de uma placa de filtro (UniFilter 350 GF/B (Whatman)) e filtrado por meio de filtro. A seguir, um procedimento de lavagem que envolve a adição de 350 μL de um tampão de ensaio de ligação (MOPS 10 mM (pH 7,4), HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM ) e filtração por meio do filtro foram repetidos três vezes. A placa de filtro foi completamente seca, e a parte inferior foi selada. Após a adição de 50 μL de Microscint 20 (PerkinElmer Inc.), a superfície superior também foi selada e a radiação derivada do radioisótopo 3H que permaneceu no filtro foi contada usando TopCount (PerkinElmer Inc.). A partir do valor obtido, um valor obtido adicionando GBP não marcada (SIGMA-ALDRICH INC.) em uma concentração final de 20 μM ao presente ensaio foi subtraído como aquele derivado de adsorção não específico, e o valor obtido foi usado como o nível de ligação específico de 3H-GBP em Cacna2d1 (unidade: "contagem").

b) Detecção de atividades inibitórias de ligação de Cacna2d1/GBP dos compostos teste

[00043] Cada composto teste foi adicionado em várias concentrações para o ensaio de detecção da reação de ligação do Cacna2d1/GBP construído no parágrafo a), e o nível de ligação foi medido pelo método descrito no parágrafo a). A seguir, com o nível de ligação específico de Cacna2d1/GBP obtido pela adição do composto em uma concentração de x nM, que é definido como "nível de ligação [x]", e a taxa inibitória de ligação de Cacna2d1/GBP em vez de ser definida como "taxa inibitória [x]", a taxa inibitória (%) foi determinada com base na equação a seguir: Taxa inibitória [x] (%)=(1-(nível de ligação [x]/nível de ligação [0]))x100, em que o nível de ligação [0] refere-se ao nível de ligação de 3H-GBP obtido sem a adição do composto.

[00044] A taxa inibitória foi representada graficamente contra a concentração. A partir deste resultado um "valor IC50" foi calculado, que é a concentração do composto teste necessário para inibir 50 % de da ligação de Cacna2d1/GBP. Exemplo de produção 1 Ácido [6-(Aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acetic

(1-a) ácido (2E)-Hepta-2,6-dienóico

[00045] 4-Pentenal (4,45 g, 51,4 mmol) e ácido malônico (6,41 g, 61,6 mmol) foram dissolvidos em piridina (9,9 mL). À solução, foi adicionada piperidina (1,9 mL) e a mistura foi então agitada a 90°C por 5 horas. A mistura resfriou naturalmente e então se tornou acídica pela adição de ácido clorídrico 2 N, seguido por extração com dietil éter. A camada orgânica foi lavada com salina saturada e seca com sulfato de magnésio anidro, e o filtrado foi então concentrado em pressão reduzida. O resíduo foi destilado em pressão reduzida para obter o composto de interesse como uma substância oleosa sem cor (3 mmHg, 110-116°C, 3,27 g, 50 %).

[00046] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 2,21-2,26 (2H, m), 2,322,37 (2H, m), 5,01-5,08 (2H, m), 5,75-6,87 (2H, m), 7,03-7,11 (1H, m).

(1-b) Acetato de terc-butil biciclo[3,2.0]hept-3-en-6-ila

[00047] Cloreto de oxalila (10 mL) foi adicionado gota a gota a uma solução de ácido (2E)-Hepta-2,6-dienóico (3,27 g, 25,9 mmol) em tolueno (60 mL) com resfriamento no gelo. A mistura foi agitada por 20 minutos, a seguir removida do banho de gelo, e gradualmente aquecida à temperatura ambiente. Após agitação por 50 minutos, a solução de reação foi agitada por 1 hora em aquecimento para refluxo. A solução resfriou naturalmente, e o solvente foi então destilado em pressão reduzida. Ao resíduo, foi adicionado mais tolueno, e o solvente foi então destilado novamente em pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em tolueno (20 mL), e esta solução foi adicionada gota a gota por 1 hora em uma solução de trietilamina (9,19 g, 91 mmol) em tolueno (20 mL) aquecido antecipadamente para 90°C. Após a finalização da adição gota a gota, a mistura foi aquecida adicionalmente com agitação por 2 horas. A solução de reação foi resfriada, a seguir diluída com salina saturada e água e filtrada por meio de Celite. O filtrado foi separado em camadas orgânicas e aquosas. A camada orgânica foi então lavada com ácido clorídrico 1N, a seguir seca com sulfato de magnésio e filtrada. O filtrado foi adicionado a uma solução de reação preparada antecipadamente a partir de uma solução de dimetoxifosforilacetato de terc-butila (5,98 g, 25,9 mmol) em dimetoxietano (20 mL) e hidreto de sódio (>65 % de óleo, 986,7 mg, 25,9 mmol), e a mistura foi agitada por 1,5 hora. À solução de reação, uma solução aquosa saturada de cloreto de amônio, salina saturada e água foi adicionada nesta ordem, e a solução de reação foi submetida à extração com acetato de etila. A camada orgânica foi seca com sulfato de magnésio anidro e então filtrada. O solvente foi destilado em pressão reduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para obter o composto de interesse como uma substância oleosa amarela (1,73 g, 32 %, mistura E/Z).

[00048] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: Isômero principal: 1,45 (9H, S), 2,29-2,35 (1H, m), 2,62-2,71 (2H, m), 2,89-2,98 (1H, m), 3,27-3,35 (1H, m), 3,92 (1H, amplo), 5,47-5,49 (1H, m), 5,80-5,87 (2H, m).Isômero secundário: 1,49 (9H, s), 2,42-2,48 (1H, m), 2,62-2,71 (2H, m), 2,89-2,98 (2H, m), 4,34-4,36 (1H, m), 5,37-5,38 (1H, m), 5,61-5,64 (2H, m).

(1-c) Acetato de terc-butil [6-(nitrometil)biciclo[3,2.0]hept-3-en-6-ila]

[00049] Acetato de terc-butil biciclo[3,2.0]hept-3-en-6-ila (1,73 g, 8,39 mmol) foi dissolvido em nitrometano (10 mL). À solução, 1,8- diazabiciclo[5,4.0]undec-7-eno (1,3 mL, 8,4 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora e então aquecida com agitação em 50 a 60°C por 5 horas. A mistura resfriou naturalmente e foi então diluída com ácido clorídrico 1N e salina saturada, seguido por extração com acetato de etila. A seguir, a camada orgânica foi seca com sulfato de magnésio anidro, e o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para obter o composto de interesse como uma substância oleosa sem cor (1,98 g, 89 %).

[00050] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 1,45 (9H, s), 1.53 (1H, dd, J=7,5, 12,9 Hz), 2,17 (1H, d, J=15,2 Hz), 2,31 (1H, ddd, J=2,4, 8,6, 12,1 Hz), 2,47 (2H, s), 2,52-2,58 (1H, m), 2,87 (1H, quint, J=7,5 Hz), 3,25-2,66 (1H, m), 4,78 (1H, d, J=11,4 Hz), 4,87 (1H, d, J=11,4 Hz), 5,65-5,67 (1H, m), 5,95 (1H, dd, J=1,6, 5,9 Hz).

(1-d) Acetato de terc-butil [6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-

[00051] Acetato de terc-butil [6-(nitrometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (1,98 g, 7,41 mmol) foi dissolvido em etanol (20 mL) e água (10 mL). À solução, foram adicionados pó de ferro (2,07 g, 37,0 mmol) e cloreto de amônio (392,7 mg, 7,41 mmol) e a mistura foi agitada por 4,5 horas em aquecimento para refluxo. A mistura resfriou naturalmente, a seguir foi diluída com salina saturada, uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e acetato de etila, e filtrada por meio de Celite para remover o material insolúvel. O filtrado foi separado em camadas orgânicas e aquosas. A camada orgânica foi lavada com salina saturada e então seca com sulfato de magnésio anidro. A seguir, o solvente foi destilado em pressão reduzida para obter o composto de interesse como um sólido amarelo claro (1,99 g, este composto foi usado diretamente na reação a seguir sem ser purificado).

[00052] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 1,39-1,49 (1H, m), 1,44 (9H, s), 1,97 (1H, ddd, J=2,8, 9,0, 11,7 Hz), 2,14 (1H, dd, J=2,3, 16,8 Hz), 2,25 (1H, d, J=13,7 Hz), 2,32 (1H, d, J=13,7 Hz), 2,47-2,55 (1H, m), 2,75 (1H, quint, J=7,4 Hz), 2,88 (2H, s), 2,98-2,99 (1H, m), 5,77-5,79 (1H, m), 5,87-5,89 (1H, m).

(1-e) ácido [6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acético

[00053] Uma solução 4N de ácido clorídrico em acetato de etila (10 mL) foi adicionada em acetato de terc-butil [6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3- en-6-ila] (0,99 g, 4,17 mmol), e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. A seguir, o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo foi suspenso pela adição de diclorometano. À suspensão, foi adicionada trietilamina gota a gota e o pó resultante foi coletado por filtração. O pó obtido foi lavado com diclorometano e então seco em pressão reduzida para obter o composto de interesse como um pó branco (211,6 mg, 35 %).

[00054] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 1,49 (1H, dd, J=7,6, 12,5 Hz), 2,06 (1H, ddd, J=2,6, 7,6, 12,5 Hz), 2,17 (1H, dd, J=2,6, 16,8 Hz), 2,49 (2H, s), 2,48-2,56 (1H, m), 2,86 (1H, quint, J=7,6 Hz), 3,15-3,16 (1H, m), 3,18 (1H, d, J=12,7 Hz), 3,22 (1H, d, J=12,7 Hz), 5,75-5,78 (1H, m), 5,915,93 (1H, m). Exemplo de produção 2 Cloridrato de ácido [6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acetic

[00055] Água (5 mL) e uma solução 4N de ácido clorídrico em 1,4- dioxano (22 mL) foram adicionadas ao ácido 6- (aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acético (320,2 mg, 1,77 mmol), e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 5 minutos. O solvente foi destilado em pressão reduzida. Ao resíduo, foi adicionado 1,4-dioxano e a mistura foi aquecida e a seguir resfriada naturalmente em temperatura ambiente. O pó resultante foi coletado por filtração. O pó obtido foi lavado com 1,4-dioxano e então seco para obter o composto de interesse como um pó branco (350.0 mg, 92 %).

[00056] RMN-1H (400 MHz, CD3OD): δ ppm: 1,51 (1H, dd, J=7,6, 12,7Hz), 2,16 (1H, ddd, J=2,8, 7,6, 15,6 Hz), 2,19 (1H, dd, J=2,2, 16,8 Hz), 2,51 (2H, s), 2,53-2,59 (1H, m), 2,89 (1H, quint, J=7,6 Hz), 3,18-3,19 (1H, m), 3,33 (1H, d, J=13,3 Hz), 3,37 (1H, d, J=13,3 Hz), 5,70-5,73 (1H, m), 5,976,00 (1H, m). Exemplo de produção 3 Benzenossulfonato de ácido [6-(Aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6- il]acetic

[00057] O ácido 6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acético (152,2 g, 391 mmol) foi dissolvido em 2-propanol (7,5 mL) e água (2,6 mL). À solução, ácido benzenossulfônico mono-hidratado (305,2 mg, 1,73 mmol) foi então adicionado e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 5 minutos. O solvente foi destilado em pressão reduzida, seguido por desidratação azeotrópica adicional com 2-propanol. A seguir, o resíduo foi lavado com 2-propanol para obter o composto de interesse como um pó branco (260,4 mg, 55 %).

[00058] RMN-1H (400 MHz, CD3OD): δ ppm: 1,51 (1H, dd, J=7,4, 12,7 Hz), 2,12-2,21 (2H, m), 2,51 (2H, s), 2,51-2,59 (1H, m), 2,89 (1H, quint , J=7,4 Hz), 3,17-3,18 (1H, m), 3,32 (1H, d, J=13,3 Hz), 3,36 (1H, d, J=13,3 Hz), 5,69-5,71 (1H, m), 5,97-6,00 (1H, m), 7,40-7,46 (3H, m), 7,80-7,84 (2H, m). Exemplo de produção 4 Ácido [6-Aminometil-3-metilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acetic

(4-a) Enoato de 4-metil-3-hidroxiept-6-metila

[00059] O hidreto de sódio (>63 % de óleo, 1,64 g, 43,1 mmol) foi adicionado em uma solução de metil 3-oxopentanoato (5,10 g, 39,2 mmol) em tetraidrofurano (50 mL) com resfriamento no gelo e a mistura foi agitada neste estado por 10 minutos. À solução de reação, n-butilítio (solúção 1,66 M em hexano, 25,9 mL, 43,1 mmol) foi adicionado gota a gota, e a mistura foi agitada adicionalmente por 10 minutos com resfriamento no gelo. A seguir, brometo de alila (5,18 g, 43,1 mmol) foi adicionado a esta, e a mistura foi agitada neste estado por 30 minutos e a seguir agitada adicionalmente por toda a noite em temperatura ambiente. À solução de reação, ácido clorídrico 1N e salina saturada foram adicionados, seguido por extração com dietil éter. A camada orgânica foi lavada com salina saturada e seca com sulfato de magnésio anidro e o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo obtido foi dissolvido em metanol (100 mL). À solução, boroidreto de sódio (1,89 g, 50 mmol) foi adicionado com resfriamento no gelo, e a mistura foi agitada neste estado por 1,5 hora. O ácido clorídrico 2 N (50 mL) foi adicionado a esta e a mistura foi agitada por 30 minutos. A seguir, salina saturada foi adicionada a esta, seguido por extração com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com salina saturada e então seca com sulfato de magnésio anidro, e o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para obter o composto de interesse como uma substância oleosa amarela (5,72 g, 85 %, mistura de diastereômeros).

[00060] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 0,89-0,94 (3H, m), 1,581,75 (1H, m), 1,91-2,03 (1H, m), 2,21-2,33 (1H, m), 2,43-2,56 (2H, m), 3,72 (3H, s), 3,84-4,00 (1H, m), 5,01-5,07 (2H, m), 5,74-5,84 (1H, m).

(4-b) Ácido 4-metil-3-hidroxiept-6-enóico

[00061] Enoato de 4-metil-3-hidroxiept-6-metila (5,72 g, 33,2 mmol) foi dissolvido em uma solução 2N de hidróxido de potássio em metanol (50 mL) e a solução foi agitada por toda a noite em temperatura ambiente. A partir da solução de reação, o solvente foi destilado em pressão reduzida. Ao resíduo, uma solução de hidróxido de sódio aquoso 1N foi então adicionada seguido por extração com dietil éter. A camada aquosa se tornou acídica pela adição de ácido clorídrico concentrado com resfriamento no gelo, seguido por nova extração com dietil éter. A camada orgânica foi lavada com salina saturada e seca com sulfato de magnésio anidro. A seguir, o solvente foi destilado em pressão reduzida para obter o composto de interesse como uma substância oleosa amarela (2,21 g, 42 %, misturas de diastereômeros).

[00062] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 0,90-0,94 (3H, m), 1,641,74 (1H, m), 1,93-2,00 (1H, m), 2,24-2,32 (1H, m), 2,45-2,61 (2H, m), 3,874,03 (1H, m), 5,03-5,08 (2H, m), 5,75-5,83 (1H, m).

(4-c) Acetato de terc-butil 3-metilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila

[00063] O ácido 4-metil-3-hidroxiept-6-enóico (2,21 g, 13,9 mmol) foi dissolvido em anidrido acético (14 mL). À solução, foi adicionado acetato de potássio (3,29 g, 33,4 mmol), e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. A solução de reação foi aquecida em 110 a 120°C e agitada por 3,5 horas. À solução de reação, água gelada e tolueno foram então adicionados e esta mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi separada em camadas aquosas e orgânicas pela adição de salina saturada e tolueno. A seguir, a camada orgânica foi lavada com uma solução de hidróxido de sódio aquoso 1N e salina saturada nesta ordem, a seguir seca com sulfato de magnésio anidro e então filtrada. O filtrado foi adicionado em uma solução de reação preparada adicionando hidreto de sódio (>63 % de óleo, 533,3 mg, 14,0 mmol) a uma solução de dimetoxifosforilacetato de terc- butila (3,24 g, 14,5 mmol) em tetraidrofurano (20 mL) com resfriamento no gelo, e a mistura foi agitada por mais 1,5 hora. A solução de reação foi separada em camadas aquosas e orgânicas pela adição de uma solução aquosa saturada de cloreto de amônio e salina saturada. A camada aquosa foi submetida à extração com acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, a seguir lavadas com salina saturada e então secas com sulfato de magnésio anidro. O solvente foi destilado em pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para obter o composto de interesse como uma substância oleosa amarela (1,21 g, 40 %, mistura E/Z).

[00064] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm:Isômero principal: 1,45 (9H, s), 2,11-2,22 (4H, m), 2,59-2,71 (2H, m), 2,87-2,97 (1H, m), 3,26-3,34 (1H, m), 3,87 (1H, amplo), 5,22-5,23 (1H, m), 5,45-5,47 (1H, m).Isômero secundário: 1,49 (9H, s), 2,11-2,21 (4H, m), 2,43-2,46 (1H, m), 2,59-2,70 (1H, m), 2,75-2,83 (1H, m), 2,87-2,97 (1H, m), 4,29 (1H, amplo), 5,36 (1H, s), 5,59 (1H, s).

(4-d) Acetato de terc-butil [3-metil-6-(nitrometil)biciclo[3.2.0]hept-3- en-6-ila]

[00065] O acetato de terc-butil 3-metilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila (1,21 g, 5,50 mmol) foi dissolvido em nitrometano (7 mL). À solução, foi adicionado 1,8-diazabiciclo[5,4.0]undec-7-eno (0,91 mL, 6,0 mmol) e a mistura foi aquecida com agitação em 50 a 60°C por 6 horas. A mistura resfriou naturalmente e uma solução aquosa saturada de di-hidrogenofosfato de potássio foi então adicionada a esta, seguido por extração com acetato de etila. A seguir, a camada orgânica foi seca com sulfato de magnésio anidro e o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para obter o composto de interesse como uma substância oleosa sem cor (1,14 g, 74 %).

[00066] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 1,45 (9H, s), 1,53 (1H, dd, J=7,6, 12,9 Hz), 1,80 (3H, s), 2,04 (1H, d, J=16,4 Hz), 2,29 (1H, ddd, J=2,8, 7,6, 12,9 Hz), 2,47 (2H, s), 2,49 (1H, dd, H=7,6, 16,4 Hz), 2,86 (1H, quint, J=7,6 Hz), 3,21-3,22 (1H, m), 4,74 (1H, d, J=11,7 Hz), 4,84 (1H, J=11,7 Hz), 5,25 (1H, s).

(4-e) Acetato de terc-butil [6-aminometil-3-metilbiciclo[3.2.0]hept-3- en-6-ila]

[00067] O acetato de terc-butil [3-metil-6-(nitrometil)biciclo[3.2.0]hept- 3-en-6-ila] (1,12 g, 3,99 mmol) foi dissolvido em etanol (20 mL) e água (10 mL). À solução, foram adicionados pó de ferro (892,8 mg, 15,9 mmol) e cloreto de amônio (211,5 mg, 3,99 mmol) e a mistura foi agitada por 4 horas em aquecimento para refluxo. A mistura resfriou naturalmente a seguir foi diluída com salina saturada, uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e acetato de etila, e filtrada por meio de Celite para remover o material insolúvel. O filtrado foi separado em camadas orgânicas e aquosas. A camada orgânica foi lavada com salina saturada, a seguir seca com sulfato de magnésio anidro e o solvente foi então destilado em pressão reduzida. Ao resíduo, foi adicionada uma solução 4N de ácido clorídrico em acetato de etila (5 mL) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. A seguir, o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo foi suspenso em diclorometano. À suspensão, foi adicionada gota a gota trietilamina e o pó resultante foi coletado por filtração, a seguir lavado com diclorometano e então seco para obter o composto de interesse como um pó branco (105,8 mg, 28 %).

[00068] RMN-1H (400 MHz, CD3OD): δ ppm: 1,40 (1H, dd, J=7,6, 12,3 Hz), 1,79 (3H, s), 2,02-2,08 (2H, m), 2,43-2,50 (1H, m), 2,45 (1H, d, J=16.2 Hz), 2,51 (1H, d, J=16.2 Hz), 2,85 (1H, quint, J=7,6 Hz), 3,05-3,12 (1H, m), 3,13 (1H, d, J=13,0 Hz), 3,17 (1H, d, J=13,0 Hz), 5,36 (1H, t, J=1,6 Hz).Exemplo de produção 5 ácido [ 6-aminometil-3 -etilbiciclo [ 3.2.0]hept-3-en-6-il] acetic

(5-a) Enoato de 4-etil-3-hidroxiept-6-etila

[00069] O hidreto de sódio (>63 % de óleo, 2,09 g, 55 mmol) foi adicionado em uma solução de 3-oxoexanoato de etila (7,91 g, 50 mmol) em tetraidrofurano (50 mL) com resfriamento no gelo, e a mistura foi agitada neste estado por 10 minutos. À solução de reação, foi adicionado gota a gota n-butilítio (solução em hexano 1,58 M, 34,8 mL, 55 mmol) e a mistura foi agitada adicionalmente por 10 minutos com resfriamento no gelo. A seguir, brometo de alila (4,7 mL, 55 mmol) foi adicionado a esta e a mistura foi agitada neste estado por 1 hora e a seguir agitada novamente em temperatura ambiente por 4 horas. À solução de reação, foram adicionados ácido clorídrico 1N e uma solução aquosa saturada de cloreto de amônio, seguido por extração com n-pentano. A camada orgânica foi lavada com salina saturada e seca com sulfato de magnésio anidro e o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo obtido foi dissolvido em etanol (80 mL). À solução, foi adicionado boroidreto de sódio (1,51 g, 40 mmol) com resfriamento no gelo e a mistura foi agitada neste estado por 2 horas. O ácido clorídrico 1N (50 mL) foi adicionado a esta e a mistura foi agitada por 30 minutos. A seguir, salina saturada foi adicionada a esta, seguido por extração com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com salina saturada e então seca com sulfato de magnésio anidro, e o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para obter o composto de interesse como uma substância oleosa amarela (3,64 g, 37 %, mistura de diastereômeros).

[00070] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 0,91 (3H, t, J=7,5 Hz), 1,28 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,43-1,55 (2H, m), 1,98-2,28 (2H, m), 2,45-2,48 (2H, m), 2,88-2,93 (1H, m), 4,07-4,10 (1H, m), 4,10-4,20 (2H, m), 5,01-5,09 (2H, m), 5,75-5,86 (1H, m).

(5-b) ácido 4-etil-3-hidroxiept-6-enóico

[00071] O enoato de 4-etil-3-hidroxiept-6-etila (3,64 g, 18,2 mmol) foi dissolvido em uma solução 2N de hidróxido de potássio em metanol (120 mL) e a solução foi agitada por toda a noite em temperatura ambiente. A partir da solução de reação, o solvente foi destilado em pressão reduzida. Ao resíduo, foi então adicionada uma solução de hidróxido de sódio aquoso 1N (200 mL) seguido por extração com dietil éter. A camada aquosa se tornou acídica pela adição de ácido clorídrico concentrado com resfriamento no gelo seguido por nova extração com dietil éter. A camada orgânica foi lavada com salina saturada e seca com sulfato de magnésio anidro. A seguir, o solvente foi destilado em pressão reduzida para obter o composto de interesse como uma substância oleosa amarela (3,14 g, <100 %, mistura de diastereômeros).

[00072] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 0,91-0,96 (3H, m), 1,391,52 (3H, m), 2,01-2,28 (2H, m), 2,52-2,55 (2H, m), 4,05-4,15 (2H, m), 5,035,10 (2H, m), 5,74-5,86 (1H, m).

Acetato de (5-c) terc-butil 3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ilideno

[00073] O ácido 4-etil-3-hidroxiept-6-enóico (3,13 g, 18,2 mmol) foi dissolvido em anidrido acético (15 mL). À solução, foi adicionado acetato de potássio (4,27 g, 43,6 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 100 minutos. A solução de reação foi aquecida para refluxo e agitada por 3,5 horas para formar "3-etilbiciclo[3.2.0]hept-6-en-6-ona" na solução de reação. À solução de reação, água gelada e tolueno foram adicionados e esta mistura foi agitada por toda a noite em temperatura ambiente. A mistura foi separada em camadas aquosas e orgânicas pela adição de salina saturada (50 mL) e tolueno (20 mL). A seguir, a camada orgânica foi lavada com uma solução de hidróxido de sódio aquoso 1N e salina saturada nesta ordem, a seguir seca com sulfato de magnésio anidro e filtrada. O filtrado foi adicionado em uma solução de reação preparada adicionando hidreto de sódio (>65 % de óleo, 761,9 mg, 20 mmol) a uma solução de dimetoxifosforilacetato de terc-butila (4,48 g, 20 mmol) em tetraidrofurano (50 mL) com resfriamento no gelo, e a mistura foi agitada por mais 1 hora. A solução de reação foi separada em camadas aquosas e orgânicas pela adição de uma solução aquosa saturada de cloreto de amônio e salina saturada. A camada aquosa foi submetida à extração com acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, a seguir lavadas com salina saturada e então secas com sulfato de magnésio anidro. O solvente foi destilado em pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para obter o composto de interesse como uma substância oleosa amarela (1,32 g, 31 %, mistura E/Z).

[00074] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: Isômero principal: 1,06 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,45 (9H, s), 2,07-2,22 (3H, m), 2,59-2,70 (2H, m), 2,87-2,96 (1H, m), 3,30 (1H, ddt, J=8,6, 18,4, 2,7 Hz), 3,86-3,88 (1H, m), 5,22-5,23 (1H, m), 5,45-5,47 (1H, m).Isômero secundário: 1,08 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,49 (9H, s), 2,07-2,21 (3H, m), 2,43-2,47 (1H, m), 2,59-2,70 (1H, m), 2,75-2,85 (1H, m), 2,87-2,96 (1H, m), 4,28-4,31 (1H, m), 5,35-5,38 (1H, m), 5,45-5,47 (1H, m).

(5-d) Acetato de terc-butil [3-etil-6-(nitrometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en- 6-ilal

[00075] O acetato de terc-butil [3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ilideno (1,32 g, 5,63 mmol) foi dissolvido em nitrometano (7 mL). À solução, foi adicionado 1,8-diazabiciclo[5,4.0]undec-7-eno (1,2 mL, 7,3 mmol) e a mistura foi aquecida com agitação em 50 a 60°C por 7 horas. A mistura resfriou naturalmente e uma solução aquosa saturada de di-hidrogenofosfato de potássio foi então adicionada a esta, seguido por extração com acetato de etila. A seguir, a camada orgânica foi seca com sulfato de magnésio anidro, e o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para obter o composto de interesse como uma substância oleosa sem cor (1,39 g, 84 %).

[00076] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 1,09 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,46 (9H, s), 1,52 (1H, dd, J=7,6, 13,2 Hz), 2,06 (1H,d, 16,6 Hz), 2,14 (2H, q, J=7,4 Hz), 2,30 (1H, ddd, J=2,4, 7,6, 13,2 Hz), 2,47 (2H, s), 2,49 (1H, dd, J=7,6,16,6 Hz), 2,86 (1H, quint, J=7,6 Hz), 3,21-3,22 (1H, m), 4,75 (1H, d, J=11,7 Hz), 4,84 (1H, d, J=11,7 Hz), 5,27 (1H, s).

(5-e) Ácido [6-aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acético

[00077] O acetato de terc-butil [3-etil-6-(nitrometil)biciclo[3.2.0]hept-3- en-6-ila] (1,09 g, 4,71 mmol) foi dissolvido em etanol (10 mL) e água (5 mL). À solução, foram adicionados pó de ferro (1,32 g, 23,5 mmol) e cloreto de amônio (249,6 mg, 4,71 mmol) e a mistura foi agitada por 2 horas em aquecimento para refluxo. A mistura resfriou naturalmente, a seguir foi diluída com salina saturada, uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e acetato de etila, e filtrada por meio de Celite para remover o material insolúvel. O filtrado foi separado em camadas orgânicas e aquosas. A camada orgânica foi lavada com salina saturada e então seca com sulfato de magnésio anidro e o solvente foi então destilado em pressão reduzida. Ao resíduo, foi adicionada uma solução 4N de ácido clorídrico em acetato de etila (20 mL) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. A seguir, o solvente foi destilado em pressão reduzida. O resíduo foi suspenso em diclorometano. À suspensão, foi adicionada gota a gota trietilamina, e o pó resultante foi coletado por filtração, a seguir lavado com diclorometano e então seco para obter o composto de interesse como um pó branco (425,1 mg, 43 %).

[00078] RMN-1H (400 MHz, CD3OD): δ ppm: 1,10 (3H, t, J=7,4 Hz),1,48 (1H, dd, J=7,5, 12,5 Hz), 2,03-2,08 (2H, m), 2,14 (2H, q, J=7,4 Hz), 2,46 (1H, d, J=16,2 Hz), 2,46-2,53 (1H, m), 2,51 (1H, d, J=16,2 Hz), 2,85 (1H, quint, J=7,5 Hz), 3,09-3,10 (1H, m), 3,14 (1H, d, J=13,0 Hz), 3,18 (1H, d, J=13,0 Hz), 5,38 (1H, dd, J=1,7, 3,7 Hz).Exemplo de produção 6 P-toluenosulfonato do ácido [6-aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3- en-6-il]acetic

[00079] O acetato de terc-butil [6-(terc-butoxicarbonilamino)metil-3- etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (1.152,23 g, 391,6 mmol) foi dissolvido em benzeno (1,2 L). À solução, foram então adicionados tioanissol (145,57 g, 1173 mmol) e ácido p-toluenossulfônico mono-hidratado (89,39 g) e a mistura foi agitada por 2 horas em refluxo. A mistura foi deixada por toda a noite em temperatura ambiente, e o pó resultante foi coletado por filtração. O pó obtido foi lavado com acetato de etila e então seco para obter o composto de interesse como um pó branco (88.29 g, 59 %).

[00080] RMN-1H (400 MHz,CD3OD): δ ppm: 1,11 (3H, t, J=7,4 Hz),1,51 (1H, dd, 7,4, 12,7 Hz), 2,06-2,20 (4H, m), 2,37 (3H, s), 2,49-2,56 (1H, m), 2,51 (2H,s), 2,87 (1H, quint , J=7,4 Hz), 3,12-3,14 (1H, m), 3,28 (1H, d, J=13,5 Hz), 3,33 (1H, d, J=13,5 Hz), 5,31-5,32 (1H, m), 7,21-7,25 (2H, m), 7,69-7,72 (2H, m). Exemplo de produção 7 Benzenossulfato do ácido [6-(aminometil)-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3- en-6-il]acetic

[00081] O ácido 6-(aminometil)-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acético (4,50 g, 20,6 mmol) foi dissolvido aquecendo em uma solução aquosa de ácido benzenossulfônico monoifratado 1M (22,7 mL) e a solução a seguir resfriou naturalmente em temperatura ambiente. O sólido resultante foi coletado por filtração. O sólido foi lavado com água (15 mL) e então seco usando uma bomba de vácuo para obter o composto de interesse como um sólido sem cor (6,45 g, 77 %).

[00082] RMN- H (400 MHz, CD3OD): δ ppm: 1,11 (3H,t, J=7,4 Hz),1,50 (1H, dd, J=7,5, 12,6 Hz), 2,08 (1H, d, 16,5 Hz), 2,10-2,20 (3H, m), 2,462,56 (3H, m), 2,87 (1H, quint. J=7,5 Hz), 3,12-3,13 (1H, m), 3,28 (1H, d, J=13,4 Hz), 3,33 (1H, d, J=13,4 Hz), 5,31 (1H, d, J=1,8 Hz), 7,39-7,45 (3H, m), 7,80-7,85 (2H, m).

[00083] Etapa de redução do grupo nitro Exemplo de produção 8 Acetato de terc-butil [6-aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila]

[00084] Níquel de Raney (102,3 g, 0,15 p/p) e etanol (5,5 L, 8,0 v/p) foram adicionados ao acetato de terc-butil [3-etil-6- (nitrometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (709,0 g, líquido: 681,8 g, 2,31 mol, mistura diastereomérica 85:15) e a mistura foi agitada. À solução de reação, foi adicionada hidrazina monoidratada (458,0 mL, 9,23 mol, 4,00 eq.) e a mistura foi agitada a 40ºC por 2 horas. A mistura foi resfriada em temperature ambiente e o níquel de Raney foi filtrado. A seguir, o solvente foi destilado para obter o composto de interesse como uma substância oleosa marrom (637,0 g, líquido: 552,3 g, rendimento: 90,2 %, mistura diastereomérica 85:15).

[00085] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): d ppm: 1,05-1,10 (cada t), 1,44-1,61 (m), 1,86-2,38 (m), 2,42-2,55 (m), 2,73-3,05 (m), 5,40-5,48 (m).

[00086] (ii)

[00087] O níquel de Raney (96 mg, 0,16 p/p) e etanol (200 μL) foram adicionados ao acetato de terc-butil [3-etil-6-(nitrometil)biciclo[3.2.0]hept-3- en-6-ila] (59 mg, mistura diastereomérica 85:15) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 12 horas na atmosfera de hidrogênio. O níquel de Raney foi filtrado. A seguir, o solvente foi destilado para obter o composto de interesse como uma substância oleosa marrom (49 mg, rendimento: 92 %, mistura diastereomérica 85:15). Exemplo de produção 9 Acetato de terc-butil [6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila]

[00088] O níquel de Raney (0.4 g) e etanol (24 mL) foram adicionados ao acetato de terc-butil [6-(nitrometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il] (4,0 g, 90:10 mistura diastereomérica) e a mistura foi agitada. À solução de reação, foi adicionada hidrazina monoidratada (2,9 mL) e a mistura foi agitada por 0,5 hora. O consumo dos materiais de partida foi confirmado por cromatografia em camada fina, e o níquel de Raney foi então filtrado. O solvente foi destilado para obter o composto de interesse como uma substância oleosa marrom (3,62 g, mistura diastereomérica 90:10). Revelador da cromatografia em camada fina: hexano:acetato de etila=9:1 Valor Rf da forma nitro: 0,7, valor Rf da forma reduzida: 0,1 (com cauda)

[00089] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 1,44-1,51 (m), 1,93-2,17 (m), 2,23-2,35 (m), 2,48-2,60 (m), 2,70-2,90 (m), 2,95-3,30 (m), 5,75-5,80 (m), 5,83-5,90 (m). Exemplo de produção 10 Acetato de terc-butil [6-aminometil-3-metilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-

[00090] O níquel de Raney (0,28 g) e etanol (20 mL) foram adicionados ao acetato de terc-butil [6-(nitrometil)-3-metilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (2,81 g, mistura diastereomérica 90:10) e a mistura foi agitada. À solução de reação, foi adicionada hidrazina monoidratada (1,9 mL) e a mistura foi agitada por 0,75 hora. O consumo dos materiais de partida foi confirmado por cromatografia em camada fina, e o níquel de Raney foi então filtrado. O solvente foi destilado para obter o composto de interesse como uma substância oleosa marrom (2,50 g, mistura diastereomérica 90:10). Revelador da cromatografia em camada fina: hexano:acetato de etila=9:1 Valor Rf da forma nitro: 0,7, valor Rf da forma reduzida: 0,1 (com cauda)

[00091] RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ ppm: 1,44-1,61 (m), 1,80-1,90 (m), 1,93-2,06 (m), 2,10-2,20 (m), 2,23-2,38 (m), 2,40-2,60 (m), 2,73-2,90 (m), 2,92-3,30 (m), 5,40-5,45 (m). Etapa de resolver diastereômeros Exemplo de produção 1 Acetato de p-toluenossulfonato de terc-butil [(1R*,5S*,6S*)-6- aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila]

[00092] O acetato de etila (70 mL, 10,4 v/p) foi adicionado em acetato de terc-butil [6-aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (7,8 g, pureza: 86,7 %, 22,03 mmol, mistura diastereomérica 87:13) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente. Após a adição de ácido p-toluenossulfônico mono- hidratado (4,2 g, 22,03 mmol, 0,87 eq.) a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 3 horas, e um cristal foi coletado por filtração. A seguir, o cristal foi seco em pressão reduzida na condição de 40°C para obter p- toluenossulfonato terc-butil [(1R*,5S*,6S*)-6-aminometil-3- etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acetato como um cristal branco (7,8 g, rendimento: 80.6 %, razão diastereomérica: 99,7:0,3).

[00093] RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6): δ ppm: 1,04 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,31-1,40 (1H, m), 1,40 (9H, s), 1,98-2,15 (4H, m), 2,25 (3H, s), 2,25-2,50 (3H, m), 2,76 (1H, quint, J=7,4 Hz), 3,05-3,18 (3H, m), 3,35 (1H, br s), 5,20 - 5,22 (1H, m), 7,10 -7,12 (2H, m), 7,4 5 -7,48 (2H, m), 7,74 (1H, br s).

[00094] Análise calculada para C23H35NO5S: C, 63,13; H, 8,06; N, 3,20; S, 7.33; C encontrado, 63,10; H, 8,14; N, 3,29; S, 7.30. Condições de análise de GC (medição da razão diastereomérica) Coluna: CP-Sil 8CB para amina (GL Science, 30 mx0,25 mm, 0,25 μm) Detector: FID Temperatura: forno de coluna (130°C), injeção (250°C), detector (250°C) Condições de temperatura: (i) 130°C (5,5 min), (ii) 130-270°C (10°C/min), (iii) 270°C (4,5 min) Vazão: 1,5 mL/min (velocidade linear média: 38 cm/sec) Razão de separação: 1/10 Gás carreador: hélio Tempo de análise: 25 min Corte máximo: 0,0-2,0 min Tempo de retenção: 13,8 min, 14,0 min Etapa de resolução óptica Exemplo de produção 12 Carboxilato de terc-butil [(1R,5S,6S)-6-aminometil-3- etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acetato (carboxilato opticamente ativo)

[00095] O acetato de p-toluenossulfonato de terc-butil [(1R*,5S*,6S*)-6- aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] foi suspenso em acetato de etila (20 v/p). A suspensão foi separada em camadas aquosas e orgânicas pela adição de uma solução aquosa de bicarbonato de sódio (4 v/p) para obter a forma livre de acetato de terc-butil [(1R*,5S*,6S*)-6-aminometil-3- etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila]. À este acetato de terc-butil [(1R*,5S*,6S*)-6- aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (200 mg, 0,754 mmol), foram adicionados éter de di-isopropila (IPE) ou acetonitrila (MeCN) (1,0 mL, 5,0 v/p) e então ácido carboxílico aticamente ativo (0,5 eq.), e a mistura foi agitada em temperatura ambiente. O cristal depositado foi filtrado e lavado com o solvente (0,5 mL, 2,5 v/p) usado. O cristal obtido foi seco em pressão reduzida para obter a forma do sal correspondente no rendimento e pureza óptica mostrados na tabela 1 a seguir.

[00096] A pureza óptica foi analisada convertendo o sal obtido na forma livre com uma solução aquosa de bicarbonato de sódio e a seguir derivando a forma livre em uma forma 3,5-dinitrobenzoila.

[00097] As condições de análise HPLC (medição da pureza óptica, analisada após a derivação na forma 3,5-dinitrobenzoila). Coluna: CHIRALPAK AS-RHx2 (Daisel, 4,6 mmx150 mm, 5 μm). Detecção: 220 nm, temperatura da coluna: 40°C, vazão: 0,8 mL/min Fase móvel: MeCN/tampão fosfato 5 mM (pH 7,0) = 55/45. Tempo de retenção: 29,6 min, 31,8 min, 36,1 min Tabela 1

Etapa de realizar a resolução óptica a partir da mistura diastereomérica Exemplo 1 Acetato de D-mandelato de terc-butil [(1R,5S,6S)-6-aminometil-3- etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila]

[00098] A acetonitrila (4,7 L, 8,6 v/p) foi adicionada em acetato de terc- butil [6-aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (627,0 g, líquido: 543,6 g, 2,05 mol, mistura diastereomérica 85:15) e a mistura foi agitada a 40°C. À solução de reação, foi adicionado ácido D-mandélico (116,3 g, 0,76 mmol, 0,37 eq.) e a mistura foi agitada a 40°C por 1 hora e a seguir resfriada naturalmente de maneira lenta a 3°C. Após a agitação a 3°C por 1 hora, o cristal resultante foi coletado por filtração. A seguir, o cristal foi seco em pressão reduzida na condição de 40°C para obter acetato de D-mandelato de terc-butil [(1R,5S,6S)-6-aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] como um pó branco (251,2 g, rendimento: 29,4 % , 97,6 % ee, 99,6 % de).

[00099] RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 1,04 (3H, t, J=7,6 Hz),1,28-1,35 (1H, m), 1,39 (9H, s), 1,96-2,11 (4H, m), 2,28 (1H, d , J=15,6 Hz), 2,33 (1H, d, J=15,6 Hz), 2,36-2,40 (1H, m), 2,72 (1H, quint, J=7,6 Hz), 3,00 (1H, d, J=13,2 Hz), 3,03 (1H, d, J=13,2 Hz), 3,31 (1H, br s), 4,54 (1H, s), 5,21 -5,23 (1H, m), 7,13 -7,25 (3H, m), 7,35 -7,37 (2H, m).

[000100] [a]20D -104,4° (C=0,108, MeOH).

[000101] A análise foi calculada para C24H35NO5: C, 69,04; H, 8,45; N, 3,35; C encontrado, 69,15; H, 8,46; N, 3.46. Exemplo 2 Acetato de (S)-O-acetil-mandelato de terc-butil [(1R,5S,6S)-6- (aminometil)biciclo [ 3.2.0]hept-3-en-6-ila]

[000102] A acetonitrila (10 mL, 5,0 v/p) foi adicionada em acetato de terc- butil [6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (1,9 g, 8,0 mmol, mistura diastereomérica 90:10). À mistura, foi adicionado ácido (S)-O-acetil- mandélico (0,45 eq.) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente. Após 2,5 horas, o cristal depositado foi filtrado e lavado com acetonitrila. O cristal obtido foi seco em pressão reduzida para obter acetato de (S)-O-acetil- mandelato de terc-butil [(1R,5S,6S)-6-aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3- en-6-ila] como um cristal branco (0,904 g, rendimento: 26,2 % , 90,4 % ee, 99 % de). Este cristal branco (620 mg) foi suspenso em acetonitrila (6,2 mL, 10,0 v/p) e a suspensão foi agitada em temperatura ambiente por 10 minutos. O cristal resultante foi filtrado e o cristal obtido foi seco em pressão reduzida para obter (S)-O-acetil-mandelato como um pó branco (557,6 mg, pureza óptica: 95,7 % ee).

[000103] RMN-1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,44-1,51 (1H, m), 1,45 (9H, s), 2,08-2,22 (2H, m), 2,13 (3H, s), 2,42 (2H, s), 2,50-2,57 (1H, m), 2,86 (1H, quint, J=7,6 Hz), 3,06 -3,16 (1H, m), 3,25-3,33 (2H, m), 5,65-5,70 (1H, m), 5,74 (1H, s), 5,95-5,99 (1H, m), 7,25 -7,34 (3H, m), 7,47 -7,51 (2H, m).[a]20D -18,9 (C 0,095, MeOH). IR (KBr): cm-1: 3046, 2977, 1726, 1584, 1235, 1144, 1028, 752. MS (FAB+): m/z: 238 (livre+H)+, MS (FAB+NaI): m/z: 260 (livre+Na)+, 217 (ácido O-acetil-mandélico+Na)+. Análise calculada para C24H33NO6: C, 66,80; H, 7.71; N,3,25; C encontrado, 66,60; H,7,72; N,3,36.

Exemplo 3 Acetato de D-mandelato de terc-butil [(1R,5S,6S)-6-aminometil-3- metilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila]

[000104] Um solvente (2,5 mL, 10 v/p) foi adicionado em acetato de terc- butil [6-aminometil-3-metilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (237 mg, 1 mmol, mistura diastereomérica 90:10). À mistura, foi adicionado ácido D-mandélico (0,5 eq.) e a mistura foi agitada por 2 horas com resfriamento no gelo. O cristal depositado foi filtrado. O cristal obtido foi seco em pressão reduzida para obter D-mandelato no rendimento e pureza óptica mostrados na tabela 2 a seguir. A pureza óptica foi analisada convertendo o sal obtido na forma livre com uma solução aquosa de bicarbonato de sódio e a seguir derivando a forma livre em uma forma 3,5-dinitrobenzoila.

a) Cloreto de 3,5-Dinitrobenzoila, HPLC Condições de análise HPLC (medição de pureza óptica, analisada após a derivação na forma 3,5-dinitrobenzoila): Coluna: CHIRALPAK AS-RHx2 (Daisel, 4,6 mmx150 mm, 5 μm). Detecção: 220 nm, temperatura da coluna: 40°C, vazão: 0,8 mL/min. Fase móvel: MeCN/tampão fosfato 5 mM (pH 7,0) = 55/45 Tempo de retenção: 28,0 min, 23,6 min, 26,0 min RMN-1H (400 MHz, CD3OD): δ ppm: 1,45-1,51 (1H, m), 1,45 (9H, s), 1,82 (3H, s), 2,02-2,14 (2H, m), 2,41 (2H, s), 2,42-2,55 (1H, m), 2,85 (1H, quint, J=7,2 Hz), 3,06 -3,13 (1H, m), 3,23 (1H, d, J=13,2 Hz), 3,26 (1H, d, J=13,2 Hz), 4,84 (1H, s), 5,25 -5,28 (1H, m), 7,19 -7,30 (3H, m), 7,44 -7,47 (2H, m). [α]20D -97,4° (C 0,102, MeOH). IR (KBr): cm-1: 3424, 2974, 2929, 1722, 1571, 1366, 1152, 1060, 755, 701. MS (FAB+): m/z: 252 (livre+H)+, MS (FAB+NaI): m/z: 274 (livre+Na)+, 175 (ácido mandélico+Na)+. Etapas de desproteger o grupo éster e formar o sal

Exemplo 4 P-toluenossulfonato do ácido [(1R,5S,6S)-6-Aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acético

[000105] O acetato de D-mandelato de terc-butil [(1R,5S,6S)-6- aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] (4,17 g, 10 mmol) foi suspenso em tolueno (21 mL). À suspensão, foram adicionadas trietilamina (2,09 mL) e a seguir água (21 mL), e a mistura foi agitada em temperatura ambiente. Após 20 minutos, a camada orgânica foi separada e extraída. A camada orgânica foi lavada novamente com água (10 mL) e a seguir concentrada em pressão reduzida para obter a forma livre de acetato de terc- butil [(1R,5S,6S)-6-aminometil-3-etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] como uma substância oleosa. O tolueno (16 mL), e a seguir o ácido p-toluenossulfônico mono-hidratado (2,28 g) foram adicionados a esta e a mistura foi agitada a 70°C. Durante a agitação, o tolueno (15 mL) foi adicionado novamente e, após 3 horas, a mistura resfriou naturalmente. O sólido depositado foi filtrado, a seguir lavado com tolueno e então seco em pressão reduzida para obter p- toluenossulfonato do ácido [(1R,5S,6S)-6-aminometil-3- etilbiciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acético como um pó branco (3,90 g).

[000106] RMN-1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,10 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,49 (1H, dd, J=7,4, 12,4 Hz), 2,06-2,20 (4H, m), 2,37 (3H, s), 2,49 -2,55 (1H, m), 2,51 (2H, s), 2,87 (1H, quint, J=7,4 Hz), 3,12 (1H, br S), 3,29 (1H, d, J=13,3 Hz), 3,33 (1H, d, J=13,3 Hz), 5,31 -5,32 (1H, m), 7,22 -7,25 (2H, m), 7,69 -7,72 (2H, m). [α]20D -56,1° (C 0,108, MeOH). IR (KBr): cm-1: 3149, 2962, 1708, 1498, 1237, 1164, 1038, 1011, 813, 680, 566. MS (FAB+): m/z: 210 (livre+H)+, 412 (livre 2M+H)+.

Exemplo 5 Benzenossulfonato do ácido[(1R,5S,6S)-6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acético

[000107] O acetato de (S)-O-acetil-mandelato de terc-butil [(1R,5S,6S)-6- (aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il] (116 mg, 0,269 mmol) foi suspenso em anisol (0,58 mL). À suspensão, foram adicionadas água (0,6 mL) e a seguir trietilamina (0,045 mL), e a mistura foi agitada em temperatura ambiente. Após 15 minutos, a camada orgânica foi separada e extraída. A camada orgânica foi lavada novamente com água (300 mL) e então concentrada em pressão reduzida para obter uma solução da forma livre de acetato de terc-butil [(1R,5S,6S)-6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-ila] em anisol. O ácido benzenossulfônico (46 mg) foi adicionado a esta, e a mistura foi agitada a 70°C por 1,25 hora e resfriou naturalmente. O sólido depositado foi filtrado, e o pó filtrado foi lavado novamente vertendo acetona e seco em pressão reduzida para obter benzenossulfonato do ácido [(1R,5S,6S)-6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-3-en-6-il]acético como um pó branco (55.5 mg).

[000108] RMN-1H (400 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,51 (1H, dd, J=7,6, 12,4 Hz), 2,12-2,20 (2H, m), 2,51 (2H, s), 2,51-2,57 (1H, m), 2,88 (1H, quint, J=7,4 Hz), 3,17-3,18 (1H, m), 3,32 (1H, d, J=13,3 Hz), 3,36 (1H, d, J=13,3 Hz), 5,69-5,71 (1H, m), 5,97-5,99 (1H, m), 7,39 -7,44 (3H, m), 7,81-7,84 (2H, m). [α]20D -99,7° (C 0,09, MeOH). IR (KBr): cm-1: 3125, 3054, 2988, 1705, 1515, 1412, 1237, 1163, 1121, 1016, 730, 689, 621, 563. MS (FAB+): m/z: 182 (livre+H)+, m/z: 363 (livre 2M+H)+. Análise calculada para C16H21NO5S: C, 56,62; H, 6,24; N, 4,13; C encontrado,56,19; H, 6,21; N, 4,13. Texto livre para a listagem de sequência

[000109] SEQ ID NO: 1: Oligonucleotídeo iniciador sentido de PCR para o fragmento da primeira metade de Cacna2d1 humano.

[000110] SEQ ID NO: 2: Oligonucleotídeo iniciador anti-sentido de PCR para o fragmento da primeira metade de Cacna2d1 humano.

[000111] SEQ ID NO: 3: Oligonucleotídeo iniciador sentido de PCR para o fragmento da segunda metade de Cacna2d1 humano.

[000112] SEQ ID NO: 4: Oligonucleotídeo iniciador anti-sentido de PCR para o fragmento da segunda metade de Cacna2d1 humano.

[000113] SEQ ID NO: 5: sítio de multiclonagem de um vetor pBluescript 2.

Claims

1. Método para produzir um composto representado pela fórmula geral (I), ou um sal do mesmo, por resolução óptica:

em que cada substituinte é definido da maneira a seguir: R1: um grupo etila, e R2: um átomo de hidrogênio ou um grupo t-butila, caracterizado pelo fato de compreender: dissolver uma mistura de compostos representada pelas fórmulas gerais (II), (III), (IV) e (V) e um ácido orgânico opticamente ativo, selecionado de ácido D-mandélico ou ácido O-acetil-D-mandélico, em um solvente, selecionado de acetonitrila, acetato de etila, tolueno ou ciclopentil metil éter:

em que as fórmulas gerais (I) e (II) são as mesmas, e então depositar um cristal do composto de fórmula geral (I).

2. Método para produzir um composto representado pela fórmula geral (I), ou um sal do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R2 é um grupo t-butila.