KR20110133568A

KR20110133568A - 2고리성 γ-아미노산 유도체의 제조 방법

Info

Publication number: KR20110133568A
Application number: KR1020117022257A
Authority: KR
Inventors: 유타카 기타가와; 마코토 이마이
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2011-12-13
Also published as: JP5610600B2; IL215357A0; CN102356061B; EP2412700A4; TWI462893B; CA2756750C; TW201041830A; HK1166495A1; JP2014001208A; KR101674700B1; CN102356061A; US8324425B2; BRPI1013482B8; HUE031770T2; EP2412700A1; JP5557292B2; EP2412700B1; BRPI1013482B1; IL215357A; US20120071685A1

Abstract

과제는 α₂δ 리간드로서 우수한 활성을 갖는 화합물의 제조 방법을 제공하는 것. 해결 수단은 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 광학 분할에 의해 제조하는 방법이다.

(I)
식 중, R¹ : 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기, R² : 수소 원자 또는 카르복실기의 보호기］

Description

2고리성 γ-아미노산 유도체의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING BICYCLIC γ-AMINO ACID DERIVATIVE}

본 발명은 2고리성 γ-아미노산 유도체, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염, 특히 α₂δ 리간드로서 활성을 가지며, 전위 의존성 칼슘 채널인 α₂δ 서브 유닛에 대해 친화성이 있는 화합물, 또는 그 제조 방법에 관한 것이다.

전위 의존성 칼슘 채널인 α₂δ 서브 유닛에 대해 고친화성 결합을 나타내는 화합물은 예를 들어 신경인성 동통의 치료에 있어서 유효하다는 것이 밝혀져 있다 (예를 들어, 비특허문헌 1 및 비특허문헌 2 참조). 여기서, 신경인성 동통이란, 신경 조직의 손상 등에 의해 야기되는 만성 동통으로, 동통 발작이 심하면 환자는 우울 상태가 되는 등 생활의 질 (Quality of Life) 을 현저하게 손상시키는 질환이다.

현재, 이러한 신경인성 동통의 치료약으로서 여러 종류의 α₂δ 리간드가 알려져 있으며, α₂δ 리간드로는, 예를 들어 가바펜틴, 프레가발린 등이 있다. 이들 화합물과 같은 α₂δ 리간드는 간질 및 신경인성 동통 등의 치료에 유용하다 (예를 들어, 특허문헌 1).

그러나, 예를 들어 가바펜틴의 경우, 대상 포진 후 신경통에 있어서의 환자의 자기 평가에 의한 치료 유효율은 약 60 ％ (예를 들어, 비특허문헌 3 참조), 프레가발린의 경우, 유통성의 당뇨병성 신경 장애에 있어서의 환자의 자기 평가에 의한 치료 유효율은 약 50 ％ (예를 들어, 비특허문헌 4 참조) 로 보고되어 있다.

그 밖의 화합물로는, 예를 들어, 특허문헌 2, 특허문헌 3, 특허문헌 4 등에 개시되어 있다.

국제공개 제04/006836호 팜플렛 국제공개 제99/21824호 팜플렛 국제공개 제01/28978호 팜플렛 국제공개 제02/085839호 팜플렛

J Biol. Chem. 271(10) : 5768-5776, 1996 J Med. Chem. 41 : 1838-18445, 1998 Acta Nerurol. Scand. 101 : 359-371, 2000 Drugs 64(24) : 2813-2820, 2004

본 발명은 α₂δ 리간드로서 우수한 활성을 갖는 2고리성 γ-아미노산 유도체, 그 제조 중간체 및 그들의 염의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명을 이하에 설명한다.

(1) 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 광학 분할에 의해 제조하는 방법으로,

[화학식 1]

(I)

[식 중, 각 치환기는 이하와 같이 정의된다.

R¹ : 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기

R² : 수소 원자 또는 카르복실기의 보호기]

일반식 (Ⅱ), (Ⅲ), (Ⅳ) 및 (Ⅴ) 를 갖는 화합물의 혼합물과 광학 활성 유기산을 용매에 용해시킨 후,

[화학식 2]

결정을 석출시킴으로써, 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.

또, 본 발명의 양태로서 바람직하게는, 이하에 나타내는 것이다.

(2) R¹ 이 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기인 (1) 에 기재된 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.

(3) R²가 t-부틸기인 (1) 또는 (2) 에 기재된 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.

(4) 광학 활성 유기산이 이하의 군에서 선택되는 어느 광학 활성 유기산인 (1) - (3) 에서 선택되는 어느 1 항에 기재된 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.

D-만델산, L-만델산, Di-p-톨루오일-L-타르타르산, N-Boc-L-프롤린, (R)-α-메톡시페닐아세트산, O-아세틸-L-만델산, Di-벤조일-L-타르타르산, O-아세틸-D-만델산, N-Boc-L-알라닌, (S)-2-(6-메톡시-2-나프틸)프로피온산, 디아세틸-L-타르타르산, L-타르타르산, L-말산, L-피로글루탐산, (＋)-캄포르산, (S)-2-메틸글루탐산, (＋)-3-브로모캄파-8-술폰산, (－)-멘톡시아세트산, (S)-2-페녹시프로피온산

(5) 용매가 이하의 군에서 선택되는 어느 용매인 (1) - (4) 에서 선택되는 어느 1 항에 기재된 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.

아세토니트릴, 아세트산에틸, 톨루엔, 시클로펜틸메틸에테르

또한, 본 발명은 이하의 제조 방법도 포함한다.

(6) 일반식 (X) 를 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법으로,

[화학식 2]

(X)

[식 중, 각 치환기는 이하와 같이 정의된다.

R¹ : 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기]

(1) 에 의해 제조된 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물의 카르복실기의 보호기를 탈보호하거나, 또는, 다시 산과 염을 형성함으로써, 일반식 (X) 를 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.

본 발명의 제조 방법에 의해, α₂δ 리간드로서 우수한 활성을 갖는 2고리성 γ-아미노산 유도체, 그 제조 중간체 및 그들의 염을 제공할 수 있다.

「C1-C6 알킬기」 란, 탄소수 1-6 개의 직사슬형 또는 분기사슬형 알킬기를 말하며, 예를 들어 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 2-메틸부틸기, 네오펜틸기, 1-에틸프로필기, 헥실기, 이소헥실기, 4-메틸펜틸기, 3-메틸펜틸기, 2-메틸펜틸기, 1-메틸펜틸기, 3,3-디메틸부틸기, 2,2-디메틸부틸기, 1,1-디메틸부틸기, 1,2-디메틸부틸기, 1,3-디메틸부틸기, 2,3-디메틸부틸기, 2-에틸부틸기 등이 있다.

「염」 또는, 「약리상 허용되는 염」 이란, 일반식 (Ⅰ) 로 나타내는 화합물 등에 있어서, 그 구조 중에 아미노기 및/또는 카르복실기를 갖는 경우에는 산 또는 염기를 반응시킴으로써 염을 형성하므로, 그 염을 말한다.

본 명세서 중 화합물명의 표기에 있어서, 「*」 은 그 표기하는 부제 탄소가 라세미 혼합물인 것을 나타낸다. 단, 「(1S^*,5R^*,6R^*)-」 와 같이 표기되어 있는 경우에는, 상대 배치에 대해서는 그 관계를 나타내는 것으로 한다.

일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 등은, 대기 중에 방치하거나 또는 재정석을 실시하거나 함으로써, 수분을 흡수하여 흡착수가 부착되어 수화물이 되는 경우가 있으며, 그러한 수화물도 본 발명의 염에 포함된다.

「카르복실기의 보호기」 란, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, 헥실기, 브로모-tert-부틸기, 트리클로로에틸기, 벤질기, p-니트로벤질기, o-니트로벤질기, p-메톡시벤질기, p-t-부틸벤질기, 아세톡시메틸기, 프로피오닐옥시메틸기, 부티릴옥시메틸기, 이소부티릴옥시메틸기, 발레릴옥시메틸기, 피발로일옥시메틸기, 아세톡시에틸기, 아세톡시프로필기, 아세톡시부틸기, 프로피오닐옥시에틸기, 프로피오닐옥시프로필기, 부티릴옥시에틸기, 이소부티릴옥시에틸기, 피발로일옥시에틸기, 헥사노일옥시에틸기, 이소부티릴옥시메틸기, 에틸부티릴옥시메틸기, 디메틸부티릴옥시메틸기, 펜타노일옥시에틸기, 메톡시카르보닐옥시메틸기, 에톡시카르보닐옥시메틸기, 프로폭시카르보닐옥시메틸기, t-부톡시카르보닐옥시메틸기, 메톡시카르보닐옥시에틸기, 에톡시카르보닐옥시에틸기, 이소프로폭시카르보닐옥시에틸기, t-부틸디메틸실릴기, 트리메틸실릴기, 메톡시메틸기, 에톡시메틸기, 프로폭시메틸기, 이소프로폭시메틸기, (2-메틸티오)-에틸기, 3-메틸-2-부테닐기, 5-인다닐기, 3-프탈리딜기 등이며, 바람직하게는 t-부틸기이다.

일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물은 통상적인 카르복실기를 탈보호하는 방법, 예를 들어, T.W. Greene 및 P.G. Wuts 저, 「Protective Groups in Organic Synthesis (제3판, 1999년)」 에 기재된 방법에 의해, 카르복실기를 탈보호함으로써 일반식 (X) 를 갖는 화합물을 제조할 수 있다.

[화학식 3]

일반식 (X) 를 갖는 화합물, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염은 α₂δ 리간드로서 활성을 나타내고, 전위 의존성 칼슘 채널인 α₂δ 서브 유닛에 대해 친화성이 있어, 손상, 중추 신경성 장해, 및 그 밖의 장해의 치료 및/또는 예방에 사용되는 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하다.

일반식 (X) 를 갖는 화합물, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 의약 조성물은, 포유 동물 (예를 들어, 사람, 말, 소, 돼지 등, 바람직하게는 사람) 에게 투여되는 경우에는, 전신적 또는 국소적으로, 경구 또는 비경구로 투여된다.

본 발명의 의약 조성물은 투여 방법에 따라 적절한 형태를 선택하고, 통상 이용되고 있는 각종 제제의 조제법에 의해 조제할 수 있다.

경구용 의약 조성물의 형태로는, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 수제, 현탁제, 유제, 시럽제, 에리키실제 등이 있다. 이러한 형태의 의약 조성물의 조제는 첨가제로서 통상 사용되는 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 팽윤제, 팽윤 보조제, 코팅제, 가소제, 안정제, 방부제, 항산화제, 착색제, 용해 보조제, 현탁화제, 유화제, 감미제, 보존제, 완충제, 희석제, 습윤제 등을 필요에 따라 적절히 선택하여, 통상적인 방법에 따라 실시된다.

비경구용 의약 조성물의 형태로는, 주사제, 연고제, 겔제, 크림제, 습포제, 첩부제 (貼付劑), 분무제, 흡입제, 스프레이제, 점안제, 점비제, 좌제, 흡입제 등이 있다. 이러한 형태의 의약 조성물의 조제는 첨가제로서 통상 사용되는 안정화제, 방부제, 용해 보조제, 보습제, 보존제, 항산화제, 착향제, 겔화제, 중화제, 용해 보조제, 완충제, 등장제, 계면활성제, 착색제, 완충화제, 증점제, 습윤제, 충전제, 흡수 촉진제, 현탁화제, 결합제 등을 필요에 따라 적절히 선택하여, 통상적인 방법에 따라 실시된다.

일반식 (X) 를 갖는 화합물, 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 투여량은 증상, 연령, 체중 등에 따라 상이한데, 경구 투여의 경우에는, 성인 (체중 약 60 Kg 으로 하여) 1 명 1 회 당, 화합물 환산량으로 1 - 2000 ㎎, 바람직하게는 10 - 600 ㎎ 이며, 비경구 투여의 경우에는, 성인 1 명 1 회 당, 화합물 환산량 0.1 - 1000 ㎎, 바람직하게는 1 - 300 ㎎ 이다.

실시예

(제제예)

일반식 (X) 를 갖는 화합물 5 g, 유당 90 g, 옥수수 전분 34 g, 결정 셀룰로오스 20 g 및 스테아르산마그네슘 1 g 을 블렌더로 혼합한 후, 정제기로 타정함으로써 정제가 얻어진다.

(시험예 1) 인간 칼슘 채널 α₂δ₁ 서브 유닛 (이하, 인간 Cacna2d1 이라고 한다) 유전자 발현 플라스미드의 구축, 및 인간 Cacna2d1 발현 세포막 획분의 조제

a) 인간 Cacna2d1 발현 플라스미드 pRK/hCacna2d1 의 구축

a-1) DNA 단편의 조제

인간 Cacna2d1 유전자는 전반 단편과 후반 단편으로 2 분할하여 취득하였다. cDNA 라이브러리 (QUICK-Clone cDNA Human Brain (Clontech Laboratories, Inc)) 를 주형으로 하여 효소 KOD 폴리멜라아제 (TOYOBO) 를 이용하고, 이 효소 첨부의 프로토콜에 따라 PCR 을 실시하였다. PCR 프라이머로는, 전반 단편에는 하기의 배열을 갖는 프라이머 :

프라이머 1 : 5'-agctgcggcc gctagcgcca ccatggctgg ctgcctgctg gc-3' (배열 번호 : 1)

프라이머 2 : 5'-attaggatcg attgcaaagt aataccc-3' (배열 번호 : 2)

후반 단편에는 하기의 배열을 갖는 프라이머 :

프라이머 3 : 5'-aatgggtatt actttgcaat cgatcc-3' (배열 번호 : 3)

프라이머 4 : 5'-agtcggatcc tcataacagc cggtgtgtgc tg-3' (배열 번호 : 4)

을 시그마·제네시스로부터 구입하여 사용하였다. PCR 반응은 전반, 후반 양 단편 모두 서멀 사이클러 (GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)) 를 이용하여, 94 ℃ 에서 1 분간 가열 후, 온도 사이클 (94 ℃ 에서 15 초, 60 ℃ 에서 30 초, 68 ℃ 에서 2 분) 를 35 회 반복한 후, 68 ℃ 에서 5 분 간격으로 4 ℃ 로 냉각시킨다는 과정으로 실시하였다.

이 2 개의 반응 산물을, PCR 산물 정제 키트 (MiniElute PCR Purification Kit (QIAGEN)) 로, 이 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 정제하였다. 얻어진 전반 단편은 제한 효소 Not1 (TOYOBO) 로 소화하였다. 후반 단편은 제한 효소 Cla1 (TOYOBO) 과 BamH1 (TOYOBO) 로 소화하였다. 이어서, 이들을 반응 산물 정제 키트 (MiniElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN)) 로, 이 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 이용하여 정제하였다.

a-2) 벡터의 제작

동물 세포용 발현 벡터 pRK5 (Pharmingen) 의 멀티 클로닝 사이트 (이하, MCS 라고 한다) 를 벡터 pBluescript 2 (STRATAGENE) 의 MCS 로 변경한 벡터를 제작하였다. 즉, pRK5 를 Cla 1 (TOYOBO), 및 Hind 3 (TOYOBO) 으로 제한 효소 처리를 실시한 후, Klenow Fragment (TAKARA) 를 이용하여 DNA 양 말단을 평활화하였다. 또한, 소 소장 알칼리포스파타아제 (이하, CIAP 라고 한다 : TAKARA) 를 이용하여 양 말단을 탈인산화한 후, MiniElute Reaction Cleanup Kit (QIAGEN) 로 정제를 실시하였다. 그리고, 이 효소 처리한 DNA 를 1.0 ％ 의 아가로오스 겔에 전기 영동하고, 전기 영동 후의 겔을 브롬화에티듐으로 염색한 후, 자외선 조사하에서 약 4.7 kbp 에 상당하는 밴드 부분을 면도날을 이용하여 분리하고, 겔 추출 정제 키트 (MiniElute Gel Extraction Kit (QIAGEN)) 를 이용하여, 이 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 DNA 를 추출하였다.

pBluescript 2 의 MCS 에 상당하는 DNA 단편을 얻기 위해, pBluescript 2 를 Sac 1 (TOYOBO), 및 Kpn 1 (TOYOBO) 로 제한 효소 처리를 실시한 후, Klenow Fragment (TAKARA) 를 이용하여 DNA 양 말단을 평활화하였다. 그리고, 이 효소 처리한 DNA 를 2.0 ％ 의 아가로오스 겔로 전기 영동하고, 전기 영동 후의 겔을 브롬화에티듐으로 염색한 후, 자외선 조사하에서 약 100 bp 에 상당하는 밴드 부분을 면도날을 이용하여 분리하고, 겔 추출 정제 키트 (MiniElute Gel Extraction Kit (QIAGEN)) 를 이용하여, 이 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 DNA 를 추출하였다.

얻어진 DNA 단편과 절단을 마친 pRK5 를, DNA 라이게이션 키트 (TAKARA) 를 이용하여, 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 연결하였다. 이 반응 산물로 대장균 DH5α 의 컴피텐트 세포 (TOYOBO) 를 형질 전환하여, 암피실린 내성의 콜로니를 얻었다. 몇 개의 콜로니를 채취한 후, 채취한 콜로니를 배양하여 얻어진 균체로부터 플라스미드를 추출하고, 그 염기 배열을 DNA 시퀀서 (Model 3700 (Applied Biosystems)) 를 이용해서 해석하여, MCS 배열이 pRK5 에 도입되어 있는 것을 확인하였다. 이 때, MCS 배열 방향이 CMV 프로모터를 상류로 하고 하류 방향에 이하의 방향 : 5'-ccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaat tcgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccg-3' (배열 번호 : 5) 로 삽입된 벡터를 pRK-SK, 역방향으로 삽입된 벡터를 pRK-KS 로 명명하였다.

a-3) 플라스미드의 구축

a-2) 에서 얻어진 pRK-SK 를 제한 효소 Xba1 (TOYOBO) 로 처리하고, Klenow Fragment (TAKARA) 를 이용하여 DNA 양 말단을 평활화하고, 추가로 평활화한 DNA 를 제한 효소 Not 1 (TOTOBO) 로 소화하여, a-2) 와 동일한 방법으로 정제를 실시하였다. 이 직사슬형으로 한 pRK-SK 와 a-1) 에서 얻어진 인간 Cacna2d1 유전자 전반부 DNA 단편에 대해, 1.0 ％ 의 아가로오스 겔로 전기 영동을 실시하고, a-2) 와 마찬가지로 약 4.7 kbp 및 약 1.5 kbp 의 DNA 를 겔로부터 추출하여 정제하였다. 얻어진 2 개의 DNA 를 a-2) 와 동일한 방법으로 라이게이션하여, 대장균의 형질 전환을 실시하였다. 얻어진 대장균의 클론으로부터 플라스미드를 추출하고, 그 염기 배열을 DNA 시퀀서 (Model 3700 (Applied Biosystems)) 를 이용해서 해석하여, 배열 번호 : 6 에 나타내는 배열이 도입되어 있는 것을 확인하였다. 이어서, 얻어진 플라스미드를 제한 효소 Cla 1 (TOYOBO) 과 BamH 1 (TOYOBO) 로 처리하고, a-2) 와 동일한 방법으로 CIAP 처리, 및 정제를 실시하였다. 이 직사슬형으로 한 플라스미드 DNA 와 a-1) 에서 얻어진 인간 Cacna2d1 유전자 후반부 DNA 단편에 대해, 1.0 ％ 의 아가로오스 겔로 전기 영동을 실시하고, a-2) 와 마찬가지로 약 6.2 kbp 및 약 1.8 kbp 의 DNA 를 겔로부터 추출하여 정제하였다. 얻어진 2 개의 DNA 를 a-2) 와 동일한 방법으로 라이게이션하여, 대장균의 형질 전환을 실시하였다. 얻어진 대장균의 클론으로부터 플라스미드를 추출하고, 그 염기 배열을 DNA 시퀀서 (Model 3700 (Applied Biosystems)) 를 이용해서 해석하여, 벡터 pRK-SK 에 배열 번호 : 7 에 나타내는 배열이 도입되어 있는 것을 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 pRK/hCacna2d1 로 명명하였다.

b) 인간 Cacna2d1 발현 293 세포주의 취득

a) 에서 구축한 인간 Cacna2d1 발현 플라스미드 pRK/hCacna2d1 을 293 세포에 유전자 도입하여, 인간 Cacna2d1 단백질의 발현을 지표로 인간 Cacna2d1 안정 발현 세포주를 취득하였다. 구체적으로는, φ6 ㎝ dish 에 2 × 10⁶ cells 의 293 세포를 파종하고, 12 시간 배양 후에 유전자 도입 시약 LipofectaminePlus (Invitrogen) 를 이용하여, 시약에 첨부된 프로토콜에 따라, 5 ㎍ 의 pRK/hCacna2d1 과 0.5 ㎍ 의 neomycin 내성 유전자 발현 플라스미드 pSV2neo (Clontech) 를 동시에 도입하였다.

유전자 도입 후, 세포를 회수하여, φ15 cm dish 에 희석시켜 파종하고, 10 ％ 우태아 혈청 (Cansera International Inc.) 및 500 ㎍/㎖ 의 G418 (Invitrogen) 을 첨가한 DMEM (Invitrogen) 에서 2 주간 배양하였다. 콜로니를 형성한 neomycin 내성 세포를 단리하여 확대 배양 후 세포를 회수하여, 세포 용해액을 Western assay 법으로 평가함으로써 인간 Cacna2d1 을 발현시키는 293 세포주를 취득하였다. Western assay 에서는 항 hCacna2d1 항체 (Chemicon Inc.) 를 1 차 항체로서 사용하였다.

c) 인간 Cacna2d1 발현 293 세포의 세포막 획분의 조제

b) 에서 취득한 인간 Cacna2d1 발현 293 세포를 10 ％ 우태아 혈청 (Cansera International Inc.) 및 500 ㎍/㎖ 의 G418 (Invitrogen) 을 첨가한 DMEM (Invitrogen) 에서 대량 배양하여, 회수하였다. Binding Assay Buffer (10 mM MOPS (pH 7.4), 10 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl) 에 프로테아제 저해제 (Comlpete EDTA free (Roche)) 를 그 시약의 추장량 첨가하여, 막 획분 조제 버퍼로 하였다. 회수한 세포를 막 획분 조제 버퍼로 세정 후, 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 그 후, 원심기를 이용하여 12,000 rpm, 4 ℃, 1 시간 원심 분리를 실시하여, 상청을 버리고 획분 조제 버퍼로 침전물을 현탁시켰다. 초음파 파쇄기를 사용한 초음파 처리에서 원심 분리 후 침전물의 현탁까지를 추가로 3 회 반복하여 실시하고, 얻어진 현탁액을 인간 Cacna2d1 발현 세포막 획분으로 하였다. 파장 280 ㎚ 의 UV 흡광도로부터 막 획분에 포함되는 전체 단백질량을 산출하였다.

(시험예 2) Cacna2d1 과 Gabapentin (이하 GBP 로 한다) 의 결합 반응의 검출계 구축 및 피검 화합물에 의한 Cacna2d1/GBP 결합 반응 저해 활성의 검출

a) Cacna2d1 과 GBP 의 결합 반응의 검출계 구축

인간 Cacna2d1 발현 세포막 획분 및 방사성 동위체 ³H 에 의해 표지된 GBP (이하 ³H-GBP 로 한다 : Tocris Cookson) 를 Binding Assay Buffer (10 mM MOPS (pH 7.4), 10 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl) 로 전체 단백질량 종농도 2.5 ㎎/㎖, ³H-GBP 종농도 4.5 nM 이 되도록 희석시켜, 반응액 120 ㎕ 를 조제하여, 4 ℃ 에서 3 시간 가만히 정지시켰다. 이 반응물을 필터 플레이트 (UniFilter350 GF/B (Whatman)) 의 웰에 첨가하여 필터 여과를 실시하였다. 그 후 350 ㎕ 의 Binding Assay Buffer (10 mM MOPS (pH 7.4), 10 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl) 를 첨가하여 필터 여과를 실시하는 세정 작업을 3 회 반복하였다. 필터 플레이트를 충분히 건조시키고, 저면을 시일하여 Microscint 20 (PerkinElmer) 을 50 ㎕ 첨가 후, 상면도 시일하여 필터에 남는 방사성 동위체 ³H 유래의 방사선을 TopCount (PerkinElmer) 로 카운트하였다. 얻어진 값으로부터, 본 어세이에 종농도 20 μM 의 비표지 GBP (SIGMA-ALDRICH) 를 첨가했을 때의 값을 비특이적 흡착 유래로서 공제하여, Cacna2d1 에 대한 ³H-GBP 의 특이적 결합량 (단위는 「count」) 으로 하였다.

b) 피검 화합물에 의한 Cacna2d1/GBP 결합 반응 저해 활성의 검출

a) 에서 구축한 Cacna2d1/GBP 결합 반응의 검출 어세이에 피검 화합물을 다양한 농도로 첨가하여, 결합량을 a) 에 기재된 방법으로 측정하였다. 그 후, 화합물을 x nM 첨가했을 때의 Cacna2d1/GBP 특이적 결합량을 「결합량 [x]」, 그 때의 Cacna2d1/GBP 결합 저해율을 「저해율 [x]」 로 하고, 하기 식 :

저해율 [x] (％) = (1-(결합량 [x]/결합량 [0])) × 100

(식 중, 결합량 [0] 이란, 화합물을 첨가하지 않는 경우의 ³H-GBP 의 결합량을 나타낸다) 에 기초하여 저해율 (％) 을 구하여, 농도에 대해 저해율을 플롯하였다. 이 결과로부터 Cacna2d1/GBP 결합을 50 ％ 저해하는 데에 필요한 피검 화합물의 농도, 「IC₅₀ 값」 을 산출하였다.

(제조예 1)

[6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산

[화학식 4]

(1-a) (2E)-헵타-2,6-디엔산

4-펜테날 (4.45 g, 51.4 m㏖) 및 말론산 (6.41 g, 61.6 m㏖) 을 피리딘 (9.9 mL) 에 용해시키고, 거기에 피페리딘 (1.9 mL) 을 첨가한 후 90 ℃ 에서 5 시간 교반하였다. 방랭 후, 2 N 염산을 첨가하여 산성으로 한 후, 디에틸에테르로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하여 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 감압 증류하여, 목적물을 무색 유상 물질로서 얻었다 (3 ㎜Hg, 110-116 ℃, 3.27 g, 50 ％).

(1-b) 비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일리덴아세트산tert-부틸

(2E)-헵타-2,6-디엔산 (3.27 g, 25.9 m㏖) 의 톨루엔 용액 (60 mL) 에 염화옥살릴 (10 mL) 을 빙랭하에서 적하하였다. 20 분 교반 후, 빙수욕을 해제하고 서서히 실온까지 승온시켰다. 50 분 교반한 후, 반응액을 가열 환류하에서 1 시간 교반하였다. 방랭 후, 용매를 감압 증류 제거하고, 추가로 톨루엔을 첨가한 후, 다시 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 톨루엔 (20 mL) 에 용해시켜, 이것을 미리 90 ℃ 로 가열해 둔 트리에틸아민 (9.19 g, 91 m㏖) 의 톨루엔 용액 (20 mL) 에 1 시간에 걸쳐 적하하고, 적하 종료 후 다시 2 시간 가열 교반하였다. 반응액을 냉각 후, 포화 식염수, 물로 희석시켜, 셀라이트로 여과하였다. 여과액을 유기층과 수층으로 분리한 후, 유기층을 1 N 염산으로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조, 여과하였다. 이 여과액을 디메톡시포스포릴아세트산tert-부틸 (5.98 g, 25.9 m㏖) 의 디메톡시에탄 용액 (20 mL) 과 수소화나트륨 (> 65 ％ 유성, 986.7 ㎎, 25.9 m㏖) 으로 미리 조제한 반응액에 첨가하여 1 시간반 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액, 포화 식염수, 물을 순차적으로 첨가하고, 반응액을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 여과하고, 용매를 감압 증류 제거하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적물을 담황색 유상 물질로서 얻었다 (1.73 g, 32 ％, E/Z 체 혼합물).

(1-c) [6-(니트로메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸

비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일리덴아세트산tert-부틸 (1.73 g, 8.39 m㏖) 을 니트로메탄 (10 mL) 에 용해시키고, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데카-7-엔 (1.3 mL, 8.4 m㏖) 을 첨가하여 1 시간 실온에서 교반한 후, 50 - 60 ℃ 에서 5 시간 가열 교반하였다. 방랭 후, 1 N 염산, 포화 식염수로 희석시켜, 아세트산에틸로 추출 후, 무수 황산마그네슘으로 건조, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물을 무색 유상 물질로서 얻었다 (1.98 g, 89 ％).

(1-d) [6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸

[6-(니트로메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일아세트산]tert-부틸 (1.98 g, 7.41 m㏖) 을 에탄올 (20 mL) 및 물 (10 mL) 에 용해시키고, 철 분말 (2.07 g, 37.0 m㏖), 염화암모늄 (392.7 ㎎, 7.41 m㏖) 을 첨가하여 가열 환류하 4 시간반 교반하였다. 방랭 후, 포화 식염수, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 및 아세트산에틸로 희석시켜, 셀라이트 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여과액을 유기층과 수층으로 분리하여, 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 용매를 감압 증류 제거하여 목적물을 담황색 고체로서 얻었다 (1.99 g, 정제하지 않고 그대로 다음 반응에 사용).

(1-e) [6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산

[6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (0.99 g, 4.17 m㏖) 에 4 N 염산 아세트산에틸 용액 (10 mL) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 교반한 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물에 디클로로메탄을 첨가하여 현탁시킨 후, 트리에틸아민을 적하하여 생긴 분말을 여과 채취하였다. 얻어진 분말을 디클로로메탄으로 세정 후, 감압 건조시켜 목적물을 백색 분말로서 얻었다 (211.6 ㎎, 35 ％).

(제조예 2)

[6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 염산염

[화학식 5]

6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 (320.2 ㎎, 1.77 m㏖) 에 물 (5 mL), 4 N 염산 1,4-디옥산 용액 (22 mL) 을 첨가하여 실온에서 5 분 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔류물에 1,4-디옥산을 첨가하여 가열 후, 실온까지 방랭시켜 생긴 분말을 여과 채취하였다. 얻어진 분말을 1,4-디옥산으로 세정 후, 건조시켜 목적물을 백색 분말로서 얻었다 (350.0 ㎎, 92 ％).

(제조예 3)

[6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 벤젠술폰산염

[화학식 6]

6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 (152.2 g, 391 m㏖) 을 2-프로판올 (7.5 mL), 물 (2.6 mL) 에 용해시킨 후, 벤젠술폰산 1 수화물 (305.2 ㎎, 1.73 m㏖) 을 첨가하여 실온에서 5 분 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거하고, 다시 2-프로판올로 공비 탈수를 한 후, 잔류물을 2-프로판올로 세정 후, 목적물을 백색 분말로서 얻었다 (260.4 ㎎, 55 ％).

(제조예 4)

[6-아미노메틸-3-메틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산

[화학식 7]

(4-a) 4-메틸-3-하이드록시헵타-6-엔산메틸

3-옥소펜탄산메틸 (5.10 g, 39.2 m㏖) 의 테트라히드로푸란 용액 (50 mL) 에 수소화나트륨 (> 63 ％ 유성, 1.64 g, 43.1 m㏖) 을 빙랭하에서 첨가하여 그대로 10 분 교반하였다. 반응액에 n-부틸리튬 (1.66 M 헥산 용액, 25.9 mL, 43.1 m㏖) 을 적하하고, 다시 빙랭하에서 10 분 교반한 후, 브롬화알릴 (5.18 g, 43.1 m㏖) 을 첨가하여 그대로 30 분 교반한 후, 실온에서 하룻밤 더 교반하였다. 반응액에 1 N 염산, 포화 식염수를 첨가한 후, 디에틸에테르로 추출하였다. 포화 식염수로 유기층을 세정, 무수 황산마그네슘으로 건조시켜, 용매를 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 메탄올 (100 mL) 에 용해시켜, 빙랭하에서 수소화붕소나트륨 (1.89 g, 50 m㏖) 을 첨가하여 그대로 1 시간반 교반하였다. 2 N 염산 (50 mL) 을 첨가하여 30 분 교반한 후, 포화 식염수를 첨가하여 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켜, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적물을 담황색 유상 물질로서 얻었다 (5.72 g, 85 ％, 디아스테레오머의 혼합물).

(4-b) 4-메틸-3-하이드록시헵타-6-엔산

4-메틸-3-하이드록시헵타-6-엔산메틸 (5.72 g, 33.2 m㏖) 을 2 N 수산화칼륨메탄올 용액 (50 mL) 에 용해시켜 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응액의 용매를 감압 증류 제거한 후, 1 N 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 디에틸에테르로 추출하였다. 수층을 빙랭하에서 진한 염산을 첨가하여 산성으로 한 후, 다시 디에틸에테르로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거하여 목적물을 황색 유상 물질로서 얻었다 (2.21 g, 42 ％, 디아스테레오머의 혼합물).

(4-c) 3-메틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일리덴아세트산tert-부틸

4-메틸-3-하이드록시헵타-6-엔산 (2.21 g, 13.9 m㏖) 을 무수 아세트산 (14 mL) 에 용해시키고, 아세트산칼륨 (3.29 g, 33.4 m㏖) 을 첨가하여 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 110 - 120 ℃ 로 가열하여 3 시간반 교반한 후, 반응액에 빙수, 톨루엔을 첨가하여 그대로 실온에서 1 시간 교반하였다. 포화 식염수, 톨루엔을 첨가하여 분액 후, 유기층을 1 N 수산화나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 세정하고 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 여과하였다. 이 여과액을, 디메톡시포스포릴아세트산tert-부틸 (3.24 g, 14.5 m㏖) 의 테트라히드로푸란 용액 (20 mL) 에 빙랭하에서 수소화나트륨 (> 63 ％ 유성, 533.3 ㎎, 14.0 m㏖) 을 첨가하여 조제한 반응액에 넣어 1 시간반 더 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액, 포화 식염수를 첨가하여 분액하였다. 수층을 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 합쳐 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적물을 담황색 유상 물질로서 얻었다 (1.21 g, 40 ％, E/Z 체 혼합물).

(4-d) [3-메틸-6-(니트로메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸

3-메틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일리덴아세트산tert-부틸 (1.21 g, 5.50 m㏖) 을 니트로메탄 (7 mL) 에 용해시키고, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데카-7-엔 (0.91 mL, 6.0 m㏖) 을 첨가하여, 50 - 60 ℃ 에서 6 시간 가열 교반하였다. 방랭 후, 포화 인산 2 수소칼륨 수용액을 첨가하여 아세트산에틸로 추출 후, 무수 황산마그네슘으로 건조, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물을 무색 유상 물질로서 얻었다 (1.14 g, 74 ％).

(4-e) [6-아미노메틸-3-메틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸

[3-메틸-6-(니트로메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (1.12 g, 3.99 m㏖) 을 에탄올 (20 mL) 및 물 (10 mL) 에 용해시키고, 철 분말 (892.8 ㎎, 15.9 m㏖), 염화암모늄 (211.5 ㎎, 3.99 m㏖) 을 첨가하여 가열 환류하 4 시간 교반하였다. 방랭 후, 포화 식염수, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 및 아세트산에틸로 희석시켜, 셀라이트 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여과액을 유기층과 수층으로 분리하여, 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물에 4 N 염산 아세트산에틸 용액 (5 mL) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 교반한 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 디클로로메탄에 현탁시켜 트리에틸아민을 적하하고, 생긴 분말을 여과 채취, 디클로로메탄으로 세정 후, 건조시켜 목적물을 백색 분말로서 얻었다 (105.8 ㎎, 28 ％).

(제조예 5)

[6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산

[화학식 8]

(5-a) 4-에틸-3-하이드록시헵타-6-엔산에틸

3-옥소헥산산에틸 (7.91 g, 50 m㏖) 의 테트라히드로푸란 용액 (50 mL) 에 수소화나트륨 (> 63 ％ 유성, 2.09 g, 55 m㏖) 을 빙랭하에서 첨가하여 그대로 10 분 교반하였다. 반응액에 n-부틸리튬 (1.58 M 헥산 용액, 34.8 mL, 55 m㏖) 을 적하하고, 다시 빙랭하에서 10 분 교반한 후, 브롬화알릴 (4.7 mL, 55 m㏖) 을 첨가하여 그대로 1 시간 교반한 후, 실온에서 다시 4 시간 교반하였다. 반응액에 1 N 염산, 포화 염화암모늄 수용액을 첨가한 후, n-펜탄으로 추출하였다. 포화 식염수로 유기층을 세정, 무수 황산마그네슘으로 건조시켜, 용매를 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 에탄올 (80 mL) 에 용해시키고, 빙랭하에서 수소화붕소나트륨 (1.51 g, 40 m㏖) 을 첨가하여 그대로 2 시간 교반하였다. 1 N 염산 (50 mL) 을 첨가하여 30 분 교반한 후, 포화 식염수를 첨가하여 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켜, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적물을 담황색 유상 물질로서 얻었다 (3.64 g, 37 ％, 디아스테레오머의 혼합물).

(5-b) 4-에틸-3-하이드록시헵타-6-엔산

4-에틸-3-하이드록시헵타-6-엔산에틸 (3.64 g, 18.2 m㏖) 을 2 N 수산화칼륨메탄올 용액 (120 mL) 에 용해시켜, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응액의 용매를 감압 증류 제거한 후, 1 N 수산화나트륨 수용액 (200 mL) 을 첨가하여 디에틸에테르로 추출하였다. 수층을 빙랭하에서 진한 염산을 첨가하여 산성으로 한 후, 다시 디에틸에테르로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거하여 목적물을 담황색 유상 물질로서 얻었다 (3.14 g, < 100 ％, 디아스테레오머의 혼합물).

(5-c) 3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일리덴아세트산tert-부틸

4-에틸-3-하이드록시헵타-6-엔산 (3.13 g, 18.2 m㏖) 을 무수 아세트산 (15 mL) 에 용해시키고, 아세트산칼륨 (4.27 g, 43.6 m㏖) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 40 분 교반하였다. 반응액을 가열 환류하고 3 시간반 교반하여, 반응액 중에 「3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-6-엔-6-온」 을 생성시킨후, 반응액에 빙수, 톨루엔을 첨가하여 그대로 실온에서 하룻밤 교반하였다. 포화 식염수 (50 mL), 톨루엔 (20 mL) 을 첨가하여 분액 후, 유기층을 1 N 수산화나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 세정하고 무수 황산마그네슘으로 건조시켜 여과하였다. 이 여과액을, 디메톡시포스포릴아세트산tert-부틸 (4.48 g, 20 m㏖) 의 테트라히드로푸란 용액 (50 mL) 에 빙랭하에서 수소화나트륨 (> 65 ％ 유성, 761.9 ㎎, 20 m㏖) 을 첨가하여 조제한 반응액에 넣어 1 시간 더 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액, 포화 식염수를 첨가하여 분액하였다. 수층을 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 합하여 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적물을 담황색 유상 물질로서 얻었다 (1.32 g, 31 ％, E/Z 체 혼합물).

¹H-NMR (400MHz, CDCl₃) : δ ppm :

(5-d) [3-에틸-6-(니트로메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸

[3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일리덴아세트산tert-부틸 (1.32 g, 5.63 m㏖) 을 니트로메탄 (7 mL) 에 용해시키고, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데카-7-엔 (1.2 mL, 7.3 m㏖) 을 첨가하여 50 - 60 ℃ 에서 7 시간 가열 교반하였다. 방랭 후, 포화 인산 2 수소칼륨 수용액을 첨가하여 아세트산에틸로 추출 후, 무수 황산마그네슘으로 건조, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물을 무색 유상 물질로서 얻었다 (1.39 g, 84 ％).

(5-e) [6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산

[3-에틸-6-(니트로메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (1.09 g, 4.71 m㏖) 을 에탄올 (10 mL) 및 물 (5 mL) 에 용해시키고, 철 분말 (1.32 g, 23.5 m㏖), 염화암모늄 (249.6 ㎎, 4.71 m㏖) 을 첨가하여 가열 환류하 2 시간 교반하였다. 방랭 후, 포화 식염수, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 및 아세트산에틸로 희석시켜, 셀라이트 여과에 의해 불용물을 제거하였다. 여과액을 유기층과 수층으로 분리하여, 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 잔류물에 4 N 염산 아세트산에틸 용액 (20 mL) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 교반한 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 디클로로메탄에 현탁시켜 트리에틸아민을 적하하고, 생긴 분말을 여과 채취, 디클로로메탄으로 세정 후, 건조시켜 목적물을 백색 분말로서 얻었다 (425.1 ㎎, 43 ％).

(제조예 6)

[6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 p-톨루엔술폰산염

[화학식 9]

[6-(tert-부톡시카르보닐아미노)메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (1152.23 g, 391.6 m㏖) 을 벤젠 (1.2 L) 에 용해시킨 후, 티오아니솔 (145.57 g, 1173 m㏖) 및 p-톨루엔술폰산 1 수화물 (89.39 g) 을 첨가하여 환류하 2 시간 교반하였다. 하룻밤 실온에서 가만히 정지시켜, 생긴 분말을 여과 채취하였다. 얻어진 분말을 아세트산에틸로 세정 후, 건조시켜 목적물을 백색 분말로서 얻었다 (88.29 g, 59 ％).

(제조예 7)

[6-(아미노메틸)-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 벤젠술폰산염

[화학식 10]

6-(아미노메틸)-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 (4.50 g, 20.6 m㏖) 을 벤젠술폰산 1 수화물의 1 몰 수용액 (22.7 mL) 에 가열 용해시킨 후, 실온까지 방랭시켜 생긴 고체를 여과 채취하였다. 고체를 물 (15 mL) 로 세정한 후, 진공 펌프로 건조시켜 목적물을 무색 고체로서 얻었다 (6.45 g, 77 ％).

(니트로기의 환원 공정)

(제조예 8)

[6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸

[화학식 11]

(ⅰ)

[3-에틸-6-(니트로메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 709.0 g (Net : 681.8 g, 2.31 ㏖, 85 : 15 의 디아스테레오머 혼합물) 에 레이니 니켈 102.3 g (0.15 w/w), 그리고, 에탄올 5.5 L (8.0 v/w) 를 첨가하여 교반하였다. 반응액에 히드라진 1 수화물 458.0 ㎖ (9.23 ㏖, 4.00 eq.) 를 첨가하여 40 도에서 2 시간 교반하였다. 실온까지 냉각시켜 레이니 니켈을 여과 제거한 후, 용매를 증류 제거하여 갈색 유상물로서 목적물 637.0 g (Net : 552.3 g, 수율 : 90.2 ％) 을 얻었다 (85 : 15 의 디아스테레오머 혼합물).

(ⅱ)

[3-에틸-6-(니트로메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 59 ㎎ (85 : 15 의 디아스테레오머 혼합물) 에 레이니 니켈 96 ㎎ (0.16 w/w), 그리고, 에탄올 200 μL 를 첨가하여 수소 분위기나 실온에서 12 시간 교반하였다. 레이니 니켈을 여과 제거한 후, 용매를 증류 제거하여 갈색 유상물로서 목적물 49 ㎎ (수율 : 92 ％, 85 : 15 의 디아스테레오머 혼합물) 을 얻었다.

(제조예 9)

[6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸

[화학식 12]

[6-(니트로메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 4.0 g (90 : 10 의 디아스테레오머 혼합물) 에 레이니 니켈 0.4 g, 그리고, 에탄올 24 ㎖ 를 첨가하여 교반하였다. 반응액에 히드라진 1 수화물 2.9 ㎖ 를 첨가하여 0.5 시간 교반하였다. 박층 크로마토그래피로 원료 소실을 확인 후, 레이니 니켈을 여과 제거하고 용매를 증류 제거하여 갈색 유상물로서 목적물 3.62 g 을 얻었다 (90 : 10 의 디아스테레오머 혼합물).

박층 크로마토그래피 전개액 : 헥산 : 아세트산에틸 = 9 : 1

니트로체 Rf 값 0.7, 환원체 Rf 값 0.1 테일링

(제조예 10)

[6-아미노메틸-3-메틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸

[화학식 13]

[6-(니트로메틸)-3-메틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 2.81 g (90 : 10 의 디아스테레오머 혼합물) 에 레이니 니켈 0.28 g, 그리고, 에탄올 20 ㎖ 를 첨가하여 교반하였다. 반응액에 히드라진 1 수화물 1.9 ㎖ 를 첨가하여 0.75 시간 교반하였다. 박층 크로마토그래피로 원료 소실을 확인 후, 레이니 니켈을 여과 제거하고 용매를 증류 제거하여 갈색 유상물로서 목적물 2.50 g 을 얻었다 (90 : 10 의 디아스테레오머 혼합물).

박층 크로마토그래피 전개액 : 헥산 : 아세트산에틸 = 9 : 1

니트로체 Rf 값 0.7, 환원체 Rf 값 0.1 테일링

(디아스테레오머를 분할하는 공정)

(제조예 11)

[(1R^*,5S^*,6S^*)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 p-톨루엔술폰산염

[화학식 14]

[6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (87 : 13 의 디아스테레오머 혼합물) 7.8 g (순도 86.7 ％, 22.03 m㏖) 에 아세트산에틸 70 ㎖ (10.4 v/w) 를 첨가하여 실온에서 교반하였다. p-톨루엔술폰산 1 수화물 4.2 g (22.03 m㏖, 0.87 eq.) 을 첨가하여 실온에서 3 시간 교반하고, 결정을 여과 채취하였다. 그 후, 40 도 조건하 감압 건조를 실시하여, 백색 결정으로서 [(1R^*,5S^*,6S^*)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 p-톨루엔술폰산염 7.8 g (수율 : 80.6 ％, 디아스테레오비 99.7 : 0.3) 을 얻었다.

GC 분석 조건 (디아스테레오머비 측정)

칼럼 : CP-Sil 8 CB for Amine (GL Science, 30 m × 0.25 ㎜, 0.25 ㎛)

검출기 : FID

온도 : column oven (130 ℃), injection (250 ℃), detector (250 ℃)

온도 조건 : (ⅰ) 130 ℃ (5.5 min), (ⅱ) 130 - 270 ℃ (10 ℃ /min), (ⅲ) 270 ℃ (4.5 min)

유속 : 1.5 ㎖/min (평균 선속도 : 38 cm/sec)

스플릿비 : 1/10

캐리어 가스 : 헬륨

분석 시간 : 25 min

피크 컷 : 0.0 - 2.0 min

유지 시간 : 13.8 min, 14.0 min

(광학 분할 공정)

(제조예 12)

[(1R,5S,6S)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 광학 활성 카르복실산염

[화학식 15]

[(1R^*,5S^*,6S^*)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 p-톨루엔술폰산염을 아세트산에틸 (20 v/w) 에 현탁시키고, 탄산수소나트륨 수용액 (4 v/w) 을 첨가하고 분액하여, [(1R^*,5S^*,6S^*)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸의 프리체를 얻었다. 그 [(1R^*,5S^*,6S^*)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (200 ㎎, 0.754 m㏖) 에 디이소프로필에테르 (IPE) 혹은 아세토니트릴 (MeCN) 1.0 mL (5.0 v/w) 를 첨가하고, 광학 활성 카르복실산 (0.5 당량) 을 첨가하여 실온에서 교반하였다. 석출한 결정을 여과하고, 사용한 용매 0.5 mL (2.5 v/w) 로 세정하였다. 얻어진 결정을 감압하에서 건조시켜, 하기 표 1 의 수율, 광학 순도에 상당하는 염의 형태를 얻었다.

또한, 광학 순도는 얻어진 염을 탄산수소나트륨 수용액으로 프리화한 후, 3,5-Dinitrobenzoyl 체로 유도 후 분석 실시하였다.

HPLC 분석 조건 (광학 순도 측정, 3,5-Dinitrobenzoyl 체로 유도 후 분석 실시)

칼럼 : CHIRALPAK AS-RH × 2 (Daisel, 4.6 ㎜ × 150 ㎜, 5 ㎛)

검출 : 220 ㎚, 칼럼 온도 : 40 ℃, 유속 : 0.8 ㎖/min

이동상 : MeCN/5 mM 인산 완충액 (pH 7.0) = 55/45

유지 시간 : 29.6 min, 31.8 min, 36.1 min

(디아스테레오머 혼합물로부터 광학 분할을 실시하는 공정)

(실시예 1)

[(1R,5S,6S)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 D-만델산염

[화학식 16]

[6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (85 : 15 디아스테레오머 혼합물) 627.0 g (Net : 543.6 g, 2.05 ㏖) 에 아세토니트릴 4.7 L (8.6 v/w) 를 첨가하여 40 도에서 교반하였다. 반응액에 D-만델산 116.3 g (0.76 m㏖, 0.37 eq.) 을 첨가하여 40 도에서 1 시간 교반한 후, 3 도까지 서랭시켰다. 3 도에서 1 시간 교반한 후, 결정을 여과 채취하였다. 그 후, 40 도 조건하 감압 건조를 실시하여 백색 분말로서 [(1R,5S,6S)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 D-만델산염 251.2 g (수율 : 29.4 ％, 97.6 ％ee, 99.6 ％de) 을 얻었다.

(실시예 2)

[(1R,5S,6S)-6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (S)-O아세틸-만델산염

[화학식 17]

[6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (90 : 10 디아스테레오머 혼합물) 1.9 g (8.0 m㏖) 에 아세토니트릴 10 mL (5.0 v/w) 를 첨가하고, (S)-O아세틸-만델산 (0.45 당량) 을 첨가하여 실온에서 교반하였다. 2.5 시간 후, 석출한 결정을 여과하고 아세토니트릴로 세정하였다. 얻어진 결정을 감압하에서 건조시켜 백색 결정으로서 [(1R,5S,6S)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (S)-O아세틸-만델산염 0.904 g (수율 : 26.2 ％, 90.4 ％ee, 99 ％de) 을 얻었다. 이 백색 결정 620 ㎎ 을 아세토니트릴 6.2 mL (10.0 v/w) 에 현탁시켜, 실온하 10 분 교반하였다. 결정을 여과하고, 얻어진 결정을 감압하에서 건조시켜 백색 분말로서 (S)-O아세틸-만델산염 557.6 ㎎ (광학 순도 95.7 ％ee) 을 얻었다.

(실시예 3)

[(1R,5S,6S)-6-아미노메틸-3-메틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 D-만델산염

[6-아미노메틸-3-메틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (90 : 10 디아스테레오머 혼합물) 237 ㎎ (1 m㏖) 에 용매 2.5 mL (10 v/w) 를 첨가하고, D-만델산 (0.5 당량) 을 첨가하여 빙랭하에서 2 시간 교반하였다. 석출한 결정을 여과하였다. 얻어진 결정을 감압하에서 건조시켜, 하기 표 2 의 수율, 광학 순도로 D-만델산염을 얻었다. 또한, 광학 순도는 얻어진 염을 탄산수소나트륨 수용액으로 프리화한 후, 3,5-Dinitrobenzoyl 체로 유도 후 분석 실시하였다.

[화학식 18]

	Solvent	Yield	ee％^a)
1	아세토니트릴	8.5％	48.5％ee
2	아세트산에틸	4.6％	79.9％ee
3	톨루엔	11.2％	85.0％ee
4	시클로펜틸메틸에테르	13.8％	82.4％ee

a) 3,5-dinitrobenzoly chloride, HPLC

칼럼 : CHIRALPAK AS-RH × 2 (Daisel, 4.6 ㎜ × 150 ㎜, 5 ㎛)

검출 : 220 ㎚, 칼럼 온도 : 40 ℃, 유속 : 0.8 ㎖/min

이동상 : MeCN/5mM 인산 완충액 (pH 7.0) = 55/45

유지 시간 : 28.0 min, 23.6 min, 26.0 min

(에스테르기의 탈보호와 염 형성 공정)

(실시예 4)

[(1R,5S,6S)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 p-톨루엔술폰산염

[(1R,5S,6S)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 D-만델산염 4.17 g (10 m㏖) 을 톨루엔 21 ㎖ 에 현탁시켜, 트리에틸아민 2.09 ㎖ 를 첨가하고, 다시 물 21 ㎖ 를 첨가하여 실온하에서 교반하였다. 20 분 후 유기층을 분리 추출하고, 물 10 ㎖ 로 재차 유기층을 세정한 후, 감압 농축하여 프리체의 [(1R,5S,6S)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸을 유상물로서 얻었다. 이것에 톨루엔 16 ㎖ 를 첨가하고 p-톨루엔술폰산 1 수화물 2.28 g 을 첨가하여 70 도에서 교반하였다. 도중에 톨루엔 15 ㎖ 를 추가하여 3 시간 후에 방랭시켰다. 석출한 고체를 여과하고, 톨루엔으로 세정한 후, 감압 건조시켜 [(1R,5S,6S)-6-아미노메틸-3-에틸비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 p-톨루엔술폰산염을 백색 분말 3.90 g 으로서 얻었다.

(실시예 5)

[(1R,5S,6S)-6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 벤젠술폰산염

[(1R,5S,6S)-6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸 (S)-O아세틸-만델산염 116 ㎎ (0.269 m㏖) 을 아니솔 0.58 ㎖ 에 현탁시켜, 물 0.6 ㎖ 를 첨가하고, 다시 트리에틸아민 0.045 ㎖ 를 첨가하여 실온하에서 교반하였다. 15 분 후 유기층을 분리 추출하고, 물 300 ㎖ 로 재차 유기층을 세정한 후, 감압 농축하여 프리체의 [(1R,5S,6S)-6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산tert-부틸의 아니솔 용액을 얻었다. 이것에 벤젠술폰산 46 ㎎ 을 첨가하여 70 도에서 1.25 시간 교반하고 방랭시켰다. 석출한 고체를 여과하고, 여과한 분말에 재차 아세톤으로 세정하고, 감압하 건조시켜 [(1R,5S,6S)-6-(아미노메틸)비시클로[3.2.0]헵타-3-엔-6-일]아세트산 벤젠술폰산염을 백색 분말 55.5 ㎎ 으로서 얻었다.

배열표 프리텍스트

배열 번호 1 은 인간 Cacna2d1 전반의 PCR 센스 프라이머이다.

배열 번호 2 는 인간 Cacna2d1 전반의 PCR 안티센스 프라이머이다.

배열 번호 3 은 인간 Cacna2d1 후반의 PCR 센스 프라이머이다.

배열 번호 4 는 인간 Cacna2d1 후반의 PCR 안티센스 프라이머이다.

배열 번호 5 는 벡터 pBluescript 2 의 멀티 클로닝 사이트이다.

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Synthetic process for Bicyclo-gamma-aminoacid Derivative <130> DSFP1024 <160> 7 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR sense primer for human Cacna2d1 front <400> 1 agctgcggcc gctagcgcca ccatggctgg ctgcctgctg gc 42 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR antisense primer for human Cacna2d1 front <400> 2 attaggatcg attgcaaagt aataccc 27 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR sense primer for human Cacna2d1 rear <400> 3 aatgggtatt actttgcaat cgatcc 26 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR antisense primer for human Cacna2d1 rear <400> 4 agtcggatcc tcataacagc cggtgtgtgc tg 32 <210> 5 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multi cloning site of vector pBluescript 2 <400> 5 ccaccgcggt ggcggccgct ctagaactag tggatccccc gggctgcagg aattcgatat 60 caagcttatc gataccgtcg acctcgaggg ggggcccg 98 <210> 6 <211> 1573 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggcggccgct agcgccacca tggctgctgg ctgcctgctg gccttgactc tgacactttt 60 ccaatctttg ctcatcggcc cctcgtcgga ggagccgttc ccttcggccg tcactatcaa 120 atcatgggtg gataagatgc aagaagacct tgtcacactg gcaaaaacag caagtggagt 180 caatcagctt gttgatattt atgagaaata tcaagatttg tatactgtgg aaccaaataa 240 tgcacgccag ctggtagaaa ttgcagccag ggatattgag aaacttctga gcaacagatc 300 taaagccctg gtgcgcctgg cattggaagc ggagaaagtt caagcagctc accagtggag 360 agaagatttt gcaagcaatg aagttgtcta ctacaatgca aaggatgatc tcgatcctga 420 gaaaaatgac agtgagccag gcagccagag gataaaacct gttttcattg aagatgctaa 480 ttttggacga caaatatctt atcagcacgc agcagtccat attcctactg acatctatga 540 gggctcaaca attgtgttaa atgaactcaa ctggacaagt gccttagatg aagttttcaa 600 aaagaatcgc gaggaagacc cttcattatt gtggcaggtt tttggcagtg ccactggcct 660 agctcgatat tatccagctt caccatgggt tgataatagt agaactccaa ataagattga 720 cctttatgat gtacgcagaa gaccatggta catccaagga gctgcatctc ctaaagacat 780 gcttattctg gtggatgtga gtggaagtgt tagtggattg acacttaaac tgatccgaac 840 atctgtctcc gaaatgttag aaaccctctc agatgatgat ttcgtgaatg tagcttcatt 900 taacagcaat gctcaggatg taagctgttt tcagcacctt gtccaagcaa atgtaagaaa 960 taaaaaagtg ttgaaagacg cggtgaataa tatcacagcc aaaggaatta cagattataa 1020 gaagggcttt agttttgctt ttgaacagct gcttaattat aatgtttcca gagcaaactg 1080 caataagatt attatgctat tcacggatgg aggagaagag agagcccagg agatatttaa 1140 caaatacaat aaagataaaa aagtacgtgt attcacgttt tcagttggtc aacacaatta 1200 tgacagagga cctattcagt ggatggcctg tgaaaacaaa ggttattatt atgaaattcc 1260 ttccattggt gcaataagaa tcaatactca ggaatatttg gatgttttgg gaagaccaat 1320 ggttttagca ggagacaaag ctaagcaagt ccaatggaca aatgtgtacc tggatgcatt 1380 ggaactggga cttgtcatta ctggaactct tccggtcttc aacataaccg gccaatttga 1440 aaataagaca aacttaaaga accagctgat tcttggtgtg atgggagtag atgtgtcttt 1500 ggaagatatt aaaagactga caccacgttt tacactgtgc cccaatgggt attactttgc 1560 aatcgatcct aat 1573 <210> 7 <211> 3301 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggcggccgct agcgccacca tggctgctgg ctgcctgctg gccttgactc tgacactttt 60 ccaatctttg ctcatcggcc cctcgtcgga ggagccgttc ccttcggccg tcactatcaa 120 atcatgggtg gataagatgc aagaagacct tgtcacactg gcaaaaacag caagtggagt 180 caatcagctt gttgatattt atgagaaata tcaagatttg tatactgtgg aaccaaataa 240 tgcacgccag ctggtagaaa ttgcagccag ggatattgag aaacttctga gcaacagatc 300 taaagccctg gtgcgcctgg cattggaagc ggagaaagtt caagcagctc accagtggag 360 agaagatttt gcaagcaatg aagttgtcta ctacaatgca aaggatgatc tcgatcctga 420 gaaaaatgac agtgagccag gcagccagag gataaaacct gttttcattg aagatgctaa 480 ttttggacga caaatatctt atcagcacgc agcagtccat attcctactg acatctatga 540 gggctcaaca attgtgttaa atgaactcaa ctggacaagt gccttagatg aagttttcaa 600 aaagaatcgc gaggaagacc cttcattatt gtggcaggtt tttggcagtg ccactggcct 660 agctcgatat tatccagctt caccatgggt tgataatagt agaactccaa ataagattga 720 cctttatgat gtacgcagaa gaccatggta catccaagga gctgcatctc ctaaagacat 780 gcttattctg gtggatgtga gtggaagtgt tagtggattg acacttaaac tgatccgaac 840 atctgtctcc gaaatgttag aaaccctctc agatgatgat ttcgtgaatg tagcttcatt 900 taacagcaat gctcaggatg taagctgttt tcagcacctt gtccaagcaa atgtaagaaa 960 taaaaaagtg ttgaaagacg cggtgaataa tatcacagcc aaaggaatta cagattataa 1020 gaagggcttt agttttgctt ttgaacagct gcttaattat aatgtttcca gagcaaactg 1080 caataagatt attatgctat tcacggatgg aggagaagag agagcccagg agatatttaa 1140 caaatacaat aaagataaaa aagtacgtgt attcacgttt tcagttggtc aacacaatta 1200 tgacagagga cctattcagt ggatggcctg tgaaaacaaa ggttattatt atgaaattcc 1260 ttccattggt gcaataagaa tcaatactca ggaatatttg gatgttttgg gaagaccaat 1320 ggttttagca ggagacaaag ctaagcaagt ccaatggaca aatgtgtacc tggatgcatt 1380 ggaactggga cttgtcatta ctggaactct tccggtcttc aacataaccg gccaatttga 1440 aaataagaca aacttaaaga accagctgat tcttggtgtg atgggagtag atgtgtcttt 1500 ggaagatatt aaaagactga caccacgttt tacactgtgc cccaatgggt attactttgc 1560 aatcgatcct aatggttatg ttttattaca tccaaatctt cagccaaaga accccaaatc 1620 tcaggagcca gtaacattgg atttccttga tgcagagtta gagaatgata ttaaagtgga 1680 gattcgaaat aagatgattg atggggaaag tggagaaaaa acattcagaa ctctggttaa 1740 atctcaagat gagagatata ttgacaaagg aaacaggaca tacacatgga cacctgtcaa 1800 tggcacagat tacagtttgg ccttggtatt accaacctac agtttttact atataaaagc 1860 caaactagaa gagacaataa ctcaggccag atcaaaaaag ggcaaaatga aggattcgga 1920 aaccctgaag ccagataatt ttgaagaatc tggctataca ttcatagcac caagagatta 1980 ctgcaatgac ctgaaaatat cggataataa cactgaattt cttttaaatt tcaacgagtt 2040 tattgataga aaaactccaa acaacccatc atgtaacgcg gatttgatta atagagtctt 2100 gcttgatgca ggctttacaa atgaacttgt ccaaaattac tggagtaagc agaaaaatat 2160 caagggagtg aaagcacgat ttgttgtgac tgatggtggg attaccagag tttatcccaa 2220 agaggctgga gaaaattggc aagaaaaccc agagacatat gaggacagct tctataaaag 2280 gagcctagat aatgataact atgttttcac tgctccctac tttaacaaaa gtggacctgg 2340 tgcctatgaa tcgggcatta tggtaagcaa agctgtagaa atatatattc aagggaaact 2400 tcttaaacct gcagttgttg gaattaaaat tgatgtaaat tcctggatag agaatttcac 2460 caaaacctca atcagagatc cgtgtgctgg tccagtttgt gactgcaaaa gaaacagtga 2520 cgtaatggat tgtgtgattc tggatgatgg tgggtttctt ctgatggcaa atcatgatga 2580 ttatactaat cagattggaa gattttttgg agagattgat cccagcttga tgagacacct 2640 ggttaatata tcagtttatg cttttaacaa atcttatgat tatcagtcag tatgtgagcc 2700 cggtgctgca ccaaaacaag gagcaggaca tcgctcagca tatgtgccat cagtagcaga 2760 catattacaa attggctggt gggccactgc tgctgcctgg tctattctac agcagtttct 2820 cttgagtttg acctttccac gactccttga ggcagttgag atggaggatg atgacttcac 2880 ggcctccctg tccaagcaga gctgcattac tgaacaaacc cagtatttct tcgataacga 2940 cagtaaatca ttcagtggtg tattagactg tggaaactgt tccagaatct ttcatggaga 3000 aaagcttatg aacaccaact taatattcat aatggttgag agcaaaggga catgtccatg 3060 tgacacacga ctgctcatac aagcggagca gacttctgac ggtccaaatc cttgtgacat 3120 ggttaagcaa cccagatacc gaaaagggcc tgatgtctgc tttgataaca atgtcttgga 3180 ggattatact gactgtggtg gtgtttctgg attaaatccc tccctgtggt atatcattgg 3240 aatccagttt ctactacttt ggctggtatc tggcagcaca caccggctgt tatgaggatc 3300 c 3301

Claims

일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 광학 분할에 의해 제조하는 방법으로,
[화학식 1]

(I)
[식 중, 각 치환기는 이하와 같이 정의된다.
R¹ : 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기
R² : 수소 원자 또는 카르복실기의 보호기]
일반식 (Ⅱ), (Ⅲ), (Ⅳ) 및 (Ⅴ) 를 갖는 화합물의 혼합물과 광학 활성 유기산을 용매에 용해시킨 후,
[화학식 2]

결정을 석출시킴으로써, 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서,
R¹ 이 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기인 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
R²가 t-부틸기인 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
광학 활성 유기산이 이하의 군에서 선택되는 어느 광학 활성 유기산인 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.
D-만델산, L-만델산, Di-p-톨루오일-L-타르타르산, N-Boc-L-프롤린, (R)-α-메톡시페닐아세트산, O-아세틸-L-만델산, Di-벤조일-L-타르타르산, O-아세틸-D-만델산, N-Boc-L-알라닌, (S)-2-(6-메톡시-2-나프틸)프로피온산, 디아세틸-L-타르타르산, L-타르타르산, L-말산, L-피로글루탐산, (＋)-캄포르산, (S)-2-메틸글루탐산, (＋)-3-브로모캄파-8-술폰산, (－)-멘톡시아세트산, (S)-2-페녹시프로피온산
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
용매가 이하의 군에서 선택되는 어느 용매인 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.
아세토니트릴, 아세트산에틸, 톨루엔, 시클로펜틸메틸에테르
일반식 (X) 를 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법으로,
[화학식 2]

(X)
[식 중, 각 치환기는 이하와 같이 정의된다.
R¹ : 수소 원자 또는 C1-C6 알킬기]
제 1 항에 기재된 제조 방법에 의해 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물을 제조한 후,
당해 일반식 (Ⅰ) 을 갖는 화합물의 카르복실기의 보호기 R² 를 탈보호하는 공정을 거치거나, 또는 다시 산과 염을 형성하는 공정을 거침으로써, 일반식 (X) 를 갖는 화합물 또는 그 염을 제조하는 방법.