BRPI0921799B1 - Compostos que expandem células-tronco hematopoétticas - Google Patents

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Anthony E. Boitano
Michael Cooke
Shifeng Pan
Peter G. Schultz
John Tellew
Yongqin Wan
Xing Wang
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Novartis Ag
The Scripps Research Institute
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Abstract

compostos que expandem células-tronco hematopoéticas. a presente invenção refere-se a compostos e composições para a expansão do número de células de cd34+ para transplante. a invenção também se refere a uma população de células que compreende células-tronco hematopoéticas expandidas (hscs) e seu uso em transplante autólogo ou alogênico para o tratamento de pacientes com doenças imunodeficientes e autoimunes herdadas e distúrbios hematopoéticos diversos para reconstruir as linhagens de células hematopoéticas e defesa do sistema imune.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos Número 61/109.821, depositado em 30 de outubro de 2008 e Pedido de Patente Provisional dos Estados U- nidos Número 61/242.765, depositado em 15 de setembro de 2009. As descrições completas destes pedidos estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade e para todos os propósitos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a compostos e composições para a expansão do número de células de CD34+ para transplante. A invenção também se refere a uma população de células que compreende células- tronco hematopoéticas expandidas (HSCs) e seu uso em transplante autólo- go ou alogênico para o tratamento de pacientes com doenças imunodeficien- tes e autoimunes herdadas e distúrbios hematopoéticos diversos para reconstituir as linhagens de células hematopoéticas e defesa do sistema imune.
Antecedentes
Células-tronco hematopoéticas (HSCs) são capazes de regenerar todos os produtos do sangue ao longo da vida de um indivíduo, equilibrando sua autorrenovação com a diferenciação de progénie. Células- tronco hematopoéticas têm potencial terapêutico como resultado de sua ca-pacidade para restaurar células do sangue e imunes em receptores de transplantes. Além disso, HSCs têm o potencial para gerar células para outros tecidos tais como cérebro, músculo e fígado. Métodos de transplante de medula óssea autólogo e alogênico humano são atualmente empregados como terapias para leucemia, linfoma, e outras doenças que põem em risco a vida. Para estes procedimentos, um grande número de células-tronco deve ser isolado para assegurar que haja bastante HSCs para o enxerto. O número de HSCs disponíveis para o tratamento é uma limitação clínica.
A presente invenção refere-se a compostos e composições para a expansão de populações de células-tronco hematopoéticas e usos das mesmas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a presente invenção fornece um composto de fórmula I:
Figure img0001
em que: Gi é selecionado de N e CR3; G2, G3 e G4 são independentemente selecionados de CH e N; com a condição de que pelo menos 1 dentre G3 e G4 seja N; com a condição de que Gi e G2 não sejam igualmente N;
L é selecionado de –NR5a(CH2)o-3- (0-3 aqui significa 0, 1, 2 ou 3), -NR5aCH(C(O)OCH3)CH2-, -NR5a(CH2)2NR5b-, -NR5a(CH2)2S-, -
NR5aCH2CH(CH3)CH2-, -NR5aCH2CH(OH)- e –NR5aCH(CH3)CH2-; em que R5a e Rδb são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila;
R1 é selecionado de hidrogênio, fenila, tiofenila, furanila, 1H- benzoimidazolila, isoquinolinila, 1H-imidazopiridinila, benzotiofenila, pirimidi- nila, 1H-pirazolila, piridinila, 1H-imidazolila, pirrolidinila, pirazinila, piridazinila, 1 H-pirrolila e tiazolila; em que a referida fenila, tiofenila, furanila, 1H- benzoimidazolila, isoquinolinila, 1H-imidazopiridinila, benzotiofenila, pirimidi- nila, 1H-pirazolila, piridinila, 1H-imidazolila, pirrolidinila, pirazinila, piridazinila, 1 H-pirrolila ou tiazolila de Ri pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados de ciano, hidróxi, Ci^alquila, Ci- 4alcóxi, halo, Ci^alquila substituída por halo, Ci_4alcóxi substituído por halo, hidróxi, amino, -C(O)Rga, -S(0)o-2R8a, -C(O)OR8a θ –C(O)NrgaR8b; θm quθ R8a e Rβb são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila; com a condição de que Ri e R3 não sejam igualmente hidrogênio;
R2 é selecionado de –S(O)2NrθaR6b, -NR9aC(O)R9b, - NR6aC(O)NR6bR6c, fenila, 1 H-pirrolopiridin-3-ila, 1H-indolila, tiofenila, piridini- la, 1H-1,2,4-triazolila, 2-oxoimidazolidinila, 1H-pirazolila, 2-oxo-2,3-di-hidro- 1H-benzoimidazolila e 1H-indazolila; em que Rεa, Reb θ Rθc θθo independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila; em que a referida fenila, 1 H-pirrolopiridin-3-ila, 1 H-indolila, tiofenila, piridinila, 1 H-1,2,4-triazolila, 2- oxoimidazolidinila, 1 H-pirazolila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1H-benzoimidazolila ou 1 H-indazolila de R2 é opcionalmente substituída com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de hidróxi, halo, metila, metóxi, amino, - O(CH2)nNR7aR7b, -S(O)2NR7aR7b, -OS(O)2NR7aR7b e –NR7aS(O)2R7b; em que R7a e R7b são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila;
R3 é selecionado de hidrogênio, Ci^alquila e bifenila; e
R4 é selecionado de Cv-ioalquila, prop-1-en-2-ila, ciclo-hexila, ciclopropila, 2-(2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, benzidrila, tetra-hidro-2H- piran-3-ila, tetra-hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila, benzila, (4- pentilfenil)(fenil)metila e 1-(1-(2-oxo-6,9,12-trioxa-3-azatetradecan-14-il)-1 H- 1,2,3-triazol-4-il)etila; em que a referida alquila, ciclopropila, ciclo-hexila, 2- (2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, tetra-hidro-2H- piran-2-ila, tetra-hidro-2H-piran-3-ila, tetra-hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra- hidrofuran-3-ila, tetra-hidrofuran-2-ila, benzila, (4-pentilfenil)(fenil)metila ou 1- (1-(2-oxo-6,9,12-trioxa-3-azatetradecan-14-il)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)etila pode ser opcionalmente substituída com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de hidróxi, C^alquila e C-i^alquila substituída por halo; ou os derivados de N-óxido, derivados de profármacos, derivados protegidos, isômeros individuais e mistura de isômeros do mesmo; ou os sais (de preferência os sais farmaceuticamente aceitáveis) e solvatos (por exemplo hidratos) de tais compostos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1 descreve o padrão de PXRD de modificação A de forma sólida de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol.
Figuras 2 a 12 descrevem os padrões de PXRD de formas sólidas de sais de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil) fenol, respectivamente os sais de nitrato, mesilato, tosilato, cloridrato, sulfato, besilato, esilato, bromidrato, orotato, fumarato e napadisilato.
Figura 13 descreve o padrão de DSC da forma amorfa de 4-(2- (2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
“Alquila” como um grupo e como um elemento estrutural de outros grupos, por exemplo alcóxi e alquila substituída por halo, ou pode ser de cadeia linear ou ramificada. Por exemplo, alquila inclui metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, t-butila, etc. Ci-4-alcóxi inclui metoxi, etóxi, e similares. Alquila substituída por halo inclui trifluorometila, pentafluo- roetila, e similares. “Arila” significa uma reunião de anéis aromáticos monocíclicos ou bicíclicos fundidos contendo seis a dez átomos de carbono de anel. Por exemplo, arila pode ser fenila ou naftila, de preferência fenila. “Arileno” significa um radical divalente derivado de um grupo arila. “Heteroarila” é tal como definida para arila onde um ou mais dos membros de anel são um heteroátomo ou porção selecionada de -O-, -N=, - NR-, -C(O)-, -S-, -S(O)- ou -S(O)2-, em que R é hidrogênio, C1_4alquila ou um grupo de proteção de nitrogênio. Por exemplo, heteroarila inclui piridila, in- dolila, indazolila, quinoxalinila, quinolinila, benzofuranila, benzopiranila, ben- zotiopiranila, benzo[1,3]dioxol, imidazolila, benzo-imidazolila, pirimidinila, fu- ranila, oxazolila, isoxazolila, triazolila, tetrazolila, pirazolila, tienila, etc. “Cicloalquila” significa um reunião de anéis monocíclicos, bicíclicos fundidos ou policíclicos em ponte, saturados ou parcialmente não saturados contendo o número de átomos de anel indicado. Por exemplo, C3- iocicloalquila inclui ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, etc. “Heterocicloalquila” significa cicloalquila, tal como definida neste pedido, com a condição de que um ou mais dos carbonos de anel indicados, sejam substituídos por uma porção selecionada de -O-, -N=, -NR-, -C(O)-, -S-, -S(O)- ou - S(O)2-, em que R é hidrogênio, Ci^alquila ou um grupo de proteção de nitrogênio. Por exemplo, Cs-eheterocicloalquila tal como empregada neste pedido para descrever compostos da invenção inclui morfolino, pirrolidinila, pipera- zinila, piperidinila, piperidinilona, 2-oxo-pirrolidin-1-ila, 1,4-dioxa-8-aza- espiro[4,5]dec-8-ila, etc. “Halogênio” (ou halo) de preferência representa cloro ou flúor, mas também pode ser bromo ou iodo. “Células-tronco hematopoéticas” (HSCs) tais como empregadas aqui se referem a células de sangue imaturas que têm a capacidade de renovarem-se e diferenciarem-se em células de sangue mais maduras compreendendo granulócitos (por exemplo, promielócitos, neutrófilos, eosinófi- los, basófilos), eritrócitos (por exemplo, reticulócitos, eritrócitos), trombócitos (por exemplo, megacarioblastos, megacariócitos produtores de plaquetas, plaquetas), e monócitos (por exemplo, monócitos, macrófagos). HSCs são alternadamente descritas como células-tronco ao longo do relatório descritivo. É conhecido na técnica que tais células podem incluir ou não células de CD34+. Células de CD34+ são células imaturas que expressam o marcador de superfície celular de CD34. Acredita-se que células de CD34+ incluem uma subpopulação de células com as propriedades de células-tronco definidas acima. Sabe-se bem na técnica que HSCs incluem células-tronco pluri- potentes, células-tronco multipotentes (por exemplo, uma célula-tronco lin- foide), e/ou células-tronco associadas à linhagens hematopoéticas específicas. As células-tronco associadas à linhagens hematopoéticas específicas podem ser de linhagem de células T, linhagem de células B, linhagem de células dendríticas, linhagem de células de Langerhans e/ou linhagem de células de macrófagos específica de tecido linfoide. Além disso, HSCs também se referem à HSC de longa duração (LT-HSC) e à HSC de curta duração (ST-HSC). ST-HSCs são mais ativas e mais proliferativas do que LT- HSCs. Entretanto, LT-HSC têm autorrenovação ilimitada (isto é, elas sobre-vivem ao longo da maioridade), enquanto que ST-HSC têm autorrenovação limitada (isto é, elas sobrevivem durante apenas um período de tempo limitado). Qualquer destas HSCs pode ser empregada em qualquer dos métodos descritos aqui. Opcionalmente, ST-HSCs são úteis porque elas são altamente proliferativas e, por conseguinte, aumentam rapidamente o número de HSCs e sua progénie. Células-tronco hematopoéticas são opcionalmente obtidas de produtos do sangue. Um produto do sangue inclui um produto obtido do corpo ou um órgão do corpo que contém células de origem hema- topoética. Tais fontes incluem medula óssea não fracionada, cordão umbilical, sangue periférico, fígado, timo, linfa e baço. Todos os produtos do sangue brutos ou não fracionados acima mencionados podem ser enriquecidos por células que têm características de células-tronco hematopoéticas de maneiras conhecidas para aqueles versados na técnica. “Tratar”, “tratando” e “tratamento” referem-se a um método de a- liviar ou enfraquecer uma doença e/ou seus sintomas concomitantes. “Expansão” no contexto de células refere-se ao aumento no número de um tipo de célula característico, ou tipos de células, de uma população de células inicial de células que podem ser ou não idênticas. As células iniciais empregadas para expansão podem não ser iguais às células geradas pela expansão. “População de células” refere-se a células mamíferas eucarióti- cas, de preferência humanas isoladas de fontes biológicas, por exemplo, tecidos ou produto do sangue e derivadas de mais de uma célula. “Enriquecida” quando empregado no contexto de população de células refere-se a uma população de células selecionada com base na presença de um ou mais marcadores, por exemplo, CD34+.
A expressão “células de CD34+” refere-se a células que expressam em sua superfície o marcador de CD34. As células de CD34+ podem ser detectadas e contadas empregando-se, por exemplo, citometria de fluxo e anticorpos anti-CD34 fluorescentemente rotulados. “Enriquecida em células de CD34+” significa que uma população de células foi selecionada com base na presença de marcador de CD34. Por conseguinte, a porcentagem de células de CD34+ na população de células após o método de seleção é mais alta do que a porcentagem de células de CD34+ na população de células inicial antes da etapa de seleção com base em marcadores de CD34. Por exemplo, células de CD34+ podem representar pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou pelo menos 90% das células em uma população de células enriquecida em células de CD34+. “Unidade de sangue de cordão” refere-se ao sangue coletado de cordão umbilical de um único nascimento.
Descrição das Modalidades Preferidas
A presente invenção refere-se a métodos e composições para a expansão de populações de HSC empregando um agente capaz de sub- regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de reações do receptor de hidrocarboneto de arila.
Em uma modalidade, o referido agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila é um composto de fórmula I.
Em uma modalidade, com referência aos compostos de fórmula I, são compostos selecionados de fórmulas la, lb, lc, Id e le:
Figure img0002
Figure img0003
L é selecionado de -NR5a(CH2)o-3-> -NR5aCH(C(O)OCH3)CH2-> NR5a(CH2)2NR5b-, -NR5a(CH2)2S-, -NR5aCH2CH(CH3)CH2-, -NR5aCH2CH (OH)- e -NR5aCH(CH3)CH2-; em que R5aθ Rδb são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila; em que o lado direito da porção de L conforme mostrado é ligado a R2> Porθxemplo:-NR5a(CH2)o-3-R2>NR5aCH(C(O)OCH3)CH2-R2, -NR5a(CH2)2NR5b-R2, -NR5a(CH2)2S-R2, - NR5aCH2CH(CH3)CH2-R2, -NR5aCH2CH(OH)-R2 θ -NR5aCH(CH3)CH2-R2.
R1 é selecionado de hidrogênio, fenila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan-3-ila, 1H-benzo[d]imidazol-1-ila, isoquinolin-4-ila, 1 H-imidazo[4,5- b]piridin-1 -ila, benzo[b]tiofen-3-ila, pirimidin-5-ila, 1 H-pirazol-4-ila, piridin-2- ila, piridin-4-ila, 1H-imidazol-1-ila, pirrolidin-1 -ila, pirazin-2-ila, piridin-3-ila, piridazin-4-ila, 1 H-pirrol-2-ila e tiazol-5-ila; em que a referida fenila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan-3-ila, 1H- benzo[d]imidazol-1-ila, isoquinolin-4-ila, 1H-imidazo[4,5-b]piridin-1-ila, ben- zo[b]tiofen-3-ila, pirimidin-5-ila, piridin-2-ila, piridin-4-ila, 1H-imidazol-1-ila, pirrolidin-1-ila, pirazin-2-ila, piridin-3-ila, piridazin-4-ila, 1 H-pirrol-2-ila ou tia- zol-5-ila de Ri pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados de ciano, hidróxi, C-Malquila, C-i^alcóxi, halo, Ci_4alquila substituída por halo, -S(0)o-2Rsaθ -C(O)ORea; em que Rsaθ Rβb são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila; com a condição de que Ri e R3 não sejam igualmente hidrogênio;
R2 é selecionado de -NR6aC(O)NR6bR6c> fenila, 1H-pirrolo[2,3- b]piridin-3-ila, 1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-ila, 1 H-indol-3-ila, tiofen-3-ila, piridin- 2-ila, piridin-3-ila, piridin-4-ila, 1H-1,2,4-triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1 H-pirazol-3-ila, 1 H-pirazol-4-ila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1 H-benzo[d]imidazol-5-ila e 1H-indazol-3-ila; em que R6a, Rθb θ Rec são independentemente selecionados de hidrogênio e C^alquila; em que a referida fenila, 1H-pirrolo[2,3- b]piridin-3-ila, 1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-ila, 1 H-indol-3-ila, tiofen-3-ila, piridin- 2-ila, piridin-3-ila, piridin-4-ila, 1H-1,2,4-triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1 H-pirazol-3-ila, 1 H-pirazol-4-ila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1 H-benzo[d]imidazol-5-ila ou 1 H-indazol-3-ila de R2 é opcionalmente substituída com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de hidróxi, halo, metoxi, amino, - OS(O)2NR7aR7b e -NR7aS(O)2R7b; em que R7a e R7b são independentemente selecionados de hidrogênio e C^alquila;
R3 é selecionado de hidrogênio, C^alquila e bifenila; e
R4 é selecionado de isopropila, metila, etila, prop-1-en-2-ila, iso- butila, ciclo-hexila, sec-butila, (S)-sec-butila, (R)-sec-butila, 1-hidroxipropan- 2-ila, (S)-1-hidroxipropan-2-ila, (R)-1-hidroxipropan-2-ila, nonan-2-ila, 2-(2- oxopirrolidin-1 -il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, tetra-hidro-2H- piran-2-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila e benzila; em que a referida ciclohexila, 2-(2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, tetra- hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila ou benzila pode ser opcionalmente substituída com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de C^alquila e C^alquila substituída por halo.
Em outra modalidade, L é selecionado de -NR5a(CH2)o-3-, - NR5aCH(C(O)OCH3)CH2-, -NR5a(CH2)2NR5b-, -NR5a(CH2)2S-,
NR5aCH2CH(CH3)CH2-, -NR5aCH(CH3)CH2- e -NR5aCH2CH(OH)-; em que R5a e R5b são independentemente selecionados de hidrogênio e metila; e Ri é selecionado de hidrogênio, fenila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan-3-ila, 1H- benzo[d]imidazol-1-ila, isoquinolin-4-ila, 1H-imidazo[4,5-b]piridin-1-ila, ben- zo[b]tiofen-3-ila, pirimidin-5-ila, 1 H-pirazol-4-ila, piridin-2-ila, piridin-4-ila, 1H- imidazol-1-ila, pirrolidin-1-ila, pirazin-2-ila, piridin-3-ila, piridazin-4-ila, 1H- pirrol-2-ila e tiazol-5-ila; em que a referida fenila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, fu- ran-3-ila, 1H-benzo[d]imidazol-1-ila, isoquinolin-4-ila, 1H-imidazo[4,5- b]piridin-1-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, pirimidin-5-ila, piridin-2-ila, piridin-4-ila, 1H-imidazol-1-ila, pirrolidin-1 -ila, pirazin-2-ila, piridin-3-ila, piridazin-4-ila, 1H- pirrol-2-ila ou tiazol-5-ila de R-i pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados de ciano, hidróxi, C^alquila, Ci. 4alcóxi, halo, C^alquila substituída por halo, -S(0)o-2Rsa e -C(O)ORβa; em que R8a e Rsb são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci- 4alquila; com a condição de que R-i e R3 não sejam igualmente hidrogênio.
Em outra modalidade, quando L é -NR5a(CH2)o-3, ele é de preferência -NRseíCH^-s (onde 1-3 aqui é 1, 2 ou 3).
Em outra modalidade, R2 é selecionado de ureia, fenila, 1H- indol-2-ila, 1 H-indol-3-ila, tiofen-3-ila, piperidin-1-ila, piridin-2-ila, piridin-3-ila, piridin-4-ila, 1H-1,2,4-triazol-3-ila, 1H-1,2,4-triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1- ila, 1 H-pirazol-3-ila, 1H-pirazol-4-ila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1H-benzo[d]imidazol- 5-ila, 1H-benzo[d]imidazol-5-ila e 1 H-imidazol-4-ila; em que a referida fenila, 1 H-indol-2-ila, 1 H-indol-3-ila, tiofen-3-ila, piperidin-1-ila, piridin-2-ila, piridin-3- ila, piridin-4-ila, 1H-1,2,4-triazol-3-ila, 1 H-1,2,4-triazol-5-ila, 2- oxoimidazolidin-1-ila, 1H-pirazol-3-ila, 1H-pirazol-4-ila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1H- benzo[d]imidazol-5-ila ou 1H-benzo[d]imidazol-5-ila de R2 é opcionalmente substituída com hidróxi, metóxi, metila, halo, amino e amino-sulfonila.
Em outra modalidade, R3 é selecionado de hidrogênio, metila e bifenila; e R4 é selecionado de isopropila, metila, etila, prop-1-en-2-ila, isobu- tila, ciclo-hexila, sec-butila, (S)-sec-butila, (R)-sec-butila, 1-hidroxipropan-2- ila, (S)-1-hidroxipropan-2-ila, (R)-1-hidroxipropan-2-ila, nonan-2-ila, 2-(2- oxopirrolidin-1 -il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, tetra-hidro-2H- piran-2-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila e benzila; em que a referida ciclo- hexila, 2-(2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, tetra- hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila ou benzila pode ser opcionalmente substituída com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de metila e trifluorometila.
Em outra modalidade são compostos selecionados de: 4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-sec-butil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-benzidril- 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3- il)-9-(tetra-hidro-2H-piran-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil- 2-(tiofen-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(4- (trifluorometil)benzil)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3- il)-9-isobutil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-metil- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(4-metilbenzil)- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-amina; 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-N-(2-(tiofen-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; 3-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-N-(4-fluorofenetil)-9-isopropil-9H- purin-6-amina; N-(4-aminofenetil)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin- 6-amina; 4-(2-(9-isopropil-2-(pirimidin-5-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2- (9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ílamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2- fenil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(tiofen-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(furan-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-N-(4-fluorofenetil)-9-fenil-9H-purin-6-amina; N-benzil-8- (bifenil-4-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- (nonan-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-sec-butil-9H-purin-6-amina; 5-((3aS,4S,6aR)-2-oxo- hexa-hidro-1 H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanoato de 3-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ila; N-(2- (2-(2-(2-(4-(1-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-6-(4-hidroxifenetilamino)-9H-purin-9- il)etil)-1 H-1,2,3-triazol-1-il)etóxi)etóxi)etóxi)etil)acetamida; 4-(2-(9-isopropil-2- (piridin-4-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9- isopropil-9H-purin-2-il)nicotinato de etila; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9- isopropil-9H-purin-2-il)nicotinato de etila; 4-(2-(2-(6-fluoropiridin-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(4-metilpiridin-3-il)- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H- purin-2-il)nicotinonitrilo; 4-(2-(9-isopropil-2-(pirrolidin-1-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(1H-imidazol-1-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridazin-4-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(pirazin-2-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(5-(metilsulfonil)piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4- (2-(9-isopropil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(4- cloropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(5- fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2- (1 -metil-1 H-pirazol-4-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2- (piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2-metoxifenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin- 3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2-metoxifenol; N-[2-(6-metóxi-1H-indol-3-il)etil]- 9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; N-[2-(5-metil-1 H-indol-3- il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 1-(2-{[9-(propan-2-il)-2- (piridin-3-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)imidazolidin-2-ona; N-(2-{[9-(propan-2-il)- 2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)piridin-2-amina; 9-(propan-2-il)-N-[3- (1 H-pirazol-4-il)propil]-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; N-{2-[(3-metil-1 H- 1,2,4-triazol-5-il)sulfanil]etil}-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 1-(2-{[2-(1-benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6- il]amino}etil)imidazolidin-2-ona; N-[2-(5-amino-1 H-1,2,4-triazol-3-il)etil]-2-(1 - benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-{[2-(1-benzotiofen-3- il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)piridin-2-amina; 2-(1-benzotiofen-3- il)-9-(propan-2-il)-N-[3-(1H-pirazol-4-il)propil]-9H-purin-6-amina; 2-(1- benzotiofen-3-il)-N-[3-(3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)propil]-9-(propan-2-il)-9H- purin-6-amina; (2-{[2-(1-benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6- il]amino}etil)ureia; 5-({[2-(1-benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6- il]amino}metil)-2,3-di-hidro-1 H-1,3-benzodiazol-2-ona; N-[2-(1 H-indol-3-il)etil]- 9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; N-(4-(2-(9-isopropil-2-(piridin- 3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenil)metano-sulfonamida; 4-(2-(2-(piridin-3-il)-9- (tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin- 3-il)-9H-purin-6-ilamino)propil)fenol; 4-(2-(9-(oxetan-3-il)-2-(piridin-3-il)-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin-2- il)-N-metilnicotinamida; 4-(2-(9-(1-hidroxipropan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin- 6-ilamino)etil)fenol; sulfamato de 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenila; 4-(2-(2-(2-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(1 -metil-1 H-pirrol-2-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(tiazol-5-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(1 H-benzo[d]imidazol-1 -il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4- (2-(2-(2,4-dimetil-1 H-imidazol-1 -il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4- (2-(9-isopropil-2-(2-metil-1 H-imidazol-1 -il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(9- sec-butil-6-(4-hidróxi-3-metilfenetilamino)-9H-purin-2-il)nicotinonitrilo; N-(2- (1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 9-isopropil-N-(2-(5-metil-1H-pirazol-3-il)etil)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2- (2-(5-cloropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9- isopropil-2-(5-(trifluorometil)piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(6-(2- (1 H-indol-3-il)etilamino)-9-sec-butil-9H-purin-2-il)nicotinonitrilo; N-(2-(1 H- indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; (R)-N-(2- (1H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; (S)-N- (2-(1H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; N- (2-(1H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; (R)- N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; (S)-N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-2-il)nicotinonitrilo; 4-(2- (6-(5-fluoropiridin-3-il)-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(6-(benzo[b]tiofen-3-il)-1 -isopropil-1 H-pirazolo[3,4- d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol; (R)-4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(tetra- hidrofuran-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-ilamino)etil)-3-metilfenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil- 9H-purin-2-il)picolinonitrilo; 3-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin- 2-il)isonicotinonitrilo; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-7-isopropil-7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol; 3-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H- purin-2-il)picolinonitrilo; 4-(2-(9-isopropil-2-(6-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(isoquinolin-4-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 2-cloro-4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 3-fluoro-4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; N-(2-(5-cloro-1 H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; N-(2-(5-fluoro-1 H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2- metilfenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; (S)-4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol; (R)-4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(tetra-hidrofuran- 3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-(5- fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9-il)propan-1 -ol; (R)-2-(6-(2-(1 H-indol-3- il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9-il)propan-1 -ol; (S)-2-(6-(2-(1 H- indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9-il)propan-1-ol; (R)-N-(2- (1H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purin-6- amina; 4-(2-(2-(3H-imidazo[4,5-b]piridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(1 H-imidazo[4,5-b]piridin-1 -il)-9-isopropil-9H-purin- 6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(6-(5-fluoropiridin-3-il)-1-isopropil-1H-imidazo[4,5- c]piridin-4-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(4,5-dimetil-1 H-imidazol-1-il)-9-isopropil- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(piridin-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)-1-hidroxietil)fenol; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(6-metóxi- 1 H-indol-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin- 3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(5- metóxi-1 H-indol-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-2-(5- fluoropiridin-3-il)-9-(prop-1-en-2-il)-9H-purin-6-amina; 5-(2-(2-(5-fluoropiridin- 3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)piridin-2-ol; N-(2-(1H-pirrolo[2,3- b]piridin-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; N-(2-(6- (2-(dietilamino)etóxi)-1H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H- purin-6-amina; 4-(2-(5-(5-fluoropiridin-3-il)-3-isopropil-3H-imidazo[4,5- b]piridin-7-ilamino)etil)fenol; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(2-metil-1 H- imidazol-1 -il)-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(2-etiI-1 H-imidazol-1 -il)-9-isopropiI- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(2-propil-1 H-imidazol-1 -il)- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 3-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin- 6-ilamino)etil)-1 H-indol-6-ol; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(5- metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(2- metil-1 H-imidazol-1 -il)-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N- (2-(7-metil-1 H-indol-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-( 1 H-indol-3-il)etil)-2-(5- fluoropiridin-3-il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-2- (5-metilpiridin-3-il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-(6-fluoro-1 H-indol- 3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin- 3-il)-9-isopropil-N-(2-(6-metil-1H-indol-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; 2-(5- fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(2-metil-1H-indol-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(4-fluoro-1H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- amina; N-(2-(7-fluoro-1H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H- purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(4-metil-1H-indol-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-7-isopropil-7H- pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol; 9-isopropil-2-(piridin-3-il)-N-(2- (piridin-4-il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-il)etil)-9- isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(1 - hidroxipropan-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2-metilfenol; 4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-ciclo-hexil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9- isopropil-2-(tiofen-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; e 1 -(2-(2-(benzo[b]tiofen- 3-il)-6-(4-hidroxifenetilamino)-9H-purin-9-il)etil)pirrolidin-2-ona. Os Compostos de fórmula I são detalhados nos exemplos e tabela I, infra.
Em outra modalidade são compostos de fórmula la:
Figure img0004
em que:
L é selecionado de -NR5a(CH2)o-3-, -NR5aCH(C(O)OCH3)CH2-, - NR5a(CH2)2NR5b-, -NR5a(CH2)2S-, -NR5aCH2CH(CH3)CH2-, NR5aCH(CH3)CH2-, -(CH2)3-, -CH2OCH2-, -CH2NR5aCH2-, -NR5aC(O)CH2- e - NR5aY-; em que R5a e R5b são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila; e Y é um anel de heteroarila de número 5 contendo até 3 heteroátomos selecionados de O, N e S;
R1 é selecionado de hidrogênio, fenila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan-2-ila, furan-3-ila, benzo[b]tiofen-2-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, benzofuran- 2-ila, benzofuran-3-ila, pirimidin-4-ila, pirimidin-5-ila, 1 H-pirazol-4-ila, 1H- pirazol-3-ila, piridin-2-ila, piridazin-3-ila, piridin-4-ila, 1 H-imidazol-1-ila, pirroli- din-1-ila, pirazin-2-ila, piridin-3-ila, 1 H-pirazol-1-ila, piridazin-4-ila, 1H-indol-2- ila, tiazol-4-ila, 1 H-indol-3-ila, 1 H-pirrol-2-ila e tiazol-5-ila; em que as referidas fenila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan-2-ila, furan-3-ila, benzo[b]tiofen-2-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, benzofuran-2-ila, benzofuran-3-ila, pirimidin-4-ila, pirimi- din-5-ila, 1H-pirazol-4-ila, 1H-pirazol-3-ila, piridin-2-ila, piridazin-3-ila, piridin- 4-ila, 1 H-imidazol-1-ila, pirrolidin-1 -ila, pirazin-2-ila, piridin-3-ila, 1 H-pirazol-1- ila, piridazin-4-ila, 1 H-indol-2-ila, tiazol-4-ila, 1 H-indol-3-ila, 1 H-pirrol-2-ila ou tiazol-5-ila de Ri podem ser opcionalmente substituídas por 1 a 3 radicais independentemente selecionados de ciano, hidróxi, C-i^alquila, Ci^alcóxi, halo, C^alquila substituída por halo, C^alcoxi substituído por halo, hidróxi, amino, -C(O)R8a, -S(O)0.2R8a, -C(O)OR8a e -C(O)NR8aR8b; em que R8a e R8b são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci-4alquila; com a condição de que Ri e R3 não sejam igualmente hidrogênio;
R2 é selecionado de -S(O)2NR6aR6b, -NRgaC(O)R9b, - NR6aC(O)NR6bR6c, fenila, 1 H-indol-2-ila, 1 H-indol-3-ila, benzo[b]tiofen-2-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, benzofuran-2-ila, benzofuran-3-ila, tiofen-2-ila, tiofen-3- ila, furan-2-ila, furan-3-ila, piperidin-4-ila, piperidin-3-ila, piperidin-2-ila, pipθ- ridin-1-ila, piridin-2-ila, piridin-3-ila, piridin-4-ila, 1H-1,2,4-triazol-3-ila, 1H- 1,2,4-triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1H-pirazol-3-ila, 1 H-pirazol-4-ila, 3- oxopiperazin-1-ila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1H-benzo[d]imidazol-5-ila, 1,2,3,4- tetra-hidronaftalen-2-ila, indolin-5-ila, 2-oxoindolin-5-ila, 1H-benzo[d]imidazol- 5-ila, 1H-indazol-5-ila e 1 H-imidazol-4-ila; em que R8a, Rβb θ Rβc são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila; em que as referi-das fenila, 1 H-indol-2-ila, 1 H-indol-3-ila, benzo[b]tiofen-2-ila, benzo[b]tiofen- 3-ila, benzofuran-2-ila, benzofuran-3-ila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila ou furan-2- ila, furan-3-ila, piperidin-4-ila, piperidin-3-ila, piperidin-2-ila, piperidin-1-ila, piridin-2-ila, piridin-3-ila, piridin-4-ila, 1 H-1,2,4-triazol-3-ila, 1H-1,2,4-triazol-5- ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1H-pirazol-3-ila, 3-oxopiperazin-1-ila, 2-oxo-2,3- di-hidro-1 H-benzo[d]imidazol-5-ila, 1,2,3,4-tetra-hidronaftalen-2-ila, indolin-5- ila, 2-oxoindolin-5-ila, 1H-benzo[d]imidazol-5-ila, 1 H-indazol-5-ila ou 1H- imidazol-4-ila de R2 são opcionalmente substituídas com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de hidróxi, halo, metila, metoxi, amino, - S(O)2NR7aR7b, -OS(O)2NR7aR7b θ -NR7aS(O)2R7b; em que R7a e R7b são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila; ou um único radical selecionado de 5-((3aS,4S,6aR)-2-oxo-hexa-hidro-1H-tieno[3,4- d]imidazol-4-il)pentanoilóxi, 2-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxo-hexa-hidro-1H- tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)etóxi)etóxi e 2-(4-(4-hex-5- inamidobenzoil)fenilamino)-2-oxoetóxi;
R3 é selecionado de hidrogênio, Ci^alquila e bifenila; e
R4 é selecionado de isopropila, isobutila, sec-butila, 1- hidroxipropan-2-ila, ciclopropila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, piperi- din-4-ila, piperidin-3-ila, piperidin-2-ila, tetra-hidro-2H-piran-2-ila, tetra-hidro- 2H-piran-3-ila, tetra-hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila, tetra- hidrofuran-2-ila, benzila, (4-pentilfenil)(fenil)metila e 1-(1-(2-oxo-6,9,12-trioxa- 3-azatetradecan-14-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)etila; em que as referidas ciclopropila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, piperidin-4-ila, piperidin-3-ila, piperidin-2-ila, tetra-hidro-2H-piran-2-ila, tetra-hidro-2H-piran-3-ila, tetra- hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila, tetra-hidrofuran-2-ila, benzila, (4-pentilfenil)(fenil)metila ou 1-(1-(2-oxo-6,9,12-trioxa-3-azatetradecan-14- il)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)etila podem ser opcionalmente substituídas com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de Ci^alquila e C-i^alquila substituída por halo; ou os derivados de N-óxido, derivados de profármacos, derivados protegidos, isômeros e misturas individuais de isômeros dos mesmos; ou os sais e solvatos farmaceutícamente aceitáveis (por exemplo hidratos) de tais compostos.
Em uma outra modalidade, com referência aos compostos de fórmula la, L é selecionado de -NR5a(CH2)o-3-, -NR5aCH(C(O)OCH3)CH2-, - NR5a(CH2)2NR5b-, -NR5a(CH2)2S-, -NR5aCH2CH(CH3)CH2-, - NR5aCH(CH3)CH2-, -(CH2)3-, -CH2OCH2-, -CH2NR5aCH2-, -NR5aC(O)CH2- e - NR5aY-; em que R5a e R5b são independentemente selecionados de hidrogênio e metila; Y é selecionado de isoxazol e 1,3,4-oxadiazol.
Em outra modalidade, quando L é -NR5a(CH2)o-3, ele é de preferência -NR5a(CH2)i.3 (onde 1 a 3 significam 1,2 ou 3).
Em outra modalidade, Ri é selecionado de hidrogênio, fenila, tio- fen-3-ila, tiofen-2-ila, furan-3-ila, furan-2-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, pirimidin-5- ila, piridin-4-ila, piridin-2-ila, pirrolidin-1-ila, 1 H-pirazol-4-ila, pirazin-2-ila, piri- dazin-3-ila, piridazin-4-ila, 1 H-pirazol-1-ila, 1H-pirazol-3-ila, 1 H-imidazol-1-ila, tiazol-4-ila, 1 H-pirrol-2-ila, tiazol-5-ila, e piridin-3-ila; em que as referidas fenila, tiofen-3-ila, tiofen-2-ila, furan-3-ila, furan-2-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, pirimi- din-5-ila, piridin-4-ila, piridin-2-ila, pirrolidin-1-ila, 1H-pirazol-4-ila, pirazin-2- ila, piridazin-3-ila, piridazin-4-ila, 1 H-pirazol-1-ila, 1 H-pirazol-3-ila, 1H- imidazol-1-ila, tiazol-4-ila, 1 H-pirrol-2-ila, tiazol-5-ila ou piridin-3-ila de Ri são opcionalmente substituídas com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de ciano, metila, metil-sulfonila, metoxi, halo, hidróxi, carboxila, etóxi- carbonila, metil-amino-carbonila e amino; com a condição de que Ri e R3 não sejam igualmente hidrogênio.
Em outra modalidade, R2 θ selecionado de amino-sulfonila, me- til-carbonil-amino, metil-sulfonil-amino, amino-sulfonil-óxi, ureia, fenila, 1H- indol-2-ila, 1 H-indol-3-ila, benzo[b]tiofen-2-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, benzofu- ran-2-ila, benzofuran-3-ila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan-2-ila, furan-3-ila, piperidin-4-ila, piperidin-3-ila, piperidin-2-ila, piperidin-1-ila, piridin-2-ila, piri- din-3-ila, piridin-4-ila, 1H-1,2,4-triazol-3-ila, 1H-1,2,4-triazol-5-ila, 2- oxoimidazolidin-1-ila, 1H-pirazol-3-ila, 1H-pirazol-4-ila, 3-oxopiperazin-1-ila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1 H-benzo[d]imidazol-5-ila, 1,2,3,4-tetra-hidronaftalen-2-ila, indolin-5-ila, 2-oxoindolin-5-ila, 1 H-benzo[d]imidazol-5-ila, 1H-indazol-5-ila e 1H-imidazol-4-ila; em que as referidas fenila, 1 H-indol-2-ila, 1 H-indol-3-ila, benzo[b]tiofen-2-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, benzofuran-2-ila, benzofuran-3-ila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan-2-ila, furan-3-ila, piperidin-4-ila, piperidin-3-ila, piperidin-2-ila, piperidin-1-ila, piridin-2-ila, piridin-3-ila, piridin-4-ila, 1 H-1,2,4- triazol-3-ila, 1 H-1,2,4-triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1H-pirazol-3-ila, 1 H-pirazol-4-ila, 3-oxopiperazin-1-ila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1 H- benzo[d]imidazol-5-ila, 1,2,3,4-tetra-hidronaftalen-2-ila, indolin-5-ila, 2- oxoindolin-5-ila, 1H-benzo[d]imidazol-5-ila, 1 H-indazol-5-ila e 1 H-imidazol-4- ila de R2 são opcionalmente substituídas com hidróxi, metoxi, metila, halo, amino, amino-sulfonila, 5-((3aS,4S,6aR)-2-oxo-hexa-hidro-1 H-tieno[3,4- d]imidazol-4-il)pentanoilóxi, 2-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxo-hexa-hidro-1H- tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)etóxi)etóxi e 2-(4-(4-hex-5- inamidobenzoil)fenilamino)-2-oxoetóxi.
Em outra modalidade, R3 é selecionado de hidrogênio, metila, e bifenila; e R4 são selecionados de isopropila, isobutila, sec-butila, 1- hidroxipropan-2-ila, ciclopropila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, piperi- din-4-ila, piperidin-3-ila, piperidin-2-ila, tetra-hidro-2H-piran-2-ila, tetra-hidro- 2H-piran-3-ila, tetra-hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila, tetra- hidrofuran-2-ila, benzila, (4-pentilfenil)(fenil)metila e 1-(1-(2-oxo-6,9,12-trioxa- 3-azatetradecan-14-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)etila; em que as referidas ciclo- propila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, piperidin-4-ila, piperidin-3-ila, piperidin-2-ila, tetra-hidro-2H-piran-2-ila, tetra-hidro-2H-piran-3-ila, tetra- hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila, tetra-hidrofuran-2-ila, benzila, (4-pentilfenil)(fenil)metila ou 1-(1-(2-oxo-6,9,12-trioxa-3-azatetradecan-14- il)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)etila podem ser opcionalmente substituídas com 1 a 3 radicais independentemente selecionados de metila e trifluorometila.
Em outra modalidade são compostos selecionados de: 4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-sec-butil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-benzidril- 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3- il)-9-(tetra-hidro-2H-piran-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-(4-(trifluorometil)benzil)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4- (2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isobutil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-metil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-(4-metilbenzil)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; N-(2-(1H- indol-3-il)etil)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; 2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-N-(2-(tiofen-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; 3-(2- (2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 2- (benzo[b]tiofen-3-il)-N-(4-fluorofenetil)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; N-(4- aminofenetil)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; 4-(2-(9- isopropil-2-(pirimidin-5-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2- (piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-fenil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(tiofen-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(furan-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 2-(benzo[b]tiofen- 3-il)-N-(4-fluorofenetil)-9-fenil-9H-purin-6-amina; N-benzil-8-(bifenil-4-il)-9- isopropil-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(nonan-2-il)-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-((4- pentilfenil)(fenil)metil)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-sec-butil-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3- il)-9-sec-butil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 3-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ol; 5-((3aS,4S,6aR)-2-oxo-hexa- hidro-1 H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanoato de 3-(2-(2-(benzoíb]tiofen-3-il)- 9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ila; N-(2-(2-(3-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5- ilóxi)etóxi)etil)-5-((3aS,4S,6aR)-2-oxo-hexa-hidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4- il)pentanamida; N-(4-(4-(2-(3-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin- 6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ilóxi)acetamido)benzoil)fenil)hex-5-inamida; N-(2- (2-(2-(2-(4-(1-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-6-(4-hidroxifenetilamino)-9H-purin-9- il)etil)-1 H-1,2,3-triazol-1-il)etóxi)etóxi)etóxi)etil)acetamida; 4-(2-(9-isopropil-2- (piridin-4-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9- isopropil-9H-purin-2-il)nicotinato de etila; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9- isopropil-9H-purin-2-il)nicotinato de etila; 4-(2-(2-(6-fluoropiridin-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(4-metilpiridin-3-il)- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(2-metoxipiridin-3-il)-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin-2- il)nicotinonitrilo; 4-(2-(9-isopropil-2-(pirrolidin-1-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(1 H-pirazol-1 -il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(1 H-imidazol-1 -il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridazin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridazin-4-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(pirazin-2-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(5-(metilsulfonil)piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4- (2-(9-isopropil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(2- cloropiridin-3-il)-6-isopropil-2,6-di-hidroimidazo[4,5-c]pirazol-3- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(4-cloropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(4-metoxipiridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(tiazol-4-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2- (9-isopropil-2-(1H-pirazol-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil- 2-(1H-pirazol-4-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(tiofen-2- il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; ácido 4-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil- 9H-purin-2-il)tiofeno-2-carboxílico; 4-(2-(2-(furan-2-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(4-metiltiofen-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2- metoxifenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2- metoxifenol; N-[2-(6-metóxi-1 H-indol-3-il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; N-[2-(5-metil-1H-indol-3-il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3- il)-9H-purin-6-amina; N-[2-(piperidin-4-il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H- purin-6-amina; 1-(2-{[9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- il]amino}etil)piperidin-4-ol; (2S)-3-(4-hidroxifenil)-2-{[9-(propan-2-il)-2-(piridin- 3-il)-9H-purin-6-il]amino}propanoato de metila; 4-(2-{[9-(propan-2-il)-2- (piridin-3-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)benzeno-1 -sulfonamida; 2-{[2-( 1 - benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-il]amino}etano-1-sulfonamida; 4- (2-{[9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)benzeno-1,2-diol; N- [2-(1H-imidazol-4-il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 1-(2- {[9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)imidazolidin-2-ona; N- [2-(5-amino-1H-1,2,4-triazol-3-il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- amina; N-(2-{[9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)piridin-2- amina; 9-(propan-2-il)-N-[3-(1H-pirazol-4-il)propil]-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- amina; N-[2-({[9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- il]amino}metil)propil]acetamida; 4-(2-{[9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin- 6-il]amino}etil)piperazin-2-ona; N-{2-[(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-5-il)suIfaniljetil}- 9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; N-[3-(3,5-dimetil-1H-pirazol- 4-il)propil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; (2-{[9-(propan-2- il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)ureia; 5-({[9-(propan-2-il)-2-(piridin-3- il)-9H-purin-6-il]amino}metil)-2,3-di-hidro-1 H-1,3-benzodiazol-2-ona; 2-(1- benzotiofen-3-il)-N-[2-(1H-imidazol-4-il)etil]-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-amina; 1-(2-{[2-(1-benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6- il]amino}etil)imidazolidin-2-ona; N-[2-(5-amino-1 H-1,2,4-triazol-3-il)etil]-2-( 1 - benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-{[2-(1-benzotiofen-3- il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)piridin-2-amina; 2-(1-benzotiofen-3- il)-9-(propan-2-il)-N-[3-(1H-pirazol-4-il)propil]-9H-purin-6-amina; N-[2-({[2-(1- benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-il]amino}metil)propil]acetamida; 4- (2-{[2-(1-benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)piperazin-2- ona; 2-(1-benzotiofen-3-il)-N-{2-[(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-5-il)sulfanil]etil}-9- (propan-2-il)-9H-purin-6-amina; 2-(1-benzotiofen-3-il)-N-[3-(3,5-dimetil-1H- pirazol-4-il)propil]-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-amina; (2-{[2-(1-benzotiofen-3- il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-il]amino}etil)ureia; 5-({[2-(1-benzotiofen-3-il)-9- (propan-2-il)-9H-purin-6-il]amino}metil)-2,3-di-hidro-1H-1,3-benzodiazol-2- ona; N-[2-(1H-indol-3-il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; N-(4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenil)metanossulfonamida; 4-(2-(2-(piridin-3-il)-9-(tetra-hidrofuran- 3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)propil)fenol; 4-(2-(9-(oxetan-3-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin-2-il)-N- metilnicotinamida; 6-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)-5,6,7,8- tetra-hidronaftalen-2-ol; N-(2-(1 H-indazol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; 4-(2-((9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- il)(metil)amino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-8-metil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 1 -(2-(9-isopropi l-2-(pirid i n-3-il)-9 H-p u ri n-6-ilam ino)etil)-1H- benzo[d]imidazol-2(3H)-ona; 4-(3-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-ptirin-6- il)propil)fenol; 4-((((9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- il)metil)(metil)amino)metil)fenol; 4-(((9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- il)metilamino)metil)fenol; 4-(((9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- il)metóxi)metil)fenol; N-(2-(indolin-5-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin- 6-amina; 4-(2-(9-(1-metilpiperidin-4-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-(piperidin-4-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; N-(2-(1 H-indazol-5-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H- purin-6-amina; N-(2-(1H-benzo[d]imidazol-5-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; 5-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)indolin-2-ona; 4-(2-(9-ciclopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-(1-hidroxipropan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; sulfamato de 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenila; 2-(4-hidroxifenil)-N-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- il)acetamida; 4-(5-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)isoxazol-3- il)fenol; 4-(5-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)-1,3,4-oxadiazol-2- il)fenol; 4-(2-(2-(2-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(1-metil-1H-pirrol-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; e 4-(2- (9-isopropil-2-(tiazol-5-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol.
Em outra modalidade está um composto de fórmula 1f:
Figure img0005
em que: R2 é selecionado de 1 H-indol-3-ila e fenila opcionalmen te substituída por hidróxi; e R4 é selecionado de isopropila, sec-butila, benzidrila, nonan-2-ila, oxetan-3-ila e tetra-hidrofuran-3-ila.
Em uma outra modalidade são compostos selecionados de: 4-(2- (2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-sec-butil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-benzidril- 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3- il)-9-(nonan-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-sec-butil-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3- il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; (S)-4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3- il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; e (R)-4-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol.
Em outra modalidade está um composto de fórmula 1g:
Figure img0006
em que: R2 é selecionado de: 1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-ila; 1H-indol- 3-ila opcionalmente substituída independentemente por 1 a 2 radicais independentemente selecionados de halo, metila e metoxi; e fenila opcionalmente substituída com 1 a 2 radicais independentemente selecionados de metila, halo e hidróxi; R4 é selecionado de isopropila, sec-butila, 1-hidroxipropan-2- ila, prop-1-en-2-ila, benzidrila, nonan-2-ila, oxetan-3-ila e tetra-hidrofuran-3- ila; e são selecionados Ra, Rb e Rc independentemente selecionados de hidrogênio, ciano, metila, halo, -SO2CH3 e trifluorometila.
Em uma modalidade adicional são compostos selecionados de: 4- (2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(6- fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2- (4-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)- 9-isopropil-9H-purin-2-il)nicotinonitrilo; 4-(2-(9-isopropil-2-(5-metilpiridin-3-il)- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(5-(metilsulfonil)piridin-3-il)- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(4-cloropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin- 6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 9-isopropil-N-(2-(6-metóxi-1H-indol-3-il)etil)-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; 9-isopropil-N-(2-(5-metil-1 H-indol-3-il)etil)-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin- 6-amina; 4-(2-(9-(oxetan-3-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4- (2-(9-(1-hidroxipropan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4- (2-(2-(2-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(9-sec- butil-6-(4-hidróxi-3-metilfenetilamino)-9H-purin-2-il)nicotinonitrilo; 4-(2-(2-(5- fluoropiridin-3-il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(5- cloropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2- (5-(trifluorometil)piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(6-(2-(1H-indol-3- il)etilamino)-9-sec-butil-9H-purin-2-il)nicotinonitrilo; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9- sec-butil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; (R)-N-(2-(1H-indol-3-il)etil)- 9-sec-butil-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; (S)-N-(2-(1 H-indol-3- il)etil)-9-sec-butil-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3- il)etil)-9-sec-butil-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; (R)-N-(2-(1H-indol- 3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; (S)-N-(2-(1 H- indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 5-(6-(4- hidroxifenetilamino)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-2-il)nicotinonitrilo; 4-(2-(6-(5- fluoropiridin-3-il)-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol; 3- (6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin-2-il)isonicotinonitrilo; 4-(2-(2- (5-fluoropiridin-3-il)-7-isopropil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(6-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 2-cloro-4- (2-(9-ísopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 3-fluoro-4-(2-(9- isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; N-(2-(5-fluoro-1 H-indol- 3-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-(5-cloro-1 H-indol-3- il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin- 3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2-metilfenol; 2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2- (5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9-il)propan-1-ol; (R)-2-(6-(2-(1 H-indol-3- il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9-il)propan-1 -ol; (S)-2-(6-(2-(1 H- indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9-il)propan-1-ol; (R)-N-(2- (1H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purin-6- amina; 4-(2-(6-(5-fluoropiridin-3-il)-1-isopropil-1H-imidazo[4,5-c]piridin-4- ílamíno)etil)fenol; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil- 9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropíridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(6-metóxi-1H-indol- 3-íl)etil)-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(5-metóxi- 1 H-indol-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin- 3-il)-9-(prop-1-en-2-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3- il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-annina; 4-(2-(5-(5- fluoropiridin-3-il)-3-isopropil-3H-imidazo[4,5-b]piridin-7-ilamino)etil)fenol; N- (2-(1H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purín-6-amina; 2-(5- fluoropirídin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(7-metil-1H-índol-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-6- amina; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2-(5-metilpiridin-3-il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin- 6-amina; N-(2-(6-fluoro-1 H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil- 9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(2-metil-1H-indol-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(6-metil-1 H- indol-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(4-fluoro-1H-indol-3-il)etil)-2-(5- fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9- isopropil-N-(2-(4-metil-1 H-indol-3-il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(7-fluoro-1 H- indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; e 4-(2-(2- (5-fluoropiridin-3-il)-9-(1-hidroxipropan-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2- metilfenol.
Em outra modalidade está um método de empregar um composto de fórmula I para estimular a expansão de células-tronco aumentando o número de divisões; o referido método compreende contatar as células- tronco com um composto de fórmula I.
Em outra modalidade está um método no qual a expansão de células-tronco é in vivo, in vitro,ou ex vivo.
Em outra modalidade está um método no qual as células-tronco são células-tronco hematopoéticas humanas.
Em outra modalidade está uma população celular com células- tronco hematopoéticas expandidas, como obtido ou obtenível pelo método da invenção.
Em uma outra modalidade está uma composição que compreende uma população de células com HSCs expandidas derivadas de uma ou duas unidades de sangue do cordão, de preferência uma unidade de sangue do cordão, em que a referida composição contém uma quantidade total de células de pelo menos 105 células, 107 células, 108 células ou 109 células, e em que entre 20 a 100% das células totais são células de CD34+, por exemplo entre 40 a 80% de células totais é CD34+.
Em outra modalidade está um método para tratamento de uma doença ou distúrbio para o qual a terapia com células-tronco resultaria na prevenção, tratamento ou erradicação do referido distúrbio.
Antecipa-se que enquanto o uso de células-tronco desenvolve- se as doenças que podem ser tratadas através de transplante de células- tronco expandir-se-ão. Uma lista não limitadora de exemplos segue, infra.
Em outra modalidade está o uso de um composto de fórmula I tal como definido no Sumário da Invenção, ou um sal do mesmo, na preparação de uma composição para o tratamento de uma doença imunodeficien- te hereditária, uma doença autoimune e/ou um distúrbio hematopoético.
Em uma outra modalidade, a administração é um transplante au- tólogo e o distúrbio hematopoético é selecionado de Mieloma múltiplo, Linfoma não Hodgkin, Doença de Hodgkin, Leucemia mieloide aguda, Neuroblastoma, Tumores de células germinativas, Distúrbios autoimunes e Amiloi- dose.
Em uma outra modalidade, os distúrbios autoimunes são selecionados de Lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e Esclerose sistêmica.
Em uma outra modalidade, a administração é um transplante a- logênico e o distúrbio hematopoético é selecionado de Leucemia mieloide aguda, Leucemia linfoblástica aguda, Leucemia mieloide crônica, Leucemia linfocítica crônica, Distúrbios mieloproliferativos, Síndromes mielodisplásicas, Mieloma múltiplo, Linfoma não Hodgkin, Doença de Hodgkin, Anemia aplási- ca, Aplasia eritrocitária pura, Hemoglobinúria noturna paroxística, Anemia de Fanconi, Talassemia principal, Anemia de célula foice, Imunodeficiência combinada grave (SCID), síndrome de Wiskott-Aldrich, Linfo-histiocitose hemofagocítica (HLH) e erros congênitos do metabolismo.
Em uma outra modalidade, os erros congênitos do metabolismo são selecionados de mucopolissacaridose, doença de Gaucher, leucodistro- fias metacromáticas e adrenoleucodistrofias.
Em outra modalidade está um método para tratamento de uma doença imunodeficiente herdada, uma doença autoimune e/ou um distúrbio hematopoético que compreende administrar a um paciente com necessidade de tal tratamento células-tronco hematopoéticas expandidas por um composto tal como descrito no Sumário da Invenção.
Em uma outra modalidade, a administração é um transplante au- tólogo e o distúrbio hematopoético é selecionado de Mieloma múltiplo, Linfoma não Hodgkin, Doença de Hodgkin, Leucemia mieloide aguda, Neuroblastoma, Tumores de células germinativas, Distúrbios autoimunes e Amiloi- dose.
Em uma outra modalidade, os distúrbios autoimunes são selecionados de Lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e Esclerose sistêmica.
Em uma outra modalidade, a administração é um transplante a- logênico e o distúrbio hematopoético é selecionado de Leucemia mieloide aguda, Leucemia linfoblástica aguda, Leucemia mieloide crônica, Leucemia linfocítica crônica, Distúrbios mieloproliferativos, Síndromes mielodisplásicas, Mieloma múltiplo, Linfoma não Hodgkin, Doença de Hodgkin, Anemia aplási- 5 ca, Aplasia eritrocitária pura, Hemoglobinúria noturna paroxística, Anemia de Fanconi, Talassemia principal, Anemia de célula foice, Imunodeficiência combinada grave (SCID), síndrome de Wiskott-Aldrich, Linfo-histiocitose hemofagocítica (HLH) e erros congênitos do metabolismo.
Em uma outra modalidade, os erros congênitos do metabolismo 10 são selecionados de mucopolissacaridose, doença de Gaucher, leucodistro- fias metacromáticas e adrenoleucodistrofias.
Utilidade
HSCs são células primitivas capazes de regenerar todas as células do sangue. Durante o desenvolvimento, a hematopoese transloca-se do 15 fígado fetal para a medula óssea, que então permanece o sítio da hematopoese ao longo da maioridade. Uma vez que a hematopoese tenha sido estabelecida na medula óssea, as HSCs não são distribuídas randomica- mente por toda a poço óssea. Em vez disso, elas são encontradas nas proximidades junto às superfícies endosteais. As células-tronco mais maduras 20 aumentam em número conforme a distância da superfície óssea aumenta. Finalmente, conforme o eixo longitudinal central do osso é aproximado a diferenciação terminal de células maduras ocorre.
A expansão do número de células-tronco, seja de fontes adultas, de sangue do cordão umbilical, fetais, ou embrionárias, teria um impacto 25 muito grande em transplante e outras terapias para doenças e distúrbios hematológicos e oncológicos, o menor dos quais seria segurança aumentada e custos reduzidos. Tal como descrito nos métodos anexos, os números de HSC são aumentados ex vivo. Um método de aumentar os números de células-tronco é importante na medida que atualmente, aproximadamente 30 25% de transplantes de doadores autólogos são rejeitados por falta de células-tronco suficientes. Além disso, menos de 25% de pacientes com necessidade de transplante alogênico podem encontrar um doador histocompatí- vel. Atualmente existem bancos de sangue de cordão umbilical e abragem a ampla constituição racial da população geral, mas estes bancos estão atualmente restritos para uso em crianças devido aos números de células- tronco inadequados nos espécimes para receptores adultos. Um método 5 para aumentar os números de células-tronco permite que o sangue do cordão seja útil para pacientes adultos, desse modo expandindo o uso de transplante alogênico. Os compostos da invenção também podem ser empregados para expandir os números de células progenitoras que são clinicamente úteis, por exemplo, para acelerar enxerto e diminuir a duração da 10 neutropenia.
Por conseguinte, um método para aumentar o número de HSCs é fornecido. Tal como empregado aqui, um aumento em HSCs significa que o paciente tem pelo menos mais uma HSC, um aumento de 10%, um aumento de 20%, um aumento de 30% ou maior. HSCs podem consistir em 15 um subconjunto de células de CD34+, o aumento de HSCs pode ser medido indiretamente pela contagem do número de células de CD34+ em uma população de células e, opcionalmente, por avaliação das propriedades de diferenciação das células de CD34+ analisando-se as unidades formadoras de colônias (CFU) tal como descrito na parte experimental abaixo: Um aumento 20 do número de cultura de células de CD34+ de pelo menos 10%, de preferência aumento de 20% ou aumento de 30% ou maior quando comparado com um controle sem expansão é indicativo de expansão de HSC. A população expandida de HSCs é colhida, por exemplo, de uma amostra de medula óssea de um paciente ou de uma cultura. A colheita de HSCs é definida 25 como o desalojamento ou separação das células. Isto é realizado empregando-se vários métodos, tais como métodos enzimáticos, não enzimáticos, centrífugos, elétricos, ou baseados no tamanho, ou de preferência, estimulando-se as células empregando-se meios de cultura (por exemplo, meios em que as células são incubadas) ou solução tamponada. As células são .30 opcionalmente coletadas, separado, e também expandidas gerando populações ainda maiores de HSCs e progénie diferenciada.
Um método para produção de uma população expandida de
HSCs compreende contatar um agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão de AHR e/ou um efetor a jusante de AHR, por exemplo, um composto da invenção, com uma população de células de partida (isto é, uma população expandida de células) compreendendo uma mistura de 5 HSCs e opcionalmente células de sustentação de HSC. A etapa de administração ocorre ex vivo, in vivoe/ou in vitro.Tal como descrito aqui, a população expandida de HSCs é opcionalmente administrada a um paciente. Para expansão ex vivo, tal agente para expansão de HSC, por exemplo um composto da invenção, pode ser formulado em DMSO ou algum outro veículo 10 adequado, “lavado” das células e as células podem ser transferidas, por e- xemplo, para um tampão de infusão. Uma formulação de DMSO, por exemplo, pode conter 0,3 mg/ml de um composto da invenção em solução de 60% de DMSO/40% de água. Por conseguinte, são fornecidos métodos de fornecimento de uma população expandida de HSCs a um paciente compreen- 15 dendo administrar ao paciente a população expandida de HSCs descrita a- qui ou produzida pelos métodos descritos aqui. A população expandida de HSCs é opcionalmente empregada para produzir células de sangue. As células de sangue são opcionalmente administradas a um paciente com necessidade. Opcionalmente, o paciente é o mesmo paciente do qual a popu- 20 lação não expandida de HSCs ou mistura de HSCs e células de sustentação de HSC foram derivadas.
Tal como empregada aqui, a expressão célula de sustentação de HSC refere-se às células naturalmente encontradas na vizinhança de uma ou mais HSCs de modo que fatores liberados por células de sustenta- 25 ção de HSCs alcançam a HSC por difusão, por exemplo. Células de sustentação de HSC incluem, mas não estão limitadas a, células estromais linforre- ticulares. Células estromais linforreticulares tais como empregadas aqui incluem, mas não estão limitadas a, todos os tipos de células presentes em um tecido linfoide que não são linfócitos ou precursores ou progenitores de .30 linfócitos. Por conseguinte, células estromais linforreticulares incluem oste- oblastos, células epiteliais, células endoteliais, células mesoteliais, células dendríticas, esplenócitos e macrófagos. Células estromais linforreticulares também incluem células que ordinariamente não funcionariam como células estromais linforreticulares, tais como fibroblastos, que foram geneticamente alteradas para secretar ou expressar em sua superfície celular os fatores necessários para a manutenção, crescimento ou diferenciação de HSCs, 5 incluindo sua progénie. Células estromais linforreticulares são opcionalmente derivadas da desagregação de um pedaço de tecido linfoide. Tais células são capazes sustentar in vitroou in vivo a manutenção, crescimento ou diferenciação de HSCs, incluindo sua progénie. Por tecido linfoide tem-se em vista incluir medula óssea, sangue periférico (incluindo sangue periférico 10 mobilizado), sangue de cordão umbilical, sangue placentário, fígado fetal, células embriônicas (incluindo células-tronco embriônicas), células aórtica- gonadal-mesonefro-derivadas, e tecido mole linfoide. Tecido mole linfoide tal como empregado aqui inclui, mas não está limitado a, tecidos tais como timo, baço, fígado, linfonodo, pele, amígdala, tecidos adenoides e placa de Peyer, e combinações dos mesmos.
Células estromais linforreticulares fornecem o microambiente de sustentação no tecido linfoide intacto para a manutenção, crescimento ou diferenciação de HSCs, incluindo sua progénie. O microambiente inclui fatores solúveis e de superfície celular expressos pelos vários tipos de células que compreendem o estroma linforreticular. Geralmente, a sustentação que as células estromais linforreticulares fornecem é caracterizada tanto como dependente de contacto quanto como não dependente de contacto.
Células estromais linforreticulares, por exemplo, são autólogas (de si mesmas) ou não autólogas (não de si mesmas, por exemplo, heteró-
Iogas, alogênicas, singênicas ou xenogênicas) em relação às HSCs. Autólogas, tal como empregado aqui, refere-se a células do mesmo paciente. Alogênicas, tal como empregado aqui, refere-se a células da mesma espécie que diferem geneticamente. Singênicas, tal como empregado aqui, refere-se a células de um paciente diferente que são geneticamente idênticas à célula .30 em comparação. Xenogênicas, tal como empregado aqui, refere-se a células de uma espécie diferente. Células estromais linforreticulares são obtidas, por exemplo, do tecido linfoide de um paciente humano ou um não hu- mano em qualquer tempo depois que o órgão / tecido tenha desenvolvido para uma fase (isto é, a fase de maturação) na qual ele possa sustentar a manutenção, crescimento ou diferenciação de HSCs. O tecido linfoide do qual as células estromais linforreticulares são derivadas normalmente de- 5 termina o empreendimento de HSCs de comprometimento da linhagem, resultando na especificidade de linhagem da progénie diferenciada.
A cocultura de HSCs (e progénie das mesmas) com células estromais linforreticulares, normalmente ocorre sob condições conhecidas na técnica (por exemplo, temperatura, conteúdo de CO2 e O2, meios nutritivos, 10 duração, etc.). O tempo suficiente para aumentar o número de células é um tempo que pode ser facilmente determinado por uma pessoa versada na técnica, e varia dependendo do número original de células semeadas. As quantidades de HSCs e células estromais linforreticulares introduzidas inicialmente (e subsequentemente semeadas) variam de acordo com as neces- 15 sidades do experimento. As quantidades ideais são facilmente determinadas por uma pessoa versada na técnica de acordo com as necessidades.
Tal como empregado em todas as partes, por um paciente pretende-se um indivíduo. Por conseguinte, pacientes incluem, por exemplo, animais domesticados, tais como gatos e cachorros, criação (por exemplo, 20 gado, cavalos, porcos, ovelhas, e cabras), animais de laboratório (por exemplo, camundongos, coelhos, ratos, e porquinhos-da-índia), mamíferos, mamí-feros não humanos, primatas, primatas não humanos, roedores, pássaros, répteis, anfíbios, peixe, e qualquer outro animal. O paciente é opcionalmente um mamífero tal como um primata ou um ser humano.
Métodos Para a Expansão de Células-tronco Hematopoéticas
A invenção, por conseguinte, refere-se a um método para a expansão de células-tronco hematopoéticas, que compreende (a)fornecimento de uma população de células de partida que compreende células-tronco hematopoéticas e (b)cultivo da referida população de células de partida ex vivo -30 na presença de um agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de reações do receptor de hidrocarboneto de arila, sob condições adequadas para a expansão de células-tronco hematopoéticas.
O receptor de hidrocarboneto de arila (dioxina) (AHR) é um fator de transcrição ativado por ligante citosólico conhecido por mediar um grande número de efeitos tóxicos e carcinogênicos em animais e possivelmente em 5 seres humanos (Safe S 2001 Toxicol Lett 120: 1-7). Como consequência da ativação de AHR por seus ligantes, muitos genes de desintoxicação são transcricionalmente induzidos, incluindo aqueles codificando para enzimas metabolizadoras de xenobióticos de fase I, tais como os citocromos P450 CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 e CYP2S1, e as enzimas de fase II UDP- 10 glicuronosiltransferase UGT1A6, quinona oxidoredutase-1 dependente de NAD(P)H (NQO1), a aldeído desidrogenase ALDH3A1, e várias glutationa-S- transferase.
Em uma modalidade, um agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a 15 jusante da série de reações do receptor de hidrocarboneto de arila é selecionado entre o grupo que consiste em: (i) um composto orgânico; (ii) uma molécula pequena de RNA de interferência (siRNA) capaz de sub-regular a expressão de AHR; e (iii) oligonucleotídeo antissenso capaz de sub-regular a expressão de AHR.
Em uma modalidade específica, o referido método para a ex pansão de células-tronco hematopoéticas compreende (a)fornecimento de uma população de células de partida que compreende células-tronco hematopoéticas e (b)cultivo da referida população de células de partida ex vivo na presença de um agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do 25 receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de rea-ções do receptor de hidrocarboneto de arila, sob condições adequadas para a expansão de células-tronco hematopoéticas, em que o referido agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de reações do receptor de hidro- -30 carboneto de arila não é alfa-naftoflavona ou 3'-metóxi-4'-nitroflavona.
O composto orgânico que inibe a atividade de AHR (também referido aqui como antagonista de AHR) foi descrito na técnica, por exemplo (2-metil-4-o-tolilazofenil)amida de ácido 2-metil-2H-pirazol-3-carboxílico (CH223191), alfa naftoflavona, resveratrol (Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis., abril de 2003; 13(2):104-13), 3'-metóxi-4'-nitroflavona (Biochem. Pharmacol., 15 de maio de 2007; 73(10): 1622-34, Epub 30 de janeiro de 2007), e 6-metil- 1,3,8-triclorodibenzofurano (Cancer Res., 15 de abril de 2004; 64(8):2889- 97). Um inibidor de atividade de AHR refere-se a um composto que diminui a atividade de AHR para pelo menos 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80% ou pelo menos 90% da atividade transcricional de AHR como observado sob condições ativadas. Um ensaio para medir a atividade inibidora de AHR é por exemplo o ensaio de gene repórter de luciferase dependente de AHR induzida por dioxina tal como descrito nos exemplos. Em uma modalidade, um inibidor da atividade de AHR é um composto que tem um EC50 de menos que 10 pM, de preferência menos que 5 pM conforme medido no ensaio de gene repórter de luciferase dependente de AHR induzida por dioxina.
AHR é um fator transcricional que regula a transcrição de vários genes no ser humano. Em uma modalidade, um efetor a jusante da série de reações de AHR é um gene que é diretamente regulado ao nível transcricional por AHR. Exemplos de tais genes são selecionados de Cyp1B1, Cyp1 A1, e AHRR. AHR também funciona em séries de reações fora de seu papel bem caracterizado em indução de enzima xenobiótica. Mostrou-se que ligantes xenobióticos de AHR regulam beta catenina, STAT5, STAT1, HES-1, c-Myc, C/EBP, PU.1, β-catenina, p21, P27, pRb, desoxinucleotidil transferase, CXCR4, e seu ligante de quimiocina CXCL12 (SDF-1).
Em uma modalidade específica, um agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila é um composto tal como definido no Sumário da Invenção.
Em outra modalidade, um agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila é um oligonucleotídeo antissenso ou uma molécula pequena de RNA interferente (siR- -30 NA), capaz de sub-regular a expressão da proteína de AHR ou a expressão da proteína de um ou mais efetores a jusante de AHR.
O planejamento de oligonucleotídeos antissenso que podem ser empregados para inibir eficazmente a expressão da proteína de AHR deve ser efetuado de uma maneira que tais oligonucleotídeos liguem especificamente o mRNA designado nas células de um modo que iniba a translação do mesmo. A sequência adequada para uso em planejamento e síntese de 5 oligonucleotídeos antissenso que especificamente ligam-se ao mRNA de AHR, DNA genômico e/ou seu promotor ou outras sequências de controle estão disponíveis em sequência publicada de AHR, em particular AHR humano. Além disso, algoritmos para a identificação de sequências com a afinidade de ligação predita mais alta em relação ao seu mRNA-alvo com base 10 no ciclo termodinâmico que responde pela energética de alterações estruturais tanto no mRNA-alvo quanto nos oligonucleotídeos também estão disponíveis.
A síntese de moléculas de RNAi adequadas para uso com a presente invenção pode ser afetada como segue: Primeiro, a sequência de 15 mRNA de AHR (ou um ou mais de seus efetores a jusante) é esquadrinhada a jusante do códon de partida de AUG para sequências de dinucleotídeo AA. A ocorrência de cada AA e os 19 3'-adjacentes é registrada como um sítio- alvo de siRNA potencial. Em seguida, os sítios-alvo potenciais são comparados a um banco de dados genômicos adequados (por exemplo, ser huma- 20 no, camundongo, rato, etc.) empregando-se qualquer software de alinhamento de sequência. O sítio-alvo putativo que exibe homologia significante a outras sequências de codificação é filtrado. Sequências preferidas são então aquelas incluindo baixo conteúdo de G/C, em particular sequências com conteúdo de G/C menor que 55%. Vários sítios-alvo são então selecio- 25 nados ao longo do comprimento do gene-alvo. Métodos ou algoritmos para identificar sítio-alvo putativo de siRNA são descritos por exemplo em (Tilesi, e outros, Curr. Opin. Mol. Ther. 11:156, 2009). Exemplos de moléculas de siRNA que são capazes de sub-regular a expressão de AHR são: AHR 111S, 5’ GCG GCA TAG AGA CCG ACT TAA TTT CAA GAG AAT TAA GTC .30 GGT CTC TAT GCC GCT TTT TTG G 3’; AHR 111AS, 5’ CGC GCC AAA AAA GCG GCA TAG AGA CCG ACT TAA TTC TCT TGA AAT TAA GTC GGT CTC TAT GCC GC 3’; AHR 242S, 5’ GGC TTC TTT GAT GTT GCA TTA ATT CAA GAG ATT AAT GCA ACA TCA AAG AAG CCT TTT TTG G 3’; AHR 242AS, 5’ CGC GCC AAA AAA GGC TTC TTT GAT GTT GCA TTA ATC TCT TGA ATT AAT GCA ACA TCA AAG AAG CC 3’.
A população de células de partida que compreende células- 5 tronco hematopoéticas será selecionada pela pessoa versada na técnica dependendo do uso pensado. Várias fontes de células que compreendem células-tronco hematopoéticas foram descritas na técnica, incluindo medula óssea, sangue periférico, sangue de cordão umbilical neonatal, placenta ou outras fontes tais como fígado, particularmente fígado fetal.
A população de células pode primeiramente ser submetida a e- tapas de enriquecimento ou purificação, incluindo seleção negativa e/ou positiva de células com base em marcadores celulares específicos a fim de fornecer a população de células de partida. Métodos para isolamento da referida população de células de partida com base em marcadores celulares 15 específicos podem empregar tecnologia de classificação de células ativadas fluorescentes (FACS) também chamada citometria de fluxo ou substrato sólido ou insolúvel ao qual estão ligados anticorpos ou ligantes que interagem com marcadores de superfície celular específicos. Por exemplo, as células podem ser contatadas com um substrato sólido (por exemplo, coluna de con- tas, frascos, partículas magnéticas) contendo os anticorpos e quaisquer células não ligadas são removidas. Quando um substrato sólido compreendendo contas magnéticas ou paramagnéticas é empregado, as células ligadas às contas podem ser facilmente isoladas por meio de um separador magnético.
Em uma modalidade, a referida população de células de partida é enriquecida em um fenótipo de marcador de célula desejável (por exemplo, CD34+, CD133+, CD90+) ou com base em efluxo de corantes tais como ro- damina, Hoechst, ou atividade de aldeído desidrogenase. Em uma modalidade específica, a referida população de células de partida é enriquecida em . 30 células de CD34+. Métodos para enriquecer população de células de sangue em células de CD34+ incluem kits comercializados por Miltenyi Biotec (kit de isolamento direto de CD34+, Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, A- lemanha) ou por Baxter (Isolex 3000).
A quantidade de sangue de cordão de um único nascimento é frequentemente inadequada para tratar um adulto ou uma criança mais velha. Uma vantagem dos métodos de expansão empregando os compostos 5 da invenção, ou agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de rea-ções do receptor de hidrocarboneto de arila, é que permite a produção de uma quantidade suficiente de células-tronco hematopoéticas de somente uma unidade de sangue de cordão.
Por conseguinte, em uma modalidade, a população de células de partida é derivada de células de sangue de cordão umbilical neonatais que foram enriquecidas em células de CD34+. Em uma modalidade relacionada, a referida população de células de partida é derivada de uma ou duas unidades de sangue de cordão umbilical.
Em outra modalidade, a população de células de partida é deri vada de células de sangue periférico mobilizado humanas que foram enriquecidas em células de CD34+. Em uma modalidade relacionada, a referida população de células de partida é derivada de células de sangue periférico mobilizado humanas isoladas de apenas um paciente.
A referida população de células de partida pode de preferência conter pelo menos 50% de células de CD34+, em algumas modalidades, mais de 90% de células de CD34+, e pode compreender entre 105 e 109 células nucleadas.
A população de células de partida pode ser empregada direta- 25 mente para expansão ou congelada e armazenada para uso em uma data posterior.
As condições para cultivar a população de células de partida para expansão de células-tronco hematopoéticas variarão, dependendo, entre outras coisas, da população de células de partida, do número final desejado . 30 de células, e proporção final desejada de HSCs.
Em uma modalidade específica, em particular, empregando-se uma população de células de partida de células de sangue de cordão umbilical enriquecidas em células de CD34+, as condições de cultura compreendem o uso de outras citocinas e fatores de crescimento, geralmente conhecidos na técnica para expansão de células-tronco hematopoéticas. Tais citocinas e fatores de crescimento incluem sem limitação IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF, GM-CSF, SCF, FIT3-L, trombopoetina (TPO), eritropoetina, e análogos dos mesmos. Tal como empregado aqui, “análogos” inclui quaisquer variantes estruturais das citocinas e fatores de crescimento tendo a atividade biológica como as formas de ocorrência natural, incluindo sem limitação, variantes com atividade biológica realçada ou diminuída quando comparadas às formas de ocorrência natural ou agonistas de receptor de citocina tais como um anticorpo de agonista contra o receptor de TPO (por exemplo, VB22B sc(Fv)2 conforme detalhado na publicação patente WO 2007/145227, e similares). Combinações de citocina e fator de crescimento são escolhidas para expandir HSC e células progenitoras embora limitando a produção de células terminalmente diferenciadas. Em uma modalidade específica, uma ou mais citocinas e fatores de crescimento são selecionados do grupo que consiste em SCF, Flt3-L e TPO. Em uma modalidade específica, pelo menos TPO é empregado em um meio sem soro sob condições adequadas para a expansão de HSC. Em uma modalidade relacionada, uma mistura de IL6, SCF, Flt3-L e TPO é empregada no método para a expansão de HSCs em combinação com o composto da invenção ou um agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de reações do receptor de hidrocarboneto de arila. IL6 ou interleucina-6 humana, também conhecida como fator 2 estimulador de células B foi descrita por (Kishimoto, Ann. review of Imm. 23:1 2005) e está comercialmente disponível. SCF ou fator de células- tronco humano, também conhecido como ligante de c-kit, fator de crescimento celular ou fator de Steel foi descrito (Smith, MA e outros, ACTA Haemato- logica, 105, 3:143, 2001) e está comercialmente disponível. Flt3-L ou Ligante de FLT-3, também referido como FL é um fator que se liga ao receptor de flt3. Ele foi descrito (Hannum C, Nature368 (6472): 643-8) e está comerei- almente disponível. TPO ou trombopoetina, também conhecida como fator de crescimento de megacariócitos (MGDF) ou ligante de c-Mpl foi descrito (Kaushansky K (2006). N. Engl. J. Med. 354 (19): 2034-45) e está comercialmente disponível.
A expansão de HSC pode ser executada em um meio basal, que é suplementado com as misturas de citocinas e fatores de crescimento descritos acima. Um meio basal tipicamente compreende aminoácidos, fontes de carbono, vitaminas, proteínas séricas (por exemplo albumina), sais inorgânicos, cátions divalentes, tampões e qualquer outro elemento adequado para uso em expansão de HSC. Exemplos de tal meio basal adequados para um método de expansão de HSC incluem, sem limitação, Meio de Expan-são Sem Soro - StemSpan® SFEM (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá), Meio Definido - StemSpan® H3000 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá), CelIGro® SCGM (CelIGenix, Friburgo, Alemanha), StemPro®- 34 SFM (Invitrogen).
Em uma modalidade, o composto da invenção ou o agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de reações do receptor de hidrocarboneto de arila, é administrado durante o método de expansão da referida população de células de partida sob uma concentração adequada para a expansão de HSC. Em uma modalidade específica, o referido composto ou agente de modulação de AhR é administrado a uma concentração compreendida entre 1 pM e 100 pM, por exemplo entre 10 pM e 10 pM, ou entre 100 pM e 1 pM.
Em uma modalidade específica onde a população de células de partida essencialmente consiste em células enriquecidas de CD34+ de uma ou duas unidades de sangue de cordão, as células são cultivadas sob condições para expansão de HSC de aproximadamente 3 dias a aproximadamente 90 dias, por exemplo entre 7 e 2 dias e/ou até a expansão de duplicação indicada e as populações de células características sejam obtidas. Em uma modalidade específica, as células são cultivadas sob condições para a expansão de HSC não mais de 21 dias, 14 dias ou 7 dias.
Em uma modalidade, a população de células de partida é cultivada durante um tempo suficiente para alcançar um número absoluto de células de CD34+ de pelo menos 105, 106, 107, 108 ou 109 células. Em outra modalidade, a referida população de células de partida é cultivada durante 5 um tempo suficiente para uma expansão de 10 a 50000 vezes de células de CD34+, por exemplo, entre expansão de 100 e 10000 vezes.
A população de células obtida após o método de expansão pode ser empregada sem purificação adicional ou pode ser submetida a outras etapas de purificação ou seleção.
A população de células pode em seguida ser lavada para remo ver o composto de invenção ou qualquer outro agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de reações do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou quaisquer outros componentes da cultura de células e ressuspensa em um meio de suspensão de células adequado para uso de curta duração ou em um meio de armazenamento de longa duração, por exemplo um meio adequado para criopreservação.
População de Células Com HSCs Expandidas Como Obtidas pelo Método de Expansão e Composições Terapêuticas
A invenção também fornece uma população de células HSCs expandidas, obteníveis ou obtidas pelo método de expansão descrito acima. Em uma modalidade específica, tal população de células é ressuspensa em um meio farmaceuticamente aceitável adequado para administração a um hospedeiro mamífero, desse modo fornecendo uma composição terapêutica.
O composto tal como definido no Sumário da Invenção ou um agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de reações do receptor de hidrocarboneto de arila permite a expansão de HSCs, por exemplo, de apenas uma ou duas unidades de sangue de cordão, para fornecer uma po- - 30 pulação de células quantitativamente e qualitativamente adequada para efi-ciente enxerto de curta e longa duração em paciente humano com necessidade do mesmo. Em particular, a invenção refere-se a uma composição que compreende uma população de células com HSCs expandidas derivadas de não mais de uma ou duas unidades de sangue de cordão, em que a referida composição terapêutica contém uma quantidade total de células de pelo menos 105, 106, 107, 108 ou 109 células, com entre 20 a 100%, por exemplo 5 entre 40 a 80% das células totais sendo células de CD34+. Em uma modalidade relacionada, a referida composição contém entre 0,1 a 40%, por exemplo entre 0,1 a 10% das células totais sendo CD34+ Thy1+ e 20 a 80% das células sendo CD34+ CD45RA+. Em algumas modalidades específicas, a referida composição contém entre 10 a 95% das células sendo CD38+ e en- 10 tre 5 a 70% das células sendo CD133+.
Uso de Composições Terapêuticas
A invenção também fornece a população de células com HSCs expandidas ou sua composição para uso em transplante de células-tronco alogênico ou autólogo em um paciente mamífero.
O paciente referido aqui é, por exemplo, um doador de medula óssea ou um indivíduo com ou em risco quanto aos níveis de células de sangue esgotados ou limitados. Opcionalmente, o paciente é um doador de medula óssea antes da colheita de medula óssea ou um doador de medula óssea depois da colheita de medula óssea. O paciente é opcionalmente um 20 receptor de um transplante de medula óssea. Os métodos descritos aqui são particularmente úteis em pacientes que têm reserva de medula óssea limitada tais como pacientes idosos ou pacientes anteriormente expostos a um tratamento de depleção imune ou tratamento mieloablativo tal como quimioterapia, por exemplo, para tratamento de leucemia ou linfomas. O paci- 25 ente, opcionalmente, tem um nível de células de sangue diminuído ou está em risco quanto ao desenvolvimento de um nível de célula de sangue diminuído quando comparado a um nível de células de sangue de controle. Tal como empregada aqui, a expressão nível de células de sangue de controle refere-se a um nível médio de células de sangue em um paciente antes de - 30 ou na ausência substancial de um evento que muda os níveis de células de sangue no paciente. Um evento que muda os níveis de células de sangue em um paciente inclui, por exemplo, anemia, trauma, quimioterapia, transplante de medula óssea e terapia de radiação. Por exemplo, o paciente tem anemia ou perda de sangue devido a, por exemplo, trauma.
A população de HSC expandida ou a composição que compreende a população de células com HSCs expandidas é administrada ao paci- 5 ente, por exemplo, antes, ao mesmo tempo, ou depois da quimioterapia, terapia de radiação ou um transplante de medula óssea. O paciente opcionalmente tem medula óssea esgotada relacionada à, por exemplo, síndrome congênita, genética ou adquirida caracterizada por perda de medula óssea ou medula óssea esgotada. Por conseguinte, o paciente é opcionalmente 10 um paciente com necessidade de hematopoese. Opcionalmente, o paciente é um doador de medula óssea ou é um paciente com ou em risco quanto à medula óssea esgotada.
A manipulação de células-tronco hematopoéticas é útil como um tratamento suplementar à quimioterapia ou terapia de radiação. Por exem- 15 pio, as HSCs são localizadas no sangue periférico e em seguida isoladas de um paciente que sofrerá quimioterapia, e depois da terapia as células são restituídas. Por conseguinte, o paciente é um paciente sofrendo ou que se espera sofrer um tratamento de depleção de células imune tal como quimioterapia, terapia de radiação ou servindo como um doador para um transplan- 20 te de medula óssea. A medula óssea é um dos tecidos mais prolíficos no corpo e é, por conseguinte, frequentemente o órgão que é inicialmente danificado por fármacos de quimioterapia e radiação. O resultado é que a produção de células de sangue é destruída rapidamente durante tratamento de quimioterapia ou radiação, e a quimioterapia ou radiação deve ser terminada 25 para permitir o sistema hematopoético reabastecer os fornecimentos de células de sangue antes que um paciente seja retratado com quimioterapia. Por conseguinte, tal como descrito aqui, HSCs ou células de sangue produzidas pelos métodos descritos aqui são opcionalmente administradas a tais pacientes com necessidade de células de sangue adicionais. - 30 São fornecidas HSCs expandidas por um composto da invenção ou um agente capaz de sub-regular a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou um efetor a jusante da série de reações do receptor de hidrocarboneto de arila ou as composições com HSCs expandidas tal como descrito acima em combinação com um produto terapêutico capaz de realçar a proliferação de HSCs in vivo, in vitro, ou ex vivo (por e- xemplo, uma molécula pequena, um anticorpo, ou outros mais) e opcional- 5 mente pelo menos um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
Por um produto terapêutico capaz de realçar a proliferação de HSC tem-se em vista: um anticorpo de agonista contra o receptor de TPO (por exemplo, VB22B sc(Fv)2 conforme detalhado na publicação patente WO 2007/145227, e similares); uma citocina tal como SCF, IL-6, ligante de Flt-3, 10 TPO ou um mimético de TPO (por exemplo, tal como descrito em WO/2007/022269; WO/2007/009120; WO/2004/054515; WO/2003/103686; WO/2002/085343; WO/2002/049413; WO/2001/089457; WO/2001/039773; WO/2001/034585; WO/2001/021180; WO/2001/021180; WO/2001/017349; WO/2000/066112; WO/2000/035446; WO/2000/028987; WO/2008/028645; e 15 similares); fator de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF); fator de estimulação de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF); uma pros- taglandina ou um agonista de receptor de prostaglandina (por exemplo, agonista de receptor-1 de prostaglandina E2 (EP-1), agonista de receptor-2 de prostaglandina E2 (EP-2), agonista de receptor-3 de prostaglandina E2 (EP- 3) e agonistas de receptor-4 de prostaglandina E2 (EP-4), conforme detalha do na publicação patente WO/2008/073748); tetraetilenopentamina (TEPA); ligantes de Incisura (Delta-1); e/ou um agonista de WNT. Além disso, o cultivo de células-tronco com células-tronco mesenquimais (MSCs) previne doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) e pode auxiliar a expansão de células-tronco. MSCs e células-tronco podem ser transplantadas como uma cultura total. Por farmaceuticamente aceitável tem-se em vista um material que não seja biologicamente ou de outra forma indesejável, isto é, o material pode ser administrado a um paciente ou célula, sem causar efeitos biológi- - 30 cos indesejáveis ou interagir de uma maneira danosa com os outros componentes da composição farmacêutica em que está contido. O veículo ou excipiente é selecionado para minimizar a degradação do ingrediente ativo e mm minimizar os efeitos colaterais adversos na célula ou paciente.
As composições são formuladas de qualquer maneira convencional para o uso nos métodos descritos aqui. A administração está por qualquer rotina conhecida para ser eficaz alguém de ordinária versatilidade 5 na técnica. Por exemplo, as composições são administradas oralmente, pa- renteralmente (por exemplo, intravenosamente), através de injeção intramuscular, por injeção intraperitoneal, transdermicamente, extracorporalmen- te, intranasalmente ou topicamente.
O método preferido de administração é infusão intravenosa. O 10 número de células transfundido levará em conta fatores tais como sexo, idade, peso, os tipos de doença ou distúrbio, fase do distúrbio, a porcentagem das células desejadas na população de células e a quantidade de células necessária para produzir um benefício terapêutico. Em uma modalidade particular, a composição é administrada através de infusão intravenosa e 15 compreende pelo menos 104 células/kg, de 105 a 5.107 células/kg ou mais se necessário. Em uma modalidade específica, as células infundidas são todas derivadas de células de sangue de cordão expandidas de um único nascimento.
Um veículo farmaceuticamente aceitável para infusão de uma 20 composição que compreende células em um paciente tipicamente compreende salina tamponada com HSA a 5% ou meio basal não suplementado ou meio tal como conhecido na técnica.
Para administração oral, as composições assumem a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparadas por meios convencionais 25 com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinado, polivinilpirrolidona ou metilce- lulose de hidroxipropila); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcrista- lina ou fosfato de hidrogênio de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata - 30 ou glicolato de amido de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, sulfato de laurila de sódio). Os comprimidos são cobertos por métodos bem conhecidos na técnica. Preparações líquidas para administração oral tomam a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou elas podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas são preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceutícamente aceitá- 5 veis tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivado celulosos ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulcifican- tes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais de fracionado); e conservantes (por exemplo, metila ou propil-p-hidroxibenzoatos ou 10 ácido sórbico). As preparações opcionalmente contêm sais de tampões, a- gentes aromatizantes, colorantes e adoçantes como adequados.
As composições são formuladas para administração parenteral através de injeção, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção são apresentadas em forma de dosagem unitária, 15 por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com ou sem um conservante adicionado. As composições levam tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter os agentes formuladores tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente ativo está em 20 forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água sem pirogênio estéril, antes do uso. Em geral, água, óleo adequado, salina, dextrose aquosa (glicose), e soluções de açúcar relacionadas e glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicóis são os veículos adequados para soluções parenterais. Soluções para administração parenteral contêm, por 25 exemplo, um sal solúvel em água do ingrediente ativo, agentes estabilizantes adequados e, se necessário, substâncias de tampão. Agentes antioxi- dantes tais como bissulfato de sódio, sulfito de sódio ou ácido ascórbico, ou sozinho ou combinação, são agentes de estabilização adequados. Também ácido cítrico e seus sais e ácido etilenodiaminatetraacético de sódio (EDTA) .30 são opcionalmente empregados. Além disso, soluções parenterais contêm conservantes tais como cloreto de benzalcônio, metil- ou propil-parabeno e clorobutanol. Veículos farmacêuticos adequados são descritos em Reming- ton: A Ciência e Prática de Farmácia, 21a Edição, David B. Troy, ed., Lippi- cott Williams &Wilkins (2005) que está incorporado por referência em sua totalidade pelo menos material relacionado aos veículos e composições farmacêuticas.
As composições são opcionalmente formuladas como uma preparação de depósito. Tais formulações de ação longa são opcionalmente administradas por implantação. Desse modo, por exemplo, as composições são formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resina de permuta de íons, ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel. As composições são aplicadas a ou incluídas com implantes simultâneos com ou após implante cirúrgico.
Adicionalmente, métodos farmacêuticos padrões são empregados para controlar a duração da ação. Estes incluem controlar preparações de liberação e macromoléculas adequadas, por exemplo, polímeros, poliés- teres, ácidos poliaminos, polivinila, pirrolidona, etilenovinilacetato, metil celulose, carboximetil celulose ou sulfato de protamina. A concentração de macromoléculas assim como os métodos de incorporação são ajustados a fim de controlar a liberação. Opcionalmente, o agente é incorporado em partículas de materiais poliméricos tais como poliésteres, ácidos de poliamino, hi- drogéis, poli (ácido láctico) ou copolímeros de etilenovinilacetato. Além de serem incorporados, estes agentes são opcionalmente empregados para capturar o composto em microcápsulas.
Uma composição para uso nos métodos descritos aqui é opcionalmente formulada como uma formulação de liberação com o tempo e/ou prolongada. Tais formulações de liberação com o tempo e/ou prolongada são preparadas por métodos de liberação prolongada ou dispositivos de liberação que são bem conhecidos por aqueles de ordinária versatilidade na técnica. As composições são empregadas para fornecer liberação lenta ou prolongada de um ou mais dos ingredientes ativos empregando-se, por e- xemplo, hidropropilmetil celulose, outras matrizes de polímero, outras, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos, revestimentos de múltiplas camadas, micropartículas, lipossomas, microesferas ou uma combinação dos mesmos para fornecer o perfil de liberação desejado em proporções variadas. Formulações de liberação prolongada adequadas são selecionadas para uso com as composições descritas aqui. Por conseguinte, formas de 5 dosagem unitária única adequadas para administração oral, tais como, mas não limitadas a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, capselas, pós que são adaptadas para liberação prolongada são empregadas.
As composições são opcionalmente liberadas por um sistema de liberação controlada. Por exemplo, a composição é administrada empre- 10 gando-se infusão intravenosa, uma bomba osmótica implantável, lipossomas, ou outros modos de administração. Um sistema de liberação controlada é colocado na proximidade do alvo.
Opcionalmente, é desejável administrar a composição localmente, isto é, à área com necessidade de tratamento. Por exemplo, a composi- 15 ção é administrada através de injeção na medula óssea de um osso longo, por exemplo. Por exemplo, a administração local é obtida, por exemplo, a- través de infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica (por exemplo, junto com um curativo de ferimento depois da cirurgia), injeção, cateter, supositório, ou implante. Um implante é de um material poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas, ou fibras.
As composições farmacêuticas descritas aqui são administradas através de quaisquer meios convencionais disponíveis para uso junto com produtos farmacêuticos, ou como ingredientes ativos terapêuticos individuais 25 ou em uma combinação de ingredientes ativos terapêuticos. Elas são opcionalmente administradas sozinhas, mas geralmente são administradas com um veículo farmacêutico selecionado com base na rotina de administração escolhida e prática farmacêutica padrão.
Os compostos descritos aqui são fornecidos em uma forma far- - 30 maceuticamente aceitável incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis e derivados dos mesmos. A expressão forma farmaceuticamente aceitável refere-se à composições incluindo os compostos descritos aqui que são geral- mente seguros, relativamente não tóxicos e nem biologicamente nem de outra forma indesejáveis. Estas composições opcionalmente incluem veículos ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos à célula ou paciente sendo exposto a estas nas dosagens e concentrações empregadas. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos de aproximadamente 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossa- carídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes de quelação tais como EDTA; alcoóis de açúcar tais como manitol ou sorbitol; cotraíons de formação de sal tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN® (Uniqema, Reino Unido), polieti- leno glicol (PEG), e PLURONICS® (BASF, Alemanha).
A expressão sais e derivados de ácido farmaceuticamente aceitáveis referem-se a sais e derivados dos compostos de fórmula I descritos aqui que retêm a eficácia e propriedades biológicas tais como descritas, e que não são biologicamente ou de outra forma indesejável. Sais farmaceuticamente aceitáveis são formados, por exemplo, com ácidos inorgânicos tais como ácido hidroclórico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares, e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malônico, ácido sucínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico, e similares.
A estabilidade química de uma composição que compreende um composto de fórmula I ou um sal ou éster farmaceuticamente aceitável do mesmo é realçada através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, um éster de ácido alcanoico de um sorbitol polietoxi- lado (um polissorbato) é adicionado a uma composição que contém um composto de fórmula I em uma quantidade eficaz para realçar a estabilidade química do composto.
Os dados obtidos dos ensaios de culturas de células e estudos animais são opcionalmente empregados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem de tais compostos situa-se de prefe- 5 rência dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da rotina de administração utilizada. Para qualquer composto empregado nos métodos fornecidos, a dose terapeuticamente eficaz é estimada inicialmente a partir dos ensaios de culturas de células.
Também é fornecido aqui um pacote ou kit que compreende um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes descritos aqui. Tais kits opcionalmente compreendem soluções e tampões quando necessário ou desejado. O kit opcionalmente inclui uma população expandida de células-tronco produzida através de métodos descritos acima ou pode conter 15 recipientes ou composições para a produção de uma população expandida de HSCs. Em particular, a invenção fornece um kit para expansão ex vivo de células-tronco hematopoéticas, que compreende um composto tal como definido no Sumário da Invenção e instruções para uso de tal composto em um método para expansão de HSC e, opcionalmente, uma ou mais citocinas 20 ou fatores de crescimento, ou meios para crescimento de células, em particular meios para crescimento de células-tronco hematopoéticas tal como descrito acima. O kit também pode compreender anticorpos para monitorar a produção das células, tais como anticorpos anti-CD34, anti-CD133, anti- CD38, anti-CD45RA e/ou anti-Thy1. Em uma modalidade específica, tal kit 25 também inclui uma ou mais citocinas ou fatores de crescimento selecionados do grupo que consiste em IL6, FLT3-L, SCF e TPO. Opcionalmente associadas com tais pacote(s) ou kit(s) estão instruções para uso.
É também fornecido um kit para fornecimento de uma quantidade eficaz de um composto da invenção para aumentar HSCs em um pacien- - 30 te compreendendo um ou mais doses do composto para uso durante um período de tempo, em que o número total de doses do composto da invenção no kit é igual à quantidade eficaz suficiente para aumentar HSCs em um pa- ciente. O período de tempo é de aproximadamente um a vários dias ou semanas ou meses. Por conseguinte, o período de tempo é de pelo menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 20, 21, 30 ou 60 dias ou mais ou qualquer número de dias entre um e 90.
Processos para a Preparação de Compostos da Invenção
A presente invenção também inclui processos para a preparação de compostos da invenção. Nas reações descritas, pode ser necessário proteger grupos funcionais reativos, por exemplo, grupos hidróxi, amino, imino, tio ou carbóxi, onde estes são desejados no produto final, para evitar sua participação não desejada nas reações. Grupos de proteção convencionais podem ser empregados de acordo com prática-padrão, por exemplo, vide T.W. Greene e P. G. M. Wuts em “Protective Groups in Organic Chemistry”, John Wiley and Sons, 1991.
Os seguintes esquemas de reação 1 a 5 detalham a preparação de compostos da invenção. Deve ser observado por alguém versado na técnica que, seguindo a introdução pelos métodos detalhados abaixo, qualquer um dos grupos Ri, R2, R3, R4, θ h pode opcionalmente ser também elaborado por transformações conhecidas para chegar aos compostos finais desejados de fórmula I.
Compostos de fórmula I podem ser preparados de acordo com o seguinte Esquema de Reação 1:
Figure img0007
em que Gi, G2, G3, G4, Ri, R2 e R4são tais como definidos para a fórmula I no Sumário da Invenção e L de fórmula I é definido no esquema de reação como -NH-L1- que é equivalente a, por exemplo, -NR5a(CH2)o-3- onde R5aθ hidrogênio e -(CH2)o-3- θ Li-
Compostos de fórmula I podem ser preparados por reação de um composto de fórmula 2 com um composto de fórmula 3 na presença de um catalisador adequado (por exemplo, Pd2(dba)3, ou similar) na presença de um ligante adequado (por exemplo, cloreto de 1,3-bis(2,4,6- trimetilfenil)imidazólio), uma base adequada (por exemplo, Cs2CO3, ou simi- 10 lar) e um solvente adequado (por exemplo, 1,4-dioxano) a uma temperatura de cerca de 80 a 100 °C durante 2 a cerca de 48 horas. Compostos de fórmula 2 por sua vez podem ser preparados por reação de um composto de fórmula 4 com um ligeiro excesso de um composto de amina de fórmula 5 em um solvente adequado (por exemplo isopropanol) a uma temperatura de 15 aproximadamente a temperatura ambiente a aproximadamente 80 °C.
Compostos de fórmula 4 podem ser preparados por alquilação de um composto de fórmula 6 com um adequado agente de alquilação 7, em que Xi é cloro, bromo, iodo, ou um éster de sulfonato, na presença de uma base adequada (por exemplo hidreto de sódio ou carbonato de potássio), em um sol- 20 vente adequado (por exemplo DMF), a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 80 °C. Alternativamente, a reação pode ser executada sob condições de Mitsunobu empregando um álcool adequado R4-OH na presença de uma fosfina adequada (por exemplo, trifenilfosfina) e azodicarboxilato (por exemplo, dietilazodicarboxilato), em um solvente inerte tal como THF ou to- 25 lueno, a uma temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente a temperatura ambiente.
Compostos de fórmula la, em que Gi é CR3 e em que todos os outros grupos G são N, também podem ser preparados procedendo-se tal como no seguinte Esquema de Reação 2:
Esquema de Reação 2
Figure img0008
no Sumário da Invenção e L de fórmula I é definido no esquema de reação como -NH-Lr que é equivalente a, por exemplo, -NR5a(CH2)o-3- onde R5a é hidrogênio e -(CH2)0-3- θ
Compostos de fórmula I podem ser preparados por reação de um composto de fórmula 8 com um composto de amina de fórmula 5 em um solvente adequado (por exemplo isopropanol) a uma temperatura de aproximadamente a temperatura ambiente a aproximadamente 100 °C. Compostos de fórmula 8 por sua vez podem ser preparados por reação de um composto de fórmula 9 com um composto de fórmula 3 na presença de um catalisador adequado (por exemplo, Pd(Ph3P)4, Pd2(dba)3, ou similar), opcionalmente na presença de um ligante adequado (por exemplo, cloreto de 1,3- bis(2,4,6-trimetilfenil)imidazólio), uma base adequada (por exemplo, Cs2COs, ou similar) e um solvente adequado (por exemplo, 1,4-dioxano) a uma temperatura de cerca de 80 a 100 °C durante 2 a cerca de 48 horas. Compostos de fórmula 9 por sua vez podem ser preparados por reação de um composto de fórmula 10 com uma mistura de di-iodometano, iodeto de cobre(l), e um nitrito de alquila (por exemplo isoamilnitrito), opcionalmente na presença de um solvente inerte, a uma temperatura de cerca de 50 a 100 °C. Compostos de fórmula 10 podem ser preparados por alquilação de um composto de fórmula 11 com um adequado agente de alquilação 7, em que Xi é cloro, bromo, iodo, ou um éster de sulfonato, na presença de uma base adequada (por exemplo hidreto de sódio ou carbonato de potássio), em um solvente adequado (por exemplo DMF), a uma temperatura de cerca de 0 °C a cerca de 80 °C. Alternativamente, a reação pode ser executada sob condições de Mitsunobu empregando um álcool adequado R4-OH na presença de uma fosfina adequada (por exemplo trifenilfosfina) e azodicarboxilato (por exemplo dietilazodicarboxilato), em um solvente inerte tal como THF ou tolueno, a uma temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente a temperatura ambiente.
Compostos de fórmula II, que são um subconjunto de compostos de fórmula I em que Ri é heterociclila ligada a N ou heteroarila ligada a N, podem ser preparados conforme detalhado no seguinte Esquema de Reação 3:
Figure img0009
G1, G2, G3, G4, RI, R2 θ R4 são tais como definidos para a fórmu la I no Sumário da Invenção e L de fórmula I é definido no esquema de reação como -NH-L-1- que é equivalente a, por exemplo, -NR5a(CH2)o-3- onde Rsa é hidrogênio e -(CHsjoo- é Compostos de fórmula II podem ser preparados reagindo um composto de fórmula 2 com um composto de fórmula 20 na presença de um excesso de amina cíclica ou heterociclo portando NH (por exemplo, pirazol substituído, imidazol substituído, e similares), a uma temperatura de cerca de 50 °C a cerca de 250 °C, para aproximadamente 1 a a- proximadamente 24 horas, opcionalmente na presença de uma base tal como hidreto de sódio ou DBU.
Compostos de fórmula 10 em que Gi é CR3, e em que todos os outros grupos G são N, também podem ser preparados procedendo tal como no seguinte Esquema de Reação 4:
Esquema de Reação 4
Figure img0010
em que R3 e R4 são tais como definidos para a fórmula I no Sumário da Invenção. Compostos de fórmula 10 podem ser preparados de acordo com procedimentos descritos em J. Med. Chem, 1972, 456, e J. Med. Chem., 1992, 4180. Um composto de ortoéster de fórmula 21 é reagido com um composto de fórmula 22, opcionalmente na presença de um ácido tal como ácido acético, a uma temperatura de aproximadamente a temperatura ambiente a aproximadamente 150 °C, para aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas. Um composto de fórmula 22 pode por sua vez ser preparado reagindo um composto de fórmula 23 com um composto de amina primária de fórmula 24, opcionalmente na presença de um ácido tal como pTSA, ou uma base como trietilamina ou DBU, a uma temperatura de cerca de 50 a aproximadamente 200 °C.
Compostos de fórmula IV podem ser preparados conforme deta lhado no seguinte Esquema de Reação 5:
Figure img0011
em que Gi, G2, G3, G4, Ri e R2 são tais como definidos para a fórmula I no Sumário da Invenção e L de fórmula I é definido no esquema de reação como -NH-Lr que é equivalente a, por exemplo, -NR5a(CH2)o-3- onde R5a é hidrogênio e -(CH2)O-3- é L|. R20 e R21 são independentemente selecionados de hidrogênio e Ci^alquila. Um composto de fórmula IV em que R2I é hidrogênio, pode ser preparado de um composto de fórmula III através de trata-mento com um agente redução adequado tal como hidreto de alumínio de lítio ou hidreto de alumínio de di-isobutila, em um solvente adequado tal como THF ou tolueno, a uma temperatura de cerca de -78 °C a aproximadamente 50 °C. A reação leva aproximadamente 0,5 a aproximadamente 16 horas para concluir. Um composto de fórmula IV em que R2Ié alquila inferior, pode ser preparado por tratamento de um composto de fórmula III com um alquil lítio ou reagente de Grignard, em um solvente adequado tal como éter ou tetra-hidrofurano, a uma temperatura de cerca de -78 °C para aproximadamente 50 °C. A reação leva aproximadamente 0,5 a aproximadamente 16 horas para concluir.
Exemplos detalhados da síntese de um composto de fórmula I 10 podem ser encontrados nos exemplos, infra.
Processos Adicionais para Preparação de Compostos da Invenção
Um composto da invenção pode ser preparado como um sal de adição ácido farmaceutícamente aceitável reagindo a forma de base livre do composto com um ácido inorgânico ou orgânico farmaceutícamente aceitá- vel. Alternativamente, um sal de adição de base farmaceutícamente aceitável de um composto da invenção pode ser preparado reagindo a forma de ácido livre do composto com uma base inorgânica ou orgânica farmaceuti- camente aceitável. Alternativamente, as formas de sais dos compostos da invenção podem ser preparadas empregando sais dos materiais de partida 20 ou intermediários.
Por exemplo, formas de sais de 4-(2-(2-(benzo[b1tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (exemplo 1, infra) foram sintetizadas como segue: sal de mesilato: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9~ isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60 g; 1,40 mmols) é dissolvida em 12 ml de acetona a 50 °C. Ácido metanossulfônico (0,137 g; 1,40 mmols) é adicionado gota a gota. A cristalização ocorre rapidamente. A suspensão branca é deixada resfriar durante aproximadamente 30 minutos com resfriamento para temperatura ambiente. A suspensão é agitada durante 18 horas _ 30 a temperatura ambiente e filtrada. O sólido é lavado com acetona (6 ml) em três porções e seco primeiro durante aproximadamente 3 horas a 50°C / a- proximadamente 1 KPa (10 mbar) e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C Iaproximadamente 1 KPa (10 mbar). O material tem um ponto de fusão a aproximadamente 233°C com um entalpia de fusão de 98 g/J. O material produzido exibe uma perda em secagem de 0,2%. A captação de água foi calculada através de termogravimetria após a exposição à 5 umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Uma captação de água de 0,4% foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de mesilato do composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de mesilato do composto do exemplo 1 que compreende os picos de 10 difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,4, 6,7, 18,3, 18,6, 26,9; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,4, 6,7, 10,3, 12,9, 16,4, 18,3, 25,8, 26,5, 26,9.
Ainda em uma outra modalidade, a invenção fornece o sal de 15 mesilato do composto do exemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado na figura 3 aqui.
Sal de tosilato: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60g; 1,40 mmols) é dissolvida em 12 ml a 50°C. Uma solução de mono-hidrato de ácido para-toluenossulfônico 20 (0,271 g; 1,40 mmols) em acetona (1,2 ml) é adicionado gota a gota. A solu ção é semeada a 50°C e cristalização ocorre rapidamente. A suspensão é deixada resfriar durante aproximadamente 30 minutos para a temperatura e agitada durante aproximadamente 18 horas. Após filtragem o sólido é lavado com acetona (6 ml) em três porções e seco primeiro durante aproxima- 25 damente 3 horas a 50°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar) e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar). O material tem um ponto de fusão a aproximadamente 233°C com uma entalpia de fusão de 88 g/J. O material produzido exibe uma perda em secagem de 0,2%. A captação de água foi calculada por Termogravimetria - 30 depois de exposição à umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Uma captação de água de 0,4% foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de tosilato do composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de tosilato do composto do exemplo 1 que compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °):6,2, 13,3, 16,7, 19,5, 25,4; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração 5 de pó de raios X seguintes: 6,2, 7,6, 12,4, 13,3, 15,1, 16,7, 17,7, 19,5, 20,2, 24,6, 24,9, 25,4, 25,6.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de tosilato do composto do exemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado na figura 4 aqui.
Sal de sulfato: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60 g; 1,40 mmols) é dissolvida em 10 ml de acetona e 1 ml água a aproximadamente 55°C. Uma solução de ácido sulfúrico (0,280 g; 2,79 mmols) em 1 ml água é adicionada gota a gota. A cristalização ocorre rapidamente. A suspensão é deixada resfriar durante 15 aproximadamente 30 minutos com resfriamento para temperatura ambiente, agitada durante aproximadamente 18 horas e filtrada. O massa filtrada é lavada com 6 ml de acetona em três porções e seca primeiro durante aproximadamente 3 horas a 50°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar) e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C / aproximadamente 1 KPa 10 mbar). O material tem um ponto de fusão a aproximadamente 224°C com um entalpia de fusão de 91 g/J. O material produzido exibe uma perda em secagem abaixo de 0,05%. A captação de água foi calculada por Ter- mogravimetria depois de exposição à umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Uma captação de água de 0,2% foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de sulfato do composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de sulfato do composto do Exemplo 1 que compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,5, 6,8, 10,7, 13,5, 26,4, 27,6; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração -30 de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,5, 6,8, 10,7, 13,1, 13,5, 18,6, 18,8, 20,8, 26,4, 27,1, 27,6.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de sulfato do composto do exemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado na figura 6 aqui.
Sal de esilato: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60 g; 1,40 mmols) é dissolvida em 5 12 ml de acetona a 50°C. Ácido etanossulfônico (0,155 g; 1,40 mmols) é adicionado gota a gota. A cristalização ocorre rapidamente. A suspensão branca resultante é deixada resfriar durante aproximadamente 30 minutos para temperatura ambiente. A suspensão é agitada durante aproximadamente 18 horas a temperatura ambiente e filtrada. O sólido é lavado com 6 10 ml de acetona em três porções e seco primeiro durante aproximadamente 3 horas a 50°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar) e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar). O material tem um ponto de fusão a aproximadamente 231 °C com uma ental- pia de fusão de 76 g/J. O material produzido exibe uma perda em secagem 15 de 0,6%. A captação de água foi calculada por Termogravimetria depois de exposição à umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Uma captação de água de 0,05% foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de esilato do composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece 20 o sal de esilato do composto do exemplo 1 que compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,3, 9,9, 18,4, 25,3, 26,1; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,3, 9,9, 17,1, 17,9, 18,4, 19,0, 22,0, 25,3, 26,1, 27,1.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de esilato do composto do exemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado na figura 8 aqui.
Sal de hidrobrometo: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60 g; 1,40 mmols) é dissolvido em 6 - 30 ml DMF a 65°C. Ácido hidrobrômico a 48% (0,235 g; 1,40 mmols) é adicionado gota a gota. A solução é deixada resfriar durante aproximadamente 30 minutos para temperatura ambiente. Sementes são adicionadas a 55°C e cristalização ocorre lentamente. A suspensão é agitada durante aproximadamente 18 horas a temperatura ambiente e filtrada. O sólido é lavado com 4 ml de DMF / água 1:1 e 6 ml de água. O sal é seco primeiro durante aproximadamente 3 horas a 50°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar) e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar). O material tem um ponto de fusão a aproximadamente 285°C com uma entalpia de fusão de 119 g/J. O material produzido exibe uma perda em secagem de 1,0%. A captação de água foi calculada por Termogravimetria depois de exposição à umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Nenhuma captação de água foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de hidrobrome- to do composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de hidrobrometo do composto do exemplo 1 que compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 7,0, 25,9, 26,8, 27,9; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 7,0, 11,4, 13,3, 21,4, 23,4, 25,9, 26,4, 26,8, 27,9.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de hidrobrometo do composto do exemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado na figura 9 aqui.
Sal de orotato: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60 g; 1,40 mmols) e ácido orótico (0,222 g; 1,40 mmols) é dissolvida em 7,8 ml de NMP (1-metil-2-pirrolidona) a 85°C. A solução é resfriada a 60°C e 6 ml de água são adicionados gota a gota durante aproximadamente 5 minutos. A suspensão branca resultante é deixada resfriar durante aproximadamente 30 minutos para temperatura ambiente e agitada durante 18 horas. Após filtragem a massa filtrada é lavada com 4 ml de NMP / água 1:1 em duas porções e 6 ml de água em três porções. O sólido é seco primeiro durante aproximadamente 3 horas a 50°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar) e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar). O material tem um ponto de fusão a aproximadamente 240°C com um entalpia de fusão de 130 g/J. O material produzido exibe uma perda em secagem abaixo de 0,05%. A captação de água foi calculada por Termogravimetria depois de exposição à umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Uma captação de água de 1,7% foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de orotato do composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de orotato do composto do dxemplo 1 que compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 7,1, 16,3, 19,2, 23,5, 25,6, 26,9; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de di- 10 fração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 7,1, 14,4, 16,3, 18,6, 19,2, 21,7, 23,0, 23,5, 25,6, 26,9, 28,7.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de orotato do composto do dxemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado na figura 10 aqui.
Sal de hemi-fumarato: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)- 9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60 g; 1,40 mmols) é dissolvida em 18 ml de metanol a 65°C. Ácido fumárico (0,164 g; 1,40 mmols) e 6 ml de metanol são adicionados. A solução é deixada resfriar durante aproximadamente 30 minutos para temperatura ambiente. Alguns cristais de semen- 20 tes são adicionados a 60°C e cristalização ocorre lentamente. A suspensão é agitada durante 18 horas a temperatura ambiente e filtrada. O sólido é lavado com 6 ml de metanol em três porções e seco primeiro durante aproximadamente 3 horas a 50°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar) e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar). O material tem um ponto de fusão a aproximadamente 232°C com uma entalpia de fusão de 83 g/J. O material produzido exibe uma perda em secagem abaixo de 0,05%. A captação de água foi calculada por Termogravimetria depois de exposição à umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Uma captação de água de 0,3% foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de hemi- fumarato do composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de hemi-fumarato do composto do exemplo 1 que compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 7,2, 8,7, 14,4, 15,8, 17,4, 19,0, 23,7; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 7,2, 8,7, 10,8, 14,4, 15,8, 17,4, 17,8, 19,0, 20,1, 23,7, 27,5.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de hemi-fumarato do composto do exemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado na figura 11 aqui.
Sal de besilato: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60 g; 1,40 mmols) é dissolvida em 10 12 ml de acetona a 50°C. Uma solução de ácido benzenossulfônico (0,225 g; 2,79 mmols) em 1,2 ml de acetona é adicionada gota a gota. Cristais de semente são adicionados a 48°C e a cristalização ocorre lentamente. A suspensão é deixada resfriar durante aproximadamente 30 minutos para temperatura ambiente. A suspensão é agitada durante aproximadamente 18 15 horas a temperatura ambiente e filtrada. O sal é lavado com 6 ml de aceto-na em três porções e seco primeiro durante aproximadamente 3 horas a 50°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar) e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar). O material tem um ponto de fusão a aproximadamente 219°C com um entalpia de fusão 20 de 92 g/J. O material produzido exibe uma perda em secagem de 0,3%. A captação de água foi calculada por Termogravimetria depois de exposição à umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Uma captação de água de cerca de 0,05% foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de besilato do 25 composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de besilato do composto do exemplo 1 que compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,2, 7,7, 17,7, 25,5; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,2, 7,7, 15,2, 16,7, 17,1, 17,7, 19,8, - 30 20,2, 24,9, 25,2, 25,5.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de besilato do composto do exemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado aqui na figura 7.
Sal de napadisilato: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60 g; 1,40 mmols) e 0,259 g de ácido 1,5-naftalenodissulfônico (0,70 mmols) são dissolvidos em 9 ml de DMF a 5 87°C. A solução clara é deixada resfriar durante aproximadamente 30 minu tos para temperatura ambiente. Sementes são adicionadas a 65°C e cristalização ocorre lentamente. A suspensão é agitada durante aproximadamente 18 horas a temperatura ambiente e filtrada. O sólido é lavado com 4 ml de DMF / água 1:1 em duas porções e 6 ml de água em três porções. O sal 10 é seco primeiro durante aproximadamente 3 horas a 50°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar)e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar). O material tem um ponto de fusão a aproximadamente 304°C com um entalpia de fusão de 83 g/J. Um fenômeno endotérmico amplo é observado a 107°C que isso poderia ser atribuído à 15 perda de água. O material produzido exibe uma perda em secagem de 6,1%. A captação de água foi calculada por Termogravimetria depois de exposição à umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Uma captação de água menor que 0,05% foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de napadisilato 20 do composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de napadisilato do composto do exemplo 1 que compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,4, 9,6, 13,1, 15,7, 16,1, 26,0; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 9,6, 13,1, 15,7, 25 16,1, 16,4, 20,4, 20,9, 23,7, 26,0, 26,9.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de napadisilato do composto do exemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado aqui na figura 12.
Sal de cloridrato: base livre de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- - 30 isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,60 g; 1,40 mmols) é dissolvida em 12 ml de acetona a 55°C. Ácido hidroclórico a 37% (0,138 g; 1,40 mmols) é adicionado gota a gota. A cristalização ocorre rapidamente. A suspensão branca é deixada resfriar durante aproximadamente 30 minutos para temperatura ambiente e agitada durante 18 horas. Após filtragem o sólido é lavado com 6 ml de acetona em três porções e seco primeiro durante aproximadamente 3 horas a 50°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar) e em seguida durante aproximadamente 16 horas a 80°C / aproximadamente 1 KPa (10 mbar). O material está exibindo um evento exotérmico a aproximadamente 162°C com uma entalpia de -13,8 J/g. Este fenômeno pode ser atribuído a uma transformação sólida em uma modificação mais estável. Um evento endotérmico é em seguida visto a aproximadamente 259°C com um entalpia de 99,7 J/g. O material produzido exibe uma perda em secagem de 0,6%. A captação de água foi calculada por Termogravimetria depois de exposição à umidade relativa (80%rh) durante 24 horas. Uma captação de água de 0,3% foi observada.
Em outra modalidade, a invenção fornece um sal de cloridrato do composto do exemplo 1. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de cloridrato do composto do exemplo 1 que compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,1, 7,0, 19,8, 26,1; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 6,1, 7,0, 18,1, 19,8, 24,7, 26,1, 27,0, 27,7.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o sal de cloridrato do composto do exemplo 1 que tem o padrão de difração de pó de raios X mostrado aqui na figura 5.
O ácido livre ou formas de base livre dos compostos da invenção podem ser preparados do sal de adição de base correspondente ou forma de sal de adição de ácido, respectivamente. Por exemplo, um composto da invenção em uma forma de sal de adição ácido pode ser convertido na base livre correspondente tratando com uma base adequada (por exemplo, solução de hidróxido de amónio, hidróxido de sódio, e similares). Um composto da invenção em uma forma de sal de adição de base pode ser convertido no ácido livre correspondente tratando com um ácido adequado (por exemplo, ácido hidroclórico, etc.). O sal de nitrato do composto de exemplo 1 pode ser feito empregando métodos conhecidos à pessoa qualificada. O padrão de difração de pó de raios X é descrito aqui na figura 2.
Compostos da invenção em forma não oxidada podem ser preparados de N-óxidos de compostos da invenção tratando com um agente de 5 redução (por exemplo, enxofre, dióxido de enxofre, fosfina de trifenila, boroi- dreto de lítio, boroidreto de sódio, tricloreto de fósforo, tribrometo, ou similar) em um solvente orgânico inerte adequado (por exemplo, acetonitrilo, etanol, dioxano aquoso, ou similar) a 0 a 80°C.
Derivados de profármaco dos compostos da invenção podem ser 10 preparados por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica (por exemplo, para detalhes adicionais vide Saulnier e outros, (1994), Bioorganic e Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, pág. 1985). Por exemplo, profármacos adequados podem ser preparados por reação de um composto não deri-vado da invenção com um agente de carbamilação adequado (por exemplo, 15 1,1-aciloxialquilcarbanocloridato, carbonato de para-nitrofenila, ou similar).
Derivados protegidos dos compostos da invenção podem ser feitos por meios conhecidos por aqueles versados na técnica. Uma descrição detalhada de técnicas aplicável à criação de grupos de proteção e sua remoção pode ser encontrada em T. W. Greene, “Protecting Groups in Organic 20 Chemistry”, 3a edição, John Wiley and Sons, Inc., 1999.
Compostos da presente invenção podem ser convenientemente preparados, ou formados durante o processo da invenção, como solvatos (por exemplo, hidrato). Hidrato de compostos da presente invenção podem ser preparados convenientemente através de recristalização de uma mistura 25 de solvente aquosa/orgânica, empregando solventes orgânicos como dioxi- na, tetra-hidrofurano ou metanol.
Compostos da invenção podem ser preparados como seus este- reoisômeros individuais reagindo uma mistura racêmica do composto com um agente de resolução opticamente ativo formar um par de compostos dia- 30 estereoisoméricos, separando os diastereômeros e recuperando os enanti- ômeros opticamente puro. Enquanto resolução de enantiômeros pode ser executada empregando derivados diastereoméricos covalentes dos compostos da invenção, complexos dissociável são preferidos (por exemplo, sal cristalino diastereomérico). Diastereômeros têm propriedades físicas distintas (por exemplo, pontos fusão, pontos de ebulição, solubilidades, reatividade, etc.) e podem ser rapidamente separados tirando proveito destas dessemelhanças. Os diastereômeros podem ser separados através de cromatografi- a, ou de preferência, por técnicas de separação/resolução com base sobre diferenças em solubilidade. O enantiômero opticamente puro é em seguida recuperado, junto com o agente de resolução, por qualquer meio prático que não resultaria em racemização. Uma descrição mais detalhada das técnicas aplicáveis à resolução de estereoisômeros de compostos a partir de sua mistura racêmica pode ser encontrada em Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, “Enantiomers, Racemates and Resolutions”, John Wiley and Sons, Inc., 1981. Compostos da invenção também podem ser preparados como seus estereoisômeros individuais empregando técnicas de cromatografia quiral, em particular, por uso de HPLC ou cromatografia de SFC empregando uma fase estacionária quiral.
Os espectros de difração de pó de raios X tais como incluídos aqui foram obtidos empregando o instrumento Bruker D8 Vario em geometria de transmissão, irradiação CuKa (30 kV, 40 mA), faixa de varredura 2° a 40° (valor de 2 teta), tempo de etapa 90,3 s. A calorimetria diferencial de varredura (DSC) do material amorfo do exemplo 1 foi executada empregando o instrumento Perkin Elmer DSC7 a uma taxa de aquecimento de 40°C/minuto.
Em resumo, os compostos de fórmula I podem ser preparados por um processo, que envolve: (a) aqueles dos esquemas de reação 1 a 5; e (b) opcionalmente conversão de um composto da invenção em um sal farmaceuticamente aceitável; (c) opcionalmente conversão de uma forma de sal de um composto da invenção para uma forma não salina; (d) opcionalmente conversão de uma forma não oxidada de um composto da invenção em um N-óxido farmaceuticamente aceitável; (e) opcionalmente conversão de uma forma de N-óxido de um composto da invenção para sua forma não oxidada; (f) opcionalmente resolução de um isômero individual de um composto da invenção a partir de uma mistura de isômeros; (g) opcionalmente conversão de um composto não derivado da invenção em um derivado de profármaco farmaceuticamente aceitável; e (h) opcionalmente conversão de um derivado de profármaco de um composto da invenção para sua forma não derivada.
Na medida em que a produção dos materiais de partida não é particularmente descrita, os compostos são conhecidos ou podem ser preparados analogamente aos métodos conhecidos na técnica ou como descritos nos exemplos daqui em diante.
Alguém versado na técnica observará que as transformações a- cima referidas são apenas representativas de métodos para a preparação dos compostos da presente invenção, e que outros métodos bem conhecidos podem similarmente ser empregados.
Exemplos
A presente invenção é também exemplificada, mas não limitada, pelos exemplos seguintes que ilustram a preparação de compostos de fórmula I (exemplos) de acordo com a invenção.
Exemplo 1
4-(2-(2-(benzorb]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol
Figure img0012
Síntese de 2,6-dicloro-9-isopropil-9H-purina (b): A 2,6-dicloro- 9H-purina (a) (6,0 mmol) dissolvido em DMF anidroso (5,0 mL) foi adicionado hidreto de sódio lentamente (7,8 mmol) com agitação a temperatura am- biente durante 2 horas. 2-lodopropano foi adicionado e a mistura foi agitada durante 16 horas. A mistura foi concentrada. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel, eluindo com hexano/EtOAc (20:1 a 3:1) para fornecer o composto título como um sólido branco. 1H 5 RMN (500 MHz, CDCh): δ 8,15 (s, 1H), 4,91 (m, 1H), 1,63 (d, 6H).
Síntese de 4-(2-(2-cloro-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil) fenol (c): 2,6-dicloro-9-isopropil-9H-purina (1,1 mmol) foi misturado com tri- amina (1,16 mmol) dissolvido em i-PrOH (6 ml) e a mistura foi agitada durante a noite. A mistura reacional foi concentrada, e o resíduo purificado atra- 10 vés de cromatografia de coluna em sílica-gel, eluindo com hexano/EtOAc (5:1 a 1:2) para fornecer o composto título como um sólido branco. 1H RMN (500 MHz, CDCh): δ 9,21 (br, 1H), 8,49 (s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,10 (d, 2H), 6,73 (d, 2H), 4,87 (m, 1H), 4,03 (t, 2H), 3,01 (t, 2H), 1,68 (d, 6H); HRMS (El) calculado para CiθHisCINsO (M + H+) 332,1273, encontrado 332,1278.
Síntese de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin- 6-ilamino)etil)fenol (d): Um frasco de schlenk seco à chama foi carregado com 4-(2-(2-cloro-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (0,62 mmol), ácido tianafteno-3-borônico (0,94 mmol), pd2(dba)3 (0,062 mmol), Cs2CO3 (1,25 mmol) e cloreto de 1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)imidazólio (0,125 mmol). O fras- co foi evacuado e carregado de novo com N2 e 1,4-dioxano anidroso (2 mL) foi adicionado. O frasco foi lacrado e a mistura reacional foi agitada a 80 °C durante 24 horas. A mistura reacional foi concentrada e purificada diretamente através de cromatografia de coluna em sílica-gel, eluindo com hexano/EtOAc (20:1 a 1:4) para fornecer o composto título como um sólido ama- 25 relado.
Alternativamente, a síntese do exemplo 1 pode ser executada como segue:
Síntese de 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-6-cloro-9-isopropil-9H- purina (b): Um frasco de fundo redondo foi carregado com 6-cloro-2-iodo-9- - 30 isopropil-9H-purina (preparado no exemplo 15c, 3,31 g, 0,0103 mol), ácido benzo[b]tiofen-3-ilborônico (2,74 g, 0,0154 mol), e tetracis(trifenil- fosfina)paládio(O) (1,19 g, 0,0103 mol). A esta mistura foi adicionado tolueno (80 ml), etanol (25 ml) e solução de carbonato de sódio aquosa (2M, 21 ml). O frasco foi lacrado e a mistura reacional foi agitada a 90 °C durante 1 hora. Água foi adicionada à mistura resfriada, que foi extraída com acetato de etila. As frações orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio, e 5 concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel, eluindo com 20 a 50% de EtOAc em hexano para produzir o composto título como um sólido que foi recristalizado de 1:1 de metanol / água. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ = 9,15 (d, 1H), 8,85 (s, 2H), 8,17 (d, 1H), 7,62 (t, 1H), 7,53 (t, 1H), 5,06 (m, 1H), 1,71 (d, 6H); MS m/z 329,0 (M + 10 1).
Síntese de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin- 6-ilamino)etil)fenol (c): 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-6-cloro-9-isopropil-9H-purina (2,2 g, 0,0067 mol) foi suspenso em 2-propanol anidroso (70 mL) em um tubo de pressão. Tiramina (1,01 g, 0,0074 mol) foi adicionada. O tubo foi la- 15 crado e aquecido a 85 °C durante 16 horas. Tiramina adicional (0,50 g, 0,0037 mol) foi adicionado e a mistura foi aquecida a 85 °C durante 48 horas. A reação foi concentrada. A solução de bicarbonato de sódio aquosa foi a- dicionada ao resíduo que foi extraído com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados, e concentrados. O 20 resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel, eluindo com 50 a 85% de EtOAc em hexano para produzir um sólido. O sólido foi triturado com metanol para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado.
Alternativamente, a síntese do exemplo 1 pode ser executada 25 como segue:
Síntese de 2,6-dicloro-9-isopropil-9H-purina (b): Para 2,6- dicloro-9H-purina (a) (998 g, 5,28 mol) dissolvido em DMF anidroso (5,0 L) foi adicionado hidreto de sódio (60% de dispersão, 254 g, 6,35 mols) com agitação a 10 °C durante 1 hora. 2-lodopropano (1595 g) foi adicionado e a _ 30 mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. Água (5,0 L) foi adicionado, e o sólido resultante precipitado foi coletado e lavado com água (500 ml) e heptano (2 x 2,5 L). O sólido bruto foi cristalizado de aceta- to de isopropila (2,1 L) para fornecer o composto título como um sólido.
Síntese de 4-(2-(2-cloro-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil) fenol (c): 2,6-dicloro-9-isopropil-9H-purina (500 g) foi adicionado em porções a uma mistura agitada de tiramina (593 g), trietilamina (262 g), e i-PrOH (5,0 5 L) a 50 °C. A mistura foi agitada àquela temperatura durante 4 horas, em seguida a mistura reacional foi concentrada. O resíduo foi absorvibo em a- cetato de isopropila (6,0 L) e foi lavado com solução de ácido cítrico a 20% (2,0 L) e água (2,0 L). A camada orgânica foi concentrada até a secura, em seguida foi absorvida em etanol (2,0 L) e novamente concentrada até a se- 10 cura. O sólido bruto foi cristalizado de etanol (3,2 L) para fornecer o composto título como um sólido.
Síntese de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-ísopropil-9H-purin- 6-ilamino)etil)fenol (d): Uma mistura de 4-(2-(2-cloro-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol (950 g), ácido tianafteno-3-borônico (561 g), dicloro- 15 bis(trifenilfosfina)paládio(ll) (10,1 g), carbonato de potássio (791 g), água (3,25 L), e DMA (3,25 L) foi agitada sob uma atmosfera de nitrogênio durante 10 minutos. A mistura agitada foi em seguida aquecida a 70 °C durante 14 horas. Acetato de etila (6,5 L) e água (3,25 L) foi adicionado, e a mistura foi filtrada através de Celita (125 g) a 50 °C, enxaguada com acetato de etila (1,0 L). As camadas foram separadas, e a camada aquosa foi extraída a 50 °C com acetato de etila adicional (7,5 L). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (3 x 2,5 L), em seguida destilada para remover aproximadamente 2,5 L de solvente. Tetra-hidrofurano (2,5 L) e tio sílica-gel de ligação de sílica (200 g) foram adicionados. A mistura foi agitada a 70 °C 25 durante 16 horas, em seguida foi filtrada, lavando a almofada com acetato de etila (1,0 L). Os filtrados combinados foram concentrados a pressão atmosférica para um volume de cerca de 5 L, em seguida a mistura foi deixada resfriar. O sólido resultante foi coletado e lavado com acetato de etila (2 x 1,0 L) para fornecer o composto título. - 30 O composto do exemplo 1 pode ser recristalizado empregando uma mistura de tolueno/etanol e pode lavado a temperatura ambiente com solução aquosa de NaHCO3.
Em outra modalidade, a invenção fornece um composto do e- xemplo 1 em modificação A de forma de cristal, em que modificação A compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 12,1, 16,9, 18,9, 21,3; e que em uma modalidade adicional compreende os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 12,1, 15,9, 16,9, 17,3, 18,9, 21,3, 22,1, 23,6, 24,4, 27,3.
Ainda em uma modalidade adicional, a invenção fornece o composto do exemplo 1 como modificação A de forma sólida compreendendo os picos de difração de pó de raios X seguintes (Ângulo 2-teta °): 9,0, 12,1, 13,0, 13,1, 13,6, 14,4, 14,7, 15,1, 15,9, 16,9, 17,3, 17,7, 18,0, 18,9, 19,0, 20,1, 21,3, 22,1, 22,3, 22,6, 22,8, 23,4, 23,6, 24,4, 25,3, 26,3, 26,5, 27,3, 27,8, 28,2, 29,5, 29,7, 30,4, 30,7, 31,0, 31,4, 32,2, 32,8, 33,3, 34,3, 35,5, 36,4, 37,5, 38,4, 39,0, 39,4.
O padrão de difração de pó de raios X do composto do exemplo 1, modificação A, é mostrado aqui na figura 1. O material amorfo do composto do exemplo 1 foi produziu in situem um cadinho de DSC (calorimetria diferencial de varredura) por aquecimento do composto até a fusão e anela- mento/resfriamento. No ciclo de resfriamento a transição vítrea pode ser observada mas no ciclo de reaquecimento é muito mais caracterizada em aproximadamente 70 - 75°C. O padrão de DSC é mostrado aqui na Figura 13.
Exemplo 15
4-(2-(Piridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol
Figure img0013
Síntese de 2-amino-6-cloro-9-isopropil-9H-purina (b): Hidreto de sódio (1,5 g de 60% de dispersão em óleo mineral, 38 mmols) foi adicionado em porções durante 10 minutos a uma suspensão agitada de 2-amino- 6-cloro-9H-purina (5,34 g, 31,5 mmols) em DMF anidroso (50 mL) a temperatura ambiente. Depois de 45 minutos, a mistura foi resfriada em um banho de gelo, em seguida foi adicionado 2-iodopropano. O banho de resfriamento foi removido e a mistura agitada foi deixada aquecer para temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi resfriada em gelo, em seguida água foi adicionada. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi tratado com acetato de etila quente. A mistura resfriada foi filtrada, e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel, eluindo com 0 a 50% de EtOAc em hexano para produzir o composto titulo como um sólido. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ 7,83(s, 1H), 5,17(s, 2H), 4,71- 4,66(m, 1H), 1,57(d, 6H). MS m/z 212,1 (M + 1).
Síntese de 6-Cloro-2-iodo-9-isopropil-9H-purina (c): 6-cloro-9- isopropil-9H-purin-2-amina (2,68 g, 12,7 mmol) foi dissolvido em THF (64 mL) a temperatura ambiente, lodo (1,61 g, 6,25 mmol), CH2I2 (10,6 mL) e Cul (1,27 g, 6,66 mmol) foram adicionados. A mistura foi agitada durante 5 minutos a temperatura ambiente. Nitrito de isopentila (5,33 mL) foi adicionado. A mistura reacional foi refluxada durante 45 minutos, e foi em seguida resfriada para temperatura ambiente. A solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada foi adicionada, e a mistura foi extraída com EtOAc três vezes. A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura, seca com MgSO4 e concentrada. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel, eluindo com 0 a 30% de acetato de etila em hexano para produzir o composto título como um sólido. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ 8,09(s, 1H), 4,95-4,88(m, 1H), 1,65 (d, 6H). MS m/z 323,0 (M + 1).
Síntese de 6-Cloro-2-(piridin-3-il)-9-isopropil-9H-purina (d): Um frasco de fundo redondo foi carregado com 6-cloro-2-iodo-9-isopropil- 9H-purina (1,2 g, 3,7 mmols), éster cíclico de 1,3-propanodiol de ácido piridi- na-3-borônico (0,91 g, 5,6 mmols), e tetracis(trifenilfosfina)paládio(0) (430 mg, 0,37 mmol). A esta mistura foi adicionado tolueno (60 ml), etanol (6 ml) e solução de carbonato de sódio aquosa (2M, 15 ml). O frasco foi lacrado e a mistura reacional foi agitada a 80 °C durante 4 horas. Água foi adicionada à mistura resfriada, que foi extraída com acetato de etila (50 ml x 3). As frações orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio, e concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel, eluindo com 30 a 70% de EtOAc em hexano para produzir o composto título como um sólido. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 9,60 (d, 1H), 8,90 - 8,87 (m, 1H), 8,68 (s, 1H), 8,67 (d, 1H), 7,63 - 7,60 (m, 1H), 5,12 - 5,05 (m, 1H), 1,74 (d, 6H). MS m/z 274,1 (M + 1).
Síntese de 4-(2-(piridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6~ ilamino)etil)fenol (e): 6-cloro-9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purina (300 mg, 1,1 mmol) foi suspenso em 2-propanol anidroso (40 mL) em um tubo de pressão. Tiramina (300 mg, 2,2 mmols) foi adicionado. O tubo foi lacrado e aquecido a 85 °C durante 16 horas. A reação foi concentrada e o resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel, eluindo com 0 a 70% EtOAc em hexano para produzir o composto título como um sólido.
Exemplo 123
4-(2-(9-lsopropil-2-(2-metil-1H-imidazol-1-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol
Figure img0014
Um tubo de reação de micro-onda foi carregado com 4-(2-(2- cloro-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (30 mg, 0,091 mmol), 2-metil- 1H-imidazol (59 mg, 0,73 mmol) e 0,5 ml de NMP. O tubo lacrado foi aquecido sob irradiação de micro-onda a 240 °C durante 2 horas. A mistura reacional foi purificada através de HPLC de fase reversa (coluna de C18, eluindo com ACN-H2O 0,05% TFA) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado.
Exemplo 128
4-(2-(2-(5-Cloropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol
Figure img0015
Síntese de 4-(2-(2-iodo-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil) fenol (b): Uma mistura de 6-cloro-2-iodo-9-isopropil-9H-purina (a) (1,0 g, 3,1 mmols), tiramina (0,64 g, 4,65 mmols), trietilamina (0,63 g, 6,2 mmols) e 2- propanol (30 mL) foi aquecida a 85 °C durante 2 horas. A mistura reacional 5 foi concentrada e solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada foi adicionada. A mistura foi extraída com acetato de etila (50 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas, e concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel (25 a 75% de acetato de etila em eluente de hexano) para for- 10 necer o composto título como um sólido. MS m/z 424,1 (M + 1).
Síntese de 4-(2-(2-(5-cloropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol (c): Seguindo o procedimento do exemplo 15d, 4-(2-(2- iodo-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (b) foi reagido com ácido 5- cloropiridin-3-ilborônico. O produto bruto foi purificado através de HPLC de 15 fase reversa (coluna de C18, eluindo com ACN-H2O 0,05% TFA) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado.
Exemplo 134
4-(2-(6-(5-Fluoropiridin-3-il)-1-isopropil-1H-pirazolo(314-dlpirimidin-4- ilamino)etil)fenol
Figure img0016
Síntese de 4-(2-(6-cloro-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4- d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol (b): Seguindo o procedimento do exemplo 128b, 4,6-dicloro-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina (US3399196) (a) (0,184 g, 0,795 mmol) foi reagido com tiramina. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (25 a 75% de acetato de etila em eluente de hexano) para fornecer o composto título como um sólido. MS m/z 332,1 (M + 1).
Síntese de 4-(2-(6-(5-fluoropiridin-3-il)-1-isopropil-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol (c): Seguindo o procedimento do exemplo 15d, 4-(2-(6-cloro-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4- ilamino)etil)fenol (b) foi reagido com ácido 5-fluoropiridin-3-ilborônico. O resíduo bruto foi purificado através de HPLC de fase reversa (coluna de C18, eluindo com ACN-H2O 0,05% TFA) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado.
Exemplo 141
4-(2-(2-(5-Fluoropiridin-3-il)-7-isopropil-7H-pirrolo[213-d1pirimidin-4- ilamino)etil)fenol
Figure img0017
Síntese de 2,4-dicloro-7-isopropil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (b): Seguindo o procedimento do exemplo 15b, 2,4-dicloro-7H-pirrolo[2,3- d]pirimidina (0,5 g, 2,67 mmols) foi reagido com 2-iodopropano. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (15 a 25% de acetato de etila em eluente de hexano) para fornecer o composto título como um sólido. MS m/z 230,2 (M + 1).
Síntese de 4-(2-(2-cloro-7-isopropil-7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol (c): Seguindo 0 procedimento do exemplo 128b, 2,4-dicloro-7-isopropil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (b) (0,278 g, 1,21 mmol) foi reagido com tiramina. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (25 a 75% de acetato de etila em eluente de he- xano) para fornecer o composto título como um sólido. MS m/z 331,1 (M + 1).
Síntese de 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-7-isopropil-7H- pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol (d): Seguindo o procedimento do Exemplo 15d, 4-(2-(2-cloro-7-isopropil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4- ilamino)etil)fenol (20 mg, 0,06 mmol) foi reagido com ácido 5-fluoropiridin-3- ilborônico. O resíduo bruto foi purificado através de HPLC de fase reversa (coluna de C18, eluindo com ACN-H2O 0,05% TFA) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado.
Exemplo 153
(R)-4-(2-(2-(benzofbltiofen-3-il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol
Figure img0018
Síntese de (R)-2,6-dicloro-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purina (b): Uma solução de 5,7-2,6-dicloro-9H-purina (400 mg, 2,12mmols), (S)- tetra-hidrofuran-3-ol (88 mg, 2,5 mmols) e trifenilfosfina (1,0 g, 3,8 mmols) em THF anidroso (30 mL) foi tratada a -78°C com azodicarboxilato de diiso- propila (856 mg, 4,23 mmols). A reação foi deixada aquecer a temperatura ambiente e foi agitada durante 16 horas. A solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada foi adicionada e a mistura foi extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio, e concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia em sílica- gel (10 a 80% de acetato de etila em eluente de hexano) para produzir um sólido branco que consisti no composto título contaminado com trifenilfosfó- xido. MS m/z 258,0 (M + 1).
Síntese de (R)-4-(2-(2-cloro-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purin- 6-ilamino)etil)fenol (c): Seguindo o procedimento do exemplo 128b, (R)- 2,6-dicloro-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purina (b) foi reagido com tiramina. A mistura reacional bruta foi purificada através de HPLC preparativa de fase reversa. MS m/z 360,1 (M + 1).
Síntese de (R)-4-(2-(2~(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(tetra- hidrofuran-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol: Seguindo o procedimento do exemplo 15d, (R)-4-(2-(2-cloro-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol (c) foi reagido com ácido de benzo[b]tiofen-3-ilborônico (22,3 mg, 0,125 mmol). O resíduo bruto foi purificado através de HPLC preparativa de fase reversa para produzir o composto título como um sólido esbranquiçado.
Exemplo 157
2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9-il)propan-1- ol
Figure img0019
Síntese de 2-(2,6-dicloro-9H-purin-9-il)propanoato de metila (b): Uma mistura de 2,6-dicloro-9H-purina (5,0 g, 26,5 mmols), 2- bromopropanoato de metila (5,3 g, 31,7 mmols) e carbonato de potássio (11,0 g, 79,4 mmols) em DMF anidroso (100 mL) foram aquecidos a 100 °C durante 15 horas. Solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada foi adicionada e reação foi extraída com acetato de etila (150 ml X 3). As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com salmoura, secas sobre sulfato de sódio, e concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (10 a 80% de acetato de etila em eluente de hexano) para fornecer o composto título como um sólido branco. MS m/z 275,0 (M + 1).
Síntese de 2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)~2-cloro-9H-purin- 9-il)propanoato de metila (c): Uma mistura de 2-(2,6-dicloro-9H-purin-9- il)propanoato de metila (b) (600 mg, 2,2 mmols), triptamina (420 mg, 2,6 mmols) e 2-propanol (30 mL) foi aquecida a 85 °C em um tubo lacrado durante 16 horas. A mistura reacional foi resfriada para temperatura ambiente e concentrada. O resíduo foi purificado através de cromatografia em sílica- gel (10 a 80% de acetato de etila em eluente de hexano) para fornecer o composto título como um sólido branco. MS m/z 360,1 (M + 1).
Síntese de 2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin- 3-il)-9H-purin-9-il)propanoato de metila (d): Um tubo de pressão de 150 ml foi carregado com 2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-cloro-9H-purin-9- il)propanoato de metila (c) (300 mg, 0,75 mmol), ácido 5-fluoropiridin-3- ilborônico (159 mg, 1,1 mmol), tetracis(trifenilfosfina)-paládio(0) (87 mg, 0,075 mmol), K3PO4 (638 mg, 3,0 mmols), e dioxano anidroso (15 mL). O tubo de pressão foi pulverizado com nitrogênio e foi lacrado, em seguida a mistura reacional foi aquecida a 130°C durante 6 horas com agitação. Água foi adicionada à mistura resfriada, e a mistura foi extraída com acetato de etila (50 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas sobre sulfato de sódio, e concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (10 a 80% de acetato de etila em eluente de hexano) para fornecer o composto título contaminado com uma quantidade pequena de óxido de trifenilfosfina. MS m/z 460,1 (M + 1).
Síntese de 2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin- 3-il)-9H-purin-9-il)propan-1-ol: Hidreto de alumínio de lítio (230 mg, 6,1 mmols) foi adicionado em porções a uma solução a 0 °C de 2-(6-(2-(1H- indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9-il)propanoato de metila (282 mg, 0,61 mmol) em THF anidroso (15 mL). A mistura reacional agitada foi deixada aquecer a temperatura ambiente durante 2 horas, em seguida água foi adicionada cuidadosamente. A mistura foi extraída com EtOAc (50 ml x 3). As frações orgânicas foram combinadas, lavadas com salmoura, secas sobre sulfato de sódio, e concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica-gel (0 a 5% de solvente B em diclorometano; solvente B = amónia a 2M em metanol) para produzir o produto título parcialmente purificado. Este também foi purificado através de TLC preparativa (5% de solvente B em diclorometano) para fornecer o composto título como um sólido branco.
Exemplos 157R& 157S
(R)-2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9- il)propan-1-ol & (S)-2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino1-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9- il)propan-1-ol
Figure img0020
(R/S)-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)- 9H-purin-9-il)propan-1-ol foi separado nos enantiômeros individuais empregando HPLC preparativa quiral em um coluna 21 x 250 mm Lux- Cellulose-2 (Fenomenex) quiral. Uma solução de 3 mg/ml do racemato em metanol foi preparada e carregada sobre a coluna com 0,5 ml de solução por injeção. A coluna foi eluída com 85/7,5/7,5 de hexa- no/etanol/metanol a uma taxa de fluxo de 20 mL/minuto durante 25 minu- tos. 1 e 2 picos foram eluídos em 20 minutos e 22,5 minutos, respectivamente. Cromatografia analítica foi executado em uma coluna 4,6 x 100 mm Lux_Cellulose-2 (Fenomenex) quiral, eluindo com 90/5/5 de hexa- no/etanol/metanol em 1 mL/minuto durante 20 min. 1 e 2 picos foram eluídos em 17,45 e 18,14 minutos, respectivamente.
Exemplo 157R
(R)-2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9- il)propan-1-ol
Figure img0021
Síntese de (R)-N-(2-(1 H-indol-3-iI)etii)-9-( 1 -(benzilóxi)propan- 2-il)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-6-amina (b): Seguindo, em sequência, os procedimentos do exemplo 153b (usando 2,6-dicloro-9H-purina e (S)-1- (benzilóxi)propan-2-ol como reagentes), exemplo 153c (usando triptamina 5 como reagente), e exemplo 153d (usando ácido 5-fluoropiridin-3-ilborônico como reagente), o composto título foi obtido.
Síntese de (R)-2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-(5- fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9-il)propan-1-ol (c): Uma solução de (R)-N-(2- (1H-indol-3-il)etil)-9-(1-(benzilóxi)propan-2-il)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin- 10 6-amina (b) (0,15 g, 0,29 mmol) em DCM (10 ml) foi tratada com BCI3 (1M, 2,9 ml, 2,9 mmol) em DCM (10 ml) a -78°C durante 2 horas, solução de hidróxido de sódio aquosa a 1N foi adicionada, e a mistura foi extraída com DCM. Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados, e concentrados e o resíduo foi purificado através de cromato- 15 grafia de coluna em sílica-gel (5% de MeOH em eluente de DCM) para fornecer o composto título. MS m/z 432,2 (M + 1).
Exemplo 157S
(S)-2-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H-purin-9- il)propan-1-ol
Figure img0022
Seguindo o procedimento do Exemplo 157R, mas empregando (R)-1-(benzilóxi)propan-2-ol em lugar de (S)-1-(benzilóxi)propan-2-ol, o composto título foi preparado. MS m/z 432,2 (M + 1).
Exemplo 161
5 4-(2-(6-(5-Fluoropiridin-3-il)-1-isopropil-1H-imidazof4,5-clpiridin-4- ilamino)etil)fenol
Figure img0023
Síntese de 4,6-dicioro-1-isopropil-1H-imidazo[4,5-c]piridina (b): Seguindo o procedimento do Exemplo 15b, 4,6-dicloro-1H-imidazo[4,5- c]piridina (J. Het. Chem. 1965, 196-201) (0,19 g, 1,0 mmol) foi reagido com 10 2-iodopropano. O resíduo foi purificado através de cromatografia em sílica- gel (25 a 35% de acetato de etila em eluente de hexano) para fornecer o composto título como um sólido. MS m/z 230,2 (M + 1).
Síntese de 4-(2-(6-cloro-1-isopropil-1H-imidazo[4,5-c]piridin- 4-ilamino)etil)fenol (c): Uma mistura de 4,6-dicloro-1-isopropil-1H- 15 imidazo[4,5-c]piridina (b) (40 mg, 0,17 mmol), tiramina (120 mg, 0,86 mmol), e 2-butanol (2 mL) foi aquecida sob irradiação de micro-onda a 140°C durante 8 horas. A mistura foi concentrada e o resíduo foi purificado através de HPLC de fase reversa (coluna de C18, eluindo com ACN-H2O 0,05% TFA) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado. MS m/z 331,1 (M + 1).
Síntese de 4-(2-(6-(5-fluoropiridin-3-il)~1-isopropil-1H- imidazo[4,5-c]piridin-4-ilamino)etil)fenol (d): Um frasco de reação de micro-ondas de 5 foi carregado com 4-(2-(6-cloro-1-isopropil-1H-imidazo[4,5- c]piridin-4-ilamino)etil)fenol (c): (17 mg, 0,051 mmol), ácido 5-fluoropiridin-3- ilborônico (72 mg, 0,51 mmol), e fetracis(trifenilfosfina)paládio(0) (36 mg, 0,031 mmol). A esta mistura foi adicionado tolueno (1 ml), etanol (0,5 ml) e solução de carbonato de sódio aquosa (2M, 0,5 ml). O frasco foi lacrado e a mistura reacional foi agitada a 140 °C sob irradiação de micro-onda durante 2 horas. Água foi adicionada à mistura resfriada que foi extraída com acetato de etila (5 ml x 3). As frações orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio, e concentradas. O resíduo foi purificado através de HPLC de fase reversa (coluna de C18, eluindo com ACN-H2O 0,05% TFA) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado.
Exemplo 177
4-(2-(5-(5-Fluoropiridin-3-il)-3-isopropil-3H-imidazoí4,5-blpiridin-7- ilamino)etil)fenol
Figure img0024
Síntese de 5,7-dicloro-3-isopropil-3H-imidazo[4,5-b]piridína (b): Seguindo o procedimento do Exemplo 15b, 5,7-dicloro-3H-imidazo[4,5- b]piridina (J. Med. Chem., 2007, 50, 828-834) (0,118 g, 0,624 mmol) foi reagido com 2-iodopropano. A mistura de produto bruta foi purificada através de cromatografia em sílica-gel (25 a 35% de acetato de etila em eluente de hexano) para produzir uma mistura do composto título (principal) e um produto isomérico como um sólido. MS m/z 230,2 (M + 1).
Síntese de 4-(2-(5-cloro-3-isopropil-3H-imidazo[4,5-b]piridin- 7-ilamino)etil)fenol (c): A mistura de produto contendo 5,7-dicloro-3- isopropil-3H-imidazo[4,5-b]piridina (b) (40 mg, 0,17 mmol), tiramina (120 mg, 0,87 mmol), e 2-propanol (2 mL) foi aquecida em um frasco lacrado a 140 °C durante 72 horas. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado através de TLC preparativa (1:2 de eluente de hexanos/ acetato de etila) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado. MS m/z 331,1 (M 5 +1).
Síntese de 4-(2-(5-(5-fluoropiridin-3-il)-3-isopropil-3H- ímidazo[4,5-b]piridin-7-ilamino)etil)fenol (d): Seguindo o procedimento do Exemplo 161 d, 4-(2-(5-cloro-3-isopropil-3H-imidazo[4,5-b]piridin-7- ilamino)etil)fenol (c) (15 mg, 0,047 mmol) foi reagido com ácido 5- 10 fluoropiridin-3-ilborônico. O resíduo bruto foi purificado através de TLC preparativa (1:1 de eluente de hexanos/ acetato de etila) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado.
Repetindo os procedimentos descritos nos exemplos anteriores, empregando materiais de partida adequados, os seguintes compostos de 15 fórmula I, tais como identificados na tabela 1, são obtidos.
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Compostos de sondagem de afinidade relacionados aos compostos da invenção também podem ser preparados, tal como descrito nos exemplos seguintes.
Exemplo 210
6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxo-hexa-hidro-1H-tienoí3,4-dlimidazol-4- il)pentanamido)hexanoato de 3-(2-(2-(benzo[bltiofen-3-il)-9-isopropil-9H- purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ila
Figure img0061
Síntese de 6-aminoexanoato de 3-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)- 9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ila (e): A uma solução de 6-(terc-butoxicarbonilamino)hexanoato de 3-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ila (a) (80 mg, 0,117 mmol) em DCM (20 ml) foi adicionado TFA (5 ml). A reação foi agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. Ela foi concentrada. Solução de carbonato de sódio aquosa foi adicionada e a mistura foi extraída com DCM. As frações orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio, e concentradas para produzir o produto como um óleo. MS m/z 582,2 (M + 1).
Síntese de 6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxo-hexa-hidro-1H-tieno[3,4- d]imidazol-4-il)pentanamido)hexanoato de 3-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ila: A uma solução de (+)- biotina (35 mg, 0,14 mmol) e Et3N (36 mg, 0,35 mmol) em DMF (1 ml) foi adicionado HATU (90 mg, 0,24 mmol). A mistura foi agitada durante 10 minutos, e em seguida foi adicionada a uma solução de 6-aminoexanoato de (3-(2-(2- (benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ila (b) (68 mg, 0,12 mmol) em DMF (1 ml). A mistura reacional foi agitada durante 16 horas a temperatura ambiente e em seguida foi concentrada. O resíduo foi purificado através de HPLC de fase reversa (coluna de C18, eluindo com MeOH-H2O 0,05% TFA) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado. O exemplo 210 apresenta um valor de ECsono ensaio de %CD34+ de 2,1 pM.
Exemplo 211
6-(terc-butoxicarbonilamino)hexanoato de 3-(2-(2-(benzo[bltiofen-3-il)-9- ísopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ila
Figure img0062
Síntese de 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-6-cloro-9-isopropil-9H- purina (b): Seguindo o procedimento do exemplo 15d, 6-cloro-2-iodo-9- isopropil-9H-purina (3,31 g, 0,0103 mol) foi reagido com ácido ben- zo[b]tiofen-3-ilborônico. O produto bruto foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (20 a 50% de acetato de etila em hexano) para fornecer o composto título como um sólido. MS m/z 329,0 (M + 1). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ = 9,15 (d, 1H), 8,85 (s, 2H), 8,17 (d, 1H), 7,62 (t, 1H), 7,53 (t, 1H), 5,06 (m, 1H), 1,71 (d, 6H).
Síntese de 3-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin- 6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ol (c): Seguindo o procedimento do exemplo 15e, 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-6-cloro-9-isopropil-9H-purina (b) (80 mg, 0,243 mmol) foi reagido com serotonina. A mistura reacional foi concentrada, em seguida solução de bicarbonato de sódio aquosa foi adicionada. A mistura foi extraída com acetato de etila. As frações orgânicas foram combinadas, secas so- bre sulfato de sódio, e concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (0 a 5% de MeOH em eluente de DCM) para fornecer o composto título como um sólido esbranquiçado. MS m/z 469,2 (M + 1).
Síntese de 6-(terc-butoxicarbonilamino)hexanoato de 3-(2-(2- 5 (benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)-1H-indol-5-ila (d): A uma solução de 3-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)-1H-indol-5-ol (55,5 mg, 0,119 mmol) e ácido 6-(terc- butoxicarbonilamino)hexanoico (30 mg, 0,113 mmol) em DMF (3 ml) foi adicionado Et3N (24 mg, 0,237 mmol) e HATU (90 mg, 0,237 mmol). A mistura 10 foi agitada a temperatura ambiente durante 16 horas, e em seguida foi concentrada. Água foi adicionada e a mistura reacional foi extraída com acetato de etila. As frações orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio, e concentradas. O resíduo foi purificado através de cromatografia em sílica-gel (0 a 5% de MeOH em eluente de DCM) para fornecer o composto 15 título como um sólido esbranquiçado.
Repetindo-se os procedimentos descritos nos exemplos anteriores, empregando-se materiais de partida adequados, as seguintes sondas de afinidade, tais como identificadas na tabela 2, são obtidas:
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Os ensaios seguintes são empregados para avaliar a atividade dos compostos da invenção para facilitar a expansão de células-tronco hematopoéticas (HSC).
Células-tronco hematopoéticas (HSCs) humanas de CD34+ a- dultas primárias são cultivadas e analisadas para identificar compostos da invenção que facilitam a expansão de HSC. As células são analisadas quanto a presença do fenótipo desejado (expressão de CD34). Os compostos da invenção promovem a expansão de HSC de uma maneira dependente da dose.
Meio de cultura: o meio StemSpan SFEM é um meio sem soro (StemCell Technologies, Vancouver, BC) suplementado com as seguintes citocinas recombinantes humanas: trombopoetina, interleucina-6, ligante de Flt-3, e fator de célula-tronco (todas de R&D Systems, Mineápolis, MN), cada qual a uma concentração final de 50 ng/mL, com veículo (DMSO) ou um composto da invenção.
Cultura de Células Humanas: Sangue periférico mobilizado de G-CSF leucoforesado humano fresco de doadores normais, células de CD34+ de medula óssea adulta e células de CD34+ de sangue de cordão humano criopreservadas são adquiridas de AllCells (Berkeley, CA). Células de CD34+ humanas são enriquecidas de sangue periférico mobilizado de G- CSF leucoforesado empregando classificação magnética de células (MACS, Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e criopreservadas. A pureza das células de CD34+, checada por Citometria de fluxo, é maior que 90%. Depois do descongelamento, a viabilidade celular testada por exclusão de azul tripano é maior que 70%. As células descongeladas são centrifugadas e ressuspensa com veículo StemSpan antes de serem aliquotadas para cultura imediata. As células são semeadas a 104 células/mL em uma placa de 384 poços (Greiner Bio-One, Monroe, Carolina do Norte) com 50 pL de meio por poço durante 7 dias. A cada 7 dias, as células são transferidas para placas de poços maiores e meio fresco é adicionado para manter a densidade celular entre 104 e 5 x 105 células/mL. As células foram cultivadas a 37°C em CO2 a 5%. Para transplante, as células foram cultivadas em frascos de 75 cm2 antes que as células fossem transplantadas em camundongos. A uma concentração de 1 micromolar, 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1), 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-sec-butil- 9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (composto 2, tabela 1), e N-(2-(1H-indol-3-il)etil)- 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina (composto 9, tabela 1) cada qual dá origem a um aumento maior 10 vezes no número de células CD34+CD45RA- derivadas de 1000 MPB CD34+ HSCs depois de 21 dias comparado ao veículo. Os compostos da invenção foram analisados em um formato de resposta à dose (1 nM a 10 pM) para determinar a concentração 5 eficaz que produziu o efeito desejado em 50% das células (EC50). Os compostos da invenção aumentaram o númerp total e/ou porcentagem de células de CD34+ com um EC50 de menos de 10 pM. Os resultados são mostrados na Tabela 1 e exemplos, supra.
Unidades de Formação de Colônia em Ensaio de Cultura (CFU- 10 C): Células mononucleares a 1000 por mL para cultura de 5 semana de san gue de cordão e 3 semana de mPB e 100 células por mL para cultura de 3 semana de CB e 1 semana de MPB foram adicionadas a MethoCult SF H4436, meio de metilcelulose sem soro que contém metilcelulose em Isco- ve’s MDM, albumina de soro bovino, 2-mercaptoetanol, L-glutamina, insulina 15 humana recombinante, de transferência humana (saturada com ferro), e citocinas humanas recombinantes: fator de células-tronco, GM-CSF, IL-3, IL-6, G-CSF, e eritropoetina (StemCell Technologies). O MetoCult é suplementado com as seguintes citocinas recombinantes humanas: trombopoetina, e ligante de Flt-3 (R&D Systems), cada qual a uma concentração final de 50 20 ng/mL. Após agitação, a mistura é dividida em três placas de 35 mm. As placas são incubadas durante 14 dias a 37°C em uma atmosfera umedecida de CO2 a 5% em ar. Ao término do período de incubação, as colônias mie- loides e eritroides são contadas em um microscópio invertido em ampliação de 40X. O conteúdo de CFU-C da cultura de expansão é calculado como 25 segue: número de colônias marcadas por três placas x número de células mononucleares totais / número de células de entrada. Até uma semana, as células mononucleares totais são determinadas por multiplicação do número de células por mililitro pelo volume de cultura. Após a semana 1 em diante, o número de inoculações também é levado em conta. As culturas tratadas com 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1) a uma concentração de 1 micromolar, geraram um aumento maior que 10 vezes no número de células formadoras de colônias depois de 21 dias de cultura de células de mPB CD34+ comparadas ao veículo. Empregando-se 1 x 103 células de CD34+ de CB tratadas com 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1) a uma concentração de 1 micromolar extraídas da cultura de 5 semanas apresentaram um aumento de >10 vezes em unidades formadoras de colônia comparadas ao controle. As células tratadas com um 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1) geraram colônias mais mistas associadas com um aumento de >10 vezes em colônias de eritrócito, um aumento de >10 vezes em colônias de granulócitos/ macrófagos, e um aumento de >10 vezes em colônias de macrófagos. As células tratadas com 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3- il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1) também dão origem a colônias mistas de granulócitos/ eritrócitos/ monócitos/ macrófagos que não são observadas em colônias derivadas de culturas não tratadas.
Ensaios de células de formação de área de remendagem (CAFC): As células estromais de FBMD-1 são mantidas em frascos de 25 cm2 e são tripsinadas após confluência de 1/3. Uma vez que está linhagem é não transformada, e por conseguinte perde gradualmente seu potencial para sustentar crescimento de CAFC em fases finais, todos os alimentado- res são empregados a seguir da inoculação 20. Para a sustentação do crescimento de CAFC em placas de 96 poços, 1 x 103 células estromais são semeadas por poços. As culturas são mantidas em meio de Iscove suplementado com soro de bezerro fetal a 10% (FCS), soro de cavalo a 2,5% (HS), L-glutamina a 1%, penicilina-estreptomicina a 1%, e hidrocortisona a 1 x IO’5 M a 37°C em uma atmosfera umedecida de CO2 a 5% em ar. Depois das camadas estromais alcançarem a confluência, elas são inoculadas com HSCs de CD34+ que foram cultivadas durante 5 dias com veículo ou um composto da invenção. MNCs são adicionados em 8 diluições em série de 1:3 (iniciando a 25.000 células/ poço), com 10 poços para cada dose de células. As diluições com poços com pelo menos um clone hematopoético de fase escura (área de remendagem) de pelo menos cinco células sob a ca- mada estromal são determinadas na semana 4. Em uma concentração de teste de 1 micromolar, 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1), estimula um aumento maior que 2 vezes no número de células de formação de área de remenda- 5 gem derivadas de HSCs de MPB CD34+ depois de 5 dias de cultura, comparada com culturas de controle que são tratadas com DMSO somente.
Análise de Antígeno de Superfície: As células são lavadas com meio de manchamento (solução de sal equilibrada de Hank contendo FBS (2%) e EDTA (2 mM)) e manchadas (a 4°C durante 30 minutos) com anticor- 10 pos conjugados primários indicados. As células são lavadas no tampão anteriormente descrito e analisadas empregando-se um citômetro de fluxo BD LSR II (Becton Dickinson, San Jose, CA). As células são passadas a uma taxa de até 1000 células/ segundo empregando-se feixes de laser de 488 nm de argônio e 633 nm de HeNe como a fonte de luz para a excitação. A e- 15 missão de 104 células é medida empregando-se amplificação logarítmica e analisada empregando-se o software FlowJo (TreeStar Inc. Ashland, OR). As células manchadas com anticorpos de controle de isótipos conjugados primários são empregadas para determinar a fluorescência de base.
Determinação de subconjuntos de células de CD34+: As porcen- 20 tagens de subconjuntos de células de CD34+ são determinadas a partir de alíquotas da cultura de células. As células foram manchadas com APC anti- Thy1.1, PerCP anti-CD34, PECy7 anti CD45RA, FITC anti CD38, e PE anti- CD133 para determinação de células de CD34+Thy1.1+, CD34+CD45RA‘, CD34+CD38’, CD133+CD38’ e CD34+CD133+. Anticorpos para CD34, CD38, 25 Thy1.1 e CD45RA foram adquiridos de Becton Dickinson e anticorpos para CD133 foram adquiridos de Miltenyi Biotec. Os resultados da análise de FACS destes subconjuntos são dados como porcentagem da população total. O número absoluto de cada população de células na cultura é calculado a partir do número total de células multiplicado pela porcentagem de cada 30 população. Iniciando com as células de CD34+ de CB, depois de cinco semanas o número total de células nas culturas aumentou em média mais de 2 vezes nas células tratadas com 1 micromolar de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)- 9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1) comparado às cultura de controle. Com mais importância, >50% das células cultivadas com 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1) eram CD34+ comparadas 5 a < 10% de células cultivadas com veículo resultando em uma expansão de mais de 10 vezes de células de CD34+ comparada ao controle e uma expansão de mais de 1.000 vezes comparada às células de entrada. Além disso, a presença de 1 micromolar de 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1) aumentou tanto a 10 porcentagem quanto os números totais das subpopulações de CD34+, CD34+CD45RA ’ CD34+CD38‘, CD133+CD38‘, e CD34+CD133+ resultando em uma expansão líquida de mais de 30 vezes para cada subconjunto.
Transplante de células de CD34+ humanas em camundongos de NOD.CB17-Prkdcscld (NOD/SCID): Para avaliar a capacidade de repopulação 15 in vivo de células de CD34+ e sua progénie cultivada, CD34+ não cultivada ou as progénies de células de CD34+ cultivadas depois de 4 dias (mPB) ou 21 dias (CB) com veículo ou um composto de teste foram injetadas intravenosamente através de rotina retro-orbital em camundongos de NOD/SCID (para experimentos de mPB HSC) ou NOD/SCIDgc-/- (para experimentos de 20 CB HSC) de 8 a 10 semanas de idade sub-letalmente irradiados (3,0 Gy).
Para monitorar enxerto, o sangue foi tirado semanalmente por via retro- orbital e tratado com solução de lise de eritrócitos (Qiagen, Valencia, CA) para remover as células vermelhas do sangue, lavado com meios de man- chamento, e analisado através de Citometria de fluxo. O enxerto foi medido 25 por detecção de células de CD45+anti-humanas no sangue. Os camundongos são sacrificados em 10 semanas após o transplante; BM é coletado tanto dos fêmures quanto das tíbias. Células de BM são lavadas em meios de manchamento e manchadas com anticorpos anti-humanos. Em seguida à incubação, a suspensão é tratada com solução de lise de eritrócitos (Qiagen, 30 Valencia, CA) para remover as células vermelhas do sangue, lavada com meios de manchamento, e analisada através de Citometria de fluxo, tal como descrito anteriormente. Tanto mPB quanto CB derivados de HSCs cultiva- das com 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol (composto 1, tabela 1; exemplo 1) a uma concentração de 1 micromolar dão origem a um aumento estatisticamente significante de células humanas 10 semanas depois do enxerto.
Identificação de alvo
Para identificar o mecanismo por meio do qual um composto da invenção expande HSCs em um estado não diferenciado, um amplo perfil transcricional de genoma de células de CD34+ derivadas de mPB tratadas durante 24 horas com o exemplo 1 e um análogo menos ativo (~20 vezes) do exemplo 1 (2-(benzo[b]tiofen-3-il)-N-(3-(3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)propil)- 9-isopropil-9H-purin-6-amina). Dentre os >50.000 grupos de sonda analisa-dos, somente 5 genes foram super-regulados mais de 3 vezes no tratamento com o Exemplo 1 e a maioria também foi induzida em algum grau pelo análogo inativo. Além disso, 5 genes foram sub-regulados em >70% no tratamento com 1 pM do Exemplo 1. Todos foram sub-regulados de uma maneira dependente da dose e nenhum foi significativamente afetado pelo análogo inativo. Os dois genes que foram os mais altamente reprimidos pelo tratamento com o exemplo 1 (citocromo P450 1B1 [CYP1B1] e o repressor do receptor de hidrocarboneto de arila [AHRR]) são transcricionalmente regulados pelo receptor de hidrocarboneto de arila (AHR). Por conseguinte, os compostos da invenção podem estar agindo como antagonista de sinalização de AHR.
Além disso, a capacidade do exemplo 1 de bloquear a expressão de mRNA de CYP1B1 mediada por 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD, dioxina) por qPCR em células de CD34+ derivadas de mPB foi determinada. O tratamento com TCDD (3 nM) causou um aumento de 4,5 vezes no nível de mRNA de CYP1B1 comparado com o controle de veículo (tolueno a 0,01%). Este aumento foi inibido pelo exemplo 1 de uma maneira dependente da dose indicando que compostos da invenção podem antagonizar a sinalização de AHR. Para determinar os efeitos do Exemplo 1 na transcrição de AHR, a capacidade do exemplo 1 de inibir um ensaio de gene repórter de luciferase dependente de AHR induzida por dioxina foi testada.
A inclusão do exemplo 1 (1 pM) aboliu completamente a transcrição dependente de AHR induzida por dioxina quando empregada em células que expressam AHR humano. A titulação do exemplo 1 revelou um EC5Q de 127 nM, demonstrando que o exemplo 1 é um potente antagonista de AHR. De 5 forma interessante, o exemplo 1 somente inibiu fracamente a transcrição induzida por dioxina em células de murino e não teve nenhuma atividade sobre as células de rato, sugerindo que o exemplo 1 de preferência inibe AHR humano. Isto correlaciona-se com uma falta de atividade do exemplo 1 sobre HSC de murino, e pode explicar a seletividade do Exemplo 1 quanto à 10 espécie. Finalmente, o exemplo 1 teve somente fraca atividade de agonista sobre células de murino ou rato, e não induziu a transcrição dependente de AHR em células humanas.
Para também explorar o papel da sinalização de AHR em HSCs, dois outros antagonistas de AHR (alfa-naftoflavona e CH-223191) foram tes- 15 tados. Ambos os compostos conduzem a aumentos dependentes da dose no número de células de CD34+ quando cultivadas com células de CD34+ derivadas de mPB durante 7 dias: a inclusão de CH223191 a 1 pM forneceu uma expansão de 2,2 vezes de células de CD34+; a-naftoflavona a 0,75 pM forneceu uma expansão de 1,9 vezes de células de CD34+ enquanto o e- 20 xemplo 1 a 0,75 pM forneceu uma expansão de 3,4 vezes de células de CD34+ totais. Para mostrar um papel direto para o AHR na expansão de HSC induzida pelo exemplo 1, HSCs de CD34+ derivadas de CB humanas foram tratadas com partículas lentivirais que contêm um AHR alvejando s- hRNA que co-expressou GFP ou vírus de controle. Quarenta e oito horas 25 em seguida à transdução, as células de CD34+GFP+ foram purificadas por classificação celular e os níveis de AHR foram determinados por qPCR. Ambos os shRNAs de alvejamento de AHR conduziram à diminuições na expressão de AHR em seguida à transdução (81% com sh111 e 51% com sh242). Estas diminuições não foram observadas em células desprovidas 30 de GFP ou em células transduzidas com vírus de controle. As células de CD34+ derivadas de CB com expressão de AHR diminuída exibiram um fe- nótipo similar às células tratadas com o exemplo 1 com expressão prolonga- da de CD34+. Este dados mostram que a inibição da atividade de AHR por um composto da invenção é suficiente para promover a expansão ex-vivo de HSC.
Método de expansão de HSCs de sangue de cordão umbilical neonatal humano
O meio de cultura empregado é StemSpan SFEM (StemCell Technologies, Cat. #09650) suplementado com as seguintes citocinas humanas recombinantes: TPO, IL6, ligante de Flt3, e SCF cada qual a uma concentração final de 50 ng/mL. Os meios de cultura são preparadas fresco no dia do uso.
Diluição de composto em meios: um concentrado de 10.000x de um composto da invenção é empregado para as diluições. A adição de composto nos meios de cultura ocorre em duas etapas. A primeira etapa é uma diluição de 1:100 (10 pL de concentrado de 10.000x em 990 pL de meios de cultura completos (contendo citocinas) em um tubo Eppendorf de 1,5 mL [USA Scientific, Cat #1615-5500]) para gerar uma solução de 100x do composto nos meios de cultura. A segunda etapa é uma diluição de 1:100 nos meios de cultura que serão empregados para iniciar a cultura de células. O volume da cultura é variável dependendo do número de entrada de células de CD34+ de sangue de cordão (CB). Por exemplo, 1 x 106 células de CD34+ de CB são semeadas em 20 mL de meios (5 x 104 células/mL). Neste caso, 200 pL da solução do exemplo 1 de 100x são adicionados ao 20 mL de meios em um tubo cônico de 50 mL (Becton Dickinson, Cat #352098) para obter-se a concentração final (vide Tabela 3).
Inicio da cultura de células: células de CD34+ de CB humanas purificadas são empregadas para os experimentos de expansão ex vivo. Após o descongelamento, a viabilidade celular, testada por exclusão azul tripano, é mais alta que 50%. As células descongeladas são diluídas 5 vezes com meios de cultura (nenhuma citocina ou compostos da invenção tal como Exemplo 1) e centrifugadas a 300 g a 25°C durante 8 minutos. Depois de aspirar o sobrenadante, a pélete é ressuspensa com o volume adequado de meio de cultura (5 x 104 células/mL, tabela 3) antes de ser injetada (agulha de calibre 22, produtos Air-Tite; seringa de 20 mL, BD cat #309661) em sacos de AFC (tabela 5) para cultura imediata. As células são cultivadas a 37°C em CO2 a 5%.
Adição de meios à cultura de células: para volumes de meios até 5 80 mL, o procedimento acima (diluição de composto em meios) é emprega do. Para volumes de meios maiores que 80 mL, a primeira diluição de 1:100 é executada em tubos cônicos de 10 mL (Corning, Cat #430052, tabela 4). A segundo etapa é uma diluição de 1:100 nos meios de cultura, em recipientes estéreis (BD Falcon, Cat #354015) que é adicionada ao saco de AFC 10 (agulha de calibre 22, produtos Air-Tite; seringa de 60 mL, BD cat #309653).
Tabela 3. Diluições do Exemplo 1 para expansão de células de CD34+ derivadas de sangue de cordão
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Tabela 4. Diluições do Exemplo 1 para adição de meios para a expan são de células de CD34+ derivadas de sangue de cordão
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Tabela 5. Restrições de volume para sacos da American Fluoroseal
Corporation.
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O mesmo protocolo pode ser empregado a partir de células de sangue periférico mobilizado de um paciente para transplante de enxerto autólogo.
Uma composição que compreende uma população de células 5 com HSCs expandidas adequada para administração intravenosa como uma infusão também pode ser preparada. Para preparar células para infusão, células cultivadas são peletizadas através de centrifugação durante 10 minutos a 300 g e ressuspensas em tampão de infusão que consiste em HSA a 5% (Baxter) a uma concentração de entre 106a 108 células / ml.
Fica compreendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são para propósitos ilustrativos apenas e que várias modificações ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas às pessoas versadas na técnica e devem estar incluídas no espírito e esfera deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, e pedidos de paten- 15 tes citados aqui estão por meio deste incorporados por referência para todos os propósitos.

Claims (25)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula I:
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na qual: Gi é selecionado dentre N e CR3; G2, G3 e G4 são independentemente selecionados dentre CH e N; com a condição de que pelo menos um dentre G3 e G4 seja N; com a condição de que Gi e G2 não sejam ambos N; L é selecionado dentre -NRsa(CH2)2-, -NRsa(CH2)3-, - NR5aCH(C(O)OCH3)CH2-, -NR5a(CH2)2NRsb-, -NR5a(CH2)2S-, NR5aCH2CH(CH3)CH2-, -NR5aCH2CH(OH)- e -NR5aCH(CH3)CH2-; na qual Rõa e Rsb são independentemente selecionados dentre hidrogênio e Ci-4alquila; Ri é selecionado dentre fenila, tiofenila, furanila, 1H- benzoimidazolila, isoquinolinila, 1 H-imidazopiridinila, benzotiofenila, pirimidinila,, piridinila, 1H-imidazolila,, pirazinila, piridazinila, 1 H-pirrolila e tiazolila; na qual a referida fenila, tiofenila, furanila, 1H- benzoimidazolila, isoquinolinila, 1 H-imidazopiridinila, benzotiofenila, pirimidinila,, piridinila, 1H-imidazolila,, pirazinila, piridazinila, 1 H-pirrolila ou tiazolila de Ri pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados dentre ciano, hidróxi, Ci-4alquila, Ci- 4alcóxi, halo, Ci-4alquila substituída por halo, Ci-4alcóxi substituído por halo, hidróxi, amino, -C(O)Rsa, -S(0)o-2Rsa, -C(O)ORsa 6 -C(O)NRsaR8b; na qual Rβa e Rsb são independentemente selecionados dentre hidrogênio e Ci-4alquila; R2 é selecionado dentre -S(O)2NR6aReb-, -NReaC(O)NR6b-, - NReaC(O)NR6bR6c-, fenila, 1 H-pirrolopiridin-3-ila, 1 H-indolila, tiofenila, piridinila, 1 H-1,2,4-triazolila, 2-oxoimidazolidinila, 1 H-pirazolila, 2-oxo- 2,3-di-hidro-1H-benzoimidazolila e 1 H-indazolila; na qual Rea, Rsb θ Rec são independentemente selecionados dentre hidrogênio e Ci-4alquila; e a referida fenila, 1 H-pirrolopiridin-3-ila, 1 H-indolila, tiofenila, piridinila, 1 H-1,2,4-triazolila, 2-oxoimidazolidinila, 1 H-pirazolila, 2-oxo-2,3-di- hidro-1H-benzoimidazolila ou 1 H-indazolila de R2 é opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados de hidróxi, halo, metila, metoxi, amino, -O(CH2)nNR?aR7b, -S(O)2NR7aR7b, - OS(O)2NR7aR7b e -NR7aS(O)2R7b; na qual R7a e R7b são independentemente selecionados dentre hidrogênio e Ci-4alquila; R3 é selecionado dentre hidrogênio, Ci-4alquila e bifenila; e R4 é selecionado dentre Ci-walquila, prop-1-en-2-ila, ciclo- hexila, ciclopropila, 2-(2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, tetra-hidro-2H-piran-3-ila, tetra-hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila, tetra-hidrofuran-2-ila, benzila, (4- pentiIfenil)(fenil)metila e 1 -(1 -(2-oxo-6,9,12-trioxa-3-azatetradecan-14-il)- 1 H-1,2,3-triazol-4-il)etila, na qual a referida alquila, ciclopropila, ciclo- hexila, 2-(2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, tetra-hidro-2H-piran-2-ila, tetra-hidro-2H-piran-3-ila, tetra-hidro-2H- piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila, tetra-hidrofuran-2-ila, benzila, (4-pentiIfenil)(fenil)metila ou 1 -(1 -(2-oxo-6,9,12-trioxa-3-azatetradecan- 14-il)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)etila pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados dentre hidróxi, Ci-4alquila e Ci-4alquila substituída por halo; ou um sal do mesmo.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula la:
Figure img0070
na qual: L é -NRsa(CH2)2-; na hidrogênio e Ci-4alquila; Ri é selecionado dentre fenila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan- 3-ila, 1H-benzo[d]imidazol-1-ila, isoquinolin-4-ila, 1H-imidazo[4,5- b]piridin-1 -ila, benzo[b]tiofen-3-ila, pirimidin-5-ila, piridin-2-ila, piridin-4- ila, 1 H-imidazol-1-ila, pirazin-2-ila, piridin-3-ila, piridazin-4-ila, 1 H-pirrol- 2-ila e tiazol-5-ila; na qual a referida fenila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan- 3-ila, 1H-benzo[d]imidazol-1-ila, isoquinolin-4-ila, 1H-imidazo[4,5- b]piridin-1-ila, benzo[b]tiofen-3-ila, pirimidin-5-ila, piridin-2-ila, piridin-4- ila, 1 H-imidazol-1-ila,, pirazin-2-ila, piridin-3-ila, piridazin-4-ila, 1 H-pirrol- 2-ila ou tiazol-5-ila de Ri pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados de ciano, hidróxi, Ci-4alquila, Ci-4alcóxi, halo, Ci-4θlquila substituída por halo, -S(0)o-2Rsa e - C(O)OR8a; na qual R8a é selecionado de hidrogênio e Ci-4alquila; R2 é selecionado dentre -NR6aC(O)NR8bR6c, fenila, 1H- pirrolo[2,3-b]piridin-3-ila, 1 H-indol-3-ila, tiofen-3-ila, piridin-2-ila, piridin- 3-ila, piridin-4-ila, 1 H-1,2,4-triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1H- pirazol-3-ila, 1 H-pirazol-4-ila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1 H-benzo[d]imidazol-5- ila e 1H-imidazol-3-ila, na qual Rea, Reb e Rec são independentemente selecionados dentre hidrogênio e Ci-4alquila; a referida fenila, 1H- pirrolo[2,3-b]piridin-3-ila, 1 H-indol-3-ila, tiofen-3-ila, piridin-2-ila, piridin- 3-ila, piridin-4-ila, 1 H-1,2,4-triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1H- pirazol-3-ila, 1 H-pirazol-4-ila, 2-oxo-2,3-di-hidro-1 H-benzo[d]imidazol-5- ila ou 1H-indazol-3-ila de R2 é opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados dentre hidróxi, halo, metóxi, amino, -OS(O)2NR?aR7b e -NR?aS(O)2R7b; na qual R7a e R7b são independentemente selecionados dentre hidrogênio e Ci-4alquila; e R4 é selecionado dentre isopropila, metila, etila, prop-1-en-2- ila, isobutila, ciclo-hexila, sec-butila, (S)-sec-butila, (R)-sec-butila, 1- hidroxipropan-2-ila, (S)-1 -hidroxipropan-2-ila, (R)-1 -hidroxipropan-2-ila, nonan-2-ila, 2-(2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila e benzila; na qual a referida ciclo- hexila, 2-(2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila ou benzila pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados dentre Ci-4θlquila e Ci-4alquila substituída por halo.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que R2 é selecionado dentre uréia, fenila, 1H- indol-2-ila, 1 H-indol-3-ila, tiofen-3-ila, piridin-2-ila, piridin-3-ila, piridin-4- ila, 1 H-1,2,4-triazol-3-ila, 1 H-1,2,4-triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1 H-pirazol-3-ila, 1 H-pirazol-4-ila e 2-oxo-2,3-di-hidro-1H- benzo[d]imidazol-5-ila,; na qual a referida fenila, 1 H-indol-2-ila, 1H- indol-3-ila, tiofen-3-ila, piridin-2-ila, piridin-3-ila, piridin-4-ila, 1 H-1,2,4- triazol-3-ila, 1 H-1,2,4-triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1 H-pirazol-3- ila, 1 H-pirazol-4-ila ou 2-oxo-2,3-di-hidro-1H-benzo[d]imidazol-5-ila de R2 é opcionalmente substituída por hidróxi, metóxi, metila, halo, amino e amino-sulfonila.
4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que: R3 é selecionado dentre hidrogênio, metila e bifenila; e R4 é selecionado dentre isopropila, metila, etila, prop-1-en-2- ila, isobutila, ciclo-hexila, sec-butila, (S)-sec-butila, (R)-sec-butila, 1- hidroxipropan-2-ila, (S)-1 -hidroxipropan-2-ila, (R)-1 -hidroxipropan-2-ila, nonan-2-ila, 2-(2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila e benzila; na qual a referida ciclo- hexila, 2-(2-oxopirrolidin-1-il)etila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila ou benzila pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados dentre metila e trifluorometila.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula la:
Figure img0071
na qual: L é -NH(CH2)2-; RI é selecionado dentre fenil, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, furan- 3-ila, furan-2-ila, benzo[b]tiofen -3-ila, pirimidin-5-ila, piridin-2-ila, piridin- 4-ila, pirazin-2-ila, piridazin-3-ila, piridazin-4-ila, 1 H-pirrol-2-ila, 1H- imidazol-1 -ila, tiazol-4-ila e tiazol-5-ila; na qual a referida fenila, tiofen-2- ila, tiofen-3-ila, furan-3-ila, furan-2-ila , benzo[b]tiofen-3-ila, pirimidin-5- ila,, piridin-2-ila, piridin-4-ila, 1 H-imidazol-1-ila, pirazin-2-ila, piridazin-3- ila, piridazin-4-ila, tiazol-4-ila, 1 H-pirrol-2-ila, tiazol-5-ila ou piridin-3-ila de Ri pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados dentre ciano, hidróxi, metila, metilsulfonila, metoxi,halo, hidróxi, carboxila, etoxi-carbonila, metil- amino-carbonila e amino; R2 é selecionado dentre amino-sufonila, metil-carbonila- amino, uréia, fenila, 1 H-indol-2-ila, 1 H-indol-3-ila, tiofen-2-ila, tiofen-3- ila, piridin-2-ila, piridin-3-ila, piridin-4-ila, 1 H-1,2,4-triazol-3-ila, 1 H-1,2,4- triazol-5-ila, 2-oxoimidazolidin-1-ila, 1 H-pirazol-3-ila, 1 H-pirazol-4-ila, 2- oxo-2,3-di-hidro-1 H-benzo[d]imidazol-5-ila, na qual a referida fenila, 1H- indol-2-ila, 1 H-indol-3-ila, tiofen-2-ila, tiofen-3-ila, piridin-2-ila, piridin-3- ila, piridin-4-ila, 1 H-1,2,4-triazol-3-ila, 1 H-1,2,4-triazol-5-ila, 2- oxoimidazolidin-1 -ila, 1 H-pirazol-3-ila, 1 H-pirazol-4-ila, 2-oxo-2,3-di- hidro-1H-benzo[d]imidazol-5-ila e 1H-indazol-5-ila de R2 θ opcionalmente substituída por hidróxi, metóxi, metila, halo, , amino, e amino-sulfonila; e R4 é selecionado dentre isopropila, isobutila, sec-butila, 1- hidroxipropan-2-ila, ciclopropila, oxetan-3-ila, oxetan-2-ila, benzidrila, tetra-hidro-2H-piran-3-ila, tetra-hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra- hidrofuran-3-ila, tetra-hidrofuran-2-ila, benzila, (4-pentilfenil) (fenil) metila e 1 -(1 -(2-oxo-6,9,12-trioxa-3-azatetradecan-14-i I)-1 H-1,2,3- triazol-4-il) etila, na qual a referida ciclopropila, oxetan-3-ila, oxetan-2- ila, benzidrila, tetra-hidro-2H-piran-3-ila, tetra-hidro-2H-piran-4-ila, fenila, tetra-hidrofuran-3-ila, tetra-hidrofuran-2-ila, benzila, (4-pentilfenil) (fenil) metila ou 1-(1-(2-oxo-6,9,12-trioxa-3-azatetradecan-14-il)-1H- 1,2,3-triazol-4-il) etila pode ser opcionalmente substituída por 1 a 3 radicais independentemente selecionados dentre metila e trifluorometila.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula If:
Figure img0072
na qual: R2 é selecionado dentre 1 H-indol-3-ilo e fenil, opcionalmente substituído por hidróxi; e R4 é selecionado dentre isopropil, sec-butil, benzidril, nonan- 2-il, oxetan-3-il e tetra-hidrofuran-3-il.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta Fórmula lg:
Figure img0073
na qual: R2 é selecionado dentre 1 H-pirrolo [2,3-b] piridin-3-il; 1H- indol-3-il, opcionalmente substituído por 1 a 2 radicais selecionados independentemente dentre halo, metil e metóxi; e fenil, opcionalmente substituído por 1 a 2 radicais selecionados independentemente dentre metil, halo e hidróxi; R4 é selecionado dentre isopropil, sec-butil, 1-hidroxipropan- 2-il, prop-1-en-2-il, benzidril, nonan-2-il, oxetan-3-il e tetra-hidrofuran-3- il; θ Ra, Rb e Rcsão, cada um, selecionados independentemente dentre hidrogênio, ciano, metil, halo, -SO2CH3 e trifluorometil.
8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre: 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-sec-butil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-benzidril-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(tetra-hidro-2H-piran-3-il)-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(tiofen-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(4-(trifluorometil)benzil)-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isobutil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-metil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(4-metilbenzil)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H- purin-6-amina; 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-N-(2-(tiofen-3-il)etil)-9H- purin-6-amina; 3-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-N-(4-fluorofenetil)-9-isopropil-9H- purin-6-amina; N-(4-aminofenetil)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-isopropil-9H- purin-6-amina; 4-(2-(9-isopropil-2-(pirimidin-5-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-fenil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(tiofen-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(furan-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 2-(benzo[b]tiofen-3-il)-N-(4-fluorofenetil)-9-fenil-9H-purin-6- amina ; 4-(2-(2 (benzo[b]tiofen-3-il)-9-(nonan-2-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-sec-butil-9H- purin-6-amina; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-4-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin-2- il)nicotinato de etila; 4-(2-((9-isopropil-2-(5-metoxi-piridin-3-ila)-9H-purin-6- ilamino)fenil)fenol; 4-(2-(2-(6-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(4-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin-2- il)nicotinonitrilo; 4-(2-(2-(1 H-imidazol-1 -i l)-9-iso propi l-9H-pu rin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridazin-4-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(pirazin-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-2-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(5-(metilsulfonil)piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(4-cloropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-((9-isopropil-2-(4-metil-tiofen-3-ila)-9H-purin-6- ilamino)fenil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2- metoxifenol; N-[2-(6-metóxi-1 H-indol-3-il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3- il)-9H-purin-6-amina; N-[2-(5-metil-1 H-indol-3-il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; 1 -(2-{[9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- il]amino}etil)imidazolidin-2-ona; N-(2-{[9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- il]amino}etil)piridin-2-amina; 9-(propan-2-il)-N-[3-(1 H-pirazol-4-il)propil]-2-(piridin-3-il)-9H- purin-6-amina; N-{2-[(3-metil-1 H-1,2,4-triazol-5-il)sulfanil]etil}-9-(propan-2- il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-amina; 1 -(2-{[2-( 1 -benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6- il]amino}etil)imidazolidin-2-ona; N-[2-(5-amino-1 H-1,2,4-triazol-3-il)etil]-2-(1 -benzotiofen-3- il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-{[2-(1-benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6- il]amino}etil)piridin-2-amina; 2-(1 -benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-N-[3-(1 H-pirazol-4- il)propil]-9H-purin-6-amina; 2-(1 -benzotiofen-3-il)-N-[3-(3,5-dimetil-1 H-pirazol-4- il)propil]-9-(propan-2-il)-9H-purin-6-amina; (2-{[2-(1-benzotiofen-3-il)-9-(propan-2-il)-9H-purin-6- il]amino}etil)ureia; N-[2-(1 H-indol-3-il)etil]-9-(propan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H- purin-6-amina; N-(4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenil)metano-sulfonamida; 4-(2-(2-(piridin-3-il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)propil)fenol; 4-(2-(9-(oxetan-3-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-(1-hidroxipropan-2-il)-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; sulfamato de 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenila; 4-(2-(2-(2-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isoprop i l-2-( 1 -metil-1H-pirrol-2-i l)-9H-pu rin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(tiazol-5-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(1H-benzo[d]imidazol-1-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(2,4-dimetil-1 H-imidazol-1 -il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(2-metil-1 H-imidazol-1 - i l)-9H-pu rin-6- ilamino)etil)fenol; 5-(9-sec-butil-6-(4-hidróxi-3-metilfenetilamino)-9H-purin-2- il)nicotinonitrilo; 9-isopropil-N-(2-(5-metil-1 H-pirazol-3-il)etil)-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(5-cloropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(5-(trifluorometil)piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 5-(6-(2-(1H-indol-3-il)etilamino)-9-sec-butil-9H-purin-2- il)nicotinonitrilo; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H- purin-6-amina; (R)-N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-fluoropiridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; (S)-N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-fluoropiridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H- purin-6-amina; (R)-N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-metilpiridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; (S)-N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(5-metilpiridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-2- il)nicotinonitrilo; 4-(2-(6-(5-f luoropirid in-3-i I)-1 -isopropi I-1 H-pirazolo[3,4- d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(6-(benzo[b]tiofen-3-il)-1 -isopro pi I-1 H-pirazolo[3,4- d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol; (R)-4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-3- metilfenol; 5-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin-2- il)picolinonitrilo; 3-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin-2- il)isonicotinonitrilo; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-7-isopropil-7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol; 3-(6-(4-hidroxifenetilamino)-9-isopropil-9H-purin-2- il)picolinonitrilo; 4-(2-(9-isopropil-2-(6-metilpiridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(isoquinolin-4-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 2-cloro-4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 3-fluoro-4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; N-(2-(5-cloro-1H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin- 3-il)-9H-purin-6-amina; N-(2-(5-fluoro-1 H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(piridin-3-il)- 9H-purin-6-amina; 4-(2-(9-isopropil-2-(piridin-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)-2- metilfenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(oxetan-3-il)-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; (S)-4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol; (R)-4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-(tetra-hidrofuran-3-il)-9H- purin-6-ilamino)etil)fenol; 2-(6-(2-(1 H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9H- purin-9-il)propan-1 -ol; (R)-2-(6-(2-(1 H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)- 9H-purin-9-il)propan-1-ol; (S)-2-(6-(2-(1 H-indol-3-il)etilamino)-2-(5-fluoropiridin-3-il)- 9H-purin-9-il)propan-1-ol; (R)-N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(tetra- hidrofuran-3-il)-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(3H-imidazo[4,5-b]piridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(1 H-imidazo[4,5-b]piridin-1 -il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(6-(5-f luoropirid in-3-i I)-1 -isopropi I-1 H-imidazol[4,5- c]piridin-4-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(4,5-dimetil-1 H-imidazol-1 -il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(piridin-3-il)etil)-9H- purin-6-amina; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)- 1 -hidroxietil)fenol; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(6-metóxi-1H-indol-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H- purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(5-metóxi-1H-indol-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(prop-1 -en-2- il)-9H-purin-6-amina; 5-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)piridin-2-ol; N-(2-(1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)- 9-isopropil-9H-purin-6-amina; N-(2-(6-(2-(dietilamino)etóxi)-1 H-indol-3-il)etil)-2-(5- fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6-amina; 4-(2-(5-(5-fluoropiridin-3-il)-3-isopropil-3H-imidazol[4,5-b] piridin-7-ilamino)etil)fenol; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-9-sec-butil-2-(2-metil-1 H-imidazol-1 - il)-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(2-eti I-1 H-imidazol-1 -i l)-9-isopropi l-9H-pu ri n-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isoprop i l-2-(2-propi I-1 H-imidazol-1 -i l)-9H-pu rin-6- ilamino)etil)fenol; 3-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-9H-purin-6- ilamino)etil)-1 H-indol-6-ol; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(5-metilpiridin-3-il)-9H- purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-9-isopropil-2-(2-metil-1 H-imidazol-1 - il)-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(7-metil-1 H-indol-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(1 H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(oxetan-3-il)- 9H-purin-6-amina; N-(2-(1H-indol-3-il)etil)-2-(5-metilpiridin-3-il)-9-(oxetan-3-il)- 9H-purin-6-amina; N-(2-(6-fluoro-1 H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(6-metil-1 H-indol-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(2-metil-1 H-indol-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; N-(2-(4-fluoro-1 H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-amina; N-(2-(7-fluoro-1 H-indol-3-il)etil)-2-(5-fluoropiridin-3-il)-9- isopropil-9H-purin-6-amina; 2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-isopropil-N-(2-(4-metil-1 H-indol-3- il)etil)-9H-purin-6-amina; 4-(2-(2-(bezo[b]tiofen-3-il)7-ispopropil-7H-pirrolo[2,3- d]pirimidin-4-ilamino)etil)fenol; 4-(2-(2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(1-hidroxipropan-2-il)-9H- purin-6-ilamino)etil)-2-metilfenol; 4-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-9-ciclo-hexil-9H-purin-6- ilamino)etil)fenol; 4-(2-(9-isopropil-2-(tiofen-3-il)-9H-purin-6-ilamino)etil)fenol; e 1-(2-(2-(benzo[b]tiofen-3-il)-6-(4-hidroxifenetilamino)-9H- purin-9-il)etil)pirrolidin-2-ona; ou um sal dos mesmos.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula:
Figure img0074
ou um sal do mesmo; ou que apresenta a Fórmula:
Figure img0075
ou um sal do mesmo; ou que apresenta a Fórmula:
Figure img0076
ou um sal do mesmo; ou que apresenta a Fórmula:
Figure img0077
ou um sal do mesmo; ou que apresenta a Fórmula:
Figure img0078
ou um sal do mesmo;
10. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula:
Figure img0079
ou um sal do mesmo.
11. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula:
Figure img0080
ou um sal do mesmo.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula:
Figure img0081
ou um sal do mesmo.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula:
Figure img0082
ou um sal do mesmo.
14. Método in vitroou ex vivo para expandir células-tronco e células progenitoras, caracterizado pelo fato de que compreende o contato das células-tronco com um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, sendo que o composto é um agente capaz de antagonizar a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou de um efetor a jusante da via de sinalização do receptor de hidrocarboneto de arila.
15. Método ex vivo para expandir células-tronco hemato- poiéticas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma população celular inicial compreendendo células-tronco hematopoéticas, e (b) cultivar a referida população celular inicial na presença de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, sob condições adequadas para a expansão das células-tronco hematopoiéticas, sendo que o composto é capaz de antagonizar a atividade e/ou expressão do receptor de hidrocarboneto de arila e/ou de um efetor a jusante da via de sinalização do receptor de hidrocarboneto de arila; e opcionalmente no qual o efetor a jusante da via de sinalização do receptor de hidrocarboneto de arila é selecionado dentre Cyp1B1, Cyp1 A1, Beta catenina, AHRR, STAT5 e STAT1.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que: (a) a referida população celular inicial é enriquecida em células CD34+; ou (b) a referida população celular inicial é derivada de células de sangue de cordão umbilical; ou (c) a referida população celular inicial é derivada de uma ou duas unidades de sangue de cordão umbilical; ou (d) a referida população celular inicial é derivada de células de sangue periférico mobilizado.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que: (a) a referida população celular inicial essencialmente consiste em células de CD34+ purificadas a partir de uma ou duas unidades de sangue de cordão umbilical, preferencialmente de uma unidade de sangue de cordão umbilical; ou (b) as referidas condições para a expansão de células-tronco hematopoéticas incluem o cultivo da referida população celular inicial na presença de uma quantidade suficiente de IL6, Flt3-L, TPO e SCF; ou (c) o referido composto é administrado no meio de cultura das células a uma concentração entre 1 pM e 10 pM; ou (d) a referida população celular inicial essencialmente consiste em células de CD34+ purificadas a partir de uma ou duas unidades de sangue de cordão umbilical, preferencialmente de uma unidade de sangue de cordão umbilical; ou (e) a referida população celular inicial é cultivada na presença do referido composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, durante tempo suficiente para uma expansão de 10 a 50.000 vezes de células CD34+; ou (f) o método compreende ressuspender as células expandidas em um meio farmaceuticamente aceitável adequado para administração em um indivíduo mamífero.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a população celular inicial consiste essencialmente de células CD34+ purificadas a partir de uma ou duas unidades de sangue de cordão umbilical, preferencialmente uma unidade, e (i) a referida população celular inicial é cultivada na presença de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, de 3 dias até 90 dias, ou entre 7 a 35 dias; e/ou (ii) a referida população celular inicial é cultivada na presença de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, durante tempo suficiente para uma expansão de 100 a 1000 vezes das células CD34+.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida população celular inicial é cultivada na presença de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, por não mais do que 21 dias, 14 dias, ou 7 dias, e/ou até que expansão indicada e as populações celulares características sejam obtidas.
20. Kit para a expansão de células-tronco hematopoéticas, caracterizado pelo fato de que compreende o composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e instruções para uso em um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19, e, opcionalmente, um ou mais dos seguintes: citocinas, fatores de crescimento e meios de crescimento de células, no qual as referidas uma ou mais citocinas ou fatores de crescimento são selecionados dentre o grupo que consiste em IL6, Flt3-L, SCF e TPO.
21. Composição, caracterizada pelo fato de que é obtida a partir de um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 19, e que compreende uma população celular e um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que: (a) a referida população de células-tronco hematopoéticas expandidas é derivada de uma ou duas unidades de sangue de cordão umbilical, preferencialmente uma unidade de sangue de cordão umbilical, na qual a referida composição contém uma quantidade total de células de pelo menos 105 células, 107 células, 108 células ou 109 células, e na qual entre 20 a 100% das células totais são células de CD34+; ou (b) a referida composição contém entre 0,1% a 40% das células totais expressando marcadores CD34 e Thy1; 20 a 80% das células totais expressando marcadores CD34 e CD45RA; 10 a 95% das células sendo CD38+; e 5 a 70% das células sendo CD133+; ou (c) a referida composição é apropriada para infusão intravenosa e a referida composição compreende pelo menos 104 células/kg transfundidas no paciente, preferencialmente entre 105 células/kg e 109 células/kg.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que é para uso no transplante de células tronco hematopoiéticas em um mamífero.
24. Composição, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que é para uso na expansão de céulas tronco hematopoiéticas, que são utilizadas no tratamento de uma doença imunodeficiente herdada, uma doença autoimune e/ou um distúrbio hematopoético.
25. Composição, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que: (a) a administração é um transplante autólogo e o distúrbio hematopoiético é selecionado dentre mieloma múltiplo, linfoma não- Hodgkin, doença de Hodgkin, leucemia mieloide aguda, neuroblastoma, tumores de células germinativas, doenças autoimunes e amiloidose; ou (b) a referida doença autoimune é selecionada dentre Lúpus Eritematoso Sistêmico e esclerose sistêmica; ou (c) o referido distúrbio hematopoético é selecionado dentre Leucemia mieloide aguda, Leucemia linfoblástica aguda, Leucemia mieloide crônica, Leucemia linfocítica crônica, Distúrbios mieloproliferativos, Síndromes mielodisplásicas, Mieloma múltiplo, Linfoma não Hodgkin, Doença de Hodgkin, Anemia aplásica, Aplasia eritrocitária pura, Hemoglobinúria noturna paroxística, Anemia de Fanconi, Talassemia maior, Anemia falciforme, Imunodeficiência combinada grave, síndrome de Wiskott-Aldrich, Linfo-histiocitose hemofagocítica e erros congênitos do metabolismo.
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