BRPI0906858B1 - Métodos in vitro para detectar a presença de uma célula de câncer em um indivíduo e para identificar uma assinatura específica de tumor em um indivíduo tendo câncer. - Google Patents

Métodos in vitro para detectar a presença de uma célula de câncer em um indivíduo e para identificar uma assinatura específica de tumor em um indivíduo tendo câncer. Download PDF

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Abstract

“métodos in vitro para detectar a presença de uma célula de câncer em um indivíduo e para identificar uma assinatura específica de tumor em um indivíduo tendo câncer” métodos e composições para o diagnóstico da presença de uma célula cancerosa em um indivíduo são fornecidos. métodos e composições para a identificação de uma assinatura específica de tumor em um indivíduo tendo câncer são fornecidos. métodos e composições para o diagnóstico da presença de um agente infeccioso em um indivíduo e/ou para a identificação de uma assinatura específica de agente infeccioso em um indivíduo infectado são fornecidos. métodos e composições para o diagnóstico da presença de uma doença em um indivíduo são fornecidos. métodos e composições para a identificação de uma assinatura específica de doença em um indivíduo tendo a doença também são fornecidos.

Description

“MÉTODOS IN VITRO PARA DETECTAR A PRESENÇA DE UMA CÉLULA DE CÂNCER EM UM INDIVÍDUO E PARA IDENTIFICAR UMA ASSINATURA ESPECÍFICA DE TUMOR EM UM INDIVÍDUO TENDO CÂNCER”
Pedidos Relacionados [001]Esse pedido reivindica o benefício da data de depósito dos Pedidos de Patentes Provisórios US Nos. 61/073,434, depositado em 18 de junho de 2008 e 61/022,033, depositado em 18 de janeiro de 2008, cada um dos quais sendo aqui incorporados por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
Campo [002]A presente invenção diz respeito a métodos para identificar marcadores de condições, tais como sexo de um feto ou doenças, tais como assinaturas genômicas, proteômicas, metabolômicas, glicômicas, glicoproteômicas, lipidômicas e/ou lipoproteômicas de tumores em células obtidas a partir de fluidos corporais de um paciente.
Fundamentos [003]Os tumores se originam a partir de células normais mediante o acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas. Este processo de multi etapas envolve múltiplas alterações genéticas que levam a transformação progressiva de células normais para um fenótipo maligno. Essas alterações são compreendidas de mudanças irreversíveis na sequência de DNA (por exemplo, mutações, deleções, translocações) e levam à ativação de oncogenes, a inativação de genes supressores de tumor e a fusão dos genes. A natureza estocástica desses eventos confere heterogeneidade genética que dá as células transformadas impressões digitais moleculares (por exemplo, um ou mais componentes celulares, tais como DNA, RNA, proteínas, lipídeos, carboidratos e semelhantes) indicativos de câncer que lhes dão fenótipos únicos. Por conseguinte, as assinaturas/marcas de conjunto único de gene são conhecidas por serem expressas por vários tumores (Perou et al. (2000) Nature
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406:747; Lobenhoferet al. (2001) Health Perspect. 109:881; varít Veer et al. (2002) Nature 415:530 (2002); Liotta e Kohn (2003) Nat. Genet. 33:10; Ginos et al. (2004) Câncer Res. 64:55; Liu (2005) Proc. Natl. Acad. ScL USA 102:3531; Grigoriadis et al. (2006) Breast Câncer Research 8:R56).
[004]Tanto os tumores primários quanto os metastáticos podem existir silenciosamente e indetectáveis por anos. No entanto, estes tumores latentes e ocultos, bem como os tumores sólidos metastáticos e primários previamente diagnosticados espalham diariamente na circulação aproximadamente de um a seis milhões de células por grama de tumor. Uma grande proporção destas células tumorais circulantes, conhecidas como CTCs, passa por apoptose e morre, ao passo que as populações de células distintas podem se desenvolver na doença metastática. Os corpos apoptóticos das células tumorais, DNA, nucleossomos, RNA e proteínas também são encontrados no sangue de pacientes com câncer. Holmgren et al. Blood 93, 3956 (1999). Esforços têm sido feitos para investigar se as assinaturas dos tumores podem ser identificadas e se elas podem ser usadas para detectar ou monitorar o câncer. Veja, Ransohoff, Nature Reviews Câncer 5, 142 (2005) e McLerran et al. Clin. Chem. 54, 44 (2008).
[005]O DNA pode ser facilmente transfectadas em várias células eucarióticas, ou seja, uma vez que é internalizado no citoplasma das células, o mesmo é capaz de integrar seus genes no genoma da célula hospedeira. Por exemplo, os neutrófilos e macrófagos podem ser rapidamente e de forma muito eficiente (50% - 90%) transfectados. A passagem de DNA a partir das células eucarióticas e procariontes também foi demonstrada e acredita-se que ocorre a partir de células eucarióticas para células eucarióticas. O DNA liberado a partir de células tumorais tem uma alta atividade de transformação. A adição do meio sobrenadante a partir de células tumorais cultivadas em células normais resulta no aparecimento de tantos focos transformados quanto aqueles que ocorrem após a transfecção com um gene ras clonado
Petição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 18/121
3/74 administrado como um precipitado de cálcio. Além disso, quando ratos saudáveis foram injetados com plasma de ratos portadores de tumor (portanto contendo DNA de tumor) do gene marcador de tumor foi encontrado no DNA de suas células do pulmão, ou seja, os genes de tumor foram transcritos em células do pulmão.
[006]Os leucócitos começam como células-tronco hematopoéticas pluripotentes na medula óssea e se desenvolvem ao longo da linhagem mielóide (monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos) ou a linhagem linfóide (linfócitos T e B e células assassinas naturais). A principal função das células da linhagem mielóide (por exemplo, neutrófilos e macrófagos) é a fagocitose de organismos infecciosos, células vivas danificadas indesejadas, células senescentes e mortas (apoptose e necrose), bem como a limpeza de detritos celulares. Os fagócitos de animais saudáveis não se replicam e são diplóides, ou seja, têm um índice de DNA de um. Em média, cada célula contém < 10 ng de DNA, < 20 ng de RNA e < 300 ng de proteína.
[007]Os diferentes padrões de expressão gênica de variação, por exemplo, aqueles associados com o tipo de célula, sexo, idade, diferenças interindividuais e semelhantes têm sido reconhecidos em WBCs de doadores saudáveis. Por exemplo, um cluster de linfócitos associados tem 55 genes únicos. Em neutrófilos, a variabilidade significativa na expressão de 52 clusters de genes únicos foi relatada. Os genes deste cluster podem ser agrupados em três famílias cada vez mais específicas: (i) aqueles expressos de forma onipresente em vários tipos de células imunes circulantes, (ii) aqueles expressos por células da linhagem mielóide, e (iii) aqueles específicos para granulócitos.
[008]A existência de diversas subpopulações de WBCs varia de alguns dias (por exemplo, neutrófilos) para vários meses (por exemplo, macrófagos). Como outros tipos de células, os leucócitos envelhecem e, eventualmente, morrem. Durante o seu processo de envelhecimento, os fagócitos derivados de tecido e sangue humano (por exemplo, neutrófilos) apresentam todos os marcadores clássicos de células
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4/74 programadas mortas (por exemplo, apoptose), incluindo a ativação da caspase, núcleos picnóticos e fragmentação da cromatina. Estas células também apresentam uma série de indicadores tipo coma-me (por exemplo, fosfatidilserina, açúcares) na superfície extracelular de suas membranas plasmáticas. Por conseguinte, as células que estão morrendo e as mortas e fragmentos subcelulares das mesmas são depuradas a partir dos tecidos e do sangue de outras células fagocíticas.
[009]A apoptose dos fagócitos é acelerada após a sua ativação. Por exemplo, após a imersão de S. aureus por neutrófilos, a fosfatidilserina é externalizada em sua membrana plasmática, assim levando à sua rápida fagocitose pelos macrófagos. Os monócitos ativados também mostraram se ligar a várias linhagens de células tumorais com níveis elevados de fosfatidilserina.
[0010]As células fagocíticas circulantes são conhecidas por invadir CTCs e fragmentos mortos e vivos dos mesmos, um processo que leva a um aumento do conteúdo de DNA (e outros constituintes celulares) da célula que fagocita. Por exemplo, as células tumorais apoptóticas mostraram ser fagocitadas por macrófagos e células dendríticas. Em consequência a essa atividade fagocítica, os macrófagos do sangue obtidos de pacientes com câncer de próstata mostraram conter níveis intracelulares muito mais elevados de antígeno específico prostático (PSA) de macrófagos obtidos de pacientes com condições benignas da próstata. Veja, Herwig et al. Clinicai Prostate Câncer 3, 184 (2004) e Herwig et al. Prostate 62 290 (2005). Acredita-se que isso é uma consequência de células tumorais que fagocitam. Sabese que as células-tronco fetais, eritrócitos nucleados, linfócitos fetais, bem como quantidades significativas de ácidos nucléicos livres de células fetais circulam no sangue materno. Veja Cheung et al. Nat. Genet. 14, 264 (1996).
[0011]Também foi demonstrado que, quando os corpos apoptóticos (fragmentos de célula encapsulados por membranas), derivados de células de linfoma de
Burkitt humano são cultivados com monócitos humanos (fagocíticas) ou células
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5/74 musculares lisas vasculares (não fagocíticas), os monócitos mostram um alto percentual de vírus Epstein-Barr (EBV) específico, células tumorais gene-positivos, enquanto que as células musculares lisas apresentam aproximadamente 0,01% de frequência de absorção e de expressão.
[0012]Os métodos que permitam o diagnóstico precoce da presença de doença (por exemplo, tumores) em indivíduos, por exemplo, indivíduos que não são conhecidos por terem a doença ou que tenham a doença periódica, são necessários. Um objetivo da presente invenção é facilitar a detecção de marcadores específicos para a doença (por exemplo, tumor), por exemplo, proteínas, RNA, DNA, carboidratos e/ou lipídeos e semelhantes dentro de subpopulações de células brancas do sangue (WBCs), em um animal, incluindo um humano.
Sumário [0013]As modalidades da presente invenção são baseadas no uso de fagócitos para determinar a presença ou ausência de marcadores associados com determinadas doenças ou condições. De acordo com certas modalidades da presente invenção, os fagócitos incorporam células e/ou fragmentos e/ou componentes dos mesmos circulantes no sangue que são característicos de uma doença ou condição particular. O conteúdo dos fagócitos fornece um perfil de marcador para a doença ou condição, por exemplo, através do conteúdo de DNA e/ou proteínas nas células ou através da expressão de DNA de proteína pela célula. A comparação dos perfis de expressão de DNA de WBC fagocítico e não fagocítico leva à detecção de assinaturas de DNA específicas do tumor, específicas da doença ou específicas da condição dentro das células fagocíticas que não foram expressas ou foram subexpressas nas células não fagocíticas. Da mesma forma, os perfis de expressão de proteína de WBC fagocítico e não fagocítico levam à detecção de assinaturas de proteínas específicas de tumor, específicas de doença ou específicas de condição dentro de células fagocíticas que foram expressas ou subexpressas nas células não fagocíticas.
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Assim, em certas modalidades, os métodos da presente invenção identificam a presença de tumores sólidos (por exemplo, lesões primárias e ou metastáticas) em um indivíduo com suspeita de ter câncer e/ou identificar a presença do câncer antes da manifestação dos sinais e sintomas patológicos e detectar a recorrência da doença. De acordo com outras modalidades, os métodos da presente invenção diagnosticam certas doenças ou outras condições pela identificação de assinaturas específicas a partir de sangue ou outro fluido corporal.
[0014]A presente invenção é baseada, em parte, na verificação de que os componentes das células do sangue, tais como células fagocíticas e células não fagocíticas de um indivíduo são idealmente adequados para a fácil identificação e diferenciação de assinaturas não específicas, normais e específicas de tumor e, portanto, a eliminação da desigualdade da consequente linha de base para interindivíduos intrínsecos (por exemplo, idade, sexo, origem étnica, estado de saúde) e variações temporais na expressão dos genes.
[0015]Em certas modalidades exemplares, os métodos para a identificação de assinaturas específicas de tumor e/ou outras assinaturas específicas da doença dentro do WBCs (obtidas a partir do sangue ou outros fluidos corporais, por exemplo, urina, fezes, saliva, linfa, fluido cerebrospinal e semelhantes) de um indivíduo com suspeita de ter câncer e/ou uma ou mais outras doenças ou distúrbios ou condições são fornecidos. As modalidades da presente invenção fornecem resultados específicos para pacientes e não são dependentes dos perfis médios de assinatura derivados da população e dos valores obtidos a partir de controles saudáveis, ou seja, a(s) assinatura(s) de linha de base/origem é/são específicos para os perfis genômicos, proteômicos, metabolômicos, glicômicos, glicoproteômicos, lipidômicos e/ou lipoproteômicos do indivíduo a ser avaliado. As modalidades da presente invenção fornecem uma predisposição personalizada ao rastreio, diagnóstico e acompanhamento da doença.
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7/74 [0016]Em certas modalidades e com referência à Figura 1, a presente invenção baseia-se na capacidade das células fagocíticas engolirem e ingerirem células viáveis, morrendo e mortas (por exemplo, células apoptóticas, células necrosadas), microrganismos (por exemplo, bactérias (por exemplo, Rickettsia), vírus, fungos, leveduras, protozoários e semelhantes) partículas subcelulares e/ou fragmentos dos mesmos (corpos de cajal, membrana celular, centríolos, centrossomos, gems, aparelho de golgi, lisossomos, mitocôndrias, membrana nuclear, núcleo, nucléolo, paraspeckles, corpos leucêmicos promielocíticos (corpos PML), ribossomos, retículo endoplasmático rugoso, retículo endoplasmático liso, vacúolos, vesículas, microvesículas, e semelhantes), e os dendritos de células, por exemplo, cromossomos, DNA (nuclear e mitocondrial), exons, genes, íntrons, proteínas, príons, proteínas de ligação de carboidratos, glicoproteínas, lipoproteínas, RNA, microRNA, lipídeos, corpos apoptóticos, núcleos, microvesículas, exossomos, nucleossomos, associações polimórficas da interfase karyosomal (ΡΙΚΑ), agregados granulares (“spreckles”) de splicing, e semelhantes) e a ausência destas características nas células não fagocíticas. Assim, a análise de DNA (nuclear, mitocondrial), RNA, microRNA, proteínas príons, proteínas de ligação de carboidratos, glicoproteínas, lipídeos, lipoproteínas, corpos apoptóticos, núcleos microvesículas, exossomos e/ou nucleossomos e/ou perfis de expressão de WBCs fagocíticos e sua comparação com os de células não fagocíticas obtidos a partir do sangue ou outros fluidos corporais de um mesmo doador fornece uma identificação do assinaturas específicas de doenças e/ou de tumor dentro das células fagocíticas (sinal específico de paciente), que são ou não expressos ou significativamente diferencialmente expressos em células não fagocíticas (ruído específico de paciente). Uma vez que tanto as células fagocíticas quanto as não fagocíticas surgem a partir das mesmas células-tronco pluripotentes dentro da medula óssea, a subtração do perfil de assinatura induzida/associada a não-tumor (identificado em células não fagocíticas) a partir de assinaturas encontradas nas células
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8/74 fagocíticas permite a identificação das assinaturas específicas de doenças e/ou de tumor da amostra do paciente específico, como mostrado na Figura 2. Segundo algumas outras modalidades, o dendrito celular nos fluidos corporais é internalizado pela entose (absorção das células), endocitose e pinocitose.
[0017]De acordo com uma modalidade da presente invenção e com referência à Figura 3, uma amostra de sangue é obtida de um indivíduo com a amostra de sangue, incluindo tanto as células fagocíticas quanto as não fagocíticas (por exemplo, WBCs). A(s) célula(s) fagocíticas(s) (por exemplo, neutrófilos, monócitos, células dendríticas, macrófagos, células de espuma) são(é) então separada(s) da(s) célula(s) não fagocíticas (por exemplo, células T, células B, as células nulas, basófilos) por vários métodos conhecidos pelos versados na técnica. De acordo com a presente invenção, o fenótipo de WBCs é alterado pela fagocitose das CTCs vivas/morrendo/mortas (e fragmentos subcelulares dos mesmos) e/ou DNA específico de doença e/ou de tumor, RNA, proteínas, carboidratos e/ou lipídeos presentes no sangue. A fagocitose leva à internalização dessas assinaturas de doença e/ou tumor nas células que fagocitam e, possivelmente, a integração do DNA das células tumorais, com suas mutações somáticas específicas de tumor (ou outras mutações relacionadas à doença) no DNA das células fagocíticas normais (ou seja, a transfecção dos cromossomos da célula-alvo). A transcrição subsequente do DNA transfectado de células fagocíticas no RNA e a tradução deste em proteínas produzem um fenótipo diferente dos WBCs não-fagocíticos.
[0018]Portanto, a comparação usando métodos de genômica, proteômica, metabolômica, glicômica, glicoproteômica, lipidômica e/ou lipoproteômico conhecidos por aqueles versados na técnica perfis de expressão do DNA, RNA, proteínas e/ou lipídeos de WBCs fagocíticos e não-fagocíticos (como mostrado na Figura 3), obtido de um indivíduo com câncer (e/ou uma ou mais outras doenças) é usado para identificar perfil(s) e/ou assinatura(s) específica(s) de tumor (e/ou específica de doPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 24/121
9/74 ença e/ou específica de condição) seletivamente nas células fagocíticas, que confirmam a presença de tumor(es) oculto(s) (ou outras doenças ou condições) no indivíduo. De acordo com a presente invenção, a subtração dos perfis de DNA, RNA, proteínas, carboidratos e/ou lipídeos de células fagocíticas a partir das células não fagocíticas fornece um método para a identificação (por exemplo, após a análise de genômica, proteômica, metabolômica, glicômica, glicoproteômica, lipidômica e/ou lipoproteômica) de assinaturas específicas de tumor (e/ou específicas de doenças) em uma amostra de sangue (e/ou outras amostras biológicas) de um paciente em particular e indicar a presença de tumor(es) oculto(s) e/ou outras doença como mostrado na Figura 2.
[0019]Em certas modalidades exemplares, as células fagocíticas e não fagocíticas (por exemplo, obtidas a partir do sangue ou a uma ou mais outras amostras biológicas (por exemplo, urina, fezes, saliva, linfa, fluido cerebrospinal e semelhantes), estão separadas. Uma vez que a fagocitose de CTCs (e fragmentos subcelulares dos mesmos) pelo WBC fagocítico conduz à interiorização das células tumorais no citoplasma de células fagocíticas, a quantidade de DNA, RNA, proteínas, carboidratos e/ou lipídeos no interior das células fagocíticas será maior do que a das células não fagocíticas. Portanto, a comparação da quantidade e do perfil destes componentes entre as células fagocíticas e não fagocíticas é usada como um indicação da presença de câncer.
[0020]Em certas modalidades exemplares, um método para diagnosticar a presença de uma célula de câncer em um indivíduo é fornecido. O método inclui as etapas de obter um primeiro perfil de expressão de uma célula fagocítica de um indivíduo, obter um segundo perfil de expressão a partir de uma célula não-fagocítica de um indivíduo, comparar o primeiro e o segundo perfis de expressão, identificar a expressão diferencial de um ou mais marcadores específicos para o primeiro perfil de expressão, e relacionar a expressão diferencial de um ou mais marcadores específiPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 25/121
10/74 cos com o primeiro perfil de expressão para a presença uma célula de câncer em um indivíduo.
[0021 ]Em certas modalidades exemplares, um método para identificar uma em um indivíduo tendo câncer é fornecido. O método inclui as etapas de obter um primeiro perfil de expressão de uma célula fagocítica de um indivíduo tendo câncer, obter um segundo perfil de expressão a partir de uma célula não-fagocítica do sangue de um indivíduo tendo câncer, comparar os primeiro e segundo perfis de expressão, identificar expressão diferencial de dois ou mais marcadores específicos para o primeiro perfil de expressão e relacionar a expressão diferencial de dois ou mais marcadores específicos para uma assinatura específica de tumor no indivíduo tendo câncer.
[0022]Em certas modalidades exemplares, um método para diagnosticar a presença de uma célula de câncer em um indivíduo, incluindo as etapas de obter um primeiro perfil de expressão de uma célula fagocítica de um indivíduo e obter um segundo perfil de expressão de uma célula não-fagocítica do sangue do indivíduo é fornecido. O método inclui as etapas de comparar os primeiro e segundo perfis de expressão, identificar a presença de uma célula tumoral de circulante ou fragmento subcelular do mesmo específico para o primeiro perfil de expressão, e relacionar a presença de uma célula tumoral circulante ou fragmento subcelular do mesmo com a presença de uma célula de câncer no indivíduo. Em certos aspectos, um aumento na quantidade de um marcador no primeiro perfil de expressão em relação ao segundo perfil de expressão indica a presença de uma célula tumoral circulante ou fragmento subcelular do mesmo.
[0023]Em certas modalidades exemplares e com referência a Figuras 4-6, um método para diagnosticar a presença de uma célula de câncer em um indivíduo, incluindo as etapas de isolar uma população de células fagocíticas de um indivíduo e separar as células fagocíticas 2n de células fagocíticas > 2n é fornecido. O método
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11/74 inclui as etapas de obter um primeiro perfil de expressão das células fagocíticas 2n, obter um segundo perfil de expressão a partir de células fagocíticas> 2n, comparar os primeiro e segundo perfis de expressão e identificar a expressão diferencial de um ou mais marcadores específicos para o primeiro perfil de expressão. O método também inclui a etapa de relacionar a expressão diferencial de um ou mais marcadores específicos com o primeiro perfil de expressão para a presença de uma célula de câncer no indivíduo.
[0024]Em certos aspectos dos métodos descritos neste documento, os marcadores incluem DNA, RNA, microRNA (por exemplo, DNA ou RNA correspondente ao gene de câncer, oncogene, um gene supressor de tumor ou qualquer combinação destes), proteína (por exemplo, uma proteína ou polipeptídeo codificado por um gene de câncer, oncogene, um gene supressor de tumor ou qualquer combinação destes), lipídio, carboidrato, e/ou qualquer combinação destes. Em certos aspectos, uma célula fagocítica do sangue é um neutrófilo, um macrófago, um monócito, uma célula dendrítica, um eosinófilo, uma célula espumosa ou qualquer combinação destes. Em certos aspectos, uma célula não-fagocítica do sangue é uma célula T, uma célula B, uma célula nula, um basófilo ou qualquer combinação destes. Em outros aspectos, uma célula fagocítica do sangue e uma célula não-fagocítica do sangue são isoladas do sangue total usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como anticorpos. Em ainda outros aspectos, uma célula fagocítica do sangue e uma célula não-fagocítica do sangue são isoladas de uma população de células brancas do sangue usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Em outros aspectos, a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são separadas usando um ligante que se liga a um receptor molecular expresso na membrana plasmática das populações de WBC. Em ainda outros aspectos, a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são separadas por um ou
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12/74 mais métodos, incluindo filtração, centrifugação à base de gradiente, eluição, métodos microfluídicos e semelhantes. Em certos aspectos, um indivíduo tem um ou mais dos cânceres ocultos (por exemplo, inativo, não diagnosticado, escondido ou encoberto), câncer primário e metastático previamente diagnosticado. Em certos aspectos, um método inclui a etapa de relacionar a presença de um ou mais marcadores para a eficácia de uma terapia contra o câncer.
[0025]Em certas modalidades exemplares, os métodos descritos acima são aplicados para detectar, identificar e diagnosticar a presença de um agente infeccioso diferente do câncer pela comparação de perfis de expressão de células fagocíticas e nâo fagocíticas para determinar a expressão diferencial de marcadores característicos de agente ou doença infecciosa diferente do câncer. Ainda em outro aspecto, um ou mais dos métodos descritos aqui são usados para detectar os perfis de DNA, RNA, proteínas, carboidratos e/ou lipídeos de patógenos (por exemplo, vírus, bactérias, rickettsia, protozoários, helmintos, fungos, leveduras e semelhantes) e de outras doenças ou patologias (por exemplo, doença de Alzheimer, demência, insuficiência cardíaca, arteriosclerose, artrite, distúrbios genéticos, doenças dos ossos, doenças gastrointestinais, doenças do príon e doenças infecciosas).
[0026]Em certos aspectos dos métodos descritos neste documento, os marcadores de DNA patogênico incluem RNA patogênico, proteína patogênica, polipeptídeo patogênico, lipídeo patogênico e qualquer combinação destes. Em certos aspectos, um agente infeccioso é um vírus, uma bactéria, um fungo, um parasita, uma proteína infecciosa e qualquer combinação destes. Em certos aspectos, um método inclui a etapa de relacionar a presença de um ou mais marcadores para a eficácia de uma terapia do patógeno.
[0027]0s métodos e composições descritos aqui, portanto, permitem a fácil identificação de assinaturas específicas do tumor na amostra de sangue de um paciente, sem depender dos perfis médios de assinatura derivada da população e dos
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13/74 valores obtidos a partir de controles saudáveis. Especificamente, os métodos e composições descritos neste documento podem facilmente e economicamente: (i) identificar a presença de tumor (lesões primárias e metastáticas) em um indivíduo, antes da manifestação dos sinais e sintomas patológicos, (ii) identificar a presença de tumor (lesões primárias e metastáticas) um indivíduo com suspeita de câncer e/ou (iii) detectar reincidência de tumor (lesões primárias e metastáticas) em um indivíduo que passam por/após vários tratamentos.
[0028]Por conseguinte, os métodos e composições descritos aqui (i) permitem o rastreio não invasivo do câncer, (ii) permitem diagnosticar tumores, especialmente nos pontos de tempo iniciais, (iii) mover a(s) intervenção(ões) significativa(s) para um ponto mais inicial na trajetória da progressão do tumor, assim, prevenindo o desenvolvimento de doença metastática, (iv) acompanhar a resposta inicial ao tratamento de rotina ou experimental (s), (v) prever a resposta ao(s) tratamento(s) de rotina ou experimental(is), (vi) facilitar a seleção de um tratamento eficaz, permitindo a rápida identificação de tratamentos ineficazes cujos efeitos colaterais não podem ser balanceados por benefícios esperados e (vii) minimizar a inconveniência e incapacidade do paciente, (viii) permitem que a detecção, diagnóstico e tratamento do tumor seja estreitamente associada (por exemplo, personalização da terapia anticâncer), (ix) fornecer a previsão e detecção precoce do tipo e estágio do tumor; (x) fornecer a seleção da terapia, (xi) determinar se um tumor é metastático ou não, (xii) fornecer métodos para a monitorização das doenças e (xiii) métodos para o prognóstico das doenças.
Breve Descrição dos Desenhos [0029]0 pedido de patente ou patente depositada contém pelo menos um desenho executado em cores. Exemplares desta publicação patente ou pedido de patente com desenho(s) em cor(es) serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento de taxa necessária. O mencionado acima e outras característiPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 29/121
14/74 cas e vantagens da presente invenção serão mais bem compreendidos a partir da seguinte descrição detalhada das modalidades ilustrativas tomadas em conjunto com os desenhos que acompanham em que:
[0030]A Figura 1 apresenta esquematicamente um caminho proposto levando à aquisição de assinaturas de DNA, RNA, proteína e/ou lipídeo específica de tumor, pelos fagócitos após o engolimento de CTCs vivas, CTCs apoptóticas, CTCs fragmentadas, DNA de tumor, RNA, proteínas e lipídeos liberados pelas células tumorais apoptóticas e/ou viáveis. Observe que somente as células fagocíticas (e não as células não fagocíticas) adquiriram assinaturas de tumor.
[0031 ]A Figura 2 mostra esquematicamente um método analítico usado na identificação de assinaturas de câncer expressas em/por células fagocíticas de pacientes com câncer de ovário (OC).
[0032]A Figura 3 mostra esquematicamente um fluxograma geral de uma modalidade de um método da invenção.
[0033]A Figura 4 mostra esquematicamente um caminho proposto levando à aquisição de assinaturas de DNA, RNA, proteína e lipídio específica de tumor pelos fagócitos do sangue após o engolimento de CTCs vivas, CTCs apoptóticas, CTCs fragmentadas, DNA do tumor, RNA, proteínas e lipídeos liberados pelas células tumorais apoptóticas e/ou viáveis. Note que o conteúdo de DNA dos fagócitos após a fagocitose é > 2n.
[0034]A Figura 5 mostra esquematicamente abordagens analíticas utilizadas na identificação de assinaturas do câncer de mama (BC) em animais portadores de BC.
[0035]A Figura 6 mostra esquematicamente um fluxograma geral de outra modalidade de um método da invenção.
[0036]A Figura 7 mostra a análise de eletroforese em gel de RNA total isolado de células LNCaP e LLC1.
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15/74 [0037]A Figura 8 apresenta o rendimento e a qualidade do RNA obtido de células brancas do sangue de camundongos (WBCs).
[0038]A Figuras 9A-9D representam arranjos mostrando sete genes relacionados com câncer, sobrerregulados (> 2 vezes), detectados em neutrófilos de camundongos nude portadores de LNCaP de tumor (câncer de próstata humano). (A) Tumor de LNCaP. (B) Neutrófilos obtidos de camundongos nude portadores de tumores de LNCaP (Nt). (C) Células T obtidas de camundongos nude portadores de tumores de LNCaP (Tt). (D) Neutrófilos obtidos a partir de camundongos nude não portadores de tumor (Nn). Assinaturas circuladas expressas em células tumorais (A) e em neutrófilos de camundongos portadores de tumor (B), e minimamente expressas em neutrófilos de camundongos não portadores de tumor (D), e em células T não fagocíticas (C). A expressão em Nt foi £ 2 vezes do que aquela em Nn e Tt.
[0039]A Figuras 10A-10D representam arranjos mostrando três genes relacionados com câncer, sobrerregulados, detectados em macrófagos de camundongos nude portadores de tumor de LNCaP (câncer de próstata humano). (A) Tumor de LNCaP. (B) Macrófagos obtidos de camundongos nude portadores de tumores de LNCaP (Mt). (C) células T obtidas de camundongos nude portadores de tumores de LNCaP (Tt). (D) macrófagos obtidos a partir de camundongos nude não portadores de tumor (Mn). Assinaturas circuladas expressas em células tumorais (A) e em macrófagos de camundongos portadores de tumor (B), e minimamente expressas em macrófagos de camundongos não portadores de tumor (D), e em células T não fagocíticas (C). A expressão em Mt foi £ 2 vezes do que aquela em Mn e Tt.
[0040]As Figuras 11A e 11B representam arranjos mostrando quatro genes relacionados com câncer, sobrerregulados (£ 2 vezes), detectados em neutrófilos de camundongos nude portadores de tumor de LS174T (câncer de cólon humano). (A)
Tumor de LS174T. (B) Neutrófilos obtidos de camundongos nude portadores de tumores de LS174T (Nt). (C) células T obtidas de camundongos nude portadores de
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16/74 tumores de LS174T (Ττ). (D) Neutrófilos obtidos a partir de camundongos nude não portadores de tumor (Nn). Assinaturas circuladas expressas em células tumorais (A) e em neutrófilos de camundongos portadores de tumor (B), e minimamente expressas em neutrófilos de camundongos não portadores de tumor (D), e em células T não fagocíticas (C). A expressão em Nt foi £ 2 vezes do que aquela em Nn e Ττ.
[0041 ]As Figuras 12A-12D representam arranjos mostrando três genes relacionados com câncer, sobrerregulados 2 vezes), detectados em macrófagos de camundongos nude portadores de tumor de LS174T (câncer de cólon humano). (A) Tumor de LS174T. (B) Macrófagos obtidos de camundongos nude portadores de tumores de LS174T (Mt). (C) células T obtidas de camundongos nude portadores de tumores de LS174T (Ττ). (D) Macrófagos obtidos a partir de camundongos nude não portadores de tumor (Mn). Assinaturas circuladas expressas em células tumorais (A) e em macrófagos de camundongos portadores de tumor (B), e minimamente expressas em macrófagos de camundongos não portadores de tumor (D), e em células T não fagocíticas (C). A expressão em Mt foi £ 2 vezes do que aquela em Mn e Ττ.
[0042]As Figuras 13A-13D representam arranjos mostrando cinco genes relacionados com câncer, sobrerregulados (^ 2 vezes), detectados em neutrófilos de camundongos C57/B1 portadores de tumor de LLC1 (câncer de pulmão metastático de camundongo). (A) Tumor de LLC1. (B) Neutrófilos obtidos de camundongos C57/B1 portadores de tumores de LLC1 (Nt). (C) células T obtidas de camundongos C57/B1 portadores de tumores de LLC1 (Ττ). (D) Neutrófilos obtidos a partir de camundongos C57/B1 não portadores de tumor (Nn). Assinaturas circuladas expressas em células tumorais (A) e em neutrófilos de camundongos portadores de tumor (B), e minimamente expressas em neutrófilos de camundongos não portadores de tumor (D), e em células T não fagocíticas (C). A expressão em Nt foi £ 2 vezes do que aquela em Nn e Ττ.
[0043]As Figuras 14A-14D representam arranjos mostrando dois genes relaPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 32/121
17/74 cionados com câncer, sobrerregulados (k 2 vezes), detectados em macrófagos de camundongos C57/B1 portadores de tumor de LLC1 (câncer de pulmão metastático de camundongo). (A) Tumor de LLC1. (B) Macrófagos obtidos de camundongos C57/B1 portadores de tumores de LLC1 (Mt). (C) células T obtidas de camundongos C57/B1 portadores de tumores de LLC1 (Tt). (D) Macrófagos obtidos a partir de camundongos C57/B1 não portadores de tumor (Mn). Assinaturas circuladas expressas em células tumorais (A) e em neutrófilos de camundongos portadores de tumor (B), e minimamente expressas em neutrófilos de camundongos não portadores de tumor (D), e em células T não fagocíticas (C). A expressão em Mt foi k 2 vezes do que aquela em Mn e Tt.
[0044]As Figura 15A-15D representam arranjos mostrando dois genes relacionados com câncer, sobrerregulados (k 2 vezes), detectados em neutrófilos de camundongos C57/B1 portadores de tumor de B16F10 (melanoma metastático de camundongo). (A) Tumor de B16F10. (B) Neutrófilos obtidos de camundongos C57/B1 portadores de tumores de B16F10 (Nt). (C) células T obtidas de camundongos C57/B1 portadores de tumores de B16F10 (Tt). (D) Neutrófilos obtidos a partir de camundongos C57/B1 não portadores de tumor (Nn). Assinaturas circuladas expressas em células tumorais (A) e em neutrófilos de camundongos portadores de tumor (B), e minimamente expressas em neutrófilos de camundongos não portadores de tumor (D), e em células T não fagocíticas (C). A expressão em Nt foi k 2 vezes do que aquela em Nn e Tt.
[0045]As Figura 16A-16D representam arranjos mostrando um gene relacionado com câncer, sobrerregulado (k 2 vezes), detectados em macrófagos de camundongos C57/B1 portadores de tumor de B16F10 (melanoma metastático de camundongo). (A) Tumor de B16F10. (B) Macrófagos obtidos de camundongos C57/B1 portadores de tumores de B16F10 (Mt). (C) células T obtidas de camundongos C57/B1 portadores de tumores de B16F10 (Tt). (D) Macrófagos obtidos a partir de
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18/74 camundongos C57/B1 não portadores de tumor (Mn). Assinaturas circuladas expressas em células tumorais (A) e em macrófagos de camundongos portadores de tumor (B), e minimamente expressas em macrófagos de camundongos não portadores de tumor (D), e em células T não fagocíticas (C). A expressão em Mt foi £ 2 vezes do que aquela em Mn e Tt.
[0046]As Figura 17A-17D representam arranjos mostrando cinco genes relacionados com câncer, sobrerregulados 2 vezes), detectados em neutrófilos de pacientes com câncer de cabeça e pescoço (carcinoma celular escamoso). (A) Biópsia de tecido (pele) normal. (B) Biópsia de tecido com tumor. (C) Neutrófilos obtidos do sangue do paciente (Nt). (D) Células T obtidas do sangue do paciente (Tt). Assinaturas circuladas expressas em células tumorais (B) e em neutrófilos do sangue do paciente (C), e minimamente expressas ou não expressas na pele normal (A) ou células T não fagocíticas (D). A expressão em Nt foi £ 2 vezes do que aquela em Tre na pele.
[0047]As Figura 18D-18A representam arranjos mostrando 23 genes relacionados com câncer, sobrerregulados (^ 2 vezes), detectados em macrófagos de pacientes com câncer de ovário (adenocarcinoma). (A) Macrófagos obtidos do sangue do paciente (Μτ). (B) Células T obtidas do sangue do paciente (Tt). Assinaturas circuladas expressas em macrófagos do paciente (A), e minimamente expressas em células T não fagocíticas (B). A expressão em Mt foi £ 2 vezes do que aquela em Tt.
[0048]A Figura 19 mostra um método usado para identificar assinaturas de tumor em células fagocíticas. Neste exemplo, as intensidades de expressão de genes associados ao câncer nos macrófagos dos animais portadores de tumor (Mt) foram quantificadas em comparação com aquelas das células T dos mesmos animais (Tt), e aquelas superexpressas por > duas vezes identificadas. Em seguida, as intensidades de todos os genes expressos em Mt foram quantificadas e comparadas
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19/74 com aquela nos macrófagos obtidos de animais não portadores de tumor (Mnt) e os genes superexpressos > 2 vezes foram identificados. Os genes comuns a ambas as listas foram selecionados e comparados aos expressos pelo mesmo tumor (área sombreada).
[0049]As Figuras 20A e 20B mostram comparações da intensidade da expressão de gene em (A) macrófagos obtidos de camundongos nude portadores de tumores de próstata humana LNCaP (Mi_Ncap) e células T dos mesmos animais (células TLNCap), (B) macrófagos e Mi_NcaP obtidos a partir de camundongos nude não portadores de tumores (Mnãojumor), (C) neutrófilos obtidos de camundongos nude portadores de tumores de próstata humana LNCaP (Nusicap) e células T a partir dos mesmos animais (células TLNCap) e (D) NusicaP e macrófagos obtidos de camundongos não portadores de tumor (Nnãojumor). Os genes em vermelho foram superexpressos > 2 vezes; aqueles em verde foram subexpressos > 2 vezes.
[0050]A Figura 21 lista a expressão de genes relacionados ao câncer dentro de neutrófilos fagocíticos (N) e macrófagos (M).
[0051 ]A Figura 22 lista genes relacionadas ao câncer sobrerregulados (> 2 vezes) em macrófagos fagocíticos de um paciente com câncer de ovário em comparação com células T não fagocíticas.
[0052]A Figura 23 ilustra eletroforese em gel SDS (10%), de amostra de proteína (5,9 pg) obtida a partir do camundongo WBC.
[0053]A Figura 24 mostra a análise de Western blot da expressão de PSA e TAG-72 em células T e monócitos/macrófagos (M/M) obtidos de camundongos portadores de tumor, ilustrando a presença de assinaturas em células fagocíticas apenas.
Descrição Detalhada do Certas Modalidades [0054]As Modalidades da presente invenção são direcionadas a um método para fornecer um perfil de expressão específico do paciente de marcadores associaPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 35/121
20/74 dos com doenças, agentes infecciosos e condições corporais com base no conteúdo celular e/ou perfis de expressão de células fagocíticas. De acordo com um aspecto da presente invenção, o conteúdo celular e/ou perfis de expressão de células fagocíticas é comparado com os marcadores conhecidos para uma condição ou estado de doença particular para detectar e/ou diagnosticar a condição ou estado de doença particular. De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, o conteúdo celular e/ou perfil de expressão de células fagocíticas é comparado com o conteúdo celular e/ou perfil de expressão de células não fagocíticas do sangue de um único paciente. Subtraindo-se o conteúdo celular e/ou perfil de expressão de células não fagocíticas das células fagocíticas cria um conteúdo celular e/ou perfil de expressão representativo apenas do estado de doença do indivíduo.
[0055]De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, uma população de células fagocíticas de um indivíduo é obtida e o conteúdo celular e/ou perfil de expressão de células fagocíticas da população onde o conteúdo de DNA é que é maior do que 2n é comparado com o conteúdo celular e/ou perfil de expressão de células fagocíticas da mesma população onde o conteúdo de DNA é 2n. De acordo com uma modalidade ainda adicional da presente invenção, uma população de células fagocíticas de um indivíduo é obtida e o perfil de expressão de células fagocíticas da população, onde o conteúdo de RNA, proteínas, carboidratos e/ou lipídeos é maior do que o normal e tem um índice de DNA maior que 1, é comparado com o perfil de expressão de células fagocíticas da mesma população, onde o conteúdo de RNA, proteínas, carboidratos e/ou lipídeos é normal e/ou tem um índice de DNA de
1.
[0056]Tal perfil de expressão específico do paciente elimina a dependência de um perfil médio de assinaturas derivada da população para uma doença particular ou agente infeccioso, que podem introduzir erro na detecção ou diagnóstico de uma doença particular no indivíduo. Esse perfil de expressão específico do paciente
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21/74 para um estado de doença da presente invenção permite que a detecção, diagnóstico e tratamento sejam personalizados para o indivíduo.
[0057]Com referência as Figuras 1-3 e de acordo com certas modalidades da presente invenção, os perfis de expressão gênica de WBCs fagocíticos e não fagocíticos obtidos a partir de camundongos com tumores humanos subcutâneas (s.c.) de aproximadamente três semanas de idade (carcinoma de próstata LNCaP ou adenocarcinoma de cólon LS174T) ou tumores de camundongo (melanoma metastático B16F10, administrado por via intravenosa, ou câncer de pulmão LLC1, injeção s.c.), foram comparados. Os resultados demonstraram que os neutrófilos e macrófagos obtidos a partir destes camundongos portadores de tumor expressam várias oncogenes e outras assinaturas do gene relacionadas ao câncer que também são expressas em cada um dos respectivos tumores. Veja as Figuras 9-16 e 19-21. Estes genes relacionados ao câncer e oncogenes (por exemplo, ERBB2, Jun, Fos, etc.) não são expressos ou são minimamente expressos por (i) as células T não fagocíticas isoladas de camundongos portadores de tumor, e (ii) neutrófilos e macrófagos obtidos de camundongos não portadores de tumor. Além disso, foi verificado que somente as células fagocíticas de camundongos portadores de tumor expressam proteínas específicas do tumor. Veja as Figuras 23 e 24. CTCs e/ou DNA específico do tumor e/ou proteínas no sangue dos camundongos foram fagocitados e alguns dos DNA das células tumorais, com suas mutações e genes específicos do tumor, foram integrados, provavelmente por transfecção (sem intenção estar ligado pela teoria), em DNA de fagócito normal, transcrito em RNA e traduzido em proteína.
[0058]Com referência as Figuras 1-3 e de acordo com certas modalidades exemplares da presente invenção, os perfis de expressão gênica de WBCs fagocíticos e não fagocíticos obtidos de pacientes com tumores de cabeça e pescoço ou com câncer de ovário também foram comparados. Os resultados demonstraram que os neutrófilos e macrófagos obtidos destes pacientes expressam várias oncogenes e
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22/74 outras assinaturas de genes relacionados ao câncer que também são expressas em cada um dos respectivos tumores. Veja as Figuras 17-18 e 22. Estes genes relacionados ao câncer e oncogenes não foram expressos ou foram minimamente expressos por células T não fagocíticas isoladas do mesmo paciente individual. As CTCs e/ou DNA e RNA específico do tumor no sangue do paciente foram fagocitados e alguns dos DNA e/ou RNA das células tumorais, com seus genes e mutações específicas do tumor, foram integrados, provavelmente através de transfecção (sem intenção estar ligado pela teoria), em DNA de fagócito normal, transcrito em RNA e traduzido em proteína.
[0059]Com referência à Figuras 4-6 e de acordo com certas modalidades exemplares, a análise quantitativa dos perfis de expressão de DNA (nuclear e/ou mitocondrial), RNA, microRNA, proteínas e/ou lipídeos de células fagocíticas (por exemplo, macrófagos) obtidos a partir do sangue ou de uma ou mais outras amostras biológicas (por exemplo, urina, fezes, saliva, linfa, fluido cerebrospinal e semelhantes), cujo (1) o conteúdo de DNA é > 2n (Pn>2) ou (2) conteúdo de RNA, proteínas, carboidratos e/ou lipídeos é maior que o normal, ou seja, células que têm CTCs fagocitadas e/ou os seus fragmentos subcelulares ou DNA / RNA / lipídeos (ou seja, assinaturas específicas de tumor ou outras assinaturas específicas de doença), e/ou têm um índice DNA maior que um, e sua comparação com a mesma população de células fagocíticas (por exemplo, macrófagos), cujo (1) o conteúdo de DNA é 2n (Pn=
2) ou (2) conteúdo de RNA, proteínas, carboidratos e/ou lipídeos é normal, ou seja, células que não tem CTCs fagocitadas e/ou seus fragmentos subcelulares e têm um índice de DNA de um, fornece um método para detectar assinaturas específicas de tumor (ou outra específica de doença) dentro das células Pn>2 (sinal específico do paciente ) que não são expressas ou são minimamente expressas nas células pn= 2 (ruído específico de paciente). Com referência à Figura 6, a subtração dos perfis de DNA, RNA, proteínas e/ou lipídeos de Pn= 2 a partir dos Pn> 2, como mostrado na FiPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 38/121
23/74 gura 5 fornece um método para identificar (por exemplo, após uma ou mais análises genômica, proteômica, metabolômica, glicômica, glicoproteômica, lipidômica e/ou lipoproteômica) assinaturas específicas de tumor (e/ou específicas de doença e/ou específicas de condição) em uma amostra de sangue (ou uma ou mais amostras biológicas, tais como, por exemplo, outros fluidos corporais) de um animal e/ou um humano com câncer (e/ou doença e/ou condições corporais) e apontar a presença de tumor(es) oculto(s) e/ou outras doenças e/ou outras condições. Ao contrário dos métodos acima descritos em que os perfis da genômica, proteômica, metabolômica, glicômica, glicoproteômica, lipidomas e/ou lipoproteômica de células fagocíticas são comparados com os das células não fagocíticas, as principais vantagens deste método de detecção analítica de acordo com a presente invenção são: (i) que utiliza uma subpopulação de células fagocíticas única como uma fonte de assinaturas “específicas de tumor” (por exemplo, Pn>2 macrófagos) e “não-específicas normais” (por exemplo, Pn=2 macrófagos), ou seja, ambos compartilham o mesmo genótipo inicial, e (ii) as células que adquirem assinaturas (por exemplo, Pn>2 neutrófilos) não são diluídas com aquelas que não fagocitaram e, portanto, não adquiriram CTCs mortas e/ou fragmentos das mesmas (por exemplo, Pn=2 neutrófilos).
[0060]Com referência as Figuras 4-6 e de acordo com certas modalidades exemplares, a análise quantitativa das células fagocíticas (por exemplo, macrófagos), obtidas a partir do sangue ou de uma ou mais outras amostras biológicas ou de fluidos corporais (por exemplo, urina, fezes, saliva, linfa, fluido cerebrospinal e semelhantes), cujo conteúdo intracelular em consequência da fagocitose ou da internalização de outras células vivas, morrendo ou morta (por exemplo, apoptóticas ou necróticas), corpos apoptóticos, núcleos, microvesículas, exossomos, nucleossomos, mitocôndrias retículo endoplasmático, e semelhantes, é maior do que a mesma população de células fagocíticas (por exemplo, macrófagos), com conteúdo intracelular normal (Pnic), ou seja, células que não fagocitaram qualquer uma das
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24/74 células acima mencionadas e / dendritos de células (ruído específico do paciente), fornece um método para detectar assinaturas específicas de tumor (ou específicas de outras doenças ou específicas de outras assinaturas condição) no fagócitos com conteúdo intracelular aumentada (Piic) que não são expressas ou são minimamente expressas nos fagócitos com um conteúdo intracelular normal (ruído específico do paciente). Com referência à Figura 6, a subtração dos perfis de DNA, RNA, proteínas e/ou lipídeos de Pnic a partir dos Piic, como mostrado na Figura 5 fornece um método para identificar (por exemplo, após uma ou mais análises genômicas, proteômicas, metabolômicas, glicômicas, glicoproteômicas, lipidômicas e/ou lipoproteômicas) assinaturas específicas de tumor (e/ou específicas de doença e/ou específicas de condição) em uma amostra de sangue (ou uma ou mais amostras biológicas, tais como, por exemplo, outros fluidos corporais) de um animal com câncer ou outras doenças e apontar a presença de tumor(es) oculto(s) e/ou outras doenças. Ao contrário dos métodos acima descritos em que os perfis da genômica, proteômica, metabolômica, glicômica, glicoproteômica, lipidomas e/ou lipoproteômica de células fagocíticas são comparados com os das células não fagocíticas, as principais vantagens deste método de detecção analítica de acordo com a presente invenção são: (i) que utiliza uma subpopulação de células fagocíticas única como uma fonte de assinaturas “específicas de doenças” (por exemplo, Piic macrófagos) e “não-específicas normais” (por exemplo, Pnic macrófagos), ou seja, ambos compartilham o mesmo genótipo de linha de base, e (ii) as células que adquirem assinaturas (por exemplo, Piic neutrófilos) não são diluídas com aquelas que não fagocitaram e, portanto, não adquiriram CTCs mortas e/ou fragmentos das mesmas (por exemplo, Pnic neutrófilos).
[0061 ]Os métodos aqui descritos (i) têm alta especificidade, sensibilidade e precisão, e devem possibilitar a detecção de assinaturas específicas de tumor (e/ou outras específicas de doenças) e não-específicas normais presentes em uma amosPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 40/121
25/74 tra de sangue (ou outra amostra biológica, tal como, por exemplo, um fluido corporal), e (ii) eliminar a “desigualdade da linha de base” que é conhecida ocorrer entre os indivíduos devido a variações intrínsecas (por exemplo, idade, sexo, origem étnica, estado de saúde e semelhantes) e temporais na expressão gênica. Sendo assim, em certos aspectos, a invenção fornece ensaios não-invasivos para a detecção no início de tumores metastáticos e primários ocultos (e/ou de uma ou mais outras doenças ou condições) em pacientes, ou seja, antes que a doença possa ser diagnosticada por técnicas de imagem convencionais (por exemplo, PET, MRI, CT e semelhantes) e, portanto, fornece um fundamento para uma melhor tomada de decisão em relação às necessidades e estratégias de intervenção, prevenção e tratamento de indivíduos com câncer.
[0062]Tal como aqui usado, o termo marcador específico de tumor é destinado a incluir, mas não está limitado a, um ou mais componentes celulares, tais como uma ou mais sequências de DNA, uma ou mais sequências de RNA, uma ou mais proteínas, um ou mais polipeptídeos, um ou mais lipídeos e semelhantes. Em certos aspectos, um marcador específico do tumor está presente em uma ou mais WBCs, tais como, por exemplo, um neutrófilo, um macrófago e/ou uma célula dendrítica.
[0063]Tal como aqui usado, o termo genes relacionados com câncer se refere a genes tais como, por exemplo, os genes de câncer, oncogenes e/ou genes supressores de tumor, que alteraram a expressão (por exemplo, expressão aumentada ou expressão diminuída quando comparados com uma célula não-cancerosa) em uma célula cancerosa (por exemplo, um WBC, tal como, por exemplo, um macrófago, um neutrófilo, uma célula T ou semelhantes). Muitos genes de câncer relacionados são conhecidos na técnica. Os genes relacionados com o câncer incluem, por exemplo, mas não estão limitados a, ERBB2, JUN, RB1, SUPP1, MDM2, MAP2K1, MMP2, PDGFB, PLAUR, FGR, MYCL1, BLYM, NRAS1, PE1, SKI, TRK, ABL2,
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26/74
MYCN, RAB1, REL, RALB, LCO, ERBB4, RAF1, ECT2, KIT, FGF5, GRO1, GRO2, GRO3, FMS, PIM, KRAS1P, FYN, MYB, ROS1, MAS1, RALA, MYCLK1, GLI3, ARAF2, MET, BRAF, MOS, LYN, MYBL1, MYC, OVC, VAV2, BMI1, RET, HRAS, SPI1, REAL, SEA, EMS1, ETS1, KRAS2, ERBB3, GLI, FLT, BRCA2, RB1, FOS, AKT1, ELK2, FES, MAF, TP53, CRK, ERBA1, NF1, EVI2, ERBBB2, INT4, BRCA1, YES1, JUND JUNB, MEL, LPSA, VAV1, AKT2, FOSB, RRAS, HKR1, HKR2, ERBAL2, SRC, MYBL2, ETS2, ERG, ARAF1, YUASA, HS2, INT3, SNO, RMYC, BMYC, HRASP, TC21, TIM, PTI-1, JAK, um ou mais membros da família CEA (ver, por exemplo, Zhou et al. (2001), Gene 264:105), PSA , MUC-16 e semelhantes.
[0064]Tal como aqui usado, o termo “câncer” se refere a vários tipos de neoplasias malignas, a maioria das quais podendo invadir tecidos adjacentes, e podendo se reproduzir por metástase para diferentes locais (ver, por exemplo, PDR Medicai Dictionary, 1° edição (1995), incorporado aqui por referência, na sua totalidade para todos os propósitos). Os termos “neoplasia” e “tumor” se referem a um tecido anormal que cresce por proliferação celular mais rapidamente do que o normal e continua a crescer depois que o estímulo que iniciou a proliferação é removido. Do mesmo modo, esse tecido anormal mostra a carência total ou parcial de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal que pode ser benigno (isto é, tumor benigno) ou maligno (isto é, tumor maligno).
[0065]Exemplos de categorias gerais do câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinomas (isto é, tumores malignos derivados de células epiteliais, tais como, por exemplo, as formas mais comuns de câncer de mama, próstata, pulmão e cólon), sarcomas (isto é, tumores malignos derivados dos tecidos conjuntivos ou mesenquimais), linfomas (isto é, malignidades derivadas de células hematopoiéticas), leucemias (isto é, neoplasias derivadas de células hematopoiéticas), tumores de células germinativas (ou seja, os tumores derivados de células totipotentes). Em adultos são mais frequentemente encontrados no testículo ou ovário; em fetos, bePetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 42/121
27/74 bês e crianças jovens são mais frequentemente encontrados na linha média do corpo, especialmente na ponta do cóccix, tumores blásticos (isto é, um tumor tipicamente maligno que se assemelha a um tecido imaturo ou embrionárias) e semelhantes.
[0066]0s exemplos de tipos de neoplasias destinados a serem abrangidos pela presente invenção incluem, mas não estão limitados a, neoplasias associadas com os cânceres do tecido neural, do tecido que forma sangue, de mama, de pele, de ossos, de próstata, de ovários, de útero, de colo do útero, de fígado, de pulmão, de cérebro, de laringe, de vesícula biliar, de pâncreas, do reto, da paratireóide, da tireóide, da glândula adrenal, do sistema imunológico, da cabeça e pescoço, de cólon, de estômago, dos brônquios e/ou dos rins.
[0067]Em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou composições aqui descritos são aplicados para detectar, identificar e/ou diagnosticar distúrbios associados com a presença de anomalias cromossômicas (por exemplo, síndrome de Down, autismo e distúrbios relacionados ao espectro do autismo (incluindo, mas não limitado a, síndrome de Asperger e transtorno do desenvolvimento pervasivo, não especificado), anemia falciforme, talassemia, etc.) em consequência à presença de células fetais e DNA no sangue materno. O rastreamento e diagnóstico de uma ou mais destas doenças pode ser realizado usando os métodos e/ou composições descritos aqui para detectar um ou mais marcadores cromossômicos, por exemplo, DNA e RNA, e semelhantes, nas células fagocíticas do sangue materno.
[0068]Em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou composições aqui descritos podem ser aplicados para testar o sexo de um feto dentro de uma mulher grávida para detectar a presença de assinaturas proteômicas, lipidômicas e/ou genômicas derivadas do feto no sangue da mulher grávida, como as células-tronco fetais, eritrócitos nucleados, linfócitos do feto, bem como as quantidades significativas de ácidos nucléicos fetais livres de células são conhecidos circular no sangue materno. De acordo com os métodos descritos aqui, o conteúdo celular e/ou
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28/74 perfil de expressão de células fagocíticas é comparado com o conteúdo celular e/ou perfil de expressão de células não fagocíticas a partir do sangue de uma mulher grávida. A Subtração do conteúdo celular e/ou perfil de expressão de células não fagocíticas das células fagocíticas cria um conteúdo celular e/ou perfil de expressão representativo do gênero do feto que está sendo carregado pela mulher grávida.
[0069]Em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou composições aqui descritos podem ser usados para detectar, identificar e/ou diagnosticar distúrbios associados com a presença de assinaturas proteômicas e/ou de miócito genômicas no sangue de indivíduos tendo ou com risco de desenvolver a doença cardíaca (por exemplo, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca crônica, doença cardíaca isquêmica, morte cardiovascular e semelhante), pela detecção da presença de miócitos mortos/morrendo e/ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, DNA, proteínas e semelhantes). O rastreamento e diagnóstico de uma ou mais destas doenças é realizado usando métodos e/ou composições descritos aqui para detectar um ou mais marcadores, por exemplo, DNA e RNA, proteínas e semelhantes, dentro de células fagocíticas do sangue.
[0070]Em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou composições aqui descritos podem ser usados para detectar, identificar e/ou diagnosticar distúrbios associados com a presença de assinaturas proteômicas, lipidômicas e/ou genômicas no sangue de indivíduos tendo ou com o risco de desenvolver aterosclerose em consequência do estreitamento da artéria coronária, aneurisma da aorta abdominal e semelhantes. O rastreamento e diagnóstico destes distúrbios podem ser realizados usando métodos e/ou composições descritos aqui para detectar um ou mais marcadores, por exemplo, DNA e RNA, proteínas e semelhantes, dentro de células fagocíticas do sangue.
[0071 ]A rejeição confirmada por biópsia, um método para diagnóstico de rejeição do alotransplante, é invasiva e sujeita a erros de amostragem. Portanto, o dePetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 44/121
29/74 senvolvimento de ensaios não-invasivos que detectam biomarcadores moleculares para o diagnóstico e controle de rejeição do órgão transplantado é útil no gerenciamento de receptores transplantados por (a) detectar de um perfil pré-rejeição que permitirá intervenções terapêuticas antes da rejeição provocar a disfunção do enxerto, (b) melhorar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico de rejeição, (c) desenvolver novos sistemas de classificação para a rejeição que irão melhorar o prognóstico, e (d) fornecer informações para a concepção de regimes de imunossupressão individualizados que poderiam evitar a rejeição ao minimizar a toxicidade da droga.
[0072]Consequentemente, em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou composições aqui descritos pode ser usado para detectar, identificar ou diagnosticar distúrbios associados com a presença de assinaturas proteômicas, lipidômicas e genômicas no sangue de indivíduos tendo passado por transplantes de órgãos pela detecção de um ou mais marcadores, por exemplo, DNA, RNA, proteínas e semelhantes, dentro de células fagocíticas do sangue.
[0073]As doenças mitocondriais resultado de falhas das mitocôndrias. O dano celular e até mesmo a morte celular são consequências. As doenças das mitocôndrias parecem causar a maioria dos danos as células do cérebro, coração, fígado, músculos esqueléticos, rins e dos sistemas endócrino e respiratório, bem como diabetes, complicações respiratórias, convulsões, doença de Alzheimer, problemas visuais/auditivos, acidose láctica, atrasos de desenvolvimento, susceptibilidade à infecção e câncer.
[0074]Assim, em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou composições aqui descritos podem ser usados para rastrear, diagnosticar e/ou detectar a doença mitocondrial, pela detecção de um ou mais marcadores de DNA associados à mitocôndria, genômicos, nas células fagocíticas do sangue.
[0075]Em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou comPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 45/121
30/74 posições descritos neste documento podem ser usados para rastrear, diagnosticar e/ou detectar a doença de Alzheimer e/ou demência pela detecção de um ou mais marcadores, por exemplo, DNA, RNA, proteínas e semelhantes, dentro das células fagocíticas do sangue.
[0076]0 lúpus eritematoso sistêmico (LES) é um distúrbio autoimune complexo que afeta vários órgãos e sistemas. Assim, em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou composições aqui descritos podem ser usados para rastrear, diagnosticar e/ou detectar LES pela detecção de um ou mais marcadores, por exemplo, DNA, RNA, lipídeos, proteínas e semelhantes, dentro de células fagocíticas do sangue.
[0077]Em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou composições aqui descritos podem ser usados para rastrear e/ou detectar assinaturas genômicas e/ou proteômicas úteis no desenvolvimento de terapêuticas e/ou moléculas de imageamento pela detecção de um ou mais marcadores, por exemplo, DNA, RNA, proteínas e semelhantes, dentro de células fagocíticas do sangue.
[0078]Em certas modalidades exemplares, um ou mais métodos e/ou composições aqui descritos podem ser usados para rastrear, diagnosticar e/ou detectar alteração nas assinaturas genômicas, proteômicas e/ou lipidômicas úteis na detecção de doenças e patologias decorrentes de um ou mais insultos internos ou externos (por exemplo, exposição a bomba suja, exposição à radiação, exposição a substâncias químicas, radioterapia, administração do radiofarmaceutica, exposição a molécula terapêutica, exposição ao radão, exposição ao amianto, exposição à poluição e semelhantes) pela detecção de um ou mais marcadores, por exemplo, DNA, RNA, proteínas, lipídeos e semelhantes, dentro de células fagocíticas do sangue.
[0079]Tal como aqui usado, o termo organismo inclui, mas não limitado a, um indivíduo humano, um primata não-humano, uma vaca, um cavalo, um carneiro, um bode, um porco, um cachorro, um gato, um coelho, um camundongo, um rato,
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31/74 um gerbo, uma rã, um sapo e uma espécie transgênica da mesma. O termo organismo inclui ainda os organismos patogênicos incluindo, mas não limitado a, um patógeno, tal como um parasita, uma célula de levedura, uma tétrade de levedura, uma colônia de levedura, uma bactéria, uma colônia de bactérias, um vírion, um virossoma, uma partícula semelhantes a vírus e/ou culturas de quaisquer deles, e semelhantes.
[0080]Em certas modalidades exemplares, os ensaios aqui descritos podem ser usados para a detecção de um agente infeccioso e/ou para o diagnóstico de uma doença associada com uma infecção de uma célula, tecido, órgãos ou semelhantes por um agente infeccioso. Em certos aspectos, a detecção de um agente infeccioso e/ou o diagnóstico de um distúrbio associada com uma infecção é realizada usando os métodos e/ou composições descritos aqui para detectar um ou mais marcadores de agentes infecciosos, por exemplo, DNA, RNA, proteínas, lipídeos e semelhantes, a partir de um ou mais agentes infecciosos.
[0081 ]Tal como aqui usado, o termo agente infeccioso inclui, mas não está limitado a, organismos patogênicos, como vírus, bactérias, fungos, parasitas, proteínas infecciosas e semelhantes.
[0082]Vírus incluem, mas não estão limitados a, viroses de DNA ou RNA de animais. Como aqui usado, os vírus RNA incluem, mas não estão limitados a, família de vírus, tais como Picornavirídae (por exemplo, o poliovírus), Reovirídae (por exemplo, o rotavírus), Togaviridae (por exemplo, o vírus da encefalite, o vírus da febre amarela, vírus da rubéola), Orthomyxovirídae (por exemplo, o vírus influenza), por exemplo, Paramyxoviridae (por exemplo, o vírus sincicial respiratório, vírus do sarampo, vírus da papeira, vírus da parainfluenza), Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da raiva), Coronaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Filoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae e Retroviridae (por exemplo, vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV), vírus da imunodeficiência humana (HIV)). Como usado aqui, os vírus de DNA incluPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 47/121
32/74 em, mas não estão limitados a, famílias de vírus, tais como Papovaviridae (por exemplo, vírus do papiloma), Adenoviridae (por exemplo, adenovírus), Herpesvirídae (por exemplo, o vírus do herpes simplex), e Poxvirídae (por exemplo, vírus da varíola).
[0083]As bactérias incluem, mas não estão limitadas a, bactérias grampositivas, bactérias gram negativas, bactérias ácido-resistentes e semelhantes.
[0084]Tal como aqui usado, as bactérias gram positivas incluem, mas não estão limitados a, Actinomedurae, Actinomyces israelii, o Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostrídium botulinum, Clostridium difficile, Clostrídium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Nocardia, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epiderme, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae e semelhantes.
[0085]Tal como aqui usado, as bactérias gram negativas incluem, mas não estão limitados a, Afipia fielis, Bacteriodes, Bartonella bacilliformis, Bortadella coqueluche, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter, Escheríchia coli, Francisella tularensis, Gardnerella vaginalis, Haemophilus aegyptius, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenziae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Neisseria meningitidia, Porphyromonas gingivalis, Providencia sturti, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella boydii, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrío cholerae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, e semelhantes.
[0086]Tal como aqui usado, as bactérias ácido-resistentes incluem, mas não estão limitados a, Myobacterium avium, Myobacterium leprae, Myobacterium tuberculose e semelhantes.
[0087]Tal como aqui usado, outras bactérias que não caem nas outras três categorias incluem, mas não estão limitados a, Bartonella henselae, Chlamydia psitPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 48/121
33/74 taci, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia Akari, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia typhi, Ureaplasma urealyticum, Diplococcus pneumoniae, Ehrlichia chafensis, Enterococcus faecium, Meningococos e semelhantes.
[0088]Tal como aqui usado, os fungos incluem, mas não estão limitados a, Aspergilli, Candidae, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococci e combinações dos mesmos.
[0089]Tal como aqui usado, os micróbios parasíticos incluem, mas não estão limitados a, Balantidium coli, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayatanensis, Encephalitozoa, Entamoeba histolytica, Enterocytozoon bieneusi, Giardia lamblia, leishmânias, Plasmodii, Toxoplasma gondii, Trypanosomae, Trapezoidal amoeba e semelhantes.
[0090]Como usado aqui, os vermes parasíticos incluem (por exemplo, helmintos), particularmente os vermes parasíticos incluem, mas não estão limitados a, Nematoda (lombrigas, por exemplo, nematóide, ancilóstomo, oxiúro, ascarídeo, filardia e semelhantes) Cestoda (por exemplo, tênia).
[0091 ]Tal como aqui usado, as proteínas infecciosas incluem os príons. Os distúrbios causados por príons incluem, mas não limitado a, perturbações humanas, tais como doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) (incluindo, por exemplo, a doença de Creutzfeldt-Jakob iatrogênico (iCJD), doença de Creutzfeldt-Jakob (vCJD), doença de Creutzfeldt-Jakob familiar (fCJD), e a doença de Creutzfeldt-Jakob esporádica (DCJe)), Síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), insônia familiar fatal (FFI), insônia fatal esporádicas (SFI), kuru, e semelhantes, bem como distúrbios em animais tal como scrapie (ovinos e caprinos), a encefalopatia espongiforme bovina (BSE) (bovinos), encefalopatia transmissível do mink (TME) (mink), doença crônica de desperdício (CWD) (alce, veados, mula), encefalopatia espongiforme felina (gatos), encefalopatia de ungulados exóticos (EUE) (orix, Niala, kudu maior), encefaloPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 49/121
34/74 patia espongiforme do avestruz e semelhantes.
[0092]Em certas modalidades exemplares, métodos para detecção de marcadores, tais como sequências de ácido nucléico (por exemplo, DNA, RNA e semelhantes), proteínas, polipeptídeos, polissacarídeos de lipídeos e semelhantes em uma amostra biológica são fornecidos. Como usado aqui, o termo ácidos nucléicos destina-se a incluir as moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos de DNA ou RNA gerado usando análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucléico pode ser de fita simples ou de dupla-hélice.
[0093]Tal como aqui usado, o termo aminoácido inclui compostos orgânicos contendo tanto um grupo amino básico quanto um grupo de ácido carboxílico. Incluído neste termo estão os aminoácidos naturais (por exemplo, L-aminoácidos), aminoácidos modificados e incomuns (por exemplo, D-aminoácidos e βaminoácidos), bem como os aminoácidos que são conhecidos por ocorrerem biologicamente na forma livre ou combinada, mas que geralmente não ocorrem em proteínas. Aminoácidos que ocorrem em proteína natural incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina, triptofano, prolina, valina e isoleucina. Ácidos não-protéicos incluem o ácido amino arginosuccínico, citrulina, ácido sulfúrico, cisteína, 3,4-dihidroxifenilalanina, homocisteína, homosserina, ornitina, 3-Monoiodotirosina, 3,5-diiodotriosina, 3,5,5-triiodotironina e 3,3',5,5’-tetraiodotironina. Aminoácidos modificados ou incomuns incluem Daminoácidos, hidroxilisina, 4-hidroxiprolina, N-Cbz-aminoácidos protegidos, ácido
2,4-diaminobutírico, homoarginina, norleucina, ácido N- metilaminobutírico, naftilalanine, fenilglicina, alfa-fenilprolina, terc-leucina, 4- aminociclohexilalanina, N-metil norleucina, 3,4-dehidroprolina, N,N- dimetilaminoglicina, ácido N-metilaminoglicina, ácido 4-aminopiperidino-4-carboxílico, ácido 6-aminocapróico, ácido trans-4Petição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 50/121
35/74 (aminometil)-cicloexanocarboxílico, ácido 2-, 3- e 4- (aminometil)-benzóico, ácido 1 aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico e ácido 2benzil-5-aminopentanóico.
[0094]Tal como aqui usado, o termo “peptídeo” inclui compostos que consistem em dois ou mais aminoácidos que estão ligados através de uma ligação peptídica. Os peptídeos podem ter um peso molecular de menos de 10.000 Daltons, menos de 5.000 Daltons ou menos de a 2.500 Daltons. O termo peptídeo também inclui compostos contendo tanto componentes de peptídeos quanto de não-peptídeo, tais como resíduos de pseudopeptídeo ou peptidomiméticos ou outros componentes de não-aminoácido. Esses compostos contendo tanto componentes de peptídeos quanto de não-peptídeo também podem ser referidos como um “análogo de peptídeo”.
[0095]Tal como usado aqui, o termo “proteína” inclui compostos que consistem em aminoácidos arranjados em uma cadeia linear e unidos em conjunto por ligações peptídicas entre os grupos carboxila e amino dos resíduos de aminoácidos adjacentes.
[0096]Tal como aqui usado, o termo “lipídeos” inclui compostos de ocorrência natural ou sintética que são geralmente antipáticos e biocompatíveis. Os lipídeos tipicamente compreendem um componente hidrófilo e um componente hidrofóbico. Os lipídeos exemplares incluem, mas não estão limitados a, ácidos graxos, gorduras neutras, fosfatídeos, glicolipídeos e semelhantes. Como aqui usado, o termo “composição de lipídeo” se refere a uma composição que compreende um composto de lipídeo, geralmente em meio aquoso. Composições de lipídeos exemplares incluem, mas não estão limitadas a, suspensões, emulsões, composições de vesículas e semelhantes.
[0097]Um método exemplar para detectar a presença ou ausência de um polipeptídeo ou ácido nucléico correspondendo a um marcador da invenção em uma amostra biológica envolve a obtenção de uma amostra biológica (por exemplo, uma
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36/74 amostra de fluido corporal (por exemplo, sangue) e/ou uma amostra de tumor) a partir de um indivíduo de teste e o contato com a amostra biológica com um composto ou um agente capaz de detectar um ou mais marcadores (por exemplo, DNA, RNA, proteínas, polipeptídeos, carboidratos, lipídeos ou semelhantes).
[0098]0s métodos de detecção descritos aqui podem ser usados para detectar um ou mais marcadores (por exemplo, DNA, RNA, proteínas, polipeptídeos, carboidratos, lipídeos ou semelhantes) em uma amostra biológica in vitro, bem como in vivo. Por exemplo, as técnicas in vitro para a detecção de mRNA incluem hibridações de Northern e hibridizações in situ. As técnicas in vitro para a detecção de um polipeptídeo correspondente a um marcador da invenção incluem o ensaio imunoabsorvente de ligação de enzimas (ELISA), Western blot, imunoprecipitações e imunofluorescência. Técnicas in vitro para a detecção de DNA genômico incluem a hibridizações de Southern. Além disso, as técnicas in vivo para a detecção de um polipeptídeo correspondente a um marcador da invenção incluem a introdução em um indivíduo de um anticorpo marcado direcionado contra o polipeptídeo. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um marcador radioativo cuja presença e localização em um indivíduo podem ser detectadas por técnicas de imageamento padrão.
[0099]0s métodos de análise de conteúdo lipídico em uma amostra biológica são conhecidos na arte (Ver, por exemplo, Kang et al. (1992) Biochim. Biophys. Acta. 1128:267; Weylandt et al. (1996) Lipides 31:977; J. Schiller et al. (1999) Anal. Biochem. 267:46; Kang et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 98:4050; Schiller et al. (2004) Prog. Lipid Res. 43:499). Um método exemplar de análise de lipídeos é extrair os lipídeos a partir de uma amostra biológica (por exemplo, usando clorofórmio : metanol (2:1, vol:vol) contendo hidroxitolueno butilado 0,005% (BHT, como um antioxidante)), preparar ésteres metílicos de ácidos graxos (por exemplo, reagente de metanol-BF3 14%) e quantificar os ésteres metílicos de ácidos graxos que são quantificados (por exemplo, HPLC, TLC, por espectroscopia de massa - cromatograPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 52/121
37/74 fia de gás usando cromatógrafos, espectrômetros de massa e/ou combinação de cromatógrafo de gás / espectrômetro de massa disponíveis no mercado). A massa de ácido graxo é determinada pela comparação de áreas de diversos ácidos graxos analisados com aquela de uma concentração fixa de padrão interno.
[00100]Um princípio geral de ensaios de diagnóstico e prognóstico envolve a preparação de uma amostra ou de uma mistura reacional que pode incluir um marcador (por exemplo, um ou vários de DNA, RNA, proteínas, polipeptídeos, carboidratos, lipídeos e semelhantes) e uma sonda mediante condições adequadas e durante um tempo suficiente para permitir que o marcador e a sonda interajam e se liguem, formando um complexo que pode ser retirado e/ou detectado na mistura reacional. Estes ensaios podem ser realizados em uma variedade de maneiras.
[00101]Por exemplo, um método para conduzir tal análise implicaria em ancorar o marcador ou sonda em um suporte de fase sólida, também conhecido como um substrato e detectar os complexos de marcador-alvo/sonda ancorados na fase sólida no final da reação. Em uma modalidade desse método, uma amostra de um indivíduo que será analisado para a presença e/ou concentração do marcador, pode ser ancorada em um carreador ou suporte de fase sólida. Em outra modalidade, a situação inversa é possível, em que a sonda pode estar ancorada a uma fase sólida e uma amostra de um indivíduo pode ser deixada reagir como um componente não ancorado do ensaio.
[00102]Existem muitos métodos estabelecidos para ensaios de ancoramento de componentes a uma fase sólida. Estes incluem, sem limitação, moléculas marcadoras ou sonda que são imobilizadas por meio da conjugação da biotina e da estreptavidina. Esse componentes de ensaio biotinilados podem ser preparados a partir de biotina-NHS (N-hidróxi-succinimida) usando técnicas conhecidas na arte (por exemplo, kit de biotinilação, Pierce Chemicals, Rockford, IL) e imobilizados nos poços de placas com 96 poços de revestidos com estreptavidina (Chemical Pierce). Em certas
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38/74 modalidades, as superfícies com componentes de ensaio imobilizados podem ser preparadas com antecedência e armazenadas.
[00103]0utros carreadores apropriados ou suportes de fase sólida para tais ensaios incluem qualquer material capaz de se ligar a classe de molécula para a qual o marcador ou sonda pertence. Suportes ou carreadores bem conhecidos incluem, mas não estão limitados a, vidro, poliestireno, náilon, polipropileno, náilon, polietileno, dextrana, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetita.
[00104]A fim de conduzir ensaios com as abordagens mencionadas acima, o componente não imobilizado é adicionado à fase sólida sobre a qual o segundo componente é ancorado. Após a reação ser completa, os componentes não complexados podem ser removidos (por exemplo, por lavagem), em condições tais que quaisquer complexos formados permanecerão imobilizados em fase sólida. A detecção de complexos de marcador/sonda ancorados na fase sólida pode ser realizada em uma série de métodos descritos neste documento.
[00105]Em certas modalidades, a sonda, quando é o componente do ensaio não ancorado, pode ser marcada com a finalidade de detecção e leitura do ensaio, direta ou indiretamente, com marcações detectáveis aqui discutidas e que são bem conhecidas por um técnico no assunto.
[00106]Também é possível detectar diretamente a formação de complexo marcador/sonda sem manipulação ou marcação adicional de um ou outro componente (marcador ou sonda), por exemplo, utilizando a técnica de transferência de energia de fluorescência (ver, por exemplo, Patentes US Nos. 5.631.169 e 4.868.103). Uma marcação de fluoróforo na primeira molécula “doadora” 'é selecionado de modo que, mediante excitação com luz incidente do comprimento de onda adequado, a sua energia fluorescente emitida será absorvida por uma marcação fluorescente em uma segunda molécula receptora, que por sua vez, é capaz de fluoPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 54/121
39/74 rescência, devido à energia absorvida. Alternativamente, a molécula de proteína “doadora” pode simplesmente utilizar a energia de fluorescência natural de resíduos do triptofano. As marcações são escolhidas de modo a emitirem diferentes comprimentos de onda de luz, de tal forma que a marcação da molécula receptora pode ser diferenciada da “doadora”. Uma vez que a eficiência da transferência de energia entre as marcações está relacionada com a distância que separa as moléculas, as relações espaciais entre as moléculas podem ser avaliadas. Em uma situação em que a ligação ocorre entre as moléculas, a emissão de fluorescência da marcação da molécula do receptor no ensaio deve ser máxima. Um evento de ligação FET pode ser facilmente medido através de meios de detecção fluorométrica padrões conhecidos na arte (por exemplo, usando um fluorímetro).
[00107]Em uma outra modalidade, a determinação da capacidade de uma sonda para reconhecer um marcador pode ser realizada sem marcação ou componente de ensaio (sonda ou marcador) pelo uso de uma tecnologia tal como análise de Interações Biomoleculares em tempo real (BIA) (ver, por exemplo, Sjõlander, S. e Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338 2345 e Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699 705). Como usado aqui, BIA ou ressonância de plásmons de superfície é uma tecnologia para estudar interações bioespecíficas em tempo real, sem qualquer marcação dos reagentes (por exemplo, BIAcore). Mudanças na massa da superfície de ligação (indicativo de um evento de ligação) resultam em alterações do índice de refração da luz próximo a superfície (o fenômeno óptico da ressonância de plásmons de superfície (SPR)), resultando em um sinal detectável que pode ser usado como uma indicação de reações em tempo-real entre moléculas biológicas.
[00108]Em alternativa, em uma outra modalidade, ensaios análogos de diagnóstico e prognóstico podem ser conduzidos com sonda e marcador como solutos em uma fase líquida. Nesse ensaio, o marcador e sonda complexados são separados dos componentes não complexados por qualquer de uma série de técnicas paPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 55/121
40/74 drões, incluindo, mas não limitados a: centrifugação diferencial, cromatografia, eletroforese e imunoprecipitação. Na centrifugação diferencial, os complexos de marcador/sonda podem ser separados dos componentes de ensaio não complexados por uma série de etapas centrífugas, devido aos diferentes equilíbrios de sedimentação dos complexos com base em seus diferentes tamanhos e densidades (ver, por exemplo, Rivas e Minton (1993) Trends Biochem. Sei. 18:284). As técnicas cromatográficas padrões podem também ser utilizadas para separar as moléculas complexadas das moléculas não complexada. Por exemplo, a cromatografia de filtração em gel separa as moléculas com base no tamanho e, através da utilização de uma resina de gel filtração apropriada em um formato de coluna, por exemplo, o complexo relativamente maior pode ser separado dos componentes relativamente menores não complexados. Da mesma forma, as propriedades de carga relativamente diferentes do complexo de marcador/sonda, em comparação com os componentes não complexados podem ser exploradas para diferenciar o complexo dos componentes não complexados, por exemplo, através da utilização de resinas de cromatografia de troca iônica. Tais resinas e técnicas de cromatografia são bem conhecidas para um versado na técnica (ver, por exemplo, Heegaard (1998) J. Moi. Recognit. 11:141; Hage e Tweed (1997) J. Chromatogr. B. Biomed. Sei. Appl. 12:499). A eletroforese em gel também pode ser empregada para separar componentes de ensaio complexados dos componentes não ligados (ver, por exemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 1999). Nesta técnica, os complexos de proteína ou ácido nucléico são separados com base no tamanho ou carga, por exemplo. A fim de manter a interação de ligação durante o processo de eletroforese em gel, os materiais da matriz de gel não desnaturante e as condições na ausência de agente redutor são geralmente preferidos. As condições apropriadas para o ensaio particular e os componentes do mesmo serão conhecidas por um versado na técnica.
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41/74 [00109]Em determinadas modalidades exemplares, o nível de mRNA correspondente ao marcador pode ser determinado através de formatos in situ e/ou in vitro em uma amostra biológica usando métodos bem conhecidos na arte. Muitos métodos de detecção de expressão usam RNA isolado. Para métodos in vitro, qualquer técnica de isolamento do RNA que não selecione contra o isolamento de mRNA pode ser utilizada para a purificação de RNA a partir de células do sangue (ver, por exemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova York 1987 1999). Além disso, um grande número de células e/ou amostras pode ser facilmente processado usando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica, tal como, por exemplo, o processo de isolamento de RNA de etapa única Chomczynski (1989, Patente US No. 4.843.155).
[00110]Os mRNA isolados podem ser usados em ensaios de hibridização ou amplificação que incluem, mas não estão limitados a, análises de Northern e Southern, análise de reação em cadeia da polimerase e matrizes de sonda. Em determinadas modalidades exemplares, um método de diagnóstico para a detecção dos níveis de mRNA envolve contatar o mRNA isolado com uma molécula de ácido nucléico (sonda) que pode hibridizar com o mRNA codificado pelo gene ser detectado. A sonda de ácido nucléico pode ser, por exemplo, um cDNA de comprimento completo, ou uma porção do mesmo, tal como um oligonucleotídeo de pelo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos de comprimento e suficiente para hibridizar mediante condições restritas a um mRNA ou DNA genômico que codifica um marcador da presente invenção. Outras sondas adequadas para uso em ensaios de diagnóstico da invenção são descritas. A hibridação de um mRNA com a sonda indica que o marcador em questão está sendo expresso.
[00111]Em um formato, o mRNA é imobilizado em uma superfície sólida e contatado com uma sonda, por exemplo, pela execução do mRNA isolado em um gel de agarose e transferência de mRNA do gel para uma membrana, tal como nitroPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 57/121
42/74 celulose. Em um formato alternativo, a(s) sonda(s) é(são) imobilizada(s) em uma superfície sólida e o mRNA é contatado com a(s) sonda(s), por exemplo, em uma matriz de chip de gene. Um técnico no assunto pode facilmente adaptar métodos de detecção de mRNA conhecidos para uso na detecção do nível de mRNA codificado pelos marcadores da presente invenção.
[00112]Um método alternativo para a determinação do nível de mRNA correspondente a um marcador da presente invenção, em uma amostra envolve o processo de amplificação de ácido nucléico, por exemplo, por rtPCR (a modalidade experimental estabelecida nas Patentes US Nos. 4.683.195 e 4.683.202) , COLD-PCR (Li et al. (2008) Nat. Med. 14:579), reação em cadeia da ligase (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., 88:189), replicação de sequência auto-sustentada (Guatelli et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 87:1874), sistema de amplificação de transcrição (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 86:1173), Replicase Q-Beta ( Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), replicação de círculo rolante (Patent US No. 5.854.033) ou qualquer outro método de amplificação de ácido nucléico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas, usando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção de moléculas de ácido nucléico, se tais moléculas estão presentes em números muito baixos. Como usado aqui, os iniciadores de amplificação são definidos como sendo um par de moléculas de ácido nucléico que pode fortalecer a região 5 'ou 3' de um gene (mais e menos filamentos, respectivamente, ou viceversa), e contém uma curta região entre os dois. Em geral, os iniciadores de amplificação são de cerca de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento e flanqueiam uma região de aproximadamente 50 a 200 nucleotídeos de comprimento. Mediante condições apropriadas e com reagentes apropriados, tais iniciadores permitem a amplificação de uma molécula de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotídeo flanqueada pelos iniciadores.
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43/74 [00113]Para nos métodos in situ, o mRNA não precisa ser isolado a partir da amostra (por exemplo, um fluido corporal (por exemplo, células do sangue)) antes da detecção. Em tais métodos, uma amostra de células ou de tecidos é preparada/processadas usando métodos histológicos conhecidos. A amostra é, em seguida, imobilizada em um suporte, geralmente um slide de vidro, e então, contatada com uma sonda que pode hibridizar o mRNA que codifica o marcador.
[00114]Como uma alternativa para preparar determinações com base no nível de expressão absoluta do marcador, as determinações podem ser baseadas no nível de expressão normalizada do marcador. Os níveis de expressão são normalizados pela correção do nível de expressão absoluta de um marcador mediante a comparação a de sua expressão com a expressão de um gene que não é um marcador, por exemplo, um gene constitutivo (housekeeping) que é constitutivamente expresso. Os genes adequados para a normalização incluem genes constitutivos, tais como o gene da actina, ou genes específicos de células epiteliais. Esta normalização permite a comparação do nível de expressão em uma amostra de pacientes a partir de uma fonte para uma amostra de paciente a partir de uma outra fonte, por exemplo, comparar uma célula fagocítica do sangue de um indivíduo com uma célula não fagocíticas do sangue do indivíduo.
[00115]Em outra modalidade exemplar, uma proteína ou polipeptídeo correspondente a um marcador é detectado. Em determinadas modalidades exemplares, um agente para a detecção de um polipeptídeo da invenção é um anticorpo capaz de se ligar a um polipeptídio correspondente a um marcador da invenção, tal como um anticorpo com uma marcação detectável. Os anticorpos podem ser policlonais, ou mais preferencialmente, monoclonais. Um anticorpo intacto, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, Fab ou F (ab» pode ser usado. O termo marcado, no que diz respeito ao anticorpo ou sonda, se destina a abranger a marcação direta da sonda ou anticorpo pelo acoplamento (ou seja, ligação em forma física) uma subsPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 59/121
44/74 tância detectável para a sonda ou anticorpo, bem como a marcação indireta da sonda ou anticorpo pela reatividade com um outro reagente que é diretamente marcado. Exemplos de marcação indireta incluem a detecção de um anticorpo primário usando um anticorpo secundário marcado de forma fluorescente e marcação da extremidade de uma sonda de DNA com biotina, tal que possa ser detectada com estreptavidina marcada de forma fluorescente.
[00116]A variedade de formatos pode ser empregada para determinar se uma amostra contém uma proteína que se liga a um dado anticorpo. Os exemplos de tais formatos incluem, mas não estão limitados a, ensaio imunoenzimático (EIA), radioimunoensaio (RIA), análise de Western blot, ensaio imunoabsorvente de ligação de enzima l(ELISA) e semelhantes. Um técnico no assunto pode facilmente adaptar métodos de detecção de proteína/anticorpos conhecidos para uso na determinação de se as células (por exemplo, células de fluidos corporais, tais como as células do sangue), expressam um marcador da presente invenção.
[00117]Em um formato, os anticorpos, ou fragmentos de anticorpos, podem ser usados em métodos tais como a técnicas de Western blot ou imunofluorescência para detectar proteínas expressas. Em tais usos, é geralmente preferível imobilizar o anticorpo ou as proteínas em um suporte sólido. Os suportes ou carreadores de fase sólida adequados incluem qualquer suporte capaz de se ligar a um antígeno ou um anticorpo. Os suportes ou carreadores bem conhecidos incluem o vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrana, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros, magnetita, e semelhantes.
[00118]Um versado na técnica conhecerá muitos outros carreadores adequados para a ligação ao anticorpo ou antígeno, e será capaz de adaptar esse suporte para o uso com a presente invenção. Por exemplo, proteína isolada de células (por exemplo, células de fluidos corporais, tais como células do sangue) pode ser executada em uma eletroforese em gel de poliacrilamida e imobilizada em um suporPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 60/121
45/74 te de fase sólida, tal como nitrocelulose. O suporte pode ser lavado com tampões adequados, seguido pelo tratamento com o anticorpo marcado detectável. O suporte de fase sólida pode ser lavado com o tampão por uma segunda vez para remover o anticorpo não ligado. A quantidade de marcação ligada com o suporte sólido pode ser detectada por meios convencionais.
[00119]Em certas modalidades exemplares, os ensaios de diagnóstico são fornecidos. Um método exemplar para detectar a presença ou ausência de uma condição corporal, uma doença e/ou distúrbio associado com o câncer, um agente infeccioso, e/ou outra doença em uma amostra biológica envolve a obtenção de uma amostra biológica de um indivíduo de teste e o contato da amostra biológica com um composto ou um agente capaz de detectar um ou mais dos marcadores de uma doença e/ou distúrbio associado com o câncer, um agente infeccioso e/ou uma outra doença ou condição, por exemplo, marcador de ácido nucléico (por exemplo, mRNA, DNA genômico), marcador de peptídeos (por exemplo, polipeptídeo ou proteína) ou marcador de lipídeo codificado pelo marcador de ácido nucléico de tal forma que a presença de um marcador de ácido nucléico ou marcador de peptídeo codificado pelo ácido nucléico é detectado na amostra biológica. Em uma modalidade, um agente para a detecção de marcadores de mRNA ou de DNA genômico é uma sonda de ácido nucléico marcada capaz de hibridizar com mRNA marcador ou DNA genômico. A sonda de ácido nucléico pode ser, por exemplo, um ácido nucléico marcador de comprimento completo ou uma porção do mesmo. Outras sondas adequadas para uso em ensaios de diagnóstico da invenção são descritos aqui.
[00120]Um agente para a detecção de marcador de peptídeo pode ser um anticorpo capaz de se ligar a um marcador de peptídeos, tais como um anticorpo com uma marcação detectável. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. Um anticorpo intacto, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, Fab ou
F(ab')2) pode ser usado. O termo marcado, no que diz respeito ao anticorpo ou
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46/74 sonda, se destina a abranger a marcação direta da sonda ou anticorpo pelo acoplamento (ou seja, ligação em forma física) uma substância detectável para a sonda ou anticorpo, bem como a marcação indireta da sonda ou anticorpo pela reatividade com um outro reagente que é diretamente marcado. Exemplos de marcação indireta incluem a detecção de um anticorpo primário usando um anticorpo secundário marcado de forma fluorescente e marcação da extremidade de uma sonda de DNA com biotina, tal que possa ser detectada com estreptavidina marcada de forma fluorescente.
[00121 ]Tal como aqui usado, o termo amostra biológica destina-se a incluir tecidos, células (por exemplo, as células fagocíticas, as células não fagocíticas, células 2n, células > 2n e semelhantes) e fluidos biológicos (por exemplo, sangue total, WBCs e semelhantes), isolados de um indivíduo, bem como tecidos, células (por exemplo, as células fagocíticas, as células não fagocíticas, células 2n, células > 2n e semelhantes) e fluidos corporais (por exemplo, urina, sangue total, WBCs e semelhantes) presentes no indivíduo. Ou seja, o método de detecção da invenção pode ser usado para detectar marcadores de polipeptídeo, proteína, carboidrato, lipídeo, oligossacarídeo, mRNA, microRNA, DNA genômico e semelhantes em uma amostra biológica in vitro, bem como in vivo. Em uma modalidade, a amostra biológica contém proteínas, polipeptídeos, lipídeos e/ou oligossacarídeos a partir do indivíduo de testo. Alternativamente, a amostra biológica pode conter moléculas de mRNA do sujeito de teste e/ou moléculas de DNA genômico a partir do sujeito de teste. Em uma modalidade a amostra biológica é uma amostra de soro, uma amostra de saliva ou de uma amostra de biópsia isolada por meios convencionais a partir de um indivíduo.
[00122]Em outra modalidade, os métodos envolvem adicionalmente a obtenção de uma amostra biológica de controle a partir de um indivíduo de controle (por exemplo, célula não fagocítica ou célula 2n), contatar a amostra de controle (por
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47/74 exemplo, célula não fagocítica ou célula 2n) com um composto ou agente capaz de detectar marcador de polipeptídeo, lipídeo, proteína, oligossacarídeo, mRNA, microRNA, DNA genômico e semelhantes detectáveis na amostra biológica, e comparar a presença de marcador de polipeptídeo, lipídeo, proteína, oligossacarídeo, mRNA, DNA genômico e semelhantes em amostra de controle com a presença do marcador de polipeptídeo, proteína, lipídeo, oligossacarídeo, mRNA, DNA genômico e semelhantes na amostra (por exemplo, célula fagocítica ou célula > 2n). Alternativamente, a presença de marcador de polipeptídeo, proteína, lipídeo, oligossacarídeo, mRNA, DNA genômico e semelhantes na amostra (por exemplo, de célula fagocítica ou célula > 2n) pode ser comparada com a informação em uma base de dados ou um tabela para resultar na detecção ou diagnóstico.
[00123]A invenção também inclui kits para detectar a presença de um ou mais marcadores associados com câncer e/ou de um agente infeccioso em uma amostra biológica. Por exemplo, o kit pode compreender um composto marcado ou um agente capaz de detectar marcador de polipeptídeo, lipídeo, proteína, oligossacarídeo, mRNA, microRNA, DNA genômico e semelhantes em uma amostra biológica, meios para determinar a quantidade de marcador na amostra, e meios para comparar a quantidade de marcador na amostra com um padrão (por exemplo, uma célula não fagocítica ou uma célula 2n). O composto ou agente pode ser empacotado em um recipiente adequado. O kit pode compreender adicionalmente instruções para o uso do kit para detecção do marcador de peptídeos ou de ácidos nucléicos.
[00124]Em certas modalidades exemplares, ensaios de prognósticos são fornecidos. Os métodos de diagnósticos descritos neste documento podem, alem disso, ser usados para identificar indivíduos tendo uma condição ou em risco de desenvolver uma doença e/ou distúrbio associado com câncer e/ou com um agente infeccioso ou um outro distúrbio aqui descrito associado com a expressão sobrerregulada (ou subregulada) de um ou mais dos marcadores descritos aqui. Por exemPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 63/121
48/74 plo, os ensaios aqui descritos, tais como os ensaios de diagnóstico antecedentes ou ensaios seguintes, podem ser utilizados para identificar um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma doença e/ou distúrbio associado com câncer e/ou um agente infeccioso e/ou um ou mais outros distúrbios aqui descritos.
[00125]0s ensaios de prognósticos aqui descritos podem ser usados para determinar se um indivíduo pode ser administrado com um agente (por exemplo, um agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, peptídeo, ácido nucléico e pequenas moléculas, ou outro candidato a droga) para tratar uma doença e/ou distúrbio associado com câncer e/ou com um agente infeccioso, e/ou com um ou mais outros distúrbios aqui descritos associados com um ou mais dos marcadores descritos. Por exemplo, esses métodos podem ser usados para determinar se um indivíduo pode ser tratado eficazmente com um agente para o tratamento, melhora ou redução de um ou mais sintomas associados ao câncer. Desse modo, a presente invenção fornece métodos para determinar se um indivíduo pode ser tratado eficazmente com um agente para uma doença e/ou distúrbio associado com câncer e/ou com um agente infeccioso, e/ou uma ou mais outros distúrbios aqui descritas.
[00126]0s métodos da invenção também podem ser usados para detectar alterações genéticas em um gene marcador, assim, determinando se um indivíduo com o gene alterado está em risco de desenvolver uma doença e/ou distúrbio associado com câncer e/ou um agente infeccioso e/ou um ou mais outros distúrbios aqui descritos caracterizados pela desregulação de uma atividade de proteína marcadora ou expressão de ácido nucléico, tal como o câncer. Em certas modalidades, os métodos incluem a detecção, em uma amostra de células (por exemplo, células de fluidos corporais, tais como as células do sangue) do indivíduo, a presença ou a ausência de uma alteração genética caracterizada por uma alteração que afeta a integridade de um gene que codifica um peptídeo marcador e/ou um gene marcador. Por exemplo, tais alterações genéticas podem ser detectadas pela verificação da exisPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 64/121
49/74 tência de pelo menos um de: 1) uma deleção de um ou mais nucleotídeos de um ou mais genes marcadores, 2) uma adição de um ou mais nucleotídeos para um ou mais genes marcadores; 3) uma substituição de um ou mais nucleotídeos de um ou mais genes marcadores; 4) um rearranjo cromossômico de um ou mais genes marcadores, 5) uma alteração no nível de transcrição do RNA mensageiro de um ou mais genes marcadores; 6) modificação aberrante de um ou mais genes marcadores, tais como o padrão de metilação do DNA genômico; 7) a presença de um padrão de splicing tipo não-selvagem de uma transcrição de RNA mensageiro de um ou mais genes marcadores; 8) um nível tipo não-selvagem de proteínas do tipo de uma ou mais proteínas marcadoras; 9) perda alélica de um ou mais genes marcadores; e 10) a modificação pós-translacional de inadequada de um ou mais proteínas marcadoras. Conforme descrito aqui, há um grande número de ensaios conhecidos na arte que pode ser usado para detectar alterações em um ou mais genes marcadores.
[00127]Em certas modalidades, a detecção de alteração envolve o uso de uma sonda/iniciador em uma reação em cadeia da polimerase (PCR) (ver, por exemplo, Patentes US Nos. 4.683.195, 4.683.202 e 5.854.033), como o PCR em tempo real COLD-PCR, PCR âncora, PCR recursiva ou RACE PCR, ou, alternativamente, em uma reação em cadeia da ligação (LCR) (ver, por exemplo, Landegran et al. (1988) Science 241:1077; Prodromou e Pearl (1992) Protein Eng . 5:827 e Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 91:360), o último dos quais podendo ser particularmente útil para a detecção de mutações de ponto em um gene marcador (ver, Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675). Este método pode incluir as etapas de coleta de uma amostra de células de um indivíduo, isolando o ácido nucléico (por exemplo, genômica, mRNA ou ambos) a partir das células da amostra, do contato com a amostra de ácido nucléico com uma ou mais iniciadores que hibridizam especificamente para uma gene marcador em condições tais que a hibridizaPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 65/121
50/74 ção e amplificação do gene marcador (se houver) ocorra, e detecção da presença ou ausência de um produto de amplificação, ou detecção do tamanho do produto de amplificação e comparação com o comprimento de uma amostra de controle. É antecipado que a PCR e/ou LCR pode ser desejável para uso como uma etapa de amplificação preliminar em conjunto com qualquer das técnicas usadas para detecção de mutações descritas aqui.
[00128]0s métodos de amplificação alternativos incluem: replicação de sequência auto sustentada (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 87:1874), sistema de amplificação transcricional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 86:1173), Replicase Q-Beta (Lizardi et al. (1988), Bio-Tecnhnology 6:1197), ou qualquer outro método de amplificação de ácidos nucléicos, seguido pela detecção de moléculas amplificadas, usando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção de moléculas de ácido nucléico, se tais moléculas estão presentes em números muito baixos.
[00129]Em uma modalidade alternativa, as mutações em um ou mais genes marcadores de uma célula de amostra podem ser identificadas por alterações nos padrões de divagem das enzimas de restrição. Por exemplo, amostra e DNA de controle é isolado, opcionalmente, amplificado, digerido com uma ou mais endonucleases de restrição, e os tamanhos de comprimento dos fragmentos são determinados por eletroforese em gel e comparados. As diferenças nos tamanhos de comprimento de fragmentos entre a amostra e controle de DNA indicam mutações no DNA de amostra. Além disso, o uso de ribozimas de sequência específicas (ver, por exemplo, Pat. US No. 5.498.531) é adequado para apontar a presença de mutações específicas pelo desenvolvimento ou perda de um sítio de divagem de ribozima.
[00130]Em outras modalidades, as mutações genéticas em um ou mais dos marcadores aqui descritos podem ser identificadas pela hibridização de uma amosPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 66/121
51/74 tra e controle de ácidos nucléicos e controle, por exemplo, DNA ou RNA, para matrizes de alta densidade contendo centenas ou milhares de sondas de oligonucleotídeos (Cronin et al. (1996), Human Mutation 7:244; Kozal et al. (1996) Nature Medicine 2:753). Por exemplo, as mutações genéticas em um ácido nucléico marcador podem ser identificadas em matrizes bidimensionais contendo sondas de DNA geradas com luz como descrito em Cronin, M.T. et al. supra. Resumidamente, uma primeira matriz de hibridização de sondas pode ser usada para fazer a varredura através de longos trechos de DNA em uma amostra e controle para identificar mudanças de base entre as sequências pela preparação de matrizes lineares de sondas de sobreposição sequenciais. Esta etapa permite a identificação de mutações pontuais. Esta etapa é seguida por uma segunda matriz de hibridação que permite a caracterização de mutações específicas pelo uso de matrizes de sonda especializadas, menores, complementares a todas as variantes ou mutações detectadas. Cada matriz de mutação é composta de conjuntos de sondas paralelas, um complementar ao gene do tipo selvagem e outro complementar ao gene mutante.
[00131]Ainda em outra modalidade, qualquer um de uma variedade de reações de sequenciamento conhecida na arte pode ser usada para sequenciar diretamente um gene marcador e detectar mutações pela comparação da sequência de amostra de gene marcador com a sequência do tipo selvagem (controle) correspondente. Exemplos de reações de sequenciamento incluem aquelas baseados em técnicas desenvolvidas pela Maxam e Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 74:560) ou Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sei E.U.A. 74:5463). É também contemplado que qualquer um de uma variedade de procedimentos de sequenciamento automáticos pode ser usada ao realizar os testes de diagnóstico ((1995) Biotechniques 19:448), incluindo o sequenciamento por espectrometria de massa (ver, por exemplo, Publicação internacional PCT No. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr36:127-162.; e Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147).
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52/74 [00132]0utros métodos para a detecção de mutações em um gene marcador incluem métodos em que a proteção dos agentes de divagem é usada para detectar bases desemparelhadas em heteroduplexes de RNA / RNA ou RNA / DNA (Myers et al. (1985), Science 230:1242). Em geral, a técnica da arte de “divagem de desemparelhamento” começa pelo fornecimento de heteroduplexes formados pela hibridação (marcada) de RNA ou DNA contendo a sequência marcadora de tipo selvagem com RNA ou DNA potencialmente mutante obtido a partir de uma amostra de tecido. Os filamentos de dúplex duplos são tratados com um agente que diva regiões de filamentos únicos do dúplex, tal como o que existe devido aos desemparelhamentos de pares de base entre o filamento de amostra e de controle. Por exemplo, o dúplex de RNA/DNA pode ser tratado com RNase e híbridos de DNA/DNA tratados com nuclease S1 para digerir enzimaticamente as regiões desemparelhadas. Em outras modalidades, o dúplex de DNA/DNA ou RNA/DNA pode ser tratado com hidroxilamina ou tetróxido de ósmio e com piperidina, a fim de digerir as regiões desemparelhadas. Após a digestão das regiões desemparelhadas, o material resultante é então separado pelo tamanho em géis de poliacrilamida de desnaturação para determinar o local da mutação. Veja, por exemplo, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286. Em uma modalidade, o controle de DNA ou RNA pode ser marcado para detecção.
[00133]Ainda em outra modalidade, a reação de divagem de desempareIhamento emprega uma ou mais proteínas que reconhecem pares de bases desemparelhados no DNA de filamento duplo (as chamadas enzimas de reparo de desemparelhamento do DNA”) em sistemas definidos para a detecção e mapeamento de mutações pontuais nos cDNAs marcadores obtidos a partir de amostras de células. Por exemplo, a enzima mutY de E. coli cliva A no desemparelhamento G/A e a glicosilase timidina DNA das células HeLa clivam T no desemparelhamento G/T (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657). De acordo com uma modalidade exemplar,
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53/74 uma sonda com base em uma sequência marcadora, por exemplo, uma sequência marcadora do tipo selvagem, é hibridizada para um cDNA ou outro DNA de uma célula de teste(s). O dúplex é tratado com uma enzima de reparo de desemparelhamento de DNA, e os produtos de divagem, se houver, podem ser detectados a partir de protocolos de eletroforese ou semelhantes. Veja, por exemplo, Patente US No. 5.459.039.
[00134]Em outras modalidades, as alterações na mobilidade eletroforética serão usadas para identificar mutações em genes marcadores. Por exemplo, o polimorfismo de conformação de filamento único (SSCP) pode ser usado para detectar diferenças na mobilidade eletroforética entre mutante e ácidos nucléicos tipo selvagem (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2766, vide também Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125; e Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73). Os fragmentos de DNA de filamento único de ácidos nucléicos marcador de controle e amostra e serão desnaturados e deixados renaturar. A estrutura secundária de ácidos nucléicos de filamentos únicos varia de acordo com a sequência, a alteração resultante na mobilidade eletroforética possibilita a detecção mesmo de uma única mudança de base. Os fragmentos de DNA podem ser marcados ou detectados com sondas marcadas. A sensibilidade do ensaio pode ser intensificada pelo uso de RNA (ao invés de DNA), no qual a estrutura secundária é mais sensível para uma mudança na sequência. Em uma modalidade, o método sujeito utiliza a análise de heteroduplex para separar moléculas heteroduplex de filamentos duplos com base de mudanças na mobilidade eletroforética (Keen et al. (1991) Trend Genet. 7:5).
[00135]Ainda em outra modalidade, o movimento de fragmentos tipo selvagem ou mutante em géis de poliacrilamida contendo um gradiente de desnaturante é analisado usando eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Quando DGGE é usado como o método de análise, o
DNA será modificado para garantir que o mesmo não desnatura completamente, por
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54/74 exemplo, pela adição de um grampo GC de aproximadamente 40 bp de DNA rico em
GC de alta fusão por PCR. Em uma modalidade adicional, um gradiente de temperatura é usado no lugar de um gradiente de desnaturação para identificar as diferenças na mobilidade do DNA de controle e da amostra (1987), (Rosenbaum e Reissner
Biophys. Chem. 265:12753).
[00136]Exemplos de outras técnicas para detectar mutações pontuais incluem, mas não estão limitados a, hibridização seletiva de oligonucleotídeo, amplificação seletiva ou extensão seletiva de iniciadores. Por exemplo, os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser preparados em que a mutação conhecida é colocada centralmente e então hibridizada para DNA alvo mediante condições que permitam a hibridização somente se uma combinação perfeita é encontrada (Saiki et al. (1986) Nature 324:163; Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 86:6230). Esses oligonucleotídeos específicos de alelos são hibridizados para DNA alvo amplificados por PCR ou uma série de diferentes mutações, quando os oligonucleotídeos estão fixos à membrana de hibridização e hibridizado com o DNA alvo marcado.
[00137]Como alternativa, a tecnologia de amplificação específica para alelo que depende de amplificação de PCR seletiva pode ser usada em conjunto com a presente invenção. Os oligonucleotídeos usados como iniciadores para amplificação específica podem proceder a mutação de interesse no centro da molécula (para que a amplificação dependa da hibridização diferencial) (Gibbs et al. (1989) Nucl. Ácidos Res. 17:2437) ou na extremidade do extremo 3’ de um iniciador onde, mediante condições apropriadas, o desemparelhamento pode impedir, ou reduzir a extensão da polimerase (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Além disso, pode ser desejável a introdução de um novo sítio de restrição na região de mutação para criar detecção com base em divagem (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). É antecipado que, em certas modalidades a amplificação também pode ser realizada usando Taq ligase para amplificação (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 88:189). NesPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 70/121
55/74 ses casos, a ligação só ocorrerá se houver uma combinação perfeita na extremidade 3' da sequência 5' tornando possível detectar a presença de uma mutação conhecida em um local específico pela procura da presença ou ausência de amplificação.
[00138]Deve ser entendido que as modalidades da presente invenção que foram descritas são meramente ilustrativas de algumas das aplicações dos princípios da presente invenção. Várias modificações podem ser feitas por aqueles versados na técnica com base nos ensinamentos aqui apresentados sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo da invenção. O conteúdo de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido é aqui incorporado por referência na sua totalidade para todos os propósitos.
[00139]0s exemplos a seguir são definidos como sendo representativos da presente invenção. Esses exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção uma vez que estas e outras modalidades equivalentes serão evidentes em vista da presente divulgação, figuras e reivindicações que o acompanham.
Exemplo 1
Método I Representativo para a Separação de Células Fagocíticas das Células não Fagocíticas e Análise de Perfis de Expressão
1. Com referência as Figuras 2 e 3, as revestir as placas com avidina.
2. Adicionar anticorpo biotinilado para células não fagocíticas do sangue (por exemplo, células T) para os poços, incubar por 30 minutos a Temperatura Ambiente (RT), lavar os poços.
3. Adicionar as esferas magnéticas.
4. Adicionar amostra de WBC de sangue.
5. Incubar a 37°C (30 minutos -1 hora).
6. Após fagocitose das esferas por células fagocíticas e ligação de anticorpos-avidina-biotina as células não fagocíticas, colocar a placa no topo do ímã e lavar
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56/74 (as células fagocíticas que interiorizaram as esferas magnéticas e as células não fagocíticas ligadas ao anticorpo ficarão; todas as outras células serão lavadas).
7. Remover o ímã e coletar as células fagocíticas.
8. Isolar o RNA das células fagocíticas (por exemplo, células ligadas a uma esfera magnética) e das células não fagocíticas (por exemplo, as células fixas no fundo dos poços por meio de anticorpo ligado a avidina biotinilado com anti-célula não fagocítica), preparar cDNA, cRNA e usar para diferenciar os perfis genéticos (por exemplo, matrizes gene inteiro e/ou matrizes de gene do câncer) das células fagocíticas e não fagocíticas.
9. Isolar o DNA de cada amostra de célula e identificar assinaturas de DNAtumor seletivamente presentes nos fagócitos (ou seja, ausente em não fagócitos) e comparar os perfis (por exemplo, matrizes de gene total, mutações de DNA e/ou SNPs obtidos em células fagocíticas e não fagocíticas).
10. Isolar a proteína de cada amostra de células, executar Western blot usando anticorpos para proteínas superexpressas conhecidas por tumores humanos (por exemplo, PSMA e PSA no câncer de próstata; CEA no câncer de cólon e Ca125 em câncer de ovário), e comparar os perfis obtidos em células fagocíticas e não fagocíticas. Alternativamente, usar espectroscopia de massa para identificar as proteínas.
11. Isolar lipídeos a partir de cada amostra de células e comparar a quantidade e a qualidade, por exemplo, usando HPLC.
Exemplo 2
Método II Representativo para a Separação de Células Fagocíticas das Células não Fagocíticas e Análise de Perfis de Expressão
1. Com referência as Figuras 2 e 3, lisar de RBCsa em amostra de sangue.
2. Centrifugar em Cytospin WBC em lâminas de vidro.
3. Fixar células em acetona / metanol (-20°C por 5 minutos).
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4. Colorir com corante de hematoxilina e eosina e anticorpos anti célula T.
5. Isolar células T (não fagocíticas) e macrófagos (fagocíticas) usando microscopia de captura a laser (LCM).
6. Isolar RNA de células fagocíticas e de células não fagocíticas, preparar cDNA, cRNA e usar para diferenciar os perfis genéticos (por exemplo, matrizes de gene do câncer e/ou matrizes de genes totais) das células fagocíticas e não fagocíticas.
7. Isolar o DNA de cada amostra de células, executar matrizes de DNA, e comparar os perfis (por exemplo, mutações no DNA, matrizes de genes totais e/ou SNPs) obtidos em células fagocíticas e não fagocíticas.
8. Isolar a proteína de cada amostra de células, executar Western blot usando anticorpos para proteínas conhecidas superexpressas por tumores de humanos (por exemplo, PSMA e PSA no câncer de próstata, CEA no câncer de cólon e CA125 no câncer de ovário), e comparar os perfis obtidos em células fagocíticas e não fagocíticas. Alternativamente, o uso de espectroscopia de massa para identificar as proteínas.
9. Isolar lipídeos a partir de cada amostra de células e comparar a quantidade e a qualidade, por exemplo, usando HPLC.
Exemplo 3
Método III Representativo para a Separação de Células Fagocíticas das Células não Fagocíticas e Análise de Perfis de Expressão
1. Com referência as Figuras 2 e 3, lisar RBC de uma amostra de sangue.
2. Usar esferas magnéticas conjugadas com anticorpos para isolar células não fagocíticas (por exemplo, células T) e fagocíticas (por exemplo, neutrófilos e/ou macrófagos e/ou monócitos) de sangue total.
3. Isolar o RNA de cada amostra de célula, preparar cDNA, cRNA e usar para diferenciar os perfis genéticos (por exemplo, matriz do gene do câncer) das céluPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 73/121
58/74
Ias fagocíticas e não fagocíticas.
4. Isolar o DNA de cada amostra de células, executar as matrizes de DNA, e comparar os perfis obtidos nas células fagocíticas e não fagocíticas.
5. Isolar a proteína de cada amostra de células, executar Western blot usando anticorpos para proteínas conhecidas superexpressas por tumores de humanos (por exemplo, PSMA e PSA no câncer de próstata, CEA no câncer de cólon e CA125 no câncer de ovário), e comparar os perfis obtidos em células fagocíticas e não fagocíticas. Alternativamente, o usar espectroscopia de massa para identificar as proteínas.
6. Isolar lipídeos a partir de cada amostra de células e comparar a quantidade e qualidade, por exemplo, usando HPLC.
Exemplo 4
Método IV Representativo para a Separação das Células Fagocíticas de Células não Fagocíticas e Análise de Perfis de Expressão
1. Com referência as Figuras 2 e 3, colorir o WBC com anticorpos fluorescentes específicos contra uma subpopulação de células particular (por exemplo, neutrófilos, macrófagos, monócitos, células T e semelhantes).
2. Separar as células (por exemplo, por FACS).
3. Isolar o RNA de cada amostra de células, preparar cDNA, cRNA e usar para diferenciar os perfis genéticos (por exemplo, matriz do gene do câncer) de células fagocíticas e não fagocíticas.
4. Isolar o DNA de cada amostra de células, executa matrizes de DNA, e comparar os perfis obtidos nas células fagocíticas e não fagocíticas.
5. Isolar a proteína de cada amostra de células, executar Western blot usando anticorpos para proteínas conhecidas superexpressas por tumores de humanos (por exemplo, PSMA e PSA no câncer de próstata; CEA no câncer de cólon e CA125 no câncer de ovário), e comparar os perfis obtidos em células fagocíticas e
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59/74 não fagocíticas. Alternativamente, usar espectroscopia de massa para identificar as proteínas.
6. Isolar lipídeos a partir de cada amostra de células e comparar a quantidade e a qualidade, por exemplo, usando HPLC.
Exemplo 5
Método V Representativo para a Separação das Células Fagocíticas de Células não Fagocíticas e Análise de Perfis de Expressão
1. Com referência as Figuras 5 e 6, colorir o WBC com anticorpos fluorescentes para cada subpopulação de células (por exemplo, neutrófilos, macrófagos, monócitos e células T) e, em seguida, colorir com corante de DNA (por exemplo, iodeto de propídio).
2. Separar as células (FACS) em células T, neutrófilos (2n), neutrófilos (> 2n), macrófagos (2n), macrófagos (> 2n), monócitos (2n) e monócitos (> 2n).
3. Isolar RNA de células T, neutrófilos (> 2n), macrófagos (> 2n) e monócitos (> 2n). A seguir, preparar cDNA, cRNA e usar para diferenciar os perfis genéticos (por exemplo, matriz do gene do câncer) das células fagocíticas e não fagocíticas.
4. Isolar o DNA das células T, neutrófilos (> 2n), macrófagos (> 2n) e monócitos (> 2n). Executar matrizes de DNA e comparar os perfis obtidos nas células fagocíticas e não fagocíticas.
5. Isolar a proteína das células T, neutrófilos (> 2n), macrófagos (> 2n) e monócitos (> 2n). Executar Western blots usando anticorpos para proteínas conhecidas superexpressas por tumores de humanos (por exemplo, PSMA e PSA no câncer de próstata; CEA no câncer de cólon e Ca125 no câncer de ovário) e comparar os perfis obtidos nas células fagocíticas e não fagocíticas. Alternativamente, usar espectroscopia de massa para identificar as proteínas.
6. Isolar lipídeos a partir de células T, neutrófilos (> 2n), macrófagos (> 2n) e monócitos (> 2n). Comparar a quantidade e a qualidade dos lipídeos, por exemplo,
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60/74 usando HPLC
Exemplo 6
Método VI Representativo para Separação de Células Fagocíticas e Análise de Perfis de Expressão
1. Com referência as Figuras 5 e 6, colorir o WBC com anticorpos fluorescentes específicos contra uma ou mais células fagocíticas (por exemplo, neutrófilos, macrófagos ou monócitos) e colorir com corante de ligação de DNA (por exemplo, iodeto de propídio).
2. Separar as células (FACS) em fagócitos 2n e > 2n.
3. Isolar RNA de cada um dos fagócitos 2n e > 2n. Preparar cDNA, cRNA e usar para diferenciar os perfis genéticos (por exemplo, matriz do gene do câncer) de células fagocíticas 2n e fagocíticas > 2n.
4. Isolar DNA de cada um dos fagócitos 2n e > 2n. Executar matrizes de DNA e comparar os perfis obtidos a partir de células fagocíticas 2n e fagocíticas > 2n.
5. Isolar proteínas de cada um dos fagócitos 2n e > 2n. Executar Western blots usando anticorpos para proteínas conhecidas superexpressas por tumores de humanos (por exemplo, PSMA e PSA no câncer de próstata, CEA no câncer de cólon e CA125 no câncer de ovário), e comparar os perfis obtidos a partir de células fagocíticas 2n e fagocíticas > 2n.
6. Isolar lipídeos de cada um dos fagócitos 2n e > 2n. Comparar a quantidade e a qualidade dos lipídeos, por exemplo, usando HPLC.
Exemplo 7
Detecção de Assinaturas específicas de tumor do gene em Fagócitos Obtidos a partir de Camundongos Portadores de Tumor [00140]De acordo com as modalidades da presente invenção, métodos são fornecidos para diferenciar entre assinaturas de ruído não-específico normal e tuPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 76/121
61/74 mor-específico e/ou doença específica no sangue ou outros fluidos corporais. Os perfis de expressão gênica a partir de monócitos, macrófagos e neutrófilos do sangue de camundongos portadores de tumor foram comparados com os das células T não fagocítica dos mesmos camundongos doadores, para identificar assinaturas específicas de tumor no interior das células fagocíticas que não foram expressas ou significativamente diferenciadamente expressas em células não fagocíticas dos mesmos camundongos portadores de tumor e de animais não portadores de tumor.
[00141]Células Humanas de Câncer da Próstata LNCaP [00142]Camundongos nude atímicos (n = 5) foram injetados por via subcutânea (s.c.) com células humanas de câncer da próstata LNCaP. Vinte e sete dias depois (tamanho do tumor = ~ 0,4 cm), os camundongos foram sangrados por punção cardíaca (~ 1 mL / camundongo) em tubos contendo EDTA, que foram então centrifugados. O sangue periférico (buffy coat) foi isolado e lavado, e os neutrófilos, macrófagos e células T foram separados, usando, respectivamente, neutrófilos anticamundongo, macrófagos e Dynabeads imunomagnéticas de células T. O RNA foi isolado a partir de cada amostra de células (triazol®). A qualidade do RNA foi determinada como mostrado na Figura 3. O rendimento de RNA é mostrado na Figura 20. O cDNA e cRNA biotinilado (cRNA-B) foram preparados. Finalmente, as amostras de cRNA-B foram incubadas com micromatrizes de gene do câncer humano (Oligo GEArray® Human Câncer PathwayFinder Microarray - SST-033 - SuperArray Bioscience). Após a hibridização, as membranas foram lavadas e coradas com avidinafosfatase alcalina e os genes foram detectados por quimioluminescência (filme de raios-X).
[00143]Tumores de Adenocarcinoma de Cólon Humano LS174T, Células de Carcinoma LLC1, Células de Melanoma de Camundongo B16F10 [00144]Experimentos semelhantes foram realizados com células isoladas de camundongos nude atímicos (n = 5) injetados s.c. com tumores de adenocarcinoma
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62/74 do cólon humano LS174T (tamanho do tumor = ~ 0,3cm), camundongos C57B1 (n =
5) injetados s.c. com células de carcinoma pulmonar de Lewis de camundongos LLC1 (tumor de tamanho = -0,6 cm), e camundongos C57B1 (n = 5) injetados por via intravenosa, 22 dias mais cedo, com 106 células de melanoma de camundongo B16F10 (quando as células do tumor eram de origem de camundongo, as amostras de cRNA-B foram hibridizadas com Oligo GEArray® Mouse Câncer PathwayFinder Microarray - OMM-033 - SuperArray Bioscience). O RNA também foi isolado a partir do crescimento exponencial LS174T, LLC1, B16F10 e as células LNCaP na cultura e a partir de neutrófilos, macrófagos e células T isoladas de camundongos C57B1 e nude não portadores de tumor, e seus perfis de gene relacionados com câncer foram determinadas.
[00145]De acordo com os dados obtidos a partir desses experimentos e mostrados nas Figuras 9-17, os neutrófilos e macrófagos - obtidos de camundongos injetados com células de próstata humana ou tumor de cólon e de camundongos portadores de câncer do pulmão ou melanoma - têm várias assinaturas de genes relacionadas ao câncer que também são encontradas em suas células tumorais respectivas. Estes genes relacionados ao câncer não foram expressos ou foram minimamente expressos por (i) células T não fagocíticas isoladas de camundongos portadores de tumor, e (ii) neutrófilos e macrófagos fagocíticos obtidos de camundongos não portadores de tumor.
[00146]Por exemplo, os neutrófilos isolados do sangue de camundongos nude portadores de células humanas de câncer da próstata LNCaP expressaram várias assinaturas de gene de tumor humano (Human Câncer PathwayFinder Microarray), que também foram expressas nas células LNCaP (comparar os perfis de matrizes nas Figuras 9 A e 9B ). Estes genes não foram expressos ou foram minimamente expressos nas células T obtidas de camundongos portadores de tumor ou neutrófilos isolados de camundongos normais (ver perfis nas Figuras 9C e 9D). Da mesma
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63/74 forma, os neutrófilos isolados do sangue de camundongos portadores de células de câncer de pulmão LLC1 expressaram várias assinaturas de gene de tumor de camundongo (Mouse Câncer PathwayFinder Microarray) que foram expressas nas células LLC1 (comparar os perfis das matrizes nas Figuras 13A e 13B).
[00147]Estes genes não foram expressos ou foram minimamente expressos nas células T obtidas de camundongos portadores de tumor ou neutrófilos isolados de camundongos normais (ver perfis mostrados nas Figuras 13C e 13D). Finalmente, as matrizes foram escaneadas, a intensidade de cada gene foi quantificada usando o software fornecido pela empresa e os genes superexpressos seletivamente por células fagocíticas foram identificados como mostrado nas Figuras 19 e 20. As Figuras 21 e 22 listam as assinaturas de genes adquiridos e exibidos diferencialmente pelas WBCs fagocíticas de camundongos portadores de tumor. Conforme mostrado na Figura 21, muitos oncogenes (genes descritos em vermelho, por exemplo, ERBB2 e Jun) foram detectados e, frequentemente eles foram expressos simultaneamente nos macrófagos e neutrófilos.
[00148]0s camundongos C57B1 (n = 5) foram injetados simultaneamente com células de carcinoma de pulmão de Lewis 1E6 de camundongo (LLC1). Vinte dias depois, os camundongos foram anestesiados e sangrados por punção cardíaca (aproximadamente 1 mL / rato) em um tubo contendo EDTA. Após centrifugação a 2000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente, o sangue periférico foi transferido para um tubo e lavado com PBS.
[00149]0s anticorpos IgG anti macrófago/monócito de camundongo (marcador monócitos / macrófagos - F4/80 - lgG2b de AbD Serotec, Raleigh, NC) foram incubados (temperatura ambiente por 30 minutos) com esferas magnéticas de anticorpos IgG anti-camundongo (DYNABEAD® anti-rat IgG de ovelhas da INVITROGEN™, Carlsbad, CA). As esferas anti-macrófago/monócito foram lavadas em PBS e armazenadas em gelo.
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64/74 [00150]Anti-rat IgG de neutrófilos de camundongo (neutrophil Marker NIMPR14 - lgG2a - Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foi incubado (temperatura ambiente por 30 minutos) com esferas magnéticas de anticorpo anti-rat IgG (DYNABEAD® anti- rat IgG de ovelha - INVITROGEN™), lavado em PBS e armazenado em gelo.
[00151]Esferas DYNABEAD® T mouse Pan (Thy 1.2) (INVITROGEN™) também foram lavadas em PBS e armazenadas em gelo.
[00152]0s macrófagos e monócitos do sangue de camundongos foram isolados a partir da suspensão de WBC preparada acima usando as esferas antimacrófago/monócito. Em essência, as esferas foram adicionadas à amostra de WBC e após a incubação (4°C por 30 minutos), as esferas de ligação de macrófagos foram isoladas usando um ímã e lavadas com PBS por três vezes e armazenadas em gelo.
[00153]As células T de camundongo foram então isoladas do restante de WBC. Resumidamente, as esferas de célula T anti-camundongo foram adicionadas à suspensão de WBCs, as amostras foram incubadas (4°C durante 30 minutos), as esferas ligadas a células T foram isoladas usando um ímã, lavadas com PBS e, armazenadas em gelo.
[00154]Finalmente, os neutrófilos dos camundongos foram isolados a partir da amostra de WBC restante. As esferas magnéticas de neutrófilos anticamundongo foram adicionadas as células e as amostras foram incubadas (4°C durante 30 minutos). As esferas de neutrófilos vinculados foram isoladas através de um ímã, lavadas com PBS e armazenadas em gelo.
[00155]0 RNA foi então isolado de cada amostra (usando TRIZOL®
INVITROGEN™, Carlsbad, CA). A qualidade do RNA foi determinada como mostrado na Figura 7. O rendimento de RNA é mostrado na Figura 8. Em seguida, os cDNA (biotinilado) foram preparados e incubados (60°C durante a noite) com microPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 80/121
65/74 matrizes de gene do câncer humano (Oligo GEArray® Human Câncer PathwayFinder Microarray OMM-033, SuperArray Bioscience, Frederick, MD). Após a hibridização, as membranas foram lavadas e coloridas com fosfatase avidina alcalina e os genes foram detectados por quimioluminescência (filme de raios-X).
[00156]Tumores de Adenocarcinoma de Cólon Humano LS175T, Carcinoma LLC1 e Células de Melanoma de Camundongo B16F10 [00157]Experimentos semelhantes foram realizados com células isoladas de camundongos nude atímicos (n = 5) injetados s.c. com tumores de adenocarcinoma de cólon humano LS174T (tamanho do tumor = ~ 0,3 cm), camundongos C57/B1 (n = 5) injetados s.c. com células de carcinoma pulmonar de Lewis de camundongo LLC1 (tumor de tamanho = ~ 0,6 cm), e os camundongos C57B1 (n = 5) foram injetados por via intravenosa, 22 dias mais cedo, com 106 células de melanoma de camundongo B16F10 (quando as células do tumor eram de origem de camundongo, as amostras de cRNA-B eram hibridizadas com o Oligo GEARRAY® Mouse Câncer PathwayFinder Microarray - OMM-033 - SuperArray Bioscience (quando os tumores eram de origem humana, o Oligo GEArray® Human Câncer PathwayFinder Microarray - SST-033 - foi usado). O RNA também foi isolado de crescimento exponencial de células LS174T, LLC1, B16F10 e LNCaP em cultura e a partir de neutrófilos, macrófagos e células T isolados dos camundongos C57B1 e nude não portadores de tumor e seus perfis de gene relacionado ao câncer foram determinados.
[00158]De acordo com os dados obtidos a partir desses experimentos e mostrado nas Figuras 9A-9D, 10A-10D, 11A-11D, 12A-12D, 13A-13D, 14A-14D, 15A-15D, 16A-16D, os neutrófilos e macrófagos (obtidos de camundongos injetados com células de próstata humana ou tumor de cólon e de camundongos portadores de câncer ou melanoma do pulmão de camundongo) tiveram várias assinaturas de gene relacionado ao câncer que também foram encontrados em suas respectivas células tumorais (Figura 21). Estes genes relacionados ao câncer não foram expresPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 81/121
66/74 sos ou foram minimamente expressos por (i) células T não fagocíticas isoladas de camundongos portadores de tumor, e (ii) neutrófilos e macrófagos fagocíticos obtidos de camundongos não portadores de tumor.
[00159]Por exemplo, os neutrófilos isolados do sangue de camundongos nude portadores de células humanas de câncer da próstata LNCaP expressaram sete assinaturas de gene de tumor humano (Human Câncer PathwayFinder Microarray), que também foram expressos nas células LNCaP (comparar os perfis das matrizes nas Figuras 9A e 9B ). Estes genes não foram expressos ou foram minimamente expressos nas células T obtidas de camundongos portadores de tumor ou neutrófilos isolados de camundongos normais (ver perfis nas Figuras 9C e 9D). Finalmente, as matrizes foram escaneadas, a intensidade de cada gene foi quantificada usando o software fornecido pela empresa e os genes superexpressos seletivamente por células fagocíticas foram identificados como mostrado nas Figuras 19 e 20. As Figuras 21 e 22 listam as assinaturas dos genes adquiridos e diferencialmente exibido por WBCs fagocíticas de camundongos portadores de tumor. Conforme mostrado na Figura 21, muitos oncogenes (por exemplo, ERBB2 e Jun) foram detectados e frequentemente eles foram expressos simultaneamente nos macrófagos e neutrófilos (mostrado pelos genes destacados em verde).
Exemplo 8
Detecção de Assinaturas de Genes Específicos de Tumor em Fagócitos Obtidos a partir de Pacientes com Câncer [00160]De acordo com certas modalidades da presente invenção, os perfis de expressão de gene de monócitos/macrófagos do sangue e neutrófilos de pacientes com câncer foram comparados com os das células T não fagocíticas dos indivíduos doadores, para identificar assinaturas específicas de tumor nas células fagocíticas que não foram expressas ou significativamente diferencialmente expressas em células não fagocíticas.
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67/74 [00161 ]Pacientes com Tumores de Cabeça e Pescoço [00162]Dez mililitros de sangue venoso foram obtidos (em um tubo contendo EDTA) de pacientes conhecidos por terem carcinoma de células escamosas do pescoço e agendados para a cirurgia. Após centrifugação a 2000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente, o sangue periférico foi transferido para um tubo e lavadas com PBS.
[00163]As células foram separadas usando Dynabeads® imunomagnéticas de rat anti-humano de células T-, neutrófilos-, e macrófago/monócito- da INVITROGEN™, Carlsbad, CA. Em essência, as esferas foram adicionadas à amostra de WBC e após a incubação individual (4°C por 30 minutos), as esferas de ligação de células T, neutrófilos e macrófagos/monócitos foram isoladas usando um ímã e lavadas com PBS por três vezes e armazenadas em gelo [00164]0 RNA foi então isolado de cada amostra (usando TRIZOL® INVITROGEN™, Carlsbad, CA). A qualidade do RNA foi determinada e cDNA e cRNA biotinilado (cRNA-B) foram preparados. Finalmente as amostras cRNA-B foram incubados (60°C durante a noite) com micromatrizes de gene do câncer humano (Oligo GEArray® Human Câncer PathwayFinder Microarray OMM-033, SuperArray Bioscience, Frederick, MD). Após a hibridização, as membranas foram lavadas e coloridas com fosfatase avidina alcalina e os genes foram detectados por quimioluminescência (filme de raios-X).
[00165]De acordo com os dados obtidos a partir desses experimentos, os neutrófilos e macrófagos (obtidos a partir de pacientes com câncer de cabeça e pescoço) tiveram várias assinaturas de gene relacionadas ao câncer que também foram encontradas em suas respectivas células tumorais. Estes genes relacionados ao câncer não foram expressos ou foram minimamente expressos por células T não fagocíticas.
[00166]Por exemplo, os neutrófilos isolados do sangue de um paciente, exPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 83/121
68/74 pressaram quatro assinaturas de gene de tumor humano (Human Câncer PathwayFinder Microarray), que também foram expressos na biópsia do tumor obtido a partir de um mesmo paciente (comparar os perfis das matrizes nas Figuras 17B e 17C). Estes genes não foram expressos ou minimamente expressos em biópsia de pele normal e nas células T isoladas da mesma amostra de sangue (ver perfis nas Figuras 17A e 17D, respectivamente). Finalmente, as matrizes foram escaneadas, a intensidade de cada gene foi quantificada usando o software fornecido pela empresa, e os genes seguintes que foram superexpressos (> 2 vezes) seletivamente por células fagocíticas foram identificados: homólogo de oncogene viral E26 (ETS2), proteína interativa Tat do HIV-1 (HTAT1P2), IL8 (ativação de neutrófilos e quimiotaxia), oncogene Jun (JUN), e matriz de metaloproteinase 9 (MMP9).
[00167]Pacientes com Câncer de Ovário [00168]Experimentos semelhantes foram realizados com células isoladas de um paciente com câncer de ovário. De acordo com os dados obtidos a partir desses experimentos, os neutrófilos e macrófagos (obtidos a partir da mulher doente) expressou muitos genes relacionados ao câncer que não foram expressos ou foram minimamente expressos por células não T fagocíticas.
[00169]Por exemplo, os macrófagos isolados de sangue do paciente com câncer de ovário expressaram 23 assinaturas de gene de tumor de humano (Human Câncer PathwayFinder Microarray) que não foram expressas ou foram minimamente expressas em células T isoladas a partir da mesma amostra de sangue (comparar de perfis das Figuras 18A e 18B). Finalmente, as matrizes foram escaneadas, a intensidade de cada gene foi quantificada usando o software fornecido pela empresa e a intensidade de cada gene de câncer relacionado com cada tipo de célula foi determinada. A lista de 23 genes relacionados ao câncer diferencialmente sobrerregulados/superexpressos em macrófagos, bem como as razões de intensidade de macrófagos para célula T são ambas mostradas na Figura 22. Note-se que um total de
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69/74 cinco oncogenes foram detectadas (mostrado em vermelho na Figura 21).
Exemplo 9
Detecção de Assinaturas de Proteínas Específicas de Tumor em Faqócitos
Obtidos a partir de camundongos portadores de tumores de próstata humano
LNCaP e tumores do cólon humano LS174T [00170]Um kit de purificação de proteínas (Norgen, Incorporated, Produto # 23500) foi usado para isolar e purificar proteínas de WBCs de camundongo, células T e macrófagos. O ensaio foi muito simples e rápido (cerca de 30 minutos) e as proteínas isoladas, que foram de alta qualidade e excelente rendimento (117,6 ± 10,60 pg por 4 ml de sangue, n = 5), poderiam ser usadas em várias aplicações a jusante, tais como análise de SDS-PAGE, tal como mostrado na Figura 23 e ensaio de Western blot.
[00171 ]As amostras de proteína foram isoladas das células fagocíticas (monócitos/macrófagos) e não fagocíticas (linfócitos T), obtidas a partir de camundongos portadores de tumores LS174T e LNCaP foram selecionadas para estes estudos uma vez que a linha celular formadora expressa PSA (Denmeade et al. ( 2001) Prostate 48:1; Lin et al. (2001) J. Urol. 166:1943) e a última exibe uma glicoproteína específico de tumor (TAG-72), uma mucina de alto peso molecular (Colcher et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 78:3199); Colcher et al. (1984) Câncer Res. 44:5744; Kassis et al. (1996) J. Nucl. Med. 37:343. A análise de Western blot foi realizada com 16 pg das amostras de proteína purificada. Em essência, cada amostra foi misturada com dois volumes de tampão de carregamento de SDS e foram executadas em SDS-PAGE10%, juntamente com padrão de proteína mais precisão sem coloração (BioRad) em tampão de Tris-glicina-SDS (pH 8,4) em 200 Volts. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (durante a noite a 4°C) usando um aparelho Mini Trans-Blot (BioRad) e um tampão de transferência contendo Tris 25 mM, pH 8,4, glicina 192 mM, e metanol 20%. A membrana foi bloqueada
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70/74 com 5% de leite desnatado seco (60 minutos em temperatura ambiente (RT)) e incubada (1 hora, RT), com ou B72.3, um anticorpo monoclonal de camundongo contra humano a TAG-72, ou ER-PR8, um anticorpo monoclonal contra a PSA humano. As manchas foram lavadas e incubadas com conjugado anti-camundongo HRP de cabra Immun-Star (Biorad), um anticorpo IgG secundário específico para camundongo e desenvolvido pela incubação (5 min, RT), com uma mistura de 1:1 de solução de luminol e tampão de peróxido (Biorad), seguida por autoradiografia.
[00172]0s dados indicaram claramente que as células fagocíticas de camundongos portadores de tumor LNCaP foram positivas para o PSA, considerando que esta proteína não pode ser detectada em células T não fagocíticas dos mesmos animais, como mostrado na Figura 24. Da mesma forma, TAG-72 foi expresso por monócitos/macrófagos obtidos de camundongos portadores de tumor LS174T e foram completamente ausentes nas células T dos mesmos animais. Estes resultados demonstram a “aquisição” e a expressão de assinaturas de proteínas específicas de tumor pelas células fagocíticas.
[00173]Embora esses dados sejam específicos para animais com câncer e células fagocíticas e não fagocíticas obtidas do sangue de camundongos, os métodos descritos também são úteis em humanos e no diagnóstico e/ou detecção de uma ou mais outras doenças e/ou distúrbios e com células fagocíticas e não fagocíticas obtidas a partir de outros fluidos corporais.
Exemplo 10
Experimentos de Caracterização [00174]lsolamento de Células Fagocíticas do Sangue [00175]Uma amostra de sangue é obtida de um paciente. O sangue (~ 5 ml_) será transferido para um tubo de 50 ml_ contendo 50 μΙ_ de EDTA 0,5M (concentração final de EDTA = ~ 4,8 mM). O tubo será vortexado suavemente e 25 ml_ de tampão de Lise RBC (Norgen, Incorporated) serão adicionados. O tubo será gentilmente
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71/74 vortexado novamente, incubado à temperatura ambiente até a cor da solução mudar para vermelho luminoso (3-5 min), e centrifugada a 2.000 rpm por 3 min. Após aspiração cuidadosa do sobrenadante, os WBCs serão lavados com 40 ml_ de PBS 0,1 M livre de Ca/Mg (contendo FBS 2%, EDTA2 mM e glicose 20 mM), e as células (106 / ml_) serão, então, incubadas (30 min, 4°C, no escuro) com uma solução de coloração de células contendo (i) o DNA, viável corante permeável em células viáveis da Hoechst 33342 (4 pg/ml_; Em = 483 nm) (ii) os anticorpos monoclonais humanos anti- monócitos/macrófagos (Alexa Fluor® conjugado-647; Em = 668 nm), que reconhece o antígeno F4/80 humano expresso por monócitos/macrófagos circulantes, e (iii) o anticorpo monoclonal de neutrófilos anti-humano (RPE-conjugado; Em = 578 nm), que reconhece neutrófilos humanos circulantes. As células serão então lavadas e separadas (BD FACSAria) em neutrófilos (Nn=2), neutrófilos (Nn>2), monócitos/ macrófagos (M / Mn= 2) e monócitos / macrófagos (M / Mn> 2).
[00176]Caracterização de gene [00177]A caracterização de gene no genoma completo humano será realizada. Para as amostras de RNA obtidas de células tumorais humanas ou neutrófilos (Nn = 2, Nn>2) e monócitos / macrófagos (M/Mn=2, M/Mn> 2), 0 GeneChip® Human Genome UI 33 Plus 2.0 Array de Affymetrix, Incorporado será usado. Esta matriz analisa 0 nível de expressão de mais de 47.000 transcritos e variantes, incluindo 38.500 genes humanos bem caracterizados. Em geral, 0 RNA extraído será usado para determinar os perfis de expressão de genes humanos usando a matriz acima mencionada. Para garantir a reprodutibilidade da matriz, cada amostra será caracterizada em triplicata e 0 experimento será repetido uma vez. Os dados de micromatriz serão filtrados para genes relacionados com a indução ao câncer, tal como descrito abaixo e validado usando quantitativo em tempo real, transcriptase reversa e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR).
[00178]Sobrerregulação/Subregulação de Genes Relacionados com a InduPetição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 87/121
72/74 ção ao Câncer [00179]0 RNA será isolado com triazol (Invitrogen, Incorporated) e purificado usando os cartuchos fornecidos no kit. A qualidade e a quantidade de RNA serão avaliadas com o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Incorporated, Paio Alto, CA) e software Degradometer versão 1.41 (Worldwide Web: dnaarrays.org). Estes resultados experimentais ajudarão a distinguir os percursos moleculares perturbados em consequência da presença de tumores.
[00180]Análise de Experimentos de Micromatrizes [00181 ]A análise de expressão molecular de larga escala/alta taxa de dados gerado dependerá fortemente da capacidade de (i) identificação de genes diferencialmente expressos em células fagocíticas com um conteúdo de DNA > 2, (ii) anotação dos genes identificados, e (iii) determinação dos genes anotados para aqueles especificamente expressos por um tumor específico. A análise estatística dos dados de micromatriz pode ser feita, por exemplo, usando o pacote dChip que acomoda facilmente este tipo de construção de listagem de gene em seu menu de “análise/ amostras de comparação”. Ao utilizar Affymetrix GeneChips, um ou mais Gene Chips e métodos associados serão aplicados para verificar a qualidade dos dados de micromatriz de matérias-primas (Gautier et al. (2004) Bioinformatics 20:307). Além disso, vários correções de fundo e procedimentos de normalização serão utilizados para chegar a um protocolo ideal para a normalização e sumarização dos conjuntos de sondas (para produzir valores de expressão) (Huber et al. (2002) Bioinformatics 18 (Suppl. 1): S96; Wu et al. (2004), Journal of the American Statistical Association 99:909; Seo e Hoffrnan (2006) BioMed Central de Bioinformatics 7:395). Em uma abordagem de filtração de duas etapas, serão comparados os perfis do gene Pn=2 para os de Pn> 2 e construída uma lista de genes expressos e, em seguida, serão comparados esses genes para os genes específicos de tumor identificados para cada linhagem de células tumorais após a filtração de perfil de gene P n=2, como
Petição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 88/121
73/74 mostrado na Figura 5. Por exemplo, (i) o sangue será obtido de pacientes com câncer de mama, (ii) os neutrófilos (n> 2 e n = 2), serão isolados e seus perfis de gene serão determinado em triplicata, (iii) a média (a partir de 3 amostras) de cada gene identificado e seu respectivo erro padrão (SE) será calculado para cada grupo (Nn> 2 e Nn= 2), (iv) os perfis de expressão de gene dos dois grupos serão comparados e uma lista (L-1) de genes expressos identificados com base em uma mudança absoluta > 2 vezes log da mudança de (Nn> 2/Nn = 2), de acordo com teste t de duas amostras modificado de Welch (v) os perfis de expressão de gene de Nn = 2 e 0 de câncer de mama (obtidos a partir de biópsias do tumor e tecido normal da mama) serão comparados e uma lista (L-2) de genes expressos será identificada, e (vi) as assinaturas do gene específico do câncer da mama que tenham sido adquiridas / expressas por Nn > 2 serão identificadas pela comparação dos genes em L1 e L-2 (análise / comparação de amostras / comparações de combinação”, dChip) e filtragem de genes comuns.
[00182]Caracterização de Proteína [00183]A caracterização de cinquenta a cem microgramas de proteína total de cada tipo de células será desnaturada e reduzida com tris-(2-carboxietil) fosfinatripsina (1 mM) e dodecil sulfato de sódio 0,02% a 60°C durante 1 hora. Cisteínas são posteriormente bloqueadas e a proteína total é digerida com tripsina a 37°C durante 12-16 horas. Os peptídeos resultantes serão marcados com iTRAQ (com tags 113-119 e 121) por uma hora (4 plexos ou 8 plexos, dependendo do número de tipos de células a ser comparado). Após a marcação, as amostras separadamente marcadas são combinadas e injetada em um sistema Agilent 1200 Series HPLC equipado com uma forte coluna de troca catiônica (A Applied Biosystems 4,6 x 100 poroso). As 96 frações recolhidas são então agrupadas em 14 frações, e cada fração é injetada no LC Packing Ultimate System HPLC para uma segunda rodada de fracionamento sob condições de fase reversa (Embalagens LC 15 cm x 75 pm de coluna
Petição 870180133125, de 21/09/2018, pág. 89/121
74/74 analítica). As frações de fase reversa são pintadas diretamente na placa-alvo usando um LC Packing Probot e são analisadas com espectrometria de massa (Applied Biosystems 4800 Plus Proteomics Analyzer). Na sequência de aquisição de dados, os espectros são processados usando o software ProteinPilot (Applied Biosystems Sciex MDS), e as proteínas individuais em cada um dos tipos celulares com seus níveis de expressão relativa são identificadas usando o software ProteinPilot™, (análise e identificação de assinaturas proteômicas associadas ao câncer serão semelhantes as descritas na Figura 5 para as assinaturas genômica)

Claims (26)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método in vitro para detectar a presença de uma célula de câncer em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:
    obter um primeiro perfil de expressão de uma célula fagocítica do sangue de um indivíduo;
    obter um segundo perfil de expressão de uma célula não-fagocítica do sangue do indivíduo;
    comparar o primeiro e o segundo perfis de expressão;
    identificar a expressão diferencial de um ou mais marcadores específicos para o primeiro perfil de expressão em comparação com o segundo perfil de expressão, o um ou mais marcadores sendo específicos para a presença de uma célula de câncer no indivíduo; e relacionar a expressão diferencial do um ou mais marcadores específicos para o primeiro perfil de expressão com a presença de uma célula de câncer no indivíduo.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais marcadores são selecionados do grupo que consiste em DNA, RNA, proteína, lipídeo, carboidrato e combinações dos mesmos.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula fagocítica do sangue é selecionada do grupo que consiste em um ou mais dentre um neutrófilo, um macrófago, um monócito, uma célula dendrítica e uma célula espumosa.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula não-fagocítica do sangue é selecionada do grupo que consiste em uma ou mais dentre uma célula T, uma célula B, uma célula nula e um basófilo.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são isoladas
    Petição 870190011194, de 02/02/2019, pág. 9/13
    2/5 do sangue total, urina, fezes, saliva, linfa ou fluido cerebrospinal.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são isoladas usando anticorpos.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são separadas por separação de células ativadas por fluorescência.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são separadas usando um ligante que se liga a um receptor molecular expresso na membrana plasmática de populações de WBC.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são separadas por um ou mais métodos selecionados do grupo que consiste em filtração, centrifugação com base em gradiente, eluição e microfluídicos.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são isoladas de uma população de células brancas do sangue.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são isoladas usando anticorpos.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são separadas por um ou mais métodos selecionados do grupo que consiste em separação de células ativadas por fluorescência, filtração, centrifugação com base em gradiente, eluição e microfluídicos.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato
    Petição 870190011194, de 02/02/2019, pág. 10/13
    3/5 de que a célula fagocítica do sangue e a célula não-fagocítica do sangue são separadas usando um ligante que se liga a receptores moleculares expressos na membrana plasmática de populações de WBC.
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem um ou mais dentre câncer oculto, câncer primário previamente diagnosticado e câncer metastático.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de relacionar a presença de um ou mais marcadores para a eficácia de uma terapia para câncer.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador é selecionado a partir de um ou mais dentre DNA, RNA e microRNA correspondendo a um ou mais dentre um gene de câncer, um oncogene e um gene supressor de tumor.
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador é um ou ambos dentre uma proteína e um polipeptídeo codificados por um ou mais dentre um gene de câncer, um oncogene e um gene supressor de tumor.
  18. 18. Método in vitro para identificar uma assinatura específica de tumor em um indivíduo tendo câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:
    obter um primeiro perfil de expressão de uma célula fagocítica do sangue de um indivíduo tendo câncer;
    obter um segundo perfil de expressão de uma célula não-fagocítica do sangue do indivíduo tendo câncer;
    comparar o primeiro e o segundo perfis de expressão;
    identificar a expressão diferencial de dois ou mais marcadores específicos para o primeiro perfil de expressão em comparação com o segundo perfil de expresPetição 870190011194, de 02/02/2019, pág. 11/13
    4/5 são; e relacionar a expressão diferencial dos dois ou mais marcadores específicos com uma assinatura específica de tumor no indivíduo tendo câncer.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que os dois ou mais marcadores são selecionados do grupo que consiste em DNA, RNA, proteína, lipídeo, carboidrato e combinações dos mesmos.
  20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que os dois ou mais marcadores são DNA ou RNA correspondendo a dois ou mais genes de câncer, oncogenes, genes supressores de tumor ou combinações dos mesmos.
  21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que os dois ou mais marcadores são proteínas ou polipeptídeos codificados por dois ou mais genes de câncer, oncogenes, genes supressores de tumor ou combinações dos mesmos.
  22. 22. Método in vitro para detectar a presença de uma célula de câncer em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:
    obter um primeiro perfil de expressão de uma célula fagocítica do sangue de um indivíduo;
    obter um segundo perfil de expressão de uma célula não-fagocítica do sangue do indivíduo;
    comparar o primeiro e o segundo perfis de expressão;
    identificar a expressão diferencial de um ou mais marcadores específicos para o primeiro perfil de expressão em comparação com o segundo perfil de expressão, o um ou mais marcadores sendo específicos para a presença de uma célula tumoral circulante ou fragmento subcelular da mesma no indivíduo; e relacionar a presença de uma célula tumoral circulante ou fragmento subcelular da mesma no indivíduo com a presença de uma célula de câncer no indivíduo.
    Petição 870190011194, de 02/02/2019, pág. 12/13
    5/5
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que um aumento na quantidade de um marcador no primeiro perfil de expressão em relação ao segundo perfil de expressão indica a presença de um ou ambos dentre uma célula tumoral circulante e um fragmento subcelular da mesma.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador é selecionado do grupo que consiste em DNA, RNA, proteína, lipídeo, carboidrato e combinações dos mesmos.
  25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador é selecionado do grupo que consiste em DNA, RNA, microRNA e combinações dos mesmos correspondendo a um gene de câncer, um oncogene, um gene supressor de tumor ou uma combinação dos mesmos.
  26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador é uma proteína ou polipeptídeo codificado por um gene de câncer, um oncogene, um gene supressor de tumor ou uma combinação dos mesmos.
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