EA020920B1 - Способ выявления злокачественной клетки у индивида - Google Patents

Способ выявления злокачественной клетки у индивида Download PDF

Info

Publication number
EA020920B1
EA020920B1 EA201070863A EA201070863A EA020920B1 EA 020920 B1 EA020920 B1 EA 020920B1 EA 201070863 A EA201070863 A EA 201070863A EA 201070863 A EA201070863 A EA 201070863A EA 020920 B1 EA020920 B1 EA 020920B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
phagocytic
cells
cell
tumor
expression
Prior art date
Application number
EA201070863A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201070863A1 (ru
Inventor
Амин И. Кассис
Original Assignee
Президент Энд Феллоуз Оф Гарвард Колледж
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Президент Энд Феллоуз Оф Гарвард Колледж filed Critical Президент Энд Феллоуз Оф Гарвард Колледж
Publication of EA201070863A1 publication Critical patent/EA201070863A1/ru
Publication of EA020920B1 publication Critical patent/EA020920B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5052—Cells of the immune system involving B-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Предложены варианты способа выявления злокачественной клетки у индивида, в частности когда индивид имеет одну или несколько доклинических форм рака, диагностированную первичную злокачественную опухоль и метастазирующий рак, а также способы и композиции для диагностики наличия злокачественной опухоли у индивида.

Description

Настоящее изобретение относится к способам идентификации маркеров состояний, таких как пол плода, или заболеваний, таких как геномные, протеомные, метаболомные, гликомные, гликопротеомные, липидомные и/или липопротеомные признаки опухоли, в клетках, полученных из жидкостей организма пациента.
Уровень техники
Опухоли возникают из нормальных клеток при накоплении генетических и эпигенетических изменений. Этот многостадийный процесс вовлекает множественные генетические изменения, которые ведут к постепенной трансформации нормальных клеток в злокачественный фенотип. Эти изменения заключаются в необратимых изменениях последовательности ДНК (например, мутациях, делециях, транслокациях) и ведут к активации онкогенов, инактивации генов супрессии опухоли и слиянию генов. Случайная природа этих событий приводит к генетической гетерогенности, которая обеспечивает молекулярные отпечатки трансформированных клеток (например, один или несколько компонентов клетки, таких как ДНК, РНК, белок, липид, углевод и т.п.), указывающих на злокачественную опухоль, которые приводят к их уникальным фенотипам. Таким образом, известно, что различными опухолями экспрессируются уникальные отличительные черты/признаки набора генов (Регои е! а1. (2000), №Дигс. 406:747; ЬоЬепйоГег е! а1. (2001), Неа1!й Регкрес!. 109:881; уап'! Уеет е! а1. (2002), Ыа!иге, 415:530 (2002); Ыойа аиб Койи (2003), №1. Сепе!. 33:10; Οίηοδ е! а1. (2004), Сапсег Кек. 64:55; Пи (2005), Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1 И8А, 102:3531; Спдопабй е! а1. (2006), Вгеак! Сапсег Кекеагсй, 8:К56).
Как первичные, так и метастатические опухоли могут быть бессимптомными и необнаруженными в течение нескольких лет. Однако эти латентные и скрытые опухоли, а также ранее диагностированные первичные и метастатические солидные опухоли каждые сутки теряют в кровоток приблизительно от 1 до 6 млн клеток/г опухоли. Большая часть этих циркулирующих опухолевых клеток, известных как СТС, претерпевает апоптоз и погибает, в то время как отдельные клеточные популяции могут приводить к метастазирующему заболеванию. Также в крови пациентов со злокачественной опухолью находятся апоптотические тельца, ДНК, нуклеосомы, РНК и белки опухолевых клеток. Но1тдтеп е! а1., В1ооб, 93, 3956 (1999). Были предприняты попытки для исследования того, можно ли идентифицировать признаки опухоли и можно ли их использовать для выявления или мониторинга злокачественных опухолей. См. КапкойоГГ, Ыа!иге Ке\1е\ук Сапсег, 5, 142 (2005) и МсЬеттап е! а1., С1ш. Сйет. 54, 44 (2008).
ДНК может легко трансфицироваться в различные эукариотические клетки, т.е. после того как она интернализуется в цитоплазму клеток, она способна встраивать свои гены в геном клетки-хозяина. Например, нейтрофилы и макрофаги могут трансфицироваться быстро и с высокой эффективностью (5090%). Также был продемонстрирован перенос ДНК из прокариотических клеток в эукариотические, и полагают, что он происходит от эукариотических клеток в эукариотические. ДНК, высвобожденная из опухолевых клеток, обладает высокой трансформирующей активностью. Добавление супернатанта среды культивированных опухолевых клеток к нормальным клеткам приводит к появлению стольких трансформированных очагов, сколько возникает после трансфекции клонированным геном гак, введенным в качестве преципитата с кальцием. Более того, когда здоровым крысам инъецировали плазму крыс с опухолью (таким образом, содержащую опухолевую ДНК), в ДНК их клеток легких был выявлен маркерный ген опухоли, т.е. в клетках легких транскрибировались гены опухоли.
Лейкоциты начинаются с плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге и развиваются либо по миелоидной линии (моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы), либо по лимфоидной линии (Т- и В-лимфоциты и естественные киллерные клетки). Основной функцией клеток миелоидного ростка (например, нейтрофилов и макрофагов) является фагоцитоз инфекционных организмов, нежелательных живых поврежденных клеток, стареющих и погибших клеток (апоптотических и некротических), а также выведение клеточного дебриса. Фагоциты из здоровых животных не размножаются и являются диплоидными, т.е. они имеют индекс ДНК, равный единице. В среднем, каждая клетка содержит <10 нг ДНК, <20 нг РНК и <300 нг белка.
В АВС здоровых доноров были выявлены различные паттерны вариабельности экспрессии генов, например паттерны, ассоциированные с типом клеток, полом, возрастом, межиндивидуальными отличиями и т.п. Например, ассоциированный с лимфоцитами кластер имеет 55 уникальных генов. В нейтрофилах также была описана значительная вариабельность экспрессии кластера из 52 уникальных генов. Гены в этом кластере могут быть сгруппированы в три семейства с возрастающей специфичностью: (ί) гены, повсеместно экспрессируемые во многих типах циркулирующих иммунных клеток; (и) гены, экспрессируемые клетками миелоидного ростка; и (ίίί) гены, специфичные к гранулоцитам.
Продолжительность жизни различных субпопуляций АВС варьирует от нескольких суток (например, нейтрофилы) до нескольких месяцев (например, макрофаги). Подобно другим типам клеток, лейко- 1 020920 циты стареют и в итоге погибают. В этом процессе старения фагоциты человека из крови и тканей (например, нейтрофилы) обладают всеми классическими маркерами запрограммированной гибели клеток (т.е. апоптоза), включая активацию каспазы, пикнотические ядра и фрагментацию хроматина. Эти клетки также экспонируют ряд меток для поглощения (например, фосфатидилсерин, сахара) на внеклеточных поверхностях их плазматических мембран. Следовательно, погибающие и погибшие клетки и их субклеточные фрагменты выводятся из тканей и крови другими фагоцитарными клетками.
Апоптоз фагоцитов ускоряется после их активации. Например, после поглощения нейтрофилами Б.аигеик на их плазматические мембраны выставляется фосфатидилсерин, тем самым вызывая их быстрый фагоцитоз макрофагами. Также было показано, что активированные моноциты связывают различные опухолевые клеточные линии с повышенными уровнями фосфатидилсерина.
Известно, что циркулирующие фагоцитарные клетки поглощают живые и погибшие СТС и их фрагменты в процессе, который приводит к повышению содержания ДНК (и других клеточных компонентов) фагоцитирующей клетки. Например, было показано, что апоптотические опухолевые клетки фагоцитируются макрофагами и дендритными клетками. Было показано, что вследствие такой фагоцитарной активности макрофаги крови, полученные от пациентов с раком предстательной железы, содержат значительно более высокие внутриклеточные уровни простат-специфического антигена (Р8А), чем макрофаги, полученные от пациентов с доброкачественными состояниями предстательной железы. См. НегАд е1 а1., СЬшса1 Ргок1а1е Сапсег, 3, 184 (2004) и НегАд е1 а1., Ргок1а1е, 62, 290 (2005). Полагают, что это является следствием фагоцитоза опухолевых клеток. Известно, что в материнской крови циркулируют стволовые клетки плода, ядросодержащие эритроциты, лимфоциты плода, а также значительные количества бесклеточных нуклеиновых кислот плода. См. СНеипд е1 а1., ΝηΙ. Оепе!. 14, 264 (1996).
Также было показано, что, когда апоптотические тельца (инкапсулированные в мембрану клеточные фрагменты), происходящие из клеток лимфомы Беркитта человека, культивируют с моноцитами (фагоцитарными) или сосудистыми гладкомышечными клетками (нефагоцитарными) человека, моноциты демонстрируют высокий процент специфичных к вирусу Эпштейна-Барр (ЕВУ), положительных по опухолевым генам клеток, в то время как гладкомышечные клетки проявляют частоту захвата и экспрессии приблизительно 0,01%.
Необходимы способы, которые обеспечивают раннюю диагностику наличия заболеваний (например, опухолей) у индивидов, например индивидов, о которых неизвестно, имеют ли они заболевание, или которые имеют рецидивирующее заболевание. Одной из задач настоящего изобретения является упрощение выявления специфичных для заболевания (например, опухолеспецифических) маркеров, например белков, РНК, ДНК, углеводов и/или липидов и т.п., в субпопуляциях лейкоцитов (АВС) у животного, включая человека.
Сущность изобретения
Варианты осуществления настоящего изобретения основаны на применении фагоцитов для определения наличия или отсутствия маркеров, ассоциированных с определенными заболеваниями или состояниями. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения фагоциты поглощают клетки, и/или их фрагменты, и/или компоненты, циркулирующие в крови, которые характерны для конкретного заболевания или состояния. Содержимое фагоцитов обеспечивает маркерный профиль заболевания или состояния, например по содержанию ДНК и/или белков в клетке или по экспрессии ДНК или белка клеткой. Сравнение профилей экспрессии ДНК фагоцитарными и нефагоцитарными АВС приводит к выявлению опухолеспецифических, специфичных для заболевания или специфичных к состоянию ДНК-признаков в фагоцитарных клетках, которые либо не экспрессируются, либо экспрессируются на сниженном уровне в нефагоцитарных клетках. Аналогично, профили экспрессии белков в фагоцитарных и нефагоцитарных АВС приводят к выявлению опухолеспецифических, специфичных для заболевания или специфичных к состоянию белковых признаков в фагоцитарных клетках, которые либо не экспрессируются, либо экспрессируются на сниженном уровне в нефагоцитарных клетках. Таким образом, в определенных вариантах осуществления способы по настоящему изобретению идентифицируют наличие солидных опухолей (например, первичных и метастатических очагов повреждения) у индивида, предположительно имеющего злокачественную опухоль, и/или идентифицируют наличие злокачественной опухоли перед проявлением патологических признаков или симптомов и выявляют рецидив заболевания. Согласно другим вариантам осуществления способы по настоящему изобретению позволяют диагностировать некоторые заболевания или другие состояния путем идентификации конкретных признаков из крови или другой жидкости организма.
Настоящее изобретение основано, частично, на открытии, что компоненты клеток крови, такие как фагоцитарные клетки и нефагоцитарные клетки, индивида идеально подходят для простой идентификации и дифференциации опухолеспецифических и нормальных неспецифических признаков и, таким образом, устранения исходного следствия естественных межиндивидуальных (например, возраст, пол, этническая принадлежность, состояние здоровья) и временных отклонений в экспрессии генов.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления предусмотрены способы идентификации опухолеспецифических и/или специфичных для другого заболевания признаков в АВС (полученных из крови или других жидкостей организма, например мочи, стула, слюны, лимфы, цереброспинальной
- 2 020920 жидкости и т.п.) индивида, предположительно имеющего злокачественную опухоль и/или одно или несколько других заболеваний или нарушений или состояний. Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают результаты для конкретного пациента, и они не зависят от популяционных средних профилей признаков и величин, полученных от здоровых контролей, т.е. исходный/фоновый признаки) является специфичным для геномного, протеомного, метаболомного, гликомного, гликопротеомного, липидомного и/или липопротеомного профиля(ей) оцениваемого индивида. Варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают персонализированное определение предрасположенности, скрининг, диагностику и мониторинг заболевания.
В определенных вариантах осуществления и ссылаясь на фиг. 1, настоящее изобретение основано на способности фагоцитарных клеток захватывать и поглощать жизнеспособные, погибающие и погибшие клетки (например, апоптотические клетки, некротические клетки), микроорганизмы (например, бактерии (например, Ктекейыа), вирусы, грибы, дрожжи, простейшие и т.п.), субклеточные частицы и/или их фрагменты (тельца Кахаля, клеточную мембрану, центриоли, центросомы, гемы, аппарат Гольджи, лизосомы, митохондрии, ядерную мембрану, ядра, ядрышко, параспеклы, проимелоцитарные лейкозные тельца (тельца РМЬ), рибосомы, шероховатую эндоплазматическую сеть, гладкую эндоплазматическую сеть, вакуоли, везикулы, микровезикулы и т.п.) и клеточный дебрис, например хромосомы, ДНК (ядерную и митохондриальную), экзоны, гены, интроны, белки, прионы, связывающие углеводы белки, гликопротеины, липопротеины, РНК, микроРНК, липиды, апоптотические тельца, ядра, микровезикулы, экзосомы, нуклеосомы, полиморфные интерфазные кариосомные ассоциации молекул (ΡΙΚΑ), спеклы сплайсинга и т.п.) и отсутствие этих характеристик в нефагоцитарных клетках. Таким образом, анализ ДНК (ядерной, митохондриальной), РНК, микроРНК, белков, прионов, связывающих углеводы белков, гликопротеинов, липидов, липопротеинов, апоптотических телец, ядер, микровезикул, экзосом и/или нуклеосом и/или профилей экспрессии фагоцитарных АВС и их сравнение с нефагоцитарными клетками, полученными из крови или других жидкостей организма того же донора, обеспечивают идентификацию опухолеспецифических и/или специфичных для заболевания признаков в фагоцитарной клетке (специфичный для пациента сигнал), которые либо не экспрессируются, либо экспрессируются на значительно отличающемся уровне в нефагоцитарных клетках (специфичный для пациента шумовой уровень). Поскольку фагоцитарные или нефагоцитарные клетки происходят из одной плюрипотентной стволовой клетки в костном мозге, вычитание не ассоциированного с опухолью/индуцированного профиля признаков (идентифицированного в нефагоцитарных клетках) из признаков фагоцитарных клеток позволяет идентификацию опухолеспецифических и/или специфичных для заболевания признаков в образце конкретного пациента, как представлено на фиг. 2. Согласно некоторым другим вариантам осуществления клеточный дебрис в жидкостях организма интернализуется энтозом (поглощение клеток), эндоцитозом и пиноцитозом.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения и ссылаясь на фиг. 3, образец крови получают от индивида, где образец крови включает фагоцитарные и нефагоцитарные клетки (например, АВС). Затем фагоцитарную клетку(и) (например, нейтрофилы, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, пенистые клетки) отделяют от нефагоцитарной клетки(ок) (например, Т-клеток, В-клеток, нуль-клеток, базофилов) различными способами, известными специалистам в данной области. В соответствии с настоящим изобретением фенотип АВС изменяют фагоцитозом живых/погибающих/погибших СТС (и их субклеточных фрагментов) и/или опухолеспецифических и/или специфичных для заболевания ДНК, РНК, белка, углевода и/или липидов, находящихся в крови. Фагоцитоз приводит к интернализации этих признаков опухоли и/или заболевания в фагоцитарную клетку и возможному встраиванию ДНК опухолевой клетки с ее опухолеспецифическими соматическими мутациями (или другими связанными с заболеванием мутациями) в ДНК нормальной фагоцитарной клетки (т.е. к трансфекции ею хромосом клетки-мишени). Последующая транскрипция трансфицированной ДНК фагоцитарных клеток в РНК и трансляция последней в белки приводят к фенотипу, отличающемуся от нефагоцитарных АВС.
Таким образом, сравнение с использованием геномных, протеомных, метаболомных, гликомных, гликопротеомных, липидомных и/или липопротеомных способов, известных специалистам в данной области, профилей экспрессии ДНК, РНК, белков и/или липидов в фагоцитарных и нефагоцитарных АВС (как показано на фиг. 3), полученных от индивида со злокачественной опухолью (и/или одним или несколькими другими заболеваниями), используют для идентификации опухолеспецифического (и/или специфичного для заболевания, и/или специфичного для состояния) признака(ов) и/или профиля(ей) селективно в фагоцитарных клетках, который подтверждает наличие скрытой опухоли(ей) (или других заболеваний или состояний) у индивида. В соответствии с настоящим изобретением вычитание профилей ДНК, РНК, белков, углеводов и/или липидов фагоцитарных клеток из профилей нефагоцитарных клеток обеспечивает способ идентификации (например, после геномного, протеомного, метаболомного, гликомного, гликопротеомного, липидомного и/или липопротеомного анализов) опухолеспецифических (и/или специфичных для заболевания) признаков в образце крови (и/или другом биологическом образце) конкретного пациента и означает наличие скрытой опухоли(ей) и/или другого заболевания, как представлено на фиг. 2.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления фагоцитарные и нефагоцитарные клетки,
- 3 020920 например, полученные из крови или одного или нескольких других биологических образцов (например, мочи, стула, слюны, лимфы, цереброспинальной жидкости и т.п.) разделяют. Поскольку фагоцитоз СТС (и их субклеточных фрагментов) фагоцитарными \УВС приводит к интернализации опухолевых клеток в цитоплазму фагоцитарных клеток, количество ДНК, РНК, белка, углевода и/или липида в фагоцитарных клетках может превышать их количество в нефагоцитарных клетках. Таким образом, сравнение количества и профиля этих компонентов между фагоцитарными и нефагоцитарными клетками используют в качестве признака злокачественной опухоли.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрен способ диагностики наличия злокачественной клетки у индивида. Способ включает стадии получения первого профиля экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида, получения второго профиля экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида, сравнения первого и второго профилей, идентификации дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии, и соотнесения дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии, с наличием злокачественной клетки у индивида.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрен способ идентификации опухолеспецифического признака у индивида, имеющего злокачественную опухоль. Способ включает стадии получения первого профиля экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида, имеющего злокачественную опухоль, получения второго профиля экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида, имеющего злокачественную опухоль, сравнения первого и второго профилей экспрессии, идентификации дифференциальной экспрессии двух или более маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии, и сопоставления дифференциальной экспрессии двух или более маркеров, специфичных для опухолеспецифического признака у индивида, имеющего злокачественную опухоль.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрен способ диагностики наличия злокачественной клетки у индивида, включающий стадии получения первого профиля экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида и получения второго профиля экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида. Способ включает стадии сравнения первого и второго профилей экспрессии, идентификации наличия циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента, специфичного для первого профиля экспрессии, и сопоставления наличия циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента с наличием злокачественной клетки у индивида. В некоторых аспектах повышение количества маркера в первом профиле экспрессии относительно второго профиля экспрессии указывает на наличие циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления и ссылаясь на фиг. 4-6, предусмотрен способ диагностики наличия злокачественной клетки у индивида, включающий стадии выделения популяции фагоцитарных клеток индивида и отделения фагоцитарных клеток 2п от фагоцитарных клеток >2п. Способ включает стадии получения первого профиля экспрессии из фагоцитарных клеток 2п, получения второго профиля экспрессии из фагоцитарных клеток >2п, сравнения первого и второго профилей экспрессии и идентификации дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии. Также способ включает стадию сопоставления дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии, с наличием злокачественной клетки у индивида.
В некоторых аспектах способов, описанных в настоящем документе, маркеры включают ДНК, РНК, микроРНК (например, ДНК или РНК, соответствующую гену злокачественной опухоли, онкогену, гену супрессии опухоли или любой их комбинации), белок (например, белок или полипептид, кодируемый геном злокачественной опухоли, онкогеном, геном супрессии опухоли или любой их комбинацией), липид, углевод и/или любую их комбинацию. В некоторых аспектах фагоцитарная клетка крови представляет собой нейтрофил, макрофаг, моноцит, дендритную клетку, эозинофил, пенистую клетку или любую их комбинацию. В некоторых аспектах нефагоцитарная клетка крови представляет собой Т-клетку, Вклетку, нуль-клетку, базофил или любую их комбинацию. В других аспектах фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови с использованием способов, известных специалистам в данной области, например с использованием антител. В других аспектах фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из популяции лейкоцитов с использованием способов, известных специалистам в данной области, таких как активированная флуоресценцией сортировка клеток (РЛС8). В других аспектах фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессированным на плазматических мембранах популяций \УВС. В других аспектах фагоцитарную клетку и нефагоцитарную клетку крови разделяют одним или несколькими способами, включающими фильтрацию, центрифугирование на основе градиента, элюирование, способы микрофлюидики и т.п. В некоторых аспектах индивид имеет одну или несколько из скрытой (например, латентной, недиагностированной, неявной или замаскированной) злокачественной опухоли, ранее диагностированной первичной злокачественной опухоли и метастатической злокачественной опухоли. В некоторых аспектах способ включает стадию сопоставления наличия одного или нескольких маркеров с эффективностью терапии злокачественной опухоли.
- 4 020920
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления описанные выше способы применяют для выявления, идентификации или диагностики наличия инфекционного агента или заболевания, отличного от злокачественной опухоли, путем сравнения профилей экспрессии фагоцитарных и нефагоцитарных клеток для определения дифференциальной экспрессии маркеров, характерных для инфекционного агента или заболевания, отличного от злокачественной опухоли. В другом аспекте один или несколько способов, описанных в настоящем документе, используют для выявления профилей ДНК, РНК, белков, углеводов и/или липидов патогенов (например, вирусов, бактерий, риккетсий, простейших, гельминтов, грибов, дрожжей и т.п.) и других заболеваний или патологий (например, болезни Альцгеймера, деменции, сердечной недостаточности, атеросклероза, артрита, генетических нарушений, заболеваний костей, желудочно-кишечных заболеваний, прионных заболеваний и инфекционных заболеваний).
В некоторых аспектах способов, описанных в настоящем документе, маркеры включают ДНК патогена, РНК патогена, белок патогена, полипептид патогена, липид патогена и любую их комбинацию. В некоторых аспектах инфекционный агент представляет собой вирус, бактерию, гриб, паразит, инфекционный белок и любую их комбинацию. В некоторых аспектах способ включает стадию соотнесения наличия одного или нескольких маркеров с эффективностью терапии от патогена.
Способы и композиции, описанные в настоящем документе, таким образом, обеспечивают простую идентификацию опухолеспецифических признаков в образце крови пациента, независимо от популяционных средних профилей признаков и величин, полученных от здоровых контролей. Конкретно, способы и композиции, описанные в настоящем документе, могут легко и экономично: (ί) идентифицировать наличие опухоли (первичных и метастатических очагов повреждения) у индивида перед проявлением патологических признаков и симптомов; (ίί) идентифицировать наличие опухоли (первичных и метастатических очагов повреждения) у индивида, предположительно имеющего злокачественную опухоль; и/или (ίίί) выявить рецидив опухоли (первичных и метастатических очагов повреждения) у индивида, проходящего/прошедшего различные способы лечения.
Таким образом, способы и композиции, описанные в настоящем документе, (ί) обеспечивают неинвазивный скрининг злокачественной опухоли; (ίί) позволяют диагностировать опухоли, особенно в наиболее ранние моменты времени; (ίίί) перемещают целенаправленное вмешательство(а) на значительно более ранний момент на пути прогрессии опухоли, тем самым предупреждая развитие метастатического заболевания; (ίν) осуществляют мониторинг раннего ответа на общепринятый или экспериментальный способ(ы) лечения; (ν) предсказывают ответ на общепринятый или экспериментальный способ(ы) лечения; (νί) упрощают выбор эффективного способа лечения, позволяя быструю идентификацию неэффективных способов лечения, побочные эффекты которых могут не соотноситься с ожидаемой пользой; (νίί) минимизируют неудобство и нетрудоспособность пациента; (νίίί) позволяют тесное сопряжение выявления, диагностики и лечения (например, персонализацию терапии злокачественной опухоли); (ίχ) обеспечивают предсказание и раннее выявление типа и стадии опухоли; (х) обеспечивают выбор терапии; (χί) определяют, является ли опухоль метастазирующей; (χίί) обеспечивают способы мониторинга заболеваний и (χίίί) обеспечивают способы прогноза заболеваний.
Краткое описание чертежей
Патент или заявка содержит по меньшей мере один рисунок, выполненный в цвете. Копии этого патента или публикации патентной заявки с цветным рисунком(ами) будут предоставлены патентным ведомством при запросе и осуществлении необходимой оплаты. Указанные выше и другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут полнее понятны из представленного ниже подробного описания иллюстративных вариантов осуществления, совместно с прилагаемыми фигурами.
На фиг. 1 схематично представлен предполагаемый каскад, ведущий к приобретению опухолеспецифических ДНК, РНК, белковых и/или липидных признаков фагоцитами после поглощения живых СТС, апоптотических СТС, фрагментированных СТС, опухолевой ДНК, РНК, белков и липидов, высвобожденных живыми и/или апоптотическими опухолевыми клетками. Следует отметить, что только фагоцитарные клетки (но не нефагоцитарные клетки) приобретают признаки опухоли.
На фиг. 2 схематично представлен аналитический способ, используемый для идентификации признаков злокачественной опухоли, экспрессированных в/из фагоцитарных клеток пациенток с раком яичника (ОС).
На фиг. 3 схематично представлена общая блок-схема одного варианта осуществления способа по изобретению.
На фиг. 4 схематично представлен предполагаемый каскад, ведущий к приобретению опухолеспецифических ДНК, РНК, белковых и липидных признаков фагоцитами крови после поглощения живых СТС, апоптотических СТС, фрагментированных СТС, опухолевой ДНК, РНК, белков и липидов, высвобождаемых жизнеспособными и/или апоптотическими опухолевыми клетками. Следует отметить, что содержание ДНК в фагоцитах после фагоцитоза составляет >2п.
На фиг. 5 схематично представлены аналитические подходы, используемые для идентификации признаков рака молочной железы (ВС) у животных, имеющих ВС.
- 5 020920
На фиг. 6 схематично представлена общая блок-схема другого варианта осуществления способа по изобретению.
На фиг. 7 представлен анализ с помощью гель-электрофореза тотальной РНК, выделенной из клеток
1,\СаР и ЬЬС1.
На фиг. 8 приведен выход и количество РНК, полученной из лейкоцитов мышей (\МВС).
На фиг. 9Ά-Ό представлены чипы, на которых показаны семь активированных (в >2 раз) связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в нейтрофилах мышей пибе с опухолью ЬМСаР (рак предстательной железы человека).
(А) Опухоль ЬМСаР. (В) Нейтрофилы, полученные от мышей пибе, имеющих опухоли ЬМСаР (Ντ). (С) Т-клетки, полученные от мышей пибе, имеющих опухоли Ь-НСаР (ТТ). (Ό) Нейтрофилы, полученные от мышей пибе, не имеющих опухоли (Νν). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (Ό), и в нефагоцитарных Т-клетках (С). Экспрессия в Ντ в >2 раз превышала экспрессию в Νν и ТТ.
На фиг. 10Α-Ό представлены чипы, на которых показаны три активированных связанных со злокачественной опухолью гена, выявленных в макрофагах мышей пибе с опухолью Ь-НСаР (рак предстательной железы человека).
(А) Опухоль Ь-НСаР. (В) Макрофаги, полученные от мышей пибе, имеющих опухоли ^NСаР (МТ). (С) Т-клетки, полученные от мышей пибе, имеющих опухоли Ь-НСаР (ТТ). (Ό) Макрофаги, полученные от мышей пибе, не имеющих опухоли (ΜΝ). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (Ό), и в нефагоцитарных Т-клетках (С). Экспрессия в МТ в >2 раз превышала экспрессию в ΜΝ и ТТ.
На фиг. 11Α-Ό представлены чипы, на которых показаны четыре активированных (в >2 раз) связанных со злокачественной опухолью гена, выявленных в нейтрофилах мышей пибе с опухолью Ь8174Т (рак толстого кишечника человека).
(А) Опухоль Ь8174Т. (В) Нейтрофилы, полученные от мышей пибе, имеющих опухоли Ь8174Т (Ντ). (С) Т-клетки, полученные от мышей пибе, имеющих опухоли Ь8174Т (ТТ). (Ό) Нейтрофилы, полученные от мышей пибе, не имеющих опухоли (Νν). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (Ό), и в нефагоцитарных Т-клетках (С). Экспрессия в N в >2 раз превышала экспрессию в Νν и ТТ.
На фиг. 12Α-Ό представлены чипы, на которых показаны три активированных (в >2 раз) связанных со злокачественной опухолью гена, выявленных в макрофагах мышей пибе с опухолью Ь8174Т (рак толстого кишечника человека).
(А) Опухоль Ь8174Т. (В) Макрофаги, полученные от мышей пибе, имеющих опухоли Ь8174Т (МТ). (С) Т-клетки, полученные от мышей пибе, имеющих опухоли Ь8174Т (ТТ). (Ό) Макрофаги, полученные от мышей пибе, не имеющих опухоли (ΜΝ). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (Ό), и в нефагоцитарных Т-клетках (С). Экспрессия в МТ в >2 раз превышала экспрессию в ΜN и ТТ.
На фиг. 13Α-Ό представлены чипы, на которых показаны пять активированных (в >2 раз) связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в нейтрофилах мышей С57/В1 с опухолью ЬЬС1 (метастазирующий рак легкого мыши).
(А) Опухоль ЬЬС1. (В) Нейтрофилы, полученные от мышей С57/В1, имеющих опухоли ЬЬС1 (Ντ·). (С) Т-клетки, полученные от мышей С57/В1, имеющих опухоли ЬЬС1 (ТТ). (Ό) Нейтрофилы, полученные от мышей С57/В1, не имеющих опухоли (ΝΝ). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (Ό), и в нефагоцитарных Т-клетках (С). Экспрессия в N в >2 раз превышала экспрессию в ΝΝ и ТТ.
На фиг. 14Α-Ό представлены чипы, на которых показаны два активированных (в >2 раз) связанных со злокачественной опухолью гена, выявленных в макрофагах С57/В1 с опухолью ЬЬС1 метастазирующий рак легкого мыши.
(А) Опухоль ЬЬС1. (В) Макрофаги, полученные от мышей С57/В1, имеющих опухоли ЬЬС1 (МТ). (С) Т-клетки, полученные от мышей С57/В1, имеющих опухоли ЬЬС1 (ТТ). (Ό) Макрофаги, полученные от мышей С57/В1, не имеющих опухоли (М^). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, имеющих опухоль (Ό), и в нефагоцитарных Т-клетках (С). Экспрессия в МТ в >2 раз превышала экспрессию в ΜN и ТТ.
На фиг. 15Α-Ό представлены чипы, на которых показаны два активированных (в >2 раз) связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в нейтрофилах мышей С57/В1 с опухолью В16Р10 (ме- 6 020920 тастазирующая меланома мыши).
(А) Опухоль В16Р10. (В) Нейтрофилы, полученные от мышей С57/В1, имеющих опухоли В16Р10 (Ντ). (С) Т-клетки, полученные от мышей С57/В1, имеющих опухоли В16Р10 (ТТ). (Ό) Нейтрофилы, полученные от мышей С57/В1, не имеющих опухоли (Νν). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, не имеющих опухоль (Ό), и в нефагоцитарных Т-клетках (С). Экспрессия в Ντ в >2 раз превышала экспрессию в Νν и ТТ.
На фиг. 16Α-Ό представлены чипы, на которых показан один активированный (в >2 раз) связанный со злокачественной опухолью ген, выявленный в макрофагах С57/В1 с опухолью В16Р10 (метастазирующая меланома мыши).
(А) Опухоль В16Р10. (В) Макрофаги, полученные от мышей С57/В1, имеющих опухоли В16Р10 (МТ). (С) Т-клетки, полученные от мышей С57/В1, имеющих опухоли В16Р10 (ТТ). (Ό) Макрофаги, полученные от мышей С57/В1, не имеющих опухоли (ΜΝ). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей, имеющих опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах от мышей, имеющих опухоль (Ό), и в нефагоцитарных Т-клетках (С). Экспрессия в МТ в >2 раз превышала экспрессию в ΜΝ и ТТ.
На фиг. 17Α-Ό представлены чипы, на которых показаны пять активированных (в >2 раз), связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в нейтрофилах пациента с раком головы и шеи (плоскоклеточная карцинома).
(А) Биоптат нормальной ткани (кожи). (В) Биоптат опухолевой ткани. (С) Нейтрофилы, полученные из крови пациента (Ν·). (Ό) Т-клетки, полученные из крови пациента (ТТ). В круги заключены признаки, экспрессированные в опухолевых клетках (В) и в нейтрофилах из крови пациента (С) и минимально экспрессированные или неэкспрессированные в нормальной коже (А) или нефагоцитарных Т-клетках (Ό). Экспрессия в N в >2 раз превышала экспрессию в ТТ и коже.
На фиг. 18Α-Ό представлены чипы, на которых показаны 23 активированных (в >2 раз), связанных со злокачественной опухолью генов, выявленных в макрофагах пациентки с раком яичника (аденокарцинома).
(А) Макрофаги, полученные из крови пациента (МТ). (В) Т-клетки, полученные из крови пациента (ТТ). В круги заключены признаки, экспрессированные в макрофагах пациента (А) и минимально экспрессированные в нефагоцитарных Т-клетках (В). Экспрессия в МТ в >2 раз превышала экспрессию в ТТ.
На фиг. 19 представлен способ, использованный для идентификации признаков опухоли в фагоцитарных клетках. В этом примере количественно определяли интенсивность экспрессии ассоциированных со злокачественной опухолью генов в макрофагах, имеющих опухоль животных (МТ) по сравнению с интенсивностью их экспрессии в Т-клетках из тех же животных (ТТ), и идентифицировали гены, сверхэкспрессированные в >2 раз. Далее количественно определяли интенсивность всех экспресированных генов в МТ и сравнивали с генами в макрофагах, полученных от не имеющих опухоли животных (Мот) и идентифицировали гены, сверхэкспрессированные в >2 раз. Гены, общие для обоих списков, отбирали и сравнивали с генами, экспрессированными указанной опухолью (затемненная область).
На фиг. 20А, В представлено сравнение интенсивности экспрессии генов в (А) макрофагах (ММСаР), полученных от мышей иибе, имеющих опухоли предстательной железы человека ^NСаР, и в Т-клетках тех же животных (Т-клетках Ν(ΡΡαΡ), (В) в ММСаР и макрофагах, полученных от не имеющих опухоль животных (Мбез опухоли), (С) в нейтрофилах (Νρν&Ρ), полученных от мышей иибе, имеющих опухоли предстательной железы человека Б-ЖОР, и Т-клетках от тех же животных (Т-клетках шСаР), и (Ό) ЦЛ-С(.|Р и макрофагах, полученных от не имеющих опухоль мышей (Ν без опухоли). Гены, обозначенные красным цветом, сверхэкспрессировались в >2 раз; гены, обозначенные зеленым цветом, имели экспрессию, сниженную в >2 раз.
На фиг. 21 приведена экспрессия связанных со злокачественной опухолью генов в фагоцитарных нейтрофилах (Ν) и макрофагах (М).
На фиг. 22 приведены связанные со злокачественной опухолью гены, активированные (>2 раз) в фагоцитарных макрофагах пациентки с раком яичника по сравнению с нефагоцитарными Т-клетками.
На фиг. 23 представлен δΌδ (10%) гель-электрофорез белкового образца (5,9 мкг), полученного из АВС мыши.
На фиг. 24 представлен вестерн-блот анализ экспрессии ТАО-72 и РБА в Т-клетках и моноцитах/макрофагах (М/М), полученных от имеющих опухоль мышей, иллюстрирующий наличие признаков только в фагоцитарных клетках.
- 7 020920
Подробное описание некоторых вариантов осуществления
Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу предоставления индивидуального для пациента профиля экспрессии маркеров, ассоциированных с заболеваниями, инфекционными агентами и состояниями организма на основе клеточного содержимого и/или профилей экспрессии фагоцитарных клеток. Согласно одному аспекту настоящего изобретения клеточное содержимое и/или профили экспрессии фагоцитарных клеток сравнивают с известными маркерами конкретного болезненного состояния или расстройства для выявления и/или диагностики конкретного болезненного состояния или расстройства. Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения клеточное содержимое и/или профиль экспрессии фагоцитарных клеток сравнивают с клеточным содержимым и/или профилем экспрессии нефагоцитарных клеток из крови отдельного пациента. Вычитание клеточного содержимого и/или профиля экспрессии нефагоцитарных клеток из клеточного содержимого и/или профиля экспрессии фагоцитарных клеток дает клеточное содержимое и/или профиль экспрессии, репрезентативный только для болезненного состояния индивида.
Согласно дополнительному варианту осуществления настоящего изобретения получают популяцию фагоцитарных клеток индивида и клеточное содержимое и/или профиль экспрессии популяции, где содержание ДНК превышает 2п, сравнивают с клеточным содержимым и/или профилем экспрессии фагоцитарных клеток из той же популяции, где содержание ДНК составляет 2п. Согласно следующему дополнительному варианту осуществления настоящего изобретения получают популяцию фагоцитарных клеток индивида и профиль экспрессии популяции фагоцитарных клеток, где содержание РНК, белков, углеводов и/или липидов превышает норму и индекс ДНК превышает 1, сравнивают с профилем экспрессии фагоцитарных клеток из той же популяции, где содержание РНК, белков, углеводов и/или липидов является нормальным и/или индекс ДНК составляет 1.
Такой специфичный для пациента профиль экспрессии устраняет зависимость от среднего популяционного профиля признаков для конкретного заболевания или инфекционного агента, которая может вносить ошибку в выявление и диагностику конкретного заболевания у индивида. Такой индивидуальный для пациента профиль экспрессии для болезненного состояния по настоящему изобретению позволяет персонализованное выявление, диагностику и лечение у индивида.
Ссылаясь на фиг. 1-3 и согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, сравнивали профили экспрессии генов фагоцитарных и нефагоцитарных АВС, полученные от мышей, имеющих примерно трехнедельные подкожные (к.с.) опухоли человека (аденокарцинома предстательной железы ЬЫСаР или аденокарцинома толстого кишечника Ь8174Т) или опухоли мыши (метастазирующая меланома В16Р10, вводимая внутривенно, или рак легкого ЬЬС1, инъецированный подкожно). Результаты показали, что нейтрофилы и макрофаги, полученные от имеющих опухоль мышей, экспрессируют различные онкогены и другие связанные со злокачественной опухолью признаки, которые также экспрессируется в каждой из соответствующих опухолей. См. фиг. 9-16 и 19-21. Эти связанные со злокачественной опухолью гены и онкогены (например, ЕКВВ2, Лт. Рок и т.д.) не экспрессируются или экспрессируются на минимальном уровне (ί) нефагоцитарными Т-клетками, выделенными из мышей, имеющих опухоль, и (тт) нейтрофилами и макрофагами, полученными от не имеющих опухоли мышей. Более того, было выявлено, что опухолеспецифические белки экспрессируют только фагоцитарные клетки от имеющих опухоль мышей. См. фиг. 23 и 24. СТС, и/или опухолеспецифические ДНК, и/или белки в крови мышей фагоцитировались, и часть ДНК опухолевой клетки с опухолеспецифическими мутациями и генами встраивалась, вероятно, путем трансфекции (без связи с какой-либо теорией) в ДНК нормального фагоцита, транскрибировалась в РНК и транслировалась в белок.
Ссылаясь на фиг. 1-3 и согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления настоящего изобретения, также сравнивали профили экспрессии генов фагоцитарных и нефагоцитарных АВС, полученных от пациентов с опухолями головы и шеи или с раком яичника. Результаты показали, что нейтрофилы и макрофаги, полученные от этих пациентов, экспрессируют различные онкогены и другие связанные со злокачественной опухолью генные признаки, которые также экспрессируются в каждой из соответствующих опухолей. См. фиг. 17-18 и 22. Эти связанные со злокачественной опухолью гены и онкогены не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне нефагоцитарными Т-клетками, полученными от того же конкретного пациента. СТС и/или опухолеспецифическая ДНК и РНК в крови пациента фагоцитировались, и часть ДНК и/или РНК опухолевых клеток с ее опухолеспецифическими мутациями и генами встраивалась, вероятно, путем трансфекции (без связи с какой-либо теорией) в ДНК нормальных фагоцитов, транскрибировалась в РНК и транслировалась в белок.
Ссылаясь на фиг. 4-6 и согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления, количественный анализ профилей экспрессии ДНК (ядерной и/или митохондриальной), РНК, микроРНК, белка и/или липидов в фагоцитарных клетках (например, макрофагах), полученных из крови одного или нескольких других биологических образцов (например, мочи, стула, слюны, лимфы, цереброспинальной жидкости и т.п.), в которых (1) содержание ДНК составляет >2п (Рп>2) или (2) содержание РНК, белков, углеводов и/или липидов превышает норму, т.е. в клетках, которые осуществили фагоцитоз СТС и/или их субклеточных фрагментов или ДНК/РНК/липидов (т.е. опухолеспецифических признаков или других специфичных для заболевания признаков) и/или имеют индекс ДНК, превышающий единицу, и сравне- 8 020920 ние этих показателей с показателями той же популяции фагоцитарных клеток (например, макрофагов), в которых (1) содержание ДНК составляет 2п (Рп=2) или (2) содержание РНК, белков, углеводов и/или липидов является нормальным, т.е. клеток, которые не осуществляли фагоцитоз СТС и/или их субклеточных фрагментов и имеют индекс ДНК, равный единице, обеспечивает способ выявления опухолеспецифических (или специфичных для другого заболевания) признаков в клетках Рп>2 (специфичный для пациента сигнал), которые ранее не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне в клетках Рп=2 (специфичный для пациента шумовой уровень). Ссылаясь на фиг. 6, вычитание профилей ДНК, РНК, белков и/или липидов для Рп=2 из этих показателей для Рп>2, как показано на фиг. 5, обеспечивает способ идентификации (например, после одного или нескольких геномных, протеомных, метаболомных, гликомных, гликопротеомных, липидомных и/или липопротеомных анализов) опухолеспецифических (и/или специфичных для заболевания, и/или специфичных для состояния) признаков в образце крови (или в одном, или нескольких других биологических образцах, например, таких как другие жидкости организма) животного и/или человека со злокачественной опухолью (и/или заболеванием, и/или состоянием организма) и указывает на наличие скрытой опухоли(ей), и/или других заболеваний, и/или других состояний. В отличие от способов, описанных выше, в которых геномный, протеомный, метаболомный, гликомный, гликопротеомный, липидомный и/или липопротеомный профили фагоцитарных клеток сравнивают с профилями нефагоцитарных клеток, главными преимуществами этого аналитического способа выявления в соответствии с настоящим изобретением является то, что (ί) в нем используется одна субпопуляция фагоцитарных клеток в качестве источника опухолеспецифических (например, макрофаги Рп>2) и нормальных неспецифических (например, макрофаги Рп=2) признаков, т.е. в обоих случаях исходный генотип является одним и тем же; и (ίί) клетки, которые приобрели признак (например, нейтрофилы Рп>2), не разрежены клетками, которые не фагоцитировали и, таким образом не приобрели, погибшие СТС и/или их фрагменты (например, нейтрофилами Рп=2).
Ссылаясь на фиг. 4-6 и согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления, количественный анализ фагоцитарных клеток (например, макрофагов), полученных из крови или одного или нескольких других биологических образцов или жидкостей организма (например, мочи, стула, слюны, лимфы, цереброспинальной жидкости и т.п.), в которых внутриклеточное содержание вследствие фагоцитоза или интернализации других живых, погибающих или погибших (например, апоптотических или некротических) клеток, апоптотических телец, ядер, микровезикул, экзосом, нуклеосом, митохондрий, эндоплазматической сети и т.п., превышает их содержание в той же популяции фагоцитарных клеток (например, макрофагов) с нормальным внутриклеточным содержанием (Ротс), т.е. клеток, которые не фагоцитировали какие-либо из указанных выше клеток и клеточного дебриса (специфичный для пациента шумовой уровень), обеспечивает способ выявления опухолеспецифических (или специфичных для другого заболевания или другого состояния) признаков в фагоцитах с повышенным внутриклеточным содержанием (Р11с), которые ранее не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне в фагоцитах с нормальным внутриклеточным содержанием (специфичный для пациента шумовой уровень). Ссылаясь на фиг. 6, вычитание ДНК, РНК, белковых и/или липидных профилей Р2|с из профилей Рпс, как показано на фиг. 5, обеспечивает способ идентификации (например, после одного или нескольких геномных, протеомных, метаболомных, гликомных, гликопротеомных, липидомных и/или липопротеомных анализов) опухолеспецифических (и/или специфичных для заболевания) признаков в образце крови (или одном, или нескольких других биологических образцах, например, таких как другие жидкости организма) животного со злокачественной опухолью или другим заболеванием, и указывает на наличие скрытой опухоли(ей) и/или другого заболевания. В отличие от способов, описанных выше, в которых геномные, протеомные, метаболомные, гликомные, гликопротеомные, липидомные и/или липопротеомные профили фагоцитарных клеток сравнивают с профилями нефагоцитарных клеток, главными преимуществами этого аналитического способа выявления в соответствии с настоящим изобретением является то, что (ί) в нем используется одна субпопуляция фагоцитарных клеток в качестве источника специфичных для заболевания (например, макрофаги Р11с) и нормальных неспецифических (например, макрофаги Рмс) признаков, т.е. в обоих случаях исходный генотип является одним и тем же; и (ίί) клетки, которые приобрели признак (например, нейтрофилы Рпс), не разрежены клетками, которые не фагоцитировали, и, таким образом, не приобрели погибшие СТС и/или их фрагменты (например, нейтрофилами РМс)·
Способы, описанные в настоящем документе, (ί) имеют высокую специфичность, чувствительность и точность и должны обеспечивать выявление опухолеспецифических (и/или специфичных для другого заболевания) и нормальных неспецифических признаков, присутствующих в образце крови (или другом биологическом образце, например, таком как жидкость организма); и (ίί) устраняют неоднородность фона, которая, как известно, существует между индивидами вследствие имманентных (например, возраст, пол, этническая принадлежность, состояние здоровья и т.п.) и временных отклонений в экспрессии генов. Таким образом, в некоторых аспектах изобретение относится к неинвазивным способам анализа для раннего выявления скрытых первичных и метастазирующих опухолей (и/или одного или нескольких других заболеваний или состояний) у пациентов, т.е. до того, как заболевание может быть диагностировано общепринятыми способами визуализации (например, РЕТ, МКТ, СТ и т.п.), и, таким образом, оно
- 9 020920 обеспечивает основу для более точного принятия решения относительно необходимости во вмешательстве и его стратегии, профилактики и лечения индивидов со злокачественной опухолью.
Как используют в настоящем документе, термин опухолеспецифический маркер включает, но не ограничивается ими, один или несколько клеточных компонентов, таких как одна или несколько последовательностей ДНК, одна или несколько последовательностей РНК, один или несколько белков, один или несколько полипептидов, один или несколько липидов и т.п. В некоторых аспектах опухолеспецифический маркер присутствует в одном или нескольких АВС, например, таких как нейтрофил, макрофаг и/или дендритная клетка.
Как используют в настоящем документе, термин связанные со злокачественной опухолью гены относится к генам, например, таким как гены злокачественной опухоли, онкогены и/или гены супрессии опухолей, которые имеют измененную экспрессию (например, повышенную экспрессию или сниженную экспрессию по сравнению с незлокачественной клеткой) в злокачественной клетке (например, АВС, например, такой как макрофаг, нейтрофил, Т-клетка или сходные с ними). В данной области известно множество связанных со злокачественной опухолью генов. Связанные со злокачественной опухолью генов включают, например, но не ограничиваются ими, ЕРВВ2, ΐυΝ, КВ1, §ИРР1, ΜΌΜ2, МАР2К1, ММР2, ΡΌΟΡΒ, РЬАиК, РСК, МУСЫ, ВЬУМ, ΝΚΑ51, РЕ1, 8К1, ТКК, АВЬ2, МУСЦ КАВ1, КЕЬ, КАЬВ, ЬСО, ЕКВВ4, КАР1, ЕСТ2, К1Т, РСР5, СКО1, СКО2, СКО3, РМ8, Р1М, ККА81Р, ΡΥΝ, МУВ, КО81, МА81, КАЬА, МУСЬК1, СЬВ, АКАР2, МЕТ, ВКАР, МО8, ΕΥΝ, МУВЬ1, МУС, ОУС, УАУ2, ВМ11, КЕТ, НКА8, 8Р11, КЕЬА, 8ЕА, ЕМ81, ЕТ81, ККА82, ЕКВВ3, СЬ1, РЬТ, ВКСА2, КВ1, РО8, АКТ1, ЕЬК2, РЕ8, МАР, ТР53, СКК, ЕКВА1, ΝΡ1, ЕУ12, ЕКВВВ2, ЮТ4, ВКСА1, УЕ81, ΐυΝΏ, ШИВ, МЕЬ, ЬР8А, УАУ1, АКТ2, РО8В, ККА8, НКК1, НКК2, ЕКВАЬ2, 8КС, МУВЬ2, ЕТ82, ЕКС, АКАР1, УиА8А, Н82, ЮТ3, 8NО, КМУС, ВМУС, НКА8Р, ТС21, Т1М, РТ1-1, 1АК. один или несколько представителей семейства СЕА (см., например, ΖΙιοιι е! а1. (2001), Сепе 264:105), Р8А, МиС-16 и т.п.
Как используют в настоящем документе, термин злокачественная опухоль относится к различным типам злокачественных новообразований, большинство из которых могут инвазировать окружающие ткани и метастазировать в другие области (см., например, РОК МеШеа1 ОюОопагу, Г’1 еДйюп (1995), включенный в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме для любых целей). Термины новообразование и опухоль относятся к аномальной ткани, которая растет путем клеточной пролиферации более быстро, чем нормальная ткань, и продолжает расти после стимулов, которые предназначены для прекращения пролиферации. И. Такая аномальная ткань демонстрирует частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью, и она может быть либо доброкачественной (т.е. доброкачественная опухоль), либо злокачественной (т.е. злокачественная опухоль).
Примеры основных категорий злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, карциномы (т.е. злокачественные опухоли, происходящие из эпителиальных клеток, например, таких как распространенные формы рака молочной железы, предстательной железы, легкого и толстого кишечника), саркомы (т.е. злокачественные опухоли, происходящие из соединительной ткани или мезенхимных клеток), лимфомы (т.е. злокачественные опухоли, происходящие из кроветворных клеток), лейкозы (т.е. злокачественные опухоли, происходящие из кроветворных клеток), герминомы (т.е. опухоли, происходящие из тотипотентных клеток. У взрослых они часто встречаются в яичках и яичниках; у плодов, младенцев и детей раннего возраста они наиболее часто встречаются по средней линии тела, в частности на вершине крестца), бластные опухоли (т.е., как правило, злокачественная опухоль, которая сходна с незрелой или эмбриональной тканью) и т.п.
Примеры типов новообразований, охватываемых настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются ими, новообразования, ассоциированные со злокачественными опухолями нервной ткани, кроветворной ткани, молочной железы, кожи, кости, предстательной железы, яичников, матки, шейки матки, печени, легкого, головного мозга, гортани, желчного пузыря, поджелудочной железы, прямой кишки, паращитовидной железы, щитовидной железы, надпочечников, иммунной системы, головы и шеи, толстого кишечника, желудка, бронхов и/или почек.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, применяют для выявления, идентификации и/или диагностики нарушений, ассоциированных с наличием хромосомных нарушений у плода (например, синдрома Дауна, аутизма и сходных нарушений, являющихся разновидностями аутизма (включая, но не ограничиваясь ими, синдром Аспергера и аутистические расстройства - в остальных случаях), серповидноклеточной анемии, таляссемии и т.п.) благодаря наличию клеток плода и ДНК в материнской крови. Скрининг и диагностику одного или нескольких из этих нарушений можно проводить с использованием способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, для выявления одного или нескольких хромосомных маркеров, например ДНК и РНК и т.п., в фагоцитарных клетках материнской крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно применять для определения пола плода у беременной женщины путем выявления наличия протеомных, липидомных и/или геномных признаков плода в крови беременной женщины, поскольку известно, что стволовые клетки плода, ядросодержащие эритро- 10 020920 циты, лимфоциты плода, а также значительные количества бесклеточных нуклеиновых кислот плода, циркулируют в материнской крови. В соответствии со способами, описанными в настоящем документе, клеточное содержание и/или профиль экспрессии фагоцитарных клеток сравнивают с клеточным содержанием и/или профилем экспрессии нефагоцитарных клеток из крови беременной женщины. Вычитание клеточного содержания и/или профиля экспрессии нефагоцитарных клеток из клеточного содержания и/или профиля экспрессии фагоцитарных клеток обеспечивает клеточное содержание и/или профиль экспрессии, репрезентативный для пола плода, вынашиваемого беременной женщиной.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для выявления, идентификации и/или диагностики нарушений, ассоциированных с наличием протеомных и/или геномных признаков миоцитов в крови субъектов, имеющих риск развития заболевания сердца (например, инфаркта миокарда, хронической сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, смерти от сердечно-сосудистого заболевания и т.п.), путем выявления наличия погибающих/погибших миоцитов и/или их фрагментов (например, ДНК, белков и т.п.). Скрининг и диагностику одного или нескольких из этих нарушений проводят с использованием способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, для выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК и РНК, белка и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для выявления, идентификации и/или диагностики нарушений, ассоциированных с наличием протеомных, липидомных и/или геномных признаков в крови субъектов с атеросклерозом или имеющих риск развития атеросклероза вследствие сужения коронарной артерии, аневризмы абдоминального отдела аорты и т.п. Скрининг и диагностику этих нарушений можно проводить с использованием способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, для выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белка и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
Подтверждение отторжения биопсией, одним способов диагностики отторжения аллотрансплантата, является инвазивным и имеет проблему ошибок при заборе образцов. Таким образом, разработка неинвазивных анализов, которые выявляют молекулярные биомаркеры для диагностики и лечения отторжения трансплантированного органа, является полезной для лечения реципиентов трансплантата посредством (а) определения профиля до отторжения, которое позволит терапевтические вмешательства до того, как отторжение вызовет дисфункцию трансплантата, (Ь) повышения чувствительности и специфичности диагностики отторжения, (с) разработки новых систем классификации отторжения, которые улучшат прогноз, и (й) предоставления информации для разработки индивидуальных иммунодепрессивных режимов, которые могут предотвратить отторжение, минимизируя токсичность лекарственного средства.
Таким образом, в некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько из способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для выявления, идентификации или диагностики нарушений, ассоциированных с наличием протеомных, липидомных и геномных признаков в крови субъектов, перенесших трансплантацию органа, путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белка или сходных с ними, в фагоцитарных клетках крови.
Митохондриальные заболевания являются следствием недостаточности митохондрий. Она приводит к повреждению клеток и даже к гибели клеток. Заболевания митохондрий в наибольшей степени вызывают повреждение клеток головного мозга, сердца, печени, скелетных мышц, почки и эндокринной и дыхательной систем, а также диабет, осложнения дыхательной системы, эпилептические припадки, болезнь Альцгеймера, проблемы со зрением/слухом, молочный ацидоз, замедление развития, чувствительность к инфекции и злокачественную опухоль.
Таким образом, в некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга, диагностики и/или выявления митохондриального заболевания посредством выявления одного или нескольких геномных, ассоциированных с митохондриями ДНК-маркеров в фагоцитарных клетках крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга, диагностики и/или выявления болезни Альцгеймера и/или деменции путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белка и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
Системная красная волчанка (8ЬЕ) представляет собой комплексное аутоиммунное нарушение, которое повреждает различные органы и системы. Таким образом, в некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга, диагностики и/или выявления 8ЬЕ путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, липидов, белков и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга и/или выявления геномных и/или протеомных признаков, пригодных для разработки терапевтических и/или визуализирующих молекул путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белка и т.п., в
- 11 020920 фагоцитарных клетках крови.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления один или несколько способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, можно использовать для скрининга, диагностики и/или выявления изменения геномных, протеомных и/или липидомных признаков, пригодных для выявления заболеваний и патологий вследствие одного или нескольких наружных или внутренних повреждений (например, воздействия грязной бомбы, воздействия радиации, химического воздействия, лучевой терапии, введения радиофармацевтического средства, воздействия терапевтической молекулы, воздействия радона, воздействия асбеста, воздействия загрязнения окружающей среды и т.п.) путем выявления одного или нескольких маркеров, например ДНК, РНК, белков, липидов и т.п., в фагоцитарных клетках крови.
Как используют в настоящем документе, термин организм включает, но не ограничивается ими, человека, не являющегося человеком примата, корову, лошадь, овцу, козу, свинью, собаку, кошку, кролика, мышь, крысу, песчанку, лягушку, жабу и их трансгенные виды. Термин организм, кроме того, включает патогенные организмы, включая, но не ограничиваясь ими, такой патоген, как паразит, дрожжевая клетка, дрожжевая тетрада, дрожжевая колония, бактерия, колония бактерий, вирион, виросома, вирусоподобная частица и/или культуры любых из них и т.п.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления анализы, описанные в настоящем документе, можно использовать для выявления инфекционного агента и/или диагностики нарушения, ассоциированного с инфицированием клетки, ткани, органа или сходных с ними инфекционным агентом. В некоторых аспектах выявление инфекционного агента и/или диагностику нарушения, ассоциированного с инфекцией, проводят с использованием способов и/или композиций, описанных в настоящем документе, для выявления одного или нескольких маркеров инфекционных агентов, например ДНК, РНК, белков липидов и т.п. одного или нескольких инфекционных агентов.
Как используют в настоящем документе, термин инфекционный агент включает, но не ограничивается ими, патогенные организмы, такие как вирусы, бактерии, грибы, паразиты, инфекционные белки и т.п.
Вирусы включают, но не ограничиваются ими, ДНК- или РНК-вирусы животных. Как используют в настоящем документе, РНК-вирусы включают, но не ограничиваются ими, семейства вирусов, такие как Рюотаутйае (например, полиовирусы), Кеоушйае (например, ротавирусы), Тодаушйае (например, вирусы энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус краснухи), Оййотухоутйае (например, вирус гриппа), Раташухоушйае (например, респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори, вирус свинки, вирус парагриппа), КйаЪйоушйае (например, вирус бешенства), Сотопаушйае, Випуаушйае, Р1ау1ушйае, Рйоутйае, Атепаутйае, и Рейоушйае (например, лимфотропные вирусы Т-клеток человека (НТЬУ), вирусы иммунодефицита человека (Ηΐν)). Как используют в настоящем документе, ДНК-вирусы включают, но не ограничиваются ими, семейства вирусов, такие как Рароуаушйае (например, вирусы папилломы), Айепоушйае (например, аденовирус), Нетрекушйае (например, вирусы простого герпеса) и Рохушйае (например, вирусы оспы).
Бактерии включают, но не ограничиваются ими, грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, кислотоустойчивые бактерии и т.п.
Как используют в настоящем документе, грамположительные бактерии включают, но не ограничиваются ими, Асйпошейитае, Асйпошусек 1кгае1й, ВасШик аййтаак, ВасШик сегеик, С1ок1ййшш ЪоШйпит, С1ок1ййшт ШГйсйе, С1ок1ййшт регйтдепк, С1ок1ййшт 1е1ат, СогупеЪас1ейит, Етегососспк Гаесайк, Ь151ег1а топосу!одепек, ЫосатЙ1а, РторютЪас1ейит аспек, 81арйу1ососсик аигеик, 81арйу1ососсик ерШегт, 8йер1ососсик ти!апк, §1гер1ососсик рпеитошае и т.п.
Как используют в настоящем документе, грамотрицательные бактерии включают, но не ограничиваются ими, Лйр1а йейк, ВасЮпойек, Вайопейа ЪасШйотшщ, Войайейа рейлык, Вотгейа Ьигдйойей Вотгейа геситгепйк, Вгисе11а, Са1уттаюЪас1епит дгапи1отайк, Сатру1оЬас1ег, ЕксйейсЫа сой, Ргапшкейа 1и1агепк1к, Сатйпетейа уадшайк, Наешорййшк аедурйик, Наешорййшк йистеуц Наешорййшк тЛиегНае, НейсоЪас1ет ру1ой, Ьедюпейа рпеишорййа, БерЮкрйа т1етгодапк, №1ккейа шешпдШШа, Ротрйутотопак дшд1уайк, РтоуШепша к!шй, Ркеийошопак аетидшока, 8а1шопе11а еп1ег1<1к, §а1шопе11а 1урЫ, §етгайа тагсексепк, §Ыде11а Ъоуйп, §1гер1оЪасй1ик тотйГоттщ, 8йер1ососсик руодепек, Тгеропета ра1ййит, ПЪйо сйойае, Уегкппа еп1егосоййса, Уегкппа рекйк и т.п.
Как используют в настоящем документе, кислотоустойчивые бактерии включают, но не ограничиваются ими, МуоЬаШегшт аушт, МуоЬаШегшт 1ергае, МуоЬаШепит щЬегшйокй и т.п.
Как используют в настоящем документе, другие бактерии, не относящиеся к этим трем категориям, включают, но не ограничиваются ими, Вайопейа йепке1ае, СЫашуШа ркШаш, СЫашуШа йасйотайк, Сох1е11а Ъитейц Мусор1акта рпеитошае, Ктскейыа акай, Ктскейыа рго^а/екй, РюкеПма йскейкп, Ктскейыа 1кШкидатик1п, Ктскейыа 1ур1п, игеар1акта игеа1уйсит, 0|р1ососспк рпеитошае, ЕйгйсЫа сйаГеп8Ϊ8, Етегососспк Гаесшт, Метпдососш и т.п.
Как используют в настоящем документе, грибы включают, но не ограничиваются ими, Акретдйй, СапШйае, СапйШа а1Ысапк, СосшйюШек 1тш1Йк, СгурЮсосш и их комбинации.
- 12 020920
Как используют в настоящем документе, паразитарные микроорганизмы включают, но не ограничиваются ими, Ва1апйбшт сой, СгурЮкропбшт рагуит, Сус1окрога сауаЮпсЮк, ЕпссрНаПЮ/оа. Еп1атоеЬа Ы81о1убса, ЕтсгосуЮ/ооп Ыспсий, С1агШа 1атЪПа, ЕсйНташас, Иазтоби, Тохор1акта допбп, Тгурапокотас, трапецевидная амеба и т.п.
Как используют в настоящем документе, паразиты включают червей (например, гельминтов), в частности паразитарных червей, включая, но не ограничиваясь ими, №та1оба (круглые черви, например трихоцефал, анкилостомы, острица, аскариды, филярии и т.п.), СсЧоба (например, ленточные черви).
Как используют в настоящем документе, инфекционные белки включают прионы. Нарушения, вызываемые прионами, включают, но не ограничиваются ими, нарушения человека, такие как болезнь Крейтцфельдта-Якоба (СГО) (включая, например, ятрогенную болезнь Крейтцфельдта-Якоба ОСГО), вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (уСГО), семейную болезнь Крейтцфельдта-Якоба (ГСГО) и спорадическую болезнь Крейтцфельдта-Якоба (зСГО)), синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера (Οδδ), летальную семейную инсомнию (ΓΡΙ), спорадическую летальную инсомнию (δΡΙ), куру и т.п., а также нарушения у животных, такие как почесуха (овцы и козы), губчатая энцефалопатия быков (В8Е) (крупный рогатый скот), трансмиссивная энцефалопатия норки (ТМЕ) (норка), хронический акобальтоз (С^О) (лось, чернохвостый олень), губчатая энцефалопатия кошек (кошки), энцефалопатия экзотических копытных животных (ЕИЕ) (ньяла, орикс, большой куду), губчатая энцефалопатия страусов и т.п.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрены способы выявления маркеров, таких как последовательности нуклеиновых кислот (например, ДНК, РНК и т.п.), белки, полипептиды, липиды, полисахариды и т.п. в биологическом образце. Как используют в настоящем документе, термин нуклеиновая кислота включает молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной.
Как используют в настоящем документе, термин аминокислота включает органические соединения, содержащие как основную аминогруппу, так и кислотную карбоксильную группу. В этот термин включены природные аминокислоты (например, Ь-аминокислоты), модифицированные и необычные аминокислоты (например, Ό-аминокислоты и β-аминокислоты), а также аминокислоты, которые, как известно, биологически встречаются в свободной или комбинированной форме, но обычно не встречаются в белках. Природные встречающиеся в белках аминокислоты включают аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, серин, треонин, тирозин, триптофан, пролин и валин. Природные небелковые аминокислоты включают аргиноянтарную кислоту, цитруллин, цистеин-серную кислоту,
3.4- дигидроксифенилаланин, гомоцистеин, гомосерин, орнитин, 3-монойодтирозин, 3,5-дийодотирозин, 3,5,5-трийодтиронин и 3,3',5,5'-тетрайодтиронин. Модифицированные или необычные аминокислоты включают Ό-аминокислоты, гидроксилизин, 4-гидроксипролин, Ы-СЬ7-защищенные аминокислоты,
2.4- диаминомасляную кислоту, гомоаргинин, норлейцин, Ν-метиламиномасляную кислоту, нафтилаланин, фенилглицин, α-фенилпролин, трет-лейцин, 4-аминоциклогексилаланин, Ν-метилнорлейцин,
3.4- дегидропролин, Ν,Ν-диметиламиноглицин, Ν-метиламиноглицин, 4-аминопиперидин-4-карбоновую кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, транс-4-(аминометил)циклогексанкарбоновую кислоту, 2-, 3- и 4-(аминометил)бензойную кислоту, 1-аминоциклопентанкарбоновую кислоту,
1-аминоциклопропанкарбоновую кислоту и 2-бензил-5-аминопентановую кислоту.
Как используют в настоящем документе, термин пептид включает соединения, которые состоят из двух или более аминокислот, которые связаны пептидной связью. Пептиды могут иметь молекулярную массу менее 10000 Да, менее 5000 Да или менее 2500 Да. Также термин пептид включает соединения, содержащие как пептидные, так и непептидные компоненты, такие как псевдопептидные или пептидомиметические остатки или другие неаминокислотные компоненты. Такие соединения, содержащие как пептидные, так и непептидные компоненты, также могут называться аналогами пептидов.
Как используют в настоящем документе, термин белок включает соединения, которые состоят из аминокислот, расположенных в виде линейной цепи и связанных пептидными связями между карбоксильными группами и аминогруппами соседних аминокислотных остатков.
Как используют в настоящем документе, термин липид включает синтетические или встречающиеся в природе соединения, которые обычно являются амфипатическими или биологически совместимыми. Липиды, как правило, содержат гидрофильный компонент и гидрофобный компонент. Иллюстративные липиды включают, но не ограничиваются ими, жирные кислоты, нейтральные жиры, фосфатиды, гликолипиды и т.п. Как используют в настоящем документе, термин липидная композиция относится к композиции, которая содержит липидное соединение, как правило, в водной среде. Иллюстративные липидные композиции включают, но не ограничиваются ими, суспензии, эмульсии, композиции везикул и т.п.
Иллюстративный способ выявления наличия или отсутствия полипептида или нуклеиновой кислоты, соответствующей маркеру по изобретению, в биологическом образце вовлекает получение биологического образца (например, образца жидкости организма (например, крови) и/или образца опухоли) от
- 13 020920 тестируемого субъекта и контактирование биологического образца с соединением или средством, способным выявлять один или несколько маркеров (например, ДНК, РНК, белок, полипептид, углевод, липид или сходные с ними).
Способы выявления, описанные в настоящем документе, можно использовать для выявления одного или нескольких маркеров (например, ДНК, РНК, белка, полипептида, углевода, липида или сходных с ними) в биологическом образце ίη νΐίτο, а также ίη νίνο. Например, способы выявления мРНК ίη νΐίΓΟ включают нозерн-гибридизацию и гибридизацию ίη яПп. Способы выявления полипептида, соответствующего маркеру по изобретению, ίη νΐίτο включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ1§А), вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и иммунофлуоресценцию. Способы выявления геномной ДНК ίη νΐίτο включают саузерн-гибридизацию. Более того, способы выявления полипептида, соответствующего маркеру по изобретению, ίη νίνο включают введение субъекту меченого антитела, направленного против полипептида. Например, антитело может быть мечено радиоактивным маркером, присутствие и расположение которого можно выявлять у субъекта стандартными способами визуализации.
Способы анализа содержания липидов в биологическом образце известны в данной области (см., например, Καη§ еί а1. (1992), ВюсЫт. ВюрЬуя. Ас1а. 1128:267; Аеу1алй! еί а1. (1996), Ь1р1Й5, 31:977; I. §сЫ11ет еί а1. (1999), Αηа1. ВюсЬет. 267:46; Каид еί а1. (2001), Ргос. №ί1. Асай. δα. υδΑ, 98:4050; δΟιί1ΕΓ еί а1. (2004), Ргод. Ь1р1й Кея. 43:499). Иллюстративным способом анализа липидов является экстракция липидов из биологического образца (например, с использованием смеси хлорформ:метанол (2:1, об./об.), содержащей 0,005% бутилированный гидрокситолуол (ВНТ, в качестве антиоксиданта)), получение метиловых сложных эфиров жирных кислот (например, реагент 14% ВР3-метанол) и количественное определение метиловых сложных эфиров жирных кислот (например, посредством ВЭЖХ, ТЬС, газовой хроматографии-масс-спектрометрии с использованием коммерчески доступных газовых хроматографов, масс-спектрометров и/или комбинации газовых хроматографов/масс-спектрометров). Массу жирной кислоты определяют сравнением зон различных анализируемых жирных кислот с зонами, соответствующими фиксированной концентрации внутреннего стандарта.
Общий принцип диагностических и прогностических анализов вовлекает получение образца или реакционной смеси, которая может содержать маркер (например, один или несколько из ДНК, РНК, белка, полипептида, углевода, липида и т.п.) и зонд в соответствующих условиях и в течение периода времени, достаточного для обеспечения взаимодействия и связывания маркера и зонда, таким образом, образующих комплекс, который может быть извлечен из реакционной смеси и/или выявлен в ней. Эти анализы можно проводить различными способами.
Например, один из способов проведения такого анализа может вовлекать заякоривание маркера или зонда на твердофазной подложке, также называемой субстратом, и выявление комплексов маркермишень/зонд, заякоренных на твердой фазе, в конце реакции. В одном варианте осуществления такого способа образец субъекта, который подлежит анализу в отношении наличия и/или концентрации маркера, можно заякоривать на носителе или твердофазной подложке. В другом варианте осуществления возможна обратная ситуация, при которой зонд можно заякоривать на твердой фазе, и образцу от субъекта можно позволять реагировать в качестве незаякоренного компонента анализа.
Существует множество общепризнанных способов заякоривания компонентов анализа на твердой фазе. Они включают, но не ограничиваются ими, молекулы маркеров или зондов, которые иммобилизованы путем конъюгации биотина и стрептавидина. Такие биотинилированные компоненты анализа можно получать из биотин-№ИБ-(Х-гидроксисукцинимида) с использованием способов, известных в данной области (например, набора для биотинилирования, Р1егсе СЬетюак, КоскГогй, 1Ь), и иммобилизовывать на лунках покрытых стрептавидином 96-луночых планшетов (Р1егсе СЬетюа1). В определенных вариантах осуществления поверхности с иммобилизованными компонентами анализа можно получать заранее и хранить.
Другие пригодные носители или твердофазные подложки для таких анализов включают любой материал, способный связывать тот класс молекул, к которому относится маркер или зонд. Хорошо известные подложки или носители включают, но не ограничиваются ими, стекло, полистирол, нейлон, полипропилен, полиэтилен, декстран, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит.
Для проведения анализов с помощью указанных выше подходов неиммобилизованный компонент добавляют к твердой фазе, на которой заякорен второй компонент. После завершения реакции не образовавшие комплексы компоненты можно удалять (например, промыванием) в таких условиях, чтобы любые образованные комплексы оставались иммобилизованными на твердой фазе. Выявление комплексов маркер/зонд, заякоренных на твердой фазе, можно проводить рядом способов, описанных в настоящем документе.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления зонд, когда он представляет собой незаякоренный компонент анализа, можно метить для выявления и получения данных анализа, либо прямо, либо непрямо, поддающимися выявлению метками, рассмотренными в настоящем документе и хорошо известными специалисту в данной области.
- 14 020920
Также можно прямо выявлять образование комплексов маркер/зонд без дальнейшего манипулирования или мечения какого-либо компонента (маркера или зонда), например, с использованием способа переноса энергии флуоресценции (см., например, патенты США № 5631169 и 4868103). Флуорофорную метку на первой донорной молекуле выбирают так, чтобы при возбуждении падающим светом соответствующей длины волны его испускаемая флуоресцентная энергия поглощалась флуоресцентной меткой на второй акцепторной молекуле, которая, в свою очередь, способна флуоресцировать вследствие поглощенной энергии. Альтернативно, в донорной молекуле белка можно просто использовать природную флуоресцентную энергию остатков триптофана. Выбирают такие метки, которые испускают свет отличающейся длины волны, так чтобы метку акцепторной молекулы можно было отличить от метки донора. Поскольку эффективность переноса энергии между метками связана с расстоянием, разделяющим молекулы, можно оценивать пространственную взаимосвязь между молекулами. В ситуации, когда между молекулами происходит связывание, флуоресцентное испускание метки акцепторной молекулы в анализе должно быть максимальным. Явление связывания РЕТ можно удобным образом измерять с помощью стандартных средств для флуореметрического выявления, хорошо известных в данной области (например, с использованием флуориметра).
В другом варианте осуществления определение способности зонда распознавать маркер можно проводить без мечения какого-либо компонента анализа (зонда или маркера) с использованием технологии, такой как анализ взаимодействия биомолекул в реальном времени (В1А) (см., например, 8|о1апйег, 8. апй игЪашс/ку, С., 1991, Апа1. СЬет. 63:2338-2345 и 8/аЪо е1 а1., 1995, Сигг. Ορίη. 81гис1. Вю1. 5:699-705). Как используют в настоящем документе, В1А или поверхностный плазмонный резонанс представляет собой технологию для исследования биоспецифических взаимодействий в реальном времени, без мечения каких-либо из участников взаимодействия (например, В1Асоге). Изменение массы на связывающей поверхности (указывающее на факт связывания) приводит к изменениям коэффициента рефракции света вблизи поверхности (оптический феномен поверхностного плазмонного резонанса (8РК)), приводящим к поддающемуся выявлению сигналу, который можно использовать в качестве признака реакций между биологическими молекулами в реальном времени.
Альтернативно, в другом варианте осуществления аналогичные диагностические и прогностические анализы можно проводить с маркером или зондом, растворенными в жидкой фазе. В таком анализе образовавшие комплекс маркер и зонд отделяют от не образовавших комплексы компонентов рядом стандартных способов, включая, но не ограничиваясь ими, дифференциальное центрифугирование, хроматографию, электрофорез и иммунопреципитацию. При дифференциальном центрифугировании комплексы маркер/зонд можно отделять от не образовавших комплексы компонентов анализа с помощью серии стадий центрифугирования, вследствие различного седиментационного равновесия комплексов, основанного на их различных размерах и плотностях (см., например, Ктуак апй Мниоп (1993), Тгепйк ВюсЬет. 8ск 18:284). Также для разделения образовавших комплексы молекул и не образовавших комплексы молекул можно использовать стандартные способы хроматографии. Например, гельфильтрационная хроматография разделяет молекулы на основе размера, и с использованием, например, соответствующей гель-фильтрационной смолы в колонке относительно более крупный комплекс может быть отделен от относительно меньших не образовавших комплексы компонентов. Аналогично, для отделения комплекса от не образовавших комплекс компонентов можно использовать относительно отличающиеся свойства заряда маркера/зонда комплекса по сравнению с не образовавшими комплекс компонентами, например, с использованием смол для ионообменной хроматографии. Такие смолы и хроматографические способы хорошо известны специалисту в данной области (см., например, Неедаагй (1998), ί. Мо1. Кесодпй. 11:141; Наде апй Т\\еей (1997), 1. СЬготаЮдг. В. Вютей. 8сЬ Арр1. 12:499). Также для разделения образовавших комплекс компонентов и несвязанных компонентов можно использовать гельэлектрофорез (см., например, Лн5нЪе1 е1 а1., ей., СиггеШ РгоЮсоЬ ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп Айеу & 8опк, Νον Уогк, 1987, 1999). В этом способе комплексы белков или нуклеиновых кислот разделяют на основе, например, размера или заряда. Для сохранения связывающего взаимодействия в ходе процесса электрофореза предпочтительными, как правило, являются неденатурирующие материалы матрикса геля и условия в отсутствие восстановителя. Соответствующие условия для конкретного анализа и его компоненты хорошо известны специалисту в данной области.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления уровень мРНК, соответствующей маркеру, можно определять в биологическом образце или ш кйи и/или ш уйго с использованием способов, известных в данной области. Во многих способах выявления экспрессии используют выделенную РНК. Для способов ш уйго для очистки РНК из клеток крови можно использовать любой способ выделения РНК, который не является селективным в отношении мРНК (см., например, АикиЪе1 е1 а1., ей., СнггеШ РгоЮсоЬ ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп Айеу & 8опк, №ν Уогк 1987, 1999). Кроме того, большие количества клеток и/или образцов можно легко обрабатывать с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, например, таких как одностадийный способ выделения РНК СЬотс/упкО (1989, патент США № 4843155).
Выделенную мРНК можно использовать в анализах гибридизации или амплификации, которые включают, но не ограничиваются ими, саузерн- или нозерн-анализы, анализы способом полимеразной
- 15 020920 цепной реакции и чипы с зондами. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления диагностический способ для выявления уровней мРНК вовлекает контактирование выделенной мРНК с молекулой нуклеиновой кислоты (зондом), которая может гибридизоваться с мРНК, кодируемой геном, подвергаемым выявлению. Зонд нуклеиновой кислоты может представлять собой, например, полноразмерную кДНК или ее часть, такую как олигонуклеотид, имеющий длину по меньшей мере 7, 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов и достаточный для специфичной гибридизации в строгих условиях гибридизации с мРНК или геномной ДНК, кодирующей маркер по настоящему изобретению. Другие пригодные зонды для применения в диагностических анализах по изобретению описаны в настоящем документе. Гибридизация мРНК с зондом указывает на то, что рассматриваемый маркер экспрессируется.
В одном формате мРНК иммобилизуют на твердой поверхности и контактируют с зондом, например, разделением выделенной мРНК на агарозном геле и переносом мРНК с геля на мембрану, такую как нитроцеллюлоза. В альтернативном формате, зонд(ы) иммобилизуют на твердой поверхности и мРНК контактируют с зондом(ами), например, на генном чипе. Квалифицированный специалист может легко адаптировать известные способы выявления мРНК для применения в выявлении уровня мРНК, кодируемой маркерами по настоящему изобретению.
Альтернативный способ определения уровня мРНК, соответствующей маркеру по настоящему изобретению в образце, вовлекает способ амплификации нуклеиновых кислот, например, посредством ткРСК (экспериментальный вариант осуществления указан в патентах США № 4683195 и 4683202), СОЬЭ-РСВ (Ы ек а1. (2008), Ыак. Мей. 14:579), лигазной цепной реакции (Вагапу (1991), Ргос. Ыак1. Леай. δει. υδΑ, 88:189), самоподдерживающейся репликации последовательностей (ОиакеШ ек а1. (1990), Ргос. Ыак1. Асай. δει. υδΑ, 87:1874), транскрипционной системы амплификации (Κ\\ό1ι ек а1. (1989), Ргос. Ыак1. Асай. δει. υδΑ, 86:1173), О-бета репликазы (Ы/агЙ1 ек а1. (1988), В|о/ТесНпо1оду 6:1197), репликации по типу катящегося кольца (патент США № 5854033) или любого другого способа амплификации нуклеиновых кислот с последующим выявлением амплифицированных молекул с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области. Эти схемы выявления особенно пригодны для выявления молекул нуклеиновых кислот, если такие молекулы присутствуют в очень низких количествах. Как используют в настоящем документе, праймеры для амплификации определяют как пару молекул нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с 5'- или 3'-областями гена (плюс- и минус-цепи, соответственно, или наоборот) и содержат короткую область между ними. Как правило, праймеры для амплификации имеют длину приблизительно от 10 до 30 нуклеотидов и фланкируют область длиной приблизительно от 50 до 200 нуклеотидов. В соответствующих условиях и с соответствующими реагентами такие праймеры позволяют амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, фланкированную праймерами.
Для способов ίη ®1ки мРНК не должна быть выделена из образца (например, жидкости организма (например, клеток крови)) перед выявлением. В таких способах образец клеток или ткани получают/обрабатывают с использованием известных гистологических способов. Затем образец иммобилизуют на подложке, как правило, на предметном стекле, а затем контактируют с зондом, который может гибридизоваться с мРНК, которая кодирует маркер.
В качестве альтернативы определению, основанному на абсолютном уровне экспрессии маркера, определение может быть основано на нормализованном уровне экспрессии маркера. Уровни экспрессии нормализуют коррекцией абсолютного уровня экспрессии маркера путем сравнения его экспрессии с экспрессией гена, который не является маркером, например гена домашнего хозяйства, который экспрессируется конститутивно. Пригодные гены для нормализации включают гены домашнего хозяйства, такие как ген актина, или специфичные для эпителиальных клеток гены. Эта нормализация позволяет сравнение уровня экспрессии в образце пациента из одного источника с образцом пациента из другого источника, например сравнение фагоцитарной клетки крови индивида с нефагоцитарной клеткой крови индивида.
В другом иллюстративном варианте осуществления проводят выявление белка или полипептида, соответствующего маркеру. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления агентом для выявления полипептида по изобретению является антитело, способное связываться с полипептидом, соответствующим маркеру по изобретению, такое как антитело с поддающееся выявлению меткой. Антитела могут быть поликлональными или более предпочтительно моноклональными. Можно использовать целое антитело или его фрагмент (например, РаЬ или Р(аЬ')2). Термин меченый в отношении зонда или антитела охватывает прямое мечение зонда или антитела присоединением (т.е. физическим связыванием) поддающегося выявлению вещества к зонду или антителу, а также непрямое мечение зонда или антитела вследствие реакционной способности к другому реагенту, который является прямо меченым. Примеры непрямого мечения включают выявление первичного антитела с использованием флуоресцентно меченого вторичного антитела и концевое мечение ДНК-зонда биотином, так чтобы его можно было выявить с помощью флуоресцентно меченого стрептавидина.
Для определения того, содержит ли образец белок, который связывается с данным антителом, можно использовать множество форматов. Примеры таких форматов включают, но не ограничиваются ими, ферментный иммунологический анализ (ΕΙΑ), радиоиммунный анализ (ЫА). вестерн-блот анализ, твер- 16 020920 дофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ1§Л) и т.п. Квалифицированный специалист может легко адаптировать известные способы выявления белка/антитела для применения в определении того, экспрессируют ли клетки (например, клетки жидкостей организма, такие как клетки крови) маркер по настоящему изобретению.
В одном формате антитела или фрагменты антител можно использовать в способах, таких как вестерн-блоттинг или иммунофлуоресцентные способы, для выявления экспрессированных белков. В таких применениях обычно предпочтительно иммобилизуют либо антитело, либо белки на твердой подложке. Пригодные твердофазные подложки или носители включают любую подложку, способную связывать антиген или антитело. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро, магнетит и т.п.
Специалисту в данной области известно множество других пригодных носителей для связывания антитела или антигена, и он способен адаптировать такую подложку для применения с настоящим изобретением. Например, белок, выделенный из клеток (например, клеток жидкостей организма, таких как клетки крови), можно разделять полиакриламидным гель-электрофорезом и иммобилизовывать на твердофазной подложке, такой как нитроцеллюлоза. Затем подложку можно промывать пригодными буферами с последующей обработкой меченым поддающейся выявлению меткой антителом. Затем твердофазную подложку можно промывать буфером второй раз для удаления несвязавшегося антитела. Затем количество связанной метки на твердой подложке можно выявлять с помощью общепринятых средств.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрены диагностические анализы. Иллюстративный способ выявления наличия или отсутствия состояния, заболевания и/или нарушения в организме, ассоциированных со злокачественной опухолью, инфекционным агентом и/или другим заболеванием в биологическом образце, вовлекает получение биологического образца из тестируемого субъекта и контактирование биологического образца с соединением или веществом, способным осуществлять выявление одного или нескольких маркеров заболевания и/или нарушения, ассоциированных со злокачественной опухолью, инфекционным агентом и/или другим заболеванием или состоянием, например, маркерной нуклеиновой кислотой (например, мРНК, геномной ДНК), маркерным пептидом (например, полипептидом или белком) или маркерным липидом, кодируемым маркерной нуклеиновой кислотой, так чтобы в биологическом образце выявлялось наличие маркерной нуклеиновой кислоты или маркерного пептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. В одном варианте осуществления средство для выявления маркерной мРНК или геномной ДНК метят нуклеиновой кислотой-зондом, способной гибридизоваться с маркерной мРНК или геномной ДНК. Нуклеиновая кислота-зонд может представлять собой, например, полноразмерную маркерную нуклеиновую кислоту или ее часть. Другие пригодные зонды для применения в диагностических анализах по изобретению описаны в настоящем документе.
Средство для выявления маркерного пептида может представлять собой антитело, способное связываться с маркерным пептидом, такое как антитело с поддающейся выявлению меткой. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Можно использовать целое антитело или его фрагмент (например, РаЬ или Р(аЬ')2). Термин меченый в отношении зонда или антитела охватывает прямое мечение зонда или антитела присоединением (т.е. физическим связыванием) поддающегося выявлению вещества к зонду или антителу, а также непрямое мечение зонда или антитела вследствие реакционной способности к другому реагенту, который является прямо меченым. Примеры непрямого мечения включают выявление первичного антитела с использованием флуоресцентно меченого вторичного антитела и концевое мечение ДНК-зонда биотином, так чтобы его можно было выявить с помощью флуоресцентно меченого стрептавидина.
Как используют в настоящем документе, термин биологический образец включает ткани, клетки (например, фагоцитарные клетки, нефагоцитарные клетки, клетки 2η, клетки >2п и т.п.) и биологические жидкости (например, цельную кровь, \УВС и т.п.), выделенные от субъекта, а также ткани, клетки (например, фагоцитарные клетки, нефагоцитарные клетки, клетки 2η, клетки >2η и т.п.) и жидкости организма (например, мочу, цельную кровь, \УВС и т.п.), находящиеся в субъекте. Таким образом, способ выявления по изобретению можно использовать для выявления маркерного полипептида, белка, углевода, липида, олигосахарида, мРНК, микроРНК, геномной ДНК и т.п. в биологическом образце ίη νίίτο, а также ίη νίνο. В одном варианте осуществления биологический образец содержит белки, полипептиды, липиды и/или олигосахариды тестируемого субъекта. Альтернативно, биологический образец может содержать молекулы мРНК тестируемого субъекта и/или молекулы геномной ДНК тестируемого субъекта. В одном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец сыворотки, образец слюны или образец биоптата, взятый у субъекта общепринятыми способами.
В другом варианте осуществления способы дополнительно вовлекают получение контрольного биологического образца (например, нефагоцитарной клетки или клетки 2η) от контрольного субъекта, контактирования контрольного образца (например, нефагоцитарной клетки или клетки 2η) с соединением или агентом, способным выявлять маркерный полипептид, белок, липид, олигосахарид, мРНК, микроРНК, геномную ДНК и т.д. в биологическом образце, и сравнение наличия маркерного полипептида, белка, липида, олигосахарида, мРНК, геномной ДНК и т.п. в контрольном образце с наличием маркерно- 17 020920 го полипептида, белка, липида, олигосахарида, мРНК, геномной ДНК и т.п. в тестируемом образце (например, фагоцитарной клетке или клетке >2п). Альтернативно, наличие маркерного полипептида, белка, липида, олигосахарида, мРНК, геномной ДНК и т.п. в тестируемом образце (например, фагоцитарной клетке или клетке >2п) можно сравнивать с информацией в базе данных или на карте, в результате осуществляя выявление или диагностику.
Также изобретение относится к наборам для выявления наличия одного или нескольких маркеров, ассоциированных со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, в биологическом образце. Например, набор может содержать меченое соединение или вещество, способное осуществлять выявление маркерного полипептида, белка, липида, олигосахарида, мРНК, микроРНК, геномной ДНК и т.п. в биологическом образце; средства для определения количества маркера в образце и средства для сравнения количества маркера в образце со стандартом (например, нефагоцитарной клеткой или клеткой 2п). Соединение или средство может быть упаковано в пригодный контейнер. Набор может дополнительно содержать инструкции по применению набора для выявления маркерного пептида или нуклеиновой кислоты.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предусмотрены прогностические анализы. Диагностические способы, описанные в настоящем документе, более того, можно использовать для идентификации субъектов, имеющих состояние или риск развития заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, или другого нарушения, описанного в настоящем документе, ассоциированного с повышенной (или сниженной) экспрессией одного или нескольких маркеров, описанных в настоящем документе. Например, для идентификации субъекта, имеющего заболевание и/или нарушение или риск развития заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом и/или одним или несколькими другими нарушениями, описанными в настоящем документе, можно использовать анализы, описанные в настоящем документе, такие как указанные выше диагностические анализы или представленные ниже анализы.
Прогностические анализы, описанные в настоящем документе, можно использовать для определения того, можно ли субъекту вводить средство (например, агонист, антагонист, пептидомиметик, белок, пептид, нуклеиновую кислоту, низкомолекулярное соединение или другое лекарственное средствокандидат) для лечения заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, и/или одним или несколькими другими нарушениями, описанными в настоящем документе, ассоциированными с одним или несколькими маркерами, описанными в настоящем документе. Например, такие способы можно использовать для определения того, можно ли субъекта эффективно лечить средством для лечения, смягчения течения или уменьшения одного или нескольких симптомов, ассоциированных со злокачественной опухолью. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам определения того, можно ли субъекта эффективно лечить средством от заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, и/или одним или несколькими другими нарушениями, описанными в настоящем документе.
Способы по изобретению также можно использовать для выявления генетических изменений маркерного гена, тем самым определяя, имеет ли субъект с измененным геном риск развития заболевания и/или нарушения, ассоциированного со злокачественной опухолью и/или инфекционным агентом, и/или одним или несколькими другими нарушениями, описанными в настоящем документе, характеризующимися нарушением регуляции активности маркерного белка или экспрессии нуклеиновой кислоты, такими как злокачественная опухоль. В определенных вариантах осуществления способы включают выявление в образце клеток (например, в клетках жидкостей организма, таких как клетки крови) от субъекта наличия или отсутствия генетического изменения, влияющего на целостность гена, кодирующего маркерный пептид и/или маркерный ген. Например, такие генетические изменения можно выявлять путем установления существования по меньшей мере одного из: 1) делеция одного или нескольких нуклеотидов из одного или нескольких маркерных генов; 2) вставка одного или нескольких нуклеотидов в один или несколько маркерных генов; 3) замена одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких маркерных генах; 4) хромосомная перестройка одного или нескольких маркерных генов; 5) изменение уровня транскрипта матричной РНК одного или нескольких маркерных генов; 6) нарушенная модификация одного или нескольких маркерных генов, такая как паттерн метилирования геномной ДНК; 7) наличие паттерна сплайсинга, не соответствующего дикому типу, у транскрипта матричной РНК одного или нескольких маркерных генов; 8) уровень, не соответствующий дикому типу, одного или нескольких маркерных белков; 9) аллельная потеря одного или нескольких маркерных генов и 10) ненадлежащая посттрансляционная модификация одного или нескольких маркерных белков. Как описано в настоящем документе, существует большое количество анализов, известных в данной области, которые можно использовать для выявления изменений в одном или нескольких маркерных генах.
В определенных вариантах осуществления выявление изменения вовлекает использование зонда/праймера в полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см., например, патенты США № 4683195, 4683202 и 5854033), такой как ПЦР в реальном времени, СОЬП-РСК, якорная ПЦР, пошаговая ПЦР или КАСЕ ПЦР, или, альтернативно, в лигазной цепной реакции (ЬСК) (см., например, Ьапбедгап с1 а1. (1988),
- 18 020920
8с1епсе, 241:1077; Ргобготои апб Реаг1 (1992), Рго!ет Епд. 5:827 и №ка/а\уа е! а1. (1994), Ргос. Ναΐ1. Асаб. 8οί. И8А, 91:360), последняя из которых может быть особенно пригодна для выявления точковых мутаций в маркерном гене (см. АЬгауауа е! а1. (1995), №с1ею Ас1бк Кек. 23:675). Этот способ может включать стадии взятия образца от субъекта, выделение нуклеиновой кислоты (например, геномной, мРНК или обеих из них) из клеток образца, контактирование образца нуклеиновой кислоты с одним или несколькими праймерами, которые специфично гибридизуются с маркерным геном в таких условиях, чтобы происходила гибридизация и амплификация маркерного гена (если он присутствует), и выявление наличия или отсутствия продукта амплификации, или выявление размера продукта амплификации и сравнение длины с контрольным образцом. Ожидается, что ПЦР и/или ЬСК могут быть желательными для применения в качестве предварительной стадии амплификации совместно с любым из способов, используемых для выявления мутаций, описанных в настоящем документе.
Альтернативные способы амплификации включают самоподдерживающуюся репликацию последовательности (Сиа!еШ е! а1. (1990), Ргос. №ιΐ1. Асаб. 8ст И8А, 87:1874), транскрипционную систему амплификации (Κ\\ό1ι е! а1. (1989), Ргос. №и1. Асаб. 8ст И8А, 86:1173), О-бета репликазу (Ы/агб1 е! а1. (1988), Вю-ТесЬпо1оду, 6:1197) или любой другой способ амплификации нуклеиновых кислот с последующим выявлением амплифицированных молекул с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области. Эти схемы выявления являются особенно пригодными для выявления молекул нуклеиновых кислот, если такие молекулы присутствуют в очень низких количествах.
В альтернативном варианте осуществления, мутации в одном или нескольких маркерных генах в клетке образца можно идентифицировать по изменению паттерна расщепления ферментом рестрикции. Например, выделяют ДНК образца и контроля, необязательно амплифицируют, расщепляют одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции и определяют длины фрагментов гель-электрофорезом и сравнивают их. Различия в размерах длин фрагментов ДНК образца и контроля указывают на мутации в ДНК образца. Более того, для оценки наличия конкретных мутаций можно использовать специфичные для последовательности рибозимы (см., например, патент США № 5498531) вследствие приобретения или утраты участка расщепления рибозима.
В других вариантах осуществления генетические мутации в одном или нескольких из маркеров, описанных в настоящем документе, можно идентифицировать гибридизацией нуклеиновых кислот, ДНК или РНК, образца и контроля, например с чипами высокой плотности, содержащими сотни или тысячи олигонуклеотидных зондов (Сгошп е! а1. (1996), Нитап Ми1абоп, 7:244; Ко/а1 е! а1. (1996), №Циге Меб1сше, 2:753). Например, генетические мутации в маркерной нуклеиновой кислоте можно идентифицировать в двухмерных чипах, содержащих полученные с помощью света ДНК-зонды, как описано в Сгошп, М.Т. е! а1. выше. В кратком изложении первый чип для гибридизации зондов можно использовать для сканирования через длительные участки ДНК в образце и контроле для идентификации изменений оснований между последовательностями, создавая линейные чипы последовательных перекрывающихся зондов. Эта стадия позволяет идентификацию точковых мутаций. После этой стадии второй чип для гибридизации позволяет охарактеризацию конкретных мутаций с использованием меньших специализированных чипов с зондами, комплементарных всем выявленным вариантам или мутациям. Каждый чип для мутаций состоит из параллельных наборов зондов, одного комплементарного гену дикого типа и другого комплементарного мутантному гену.
В другом варианте осуществления для прямого секвенирования маркерного гена и выявления мутаций путем сравнения последовательности маркерного гена образца с соответствующей последовательностью дикого типа (контрольной) можно использовать любую из множества реакций секвенирования, известных в данной области. Примеры реакций секвенирования включают реакции на основе способов, разработанных Махат апб ОПЬег! ((1977), Ргос. №ι!1. Асаб. 8ст И8А, 74:560) или 8апдег ((1977), Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А, 74:5463). Также предусматривается, что при проведении диагностических анализов можно использовать любой из множества способов автоматического секвенирования ((1995), Вю1есЬшдиек, 19:448), включая секвенирование с помощью масс-спектрометрии (см., например, международную публикацию РСТ № АО 94/16101 (СоЬеп е! а1. (1996), Абу. СНготаЮдг. 36:127-162 и ОгЖп е! а1. (1993), Арр1. ВюсНет. Вю!есЬпо1. 38:147).
Другие способы выявления мутаций в маркерном гене включают способы, в которых используют защиту от расщепляющих агентов для выявления неправильно спаренных оснований в РНК/РНК или гетеродуплексах РНК/ДНК (Муегк е! а1. (1985), 8шепсе, 230:1242). Как правило, известный в данной области способ расщепления неправильно спаренных оснований начинают путем предоставления гетеродуплексов, образованных гибридизацией (меченой) РНК или ДНК, содержащей маркерную последовательность дикого типа с потенциально мутантной РНК или ДНК, полученной из образца ткани. Двухцепочечные дуплексы обрабатывают агентом, который расщепляет одноцепочечные области дуплекса, которые существуют вследствие ошибочного спаривания оснований между цепями контроля и образца. Например, дуплексы РНК/ДНК можно обрабатывать РНКазой, а гибриды ДНК/ДНК можно обрабатывать 81-нуклеазой для ферментативного расщепления неправильно спаренных областей. В других вариантах осуществления для расщепления неправильно спаренных областей дуплексы либо ДНК/ДНК, либо РНК/ДНК можно обрабатывать гидроксиламином или тетроксидом осмия и пиперидином. После расще- 19 020920 пления неправильно спаренных областей полученный материал разделяют по размеру на денатурирующих полиакриламидных гелях для определения участка мутации. См., например, Со!!оп е! а1. (1988), Ргос. йа!1. Асаб. δα. И8А, 85:4397; 8а1ееЬа е! а1. (1992), Ме!йобк Еп/уто1. 217:286. В одном варианте осуществления ДНК или РНК контроля можно метить для выявления.
В другом варианте осуществления в реакции расщепления неправильно спаренных оснований используются один или несколько белков, которые распознают неправильно спаренные пары оснований в двухцепочечной ДНК (так называемые ферменты репарации неправильно спаренных оснований ДНК) в определенных системах для выявления и картирования точковых мутаций в маркерных кДНК, полученных из образцов клеток. Например, фермент ти!У Е.соП расщепляет А при неправильно спаренных основаниях С/А, а тимидин-ДНК-гликозилаза из клеток НеЬа расщепляет Т при неправильно спаренных основаниях С/Т (Нки е! а1. (1994), Сагстодепекй, 15:1657). Согласно иллюстративному варианту осуществления зонд на основе маркерной последовательности, например маркерной последовательности дикого типа, гибридизуют с кДНК или другим ДНК-продуктом из тестируемой клетки(ок). Дуплекс обрабатывают ферментом репарации неправильно спаренных оснований ДНК, и продукты расщепления, при их наличии, могут быть выявлены с помощью протоколов электрофореза или сходных с ними. См., например, патент США № 5459039.
В других вариантах осуществления для идентификации мутаций в маркерных генах можно использовать изменения электрофоретической подвижности. Например, для выявления различной электрофоретической подвижности между мутантной нуклеиновой кислотой и нуклеиновой кислотой дикого типа можно использовать полиморфизм одноцепочечной конформации (§§СР) (Огйа е! а1. (1989), Ргос. йа!1. Асаб. δα. υδΑ, 86:2766, см. также Со!!оп (1993), Ми!а!. Кек. 285:125 и НауакЫ (1992), Сепе!. Апа1. Тесй. Арр1. 9:73). Одноцепочечные фрагменты ДНК маркерных нуклеиновых кислот образца и контроля можно денатурировать и позволять им ренатурировать. Вторичная структура одноцепочечных нуклеиновых кислот варьирует, в зависимости от последовательности, полученное изменение электрофоретической подвижности обеспечивает выявление даже одного изменения оснований. Фрагменты ДНК можно метить или выявлять с помощью меченых зондов. Чувствительность анализа можно повышать с использованием РНК (вместо ДНК), в которой вторичная структура является более чувствительной к изменению последовательности. В одном варианте осуществления в рассматриваемом способе анализ гетеродуплексов используется для разделения двухцепочечных гетеродуплексных молекул на основании изменений электрофоретической подвижности (Кееп е! а1. (1991), Тгепбк Сепе!. 7:5).
В другом варианте осуществления анализируют миграцию мутантных фрагментов или фрагментов дикого типа в полиакриламидных гелях, содержащих градиент денатурирующего агента, с использованием гель-электрофореза в денатурирующем градиенте (ЭССЕ) (Муегк е! а1. (1985), йа!иге, 313:495). Когда в качестве способа анализа используют ЭССЕ, ДНК может быть модифицирована для обеспечения того, чтобы она полностью не денатурировала, например, добавлением с помощью ПЦР СС-зажима приблизительно из 40 п.н. из СС-богатой ДНК с высокой температурой отжига. В следующем варианте осуществления для идентификации различий в подвижности ДНК контроля и образца вместо денатурирующего градиента используют градиент температуры (КокепЬаит апб Кейкпег (1987), Вюрйук. Сйет. 265:12753).
Примеры других способов выявления точковых мутаций включают, но не ограничиваются ими, селективную гибридизацию с олигонуклеотидами, селективную амплификацию или селективное удлинение праймеров. Например, можно получать олигонуклеотидные праймеры, в центр которых внесена мутация, а затем гибридизовать их с ДНК-мишенью в условиях, которые позволяют гибридизацию, только если найдено точное совпадение (δπίΐά е! а1. (1986), йа!иге, 324:163; δπίΐά е! а1. (1989), Ргос. йа!1. Асаб. δα. и8А, 86:6230). Такие аллелеспецифические олигонуклеотиды гибридизуются с амплифицированной посредством ПЦР ДНК-мишенью или рядом различных мутаций, когда олигонуклеотиды присоединяются к мембране для гибридизации и гибридизуются с меченой ДНК-мишенью.
Альтернативно, совместно с настоящим изобретением можно использовать технологию аллелеспецифической амплификации, которая зависит от селективной амплификации посредством ПЦР. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для специфичной амплификации, могут нести представляющую интерес мутацию в центре молекулы (так что амплификация зависит от отличающейся гибридизации) (СЬЬк е! а1. (1989), Йпс1. Аабк Кек. 17:2437) или на самом 3'-конце одного праймера, где в соответствующих условиях неправильное спаривание оснований может предотвращаться или оно может уменьшать удлинение полимеразой (Ргоккпег (1993), Т1Ь!есй, 11:238). Кроме того, может быть желательным внесение нового участка рестрикции в область мутации для обеспечения выявлению на основе расщепления (Сакрапт е! а1. (1992), Мо1. Се11 РгоЬек, 6:1). Ожидается, что в определенных вариантах осуществления амплификацию также можно проводить с использованием Тасрлигазы для амплифликации (Вагапу (1991), Ргос. йа!1. Асаб. δα. и8А, 88:189). В таких случаях лигирование происходит, только если существует точное совпадение на 3'-конце 5'-последовательности, что делает возможной выявление наличия известной мутации в конкретном участке путем выявления наличия или отсутствия амплификации.
- 20 020920
Следует понимать, что описанные варианты осуществления настоящего изобретения являются только иллюстративными для некоторых из применений принципов настоящего изобретения. Специалисты в данной области на основе указаний, представленных в настоящем документе, могут проводить различные модификации без отклонения от истинной сущности и объема изобретения. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, цитированных на протяжении этого документа, включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.
Нижеследующие примеры представлены в качестве репрезентативных для настоящего изобретения. Эти примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения, поскольку эти и другие эквивалентные варианты осуществления будут очевидны ввиду настоящего описания, фигур и прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1.
Репрезентативный способ I для отделения фагоцитарных клеток от нефагофитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 2 и 3, покрыть планшеты авидином.
2. Добавить в лунки биотинилированное антитело к нефагоцитарной клетке крови (например, Т-клеткам), инкубировать в течение 30 мин при КТ, промыть лунки.
3. Добавить магнитные гранулы.
4. Добавить образец \УВс крови.
5. Инкубировать при 37°С (30 мин - 1 ч).
6. После фагоцитоза гранул фагоцитарными клетками и связывания авидин-биотин-антитела с нефагоцитарными клетками поместить планшет сверху магнита и промыть (фагоцитарные клетки, которые интернализовали магнитные гранулы и нефагоцитарные клетки, связанные с антителом, останутся; все другие клетки отмоются).
7. Удалить магнит и собрать фагоцитарные клетки.
8. Выделить РНК из фагоцитарных клеток (например, клеток, связанных с магнитными гранулами) и нефагоцитарных клеток (например, клеток, прикрепленных ко дну лунок с помощью связанного с ним биотинилированного антитела против нефагоцитарных клеток), получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, полные генные чипы и/или чипы для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
9. Выделить ДНК из каждого клеточного образца и идентифицировать признаки ДНК опухоли, селективно присутствующие в фагоцитах (т.е. отсутствующие в нефагоцитах); сравнить профили (например, полные генные чипы, мутации ДНК и/или §МР, выявленные в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках).
10. Выделить белок из каждого клеточного образца, провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, Р8Л и Р8МЛ при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
11. Выделить липиды из каждого клеточного образца и сравнить количество и качество, например, с использованием ВЭЖХ.
Пример 2.
Репрезентативный способ II для отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 2 и 3, лизировать КВс в образце крови.
2. Центрифугировать \УВс на предметных стеклах на цитоцентрифуге.
3. Фиксировать клетки в смеси ацетон/метанол (-20°с в течение 5 мин).
4. Окрашивать гематоксилином и эозином и антителом против Т-клеток.
5. Выделить Т-клетки (нефагоцитарные) и макрофаги (фагоцитарные) с использованием микроскопии с лазерным захватом (ЬсМ).
6. Выделить РНК из фагоцитарных клеток и нефагоцитарных клеток, получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, полные генные чипы и/или чипы для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
7. Выделить ДНК из каждого клеточного образца, провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили (например, полные генные чипы, мутации ДНК и/или 8МР), полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
8. Выделить белок из каждого клеточного образца, провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, Р8А и Р8МА при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
- 21 020920
9. Выделить липиды из каждого клеточного образца и сравнить количество и качество, например, с использованием ВЭЖХ.
Пример 3.
Репрезентативный способ III для отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 2 и 3, лизировать ВВС в образце крови.
2. Использовать магнитные конъюгированные с антителом гранулы для выделения нефагоцитарных (например, Т-клеток) и фагоцитарных клеток (например, нейтрофилов, и/или макрофагов, и/или моноцитов) из цельной крови.
3. Выделить РНК из каждого клеточного образца, получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, чип для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
4. Выделить ДНК из каждого образца, провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
5. Выделить белок из каждого клеточного образца, провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, РδΑ и РδΜΑ при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
6. Выделить липиды из каждого клеточного образца и сравнить количество и качество, например, с использованием ВЭЖХ.
Пример 4.
Репрезентативный способ IV отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 2 и 3, окрасить \УВС флуоресцентными антителами, специфичными к конкретной субпопуляции клеток (например, нейтрофилам, макрофагам, моноцитам, Т-клеткам и т.п.).
2. Сортировать клетки (например, ΡΑСδ).
3. Выделить РНК из каждого клеточного образца, получить кДНК, кРНК и использовать их для дифференциации генетических профилей (например, чип для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
4. Выделить ДНК из каждого клеточного образца, провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
5. Выделить белок из каждого клеточного образца, провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, РδΑ и РδΜΑ при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
6. Выделить липиды из каждого клеточного образца и сравнить количество и качество, например, с использованием ВЭЖХ.
Пример 5.
Репрезентативный способ V отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 5 и 6, окрасить \УВС флуоресцентными антителами к каждой субпопуляции клеток (например, нейтрофилам, макрофагам, моноцитам и Т-клеткам), а затем окрасить красителем ДНК (например, йодидом пропидия).
2. Сортировать клетки (ΡΑСδ) на Т-клетки, нейтрофилы (2п), нейтрофилы (>2п), макрофаги (2п), макрофаги (>2п), моноциты (2п) и моноциты (>2п).
3. Выделить РНК из Т-клеток, нейтрофилов (>2п), макрофагов (>2п) и моноцитов (>2п). Затем получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, чип для генов злокачественных опухолей) фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
4. Выделить ДНК из Т-клеток, нейтрофилов (>2п), макрофагов (>2п) и моноцитов (>2п). Провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток.
5. Выделить белок из Т-клеток, нейтрофилов (>2п), макрофагов (>2п) и моноцитов (>2п). Провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, РδΑ и РδΜΑ при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток. Альтернативно, использовать масс-спектрометрию для идентификации белков.
6. Выделить липиды из Т-клеток, нейтрофилов (>2п), макрофагов (>2п) и моноцитов (>2п). Сравнить количество и качество липидов, например, с использованием ВЭЖХ.
- 22 020920
Пример 6.
Репрезентативный способ VI отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии.
1. Как указано на фиг. 5 и 6, окрасить \УВС флуоресцентными антителами к каждой субпопуляции клеток (например, нейтрофилам, макрофагам, моноцитам и Т-клеткам), а затем окрасить красителем ДНК (например, йодидом пропидия).
2. Сортировать клетки (ЕАС8) на фагоцитах 2п и >2п.
3. Выделить РНК из фагоцитов 2п и >2п. Затем получить кДНК, кРНК и использовать для дифференциации генетических профилей (например, чип для генов злокачественных опухолей) 2п-фагоцитарных и >2п-фагоцитарных клеток.
4. Выделить ДНК из фагоцитов 2п и >2п. Провести анализ ДНК-чипов и сравнить профили, полученные для 2п-фагоцитарных и >2п-фагоцитарных клеток.
5. Выделить белок из каждых из фагоцитов 2п и >2п. Провести вестерн-блоттинг с использованием антител к известным белкам, сверхэкспрессированным на опухолях человека (например, Р8А и Р8МА при раке предстательной железы; СЕА при раке толстого кишечника и СА125 при раке яичника), и сравнить профили, полученные для 2п-фагоцитарных и >2п-фагоцитарных клеток.
6. Выделить липиды из фагоцитов 2п и >2п. Сравнить количество и качество липидов, например, с использованием ВЭЖХ.
Пример 7.
Выявление опухолеспецифических генных признаков в фагоцитах, полученных от имеющих опухоли мышей.
Согласно вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы дифференциации между нормальным неспецифическим шумовым уровнем и опухолеспецифическими и/или специфичными к заболеванию признаками в крови или других жидкостях организма. Профили экспрессии генов в моноцитах/макрофагах и нейтрофилах крови от имеющих опухоли мышей сравнивали с профилями для нефагоцитарных Т-клеток от тех же донорных мышей для идентификации опухолеспецифических признаков в фагоцитарных клетках, которые либо не экспрессировались, либо в значительной степени дифференциально экспрессировались в нефагоцитарных клетках от тех же имеющих опухоли мышей и от не имеющих опухолей мышей.
Злокачественные клетки ЕЫСаР предстательной железы человека.
Бестимусным мышам пийе (п=5) подкожно инъецировали (к.с.) клетки ЬХСаР рака предстательной железы человека. Через 27 суток (размер опухоли ~0,4 см) у мышей брали кровь путем пункции сердца (~1 мл/мышь) в содержащие ЭДТА пробирки, которые затем центрифугировали. Лейкоцитарную пленку отбирали и промывали и нейтрофилы, макрофаги и Т-клетки разделяли с использованием соответственно иммуномагнитных ЭупаВеайк для нейтрофилов, макрофагов и Т-клеток мыши. РНК выделяли из каждого клеточного образца (Тпа/о1®). Качество РНК определяли, как показано на фиг. 3. Выход РНК представлен на фиг. 20. Получали кДНК и биотинилированную кРНК (кРНК-В). Наконец, образец кРНК-В инкубировали с микрочипами генов злокачественных опухолей человека (ОЬдо СЕАггау® Нитап Сапсег РайтауРшйег Мюгоаггау - ОН8-033 - 8ирегАггау Вюкаепсе). После гибридизации мембраны промывали и окрашивали авидин-щелочной фосфатазой и проводили выявление генов с использованием хемилюминесценции (рентгеновская пленка).
Опухоли аденокарциномы толстого кишечника Б8174Т человека, клетки карциномы ЬЬС1, клетки меланомы В16Р10 мыши.
Сходные эксперименты проводили с клетками, полученными от бестимусных мышей пийе (п=5), которым подкожно инъецировали опухоли аденокарциномы толстого кишечника Ь8174Т человека (размер опухоли ~0,3 см), мышей С57/В1 (п=5), которым подкожно инъецировали клетки карциномы легкого Льюис ЬЬС1 (размер опухоли ~0,6 см), и мышей С57/В1 (п=5), которым внутривенно инъецировали за 22 суток до этого 106 клеток меланомы мыши В16Р10 (когда клетки опухоли имели мышиное происхождение, образцы кРНК-В гибридизовали с ОБдо СЕАггау® Моизе Сапсег РайтауРшйег Мюгоаггау - ОММ033 - 8ирегАггау Вюзиепсе). РНК также выделяли из экспоненциально растущих клеток Ь8174Т, ЬЬС1, В16Р10 и ЕЫСаР в культуре и из нейтрофилов, макрофагов и Т-клеток, полученных от не имеющих опухолей мышей С57/В1 и мышей пийе, и определяли их связанные со злокачественной опухолью генные профили.
Согласно данным, полученным из этих экспериментов и показанным на фиг. 9-17, нейтрофилы и макрофаги, полученные от мышей, которым инъецировали клетки опухоли предстательной железы или толстого кишечника, и от мышей, имеющих рак легкого или меланому мыши, имеют различные связанные с опухолью генные признаки, которые также имеются в их соответствующих опухолевых клетках. Эти связанные со злокачественной опухолью гены не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне (ί) нефагоцитарными Т-клетками, полученными от имеющих опухолей мышей; и (ίί) фагоцитарными нейтрофилами и макрофагами, полученными от не имеющих опухолей мышей.
- 23 020920
Например, нейтрофилы, выделенные из крови мышей пибе, имеющих клетки рака предстательной железы человека ЬМСаР, экспрессировали несколько генных признаков человека (Нитап Сапсег Раб1теауРшбег Мюгоаггау), которые также экспрессировались в клетках ЬМСаР (профили чипов на фиг. 9А и В для сравнения). Эти гены либо не экспрессировались, либо экспрессировались на минимальном уровне в Т-клетках, полученных от имеющих опухоли мышей, или нейтрофилах, полученных от нормальных мышей (см. профили на фиг. 9С и Ό). Аналогично, нейтрофилы, выделенные из крови мышей, имеющих клетки рака легкого мыши ЬЬС1, экспрессировали несколько генных признаков опухоли мыши (Мойке Сапсег РаШтеауРшбег Мюгоаггау), которые экспрессировались в клетках ЬЬС1 (профили чипов на фиг. 13А и В для сравнения).
Эти гены либо не экспрессировались, либо экспрессировались на минимальном уровне в Т-клетках, полученных от имеющих опухоли мышей, или нейтрофилах, полученных от нормальных мышей (см. профили, представленные на фиг. 13С и Ό). Наконец, чипы сканировали, количественно определяли интенсивность каждого гена с использованием программного обеспечения, предоставляемого компанией, и идентифицировали гены, сверхэкспрессированные селективно фагоцитарными клетками, как представлено на фиг. 19 и 20. На фиг. 21 и 22 приведены генные признаки, приобретенные и дифференциально проявляемые фагоцитарными \УВС имеющих опухоли мышей. Как показано на фиг. 21, были выявлены многие онкогены (гены, обозначенные красным цветом, например ЕКВВ2 и 1ип), и они экспрессировались одновременно в макрофагах и нейтрофилах.
Мышам С57/В1 (п=5) инъецировали подкожно клетки карциномы легкого Льюис мыши 1Е6 (ЬЬС1). Через 20 суток мышам проводили анестезию и отбирали кровь пункцией сердца (приблизительно 1 мл/мышь) в содержащую ЭДТА пробирку. После центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре лейкоцитарную пленку переносили в пробирку и промывали РВЗ.
Антитела Ι§Ο крысы против макрофагов/моноцитов мыши (маркер моноцитов/макрофагов - Р4/80 1дО2Ь от АЬБ 8его1ес. Ра1ещ1г ΝΟ) инкубировали (комнатная температура в течение 30 мин) с магнитными гранулами с антителом против 1§С крысы (ΌΥΝΑΒΕΑΌ® с антителом овцы против 1§С крысы от ΙΝνίΤΚΌΟΕΝ™, Саг1кЬаб, СА). Затем гранулы для макрофагов/моноцитов промывали в РВЗ и хранили на льду.
Ι§Ο крысы против нейтрофилов мыши (маркер нейтрофилов ΝΙΜΡ-Κ14 - 1§С2а - ЗаШа С’ги/ Вю1есЬпо1оду, 8ап1а Сгн/, СА) инкубировали (комнатная температура в течение 30 мин) с магнитными гранулами с антителом против 1§С крысы (ΌΥΝΑΒΕΑΌ® с антителом овцы против 1§С крысы - ΙΝνίΤΚΌΟΕΝ™), промывали в РВ8 и хранили на льду.
Гранулы ΟΥΝΑΒΕΑΌ® тоике Рап Т (ТЬу 1.2) (ΙΝνίΤΚΟΟΕΝ™) также промывали в РВ8 и хранили на льду.
Макрофаги и моноциты крови мыши выделяли из суспензии \УВС полученной, как указано выше, с использованием гранул с антителами к макрофагам/моноцитам. По существу, гранулы добавляли к образцу \УВС и после их инкубации (4°С в течение 30 мин) выделяли связанные с макрофагами гранулы с использованием магнита и промывали РВ8 три раза и хранили на льду.
Затем из оставшихся \УВС выделяли Т-клетки мыши. В кратком изложении, гранулы для Т-клеток мыши добавляли к суспензии ^ВС, образцы инкубировали (4°С в течение 30 мин), выделяли связанные с Т-клетками гранулы с использованием магнита, промывали их РВ8 и хранили на льду.
Наконец, нейтрофилы мыши выделяли из оставшегося образца \УВС. К клетками добавляли магнитные гранулы для нейтрофилов мыши и образцы инкубировали (4°С в течение 30 мин). Связанные с нейтрофилами гранулы выделяли с использованием магнита, промывали РВ8 и хранили на льду.
Затем из каждого образца выделяли РНК (с использованием ТККОЬ®, ΙΝΥΤΓΚΟΟΕΝ™, Саг1кЬаб, СА). Качество РНК определяли, как показано на фиг. 7. Выход РНК представлен на фиг. 8. Далее, получали кДНК (биотинилированную) и инкубировали (60°С в течение ночи) с микрочипами для генов злокачественных опухолей человека (ОЬЮО ΟΕΑΚΚΑΥ® Нитап Сапсег РаШтеауРшбег Мюгоаггау ОММ-033, З^е^ину Вюкшепсе, Ргебепск, МО). После гибридизации мембраны промывали и окрашивали авидин-щелочной фосфатазой и проводили выявление генов с использованием хемилюминесценции (рентгеновская пленка).
Опухоли аденокарциномы толстого кишечника человека ЬЗ175Т, клетки карциномы ЕЬС1 и клетки меланомы мыши В16Р10.
Сходные эксперименты проводили с клетками, полученными от бестимусных мышей пибе (п=5), которым подкожно инъецировали опухоли аденокарциномы толстого кишечника человека ЬЗ174Т (размер опухоли ~0,3 см), мышей С57/В1 (п=5), которым подкожно инъецировали клетки карциномы легкого Льюис ЕЬС1 (размер опухоли ~0,6 см), и мышей С57/В1 (п=5), которым внутривенно инъецировали за 22 суток до этого 106 клеток меланомы мыши В16Р10 (когда клетки опухоли имели мышиное происхождение, образцы кРНК-В гибридизовали с О1що ΟΕΑγγηυ® Мойке Сапсег РаШтеауРшбег Мюгоаггау - ОММ-033 - З^зе^ти Вюкшепсе). РНК также выделяли из экспоненциально растущих клеток ЕЗ174Т, ЕЕС1, В16Р10 и Р-КС'аР в культуре и из нейтрофилов, макрофагов и Т-клеток, полученных от не имеющих опухолей мышей С57/В1 и мышей пибе, и определяли их связанные со злокачественной
- 24 020920 опухолью генные профили.
Согласно данным, полученным из этих экспериментов и представленным на фиг. 9Ά-Ό, 10Ά-Ό, 11Ά-Ό, 12А-Э, 13А-Э, 14А-Э, 15А-Э, 16А-Э, нейтрофилы и макрофаги (полученные от мышей, которым инъецировали клетки предстательной железы или клетки опухоли толстого кишечника человека, и от мышей, имеющих рак легкого или меланому мыши) имели различные связанные со злокачественной опухолью генные признаки, которые также имелись в их соответствующих опухолевых клетках (фиг. 21). Эти связанные со злокачественной опухолью гены не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне (ί) нефагоцитарными Т-клетками, полученными от имеющих опухолей мышей; и (ίί) фагоцитарными нейтрофилами и макрофагами, полученными от не имеющих опухолей мышей.
Например, нейтрофилы, выделенные из крови мышей пиПе, имеющих клетки рака предстательной железы человека ЕЖ'.'аР, экспрессировали несколько генных признаков человека (Нитап Сапсег РаШуауРтПег Мкгоаггау), которые также экспрессировались в клетках ЕЖ'.’аР (профили чипов на фиг. 9А и В для сравнения). Эти гены либо не экспрессировались, либо экспрессировались на минимальном уровне в Т-клетках, полученных от имеющих опухоли мышей, или нейтрофилах, полученных от нормальных мышей (см. профили на фиг. 9С и Ό). Наконец, чипы сканировали, интенсивность каждого гена количественно определяли с использованием программного обеспечения, предоставляемого компанией, и идентифицировали гены, сверхэкспрессированные селективно фагоцитарными клетками, как представлено на фиг. 19 и 20. На фиг. 21 и 22 приведены генные признаки, приобретенные и дифференциально проявляемые фагоцитарными АВС имеющих опухоли мышей. Как показано на фиг. 21, были выявлены многие онкогены (например, ЕКВВ2 и Йип), и они экспрессировались одновременно в макрофагах и нейтрофилах (показаны как гены, выделенные зеленым цветом).
Пример 8.
Выявление опухолеспецифических генных признаков в фагоцитах, полученных от пациентов со злокачественной опухолью.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения профили экспрессии генов в моноцитах/макрофагах и нейтрофилах крови от пациентов со злокачественной опухолью сравнивали с профилями экспрессии в нефагоцитарных Т-клетках тех же доноров для идентификации опухолеспецифических признаков в фагоцитарных клетках, которые либо не экспрессировались, либо экспрессировались на значительно отличающемся уровне в нефагоцитарных клетках.
Пациенты с опухолями головы и шеи.
мл венозной крови получали (в содержащую ЭДТА пробирку) от пациентов, о которых было известно, что они имеют плоскоклеточную карциному шеи и у которых запланирована хирургическая операция. После центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре лейкоцитарную пленку переносили в пробирку и промывали РВ8.
Клетки разделяли с использованием иммуномагнитных гранул ЭупаВеайз® с антителами крысы против Т-клеток, нейтрофилов и макрофагов/моноцитов ШУТТКОСЕК™, СагкЪаП, СА. По существу, гранулы добавляли последовательно к образцу АВС и после индивидуальных инкубации при 4°С в течение 30 мин гранулы, связанные с Т-клетками, нейтрофилами и макрофагами/моноцитами выделяли с использованием магнита и промывали РВ8 три раза.
Затем из каждого образца выделяли РНК (с использованием ТККОЬ®, 1КУ1ТКОСЕК™, СагкЪаП, СА). Определяли количество и качество РНК и получали кДНК и биотинилированную кРНК (кРНК-В). Наконец, образцы кРНК-В инкубировали (60°С в течение ночи) с микрочипами генов злокачественных опухолей человека (ОЬдо СЕАггау®® Нитап Сапсег РаШтеауРшПег Мкгоаггау - ОН8-033 -8ирегАггау Вкзскпсе, Ргейегкк, МО). После гибридизации мембраны промывали и окрашивали авидин-щелочной фосфатазой и проводили выявление генов с использованием хемилюминесценции (рентгеновская пленка).
Согласно данным, полученным из этих экспериментов, нейтрофилы и макрофаги (полученные от пациентов с раком головы и шеи) имели различные связанные со злокачественной опухолью генные признаки, которые также были найдены в их соответствующих опухолевых клетках. Эти связанные со злокачественной опухолью гены не экспрессировались или минимально экспрессировались нефагоцитарными Т-клетками.
Например, нейтрофилы, выделенные из крови одного такого пациента, экспрессировали четыре генных признака опухоли человека (Нитап Сапсег РаШтеауРшПег Мкгоаггау), которые также экспрессировались в биоптате опухоли, полученном от того же пациента (профили на чипах на фиг. 17В и С для сравнения). Эти гены либо не экспрессировались, либо экспрессировались на минимальном уровне в биоптатах нормальной кожи и в Т-клетках, выделенных из того же образца крови (см. профили на фиг. 17А и Ό соответственно). Наконец, чипы сканировали, количественно определяли интенсивность каждого гена с использованием программного обеспечения, предоставляемого компанией, и были идентифицированы следующие гены, которые селективно сверхэкспрессировались (>2 раз) фагоцитарными клетками: ген гомолога вирусного онкогена Е26 (ЕТ82), ген взаимодействующего с Та! белка Н1У-1 (НТАТ1Р2), ген 1Ь8 (активация и хемотаксис нейтрофилов), онкоген Йип (ΐυΝ) и ген матриксной металлопротеиназы 9
- 25 020920 (ММР9).
Пациенты с раком яичника.
Сходные эксперименты проводили с клетками, полученными от пациента с раком яичника. Согласно данным, полученным из этих экспериментов, нейтрофилы и макрофаги (полученные от женщины с заболеванием) экспрессировали множество связанных со злокачественной опухолью генов, которые не экспрессировались или экспрессировались на минимальном уровне нефагоцитарными Т-клетками.
Например, макрофаги, выделенные из крови пациентки с раком яичника, экспрессировали 23 генных признака опухоли человека (Нитап Сапсег РабтауРшбег Мюгоаггау), которые либо не экспрессировались, либо экспрессировались на минимальном уровне в Т-клетках, выделенных из образца крови (профили на фиг. 18А и В для сравнения). Наконец, чипы сканировали, количественно определяли интенсивность каждого гена с использованием программного обеспечения, предоставленного компанией, и определяли интенсивность для каждого связанного со злокачественной опухолью гена в каждом типе клеток. Перечень из 23 связанных со злокачественной опухолью генов, дифференциально активированных/сверхэкспрессированных в макрофагах, а также отношения интенсивности макрофагов к интенсивности Т-клеток представлены на фиг. 22. Следует отметить, что было выявлено пять онкогенов (показаны красным на фиг. 21).
Пример 9.
Выявление опухолеспецифических белковых признаков в фагоцитах, полученных от мышей, имеющих опухоли предстательной железы человека ЬКСаР и опухоли толстого кишечника человека Ь8174Т.
Для выделения и очистки белков из \УВС. Т-клеток и макрофагов мыши использовали набор для очистки белков (Когдеп, 1псогрога1еб, Ргобис! # 23500). Анализ был очень простым и быстрым (приблизительно 30 мин) и выделенные белки, которые имели высокое качество и превосходный выход (117,6±10,60 мкг на 4 мл крови, п=5), можно было использовать в ряде последующих применений, таких как анализ δΌδ-РАСЕ, как представлено на фиг. 23, и вестерн-блоттинг.
Для этих исследований образцы белков выделяли из фагоцитарных (моноциты/макрофаги) и нефагоцитарных (Т-лимфоциты) клеток, полученных от мышей, имеющих опухоли ЬКСаР и Ь§174Т, поскольку первая из этих клеточных линий экспрессирует ΡδΑ (Эептеабе е! а1. (2001), Ргоз1а!е, 48:1; Ьш е! а1. (2001), 1. Иго1. 166:1943), а вторая обладает опухолеспецифическим гликопротеином (ТАС-72), высокомолекулярным муцином (Со1сйег е! а1. (1981), Ргос. Ка!1. Асаб. 8сг И8А, 78:3199; Со1сйег е! а1. (1984), Сапсег Кез. 44:5744; Казз15 е! а1. (1996), I. Ыис1. Меб. 37:343). Вестерн-блот анализ проводили с помощью 16 мкг очищенных образцов белков. По существу, каждый образец смешивали с двумя объемами нагрузочного буфера δΌδ и разделяли на 10% δΌδ-ΡΑΟΕ вместе с неокрашенными белковыми стандартами Ргетзюп Р1из (Вюгаб) в буфере Тпз-глицин-δΌδ (рН 8,4) при 200 В. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (в течение ночи при 4°С) с использованием устройства Мгш Тгапз-В1о! (Вюгаб) и буфера для переноса, содержащего 25 мМ Тпз, рН 8,4, 192 мМ глицин и 20% метанол. Мембрану блокировали 5% обезжиренным сухим молоком (60 мин при комнатной температуре (КТ)) и инкубировали (1 ч, КТ) либо с В72.3, моноклональным антителом мыши против ТАС-72 человека, либо с ЕК-РК8, моноклональным антителом мыши против Р8А человека. Блоты промывали, а затем инкубировали с конъюгатом антитела козы против антител мыши с НКР 1ттип-§!аг (Вюгаб), вторичным антителом специфчным к 1дС мыши, и проявляли посредством инкубации (5 мин, КТ) со смесью 1: 1 раствора люминола и пероксидного буфера (Вюгаб) с последующей радиоавтографией.
Данные отчетливо указывают на то, что фагоцитарные клетки из имеющих опухоли ЬКСаР мышей были положительными по Р8А, в то время как этот белок нельзя было выявить в нефагоцитарных Т-клетках от тех же животных, как представлено на фиг. 24. Аналогично, ТАС-72 экспрессировался моноцитами/макрофагами, полученными от имеющих опухоли Ь§174Т мышей, и он полностью отсутствовал в Т-клетках этих же животных. Эти данные демонстрируют приобретение и экспрессию опухолеспецифических белковых признаков фагоцитарными клетками.
Хотя эти данные являются специфичными для животных со злокачественной опухолью и фагоцитарных и нефагоцитарных клеток, полученных из крови мышей, описанные способы также пригодны для человека и при диагностике и/или выявлении одного или нескольких других нарушений и/или заболеваний и для фагоцитарных и нефагоцитарных клеток, полученных из других жидкостей организма.
Пример 10.
Эксперименты по анализу профиля.
Выделение фагоцитарных клеток крови.
Получают образец крови пациента. Кровь (~5 мл) переносят в 50-мл пробирку, содержащую 50 мкл 0,5 М ЭДТА (конечная концентрация ЭДТА ~4,8 мМ). Пробирку встряхивают осторожно и добавляют 25 мл лизирующего КВС буфера (Когдеп, 1псогрога!еб). Пробирку снова осторожно встряхивают, инкубируют при комнатной температуре до изменения цвета раствора на ярко-красный (3-5 мин) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 3 мин. После осторожного аспирирования супернатанта \УВС промывают 40 мл не содержащего Са/Мд 0,1 М РВ§ (содержащего 2% РВ§, 2 мМ ЭДТА и 20 мМ глюкозу), а
- 26 020920 затем клетки (106/мл) инкубируют (30 мин, 4°С в темноте) с раствором для окрашивания клеток, содержащим (ί) проникающую в жизнеспособные клетки краску для ДНК Ноесйк! 33342 (4 мкг/мл; Ет=483 нм), (ίί) моноклональное антитело против моноцитов/макрофагов человека (А1еха Р1иог® 647-конъюгат; Ет=668 нм), которое распознает антиген Р4/80 человека, экспрессируемый циркулирующими моноцитами/макрофагами, и (ίίί) моноклональное антитело против моноцитов человека (КРЕ-конъюгат; Ет=578 нм), которое распознает циркулирующие нейтрофилы человека. Затем клетки промывают и сортируют (ВО РАСЗАпа) на нейтрофилы (Νπ=2), нейтрофилы (Ып>2), моноциты/макрофаги (М/Мп=2) и моноциты/макрофаги (М/Мп>2).
Анализ профиля генов.
Будет проведен анализ полногеномного профиля человека. Для образцов РНК, полученных из опухолевых клеток или нейтрофилов (Νπ=2, Ν>2) и моноцитов/макрофагов (М/Мп=2, М/Мп>2) человека, используют СепеСЫр® Нитап Сепоте И133 Р1ик 2.0 Аггау от Айутейгх 1псогрога1еб. Этот чип анализирует уровень экспрессии свыше 47000 транскриптов и вариантов, включая 38500 хорошо охарактеризованных генов человека. Как правило, для определения профилей экспрессии генов человека с использованием указанного выше чипа используют экстрагированную РНК. Для обеспечения воспроизводимости на чипе анализ профиля каждого образца проводят три раза и эксперимент повторяют один раз. Данные микрочипа фильтруют в отношении связанных со злокачественной опухолью генов, как описано ниже, и проверяют с использованием количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскриптазой (КТ-РСК).
Активация/подавление связанных со злокачественной опухолью генов.
РНК выделяют с использованием Тпа/о1 (1пуйгодеи, 1псогрога1еб) и очищают с использованием кассет, предоставленных в наборе. Качество и количество РНК оценивают с помощью Вюапа1у/ег 2100 (Адйей Тесйпокфек, 1псогрога1еб, Ра1о А11о, СА) и программного обеспечения Недгаботе1ег версии 1.41 (всемирный АеЬ: ^NАа^^аук.о^§). Эти экспериментальные результаты помогут отличить молекулярные каскады, нарушенные вследствие присутствия опухолей.
Анализ экспериментов на микрочипах.
Анализ полученных данных крупномасштабной/высокопроизводительной экспрессии будет основан в основном на возможности (ί) идентифицировать гены, дифференциально экспрессируемые в фагоцитарных клетках с содержанием ДНК >2, (ίί) отметить идентифицированные гены и (ίίί) определить отмеченные гены как гены, специфично экспрессируемые конкретными опухолями. Статистический анализ данных микрочипа можно проводить, например, с использованием пакета бСЫр, который легко адаптирует этот тип построения списка генов в его меню Апа1ук1к/Сотраге 8атр1ек. При использовании Айутейгх СепеСйрк один или несколько Сепе Сйрк и связанных с ними способов будут применять для проверки качества исходных данных микрочипов (Саийег е1 а1. (2004), ВюшГогтайск, 20:307). Более того, для обеспечения оптимального протокола нормализации и суммирования наборов зондов (для получения величин экспрессии) будут использовать различные способы коррекции и нормализации по фону (НиЬег е1 а1. (2002), ВюшГогтайск, 18 (8ирр1. 1): 896; Аи е1 а1. (2004), 1оигпа1 оГ 1йе Атепсап 81абкбса1 Аккос1айоп, 99:909; 8ео апб НоГГтап (2006), ВюМеб. Сеп1га1 ВютГогтайск, 7:395). В двухстадийном фильтрационном подходе авторы настоящего изобретения будут сравнивать профили генов Рп=2 с профилями Рп>2 и строить список экспрессированных генов, а затем сравнивать эти гены с опухолеспецифическими генами, идентифицированными для каждой опухолевой клеточной линии - после фильтрации профиля генов Рп=2, как показано на фиг. 5. Например, (ί) получат кровь от пациентов с раком молочной железы; (ίί) выделят нейтрофилы (п>2 и п=2) и определят их генные профили три раза; (ίίί) для каждой группы (N>2 и Ν=2) вычислят среднее значение (для 3 образцов) для каждого идентифицированного гена и его соответствующую стандартную ошибку (8В); (ίν) затем профили экспрессии генов двух групп сравнят и идентифицируют список (Ь-1) экспрессированных генов на основе абсолютного логарифмического изменения >2 раз (Ν^/Ν^), согласно модифицированному двухвыборочному ΐ-критерию Велша; (ν) профили экспрессии генов Ν=2 и профили экспрессии генов при раке молочной железы (полученные из биоптатов опухоли и нормальной ткани молочной железы) сравнят и идентифицируют список (Ь-2) экспрессированных генов; и (νί) приобретенные/экспрессированные в №>2 специфичные для рака молочной железы генные признаки идентифицируют путем сравнения генов в Ь-1 и Ь-2 (АпаРНк/Сотраге 8атр1ек/СотЬше Сотрапкопк, бСЫр) и фильтрации общих генов.
Анализ профиля белков.
От 50 до 100 мкг тотального белка из каждого типа клеток будут денатурировать и восстанавливать трис-(2-карбоксиэтил)фосфинтрипсином (1 мМ) и 0,02% додецилсульфатом натрия при 60°С в течение 1 ч. Затем остатки цистеин будут блокировать и общий белок будут расщеплять трипсином при 37°С в течение 12-16 ч. Полученные пептиды будут метить ИКАО (с помощью меток 113-119 и 121) в течение 1 ч (4-компонентные или 8-компонентные в зависимости от числа типов клеток, для сравнения). После мечения отдельно меченые образцы объединят и инъецируют в систему ВЭЖХ АдПеШ 1200 8епек, оборудованную сильной катионообменной колонкой (АррНеб Вюкуйетк 4,6x100 Рогоик). Затем 96 собранных фракций объединяют в 14 фракций и каждую фракцию инъецируют в систему ВЭЖХ ЬС Раскгпдк
- 27 020920 иШта1с для второго раунда фракционирования в обращенно-фазовых условиях (аналитическая колонка ЬС Раск1п§8 15 смх75 мкм). Обращенно-фазовые фракции точечно нанесут непосредственно на заданный планшет с использованием ЬС Раскшдк РгоЬо! и проанализируют с помощью масс-спектрометрии (Аррйсб Вю5У51сш5 4800 Р1и8 Рго1сопис5 Апа1у/сг). После получения данных спектры обработают с использованием пакета программ РгоЮтРПо! (Аррйсб ВюууЧспъ ΜΌδ §сюх) и идентифицируют отдельные белки в каждом из типов клеток с их относительными уровнями экспрессии с использованием программного обеспечения РгоЮтРПо!™ (анализ и идентификация ассоциированных со злокачественной опухолью протеомных признаков будет сходна с анализом, приведенным на фиг. 5, для геномных признаков).

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, в частности, когда индивид имеет одну или несколько доклинических форм рака, диагностированную первичную злокачественную опухоль и метастазирующий рак, включающий следующие стадии:
    получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии;
    идентификация дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого набора характеристик экспрессии, или для идентификации опухолеспецифического признака, включающий следующие стадии: получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови больного раком; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови больного раком;
    сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии;
    идентификация дифференциальной экспрессии двух или более маркеров, специфичных для первого профиля экспрессии.
  2. 2. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, включающий следующие стадии: получение первого набора характеристик экспрессии в фагоцитарной клетке крови индивида; получение второго набора характеристик экспрессии в нефагоцитарной клетке крови индивида; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии;
    идентификация циркулирующей опухолевой клетки или ее субклеточного фрагмента, специфичного для первого набора характеристик.
  3. 3. Способ по п.2, где повышение количества маркера в первом наборе характеристик экспрессии по сравнению со вторым набором характеристик экспрессии указывает на наличие либо циркулирующей опухолевой клетки, либо ее субклеточного фрагмента, либо того и другого.
  4. 4. Способ выявления злокачественной клетки у индивида, включающий следующие стадии: выделение популяции фагоцитарных клеток индивида;
    отделение фагоцитарных клеток 2η от фагоцитарных клеток >2η; получение первого набора характеристик экспрессии из фагоцитарных клеток 2η; получение второго набора характеристик экспрессии из фагоцитарных клеток >2η; сравнение первого и второго наборов характеристик экспрессии;
    идентификация дифференциальной экспрессии одного или нескольких маркеров, специфичных для первого набора характеристик экспрессии.
  5. 5. Способ по пп.1, 2 или 4, где один или несколько маркеров для выявления или идентификации раковой клетки выбраны из группы, состоящей из ДНК, РНК, белка, липида, углевода и их комбинаций.
  6. 6. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарная клетка крови выбрана из группы, состоящей из одного или нескольких из нейтрофила, макрофага, моноцита, дендритной клетки и пенистой клетки.
  7. 7. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где нефагоцитарная клетка крови выбрана из группы, состоящей из одной или нескольких из Т-клетки, В-клетки, нуль-клетки и базофила.
  8. 8. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови, мочи, стула, слюны, лимфы или цереброспинальной жидкости, или способ по п.4 для выявления раковой клетки или инфекционного агента, где фагоцитарную клетку крови выделяют из цельной крови, мочи, стула, слюны, лимфы или цереброспинальной жидкости.
  9. 9. Способ по п.1 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови выделяют из популяции лейкоцитов.
  10. 10. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием антител, или способ по п.4, где фагоцитарную клетку крови выделяют с использованием антител.
  11. 11. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с помощью одного или нескольких способов, выбранных из группы,
    - 28 020920 состоящей из активированной флуоресценцией сортировки клеток, фильтрации, градиентного центрифугирования, элюирования, и способов микрофлюидики, или способ по п.4, где фагоцитарную клетку крови разделяют с помощью одного или нескольких способов, выбранных из группы, состоящей из активированной флуоресценцией сортировки клеток, фильтрации, градиентного центрифугирования, элюирования, и способов микрофлюидики.
  12. 12. Способ по п.8 или 9 для выявления раковой клетки, где фагоцитарную клетку крови и нефагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессированным на плазматических мембранах популяций лейкоцитов, или способ по п.4 для выявления раковой клетки или выявления инфекционного агента, где фагоцитарную клетку крови разделяют с использованием лиганда, который связывается с молекулярным рецептором, экспрессированным на плазматических мембранах популяций лейкоцитов.
  13. 13. Способ по п.1 или 2 для выявления раковой клетки, где маркер выбран из одной или нескольких ДНК, РНК и микроРНК, соответствующих одному или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогена и гена супрессии опухоли, или по п. 1 для идентификации опухолеспецифического признака, где два или несколько маркеров представляют собой ДНК или РНК, соответствующие двум или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогенам и генам супрессии опухоли, или их сочетания, или по п.4 для выявления раковой клетки, где один или несколько маркеров выбраны из группы, состоящей из ДНК, РНК, микроРНК и их сочетаний, соответствующих двум или нескольким генам злокачественной опухоли, онкогенам, генам супрессии опухоли или их сочетаниям.
  14. 14. Способ по п.1 или 2 для выявления раковой клетки, где маркер представляет собой белок или полипептид или белок и пептид, кодируемые одним или несколькими генами злокачественной опухоли, и онкогеном и геном опухолевой супрессии, или способ по п.1 для идентификации опухолеспецифического признака, где два или несколько маркеров представляют собой белки или пептиды, кодируемые двумя или несколькими генами злокачественной опухоли, онкогенами, генами опухолевой супрессии или их сочетаниями.
EA201070863A 2008-01-18 2009-01-19 Способ выявления злокачественной клетки у индивида EA020920B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2203308P 2008-01-18 2008-01-18
US7343408P 2008-06-18 2008-06-18
PCT/US2009/031395 WO2009092068A1 (en) 2008-01-18 2009-01-19 Methods of detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201070863A1 EA201070863A1 (ru) 2011-02-28
EA020920B1 true EA020920B1 (ru) 2015-02-27

Family

ID=40885676

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201070863A EA020920B1 (ru) 2008-01-18 2009-01-19 Способ выявления злокачественной клетки у индивида
EA201400710A EA201400710A1 (ru) 2008-01-18 2009-01-19 Способы детекции признаков заболеваний или состояний в жидкостях организма

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201400710A EA201400710A1 (ru) 2008-01-18 2009-01-19 Способы детекции признаков заболеваний или состояний в жидкостях организма

Country Status (18)

Country Link
US (8) US20110033839A1 (ru)
EP (3) EP3358354B1 (ru)
JP (6) JP5781767B2 (ru)
KR (7) KR20200091961A (ru)
CN (3) CN107119108A (ru)
AU (1) AU2009205956B2 (ru)
BR (2) BR122018069446B8 (ru)
CA (2) CA2712303C (ru)
DK (1) DK2240781T3 (ru)
EA (2) EA020920B1 (ru)
ES (2) ES2809171T3 (ru)
HK (2) HK1243737A1 (ru)
IL (4) IL207027A0 (ru)
MX (2) MX340916B (ru)
NZ (2) NZ602007A (ru)
PT (1) PT2240781T (ru)
SG (2) SG187453A1 (ru)
WO (1) WO2009092068A1 (ru)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009205956B2 (en) 2008-01-18 2015-07-02 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
EP2857522A3 (en) 2009-03-12 2015-10-14 Cancer Prevention And Cure, Ltd. Methods of identification, assessment, prevention and therapy of lung diseases and kits thereof including gender-based disease identification, assessment, prevention and therapy
AU2011280997A1 (en) * 2010-07-23 2013-02-28 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting autoimmune or immune-related diseases or conditions
SG10201505724SA (en) * 2010-07-23 2015-09-29 Harvard College Methods of detecting diseases or conditions using phagocytic cells
EP2596349B1 (en) * 2010-07-23 2017-12-13 President and Fellows of Harvard College Methods of detecting cardiovascular diseases or conditions
EP2596353A4 (en) 2010-07-23 2014-01-15 Harvard College METHOD FOR DETECTING PRENATAL OR PREGNANT DISEASES OR SUFFERING
CA2806296A1 (en) * 2010-07-23 2012-01-26 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting kidney-associated diseases or conditions
US20130178375A1 (en) * 2010-07-23 2013-07-11 President And Fellows Of Harvard College Methods of Detecting Neurological or Neuropsychiatric Diseases or Conditions
MX361944B (es) * 2010-07-23 2018-12-19 President And Fellows Of Harvard College Star Metodos para detectar firmas de enfermedad o condiciones en fluidos corporales.
WO2012125721A2 (en) * 2011-03-14 2012-09-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for using the contents of phagocytes to detect neoplasms
CA3120217A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Cancer Prevention And Cure, Ltd. Methods of identification and diagnosis of lung diseases using classification systems and kits thereof
JP6362543B2 (ja) * 2012-02-23 2018-07-25 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 細胞および他の複雑な生物学的材料のクロマトグラフィーによる単離
US11156596B2 (en) 2012-06-01 2021-10-26 Creatv Microtech, Inc. Capture, identification and use of a new biomarker of solid tumors in body fluids
CA2874691C (en) 2012-06-01 2021-08-24 Creatv Microtech, Inc. Capture, identification and use of a new biomarker of solid tumors in body fluids
AU2013274002A1 (en) * 2012-06-15 2015-02-05 Harry Stylli Methods of detecting diseases or conditions
US10494675B2 (en) 2013-03-09 2019-12-03 Cell Mdx, Llc Methods of detecting cancer
EP2965086A4 (en) * 2013-03-09 2017-02-08 Harry Stylli Methods of detecting prostate cancer
WO2015095359A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Harry Stylli Methods of detecting diseases or conditions
WO2015128396A1 (de) * 2014-02-26 2015-09-03 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren für die molekulardiagnostik zum anreichern einer nukleinsäure aus einer biologischen probe
DE102014206441A1 (de) * 2014-04-03 2015-10-08 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren für die Molekulardiagnostik zum Anreichern einer Nukleinsäure aus einer biologischen Probe
MY184699A (en) 2014-04-16 2021-04-18 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells
EP3186397B1 (en) 2014-08-25 2024-02-07 Creatv Microtech, Inc. Use of circulating cell biomarkers in the blood for detection and diagnosis of diseases and methods of isolating them
WO2016040843A1 (en) * 2014-09-11 2016-03-17 Harry Stylli Methods of detecting prostate cancer
GB2594421A (en) * 2015-03-06 2021-10-27 Micromass Ltd Inlet instrumentation for ion analyser coupled to rapid evaporative ionisation mass spectrometry ("REIMS") device
US20170097355A1 (en) * 2015-10-06 2017-04-06 University Of Washington Biomarkers and methods to distinguish ovarian cancer from benign tumors
MA45489A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
MA45426A (fr) 2015-10-22 2019-05-01 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits, agents et appareils de transduction
EP3426826A4 (en) * 2016-03-09 2019-09-04 Molecular Stethoscope, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR DETECTION OF TISSUE STATES
CN110709936A (zh) 2017-04-04 2020-01-17 肺癌蛋白质组学有限责任公司 用于早期肺癌预后的基于血浆的蛋白质概况分析
NZ758485A (en) 2017-04-27 2024-02-23 Juno Therapeutics Gmbh Oligomeric particle reagents and methods of use thereof
JP2020532732A (ja) 2017-09-01 2020-11-12 ヴェン バイオサイエンシズ コーポレーション 診断および治療モニタリングのためのバイオマーカーとしての糖ペプチドの同定および使用
KR20200095465A (ko) * 2017-10-18 2020-08-10 벤 바이오사이언시스 코포레이션 진단 및 치료 모니터링을 위한 생물학적 매개변수의 식별 및 용도
WO2020028456A1 (en) * 2018-07-31 2020-02-06 Cell Mdx, Llc Compositions and methods for detecting prostate cancer
CN109207425A (zh) * 2018-09-29 2019-01-15 中国医科大学附属口腔医院 牙龈卟啉单胞菌诱导巨噬细胞外泌体rna表达研究方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4814434A (en) * 1984-02-03 1989-03-21 Ventres Laboratories, Inc. Inducer of T-suppressor cells
US5043267A (en) * 1984-05-18 1991-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for rapid detection of bacterial and fungal infection
US6117985A (en) * 1995-06-16 2000-09-12 Stemcell Technologies Inc. Antibody compositions for preparing enriched cell preparations
US20060094067A1 (en) * 2002-06-26 2006-05-04 Ralf Herwig Method for the determination of characteristics and/or the classification of circulating macrophages, and analysis arrangement for carrying out said method
US20060115832A1 (en) * 2002-11-14 2006-06-01 Jon Wayne Cancer Institute Detection of cancer cells in body fluids
US20070015172A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-18 Z-Biomed, Inc. Expression profiles for microbial infection
US20070099209A1 (en) * 2005-06-13 2007-05-03 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20070134689A1 (en) * 2005-09-28 2007-06-14 National Taiwan University Tumor marker for ovarian cancer diagnosis

Family Cites Families (268)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4868103A (en) 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
US4843155A (en) 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
US5077216A (en) 1988-07-06 1991-12-31 The Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies specific for a human mononculear phagocyte-specific antigen
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
DE69326967T2 (de) 1992-01-17 2000-06-15 Lakowicz Joseph R Phasenmodulationsenergieübertragungsfluoroimmunassay
WO1994016101A2 (en) 1993-01-07 1994-07-21 Koester Hubert Dna sequencing by mass spectrometry
US6172198B1 (en) 1993-03-19 2001-01-09 Northern Sydney Area Health Service PAPP-A, its immunodetection and uses
US5594637A (en) 1993-05-26 1997-01-14 Base Ten Systems, Inc. System and method for assessing medical risk
US5498531A (en) 1993-09-10 1996-03-12 President And Fellows Of Harvard College Intron-mediated recombinant techniques and reagents
US5514598A (en) 1993-11-30 1996-05-07 Doody; Michael Prenatal detection of meconium
US6025395A (en) 1994-04-15 2000-02-15 Duke University Method of preventing or delaying the onset and progression of Alzheimer's disease and related disorders
US7625697B2 (en) * 1994-06-17 2009-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6031088A (en) 1996-05-23 2000-02-29 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Polycystic kidney disease PKD2 gene and uses thereof
US20030044859A1 (en) 1996-08-19 2003-03-06 Henslee Jerry G. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US20010051341A1 (en) 1997-03-04 2001-12-13 Isis Innovation Limited Non-invasive prenatal diagnosis
GB9704444D0 (en) 1997-03-04 1997-04-23 Isis Innovation Non-invasive prenatal diagnosis
US20020119118A1 (en) 1997-11-03 2002-08-29 Genentech, Inc. Novel polypeptides and nucleic acids encoding bolekine
JPH11118792A (ja) * 1997-10-17 1999-04-30 Ajinomoto Co Inc マクロファージの分類方法、免疫性疾患等の検定方法及び免疫性疾患治療剤のスクリーニング方法
JP3301963B2 (ja) * 1998-04-14 2002-07-15 和久 鍬田 重症化侵襲のスクリーニング方法
WO2000040749A2 (en) 1999-01-06 2000-07-13 Genenews Inc. Method for the detection of gene transcripts in blood and uses thereof
US6762032B1 (en) 1999-08-23 2004-07-13 Biocrystal, Ltd. Compositions, assay kits, and methods for use related to a disease condition comprising multiple sclerosis and/or a pro-MS immune response
DE60139553D1 (de) 2000-06-05 2009-09-24 Genetics Inst Llc Zusammensetzungen, testsätze und methoden zur identifizierung und modulation von typ i diabetes
ES2291246T3 (es) 2000-06-27 2008-03-01 Von Recklinghausen Gesellschaft E.V. Procedimiento para adquirir datos para el diagnostico presintomatico o prenatal de neurofribromatosis del tipo 1.
US6631330B1 (en) 2000-08-21 2003-10-07 Assistance Publique-Hopitaux De Paris (Ap-Hp) Diagnosis method of inflammatory, fibrotic or cancerous disease using biochemical markers
WO2002028999A2 (en) * 2000-10-03 2002-04-11 Gene Logic, Inc. Gene expression profiles in granulocytic cells
US6664056B2 (en) 2000-10-17 2003-12-16 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive prenatal monitoring
WO2002070748A2 (en) * 2000-10-24 2002-09-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Response of dendritic cells to a diverse set of pathogens
FR2816411B1 (fr) 2000-11-03 2003-07-04 Inst Nat Sante Rech Med Moyens de detection de la transformation pathologique de la proteine app et leurs applications
DE60239522D1 (de) 2001-01-09 2011-05-05 Baylor Res Inst Dallas Verfahren zur behandlung von autoimmunerkrankungen bei einem probanden und diagnostische in-vitro-assays
WO2002061434A2 (en) 2001-01-29 2002-08-08 The Center For Blood Research, Inc Anergy-regulated molecules
US6753137B2 (en) 2001-01-31 2004-06-22 The Chinese University Of Hong Kong Circulating epstein-barr virus DNA in the serum of patients with gastric carcinoma
GB0104690D0 (en) 2001-02-26 2001-04-11 Cytogenetic Dna Services Ltd Diagnostic test
FR2824144B1 (fr) 2001-04-30 2004-09-17 Metagenex S A R L Methode de diagnostic prenatal sur cellule foetale isolee du sang maternel
CA2446666A1 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Biovision Ag Method for detecting progredient chronic dementia, and associated peptides and detection reagents
US7235358B2 (en) * 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
WO2003019193A1 (en) 2001-08-30 2003-03-06 Ciphergen Biosystems, Inc. Method of diagnosing nephrotic syndrome
US6927028B2 (en) 2001-08-31 2005-08-09 Chinese University Of Hong Kong Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA
US20040038201A1 (en) * 2002-01-22 2004-02-26 Whitehead Institute For Biomedical Research Diagnostic and therapeutic applications for biomarkers of infection
US6986995B2 (en) 2002-02-28 2006-01-17 Prometheus Laboratories, Inc. Methods of diagnosing liver fibrosis
US7744876B2 (en) 2002-04-09 2010-06-29 The Curators Of The University Of Missouri Methods and compositions for treatment, prevention, suppression, and/or delaying the onset of type 1 diabetes
US7009038B2 (en) 2002-05-02 2006-03-07 Univ. Of Medicine & Dentistry Of N.J. pDJA1, a cardiac specific gene, corresponding proteins, and uses thereof
JP4514606B2 (ja) 2002-05-09 2010-07-28 ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド 心血管疾患マーカーおよび治療標的としてのｉｌ１ｒｌ−１
US20040009518A1 (en) 2002-05-14 2004-01-15 The Chinese University Of Hong Kong Methods for evaluating a disease condition by nucleic acid detection and fractionation
CA2390820A1 (en) 2002-06-17 2003-12-17 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease
AU2003246380A1 (en) 2002-07-05 2004-01-23 Evotec Neurosciences Gmbh Diagnostic and therapeutic use of tb2 gene and protein for neurodegenerative diseases
FR2844279A1 (fr) 2002-09-06 2004-03-12 Inst Nat Sante Rech Med Moyens de detection des processus neurodegeneratifs et leurs applications
AU2003272547A1 (en) 2002-09-16 2004-04-30 Abgenix, Inc. Method for the treatment of nephritis using anti-pdgf-dd antibodies
EP1826217B1 (en) * 2002-10-02 2010-07-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Method for identification of antigenic peptides
DK1571970T3 (da) 2002-10-02 2011-11-28 Dmi Biosciences Inc Diagnose og monitorering af sygdomme
US20040086864A1 (en) 2002-10-22 2004-05-06 The Chinese University Of Hong Kong Novel classification methods for pleural effusions
GB0225360D0 (en) 2002-10-31 2002-12-11 Univ London Genetic markers
AU2003298689A1 (en) * 2002-11-21 2004-06-18 Wyeth Methods for diagnosing rcc and other solid tumors
AU2002952993A0 (en) 2002-11-29 2002-12-12 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Therapeutic and diagnostic agents
CN101245376A (zh) 2003-01-17 2008-08-20 香港中文大学 作为妊娠相关病症的诊断标志物的循环mRNA
EP1590673B1 (en) 2003-02-04 2009-04-15 EVOTEC Neurosciences GmbH Diagnostic use of scn2b for alzheimer's disease
WO2004071269A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 Intellectual Property Consulting Inc. Gene marker and composition for diagnosis and treatment of neurological disorders and diseases and use of the same
WO2004076639A2 (en) 2003-02-26 2004-09-10 Wyeth Use of gene expression profiling in the diagnosis and treatment of lupus nephritis and systemic lupus erythematosus
US20070026398A1 (en) 2003-03-03 2007-02-01 Farnsworth Amanda L Protein tyrosine phosphatase-prl-1 a a marker and therapeutic target for pancreatic cancer
US20070105105A1 (en) * 2003-05-23 2007-05-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Surrogate cell gene expression signatures for evaluating the physical state of a subject
EP1718327B1 (en) 2003-06-20 2015-01-07 University of Florida Biomarkers for differentiating between type 1 and type 2 diabetes
DE10333406A1 (de) 2003-07-15 2005-02-10 Protagen Ag T-regulatorische-Zellen enthaltend Galectine zur Therapie und Diagnose von Erkrankungen
WO2005012907A1 (en) 2003-08-01 2005-02-10 Renovar, Inc. Systems and methods for characterizing kidney diseases
US7323346B2 (en) 2003-08-14 2008-01-29 The General Hospital Corporation Screening for gestational disorders
EP2354253A3 (en) 2003-09-05 2011-11-16 Trustees of Boston University Method for non-invasive prenatal diagnosis
US7445886B2 (en) 2003-09-10 2008-11-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Macrophage migration inhibitory factor as a marker for cardiovascular risk
US20050181386A1 (en) 2003-09-23 2005-08-18 Cornelius Diamond Diagnostic markers of cardiovascular illness and methods of use thereof
US20070122813A1 (en) 2003-10-03 2007-05-31 David Salomon Use of cripto-1 as a biomarker for neurodegenerative disease and method of inhibiting progression thereof
CN1930303B (zh) 2003-10-08 2013-11-20 波士顿大学信托人 染色体异常的产前诊断试剂盒
EP1524321B2 (en) 2003-10-16 2014-07-23 Sequenom, Inc. Non-invasive detection of fetal genetic traits
US7670764B2 (en) 2003-10-24 2010-03-02 Prometheus Laboratories Inc. Methods of diagnosing tissue fibrosis
AU2004294178C1 (en) 2003-11-19 2011-10-27 Rules-Based Medicine, Inc. Methods for diagnosis, stratification, and monitoring of Alzheimer's disease
US20060094064A1 (en) 2003-11-19 2006-05-04 Sandip Ray Methods and compositions for diagnosis, stratification, and monitoring of alzheimer's disease and other neurological disorders in body fluids
EP1685410A1 (en) 2003-11-19 2006-08-02 EVOTEC Neurosciences GmbH Diagnostic and therapeutic use of the human sgpl1 gene and protein for neurodegenerative diseases
WO2005072340A2 (en) 2004-01-27 2005-08-11 Compugen Ltd. Novel polynucleotides encoding polypeptides and methods using same
WO2005075674A1 (en) 2004-02-04 2005-08-18 Evotec Neurosciences Gmbh Diagnostic and therapeutic use of kcne4 gene and protein for alzheimer disease
WO2005082110A2 (en) 2004-02-26 2005-09-09 Illumina Inc. Haplotype markers for diagnosing susceptibility to immunological conditions
DE102004016437A1 (de) 2004-04-04 2005-10-20 Oligene Gmbh Verfahren zur Erkennung von Signaturen in komplexen Genexpressionsprofilen
US8071552B2 (en) 2004-04-05 2011-12-06 Universite Bordeaux 2 Peptides and peptidomimetics binding to CD23
US20080051334A1 (en) 2004-04-16 2008-02-28 Evotec Neurosciences Gmbh Diagnostic and Therapeutic Use of Kcnc1 for Neurodegenerative Diseases
WO2005103712A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Sphingotec Gmbh Use of precursors of tachykinins and/or their fragments in medical diagnostic
AU2005240669A1 (en) 2004-05-07 2005-11-17 Garvan Institute Of Medical Research Detecting disease association with aberrant glycogen synthase kinase 3-beta expression
JP2007535959A (ja) 2004-05-10 2007-12-13 エボテツク・ニユーロサイエンシーズ・ゲー・エム・ベー・ハー アルツハイマー病のためのｋｃｎｊ６の診断および治療使用
US8013123B2 (en) 2004-05-13 2011-09-06 B.R.A.H.M.S. Gmbh Use of precursors of enkephalins and/or their fragments in medical diagnostics
EP1766060A4 (en) * 2004-05-14 2007-11-28 King Pharmaceuticals Res & Dev METHODS FOR DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF SOLID TUMORS AND MELANOMAS
ATE518142T1 (de) 2004-05-19 2011-08-15 Uinv Kobenhavns Adam12 als marker für das turner-syndrom beim fötus
US7709194B2 (en) 2004-06-04 2010-05-04 The Chinese University Of Hong Kong Marker for prenatal diagnosis and monitoring
EP1797425A2 (en) 2004-07-19 2007-06-20 University of Rochester Biomarkers of neurodegenerative disease
US7943294B2 (en) 2004-07-30 2011-05-17 Hologic, Inc. Methods for detecting oncofetal fibronectin
WO2006020899A2 (en) 2004-08-13 2006-02-23 Metrigenix Corporation Markers for autoimmune disease detection
WO2006023966A2 (en) 2004-08-24 2006-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Center For Technology Transfer Assessment of cardiovascular risk
US20070087376A1 (en) 2004-08-30 2007-04-19 Potashkin Judith A Splice variants of pre-mRNA transcripts as biomarkers in idiopathic neurodegenerative diseases
WO2006032126A1 (en) 2004-09-24 2006-03-30 Syn X Pharma, Inc. Diagnosis and treatment of early pre-type-1 diabetes utilizing neuronal proteins
WO2006050475A2 (en) 2004-11-03 2006-05-11 Brigham And Women's Hospital, Inc. Identification of dysregulated genes in patients with neurological diseases
WO2006048778A1 (en) 2004-11-08 2006-05-11 King's College London Markers of predisposition to addictive states
US20060115854A1 (en) 2004-12-01 2006-06-01 Power3 Medical Products, Inc. Acetyl-LDL receptor related proteins and peptides as a biomarker for neurodegenerative disease
US20060115855A1 (en) 2004-12-01 2006-06-01 Power3 Medical Products, Inc. FK506-binding protein 7 related protein as a biomarker for neurodegenerative disease
CA2590775A1 (en) 2004-12-07 2006-06-15 Electrophoretics Limited Diagnosis of neurodegenerative diseases
GB0426859D0 (en) 2004-12-07 2005-01-12 Proteome Sciences Plc Diagnosis of neurodegenerative disorders
EP1838735A2 (en) 2004-12-31 2007-10-03 Genentech, Inc. Polypeptides that bind br3 and uses thereof
FR2880897B1 (fr) 2005-01-18 2010-12-17 Inst Nat Sante Rech Med Methode de detection, non invasive, prenatale, in vitro de l'etat sain normal, de l'etat de porteur sain ou de l'etat de porteur malade de la mucoviscidose
US7432107B2 (en) 2005-01-24 2008-10-07 Roche Diagnostics Operations, Inc. Cardiac hormones for assessing cardiovascular risk
US20060172429A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Nilsson Erik J Methods of identification of biomarkers with mass spectrometry techniques
US7572592B2 (en) 2005-01-31 2009-08-11 Glycominds Ltd Method for diagnosing multiple sclerosis
US20070141625A1 (en) 2005-02-03 2007-06-21 Santos Jose H Method for assessing risk of and predisposition to development of a pathology related to the presence of anti-epcr autoantibodies
ITRM20050067A1 (it) 2005-02-17 2006-08-18 Istituto Naz Per Le Malattie I Metodo per la rivelazione di acidi nucleici virali o di origine virale nelle urine.
CA3007182A1 (en) 2005-03-18 2006-09-21 The Chinese University Of Hong Kong Markers for prenatal diagnosis, monitoring or predicting preeclampsia
AU2006224971B2 (en) 2005-03-18 2009-07-02 Boston University A method for the detection of chromosomal aneuploidies
JP2008537776A (ja) 2005-03-24 2008-09-25 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター 妊娠期間中に胎児１３トリソミーまたは胎児１３トリソミーのリスクを診断する方法
DK2146209T3 (da) 2005-04-06 2012-02-13 Univ Antwerp Neurodegenerative markører for Alzheimer's sygdom
US20090054321A1 (en) 2005-04-18 2009-02-26 O'neill Luke Anthony John Polypeptides and use thereof
WO2006114661A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Dwek Raymond A High throughput glycan analysis for diagnosing and monitoring rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases
WO2006121952A2 (en) 2005-05-05 2006-11-16 The Regents Of The University Of California Diagnostic biomarkers for neurodevelopmental disorders
PL1889065T3 (pl) 2005-05-18 2013-12-31 Novartis Ag Metody diagnostyki i leczenia chorób posiadających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny
WO2006135904A2 (en) * 2005-06-13 2006-12-21 Kohne David E Method for producing improved results for applications which directly or indirectly utilize gene expression assay results
GB0512401D0 (en) 2005-06-17 2005-07-27 Randox Lab Ltd Method
GB2428240A (en) 2005-07-14 2007-01-24 Univ Gen Ve Diagnostic method for brain damage-related disorders
US20070148661A1 (en) 2005-07-19 2007-06-28 Duke University LSAMP Gene Associated With Cardiovascular Disease
IL172297A (en) 2005-10-03 2016-03-31 Compugen Ltd Soluble vegfr-1 variants for the diagnosis of preeclampsia
US20070218469A1 (en) 2005-10-03 2007-09-20 Ruth Navon Novel mutations in hexosaminidase A
AU2006302031A1 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Tethys Bioscience, Inc. Diabetes-associated markers and methods of use thereof
WO2007047907A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 The Regents Of The University Of Michigan Dek protein compositions and methods of using the same
AR056786A1 (es) 2005-11-10 2007-10-24 Smithkline Beecham Corp Compuesto de 1h- imidazo ( 4,5-c) piridin-2-ilo, composicion farmaceutica que lo comprende, procedimiento para preparar dicha composicion, su uso para preparar unmedicamento, uso de una combinacion que omprende al compuesto y al menos un agente antineoplasico para preparar un medicamento y dicha com
SG179468A1 (en) 2005-12-22 2012-04-27 Baxter Int Improved monocyte activation test better able to detect non-endotoxin pyrogenic contaminants in medical products
TW200726845A (en) 2006-01-02 2007-07-16 Nat Defense Medical Ct Biomarker molecular of renal illness and detecting method for the same
EP1808694A1 (en) 2006-01-17 2007-07-18 Universitätsklinikum Freiburg Method for diagnosing polycystic kidney disease
FR2896588B1 (fr) 2006-01-20 2016-08-19 Univ D'angers Methode de diagnostic in vitro de reponse immunitaire autoimmune par detection d'anticorps diriges contre l'antigene pentraxine 3.
EP1987361A4 (en) 2006-01-30 2009-03-04 Invitrogen Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING AND QUANTIFYING TOXIC SUBSTANCES IN DISEASE STATES
US7459280B2 (en) 2006-02-27 2008-12-02 Picobella, Llc Methods for diagnosing and treating kidney cancer
CA2689848A1 (en) 2006-02-28 2007-09-07 Phenomenome Discoveries Inc. Methods for the diagnosis of dementia and other neurological disorders
US7488584B2 (en) 2006-03-24 2009-02-10 Picobella Methods for diagnosing and treating kidney and colorectal cancer
US20070224638A1 (en) 2006-03-27 2007-09-27 Institut Pasteur Secreted proteins as early markers and drug targets for autoimmunity, tumorigenesis and infections
GB0606776D0 (en) 2006-04-03 2006-05-10 Novartis Pharma Ag Predictive biomarkers for chronic allograft nephropathy
EP1847615A1 (en) 2006-04-18 2007-10-24 Genoscreen Expression and polymorphism of the ornithine transcarbamylase (OTC) gene as markers for diagnosing Alzheimer's disease
US7662578B2 (en) 2006-04-21 2010-02-16 Children's Hospital Medical Center Method and kit for the early detection of impaired renal status
WO2007143295A2 (en) 2006-04-27 2007-12-13 Critical Care Diagnostics, Inc. Interleukin-33 (il-33) for the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease
ES2380711T3 (es) 2006-05-01 2012-05-17 Critical Care Diagnostics, Inc. Diagnóstico de enfermedades cardiovasculares
US7754428B2 (en) 2006-05-03 2010-07-13 The Chinese University Of Hong Kong Fetal methylation markers
US7901884B2 (en) 2006-05-03 2011-03-08 The Chinese University Of Hong Kong Markers for prenatal diagnosis and monitoring
US8257933B2 (en) 2006-05-12 2012-09-04 Keio University Detection of inflammatory disease and composition for prevention or treatment of inflammatory disease
WO2007131345A1 (en) 2006-05-12 2007-11-22 The Hospital For Sick Children Genetic risk factor in sod1 and sfrs15 in renal disease, diabetic cataract, cardiovascular disease and longevity
AU2007254243B2 (en) 2006-05-17 2013-06-13 Ludwig Institute For Cancer Research Targeting VEGF-B regulation of fatty acid transporters to modulate human diseases
EP2032983A2 (en) 2006-05-24 2009-03-11 Cellumen, Inc. Method for modeling a disease
US20080038269A1 (en) 2006-05-25 2008-02-14 Mount Sinai Hospital Methods for detecting and treating kidney disease
US20080057590A1 (en) 2006-06-07 2008-03-06 Mickey Urdea Markers associated with arteriovascular events and methods of use thereof
DE102006027818A1 (de) 2006-06-16 2007-12-20 B.R.A.H.M.S. Aktiengesellschaft In vitro Multiparameter-Bestimmungsverfahren zur Diagnose und Frühdiagnose von neurodegenerativen Erkrankungen
WO2008084331A2 (en) 2006-06-21 2008-07-17 Hopitaux Universitaires De Geneve Biomarkers for renal disorders
WO2008003826A1 (en) 2006-07-07 2008-01-10 Oy Jurilab Ltd Novel genes and markers in essential arterial hypertension
KR100856375B1 (ko) 2006-07-18 2008-09-04 김현기 퇴행성 신경질환 진단용 마커
US7851172B2 (en) 2006-07-25 2010-12-14 University Of Kentucky Research Foundation Biomarkers of mild cognitive impairment and alzheimer's disease
US20080113358A1 (en) 2006-07-28 2008-05-15 Ravi Kapur Selection of cells using biomarkers
US20080026378A1 (en) 2006-07-28 2008-01-31 Gian Franco Bottazzo Prediction and prophylactic treatment of type 1 diabetes
ITTO20060614A1 (it) 2006-08-21 2008-02-22 Uni Degli Studi Del Piemonte "diagnosi differenziale per la sclerodermia"
WO2008028257A1 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Garvan Institute Of Medical Research Diagnostics and therapeutics of neurological disease
EP2064544A1 (en) 2006-09-14 2009-06-03 Zora Biosciences OY Biofluid metabolite profiling as a tool for early prediction of autoimmunity and type 1 diabetes risk
EP1905841A1 (en) 2006-09-25 2008-04-02 Max Delbrück Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch; Trex1 as a marker for lupus erythematosus
WO2008037449A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Proteosys Ag Use of at least one isoform of progesterone receptor membrane component 1 (pgrmc1)
US8110365B2 (en) 2006-10-05 2012-02-07 Rhode Island Hospital Compositions and methods for detecting and treating renal injury and inflammation
WO2008043725A1 (en) 2006-10-10 2008-04-17 Novartis Ag Biomarker in inflammatory disorders
WO2008043782A2 (en) 2006-10-11 2008-04-17 Novartis Ag Modulation of cd1b or cd1d expression in autoimmune disorders
US8088584B2 (en) 2006-10-16 2012-01-03 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft LTBP2 as a biomarker and diagnostic target
WO2008046511A1 (en) 2006-10-16 2008-04-24 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Crtac as a biomarker, therapeutic and diagnostic target
EP2087359A1 (en) 2006-10-16 2009-08-12 Bayer Schering Pharma AG Prss23 as a biomarker, therapeutic and diagnostic target
WO2008046510A1 (en) 2006-10-16 2008-04-24 Bayer Healthcare Ag Fn1 as a biomarker, therapeutic and diagnostic target
AU2007312960A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Newcastle Innovation Limited Assay for the detection of biomarkers associated with pregnancy related conditions
AU2007322252A1 (en) 2006-11-01 2008-05-29 George Mason Intellectual Properties, Inc. Biomarkers for neurological conditions
US20080254482A1 (en) 2006-11-22 2008-10-16 Invitrogen Corporation Autoimmune disease biomarkers
EP2082237A2 (en) 2006-12-06 2009-07-29 Universität Zürich Means and methods for isolating and determining novel targets for the treatment of neurodegenerative, neurological or neuropsychiatric disorders and compositions comprising the same
US20090104605A1 (en) 2006-12-14 2009-04-23 Gary Siuzdak Diagnosis of sepsis
IL180095A0 (en) 2006-12-14 2007-05-15 Ohad Birk Method for antenatal estimation of down syndrome risk
US8362224B2 (en) 2006-12-19 2013-01-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Screening for CD93 (C1qRp)-associated polymorphism(S) in the diagnosis, prevention and treatment of autoimmune diseases
US8815519B2 (en) 2006-12-22 2014-08-26 Hvidovre Hospital Method for predicting cancer and other diseases
AU2007342674B2 (en) 2007-01-10 2013-09-19 Purdue Research Foundation Polypeptide inhibitors of HSP27 kinase and uses therefor
WO2008085024A1 (en) 2007-01-12 2008-07-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Identification and detection of peptides relating to specific disorders
EP2468888B1 (en) 2007-01-22 2018-04-11 Medizinische Universität Innsbruck Novel markers for chronic kidney disease
AU2008213742A1 (en) 2007-02-08 2008-08-14 Powmri Limited Method of diagnosing a neurodegenerative disease
US20080261226A1 (en) 2007-02-15 2008-10-23 Rengang Wang Biomarkers of neurodegenerative disease
CA2679581C (en) 2007-02-21 2020-12-22 Anna Helgadottir Genetic susceptibility variants associated with arterial disease
WO2008112772A2 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Baylor Research Institute Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from children with diabetes
JP2010524434A (ja) 2007-03-26 2010-07-22 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ Ｋｃｎｈ２の統合失調症関連アイソフォームおよび抗精神病薬の開発
EP1975252A1 (en) 2007-03-29 2008-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Methods for the prognosis or for the diagnosis of a thyroid disease
WO2008120684A1 (ja) 2007-03-30 2008-10-09 Yamaguchi University 急性中枢神経障害の予後判定方法
EP2145182A2 (en) 2007-04-12 2010-01-20 Apitope International NV Biomarkers for multiple sclerosis
GB0707933D0 (en) 2007-04-24 2007-05-30 Apitope Technology Bristol Ltd Disease markers
GB0708075D0 (en) 2007-04-26 2007-06-06 Univ Nottingham Nethods
ES2653851T3 (es) 2007-05-01 2018-02-09 University Of Miami Biomarcadores transcriptómicos para evaluación de riesgo individual en insuficiencia cardíaca de nueva aparición
AU2008247398B2 (en) 2007-05-03 2013-10-10 Medimmune, Llc Interferon alpha-induced pharmacodynamic markers
WO2008147938A2 (en) 2007-05-24 2008-12-04 Centocor, Inc. Wnt5a as an inflammatory disease marker
US20100184110A1 (en) 2007-06-06 2010-07-22 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Predictive diagnostics for kidney disease
WO2008148858A1 (en) 2007-06-08 2008-12-11 Vib Vzw The novel adipocytokine visfatin/pbef1 is an apoptosis associated factor induced in monocytes during in vivo hiv-1 infection
WO2008156867A1 (en) 2007-06-21 2008-12-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarkers for the diagnosis of autoimmune disease
ITRM20070351A1 (it) 2007-06-22 2008-12-23 Istituto Naz Per Le Malattie I Gene codificante la proteina ambra 1 avente attivita' regolatoria dell autofagia e dello sviluppo del sistema nervoso centrale
US20110212075A1 (en) 2007-06-25 2011-09-01 Siemens Aktiengesellschaft Screening method for polymorphic markers in htra1 gene in neurodegenerative disorders
WO2009003142A1 (en) 2007-06-27 2008-12-31 The Board Of Trustees Of The Leland, Stanford Junior University Beta2-microglobulin and c reactive protein (crp) as biomarkers for peripheral artery disease
CN101801462A (zh) 2007-07-13 2010-08-11 健泰科生物技术公司 用于癌症、炎性病症和自身免疫性病症的治疗和诊断
CA2690541A1 (en) 2007-07-17 2009-01-29 Metabolon, Inc. Biomarkers for pre-diabetes, cardiovascular diseases, and other metabolic-syndrome related disorders and methods using the same
EP2185936A4 (en) 2007-08-02 2010-08-04 Iss Immune System Stimulation DIAGNOSIS, STADIFICATION AND SURVEILLANCE OF INFLAMMATORY ABDOMINAL DISEASE
US20090275046A1 (en) 2007-08-29 2009-11-05 Power3 Medical Products, Inc. Complement factor H protein as a biomarker of Parkinson's disease
US9086425B2 (en) 2007-08-29 2015-07-21 The Cleveland Clinic Foundation Carbamylated proteins and risk of cardiovascular disease
US8748100B2 (en) 2007-08-30 2014-06-10 The Chinese University Of Hong Kong Methods and kits for selectively amplifying, detecting or quantifying target DNA with specific end sequences
GB0717637D0 (en) 2007-09-10 2007-10-17 Univ Leiden Future cardiac event biomarkers
ITUD20070183A1 (it) 2007-10-01 2009-04-02 Univ Degli Studi Udine Metodo diagnostico e prognostico per la diagnosi e la prognosi della linfoproliferazione nelle malattie autoimmuni
US8062852B2 (en) 2007-10-01 2011-11-22 The Children's Hospital And Regional Medical Center Detection and treatment of autoimmune disorders
EP2209810A1 (en) 2007-10-15 2010-07-28 King's College London Viral therapeutic
EP2212693B1 (en) 2007-10-22 2015-04-22 The Regents of The University of California Biomarkers for prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus
FI20070795A0 (fi) 2007-10-24 2007-10-24 Faron Pharmaceuticals Oy Uusi biomarkkeri sairauksien kehittämisen tarkkailuun ja terapioiden tehon arviointiin
EP2557425A3 (en) 2007-10-26 2013-07-10 Biohit Oyj Methods and products for diagnosing autoimmune diseases and gastric cancer linked with atrophic gastritis
WO2009059259A2 (en) 2007-10-31 2009-05-07 Children's Hospital Medical Center Detection of worsening renal disease in subjects with systemic lupus erythematosus
WO2009058168A1 (en) 2007-11-04 2009-05-07 Prediction Sciences Llc Cellular fibronectin as a diagnostic marker in cardiovascular disease and methods of use thereof
US20100233716A1 (en) 2007-11-08 2010-09-16 Pierre Saint-Mezard Transplant rejection markers
US8008013B2 (en) 2007-11-16 2011-08-30 Oklahoma Medical Research Foundation Predicting and diagnosing patients with autoimmune disease
EP2245188A2 (en) 2007-11-28 2010-11-03 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Biomarkers for the onset of neurodegenerative diseases
US8506933B2 (en) 2007-11-30 2013-08-13 Msdx, Inc. Methods of detecting a neurological condition via analysis of circulating phagocytes
WO2009074331A2 (en) 2007-12-11 2009-06-18 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Early and differential diagnosis test for alzheimer's disease
WO2009075566A1 (en) 2007-12-12 2009-06-18 Erasmus University Medical Center Rotterdam Biomarkers for cardiovascular disease
EP2075343A1 (en) 2007-12-21 2009-07-01 Gert Mayer A method of diagnosing a progressive disease
WO2009083950A2 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Compugen Ltd. Biomarkers for the prediction of renal injury
AU2009205956B2 (en) 2008-01-18 2015-07-02 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
CN101952721A (zh) 2008-01-23 2011-01-19 里格舒斯匹塔里特医院 根据测量生物标记ykl-40的水平所发现的生存预后,对患有心血管疾病的个体的分类
US20090299155A1 (en) 2008-01-30 2009-12-03 Dexcom, Inc. Continuous cardiac marker sensor system
CN101983337A (zh) 2008-02-04 2011-03-02 班扬生物标记公司 用于诊断或治疗脑损伤的方法
US20110262928A1 (en) 2008-02-08 2011-10-27 Medimmune Llc Disease markers and uses thereof
US20090239242A1 (en) 2008-03-18 2009-09-24 Biotrin Intellectual Properties Limited Method for the early identification and prediction of kidney injury
CA2646040A1 (en) 2008-03-22 2009-09-22 David V. Pow Detection of a biomarker of aberrant cells of neuroectodermal origin in a body fluid
GB0809069D0 (en) 2008-05-19 2008-06-25 Univ Leuven Kath Gene signatures
WO2009122387A1 (en) 2008-04-04 2009-10-08 Biotrin Group Ltd. Method for the detection and prediction of obesity-related renal disease
EP2107377A1 (en) 2008-04-04 2009-10-07 BRAHMS Aktiengesellschaft Pro-endothelin-1 levels for the prediction of risk of tachyarrhytmic events
CA2720644A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Rainer Oberbauer Markers of acute kidney failure
US8030097B2 (en) 2008-04-30 2011-10-04 Versitech Limited and R & C Biogenius Limited Lipocalin-2 as a prognostic and diagnostic marker for heart and stroke risks
WO2010005750A2 (en) 2008-06-16 2010-01-14 The Regents Of The University Of California Potential prognostic markers and therapeutic targets for neurological disorders
US20100167937A1 (en) 2008-07-08 2010-07-01 Power3 Medical Products, Inc. Multiple forms of Alzheimer's disease based on differences in concentrations of protein biomarkers in blood serum
US20100068711A1 (en) 2008-07-18 2010-03-18 Xenomics, Inc. Methods of PCR-Based Detection of "Ultra Short" Nucleic Acid Sequences
WO2010011506A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 The Washington University Risk factors and a therapeutic target for neurodegenerative disorders
ES2534432T3 (es) 2008-07-31 2015-04-22 Queen Mary And Westfield College, University Of London Biomarcadores de riñón sano
CA2733990C (en) 2008-08-11 2018-12-11 Banyan Biomarkers, Inc. Biomarker detection process and assay of neurological condition
ES2341419B1 (es) 2008-08-14 2011-05-03 Hospital Clinic I Provincial De Barcelona Wnt1 como biomarcador de daño renal.
US8673574B2 (en) 2008-08-21 2014-03-18 Pxbiosciences Llc Diagnosis and monitoring of renal failure using peptide biomarkers
JP5947544B2 (ja) 2008-08-29 2016-07-06 アスチュート メディカル，インコーポレイテッド 腎損傷および腎不全の診断および予後のための方法および組成物
EP2161577A1 (en) 2008-09-01 2010-03-10 Atlas Antibodies AB ANLN protein
WO2010039714A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Genentech, Inc. Biological markers predictive of rheumatoid arthritis response to lymphotoxin antagonists
US20100124756A1 (en) 2008-10-10 2010-05-20 Sandip Ray Collection of biomarkers for diagnosis and monitoring of alzheimer's disease in body fluids
GB0818650D0 (en) 2008-10-10 2008-11-19 Uni I Oslo Methods
CA2740788C (en) 2008-10-21 2023-03-14 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
NZ619918A (en) 2008-10-21 2015-04-24 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
EP2180322A1 (en) 2008-10-22 2010-04-28 BRAHMS Aktiengesellschaft Prognostic biomarkers for the progression of primary chronic kidney disease
KR101051435B1 (ko) 2008-10-22 2011-07-22 한국생명공학연구원 대장암 관련 마커를 이용한 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 대장암 진단 방법
WO2010048497A1 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Genizon Biosciences Inc. Genetic profile of the markers associated with alzheimer's disease
WO2010046503A2 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Vereniging Vu-Windesheim Biomarkers for predicting the development of chronic autoimmune diseases
WO2010054167A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Miami Limited proteolysis of cd2ap and progression of renal disease
EP4335932A2 (en) 2008-11-07 2024-03-13 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of monitoring conditions by sequence analysis
AU2009313189B2 (en) 2008-11-10 2014-10-23 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
CN102209894A (zh) 2008-11-11 2011-10-05 安特鲁斯公司 用于评价动脉粥样硬化潜在性的生物标记
US20120094295A1 (en) 2008-11-21 2012-04-19 The Johns Hopkins University Neurodegenerative disease diagnostic compositions and methods of use
ES2528799T3 (es) 2008-11-22 2015-02-12 Astute Medical, Inc. Métodos para el pronóstico de insuficiencia renal aguda
IT1392551B1 (it) 2008-11-25 2012-03-09 Bioindustry Park Del Canavese S P A Biomarcatori per la diagnosi e per rilevare la progressione di malattie neurodegenerative, in particolare della sclerosi laterale amiotrofica
NZ735173A (en) 2008-12-09 2022-10-28 Stephanie Fryar Williams Biomarkers for the diagnosis and/or prediction of susceptibility to mental and neurodegenerative disorders
EP3474016A1 (en) 2008-12-10 2019-04-24 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of diagnosing and predicting renal disease
CA2806296A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting kidney-associated diseases or conditions
US20130178375A1 (en) 2010-07-23 2013-07-11 President And Fellows Of Harvard College Methods of Detecting Neurological or Neuropsychiatric Diseases or Conditions
EP2596349B1 (en) 2010-07-23 2017-12-13 President and Fellows of Harvard College Methods of detecting cardiovascular diseases or conditions
SG10201505724SA (en) 2010-07-23 2015-09-29 Harvard College Methods of detecting diseases or conditions using phagocytic cells
EP2596353A4 (en) 2010-07-23 2014-01-15 Harvard College METHOD FOR DETECTING PRENATAL OR PREGNANT DISEASES OR SUFFERING
MX361944B (es) 2010-07-23 2018-12-19 President And Fellows Of Harvard College Star Metodos para detectar firmas de enfermedad o condiciones en fluidos corporales.
AU2011280997A1 (en) 2010-07-23 2013-02-28 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting autoimmune or immune-related diseases or conditions
CA2827894A1 (en) 2011-02-22 2012-08-30 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Circulating biomarkers

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4814434A (en) * 1984-02-03 1989-03-21 Ventres Laboratories, Inc. Inducer of T-suppressor cells
US5043267A (en) * 1984-05-18 1991-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for rapid detection of bacterial and fungal infection
US6117985A (en) * 1995-06-16 2000-09-12 Stemcell Technologies Inc. Antibody compositions for preparing enriched cell preparations
US20060094067A1 (en) * 2002-06-26 2006-05-04 Ralf Herwig Method for the determination of characteristics and/or the classification of circulating macrophages, and analysis arrangement for carrying out said method
US20060115832A1 (en) * 2002-11-14 2006-06-01 Jon Wayne Cancer Institute Detection of cancer cells in body fluids
US20070015172A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-18 Z-Biomed, Inc. Expression profiles for microbial infection
US20070099209A1 (en) * 2005-06-13 2007-05-03 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20070134689A1 (en) * 2005-09-28 2007-06-14 National Taiwan University Tumor marker for ovarian cancer diagnosis

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAKRABORTY et al., A spontaneous murine melanoma lung metastasis comprised of host X tumor hybrids. Cancer Research, 1 May 2000, vol. 60, No. 9. pg. 2512-2519, pg. 2517, para 2 *
ENGELS. Infectious agents as causes of non-Hodgkin lymphoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. March 2007. Vol. 16. No. 3. pg. 401-404 *
KRAVTSOV et al.. Flow cytofluorometric assay of human whole blood leukocyte DNA degradation in response to Yersinia pestis and Staphylococcus aureus, Proc. SPIE, 4 May 2001. Vol. 4241. pg. 260-267 [online]. Saratov Fall Meeting 2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II. edited by Valery V. Tuchin [retrieved on 17.03.2009]. Retrieved from the internet: <URL:http://adsabs.harvard.edu//abs/2001SPIE.4241...260K, pg 260, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20100105776A (ko) 2010-09-29
NZ586834A (en) 2013-03-28
KR20180090396A (ko) 2018-08-10
JP5781767B2 (ja) 2015-09-24
EP2240781A1 (en) 2010-10-20
EP2240781B1 (en) 2018-01-10
ES2663662T3 (es) 2018-04-16
US20210238697A1 (en) 2021-08-05
PT2240781T (pt) 2018-03-28
HK1243737A1 (zh) 2018-07-20
KR20180001596A (ko) 2018-01-04
SG187453A1 (en) 2013-02-28
WO2009092068A1 (en) 2009-07-23
NZ602007A (en) 2014-09-26
US20110033839A1 (en) 2011-02-10
BRPI0906858B1 (pt) 2019-04-24
EA201400710A1 (ru) 2015-03-31
US20160369350A1 (en) 2016-12-22
MX2019011992A (es) 2019-11-08
BR122018069446B8 (pt) 2021-07-27
EP2240781A4 (en) 2012-03-07
US20160195516A1 (en) 2016-07-07
BRPI0906858A2 (pt) 2015-06-30
SG10201704689XA (en) 2017-07-28
CA2712303A1 (en) 2009-07-23
US20170044626A1 (en) 2017-02-16
CN101978269A (zh) 2011-02-16
KR20200091961A (ko) 2020-07-31
CN107119108A (zh) 2017-09-01
IL257739A (en) 2018-04-30
US20240158863A1 (en) 2024-05-16
HK1243462A1 (zh) 2018-07-13
JP2014128275A (ja) 2014-07-10
EP3779444A1 (en) 2021-02-17
CA2712303C (en) 2015-03-31
IL242781A (en) 2017-09-28
EA201070863A1 (ru) 2011-02-28
KR20190030779A (ko) 2019-03-22
JP2020126067A (ja) 2020-08-20
US10934589B2 (en) 2021-03-02
IL257739B (en) 2019-11-28
JP2018112558A (ja) 2018-07-19
BRPI0906858B8 (pt) 2021-07-27
EP3358354B1 (en) 2020-07-15
IL242780B (en) 2018-03-29
US20130023426A1 (en) 2013-01-24
AU2009205956B2 (en) 2015-07-02
US20180119226A1 (en) 2018-05-03
US11001894B2 (en) 2021-05-11
DK2240781T3 (en) 2018-03-26
ES2809171T3 (es) 2021-03-03
IL207027A0 (en) 2010-12-30
AU2009205956A1 (en) 2009-07-23
CA2878025A1 (en) 2009-07-23
CA2878025C (en) 2018-12-11
KR101815138B1 (ko) 2018-01-05
KR20220008944A (ko) 2022-01-21
MX2010007822A (es) 2010-09-30
CN107254517A (zh) 2017-10-17
KR20160084506A (ko) 2016-07-13
JP2011510304A (ja) 2011-03-31
BR122018069446B1 (pt) 2019-05-14
EP3358354A1 (en) 2018-08-08
JP2023033342A (ja) 2023-03-10
JP2016145835A (ja) 2016-08-12
US10934588B2 (en) 2021-03-02
MX340916B (es) 2016-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020920B1 (ru) Способ выявления злокачественной клетки у индивида
JP2020126067A5 (ru)
JP2021074011A (ja) 体液中の疾患または症状のシグネチャを検出する方法
AU2020203158B2 (en) Methods of detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
NZ763196A (en) Methods of detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
NZ763196B2 (en) Methods of detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids