BRPI0902782A2

BRPI0902782A2 - método para a produção de um cristal de anidrido de citrulina

Info

Publication number: BRPI0902782A2
Application number: BRPI0902782-3A
Authority: BR
Inventors: Hiroshi Kaneko; Tetsuo Tanegawa
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2008-09-05
Filing date: 2009-08-31
Publication date: 2011-05-03
Also published as: BRPI0902782B1; JP2010059125A; BRPI0902782B8; JP5125908B2

Abstract

METODO PARA A PRODUçãO DE UM CRISTAL DE ANIDRIDO DE CITRULINA Em um método de produção de um cristal de anidrido de citrulina que é composto da realização da cristalização do anidrido de citrulina a partir de uma solução aquosa de citrulina e a coleta de um cristal de anidrido de citrulina, a cristalização é realizada na presença de um aminoácido básico como ornitina, lisina, e arginina, e de preferência, na presença do aminoácido básico, em uma concentração de 0,003 a 10,0 g/100 g de H20 com relação à água na solução aquosa de citrulina.

Description

"MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM CRISTAL DE ANIDRIDO DECITRULINA"

Campo técnico

A presente invenção refere-se a um método para a produção deum cristal de anidrido de citrulina.Fundamentos da técnica

A citrulina tem sido utilizada como um produto medicinal ouum alimento para a saúde nos países do oeste e em outros. No Japão, acitrulina foi oficialmente aprovada como um aditivo alimentício peloMinistério da Saúde, Trabalho e Bem-estar em 2007. Assim sendo, espera-seque a citrulina seja aplicada não somente em medicamentos, como umaaplicação convencional, mas também em alimentos e bebidas. É sabido queum método de fermentação (documento de patente 1) é utilizado para aprodução de citrulina.

Os cristais de citrulina são amplamente divididos em doispolimorfismos de cristal, incluindo o anidrido de citrulina e o diidreto decitrulina. A presença dos polimorfismos de cristal é conhecida há muitotempo, e o anidrido de citrulina pode ser facilmente precipitados semeando-seo anidrido de citrulina em uma solução supersaturada de citrulina a 45 °C oumaior. No entanto, sabe-se que, se a cristalização é realizada a 45°C oumenor, a cristalização do diidreto de citrulina é iniciada em uma suspensão deanidrido de citrulina (documento de patente 2).

Além disso, sabe-se que, no caso em que a cristalização érealizada semeando-se diidreto de citrulina em uma solução de citrulina a 40ou 5O°C ou menor, o diidreto de citrulina pode ser facilmente obtido(documento de patente 3). Isto é, acreditava-se que de acordo com atecnologia convencional, a iniciação da cristalização do diidreto de citrulina ea transição do anidrido de citrulina em diidreto de citrulina eram facilmenteprovocados a 45°C ou menor. Se ocorre a transição, a suspensão de anidridode citrulina se torna uma mistura de anidrido de citrulina e de diidreto decitrulina ou somente de diidreto de citrulina. O anidrido de citrulina poderá tertrês tipos de cristal (α, γ, e δ), e o cristal do tipo δ é estável. Um cristal obtidopor métodos usuais, tais como a cristalização por concentração, a cristalizaçãopor resfriamento, ou semelhante, é o cristal do tipo δ (documento de patente2)·

No caso em que o produto final tem a forma de uma mistura deanidrido de citrulina e diidreto de citrulina ou somente de diidreto de citrulina,ocorrem alguns problemas nas etapas de secagem e embalagem. Isto é, énecessário secar-se o diidreto de citrulina em baixa temperatura porque, se asecagem é realizada em uma temperatura elevada, o produto seco se tornacolorido. Além disso, é difícil remover a água do cristal do diidreto decitrulina. Assim sendo, é gasto um tempo muito longo para se completar asecagem. Além disso, o cristal é fácil de se ligar a outro cristal para formarum agregado, devido ao efeito da evaporação da água do cristal durante asecagem, e é muito trabalhosa a separação ou pulverização do agregado.Além disso, o anidrido de citrulina é um cristal granulado e tende a ter umvolume específico pequeno, enquanto que o diidreto de citrulina é um cristaldo tipo agulha ou um cristal prismático e tende a ter um grande volumeespecífico. Assim sendo, quando o anidrido de citrulina e o diidreto decitrulina que têm o mesmo peso são embalados, as sacolas de embalagemnecessitam ser diferentes no tamanho. Isto é, no caso em que o anidrido decitrulina e o diidreto de citrulina que têm o mesmo peso são embalados, asacola de embalagem para o anidrido de citrulina é menor, ou o número deembalagens de anidrido de citrulina é menor. Assim sendo, o anidrido decitrulina é desejado como uma forma de produto.

No entanto, no caso em que é obtido o anidrido de citrulina,ocorrem os seguintes problemas. A solubilidade da citrulina é dependente datemperatura, e a solubilidade é maior em uma temperatura maior (odocumento não de patente 1). Assim sendo, o rendimento variasignificativamente, dependendo da temperatura de cristalização. No entantode acordo com a tecnologia convencional, a cristalização de anidrido decitrulina, desejavelmente, é realizada a 45°C ou maior, e é necessário separar-se a citrulina em um líquido mãe de cristalização contendo citrulina em umaconcentração elevada. Assim sendo, o rendimento é baixo, comparado com acristalização para a produção de diidreto de citrulina, que é fácil de ser obtidoem uma temperatura menor.

Documento de patente 1: IJP S57-163488 A

Documento de patente 2: JP S56-99453 A

Documento de patente 3: JP S46-174 B

Documento não de patente 1: " Amino acid Handook", Kogyo

Chosakai Publishing, Inc., 2003

Apresentação da invenção

Um objetivo da presente invenção é a obtenção de um cristal

de anidrido de citrulina de forma estável e/ou com rendimento elevado emuma temperatura onde a solubilidade é menor do que sempre foi antes.

Para resolver os problemas mencionados acima, os inventoresda presente invenção realizaram estudos extensos. Como resultado, verificou-se que, quando é realizada a cristalização do anidrido de citrulina na presençade um aminoácido básico, a iniciação da cristalização do diidreto de citrulinae a transição do anidrido de citrulina para diidreto de citrulina sãosignificativamente inibidos, para dessa forma produzirem o anidrido decitrulina de forma estável, comparado com o caso onde não é adicionadonenhum aminoácido e, e assim sendo, a completaram a presente invenção.

Isto é, a presente invenção refere-se ao seguinte:(1) Um método de produção de um cristal de anidrido decitrulina compreendendo:

- a realização da cristalização de anidrido de citrulina a partirde uma solução aquosa de citrulina, e

- a coleta de um cristal de anidrido de citrulina, onde acristalização é realizada na presença de um aminoácido básico;

(2) O método, conforme descrito acima, onde a cristalização érealizada em uma temperatura menor do que 45°C;

(3) O método, conforme descrito acima, onde o aminoácidobásico é um aminoácido selecionado de ornitina, lisina, e arginina;

(4) O método, conforme descrito acima, onde a citrulina é acitrulina L, e o aminoácido básico é o aminoácido L selecionado de ornitinaL, lisina L, e arginina L;

(5) O método, conforme descrito acima, onde o aminoácidobásico está presente em uma concentração de 0,003 a 10,0 g/100 g de H2O,com relação à água na solução aquosa de citrulina; e

(6) O método, conforme descrito acima, onde a cristalização érealizada por cristalização por concentração e/ou cristalização porresfriamento.

De acordo com a presente invenção, a cristalização do anidridode citrulina pode ser realizada em uma temperatura menor do que aquela natecnologia convencional e o anidrido de citrulina pode ser produzido comrendimento elevado inibindo-se significativamente a iniciação da cristalizaçãodo diidreto de citrulina e a transição do anidrido de citrulina para diidreto decitrulina.

Breve descrição dos desenhos

[Fig. 1] Fotografias mostrando um cristal de anidrido decitrulina (A) e um cristal de diidreto de citrulina (B)

[Fig. 2] Desenhos ilustrando padrões de difração de raios X depó de um cristal do tipo δ de anidrido de citrulina (A) e um cristal de diidretode citrulina (B).

Descrição das realizações preferidasDaqui por diante, a presente invenção é descrita em detalhes.

A presente invenção é direcionada para um método para aprodução de um cristal de anidrido de citrulina, constituído de: realização dacristalização de anidrido de citrulina a partir de uma solução aquosa decitrulina; e a coleta de um cristal de anidrido de citrulina, onde a cristalizaçãoé realizada na presença de um aminoácido básico. O cristal de anidrido decitrulina produzido pela presente invenção, de preferência, é um cristal dotipo δ.

O termo "solução aquosa" significa uma solução que contémsomente água como um solvente ou uma solução principalmente contendoágua como um solvente. A solução aquosa poderá conter não somente água,mas também um solvente orgânico solúvel em água, incluindo um álcoolmenor, como metanol, etanol, propanol e semelhante, ou uma cetona menor,como acetona, metil etil cetona e semelhante, desde que o efeito da presenteinvenção não seja prejudicado.

A solução aquosa de citrulina é uma solução aquosa quecontém pelo menos citrulina dissolvida na mesma. A solução poderá ser umasolução onde a citrulina é completamente dissolvida ou poderá conter nãosomente citrulina dissolvida, mas também um cristal de citrulina.

Entretanto, a solução aquosa de citrulina poderá conter umsoluto diferente de citrulina e um aminoácido básico, desde que o efeito dapresente invenção não seja prejudicado. Exemplos do soluto incluem sais eagentes de solução tampão. Além disso, a solução aquosa de citrulina poderáser um sobrenadante de uma solução de fermentação contendo citrulina ouuma solução de reação onde é produzida a citrulina. O pH da solução aquosade citrulina é, mas não é limitado a, de preferência, 2,0 a 10,0, mais depreferência, 3,0 a 9,0.

A citrulina a ser utilizada na presente invenção poderá serobtida por qualquer método de produção, e de preferência, é citrulinaoticamente ativa. Na presente invenção, é preferível a citrulina L. Exemplosdo método de produção de citrulina, incluem um método de fermentação (porexemplo, JP S57-163488 A), um método de catalisador microbiano (JP H05-168486 A e JP H08-89269 A), e um método de produção de citrulina atravésde uma reação química. Exemplos do método de produção de citrulina atravésde uma reação química incluem um método onde um sal de cobre de ornitinareage com uréia e um método onde a arginina é decomposta por álcali (JPS46-174 B).

Exemplos de aminoácido básico a ser utilizado na presenteinvenção incluem arginina, lisina, ornitina e semelhante. No caso em que acitrulina é a citrulina L, o aminoácido básico, de preferência, é o aminoácidoL.

Na presente invenção, quando é realizada a cristalização doanidrido de citrulina a partir de uma solução aquosa de citrulina, é preparadauma solução aquosa de citrulina contendo um aminoácido. Para preparar asolução aquosa de citrulina que contém um aminoácido básico, o aminoácidobásico poderá ser adicionado na solução aquosa de citrulina, ou a citrulinapoderá ser adicionada em uma solução do aminoácido básico. O aminoácidobásico a ser adicionado poderá ser um sólido ou uma solução. No caso em queé adicionado um aminoácido básico sólido, o aminoácido, de preferência, éadicionado e dissolvido.

Entretanto, o aminoácido básico poderá ser adicionado nasolução aquosa de citrulina antes da cristalização, ou o aminoácido básicopoderá ser adicionado após a cristalização de parte da citrulina como anidridode citrulina e antes da iniciação da transição em diidreto de citrulina.

Exemplos do método de cristalização incluem, mas não sãolimitados a: cristalização por concentração, onde a cristalização é realizadaatravés de concentração de uma solução aquosa de citrulina; cristalização porresfriamento, onde a cristalização é realizada através de resfriamento de umasolução aquosa de citrulina; e um método de cristalização realizado ajustando-se o pH de uma solução que contém citrulina. Daqueles, a cristalização, depreferência, é realizada por cristalização por concentração, cristalização porresfriamento, ou ambos.

Para iniciar a cristalização de um cristal de citrulina, a soluçãoaquosa de citrulina poderá ser concentrada ou resfriada para aumentar aconcentração de citrulina até um nível maior do que a solubilidade.Alternativamente, para iniciar a cristalização de um cristal de citrulina, o pHda solução aquosa de citrulina poderá ser ajustado para reduzir a solubilidade.Neste caso, se é contido um aminoácido básico, a cristalização de um cristalde anidrido de citrulina pode ser realizada em uma temperatura menor do queaquela no caso da cristalização na ausência do aminoácido básico. Entretanto,o cristal de anidrido de citrulina obtido por cristalização pode ser mantido deforma estável como um cristal de anidrido de citrulina na presença doaminoácido básico em uma temperatura menor do que aquela no caso dacristalização e na ausência do aminoácido básico. Conforme descrito acima, acristalização do anidrido de citrulina pode ser realizada em uma temperaturabaixa, e pode ser obtido um cristal de anidrido de citrulina com rendimentoelevado.

Além disso, antes ou durante o processo por concentração oude resfriamento, um cristal de anidrido de citrulina (cristal do tipo δ) poderáser adicionado como um cristal de semeadura. Um cristal de anidrido decitrulina pode ser obtido, por exemplo, através da realização da cristalização apartir de uma solução aquosa de citrulina a 45°C ou mais elevada, oupermitindo-se que uma suspensão de cristais de diidreto de citrulinapermaneça em repouso a 40 ou 50°C para realizar a transição do diidreto decitrulina em anidrido de citrulina.

Quando a cristalização é realizada a 45°C ou a menos, naausência de um aminoácido básico, a cristalização do diidreto de citrulina éiniciada ou mesmo se a cristalização do anidrido de citrulina é iniciada, ocorrea transição para o diidreto de citrulina. O fenômeno se torna maispronunciado no caso em que a temperatura de cristalização é baixa. Por outrolado, na presença de um aminoácido básico, a iniciação da cristalização doanidrido de citrulina e a transição para diidreto de citrulina poderá ocorrer emuma temperatura menor do que aquela no caso da cristalização e na ausênciado aminoácido básico. Além disso, mesmo se a temperatura é a mesma, atransição do anidrido de citrulina para diidreto de citrulina pode ser retardada.

Em uma realização da presente invenção, a solução aquosa decitrulina é concentrada para precipitar parte da citrulina como um cristal deanidrido de citrulina, e a suspensão resultante é resinada para adicionalmenteprecipitar citrulina, a qual existe na solução como um cristal de anidrido decitrulina. Neste caso, um aminoácido básico é adicionado antes ou após aconcentração da solução aquosa de citrulina, ou pelo menos no momento doresfriamento.

Quando uma suspensão de anidrido de citrulina é resfriadapara cristalizar a citrulina, é iniciada a transição para diidreto de citrulina.Neste caso, se a solução contém um aminoácido básico tendo uma estrutura(por exemplo, o número de átomos de carbono em uma cadeia lateral)semelhante àquele da citrulina, como arginina, lisina, ou ornitina, oaminoácido básico interage com a superfície do anidrido de citrulina ou ocristal de diidreto, o que poderá resultar na inibição da transição para diidretode citrulina.

A temperatura de cristalização do anidrido de citrulina napresente invenção é especialmente limitada, desde que não ocorra a iniciaçãoda cristalização do anidrido de citrulina ou a transição para diidreto decitrulina. Especificamente, a temperatura, de preferência, é de 45°C ou menor,mais de preferência, 40°C ou menor, ainda mais de preferência, 30°C oumenor, especialmente, de preferência, 20°C ou menor. Entretanto, atemperatura onde ocorre a iniciação da cristalização de anidrido de citrulinaou a transição para diidreto de citrulina é diferente, dependendo do tipo ou daconcentração do aminoácido básico. Assim sendo, apesar do limite inferior datemperatura de cristalização depender das condições, a temperatura, depreferência, é de 5°C ou maior, mais de preferência, 10°C ou maior.

Por exemplo, no caso em que a temperatura de cristalização éde 15 °C ou maior, a concentração do aminoácido básico presente na soluçãoaquosa de citrulina, de preferência, é de 0,003 a 10,0 g/100 g de H2O mais depreferência, 0,25 a 4,0 g/100 g de H2O. No entanto, o efeito da inibição da10 transição do anidrido de citrulina em diidreto de citrulina através doaminoácido básico poderá depender do tipo de aminoácido básico, datemperatura de cristalização, e do tipo ou da concentração dos componentes,além da citrulina e do aminoácido básico na solução aquosa de citrulina. Porexemplo, o efeito mencionado acima é influenciado por uma interação entreas impurezas e citrulina na solução aquosa de citrulina, e uma concentraçãopreferida do aminoácido básico em uma solução obtida pela dissolução de umcristal puro de citrulina em água é esperada que seja diferente daquela emuma solução de fermentação de citrulina. Assim sendo, uma quantidadepreferida do aminoácido básico adicionado, de preferência, é determinada deforma apropriada, dependendo da solução aquosa de citrulina utilizada comomatéria-prima, do aminoácido básico a ser utilizado, e da temperatura decristalização. Em qualquer caso, para se reduzir a temperatura decristalização, a concentração do aminoácido básico, de preferência, é elevada.

A quantidade preferida do aminoácido básico a ser adicionadopoderá ser determinada, por exemplo, como se segue. O aminoácido básico éadicionado na água em uma suspensão de anidrido de citrulina, para a atingiruma concentração de cerca de 0 a 10,0 g/100 g de H2O, seguido porcristalização por resfriamento. Parte do cristal é separada durante acristalização por resfriamento, e o cristal é observado sob um microscópiopara se avaliar se o cristal inteiro é anidrido de citrulina, ou se ocorre ainiciação da cristalização de diidreto de citrulina ou a transição do anidrido decitrulina para diidreto de citrulina. Além disso, no caso em que é difícil fazero julgamento acima em um microscópio, o padrão de difração de raios X depó é confirmado para julgar se o cristal é anidrido de citrulina ou é diidreto decitrulina, com base no padrão de difração do cristal. Conforme descrito acima,pode ser determinada a concentração do aminoácido básico e a temperatura decristalização onde somente é obtido o cristal de anidrido de citrulina.

O cristal de anidrido de citrulina pode ser obtido realizando-sea cristalização do anidrido de citrulina conforme descrito acima e coletando-se o cristal. Se o cristal de anidrido de citrulina é, por exemplo, recristalizadoou lavado, o aminoácido básico e as impurezas podem ser removidos. Para seevitar a transição em diidreto de citrulina, o cristal resultante, de preferência,é secado. A secagem poderá ser realizada através de redução de pressão e/oude aquecimento. O aquecimento, de preferência, é realizado de 60 a 100°C. Ocristal de anidrido de citrulina seco poderá ser embalado apropriadamentepara a produção do produto final.

O aminoácido básico na solução aquosa de citrulina pode serreciclado para cristalização do anidrido de citrulina outra vez.

EXEMPLOS

Daqui por diante, a presente invenção é descrita maisespecificamente por intermédio de exemplos.

<Exemplo 1> Preparação de anidrido de citrulina

200 g de um reagente de citrulina L (Sigma-Aldrich JapanK.K.) são colocadas em um béquer de 3 litros, e é adicionado no mesmo águaaté o volume total atingir a 2 litros. A solução foi aquecida a 40°C paradissolver o cristal e foi concentrada em um evaporador até que o peso dasolução atingiu 400 g para se realizar a cristalização por concentração dacitrulina. Para se obter o anidrido de citrulina através de cristalização porconcentração, a temperatura de concentração foi controlada a 45 0C ou maiorde acordo com um método convencional (JP S56-99453 A).

Depois do término da cristalização por concentração, asuspensão obtida por cristalização foi separada com Nutsche. A suspensão foisecada ao ar, para dessa forma produzir 161 g de um cristal de citrulina. AFig. 1 mostra um micrográfico do cristal. A suspensão obtida pelacristalização foi resfriada até 10°C e deixada em repouso durante 24h, e ocristal foi separado com Nutsche. A figura 2 mostra um micrográfico docristal.

A partir dos micrográficos mostrados nas figuras 1 e 2 ou porcomparação do padrão de difração de raios X de pó de anidrido de citrulinaque foi apresentado (JP S56- 99453 A) com o padrão de difração de raios Xde pó do cristal obtido (Rigaku Corporation, MiniFlexII), foi determinado queo anidrido de citrulina (cristal do tipo δ) foi obtido.

<Exemplo 2> Efeito do amino básico no ácido do tipo de cristal de citrulina(1)

6,33 g de anidrido de citrulina preparado no exemplo e 30 g deágua foram adicionados em um frasco cônico de 100 ml. Cloridrato deornitina L ou cloridrato de Lisina L (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foiadicionado na solução com as composições diferentes mostradas na tabela 1 edissolvido. O frasco cônico foi agitado a 120 rpm durante 24h em um banhocontrolado pela temperatura (Tokyo Rikakikai Co., Ltd., NCS-1300) onde atemperatura foi ajustada a 15°C, 10°C, ou 5°C. 24h mais tarde, o cristal daspartículas da suspensão foi observado em um microscópio para se avaliar se ocristal era anidrido de citrulina ou se foi convertido em diidreto de citrulinaatravés da transição. No caso onde era impossível avaliar-se visualmente ocristal, o padrão de difração de raios X de pó foi observado para se avaliar seo cristal era anidrido de citrulina ou diidreto de citrulina. A tabela 2 mostra osresultados da observação dos cristais.Tabela 1

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Tabela 2

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1) No caso da partícula da suspensão ser identificada comoanidrido de citrulina através de observação, o resultado é representado por"o"; no caso da partícula em suspensão ser identificada como sendo umamistura de anidrido de citrulina e de diidreto de citrulina por observação, oresultado é representado por "Δ"; e no caso da partícula em suspensão seridentificada como sendo diidreto de citrulina (transição completada) atravésde observação, o resultado é representado por "x".

No experimento 7 onde não foi adicionado nenhumaminoácido, a transição de anidrido de citrulina em diidreto de citrulina foicompletada 24h mais tarde em todas as temperaturas (5°C, 10°C, e 15°C). Poroutro lado, nos experimentos 1 a 6, onde foi adicionado o aminoácido básico,a transição do anidrido de citrulina não ocorreu a IO0C ou 15°C. Entretanto,entre 5 e 10°C, quanto maior foi a quantidade de aminoácido básicoadicionada, mais improvável era a transição do anidrido de citrulina emdiidreto de citrulina.

Isto é, a adição do aminoácido básico teve sucesso em inibirsignificativamente a transição para diidreto de citrulina e manter estável oanidrido de citrulina.

<Exemplo 3> Efeito do aminoácido básico no cristal de citrulina do tipo (2)6,33 g de anidrido de citrulina preparado no exemplo 1 e 30 gde água foram adicionados em um frasco cônico de 100 ml. O cloridrato dearginina L (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi adicionado na soluçãonas composições diferentes mostradas na tabela 3 e foi dissolvido. O frascocônico foi agitado a 120 rpm durante 24h em um banho controlado pelatemperatura, onde a temperatura foi ajustada para 15°C, 10°C, ou 5°C. 24hmais tarde, o cristal das partículas em suspensão foi observado em ummicroscópio para se avaliar se o cristal era anidrido de citrulina ou setransformou em diidreto de citrulina através da transição. No caso em que eraimpossível avaliar-se visualmente o cristal, foi observado o padrão dedifração de raios X de pó para avaliar se o cristal era anidrido de citrulina oudiidreto de citrulina. A tabela 4 mostra os resultados da observação doscristais.

Tabela 3

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Tabela 4

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1) no caso em que se verificou-se que a partícula de suspensãopermanece como anidrido de citrulina por observação, o resultado érepresentado por "o"; no caso em que foi observado que a partícula dasuspensão era uma mistura de anidrido de citrulina e diidreto de citrulina porobservação, o resultado é representado por " Δ "; e no caso onde a partícula dasuspensão é identificada como sendo um diidreto de citrulina (transiçãocompletada) por observação, o resultado é representado por "x".

Nas experimentos 8 a 12, verificou-se que todos os cristaispermaneceram como anidrido de citrulina a 15°C 24h mais tarde. Entretanto,de 5 a 10°C, quanto maior era a quantidade de aminoácido básico adicionada,mais improvável era a transição do anidrido de citrulina em diidreto decitrulina. Isto é, a adição do aminoácido básico teve sucesso em inibirsignificativamente a transição para diidreto de citrulina e manter estável oanidrido de citrulina.

<Exemplo 4> Efeito do pH no tipo de cristal de citrulina

6,33 g de anidrido de citrulina preparado no exemplo 1 e 30 g deágua foram adicionados em um frasco cônico de 100 ml. Foi adicionado cloridratode arginina L na solução nas composições diferentes mostradas na tabela 5 e foidissolvido. Então, conforme mostrado na tabela 5, o pH foi ajustado através daadição de ácido clorídrico IM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e hidróxidode sódio IM (Wako Pure Chemical industries, Ltd.). O frasco cônico foi agitado a120 rpm durante 24h em um banho controlado pela temperatura, onde atemperatura foi ajustada para 20°C ou 10°C. 24h mais tarde, o cristal da partículada suspensão foi observado em um microscópio para se avaliar se o cristal eraanidrido de citrulina ou se transformou em diidreto de citrulina através detransição. No caso onde era impossível avaliar-se visualmente o cristal, o padrãode difração de raios X de pó foi observado para se avaliar se o cristal era anidridode citrulina ou diidreto de citrulina. A tabela 6 mostra os resultados da observaçãodos cristais.

Tabela 5

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Tabela 6

<table>table see original document page 15</column></row><table>

1) No caso em que verificou-se que a partícula da suspensãopermaneceu como anidrido de citrulina por observação, o resultado érepresentado por "o"; no caso em que verificou-se que a partícula dasuspensão era uma mistura de anidrido de citrulina e diidreto de citrulina porobservação, o resultado é representado por "Δ"; e no caso em que verificou-seque a partícula da suspensão era diidreto de citrulina (transição completada)por observação, o resultado é representado por "x".

Verificou-se que os cristais permaneceram como anidrido decitrulina em todos os pHs.

< Exemplo comparativo 1> Transição do cristal quando não é adicionadonenhum aminoácido

6,33 g de anidrido de citrulina preparado no exemplo 1 e 30 g deágua foram adicionados em um frasco cônico de 100 ml. Conforme mostrado natabela 7, o pH foi ajustado adicionando-se ácido clorídrico a IM e hidróxido desódio a 1M. O frasco cônico foi agitado a 120 rpm durante 24h em um banhocontrolado pela temperatura, onde a temperatura foi ajustada para 10°C. 24hmais tarde, o cristal da partícula da suspensão foi observado em um microscópiopara avaliar-se se o cristal era anidrido de citrulina ou se transformou em diidretode citrulina através de transição. No caso em que era impossível avaliar-sevisualmente o cristal, foi observado o padrão de difração de raios X de pó paraavaliar-se se o cristal era anidrido de citrulina ou diidreto de citrulina. A tabela 8mostra os resultados da observação dos cristais.

Tabela 7

<table>table see original document page 16</column></row><table>

Tabela 8

<table>table see original document page 16</column></row><table> 1) "x" significa que a transição para diidreto de citrulina foicompletada.

Os resultados revelaram que a transição para diidreto decitrulina ocorreu 24h mais tarde em todos os cristais.<Exemplo 5> Cristalização de citrulina L

70 g do reagente de citrulina L (Sigma-Aldrich Japan K.K.)foram colocadas em um béquer de 2 litros. Foi adicionada água no mesmo atéo peso total alcançar 1.000 g. A solução foi aquecida a 40°C para dissolver ocristal e foi concentrada em um evaporador até que o peso do concentradoalcançou 175 g. A operação é definida como experimento 23. O-cristal decitrulina L precipitado no concentrado foi confirmado como sendo anidrido decitrulina através de observação em microscópio.

Da mesma forma acima, 70 g de citrulina L foram colocadas emum béquer de 2 litros, e foram adicionadas 1,26 g de cloridrato de arginina. Foiadicionada água no mesmo até o peso total alcançar 1.000 g. A solução foiaquecida a 40°C para dissolver o cristal e foi concentrada em um evaporador até opeso do concentrado atingir 175 g. A operação é definida como experimento 24. Ocristal de citrulina L precipitado no concentrado foi confirmado como sendoanidrido de citrulina através de observação em microscópio.

Os frascos contendo os concentrados respectivos foramimersos em um banho controlado por temperaturas a 50°C e os concentradosforam resfriados a 20°C com uma velocidade de 5°C/hora sob agitação. Atemperatura foi mantida a 20°C durante 8h. Posteriormente, parte de umcristal em cada partícula da suspensão foi observada em um microscópio paraavaliar-se se o cristal era anidrido de citrulina ou diidreto de citrulina. Então,somente no caso em que o cristal era anidrido de citrulina, parte dosobrenadante foi separada e filtrada com filtro com um tamanho de poros de0,45 μηι, e foi determinada a concentração de citrulina no sobrenadante.

A seguir, o banho controlado pela temperatura foi resfriadopara 15°C e os frascos contendo os concentrados respectivos foram entãomantidos a 150C durante 6h. Posteriormente, um cristal em cada partícula dasuspensão foi observado em um microscópio para avaliar-se se o cristal eraanidrido de citrulina ou diidreto de citrulina. Além disso, somente no caso emque a partícula da suspensão era anidrido de citrulina, parte do sobrenadantefoi separada e filtrada com filtro com um tamanho de poros de 0,45micrometros, e foi determinada a concentração de citrulina no sobrenadante.

A seguir, o banho controlado por temperatura foi resfriado a10°C e os frascos contendo os concentrados respectivos foram então mantidosa 10°C durante 6h. Posteriormente, foi observado um cristal em cada partículada suspensão em um microscópio, para avaliar-se se o cristal era anidrido decitrulina ou diidreto de citrulina. Então, somente no caso em que a partículada suspensão era anidrido de citrulina, o sobrenadante foi filtrado com umfiltro com um tamanho de poros de 0,45 μηι, e foi determinada a concentraçãode citrulina no sobrenadante.

A tabela 9 mostra os tipos de cristal da partícula da suspensãodo exemplo 5 e as concentrações de citrulina nos sobrenadantes.

Tabela 9

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1) no caso em que verificou-se que a partícula da suspensãopermaneceu como anidrido de citrulina através de observação, o resultado érepresentado por "0"; no caso em que verificou-se que a partícula dasuspensão era uma mistura de anidrido de citrulina e diidreto de citrulina porobservação, o resultado é representado por "Δ"; e no caso em que verificou-seque a partícula da suspensão era diidreto de citrulina (transição completada)por observação, o resultado é representado por "x".

2) a concentração de citrulina em cada sobrenadante foideterminada somente quando a partícula da suspensão era anidrido decitrulina.

No experimento 23, verificou-se que a transição para diidretode citrulina era iniciada a 20°C na parte do cristal. Por outro lado, noexperimento 24, verificou-se que o cristal permaneceu como anidrido decitrulina, mesmo a 10°C.

No experimento 23, verificou-se que a partícula da suspensãoa 20°C era uma mistura de anidrido de citrulina e diidreto de citrulina, everificou-se que a concentração de citrulina no sobrenadante era de 9,95% empeso. Por outro lado, no experimento 24, verificou-se que a partícula dasuspensão a IO0C era anidrido de citrulina, e verificou-se que a concentraçãode citrulina no sobrenadante era de 7,80% em peso. Isto é de acordo com apresente invenção, o anidrido de citrulina pode ser produzido em umatemperatura menor do que anteriormente. Como resultado, o anidrido decitrulina pode ser separado, mesmo em um líquido mãe de cristalizaçãocontendo citrulina em uma concentração baixa, o que resulta na produção deanidrido de citrulina com rendimento elevado.

A partícula da suspensão obtida a 10°C no experimento 23,isto é, diidreto de citrulina obtido por transição do anidrido de citrulina, foiseparada com Nutsche. Da mesma forma acima, a partícula da suspensãoobtida a IO0C no experimento 24, isto é, anidrido de citrulina, que não foisubmetida à transição para diidreto de citrulina, foi separada com Nutsche. Oscristais separados foram secados por aquecimento sob pressão reduzida (80mm de Hg,70°C), e os volumes específicos brutos e os volumes específicosfinos de ambos os cristais foram medidos pelo método descrito na JP S59-172444 A. Conforme mostrado na tabela 10, verificou-se que o volumeespecífico bruto e o volume específico fino do cristal de anidrido de citrulinaobtidos no experimento 24 eram menores. Isto é, no caso do cristal obtido noexemplo 5 ser embalado, o número de embalagens obtidas de anidrido decitrulina no experimento 24 é menor, o que poderá resultar em uma reduçãona carga de trabalho da embalagem.

Tabela 10

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Conforme especificamente mostrado nos exemplos, verificou-se que, quando a cristalização do anidrido de citrulina é realizada na presençade um aminoácido básico, a iniciação da cristalização de diidreto de citrulinae a transição de anidrido de citrulina para diidreto de citrulina sãosignificativamente inibidos, em comparação com o caso da cristalização naausência do aminoácido básico.

Claims

1. Método para a produção de um cristal de anidrido decitrulina, caracterizado pelo fato de compreender:- a realização da cristalização do anidrido de citrulina a partirde uma solução aquosa de citrulina, e- a coleta de um cristal de anidrido de citrulina, onde acristalização é realizada na presença de um aminoácido básico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato da cristalização ser realizada em uma temperatura menor do que 45°C.

3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato do aminoácido básico ser um aminoácido selecionadode ornitina, lisina e arginina.

4. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato da citrulina ser citrulina L, e o aminoácido básico serum aminoácido L selecionado de ornitina L, lisina L, e arginina L.

5. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato do aminoácido básico estar presente em umaconcentração de 0,003 a 10,0 g/100 g de H2O com relação à água na soluçãoaquosa de citrulina.

6. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato da cristalização ser realizada por cristalização porconcentração e/ou cristalização por resfriamento.