BRPI0806605A2

BRPI0806605A2 - métodos para tratar psorìase

Info

Publication number: BRPI0806605A2
Application number: BRPI0806605-1A
Authority: BR
Inventors: Joaquim Mario Valdes; Elliot Keith Chartash; William T Barchuk; Susan K Paulson; Alexandra B Kimball
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2007-01-16
Filing date: 2008-01-16
Publication date: 2011-09-06
Also published as: JP2015145389A; SG177982A1; EP2839743A1; CN104524567A; WO2008088823A3; CA2675233A1; AU2008205512B2; KR20150038227A; RU2009131080A; IL199739A0; EP2117303A4; RU2012147583A; AU2008205512A1; WO2008088823A2; US20100297143A1; EP2117303A2; NZ578065A; US7776331B1; US9051368B2; JP2010515774A

Abstract

MéTODOS PARA TRATAR PSORìASE. A invenção provê um método de tratar psoríase em um paciente por administração a um paciente de um anticorpo capaz de se ligar á subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23.

Description

"MÉTODOS PARA TRATAR PSORÍASE"

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA No. 60/880.767, depositado em 16 de Janeiro de 2007; Pedido Provisório dos EUA No. 60/904.022, deposi- tado em 27 de Fevereiro de 2007; Pedido Provisório dos EUA No. 60/925.960, depositado em 24 de Abril de 2007; Pedido Provisório dos EUA No. 60/961.764, depositado em 24 de Julho de 2007; e Pedido Provisório dos EUA No. 60/997.012, depositado em 28 de Setem- bro de 2007, os conteúdos inteiros de cada um dos quais são aqui incorporados por referência.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

Psoríase é uma doença inflamatória mediada por célula T que é considerada ser uma das doenças autoimunes mais comuns, afetando aproximadamente 2% a 3% de adul- tos, though a prevalência global varia amplamente (Stem R.S., et al, J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2004, 9: 136-39; Davidson A e Diamond. Β. N. Engl. J. Med. 2001, 345:340-50; Langley R. G. B., et al, Ann. Rheum- Dis. 2005, 64 (Suplem. II): N18-23). Psoríase tem im- pacto maior na qualidade de vida (de Korte J., et al, J. Investig Dermatol Symp Proc 2004, 9:140-7; Krueger G., et al, Arch Dermatol 2001, 137:280-4; Finlay AY e Coles EC, Br J Der- matol 1005, 132: 236-44) e é associado com um número de problemas psicosociais (Kimball AB, Am J Clin Dermatol 2005, 6:383-92; Russo PA et al, Australas J Dermatol 2004, 45: 155-9). Muitas terapias de psoríase tradicionais têm efeitos adversos tóxicos; assim, seu uso em longo prazo é limitado (Lebwohl M. e Ali S., J Am Acad Dermatol 2001, 45:487-98; Leb- wohl M. e Ali S., J Am Acad Dermatol 2001, 45:649-61). Em adição, muitos pacientes com psoríase estão insatisfeitos com terapias tradicionais (Stern RS, et al, J Investig Dermatol Symp Proc 2004, 9:136-30; Finlay AY e Ortonne JP1 J Cutan Med Surg 2004, 8:310-20); então, existe uma necessidade clara para terapias que são seguros e mais fáceis para usar e que podem ser prescritos em uma base de longo prazo.

Interleueina 12 (IL-12) e a citocina relacionada IL-23 são membros da superfamília IL-12 de citocinas que dividem uma subunidade p40 em comum (Anderson EJR, et al, S- pringer Semin Immunopathol 2006, 27: 425-42). Ambas as citocinas contribuem para o de- senvolvimento da resposta imune celular auxiliadora T (Th1) do tipo 1 em psoríase, mas cada uma tem um papel único (Rosmarin D e Strober BE, J Drugs Dermatol 2005, 4:318-25; Hong K., et al, J Immunol 1999, 162:7480-91; Yawalkar N, et al, J Invest Dermatol 1998, 111:1053-57). IL-12 primariamente estimula a diferenciação de células Th1 e a subsequente secreção de interferon-gama, enquanto IL-23 preferivelmente estimula a diferenciação de células T naive em células T auxiliadoras efetoras (Th17) que secretam IL-17, um mediador pró-inflamatório (Rosmarin D e Strober BE, J Drigs Dermatol 2005, 4:318-25; Harrington Le et al, Nature Immunol 2005, 6:1123-32; Park H, et al, Nature Immunol 2005, 6: 1132-41). A superexpressão de RNA mensageiro de IL-12 p40 e IL-23 p40 em lesões de pele psoriáticas sugere que a inibição de IL-12 e IL-23 com um anticorpo neutralizante para a proteína da subunidade p40 IL-12/IL-23 pode oferecer uma abordagem terapêutica efetiva para o trata- mento da psoríase (Yawalkar N1 et al, J Invest Dermatol 1998, 111:1053-57; Lee E, et al, J Exp Med 2004, 199: 125-30; Shaker OG1 et al, Clin Biochem 2006, 39:119-25; Piskin G1 et al, J Immunol 2006, 176: 1908-15). Tais abordagens terapêuticas para o tratamento de pso- ríase são claramente necessárias na técnica.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê métodos e composições para tratar psoríase, por exem- pio, psoríase crônica, utilizando um anticorpo, ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo, que se liga a IL-12 humana e/ou IL-23 humana.

Em um aspecto, a invenção provê um método de tratar psoríase em um paciente compreendendo a administração a um paciente quinzenalmente, semanalmente ou dose única de um anticorpo, ou uma porção de ligação do antígeno do mesmo, direcionado contra IL-12 e/ou IL-23 humana.

Em uma modalidade, o paciente mantém uma resposta quinzenalmente, semanal- mente ou dose única do anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, por um período estendido, por exemplo, por pelo menos cerca de 12 semanas ou por pelo me- nos cerca de 24 semanas.

Em outra modalidade, o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 75 por um período prolongado seguindo uma dose quinzenalmente, semanalmente ou única de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, direcionado contra a IL-12 humana e IL-23 humana ao paciente. Em ainda outra modalidade, o paciente mantém pelo menos uma reposta PASI 90 por um período prolongado seguindo uma dose quinzenalmente, se- manalmente ou dose única de um anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, direcionado contra a IL-12 humana e IL-23 humana ao paciente. Em ainda uma modalidade adicional, o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 100 por um perí- odo prolongado seguindo uma dose quinzenalmente, semanalmente ou dose única de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, direcionado contra a IL-12 humana e IL-23 humana ao paciente.

Em uma modalidade, a dose do anticorpo direcionada contra a IL-12 humana e/ou IL-23 humana é cerca de 200 mg ou cerca de 100 mg.

Em uma modalidade, a psoríase é uma placa psoriática, por exemplo, placa psoriá- tica crônica. Em outra modalidade, a psoríase é psoríase crônica, por exemplo, placa psoriá- tica crônica. Em ainda outra modalidade, a psoríase é psoríase moderada a severa, por e- xemplo, placa psoriática moderada a severa, psoríase crônica moderada a severa ou placa psoriática crônica moderada a severa. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é administrada através da administração subcutânea.

Em outro aspecto, a invenção provê um método de tratar psoríase em um paciente compreendendo os passos de: (i) selecionar um paciente que está sofrendo de psoríase crônica; e (ii) administração ao paciente de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23; assim tratando psoríase crônica no paciente.

Em uma modalidade, o paciente tem tido um diagnóstico clínico de psoríase por pe- lo menos 6 meses. Em outra modalidade, o paciente tem tido placas psoriáticas estáveis por pelo menos 2 meses.

Em ainda outro aspecto, a invenção provê um método de tratar psoríase em um pa- ciente compreendendo os passos de: (i) selecionar um paciente que não tenha tido uma condição selecionada a partir do grupo consistindo de exposição prévia à terapia anti-IL-12 sistêmica ou biológica; psoríase não placa; inabilidade de descontinuar terapias psoríase tópica pelo menos 2 semanas antes do tratamento; fototerapia de luz ultravioleta B pelo me- nos 2 semanas antes do tratamento; fototerapia de luz ultravioleta psoralena pelo menos 4 semanas antes do tratamento; terapias sistênicas pelo menos 4 semanas antes do trata- mento; terapias biológicas pelo menos 12 semanas antes do tratamento; ingestão requerida de corticosteróides orais ou injetávais durante o tratamento; uma exarcebação da asma re- querindo hospitalização nos 10 anos anteriores à seleção; uma infecção ou fatores de risco para infecção severa; uma história de malignâncias outras que trataram com sucesso carci- noma celular basal, por exemplo, com uma história de carcinoma celular escamoso, ou um carcinoma cervical local; e uma história de reação imunológica principal, por exemplo, doen- ça do soro ou reação anafilatóide, a um agente contendo imunoglobulina G, por exemplo, gamaglobulina intravenosa, uma proteína fusão, ou um anticorpo monoclonal; e (ii) adminis- tração ao paciente de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que é capaz de ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23; assim tratando psoríase no paciente.

Em ainda outro aspecto, a invenção provê um método de tratar psoríase em um pa- ciente compreendendo os passos de: (i) selcionando um paciente que não tenha tido vaci- nação com um agente viral vivo dentro de 1 mês; e (ii) administrando a um paciente de um anticorpo, ou porção de ligação do antígeno do mesmo, que é capaz de ligar a um epítopo para a subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23; assim tratando psoríase no paciente.

Em ainda um aspecto adicional, a invenção provê um método de tratar psoríase em um paciente compreendendo os passos de: (i) administrar um anticorpo, ou porção de liga- ção ao antígeno do mesmo, que é capaz de ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23 para o paciente; (ii) monitorando o paciente para um resultado laboratorial anor- mal clinicamente significante selecionado a partir do grupo consistindo de aspartato transa- minase ou alanina transaminase >5 vezes para o limite superior normal; bilirrubina sérica total >3 vezes do limite superior normal; creatinina sérica >3 vezes do limite superior normal; creatinina fosfoquinase >5 vezes do limite superior normal; hemoglobina <8 g/dL; células brancas saguíneas <2x10^9/L; e contagem de plaqueta <75x109/L; e (iii) administração des- continuada do anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em um paciente em que o resultado laboratorial anormal clinicamente significante é detectado; assim tratando psoríase no paciente.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção de ligação do antígeno do mesmo, é administrado quinzenalmente. Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora do an- tígeno do mesmo, é administrado semanalmente ou em uma dose única.

Em uma modalidade o anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, é ad- ministrada em uma dose de cerca de 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg ou 220 mg.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, é ca- paz de ligar ao epítopo da subunidade p40 quando a subunidade p40 está ligada à subuni- dade p35 de IL-12. Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, é capa de ligar ao apítopo da subunidade p40 quando a subunidade p40 está ligada a uma subunidade p19 da IL-23. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigado- ra do antígeno do mesmo, é capaz de ligar ao epítopo da subunidade p40 quando a subuni- dade p40 está ligado à subunidade p35 da IL-12 e quando a subunidade p40 está ligada a uma subunidade p19 da IL-23.

Em uma modalidade, a psoríase é psoríase crônica, por exemplo, placa psorítica crônica, por exemplo, placa psorítica moderada a sevara.

Em outro aspecto, a invenção provê um método de tratar psoríase em um paciente compreendendo a administração a um paciente de um anticorpo, ou porção Iigadora de an- tígeno do mesmo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL- 23, em que o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 90 por um período prolon- gado seguindo a administração inicial do anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, dessa forma tratando psoríase no paciente.

Em uma modalidade, o período prolongado é pelomenos cerca de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 semanas.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é ad- ministrado quinzenalmente. Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigador de antíge- no do mesmo, é administrado semanalmente. Em ainda outra modalidade, o anticorpo é administrado em uma dose única.

Em uma modalidade o anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, é ad- ministrado em uma dose de cerca de 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, ou 220 mg.

Em uma modalidade, a psoríase é psoríase crônica, por exemplo, placa psoriática crônica, por exemplo, placa psoriática crônica moderada a severa.

Em ainda outro aspecto, a invenção provê um método de tratar psoríase em um pa- ciente compreendendo administração a um paciente de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é capaz de ligar a um epitopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL- 23 do paciente, em que o paciente mantém uma avaliação AGM clara ou mínima por um período de tempo prolongado seguindo a administração inicial do anticorpo, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, assim tratando psoríase no paciente.

Em uma modalidade, o período prolongado é pelo menos cerca de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 semanas.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, é ad- ministrado quinzenalmente. Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antí- geno do mesmo, é administrado semanalmente. Em ainda outra modalidade, o anticorpo é administrado em uma dose única.

Em uma modalidade o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, é ad- ministrado em uma dose de cerca de 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, 220 mg.

Em uma modalidade, a psoríase é psoríase crônica, por exemplo, placa psoriática crônica, por exemplo, placa psoriática moderada a severa.

Em ainda um aspecto adicional, a invenção provê um método de tratar a psoríase em um paciente compreendendo a administrar ao paciente um anticorpo, porção Iigadora do antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar a um epitopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23 do paciente, em que o paciente exibe um PASI melhorado por cerca de 8 semanas seguindo a administração inicial do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, assim tratando a psoríase no paciente.

Em uma modalidade, o paciente exibe um índice PASI melhorado por cerca de 7 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 3 se- manas, cerca de 2 semanas ou cerca de 1 semana seguindo a administração inicial do anti- corpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é ad- ministrada quinzenalmente. Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antí- geno do mesmo, é administrada semenalmente. Em ainda outra modalidade, o anticorpo é administrado em uma dose única.

Em uma modalidade o anticorpo, ou poção Iigadora de antígeno do mesmo, é ad- ministrado em uma dose de cerca de 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, ou 220 mg.

Em outro aspecto, a invenção provê um método de tratar psoríase em um paciente compreendendo a administração de um anticorpo ao paciente, ou porção ligadora de antí- geno do mesmo, que é capaz de ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23, em que o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 50 por um período prolongado seguindo a descontinuação da administração do anticorpo, ou porção ligadora do antígeno do mesmo, assim tratando a psoríase no paciente.

Em um aspecto relacionado, a invenção provê um método de tratar psoríase em um paciente compreendendo a administração de um anticorpo a um paciente, ou porção ligado- ra do antígeno do mesmo, que é capaz de ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23, em que o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 75 por um período prolongado seguindo a descontinuação da administração do anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, assim tratando a psoríase no paciente.

Em ainda outro aspecto relacionado, a invenção provê um método de tratar psoría- se em um paciente compreendendo a administração de um anticorpo a um paciente, ou por- ção ligadora do antígeno do mesmo, que é capaz de ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23, em que o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 90 por um período prolongado seguindo a descontinuação da administração do anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, assim tratando a psoríase no paciente.

Em uma modalidade, o período prolongado seguindo descontinuação da adminis- tração do anticorpo é pelo menos cerca de 12 semanas.

Em uma modalidade, o anticorpo é administrado por pelo menos cerca de 12 se- manas.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, é ad- ministrado quinzenalmente. Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora de antí- geno do mesmo, é administrado semanalmente. Em outra modalidade, o anticorpo, ou por- ção ligadora do antígeno do mesmo, é administrado em uma dose única.

Em uma modalidade o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, é ad- ministrado em uma dose de cerca de 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, ou 220 mg.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção é capaz de ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12.

Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, é ca- paz de ligar ao epítopo da subunidade p40 quando a subunidade p40 é ligada à subunidade p35 da IL-12. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção da ligação de antígeno do mesmo, é capaz de ligar o epítopo da subunidade p40 quando a subunidade p40 é ligada à subunidade p19. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno, é capaz de ligar o epítopo da subunidade p40 quando a subunidade p40 é ligada à subunidade p35 da IL-12 e quando a subunidade p40 é ligada a uma subunidade p19.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, liga- se a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 ao qual um anticorpo selecionado a partir do grupo consistindo de Iigantes Y61 e J695.

Em outra modalidade, o anticorpo é ainda capaz de ligar a um primeiro heterodíme- ro e é também capaz de ligar a um segundo heterodímero, em que o primeiro heterodímero compreende a subunidade p40 da IL-12 e a subunidade p35 da IL-12, e em que o segundo heterodímero compreende a subunidade p40 da IL-12 e uma subunidade p19.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo neutraliza a atividade do primeiro hete- rodímero. Em outra modalidade, o anticorpo neutraliza a atividade do segundo heterodíme- ro. Em ainda outra modalidade, o anticorpo neutraliza a atividade do primeiro heterodímero e o segundo heterodímero.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utilizado nos métodos da invenção inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio in vitro de PHA com um IC50 1x10"9 M ou mesmo, ou que inibe a produção de IFNy humano com um IC50 de 1x10"10 M ou mesmo.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção dissociado a partir da subunidade p40 da IL-12 com um Kd de 1x10"10 M ou menor ou uma constante de taxa Koff de 1x10"3s"1 ou menor, como determi- nado por ressonância plásmon de superfície.

Em uma modalidade, o anticorpo isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, utilizado nos métodos da invenção é um anticorpo quimérico, um anticorpo humani- zado ou um anticorpo humano.

Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção tem uma cadeia pesada CDR3 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:25 e uma cadeia leve CDR3 compreendendo a seqüência ami- noácida da SEQ ID NO:26;

Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção tem uma cadeia pesada CDR2 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:27 e uma cadeia leve CDR2 compreendendo a seqüência ami- noácida da SEQ ID NO:28.

Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção tem uma cadeia pesada CDR1 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:29 e uma cadeia leve CDR1 compreendendo a seqüência ami- noácida da SEQ ID N0:30.

Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora antígeno do mesmo, utilizado nos métodos da invenção é capaz de ligar a uma interleucina compreendendo uma subuni- dade p40. Em uma modalidade, a interleucina compreende uma subunidade p40 e uma su- bunidade p35, por exemplo, a interleucina é IL-12. Em outra modalidade, a interleucina compreende uma subunidade p40 e uma subunidade p19. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, neutraliza a atividade da interleucina.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora do antígeno do mesmo, liga- se a um epítopo da subunidade p40.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção I=ligadora do antíeno do mesmo, é ad- ministrado a um paciente em uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo, ou porção ligadora do antígeno do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A com- posição farmacêutica pode também compreender um agente adicional, tal como agente te- rapêutica, por exemplo, budenosida, fator de crescimento epidermal, corticosteróides, ci- closporina, sulfasalazina, aminosalicilato, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inibi- dores da lipoxigenase, mesalamina, olsalazina, balsalazida, anticorpos, inibidores do trom- boxano, antagonistas do receptor da IL-1, anticorpos monoclonais anti-IL-1β, anticorpos mo- noclonais anti-IL-6, fatores de crescimento, inibidores de elastase, compostos piridinil- imidazol, anticorpos ou agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, II-7, II-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II1 GM-CSF, FGF, e PDGF1 anticorpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 ou seus ligantes, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato de mofetila, leflunomida, AINES, ibuprofeno, corticosteróides, prednisolona, inibidores da fosfodiesterase, agonistas adenosina, agentes antitrombóticos, inibidores do complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK1 IKK, p38, inibidores da MAP quinase, inibi- dores da enima conversora de IL-1β, inibidores da enzima conversora de TNFα , inibidores de sinalização da célula T, inibidores de metaloproteinase, sulfasalazina, azatioprina, 6- mercaptopurinas, inibidores da enzima conversora de angiotensina, receptores solúveis de citocinas, receptor solúvel de p55 TNF, receptor solúvel de p75 TNF, slL-1 RI, sIL-RII, sIL- 6R, citocinas antiinflamatórias, IL-4, IL-10, IL-11, 11-13 e TGF-β.

Em outra modalidade, o agente terapêutico na composição farmacêutica adminis- trada ao paciente pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de anticorpos anti-TNF e fragmentos de anticorpos dos mesmos, construções TNFR-lg, inibidores TACE, inibidores PDE4, corticosteróides, budenosida, dexametasona, sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, inibidores da enzima conversora da IL-1β, IL-1 ra, inibidores da tirosina quinase, 6-mercaptopurinas e IL-11. Em outra modalidade, o agente terapêutico pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de corticosteróides, prednisolona, metilprednisolona, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, 4-aminopiridina, tizanidina, interferon-/?1a, interferon-/?1 b, copolí- mero 1, oxigêio hiperbárico, imunoglobulina intravenoso, clabribina, anticorpos ou agonistas do TNF1 LT1 IL-1, IL-2, IL-6, II-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF1 FGF1 PDGF1 anticorpos para CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 ou seus ligantes, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato de mofetila, leflunomida, AINES, ibuprofeno, corticosteróides, prednisolona, inibidores da fosfodiesterase, agonistas adenosina, agentes antitrombóticos, inibidores do complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK1 IKK, inibidores da p38 ou MAP, inibidores da enzima con- versora de IL-1/?, inibidores da TACE, inibidores da sinalização da célula T, inibidores quina- se, inibidores da metaloproteinase, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inibidores da enzima conversora de angiotensina, receptores solúveis de citocina, receptor solúvel p55 dfe TNF, receptor solúvel p75 de TNF, slL-1RI, slL-1RII, slL-6R, SIL-13R, anti-P7s, Iigante de p-selectina glicoproteína (PSGL), citocinas antiinflamatórias, IL-4, IL-10, IL-13 e TGF/?.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zada nos métodos da invenção liga-se a IL-12 humana e/ou IL-23 humana e dissociada a partir IL-12 humana e/ou IL-23 humana, respectivamente, com um Kd de 1x10"10 M ou me- nos e uma taxa Koff constante de 1x10"3s"1 ou menos, como determinada por ressonância plásmon de superfície. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, dissocia a partir da IL-12 humana e/ou IL-23 humana com uma taxa koff constante de 1x10"4s"1 ou menos. Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, dissocia da IL-12 humana e/ou IL-23 humana com uma taxa koff constante de 1x10" 5S1 ou menos.

Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, liga- se a IL-12 humana e/ou IL-23 humana e dissocia-se a partir IL-12 humana e/ou IL-23 huma- na, respectivamente, com uma taxa Koff constante de 1x10"2s"1 ou menos, como determina- da por ressonância de plásmon de superfície. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, dissocia-se a partir da IL-12 humana e/ou IL-23 hu- mana com uma taxa koff constante de 1x10"3s"1 ou menos. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, dissocia da IL-12 humana e/ou IL-23 humana com uma taxa koff constante de IxIO-4S1 ou menos. Em outra modalidade, o anti- corpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, dissocia da IL-12 humana e/ou IL-23 hu- mana com uma taxa koff constante de 1x10"5s"1 ou menos.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, liga-se a IL-12 humana e/ou IL-23 humana e dissocia-se a partir IL-12 humana e/ou IL-23 humana, respectivamente, com um Kd constante de 1,34x10"10 M ou menos. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, liga-se à IL-12 humana e/ou IL-23 humana e dissocia-se a partir da IL-12 humana e/ou IL-23 humana, respectiva- mente, com um kd de 9.74x10"11 ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é um anticorpo recombinante, ou porção Iigadora de antí- geno do mesmo.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção é um anticorpo neutralizante, por exemplo, neutraliza a ativi- dade da IL-12 humana e/ou IL-23 humana. Em uma modalidade, o anticorpo neutralizante, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"9 M ou menos. Em outra modalidade, o anticorpo neutralizante, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a proliferação blás- tica de fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"10 M ou menos. Em ainda outra modalidade, o anticorpo neutralizante, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"11 M ou menos. Em ainda outra modalidade, o anticorpo neutralizante, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a proliferação blástica de fitoemaglutinina (en- saio de PHA) com um IC50 de 1x10"7 M ou menos. Em ainda outra modalidade, o anticorpo neutralizante, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"8 M ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo neutralizante, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a produção de IFNy com um IC50 de 1x10"10 M ou menos. Em ainda outra modalidade, o anti- corpo neutralizante, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a produção de IFNy com um IC50 de 1x10"11 M ou menos. Em ainda uma modalidade adicional, o anticorpo neu- tralizante, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a produção de IFNy com um IC50 de 5x10"12 M ou menos.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção

a)inibe a proliferação blástica da fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10-9 M ou menos;

b) tem uma cadeia pesada CDR3 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:25; e

c) tem uma cadeia leve CDR3 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:26. Em uma modalidade, o anticorpo ainda tem uma cadeia pesada CDR2 compreen- dendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:27; e uma cadeia leve CDR2 compreenden- do a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:28. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, ainda tem uma cadeia pesada CDR1 compreen- dendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:29; e uma cadeia leve CDR1 compreenden- do a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:30. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, ainda inibe proliferação blástica com fitoemaglutini- na em um ensaio de PHA in vitro com um OCõO de 1x10"10 M ou menos. Em ainda outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, ainda inibe proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"11 M ou menos.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção têm uma região de cadeia variável pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:31, e uma região de cadeia variável leve compreen- dendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:32.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção compreende uma região constante de cadeia pesada sele- cionada a partir do grupo consistindo de regiões constante de IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgE. Em uma modalidade, a região constante da cadeia pesada do anticorpo é IgGI. Em outra modalidade o anticorpo é um fragmento Fab, fragmento F(ab')2, ou um fragmento Fv de cadeia única.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos d ainvenção dissocia a partir da IL-12 humana e/ou IL-23 humana com um Kd de 1x10"10 M ou menos e liga-se a um epítopo na subunidade p40 da IL-12 humana e/ou IL-23 humana.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, utili- zada nos métodos da invenção é um anticorpo humano, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, que

a)dissocia a partir da IL-12 humana com uma taxa constante Koff de 1x10 3S1 ou menos, como determinado por ressonância de plásmon de superfície;

b) tem uma cadeia pesada CDR3 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 25; e

c) tem uma cadeia leve CDR3 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:26.

Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção dissocia a partir da IL-12 humana com uma taxa constante koff de IxIO-4S"1 ou menos. Em uma modalidade ainda, o anticorpo humano, ou porção Iiga- dora de antígeno do mesmo, dissocia a partir da IL-12 humana com uma taxa constante koff de 1x10"5s"1 ou menos.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção é um anticorpo humano, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que se liga a IL-12 humana e compreende: um domínio CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:26; e

um domínio CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:25.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, tem uma região variável de cadeia leve (RVCL) tendo um domínio CDR3 compreendendo a se- qüência aminoácida da SEQ ID NO:26, e tem uma região variável de cadeia pesada (RVCP) tendo um domínio CDR3 compreendendo a seqüência aminoácida de SEQ ID NO:25. Em outra modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, compreende uma RVCL ainda tendo um domínio CDR2 compreendendo a seqüência aminoácida de SEQ ID NO:28 e uma RVCP ainda compreendendo um domínio CDR2 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:27. Em ainda outra modalidade, a RVCL ainda temum domínio CDR1 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:30 e a RVCP tem um domí- nio CDR1 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:29.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, liga- se a IL-12 humana e/ou IL-23 humana e é o anticorpo J695 (também referido como ABT- 874), ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, liga- se a IL-12 humana e/ou IL-23 humana e dissocia-se a partir da IL-12 com um Kd de 1,34x10"10 M ou menos, e neutraliza a IL-12 humana e/ou IL-23 humana. Em uma modalida- de, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, dissocia-se a partir da IL-12 e/ou IL-23 humana com um Kd de 9,74x10"11 M ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"7 M ou menos. Em uma modalidade, o anti- corpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a proliferação blástica por fitoema- glutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"® M ou menos. Em uma moda- lidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"9 M ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, inibe a prolifera- ção blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"10 M ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"11 M ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a produção de IFNy humano com um IC50 de 1x10"10 M ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a produção de IFNy humano com um IC50 de 1x10"11 M ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, inibe a produção de IFNy humano com um IC50 de 1x1 CT12 M ou menos.

Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, utili- zado nos métodos da invenção inibe a ligação da IL-12 e/ou IL-23 ao seu receptor em um ensaio de ligação do receptor de IL-12 ou IL-23 (RBA)1 respectivamente, com um IC50 de 1x10"9 M ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, utilizado nos métodos da invenção inibe a ligação da IL-12 e/ou IL-23 ao seu recep- tor em um ensaio de ligação do receptor de IL-12 ou IL-23 (RBA)1 respectivamente, com um IC50 de 1x10"10 M ou menos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou porção Iigadora de antí- geno do mesmo, utilizado nos métodos da invenção inibe a ligação da IL-12 e/ou IL-23 ao seu receptor em um ensaio de ligação do receptor de IL-12 ou IL-23 (RBA), respectivamen- te, com um IC50 de 1x10"11 M ou menos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 mostra a disposição do paciente da triagem. (O termo "cos" refere-se a ca- da outra semana de dose).

Figure 2 mostra a porcentagem de pacientes com pelo menos 75% de melhoramen- to na área de psoríase e índice de severidade (PASI 75) durante a porção da 12 semana da triagem. Pela semana 8, com a exceção de 200 mg χ 1 grupi, a porcentagem de pacientes que tiveram uma resposta PASI 75 foi estatisticamente significante maior (p<0,001) em cada grupo de tratamento ABT-874 para cada comparação com placebo baseado em uma análise de variância dos dados observados para a população com intenção de tratamento. ( O termo "cos" refere-se a cada outra semana de dose).

A Figura 3 mostra a porcentagem média de melhoramento na área da psoríase e os índices do índice de severidade (PASI) a partir da linha de base. Os dados mostram que *p<0,001 para cada grupo de tratamento ABT-874 comparado com placebo em todos os pontos (exceto 100 mg cos na semana 1, p=0,023) baseado na análise da variância dos dados observados para a população com intenção de tratamento (O termo "cos"refere-se a cada outra semana de dose).

A Figura 4A-C mostra a porcetagem de pacientes que mantiveram uma resposta PASI 50, PASI 75 e PASI 90, respectivamente, na semana 24 da triagem, isto é, nas 12 se- manas seguindo a descontinuação da administração do anticorpo.

Figura 4D mostra oa porcentagem dos pacientes mantendo a resposta PASI 75 ao longo do tempo durante o período da semana 24 da triagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A fim de que a presente invenção possa ser mais rapidamente entendida, certos termos são primeiro definidos.

O termo "aumentando atividade do resíduo aminoácido" inclui um resíduo aminoá- cido que melhora a atividade do anticorpo. Isto deve ser entendido que a atividade aumen- tada do resíduo aminoácido pode substituir um resíduo aminoácido em um contato, hipermu- tação ou posição de mutagênese seletiva preferida e, ainda, que mais uma atividade au- mentada do resíduo aminoácido possa estar presente dentro de um ou mais CDRs. Um re- síduo aminoácido de atividade aumentada inclui um resíduo aminoácido que melhora a Iiga- ção de especificidade/afinidade de em anticorpo, por exemplo, anticorpo anti- IL-12 anti- humano de ligando a uma IL-12 humana. A atividade aumentada de um resíduo de aminoá- cido é também tencionada para incluir um resíduo aminoácido que melhora a potência de neutralização de um anticorpo, por exemplo, o anticorpo IL-12 humano que inibe a IL-12 humana.

O termo "anticorpo" inclui uma molécula de imunoglobulina compreendida de quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (P) e duas cadeias leves (L) interconectadas por pontes dissulfetos. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de ca- deia pesada (abreviada aqui como RVCP ou VP) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como RVCL ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreedida de um domínio, CL. As regiões VP e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementarie- dades (CDRs), intercalado com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VP e VL é composto de três CDRs e quatro FRs1 arrajandas a partir do amino-terminal para o carbóxi-terminal na seguinta ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em uma modalidade, o anticorpo utilizado nas composições e métodos da invenção é o anticorpo descrito na Patente dos EUA No. 6.914.128, incorporada aqui por referência. Em outra modalidade, o anticorpo utilizado nas composições e métodos da in- venção é o anticorpo ABT-874 (também referido como J695; Laboratórios Abbott).

O termo "porção Iigadora de antígeno" de um anticorpo (ou "porção anticorpo") in- clui fragmentos de um anticorpo que retém a habilidade de especificamente se ligar a um antígeno (por exemplo, hlL-12). Tem sido mostrado que a função Iigadora de antígeno de um anticorpo pode ser formada por fragmentos de um anticorpo de comprimeiro inteiro. E- xemplos de fragmentos de ligação compreendidos dentro do termo "porção Iigadora de antí- geno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab1 um fragmento monovalente consistin- do de domínios VL, VP1 VL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente com- preendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto em uma região dobradi- ça; (iii) um fragemnto Fd consistindo de domínios VP e CH1; (iv) um fragmento Fv consistin- do de domínios VL e VP de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546), que consiste de um domínio VC; e (vi) uma região determi- nante de complementariedade (CDR) isolado. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv1 VL e VP1 são codificados para genes separados, eles podem ser juntados, utilizando métodos recombinantes, por um Iigador sintético que permite a eles serem como uma cadeia de proteína única em que as regiões VL e VP se paream para formar moléculas monovalentes (conhecidos como cadeia única Fv (scFv); ver por exemplo, Bird et al (1988) Science 242:423-426; e Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única são também tencionados serem compreendidos dentro do termo "porção Iigadora de antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia úni- ca, tais como dianticorpos são também compreendidos. Dianticorpos são bivalentes, anti- corpos biespecíficos em que domínios VP e VL são expressos em uma cadeia polipeptídica única, mas utilizando um Iigador que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, assim forçando os domínios para parear com os domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno (ver, por e- xemplo, Holliger, P. et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:6444-6448; Poljak, R.J. et al (1994) Structure 2:1121-1123). Ainda adicionalmente, um anticorpo ou porção Iigadora de antígeno do mesmo pode ser parte de uma molécula de imunoadesão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos. Exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem uso de região núcleo de estreptavidina para fazer uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., et al (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e uso de um resíduo cisteína, um peptídeo marcador e um marcador poliistidina C-terminal para fazer moléculas scFv bivalen- tes e biotiniladas (Kipriyanov, S.M., et al (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Porções de anticorpo, tais como fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparadas a partir de anticorpos inteiros utilizando técnicas convencionais, tais como digestão de papaína e pepsina, respec- tivamente, de anticorpos inteiros. Além disso, anticorpos, porções de anticorpos e moléculas imunoadesivas podem ser obtidas utilizando técnicas de DNA recombinante padrão, como aqui descrito. Porções Iigadoras de antígeno preferidas são domínios completos ou pares de domínios completos.

O termo "mutação retrógrada" refere-se a um processo em que algum ou todos os aminoácidos mutados somaticamente de um anticorpo humano são substituídos com os resíduos da linha germinativa correspondente a partir de uma seqüência de anticorpo linha germinativa homólogo. As seqüências cadeias de pesada e leve do anticorpo humano da invenção são alinhados separadamente com as seqüências linha germinativa na base de dados VBASE para identificar as seqüências com a mais alta homologia. Diferenças no anti- corpo humano da invenção são retornadas para a seqüência linha germinativa por mutar as posições nucleotídicas definidas codificando tal aminoácido diferente. O papel de cada ami- noácido então identificado como candidato para mutação retrógrada deve ser investigado para papel direto ou indireto na ligação de antígeno e qualquer aminoácido encontrado após mutação para afetar qualquer característica desejável do anticorpo humano deve não ser incluído no anticorpo humano final; como um exemplo, atividade aumentada de aminoácidos identificados pela abordagem de mutagênese seletiva não será sujeita a mutação retrógra- da. Para minimizar o número de aminoácidos sujeitos para mutação retrógrada àquelas po- sições aminoácidas encontradas serem diferentes a partir da seqüência linha germinativa mais próxima, mas idêntica ao aminoácido correspondente em uma segunda seqüência li- nha germinativa pode permanecer, provido que a segunda seqüência linha germinativa é idêntica e colinear à seqüência do anticorpo humano da invenção por pelo menos 10, prefe- rivelmente 12 aminoácidos, em ambos os lados do aminoácido em questão. Mutação retró- grada pode ocorrer em qualquer estágio da optimização do anticorpo; preferivelmente, mu- tação retrógrada ocrre diretamente antes ou depois da abordagem de mutagênese seletiva. Mais preferivelmente, mutação retrógrada ocorre diretamente antes da abordagem de muta- gênese seletiva.

A frase "interleucina 12 humana" (abreviada aqui como hlL-12, ou IL-12), como aqui utilizado, inclui uma citocina humana que é secretada primariamente por macrófagos e célu- las dendríticas. O termo inclui uma proteína heterodimérica compreendendo uam subunida- de 35 kD (p35) e uma subunidade 40 kD (p40) que são ambas ligadas juntas com uma pon- te dissulfeto. A proteína heterodimérica é referida como uma "subunidade p70". A estrutura da IL-12 humana é descrita ainda em, por exemplo, Kobayashi, et al (1989) J Exp. Med. 170:827-845; Seder et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. 90:10188-10192; Ling et al (1995) J. Exp. Med. 154:116-127; Podlaski et al (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237. O ter- mo IL-12 humano é tencionado para incluir IL-12 humana recombinante (rh IL-12), que pode ser preparado por métodos de expressão recombinante padrões.

Os termos "numeração Kabat", "definições Kabat" e "marcação Kabat" são utiliza- dos de modo passível de mudança aqui. Esses termos, que são reconhecidos na técnica, referem-se a um sistema de numeração de resíduos aminoácidos que são mais variáveis (isto é, hipervariável) que outros resíduos aminoácidos nas regiões variáveis de cadeia pe- sada e leve de um anticorpo, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo (Kabat et al (1971) Ann. NY Acad. Sei. 190:382-391) e Kabat. E. A. et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, Departamento dos EUA de Serviços de Saúde e Huma- no, Publicação NIH No. 91-3242). Para a região variável de cadeia pesada, a região hiperva- riável varia de posições aminoácidas 31 a 35 para CDR1, posições aminoácidas 50 a 65 para CDR2, e posições aminoácidas 95 a 102 para CDR3. Para a região variável de cadeia leve, a região hipervariável varia de posições aminoácidas 24 a 34 para CDR1, posições aminoácidas 50 a 56 para CDR2, e posições aminiácidas 89 a 97 para CDR3.

A numeração Kabat é utilizada aqui para indicar as posições de modificações ami- noácidas feitas em anticorpos da invenção. Por exemplo, o anticorpo Y61 anti-IL-12 pode ser mutado de serina (S) para ácido glutâmico (E) na posição 31 da cadeia pesada CDR1 (H31S —► E), ou glicina (G) pode ser mutada para tirosina (Y) na posição 94 da cadeia leve CDR3 (L94G ->Y).

O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos tendo regiões variável e constante correspondendo a seqüências de imunoglobulina linha germinativa humanas como descrito por Kabat et al (Ver Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento dos EUA de Serviços em Saúde e Humanos, Publicação NIH No. 91-3242). Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos aminoácidos não codificados por seqüências de imunoglobulinas linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio específico in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nos CDRs e em particular CDR3. As mutações preferivel- mente são introduzidas utilizando a "abordagem de mutagênese seletiva" descrita aqui. O anticorpo humano pode ter pelo menos uma posição substituída com um resíduo aminoáci- do, por exemplo, uma atividade aumentada do resíduo aminoácido que não é codificado por seqüência imunoglobulina linha germinativa humana. O anticorpo humano pode ter até vinte posições substituídas com resíduos aminoácidos que não são parte da seqüência de imu- noglobulina da linha germinativa humana. Em outras modalidades, até dez, até cinco, até três ou até duas posições são substituídas. Em uma modalidade preferida, essas substitui- ções estão dentro das regiões CDR como descrito em detalhes abaixo. Entretanto, o termo "anticorpo humano", como aqui utilizado, não é tencionado incluir anticorpos em que as se- qüências CDR derivadas a partir da linha germinativa de outras espécies mamíferas, tal co- mo camundongo, têm sido enxertada em seqüências estruturais humanas.

A frase "anticorpo humano recombinante" inclui anticorpos humanos que são prepa- rados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos ex- pressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospe- deira (descrita adicionalmente na Seção II abaixo), anticorpos isolados a partir de uma bibli- oteca de anticorpo humano recombinante combinatorial (descrito adicionalmente na Seção III, abaixo), anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes da imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor, L.D., et al (1992) Nucl. Acids. Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem junção das seqüências gênicas imuno- globulinas humanas para outras seqüências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinan- tes têm regiões variáveis e constentes derivadas a partir das seqüências de imunoglobulina linha germinativa humana (Ver Kabat, E.A. et al (1991) Sequences of Proteins of Immunolo- gical Interest, Quinta Edição, Departamento dos EUA de Serviços de Saúde e Humano, Pu- blicação NIH No. 91-3242). Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes são sujeitos para mutagênese in vitro (ou, quando um animal trangênico para seqüências Ig humanas é utilizado, mutagênese somática in vivo) e então as seqüências aminoácidas das regiões VP e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que, en- quanto derivadas a partir de e relacionadas a seqüências VP e VL linha germinativa huma- na. Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos recombinantes são o resultado da abordagem de mutagênese seletiva ou mutação retrógrada ou ambos.

Um "anticorpo isolado" inclui um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se liga a hlL-12 é substancialmente livre de anticorpos que especifica- mente se ligam a antígenos outros que hlL-12). Um anticorpo isolado que especificamente se liga a hlL-12 pode ser ligar moléculas IL-12 a partir de outras espécies (discutidos em adicionais detalhes abaixo). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material e/ou químico.

Um "anticorpo neutralizante" (ou um "anticorpo que neutralizou a atividade da hlL- 12") inclui um anticorpo que se ligou a hlL-12 e resultou na inibição da atividade biológica da hlL-12. Este inibição da atividade biológica da hlL-12 podem ser avaliada por medir um ou mais indicadores da atividade biológica da hlL-12, tal como inibição da proliferação blástica da fitoemaglutinina humana em um ensaio de proliferação blástica por fitoemaglutinina (PHA), ou inibição da ligação ao receptor em um ensaio de ligação ao receptor de IL-12 hu- mana (ver Exemplo 3 - Ensaio de Indução de Interferon Gama da Patente dos EUA No. 6.914.128). Esses indicadores da atividade biológica hlL-12 pode ser avaliada por um ou mais de vários ensaior in vitro e in vivo padrões conhecidos na técnica (ver Exemplo 3 da Patente dos EUA 6.914.128).

O termo "atividade" inclui atividades tais como a especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo para um antígeno, por exemplo, um anticorpo anti-hlL-12 que se liga a um antígeno IL-12 e/ou a potência neutralizante de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-hlL-12 que se liga a hlL-12 e inibe a atividade biológica da hlL-12, por exemplo, inibição de uma proliferação blástica por PHA ou inibição da ligação ao receptor em um ensaio de ligação ao receptor de IL-12 humana (ver Exemplo 3 da Patente dos EUA No. 6.914.128).

A frase "ressonância de plásmon de superfície" inclui um fenômeno óptico que per- mite para a análise de intereções bioespecíficas em tempo real por detecção de alterações nas concentrações de proteína dentro de uma matriz biosensora, por exemplo, utilizando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ). Para des- crições adicionais, ver Exemplo 5 da Patente dos EUA No. 6.914.128 e Jonsson, U. et al (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U. et al (1991) Biotechniques 11:620-627; Johns- son, B., et al (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; e Johnnson, B., et al (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

O termo "koff", como aqui utilizado, é tencionado para referir-se à taxa constante off para dissociação de um anticorpo a partir do complexo anticorpo/antígeno.

O termo "kd", como aqui utilizado, é tencionado para referir-se à constante de dis- sociação de uma interação anticorpo-antígeno particular.

A frase "molécula de ácido nucléico" inclui moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser uma fita simples ou fita dupla, mas preferivelmen- te é DNA de fita dupla.

A frase "molécula isolada de ácido nucléico", como utilizada aqui em referência aos ácidos nucléicos codificando anticorpos ou porções de anticorpos (por exemplo, VP, VL, CDR3) que se ligam a hlL-12 incluindo "anticorpos isolados"), incluem uma molécula de ácido nucléico em que as seqüências nucleotídicas codificando o anticorpo ou porção anti- corpo são livres de outras sequ&encias nucleotídicas codificando anticorpos ou porções de anticorpo que se ligam a antígenos outros que hlL-12, que outras seqüências podem natu- ralmente Iadea o ácido nucléico no DNA genômico humano. Então, por exemplo, um ácido nucléico isolado da invenção codificando uma região VP de um anticorpo anti-IL-12 não con- tém outras seqüências codificando outras regiões VP que se liguem aos antígenos outros que IL-12. A frase "molécula aminoácida isolada" é também tencionada incluir seqüências codificando anticorpos bivalentes, biespecíficos, tais como dianticorpos em que as regiões VP e VL não contêm outras seqüências que as seqüências do dianticorpo.

O termo "vetor" inclui uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual ele tenha sido ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídio", que se refe- re a uma alça de DNA de fita dupla circular em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais po- dem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos ten- do uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos episomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não episomais) podem ser integrados no genoma da célu- la hospedeira sob introdução na célula hospedeira, e assim são replicados junto com o ge- noma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "ve- tores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinantes são sempre na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser utilizados de modo passível de mudança como o plasmídeo é mais comumente forma de vetor. Entretan- to, a invenção é tencionada a incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, replicação defeituosa de retrovírus, adenovírus e vírus associa- dos a adeno), que serve funções equivalentes.

A frase "células hospedeiras recombinantes" (ou simplesmente "célula hospedeira") inclui uam célula em que um vetor de expressão recombinante tem sido introduzido. Deve ser entendido que tais termos são tencionados referir-se não somente à célula particular sujeita, mas para a progênie de tal célula. Por causa de certas modificações podem ocorrer em gerações sussessoras devido a ou mutação ou influências ambientais, tal progênie pode não, de fato, ser idêntico a célula parental, mas são ainda incluídas dentro do objetivo do termo "célula hospdeira" como aqui utilizado.

O termo "modificar", como aqui utilizado, é tencionado referir-se a mudar um ou mais aminoácidos nos anticorpos ou porções Iigadoras de antígeno dos mesmos. A mudan- ça pode ser produzida por adição, substituição ou deleção de um aminoácído em uma ou mais posições. A mudança pode ser produzida utilizando técnicas conhecidas, tal como mu- tagênese PCR.

A frase "posição de contato" inclui uma posição aminoácida do CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve de um anticor- po que é ocupada por um aminoácido que tem contato com antígeno em uma das vinte e seis estruturas anticorpo-antígeno. Se um aminoácido CDR em qualquer dos 26 estruturas solvidas conhecidas de complexos anticorpo-antígeno contacta o antígeno, então que ami- noácido pode ser considerado para ocupar uma posição de contato. Posições de contato têm uma probabilidade mais alta de ser ocupadas por um aminoácido cujo antígeno de con- tato que posições não contato. Preferivelmente uma posição de contato é uma posição CDR que contém um aminoácido que contém antígeno em maiores que 3 a 26 estruturas (>11,5%). Mais preferivelmente uma posição de contato é uma posição de CDR que contém um aminoácido que contanto antígeno é maior que 8 a 25 estruturas (>32%).

O termo "posição hipermutação" inclui um resíduo aminoácido que ocupa a posição na região CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve de um anticorpo que é considerado ter uma freqüência ou probabilidade para hipermutação somática durante maturação de afinidade in vivo do anticorpo. "Alta freqüência ou probabilidade para hipermutação somática" inclui freqüências ou probabilidades de 5 a cerca de 40% de chance que o resíduo passará por hipermutação somática durante a matu - ração de afinidade in vivo do anticorpo. Deve ser entendido que todas as variações dentro deste estado de variação são também tencionam ser parte desta invenção, por exemplo, 5 a cerca de 30%, por exemplo, 5 a cerca de 15%, por exemplo, 15 a cerca de 30%.

O termo "posição de mutagênese seletiva preferida" inclui um resíduo aminoácido que ocupa uma posição na região CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia pe- sada ou região variável de cadeia leve que pode ser considerada para ambos, uma posição de contato e uma hipermutação.

Ά frase "abordagem de mutagênese seletiva" inclui um método de melhorar a ativi- dade de um anticorpo por selecionar e individualmente mutar aminoácidos CDR em pelo menos uma posição de mutagênse seletiva preferida, hipermutação, e/ou posição de conta- to. Um anticorpo humano "seletivamente mutado" é um anticorpo que contém uma mutação em uma posição selecionada utilizando uma abordagem de mutagênese seletiva. Em outra modalidade, a abordagem de mutagênese seletiva é tencionada prover um método de prefe- rivelmente mutar resíduos aminoácidos individualmente selecionados em CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia pesada (de agora em diante P1, P2, e P3, respectiva- mente), ou o CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia leve (de agora em diante referido como L1, L2, e L3, respectivamente) de um anticorpo. Resíduos aminoácidos po- dem ser selecionados a partir de posições de mutagênese seletivas, posições de contato, ou posições de hipermutação. Resíduos aminoácidos podem ser selecionados a partir de posi- ções de mutagênese seletivas preferidas, posições de contato, ou posições de hipermuta- ção. Aminoácidos individuais são selecionados baseados na sua posição na região variável de cadeia leve ou pesados. Deve ser entendido que uma posição de hipermutação pode também ser uma posição de contato. Em uma modalidade, a abordagem de mutagênese seletiva é uma "abordagem com alvo". A linguagem "abordagem em alvo" é tencionada in- cluir um método de preferivelmente mutar resíduos aminoácidos individuais selecionados em CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia pesada ou CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia leve de um anticorpo em uma maneira alvo, por exemplo, "a- bordagem em alvo grupo-guia" ou "abordagem em alvo CDR-guia". Na "abordagem em alvo grupo-guia", resíduos aminoácidos individuais em particular grupos são alvos para mutações seletivas incluindo grupos (incluindo L3 e P3), Il (incluindo P2 e L1) e Ill (incluindo L2 e P1), os grupos sendo listados a fim de preferência por alvos. Na "abordagem em alvo CDR-guia", resíduos aminoácidos individuais em particular CDRs são alvos para mutações seletivas com a ordem de preferência para alvos como segue: P3, L3, P2, L1, P1 e L2. Os resíduos aminoácidos selecionados são mutados, por exemplo, para pelo menos dois outros resíduos aminoácidos, e o efeito da mutação na atividade do anticorpo é determinado. Atividade é medida como uma mudança na especificidade/afinidade de ligação do anticorpo, e/ou po- tências de neutralização do anticorpo. Deve ser entedido que a abordagem de mutagênese seletiva pode ser utilizada para a otimização de qualquer anticorpo derivado a partir de qualquer fonte incluindo revelação fago, animais transgênicos com genes linha germinativa de IgG humana, anticorpos humanos isolados a partir de célula B. Preferivelmente, a abor- dagem de mutagênese seletiva é utilizada em anticorpos que não podem ser otimizados ainda utilizando tecnologia de revelação de fago. Deve ser entendido que anticorpos a partir de qualquer fonte incluindo revelação fago, animais trangênicos com genes linha germinati- va IgG humana, anticorpos humanos isolados a partir de células B humana podem ser sujei- tos a mutação retrógrada antes ou após da abordagem de mutagênse seletiva.

O termo "atividade aumentada do resíduo aminoácido" inclui um resíduo aminoáci- do que melhora a atividade do anticorpo. Deve ser entendido que a atividade aumentada do resíduo aminoácido pode substituir um resíduo aminoácido em uma posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato, ou uma posição de hipermutação e, ainda, mais que uma atividade aumentada do resíduo aminoácido pode estar presente dentro de um ou mais CDRs. Uma atividade aumentada do resíduo aminoácido inclui, um resíduo aminoácido que melhora a especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo, por exemplo, anticorpo anti- IL-12 humano se ligando a IL-12 humana. A atividade aumentada do resíduo aminoácido é também tencionada incluir um resíduo aminoácido que melhora a potência de neutralização de um anticorpo, por exemplo, o anticorpo IL-12 humano que inibe a IL-12 humana.

O termo "dose", como aqui utilizado, refere-se à administração de uma substância (por exemplo, um anticorpo anti-IL-12, anti-IL-23) para alcançar um objetivo terapêutico (por exemplo, o tratamento de artrite reumatóide).

Os termos "regime de dose quinzenalmente", "dose quinzenalmente", e "administra- ção quinzenalmente", como aqui utilizado, refere-se ao tempo de curso de administração de uma substância (por exemplo, um anticorpo anti-IL-12, anti-IL-23) a um paciente para alcan- çar um objetivo terapêutico, em que o tempo de curso é cada outra semana (cos). O regime de dose quinzenalmente não tenciona incluir um regime de dose semanal. Preferível mente, a substância é administrada cada 9-19 dias, mais preferivelmente, cada 11-17 dias, ainda mais preferivelmente, cada 13-15 dias, e mais preferivelmente, cada 14 dias.

O termo "combinação" como na frase "um primeiro agente em combinação com um segundo agente" inclui co-administração de um primeiro agente e um segundo agente, que, por exemplo, pode ser dissolvido ou intermisturado no mesmo veículo farmaceuticamente aceitável, ou administração de um primeiro agente seguido pelo segundo agente, ou admi- nistração do segundo agente, seguido pelo primeiro agente. A presente invenção, assim, inclui métodos de combinação de tratamento terapêutico e combinação de composições farmacêuticas.

O termo "concomitante" como na frase "tratamento terapêutico concomitante" inclui administração de um agente em presença de um segundo agente. Um método de tratamen- to terapêutico como agente está em presença de um segundo agente. Um método de trata- mento terapêutico concomitante inclui métodos em que o primeiro, segundo, terceiro ou a- gentes adicionais são co-administrados. Um tratamento terapêutico concomitante também inclui métodos em que os primeiros a agentes adicionais são administrados em presença de um segundo ou agentes adicionais, em que o segundo ou agentes adicionais, por exemplo, podem ter sido previamente administrados. Um método de tratamento terapêutico concomi- tante pode ser executado gradativamente por componentes diferentes. Por exemplo, um componente pode administrar a um paciente um primeiro agente e um segundo componente pode administrar ao paciente a um segundo agente, e os passos de administração podem ser executados ao mesmo tempo, ou perto do mesmo tempo, ou em tempos distantes, a fim de que o primeiro agente (e agentes adicionais) está após administração em presença do segundo agente (e agentes adicionais). O componente e o paciente podem ser a mesma entidade (por exemplo, humano).

O termo "combinação de terapia", como aqui utilizado, refere-se à administração de duas ou mais substâncias terapêuticas, por exemplo, um anticorpo anti-IL-12, anti-IL-23 e outra droga. A(s) outra(s) droga(s) pode ser administrada concomitantemente com, antes de, ou seguindo a administração de um anticorpo anti-IL-12, anti-IL-23.

O termo "estojo" como aqui utilizado refere-se a um pacote de produto compreen- dendo componentes com os quais se administra o anticorpo anti-IL-12, anti-IL23 da inven- ção para tratamento de um distúrbio relacionado a IL-12. O estojo preferivelmente compre- ende uma caixa ou recipiente que engloba os componentes do estojo. A caixa ou recipiente é afixada com uma etiqueta ou um protocolo aprovado da "Food and Drug Administration". A caixa ou recipiente engloba componentes da invenção que são preferivelmente contidos dentro de recipientes de plástico, polietileno, polipropileno, etileno, ou propileno. Os recipien- tes podem ser tubos ou garradas com tampa. O estojo pode também incluir instruções para administração de um anticorpo anti-IL-12, anti-IL-23.

Vários aspectos da invenção são descritos em detalhes adicionais nas seguintes subseções.

I.Anticorpos Humanos que se Ligam a IL-12 Humana

Este invenção prove métodos e composições para uso de anticorpos humanos, ou porções Iigadoras de antígeno dos mesmos, que se ligam a IL-12 humana para o tratamento de psoríase. A invenção também inclui métodos e composições para uso de um anticorpo que se liga a IL-12 e IL-23. Preferivelmente, os anticorpos humanos utilizados na invenção são anticorpos anti-hlL-12 humano recombinante, neutralizante.

Em uma modalidade, o anticorpo utilizando na invenção é o anticorpo ABT-874 (ver Patente dos EUA No. 6.914.128). ABT-874 é um anticorpo completamente humano contra a interleucina 12 (IL-12) e IL-23. Ele se liga com uma ótima afinidade à subunidade p40 co- mum a ambas IL-12 e IL-23, alvos validados no tratamento da psoríase (Ps).

Anticorpos que ligam à IL-12 humana podem ser selecionados, por exemplo, por seleção em uma ou mais bibliotecas de cDNA VL e VP com hlL-12, tal como por técnicas de revelação fago como descrito no Exemplo I da Patente dos EUA No. 6.914.128. Seleção de bibliotecas de cDNA VL e VP humano inicialmente identificou uma série de anticorpos anti- IL-12 dos quais um anticorpo, referido aqui como "Joe 9" (ou "Joe 9 selvagem"), foi selecio- nado para desenvolvimento adicional. Joe 9 tem uma afinidade relativamente baixa para anticorpo IL-12 humano (por exemplo, um Koof de cerca de 0,1 seg"1), ainda é útil para es- pecificamente se ligar e detectar hIL-12. A afinidade do anticorpo Joe 9 foi melhorada por conduzir mutagênese de GDRs de cadeia leve e pesada, produzindo um painel de regiões variáveis de cadeia leve e pesada que foram "misturadas e unidas" e mutadas adicionalmen- te, levando a numerosos anticorpos anti-ll-12 adicionais com afinidade aumentada para hlL- 12 (ver Exemplo 1, tabela 2 (ver Apêndice A) da Patente dos EUA No. 6.914.128 e os ali- nhamentos de seqüência de Figuras 1A-D da Patente dos EUA No. 6.914.128.

Desses anticorpos, o anticorpo anti-hlL-12 humano referido aqui como Y61 de- monstrou uma melhora significante na afinidade de ligação (por exemplo, um Koff de cerca de 2x10 4 seg"1). O anticorpo Y61 anti-hlL-12 foi selecionado para maturação de afinidade adicional por resíduos aminoácidos específicos de mutação individual dentro de CDRs de cadeia pesada e leve. Resíduos aminoácidos de Y61 foram selecionados para mutação sí- tio-específica (abordagem de mutagênese seletiva) baseados no resíduo aminoácido ocu- pando uma posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato e/ou hipermuta- ção. Um resumo das substituições nas posições selecionadas nos CDRs de cadeia de pe- sada e leve é mostrado nas Figuras 2A-2H da Patente dos EUA No. 6.914.128. Um anticor- po neutralizante recombinante preferido da invenção, referido aqui como J695 (também refe- rido como ABT-874 (Laboratórios Abbott), resultou a partir de uma substituição Gly ou Tyr na posição 50 da cadeia leve de CDR2 do Y61, e substituição Gly ou Tyr na posição 94 da cadeia leve de CDR3 do Y61.

Alinhamentos da seqüência de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um painel de anticorpos anti-IL-12 utilizado na invenção, na linhagem a partir de Joe 9 selvagem para J695, são mostrados nas Figuras 1A-1D da Patente dos EUA No. 6.914.128. Essa seqüência de alinhamentos permitiu a identificação de consenso de se- qüências para regiões variáveis de cadeia pesada e leve preferidas de anticorpos da inven- ção que se ligam a hll-12, bem como como consenso de seqüências para CDR3, CDR2 e CDR1, na linhagem a partir de Joe 9 para J695. Além disso, a análise de mutagênese Y61 resumida nas Figuras 2A-2H permitiu a identificação das seqüências consenso para regiões variáveis de cadeia pesada e leve que se ligam a hlL-12, bem como seqüências consenso para CDR3, CDR2, e CDR1 que se ligam a hlL-12 na linhagem a partir de Y61 a J695 que compreende seqüências com modificações a partir de Y61 ainda retém boas características de ligação a hlL-12. Seqüências CDR, VP e VL preferidas da invenção (incluindo seqüên- cias consenso) como identificado pelos identificadores de seqüência na Listagem de Se- qüência anexada, são resumidos abaixo.

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Anticorpos produzidos a partir da afinidade de maturação do Joe 9 selvagem foram funcionalmente caracterizados por análise de ressonância plásmon de superfície para de- terminar a taxa de Kd e Koof. Uma série de anticorpos foram produzidos tendo a taxa Koff dentro da variação de cerca de 0,1 s"1 a cerca de 1x10'5s"1, e mais preferivelmente um koff de cerca de 1x10"4s"1 para 1x10"5s"1 ou menos. Anticorpos foram também caracterizados in vitro para sua habilidade em inibir proliferação blástica por fitoemaglutinina (PHA), com des- crito no Exemplo 3 da Patente dos EUA No. 6.914.128. Uma série de anticorpos foram pro- duzidos tendo um valor de IC50 na variação de cerca de IxICT6 M para cerca de 1x10"11 M, mais preferivelmente cerca de 1x10"10 M a 1x10"11 M ou menos.

Consequentemente, em um aspecto, a invenção provê métodos e composições pa- ra uso de um anticorpo humano isolado, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, que se liga a uma IL-12 humana e dissocia-se a partir da IL-12 humana com uma taxa constante de Koff de 0,1 s"1 ou menos, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou que inibe proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de proliferação blástica de fito- emaglutinina in vitro (ensaio de PHA) com um IC50 de 1x10"® M ou menos. Em modalidades preferidas, o anticorpo IL-12 humano isolado, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, dissociado a partir da IL-12 humana com uma taxa constante Koff de 1x10"2s"1 ou menos, ou inibe proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x107 M ou menos. Em mais modalidades preferidas, o anticorpo IL-12 humano isolado, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, dissocia a partir da IL-12 humana com uma taxa constante koff de 1x10-3s-1 ou menos, ou inibe proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de IxIO"8 M ou menos. Em mais modalidades prefe- ridas, o anticorpo IL-12 humano isolado, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, disso- cia-se a partir da IL-12 humana com uma taxa constante de Koff de 1x10-4S-1 ou menos, ou inibe proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10-9 M ou menos. Em mais modalidades preferidas, o anticorpo IL-12 humano isolado, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, dissocia-se a partir da IL-12 humana com uma taxa constante de Koff de 1x10-5s-1 ou menos, ou inibe proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10-10 M ou menos. Em ainda mais modali- dades preferidas, o anticorpo IL-12 humano isolado, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, dissocia-se a partir da IL-12 humana com uma taxa constante de Koff de 1x10-5s-1 ou menos, ou inibe proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10-11 M ou menos.

A taxa constante de dissociação (Koff) de um anticorpo IL-12 pode ser determinado por ressonância plásmon de superfície (ver Exemplo 5 da Patente dos EUA 6.914.128). Ge- ralmente, análise de ressonância plásmon de superfície mede uma interação de ligação em tempo real entre Iigante (IL-12 humana recombinante imobilizada em uma matriz biosenso- ra) e analito (anticorpos em solução) por ressonância plásmon de superfície (RPS) utilizando um sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Análises plásmon de superfície podem também ser feitas por imobilização do analito (anticorpos em uma matriz biosensora) e presença do Iigante (IL-12 recombinante em solução). Atividade de neutralização dos anti- corpos de IL-12, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo, podem ser avaliadas utilizan- do um ou mais dos vários ensaios in vitro adequados (ver Exemplo 3 da Patente dos EUA No. 6.914.128).

É bem conhecido na técnica que CDRs de cadeia leve e pesada de anticorpos de- sempenham um papel importante na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo para um antígeno. Consequentemente, a invenção compreende anticorpos humanos tendo CDRs de cadeia leve e pesada do Joe 9, bem como outros anticorpos tendo CDRs que têm sido modificados para melhorar a especificidade/afinidade de ligação do anticorpo. Como demonstrado no Exemplo 1 da Patente dos EUA No. 6.914.128, uma série de modificações dos CDRs de cadeia leve e pesada resulta na maturação da afinidade dos anticorpos anti- hlL-12 humanos. Os alinhamentos da seqüência aminoácida da região variável de cadeia pesada e leve de uma série de anticorpos humanos variando do tipo Joe 9 selvagem a J695 que se liga a 11-12 humana é mostrado nas Figuras 1A-1D da Patente dos EUA No. 6.914.128. Motivos da seqüência consenso dos CDRs de anticorpos podem ser determina- dos a partir da seqüência alinhamento. Por exemplo, um motivo consenso para o VP CDR3 da linhagem a partir de Joe 9 a J695 compreende a seqüência aminoácida: (HZS)-G-S-(HZY)- D-(N/T/Y) (SEQ ID NO:1), que compreende aminoácidos a partir da posição 95 a 102 do HCVR consenso mostrado na SEQ ID NO:7. Um motivo consenso para VL CDR3 compre- ende a seqüência aminoácida: Q-(Sn)-Y-(D/E)-{SIRJK)-(S/GrY)-(UFmS)-(RJSn/W/H)-{G/P)- (S/T/A/L)-(R/S/M/T/L-V/l/T/M/L) (SEQ ID NO:2), que compreende aminoácidos a partir da posição 89 a 97 do LCVR consendo mostrado na SEQ ID NO:8.

Consequentemente, em outro aspecto, a invenção provê métodos e composições compreendendo um anticorpo humano isolado, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que tem as seguintes características:

a)inibe proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de IxIO-6M ou menos;

b) tem uma cadeia pesada CDR3 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:1; e

c) tem um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ IDNO:2.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo ainda compreende uma VP CDR2 com- preendendo a seqüência aminoácida: F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO:3) (que compreende aminoácidos a partir da posição 50 a 65 da HCVR consenso compreen- dendo a seqüência aminoácida SEQ ID NO:7) e ainda compreende uma VL CDR2 compre- endendo a seqüência aminoácida: (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S (SEQ ID NO:4) (que compre- ende aminoácidos a partir da posição 50 a 56 da LCVR consenso compreendendo a se- qüência aminoácida SEQ ID NO:8).

Em outra modalidade preferida, o anticorpo ainda compreende uma VP CDR1 com- preendendo a seqüência aminoácida: F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H (SEQ ID NO:5) (que compre- ende aminoácidos a partir da posição 27 a 35 da HCVR consenso compreendendo a se- qüência aminoácida SEQ ID NO:7) e ainda compreende uma VL CDR1 compreendendo a seqüência aminoácida: (SZT)-G-(GZS)-(FyS)-S-N-l-(GZV)-(SZA)-(NZGZY)-(TZD)-V-(K/H) (SEQ ID NO:6) (que compreende aminoácidos a partir da posição 24 a 34 da LCVR consenso com- preendendo a seqüência aminoácida SEQ ID NO:8).

Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo utilizando na invenção compre- ende um HCVR compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:7 e um LCVR compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:8.

Motivos consenso adicionais podem ser determinados baseados na análise muta- cional feita em Y61 que leva ao anticorpo J695 (resumido nas Figuras 2A-2H da Patete dos EUA No. 6.914.128). Como demonstrado pelos gráficos mostrados nas Figuras 2A-2H da Patente dos EUA No. 6.914.128, certos resíduos de CDRs de cadeia pesada e leve da Y61 foram fáceis de substituição sem impedimento significante das propriedades de ligação da hlL-12 do anticorpo. Por exemplo, substituições individuais na posição 30 em CDR H1 com doze resíduos aminoácidos diferentes não reduzem significantemente a taxa de Koff do an- ticorpo, indicando que a posição é fácil para substituição com uma variedade de resíduos aminácidos diferentes. Então, baseado na análise mutacional (isto é, posições dentro de Y61 qye foram fáceis para substituição por outros resíduos aminoácidos) motivos consenso foram determinados. Os motivos consenso para CDR3s de cadeia pesada e leve são mos- trados na SEQ ID N0s:9 e 10, respectivamente, motivos consenso para CDR2s de cadeia pesada e leve são mostrados na SEQ ID NOs:11 e 12, respectivamente, e motivos consen- so para CDRIs de cadeia pesada e leve são mostrados nas SEQ ID NOs: 12 e 14, respecti- vãmente. Motivos consenso para regiões VP e VL são mostrados nas SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente.

Consequentemente, em um aspecto, a invenção inclui um anticorpo humano isola- do, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que tem as seguintes características:

a)inibe proliferação blástica de fitoemaglutinina em um ensaio de Pha in vitro com um IC50 de 1x10"9 M ou menos;

b) tem um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:9; e

c) tem um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:10.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo ainda compreende uma VP CDR2 com-

preendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 11 e ainda compreende um VL CDR2 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 12.

Em outra modalidade preferida, o anticorpo ainda compreende a VP CDR1 com- preendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 13 e ainda compreende uma VL CDR1 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 14.

Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo utilizado na invenção compreen- de um HCVR compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 15 e um LCVR com- preendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 16.

Um anticorpo preferido utilizado na invenção, anticorpo anti-IL-12 humano Y61, po- de se produzido por maturação de afinidade do Joe 9 selvagem por mutagênese em PCR do CDR3 (como descrito no Exemplo 1 da Patente dos EUA No. 6.914.128). Y61 teve uma es- pecificidade/afinidade de ligação determinada pela ressonância plásmon de superfície e por ensaios de neutralização in vitro. Os CDR3s de cadeia pesada e leve do Y61 são mostrados na SEQ ID NOs: 17 e 18, respectivamente, as cadeia CDR2 pesada e leve de Y61 são mos- tradas nas SEQ ID NOs: 19 e 20, respectivamente. A VP de Y61 tem a seqüência aminoáci- da da SEQ ID NO:23 e a VL de Y61 tem a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:24 (essas seqüências são também mostradas nas Figuras 1A-1D da Patente dos EUA No. 6.914.128, alinhadas com Joe 9).

Consequentemente, em outro aspecto, as características da invenção usam um an- ticorpo humano isolado, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que

a)inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10 9 M ou menos;

b) tem um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 17; e

c) tem um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:18.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, utilizado nos métodos e composições da invenção tem um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:19 e um CDR2 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:20.

Em outra modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigado- ra de antígeno do mesmo, utilizado nos métodos e composições da invenção tem um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:21 e um CDR1 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:22.

Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou uma porção ligadora de antígeno do mesmo, utilizado nos métodos e composições da invenção compre- endendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:23, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoá- cida da SEQ ID NO:24.

Em certas modalidades, o comprimento inteiro do anticorpo compreende uma regi- ão constante de cadeia pesada, tais como regiões constante de IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgE1 e qualquer variante alotípica aqui como descrito em Kabat (Kabat, Ε. A., et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH No. 91-3242). Preferivelmente, a re- gião constante de cadeia pesada do anticorpo é uma região constante de cadeia pesada IgGI. Alternativamente, a porção do anticorpo pode ser um fragmento Fab, um fragmento F(ab'2) ou um fragmento Fv de cadeia única.

Modificações de resíduos individuais de Y61 leve à produção de um painel de anti- corpos mostrados nas Figuras 2A-2H da Patente dos EUA No. 6.914.128. A especificida- de/afinidade de ligação de cada anticorpo foi determinada por ressonância plásmon de su- perfície e/ou por ensaios de neutralização in vitro.

Consequentemente, em outro aspecto, a invenção retrata um anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, que

b) tem um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida sele- cionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID N0:404-SEQ ID NO:469; e

c) tem um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida selecio- nada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO:534-SEQ ID NO:579.

Em modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, utilizado nos métodos e composições da invenção tem uma cadeia pesada CDR2 compreendendo a seqüência aminoácida selecionada a partir do grupo con- sistindo de SEQ ID NO:335-SEQ ID N0:403; e uma cadeia leve CDR2 compreendendo a seqüência aminoácida selecionada do grupo consistindo do grupo de SEQ ID N0:506-SEQ ID NO:533.

Em outra modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigado- ra do mesmo, tem uma cadeia pesada CDR1 compreendendo a seqüência aminoácida se- lecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO:288-SEQ ID NO:334; e uma cadeia leve CDR1 compreendendo a seqüência aminoácida selecionada a partir do grupo consis- tindo de SEQ ID N0:470-SEQ ID N0:505.

Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou uma porção ligadora de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:23, e uma região variável de ca- deia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:24.

Em certas modalidades, o comprimento inteiro do anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada tais como regiões constante de IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, lgM, IgA e IgE e qualquer variante alotípica aqui como descrito em Kabat (Kabat, E.A. et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH No. 92-3242).Preferivelmente, a regi- ão constante da cadeia pesada no anticorpo é uma região constante de cadeia pesada de lgG1. Alternativamente, a porção de anticorpo pode ser um fragmento Fab, um fragmento F(ab'2) ou um simples fragmento Fv.

Um recombinante, anticorpo neutralizante, J695 particularmente preferido, que po- dem ser utilizados na invenção foi produzida por mutagênese sítio-direcionada de contato e resíduos aminácidos de hipermutação do anticorpo Y61 (ver Exemplo 2 da Patente dos EUA No. 6.914.128 e seção Ill abaixo). J695 difere a partir do Y61 por uma substituição Gly a Tyr em Y61 na posição 50 do CDR2 de cadeia leve e por substituição Gly por Tyr na posição 94 do CDR3 de cadeia leve. Os CDR3s de cadeia pesada e leve do J695 são mostrados na SEQ ID NOs: 25 e 26, respectivamente, as CDR2s de cadeia pesada e leve de J695 são mostrados na SEQ ID NO:31 e a VL de J695 tem a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:32 (essas seqüências são também mostradas nas Figuras 1A-1D da Patente dos EUA No. 6.914.128, alinhada com Joe9).

Consequentemente, em outro aspecto, a invenção caracteriza um anticorpo huma- no isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, que a) inibe proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"9 M ou menos; b) tem um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:25; e c) tem um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:26.

Na modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, utilizado na invenção tem um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:27, e CDR2 de cadeia leve compreendendo a se- qüência aminoácida da SEQ ID NO:28.

Em outra modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigado- ra de antígeno do mesmo, utilizado na invenção tem um CDR1 de cadeia pesada compre- endendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:29, e o CDR1 de cadeia leve compreen- dendo a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:30.

Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, utilizado na invenção tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminácida de SEQ ID NO:31, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:32.

Em certas modalidades, o anticorpo de comprimento inteiro compreende uma regi- ão constante de cadeia pesada, tais como regiões contante de IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, igA e IgE e qualquer variante alotípico aqui como descrito em Kabat (Kabat E.A. et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Seviços Humanos dos EUA, Publicação do NIH No. 91-3242). Preferivelmente, a região constante da cadeia pesada do anticorpo é uma região constante de cadeia pesada de IgGI. Alternativamente, a porção do anticorpo pode ser um fragmento Fab, um fragmento F(ab'2) ou um fragmento Fv de cadeia única.

Mutações adicionais das seqüências consenso preferidas para CDR3, CDR2 e CDR1 de anticorpos na linhagem a partir de Joe9 para J695, ou a partir da linhagem Y61 para J695, podem ser feitas para prover anticorpos anti-IL-12 adicionais da invenção. Tais métodos de modificação podem ser feitos utilizando técnicas de biologia molecular padrões, tais como mutagênese por PCR, contato individual em alvo ou hipermutação de resíduos aminoácidos nos CDRs de cadeia leve e/ou cadeia pesada, seguido por cinética e análise funcional dos anticorpos modificados como aqui descrito (por exemplo, ensaios de neutrali- zação descritos no Exemplo 3 da Patente dos EUA No. 6.914.128, e por análise BIAcore, como descrito no Exemplo 5 da Patente dos EUA No. 6.914.128).

Consequentemente, em outro aspecto a invenção retrata uso de um anticorpo hu- mano isolado, ou uma porção ligadora de antígeno do mesmo, que

a)inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10-6 M ou menos;

b) compreende um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoá- cida da SEQ ID N0:1, um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:3 e um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:5, ou um mutante do mesmo tendo uma ou mais substituições aminoácidas em uma posição de mutagênese seletiva preferida ou uma posição de hipermutação, em que o referido mutante tem uma taxa de Koff não mais que 10 vezes mais alta que o anticorpo compreendendo um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:1, um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:3, e um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:5; e

c) compreende um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:2, um CDR2 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:4, e um CDR1 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:6, ou um mutante do mesmo tendo uma oumais substituições aminoácidas em uma posição de mutagênese seletiva preferida ou uma posição de hipermutação, em que o refe- rido mutante tem uma taxa Koff não mais que 10 vezes maior que o anticorpo compreen- dendo um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:2, um CDR2 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:4, e um CDR1 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoáciad da SEQ ID NO:6.

Em outro aspecto a invenção retrata o uso de um anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, que

a)inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10-9 M ou menos;

b) compreende um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoá- cida da SEQ ID NO:9, um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:11 e um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 13, ou um mutante do mesmo tendo uma ou mais substituições aminoácidas em uma posição de mutagênese seletiva preferida ou uma posição de hipermutação, em que o referido mutante tem uma taxa de Koff não mais que 10 vezes mais alta que o anti- corpo compreendendo um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoáci- da da SEQ ID NO:9, um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:11, e um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:13; e

c) compreende um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 10, um CDR2 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 12, e um CDR1 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 14, ou um mutante do mesmo tendo uma ou mais substituições aminoácidas em uma posição de mutagênese seletiva preferida ou uma posição de hipermutação, em que o referido mutante tem uma taxa Koff não mais que 10 vezes maior que o anticorpo compre- endendo um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 10, um CDR2 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 12, e um CDR1 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:14.

Um versado na técnica também apreciará que mutações adicionais para as regiões CDR de um anticorpo, por exemplo, no Y61 ou em J695, pode ser feito para prover anticor- pos anti-IL-12 adicionais da invenção. Tais métodos de modificação podem ser feitos utili- zando técnicas de biololgia molecular padrões, como descrito. A análise funcional e cinética dos anticorpos modificados pode ser feita como descritos no Exemplo 3 da Patente dos EUA No. 6.914.128 e Exemplo 5 da Patente dos EUA No. 6.914.128, respectivamente. Modifica- ções de resíduos individuais de Y61 que levam a identificação do J695 são mostradas nas Figuras 2A-2H da Patente dos EUA No. 6.914.128 e são descritos no Exemplo 2 da Patente dos EUA No. 6.914.128.

Consequentemente, em outro aspecto a invenção retrata uso de um anticorpo hu- mano isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, que

a)inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de PHA in vitro com um IC50 de 1x10"9 M ou menos;

b) compreende um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoá- cida da SEQ ID NO: 17, um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoáci- da da SEQ ID NO: 19 e um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoáci- da da SEQ ID NO:21, ou um mutante do mesmo tendo uma ou mais substituições aminoáci- das em uma posição de mutagênese seletiva preferida ou uma posição de hipermutação, em que o referido mutante tem uma taxa de Koff não mais que 10 vezes mais alta que o anticorpo compreendendo um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência amino- ácida da SEQ ID NO: 17, um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoá- cida da SEQ ID NO: 19, e um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a seqüência amino- ácida da SEQ ID NO:21; e

c) compreende um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 18, um CDR2 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:20, e um CDR1 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:22, ou um mutante do mesmo tendo uma ou mais substituições aminoácidas em uma posição de mutagênese seletiva preferida ou uma posição de hipermutação, em que o referido mutante tem uma taxa Koff não mais que 10 vezes maior que o anticorpo compre- endendo um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO: 18, um CDR2 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:20, e um CDR1 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoáciad da SEQ ID NO:22.

Em outro aspecto a invenção retrata usa um anticorpo humano isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, que

b) compreende um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoá- cida da SEQ ID NO:25, um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoáci- da da SEQ ID NO:27 e um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoáci- da da SEQ ID NO:29, ou um mutante do mesmo tendo uma ou mais substituições aminoáci- das em uma posição de mutagênese seletiva preferida ou uma posição de hipermutação, em que o referido mutante tem uma taxa de Koff não mais que 10 vezes mais alta que o anticorpo compreendendo um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência amino- ácida da SEQ ID NO:25, um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoá- cida da SEQ ID NO:27, e um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a seqüência amino- ácida da SEQ ID NO:29; e

c) compreende um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:26, um CDR2 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:28, e um CDR1 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:30, ou um mutante do mesmo tendo uma ou mais substituições aminoácidas em uma posição de mutagênese seletiva preferida ou uma posição de hipermutação, em que o referido mutante tem uma taxa Koff não mais que 10 vezes maior que o anticorpo compre- endendo um CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:26, um CDR2 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:28, e um CDR1 de cadeia leve compreendendo a seqüência aminoáciad da SEQ ID N0:30.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê o uso de um anticorpo humano isola- do, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo, que neutralizam a atividade da IL-12 hu- mana, em pelo menos um IL-12 primado adicional selecionado a partir do grupo consistindo de IL-12 babuíno, 11-12 marmoset (um tipo de macaco), IL-12 de chipamzé, IL-12 cynomol- gus (tipo de macaco) e IL-12 reso, mas que não neutraliza a atividade da IL-12 de camun- dongo.

Seleção de Anticorpos Humanos Recombinantes

Anticorpos humanos recombinantes que podem ser utilizados na invenção podem ser isolados por seleção de uma biblioteca de anticorpo combinatorial recombinante, preferi- velmente uma biblioteca que revela o fago scFv, preparado usando cDNAs de VL e VP hu- mano preparado a partir do mRNA derivado a partir de linfócitos. Métodos para identificar anticorpos que podem ser utilizados nos métodos e composições da invenção são descritos na Patente dos EUA No. 6.914.128, incorporados aqui por referência. Em adição aos kits comercialmente disponíveis para gerar bibliotecas que revelam fago (por exemplo, a Phar- macia Recombinant Phage Antibody System, catálogo no. 27-9400-01; e o kit que revela fago Stratagene SurfZAP®, catálogo no. 240612), exemplos de métodos e reagentes parti- cularmente fácil para uso em gerar e selecionar bibliotecas que revelam anticorpo podem ser encontrados em, por exemplo, Kang et al Publicação PCT No. WO 92/18619; Winter et al Publicação PCT No. WO 92/20791; Breitling et al, Publicação PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al, Publicação PCT No. WO 92/01047; Garrard et al Publicação PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al (1991) bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al (1992) Hum Antibod Hybridomas, 3:81-85; Huse et al (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al, Publica- ção PCT No. WO 92/01047; Garrard et al, Publicação PCT No. Wo 92/09690; Fuchs et al (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al, Nature (1990) 348:552-554; Grif- fiths et al (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clack- son et al (1991) Nature 352:624-628; Gram et al (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; hoogenboom et al (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas et a/(1991) PNAS 88:7978-7982.

As bibliotecas de anticorpo utilizadas neste método são preferivelmente bibliotecas de scFv preparadas a partir de cDNAs de VL e VP. As bibliotecas de anticotpo scFv são preferivelmente selecionadas utiliando IL-12 humana recombinante como o antígeno para selecionar seqüências de cadeia pesada e leve humanas tendo um atividade de ligação pa- ra a IL-12. Para selecionar a especificidade dos anticorpos para a subunidade p35 da IL-12 ou o heterodímero p70, ensaios de seleção foram feitos em presença de excesso de subu- nidade p40 livre. Preferências de subunidades podem ser determinadas, por exemplo, por titulação micro-Friguet, como descrito no Exemplo 1 da Patente dos EUA No. 6.914.128.

Uma vez segmentos de VL e VP humano iniciais são selecionados. Experimentos de "mistura e adapta", em que diferentes pares dos segmentos VL e VP selecionados são filtrados para ligação à IL-12, são feitos para selecionar as combinações de pares VL/VP preferidos (ver Exemplo 1 da Patente dos EUA No. 6.914.128). Adicionalmente, para ainda melhorar a afinidade e/ou diminuir a raxa off constante para a ligação da hlL-12, os segmen- tos VL e VP do(s) par(s) VL/VP preferido(s) pode(m) ser aleatoriamente mutado(s), preferi- velmente dentro da região CDR3 da VP e/ou VL, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação da afinidade dos anticorpos durante a resposta imune natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser realizada por amplifi- car as regiões da VP e VL utilizando iniciadores de PCR complementares para o CDR3 VP ou CDR3 VL1 respectivamente, cujos iniciadores têm sido "spiked" com uma mistura aleató- ria das quatro bases nucleotídicas em certas posições tal que os produtos de PCR resultan- tes codificam os segmentos VP e VL em que mutações aleatórias têm sido introduzidas nas regiões VP e/ou VL da CDR3. Esses segmentos VP e VL mutados aleatoriamente podem ser re-selecionados e re-filtrados para ligação à hlL-12 e seqüências que exibem alta afini- dade e uma baixa taxa off para ligação à 11-12 podem ser selecionadas. Tabela 2 (ver Apên- dice A da Patente dos EUA No. 6.914.128) mostra anticorpos que mostram especificida- de/afinidade de ligação produzida como um resultado da maturação de afinidade in vitro.

Seguindo a seleção, isolamento e separação de um anticorpo anti-hlL-12 da inven- ção a partir da biblioteca que revela imunoglobulina recombinante, ácido nucléico codifican- do o anticorpo selecionado pode ser recuperado a partir de partícula(s) fago (por exemplo, a partir do genoma fago) e subclonado em outros vetores de expressão por técnicas de DNA recombinante padrão. Se desejado, o ácido nucléico pode ser ainda manipulado para criar outras formas de anticorpo da invenção (por exemplo, ligado ao ácido nucléico codificando domínios de imunoglobulina adicionais, tais como regiões constantes adicionais). Para ex- pressar um anticorpo humano recombinante isolado por seleção de uma biblioteca combina- torial, o DNA codificando o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras mamífero, como descrito em detalhes adicionais na Se- ção IV abaixo.

Métodos para selecionar anticorpos de ligação da IL-12 humana por tecnologia de revelação de fago, e maturação de afinidade dos anticorpos selecionados por mutagênese sítio-direcionada ou aleatória das regiões CDR são descritas em detalhes adicionais no E- xemplo 1 da Patente dos EUA No. 6.914.128.

Como descrito no Exemplo 1 da Patente dos EUA No. 6.914.128, selecionado de bibliotecas de cDNA de VL e VP humana identificou uma série de anticorpos anti-IL-12, dos qual o anticorpo Joe 9 foi selecionado para desenvolvimento adicional. Uma comparação da região variável de cadeia pesada do Joe 9 com as seqüências de linha germinativa da ca- deia pesada a partir da base de dados VBASE, revelou que Joe 9 foi similar à seqüência linha germinativa COS-3. COS-3 pertence à família VH3 de seqüências linha germinativa.

A família VH3 é parte do repertório linha germinativa VP humano que é agrupado em sete famílias, VH1-VH7, baseado na homologia da seqüência nucleotídica (Tomlinson et al (1992) J. Mol. Biol. 227, 776-798 e Cook et al (1995) Immunology Today, 16, 237-242). A família VH3 contém o número mais alto de membros e fa a maior contribuição do repertório linha germinativa. Para qualquer dada seqüência de anticorpo linha germinativa VH3 huma- na, a identidade da seqüência aminoácida dentro da família VH3 inteira é alta (Ver, por e- xemplo, Tomlinson et al (1992) J Mol Biol1 227, 776-798 e Cook et al (1995) Immunology Today, 16, 237-242). A variação da identidade de seqüência aminoácida entre qualquer de duas seqüências VP linha germinativa da família VH3 varia a partir de resíduos 69-98 de aproximadamente 100 resíduos VP (isto é, 69-98% de homologia de seqüência aminoácida entre quaisquer de suas seqüências VP linha germinativa). Para a maioria dos pares das seqüências linha germinativa existe pelo menos 80 ou mais resíduos aminoácidos idênticos (isto é, pelo menos 80% de homologia da seqüência aminoácida). O alto grau de homologia de seqüência aminoácida entre os membros da família VH3 resulta em certos resíduos ami- nácidos sendo presente em sítios chaves nas regiões CDR e estrutura da cadeia VP. Esses resíduos aminoácidos conferem características estruturais sob os CDRs.

Estudos de estruturas de anticorpos têm mostrado que conformações de CDR po- dem ser agrupadas em famílias de estruturas CDR canônicas nos resíduos aminoácidos que ocupam certas posições nas regiões CDR e estrutura. Consequentemente, existem confor- mações CDR locais similares em anticorpos diferentes que têm estruturas canônicas com resíduos aminoácidos chaves idênticos (Chothia et al (1987) J Mol Biol, 196, 901-917 e Cho- thia et al (1989) Nature, 342, 877-883). Dentro da família VH3 existe uma conservação da identidade do resíduo aminoácido nos sítios chave para as estruturas canônicas CDR1 e CDR2 (Chothia et al (1992) J Mol Biol, 227, 799-817).

O gene VH linha germinativa COS-3, é um membro da família VH3 e é uma varian- te do alelo VP linha germinativa 3-30 (DP-49). COS-3, difere a partir das seqüências amino- ácidas Joe 9 VP em somente 5 posições. O alto grau de homologia sa seqüência aminoáci- da entre Joe 9 VP e Cos-3, e entre Joe 9 VP e outros membros da família VH3 também con- fere um alto grau de homologia estrutural CDR (Chothia et al (1992) J. Mol. Biol., 227, 799- 817; Chothia et a/(1987) J Mol Biol., 196, 901-917 e Chothia et a/(1989) Nature, 342, 877- 883).

O versado na técnica apreciará que baseado na alta seqüência aminoácida e simi- laridade estrutural canônica para Joe 9, outros membros da família VH3 podem também ser utilizados para gerar anticorpos que ligam à IL-12 humana. Este pode ser feito, por exemplo, por selecionar técnicas apropriadas de VL por mistura de cadeia (Winter et al (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433-55), ou por montagem de CDRs a partir de roedores ou outro anti- corpo humano incluindo CDRs a partir de anticorpos da invenção em uma estrutura da famí- lia VH3.

O repertório linha germinativa Iambda V humano é agrupado em 10 famílias basea- das na homologia sa seqüência nucleotídica (Williams et al (1996) J Mol Biol, 264, 220-232). Uma comparação da região variável de cadeia leve do Joe 9 com as seqüências linha ger- minativa de cadeia leve a partir da base de dado VBASE, revelou que Joe 9 foi similar à li- nha germinativa Iambda DPL8. A VL do Joe 9 difere a partir da seqüência DPL8 em somen- te quatro posições estrutura, e é altamente homóloga para as seqüências estrutura dos membros da família VA1. Baseados na alta homologia da seqüência aminoácida e similari- dade estrutural canônica para Joe 9, outros membros da família VA1 podem também ser utilizados para gerar anticorpos que se ligam a IL-12 humana. Este pode ser feito, por e- xemplo, por selecionar uma VP apropriada por técnicas de mistura de cadeia (Winter et al, Supra, ou por montagem de CDRs a partir de um roeador ou outro anticorpo humano inclu- indo CDRs a partir de anticorpos desta invenção em um estrutura da família VA1.

Os métodos da invenção são tencionados incluir anticorpos recombinantes que se ligam a hlL-12, compreendendo uma região variável de cadeia pesada derivada a partir de um membro da família VH3 de seqüências linha germinativa, e uma região variável de ca- deia leve derivada a partir de um membro da família VA1 das seqüências linha germinativa. Além disso, o versado na técnica apreciará que qualquer membro da seqüência de cadeia pesada da família VH3 pode ser combinado com qualquer membro da seqüência de cadeia leve da família VA1.

Aqueles versados na técnica também apreciarão que polimorfismos da seqüência de DNA que levam a mudanças nas seqüências aminoácidas da linha germinativa podem existir dentro de uma população (por exemplo, a população humana). Tal polimorfismo gêni- co nas seqüências linha germinativa pode existir entre indivíduos dentro de uma população devido à variação alélica natural. Tais variações alélicas naturais podem tipicamente resul- tam em uma variação de 1-5% na seqüência nucleotídica de um gene. Qualquer e todas tais variações nucleotídicas e polimorfismos aminoácidos resultantes nas seqüências linha ger- minativa que são o resultado da variação alélica natural são tencionadas estar dentro do objetivo da invenção.

Consequentemente, em um aspecto, a invenção retrata um anticorpo humano iso- lado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, que tem as seguintes características:

a)que se liga à 11-12 humana e dissocia a partir da IL-12 com uma taxa Koff cons- tante de 0,1 s"1 ou menos, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou que inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de proliferação blástica de fitoemaglutinina in vitro (ensaio de PHA) com um IC50 de 1x10"® M ou menos.

b) tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência ami- noácida selecionada a partir de um membro da família linha germinativa VH3, em que a re- gião variável de cadeia pesada tem uma mutação em uma posição de contato ou hipermu- tação com uma atividade aumentada do resíduo aminoácido.

c) tem um região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência aminoáci- da selecionada a partir de um membro da família linha germinativa VA1, em que a região variável de cadeia leve tem uma mutação em uma posição de mutagênese seletiva preferi- da, posição de contato ou hipermutação com uma atividade de resíduo aminoácido aumen- tada.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou antígeno ligador tem mutação na cadeia pesada CDR3. Em outra modalidade preferida, o anticorpo humano iso- lado, ou ligação de antígeno tem mutação na cadeia leve CDR3. Em outra modalidade pre- ferida, o anticorpo humano isolado, ou ligação de antígeno tem mutação na cadeia pesada CDR2. Em outra modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou ligação de antígeno tem mutação na cadeia leve CDR2. Em outra modalidade preferida, o anticorpo humano isolado, ou ligação de antígeno tem mutação na cadeia pesada de CDR1. Em outra modali- dade preferida, o anticorpo humano isolado, ou ligação de antígeno tem mutação na cadeia leve CDR1.

Em versado na técnica apreciará que baseado na alta similaridade da seqüência aminoácida entre membros da família linha germinativa VH3, ou entre membros da família linha germinativa VA1 de cadeia leve, que muta para seqüências linha germinativas podem prover anticorpos adicionais que se ligam à 11-12 humana. Tabela 1 da Patente dos EUA NO. 6.914.128 (ver também Apêndice A da Patente dos EUA No. 6.914.128) mostra as seqüên- cias linha germinativa dos membros da família VH3 e demonstra a homologia de seqüência significante dentro dos membros da família. Também mostrado na tabela 1 da Patente dos EUA No. 6.914.128 são as seqüências linha germinativa para membros da família VA1. As seqüências da cadeia pesada e leve do Joe 9 são providos como uma comparação. Muta- ções para as seqüências linha germinativa dos membros da família VH3 e VA1 podem ser feitos, por exemplo, nas mesmas posições aminoácidas como àquelas feitas nos anticorpos da invenção (por exemplo, mutações em Joe 9). As modificações podem ser feitas utilizando técnicas de biologia molecular padrão, tais como mutagênese PCR, resíduos aminoácidos individuais alvo nas seqüências linha germinativa, seguido por análise cinética e funcional dos anticorpos modificados como aqui descrito (por exemplo, ensaios de neutralização des- critos no Exemplo 3 da Patente dos EUA No. 6.914.128 e por análise BIAcore, como descri- to no Exemplo 5 da Patente dos EUA No. 6.914.128.

Consequentemente, em um aspecto, a invenção retrata usa de um anticorpo huma- no isolado, ou uma porção Iigadora de anticorpo do mesmo, que tem as seguintes caracte- rísticas:

a) tem uma região de cadeia pesada compreendendo uma seqüência aminoácida selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 595-667, em que a região variá- vel de cadeia pesada tem uma mutação em uma posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação com um resíduo aminoácido de atividade aumentada.

b) tem uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência aminoá- cida selecionada a partir do grupo consistindo da SEQ ID NOs: 669-675, em que a região variável de cadeia pesada tem uma mutação em uma posição de mutagênese seletiva pre- ferida, posição de contato ou hipermutação com um resíduo aminoácido de atividade au- mentado.

Um versado na técnica apreciará que baseado na alta similaridade da seqüência aminoácida entre Joe 9 e COS-3 da seqüência linha gemninativa de cadeia pesada, e entre seqüência linha germinativa Joe 9 e DPL8 lambda, que outras mutações para as regiões CDR dessas seqüências linha germinativas podem prover anticorpos adicionais que se li- gam a IL-12 humana. Tais métodos de modificação podem ser feitos utilizando técnicas de biologia molecular padrões como descrito acima.

Consequemente, em um aspecto, a invenção retrata usa um anticorpo humano iso- lado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, que tem as seguintes características:

a)que se liga à 11-12 humana e dissocia a partir da IL-12 humana com uma taxa Koff constante de 0,1s"1 ou menos, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou que inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de proliferação blástica de fitoemaglutinina in vitro (ensaio de PHA) com um IC50 de IxIO"6 M ou menos.

b) tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência aminoá- cida linha germinativa COS-3, em que a região variável de cadeia pesada tem uma mutação na posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação com uma atividade aumentada do resíduo aminoácido.

c) tem uma região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência aminoá- cida linha germinativa DPL8, em que a região variável de cadeia leve tem uma mutação em uma posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação com uma atividade de resíduo aminoácido aumentada.

Devido a certos resíduos aminoácidos ocupando sítios chaves no CDR e regiões estruturais na região variável de cadeia leve e pesada, estruturas retratadas são conferidas nessas regiões. Em particular, as regiões CDR2 e CDR1 são pacientes para classificações estruturais canônicas. Desde que existe um alto grau de homologia das seqüências aminoá- cidas entre membros da família, essas retrata canônicas estão entre membros da família. Os versados na técnica apreciarão que modificações nos resíduos aminoácidos que confe- rem essas estruturas canônicas devem produzir anticorpos adicionais que se ligam a IL-12. As modificações podem ser feitas utilizando técnicas de biologia molecular padrão como descrito acima.

Consequentemente, em outro aspecto, a invenção retrata usam um anticorpo hu- mano isolado, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo, que tem as seguintes carac- terísticas: a)que se liga à 11-12 humana e dissocia a partir da IL-12 humana com uma taxa Koff constante de 0,1s"1 ou menos, como determinado por ressonância plásmon de superfície, ou que inibe a proliferação blástica por fitoemaglutinina em um ensaio de proliferação blástica de fitoemaglutinina in vitro (ensaio de PHA) com um IC50 de IxIO"6 M ou menos.

b) tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência ami- noácida selecionada a partir de um membro da família linha germinativa VH3, em que a re- gião variável de cadeia pesada compreende uma CDR2 que é estruturalmente similar ao CDR2s a partir dos membros da família linha germinativa VH3, e um CDR1 que é estrutu- ralmente dimilar aos CDRIs a partir dos membros da família linha germinativa, e em que a região variável da cadeia pesada tem uma mutação em uma posição em uma posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação com uma atividade au- mentada do resíduo aminoácido;

c) tem um região variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência aminoáci- da selecionada a partir de um membro da família linha germinativa VÂ1, em que a região variável de cadeia leve compreende um CDR2 que é estruturalmente similar aos CDR2s a partir de outros membros da família linha germinativa VA1, e um CDR1 que é estruturalmen- te similar aos CDRIs a partir de outros membros da família linha germinativa VA1, e em que a região variável de cadeia leve tem uma mutação posição de mutagênese seletiva preferi- da, posição de contato ou hipermutação com uma atividade de resíduo aminoácido aumen- tada.

Anticorpos humanos recombinantes utilizados na invenção têm regiões constantes e variáveis que são homólogos às seqüências de imunoglobulina da linha germinativa hu- mana selecionada a partir de uma base de dados VBASE. Mutações para os anticorpos hu- manos recombinantes (por exemplo, por mutagênese aleatória ou mutagênese PCR) resul- tam em aminoácidos que não são codificados por seqüências de imunoglobulinas de linha germinativa humana. Também, bibliotecas de anticorpos recombinantes que foram deriva- das a partir de doadores humanos conterão seqüências de anticorpos que diferem a partir de seqüências linha germinativa correspondentes devido ao processo normal de mutação somática que ocorre durante o desenvolvimento da células B. Deve ser notado que se as seqüências "linha germinativa" obtidas por amplificação por PCR codificam diferenças ami- noácidas nas regiões estrutura a partir da verdadeira configuração linha germinativa (isto é, "mutação retrógrada" dos resíduos estrutura para a configuração linha germinativa). Então, a presente invenção pode opcionalmente incluir um passo mutação retrógrada. Para fazer isso, as seqüências aminoácidas de cadeia pesada e leve codificados pela linha germinativa (como encontrado como exemplo na base de dados VBASE) são primeiro comparados às seqüências aminoácidas estrutura de cadeia pesada e leve de imunoglobulina mutada para identificar resíduos aminoácidos na seqüência estrutura da imunoglobulina mutada que dife- rem a partir de seqüências das linhas germinativas mais próximas. Então, os nucleotídeos apropriados da seqüência imunoglobulina mutada são mutadas de volta para corresponder à seqüência linha germinativa, utilizando o código genético para determinar quais mudanças de nucleotídeos devem ser feitas. Mutagênese da seqüência estrutura da imunoglulina mu- tada é realizada por métodos padrões, tais como mutagênese mediada por PCR (em que os nucleotídeos mutados são incorporados nos iniciadores PCR tal que o produto PCR contém as mutações) ou mutagêneses sítio-direcionadas. O papel de cade aminoácido identificado como candidato para mutação retrógrada deve ser investigado para um papel direto ou indi- reto na ligação de antígeno e qualquer aminoácido encontrado após mutação para afetar qualquer característica desejável do anticorpo humano deve não ser incluído no anticorpo humano final; como um exemplo, aminoácidos aumentadores de atividade identificados pela abordagem de mutagênese seletiva não será sujeita a mutação retrógrada. Ensaios para determinar as características do anticorpo resultando a partir de mutagênese podem incluir ELISA, ELISA competitivo, ensaios de neutralização in vitro e in vivo e/ou (ver, por exemplo, Exemplo 3 da Patente EUA No. 6.914.128) imunoistoquímica com seções tissulares a partir de várias fontes (incluindo humano, primata e/ou outras espécies).

Para minimizar o número de aminoácidos sujeitos à mutação retrógrada aquelas posições aminoácidas encontradas para serem diferentes da seqüência linha germinativa mais próxima mas idêntica para o aminoácido correspondente em uma segunda seqüência linha germinativa pode permanecer, provido que a seqüência linha germinativa segundo é idêntico e colinear à seqüência do anticorpo humano da invenção por pelo menos 10, prefe- rivelmente 12 aminoácidos, ou ambos os lados do aminoácido em questão. Isto pode asse- gurar que qualquer peptídeo epítopo apresentado ao sistema imune por células apresenta- doras de antígeno em um paciente tratado com o anticorpo humano da invenção não deve ser estranho mas idêntico ao auto-antígeno; isto é, a imunoglobulina codificada pela segun- da seqüência linha germinativa. Mutação retrógrada pode ocorrer em qualquer estágio de otimização de anticorpo; preferivelmente, mutação retrógrada ocorre diretamente antes ou após a abordagem de mutagênese seletiva. Mais preferivelmente, mutação retrógrada ocor- re diretamente antes da abordagem de mutagênese seletiva.

III. Modificações para Posições de Mutagêneses Seletivas Preferidas, Posições de Contato e/ou Hipermutação

Tipicamente, seleção de anticorpos com afinidades melhoradas podem ser realiza- dos utilizando métodos revelados, como descrito na seção II acima e na Patente dos EUA No. 6.914.128, incorporado aqui por referência. Este pode ser realizado por combinações de mutação aleatória de resíduos CDR e gerando grandes bibliotecas contendo anticorpos de seqüências diferentes. Entretanto, para essa seleção de métodos para trabalhar, a reação anticorpo-antígeno deve tender para o equilíbrio para permitir, ao longo do tempo, ligação preferencial de anticorpos de afinidade mais alta para o antígeno. Condições de seleção que podem permitir o equilíbrio para ser estabilizado não devem ser determinadas (presumivel- mente devido às interações não específicas entre o antígeno e partícula fago) quando os métodos que revelam fago foram utilizados para aumentar a afinidade de anticorpos anti-IL- 12 selecionados, alcançando certo nível de afinidade alcançada (isto é, aquela do anticorpo Y61). Consequentemente, anticorpos com afinidades ainda maiores não devem ser selecio- nados por métodos revelados de fago. Então, para pelo menos certos anticorpos ou antíge- nos, métodos revelados para fago são limitados em sua habilidade de selecionar anticorpos com uma especificidade/afinidade de ligação altamente aumentada. Consequentemente, um método denominado Abordagem de Mutagênese Seletiva que não requer maturação de afi- nidade revelada de fago de anticorpos, foi estabelecida para superar esta limitação e é pro- vido pela invenção. Embora esta Abordagem de Mutagênese Seletiva foi desenvolvida para superar limitações usando o sistema de revelação de fago, deve ser notado que este méto- do pode também ser utilizado com o sistema de revelação de fago. Além disso, a aborda- gem mutagênese seletiva pode ser utilizada para melhorar a atividade de qualquer anticor- po.

Para melhorar a atividade (por exemplo, afinidade ou atividade de neutralização) de um anticorpo, idealmente um pode querer mutar cada posição de CDR em ambas as cadei- as pesada e leve para cada outro resíduo aminoácido possível. Entretanto, desde que se- jam, na média, 70 posições CDR dentro de um anticorpo, tal como uma abordagem pode consumir muito tempo e trabalho intensivo. Consequentemente, o método da invenção per- mite um melhorar a atividade do anticorpo por mutar somente certos resíduos selecionados dentro dos CDRs de cadeia pesada e/ou leve. Além disso, o método da invenção permite melhoramento na atividade do anticorpo sem afetar outras propriedades desejáveis do anti- corpo.

Determinando que os resíduos aminoácidos de uma região variável de anticorpo estão em contato com um antígeno não pode ser acuradamente predita baseada na se- qüência primária ou suas posições dentro da região variável. Apesar disso, alinhamentos de seqüências a partir de anticorpos com especificidades diferentes conduziram por Kabar et al têm identificado os CDRs como regiões locais dentro de regiões variáveis que diferem signi- ficantemente entre anticorpos (Kabat et al (1971) Ann. NY Acad. Sei. 190:382-393, Kabat, E.A. et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departa- mento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH No. 91-3242). Estudos es- truturais têm mostrado que a superfície de ligação do antígeno é formada por resíduos ami- noácidos presentes nos CDRs. Outros resíduos aminoácidos fora de CDr são também co- nhecidos desempenhar papéis estruturais ou ser diretamente envolvidos na ligação de antí- geno. Assim, para cada par de antígeno-anticorpo, resíduos aminoácidos dentro e fora dos CDRs podem ser importantes.

Os estudos de alinhamento de seqüência por Tomlison et al identificaram um núme- ro de posições na cadeia pesada e leve de CDR1 e CDR2, e em uma porção da cadeia kappa CDR3 que são freqüentes em sítios de mutação somática (Tomlison et al (1996) J. Mol. Biol. 256: 813-817). Em particular, posições H31, H31B, H33, H33B, H52B, H56, H58, L30, L31, L50, L53, L91, L93 e L94 foram identificados como sítios freqüentes para mutação somática. Entretanto, esta análise exclui a importante região CDR3 da cadeia pesada, e seções do CDR3 de cadeia leve que são conhecidos por situar-se no centro de um sítio de ligação de anticorpo, e potencialmente provê interações importantes com um antígeno. Além disso, Tomlison et al propõe que a diversidade somática sozinha não necessariamente pre- diz um papel de um aminoácido específico na ligação do antígeno, e sugere resíduos ami- noácidos conservados que contactam o antígeno, e resíduos aminoácidos diversos que não contactam antígeno. Esta conclusão é ainda suportada por estudos mutacionais no papel de mutações somáticas da afinidade do anticorpo (Sharon (1990), PNAS, 87:4814-7). Dezeno- ve mutações somáticas em um anticorpo de alta afinidade anti-p-azofenilarsonato (Ars) fo- ram simultaneamente substituído com seus resíduos da linha germinativa correspondente, gerando uma versão linha germinativa do anticorpo anti-Ars que teve duzentas vezes perda de atividade. A afinidade inteira do anticorpo anti-Ars pode ser recuperada por restaurar so- mente tr6es das dezenove mutações somáticas, demonstrando que muitas mutações somá- ticas podem ser permitidas que não contribuem para atividade de ligação ao antígeno.

O resultado pode ser explicado em parte pela natureza da diversidade de anticorpo do mesmo. Células B imaturas podem produzir inicialmente anticorpos de baixa afinidade que reconhecem um número de antígenos próprios ou não próprios. Além disso, anticorpos podem ser submetidos no curso das variações de seqüência de maturação de afinidade que podem causar auto-reatividade. Hipermutação de tais anticorpos de baixa afinidade podem servir para abolir auto-reatividade ("seleção negativa") e afinidade aumentada para o antíge- no externo. Além disso, a análise de dados primários e estruturais de um grande número de anticorpos não provêem um método de predizer ou (1) o papel de sítios de hipermutação somática no processo de maturação de afinidade versus o processo de diminuição de afini- dade para antígenos não queridos, ou (2) como um dado aminoácido contribui para as pro- priedades do par de antígeno-anticorpo específico.

Outras tentativas de endereçar o papel dos resíduos aminoácidos específicos no reconhecimento do antígeno foram feitos por análise de um número de estruturas cristais dos complexos antígeno-anticorpo (MacCaIIum et al (1996) J Mol Biol 262:732-745). O papel potencial das posições localizadas dentro e fora dos CDRs foi indicado. Posições nos CDRs envolvidas na ligação do antígeno em mais que 10 a 26 estruturas analisadas incluíam H31, H33, H50, H52, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98 e H100 na cadeia pesada e L30A, L32, L91, L92, L93, L94, L96 na cadeia leve. Entretanto, os autores notaram que predição de contatos de antígenos utilizando esses e outros dados podem exceder sob posições de con- tato preditas, levando para a especulação que uma estratégia diferente pode ter que ser aplicada para diferentes antígenos.

Pini et al, descreve resíduos múltiplos aleatórios nas seqüências CDR de anticorpo em uma grande biblioteca que revela fago para rapidamente aumentar a afinidade do anti- corpo (Pini et al (1998) J Biol Chem 273:21769-21776). Entretanto, os anticorpos de alta afinidade discutidos por Pini et al tiveram mutações em um total de oito posições, e uma análise reducionária das quais mudanças são absolutamente requeridas para melhorar a afinidade do anticorpo se torna impraticável porque o grande número de possíveis combina- ções a ser testado para o menor número de aminoácidos requerido.

Alem disso, resíduos múltiplos aleatórios podem não necessariamente preservar outras propriedades desejadas do anticorpo. Propriedades desejáveis ou características de um anticorpo são reconhecidas na técnica e incluem, por exemplo, preservação de reativi- dade não cruzada, por exemplo, com outras proteínas ou tecidos humanos e preservação de seqüências anticorpos que estão perto de melhoramento de seqüências de imunoglobuli- na linha germinativa humanas de potência de neutralização. Outras propriedades desejáveis ou características incluem habilidade para preservar espécies de reatividade cruzada, habi- lidade para preservar a especificidade do epítopo e habilidade para preservar altos níveis de expressão de proteína em células mamíferas. As propriedades desejáveis ou características podem ser observadas ou medidas utilizando técnicas reconhecidas na arte incluindo, mas não limitados a ELISA, ELISA competitivo, ensaios de neutralização in vitro e in vivo (ver, por exemplo, Exemplo 3 da Patente dos EUA No. 6.914.128), imunoistoquímica com seções de tecido a partir de dontes diferentes incluindo humano, primata ou outras fontes como a necessidade podem ser, e estudos em células mamíferas utilizando expressão transiente ou expressão estável.

Em adição, o método de Pini et al pode introduzir mais mudanças que o número mínimo atualmente requer para melhorar a afinidade e pode levar aos anticorpos iniciar a formação do anticorpo anti-humano (HAMA) em pacientes humanos. Adicionalmente, como discutido em outro lugar, o fago revela como desmonstrado aqui, ou outro método relacio- nado incluindo revelação de ribossomo pode não funcionar apropriadamente sob pesquisa de certas afinidades entre anticorpo e antígeno e as condições requeridas para alcançar equilíbrio não podem ser estabelecidas em um tempo específico razoável por causa de inte- rações adicionais incluindo interações com outros componentes fago ou ribossomo e o antí- geno.

O versado na técnica pode juntar informação científica interessante na origem da diversidade do anticorpo a partir dos ensinamentos das referências discutidas acima. A pre- sente invenção, entretanto, provê um método para aumentar a afinidade do anticorpo de um par antígeno-anticorpo específico enquanto outras retrata relevantes ou características de- sejáveis do anticorpo. Isto é especificamente importante quando considerando a desejabili- dade de impedir uma massa de características diferentes em um anticorpo específico inclu- indo ligação ao antígeno.

Se o anticorpo inicial tem propriedades desejáveis ou características qe precisam ser retidos, uma abordagem de mutagênese seletiva pode ser a melhor estratégia para pre- servar essas propriedades desejáveis enquanto melhorar a atividade do anticorpo. Por e- xemplo, na mutagênese de Y61, o objetivo foi aumentar a afinidade para hIL-12, e para me- lhorar a potência da neutralização do anticorpo enquanto preservando as propriedades de- sejadas. Propriedades desejadas do Y61 incluíram (1) preservação da reatividade não cru- zada com outras proteínas ou tecidos humanos, (2) preservação da fina especificidade do epítopo, isto é, reconhecendo um epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 (p40/p35), assim prevenindo a interferência da ligação a partir do p40 solúvel livre; e (3) geração de um anticorpo com seqüências aminoácidas de cadeia pesada e leve que foram tão próximos com possível para suas respectivas seqüências de imunoglobulina linha ger- minativa.

Em uma modalidade, o método da invenção provê uma abordagem de mutagênese seletiva como uma estratégia para preservação das propriedades desejáveis ou característi- cas do anticorpo enquanto melhorar a afinidade e/ou potência de neutralização. O termo "abordagem de mutagênese seletiva" é como definido acima e inclui um método de mutar individualmente resíduos aminoácidos selecionados. Os resíduos aminoácidos a ser muta- dos podem primeiro ser selecionados a partir de posições de mutagênese seletiva preferi- das, então a partir de posição de contato, e então a partir de posições de hipermutação. A posição individual selecionada pode ser mutada em pelo menos dois resíduos aminoácidos e o efeito da mutação, ambas, as propriedades desejadas do anticorpo e o melhoramento na atividade do anticorpo são determinados.

A abordagem da Mutagênese Seletiva compreende os passos de:

Selecionar posições cadidatas na ordem de 1) posições de mutagêneses seletivas preferidas; 2) posições de contato; 3) posições de hipermutação e elegendo as posições baseadas na localização da posição dentro de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo (CDR3 preferido sob CDR2 preferido sob CDR1);

Posições de mutagênese seletiva preferidas de candidatos mutados individualmen- te, hipermutação e/ou posições de contato a fim de eleger, para todas as possibilidades ou- tros resíduos aminoácidos e analisando o efeito das mutações individuais na atividade do anticorpo a fim de determinação da atividade de resíduos aminoácidos de atividade aumen- tada;

Se necessário, fazer combinações gradativamente da atividade individual de resí- duos aminoácidos de atividade aumentada e analisar o efeito de várias combinações na atividade dos anticorpos; selecionar anticorpos mutantes com resíduos aminoácidos de ati- vidade aumentada e elegendo os anticorpos mutantes baseados na localização e identidade das substituições aminoácidas com respeito ao seu potencial imunogênico. A posição mais alta é dada para anticorpos mutantes que compreendem uma seqüência aminoácida que quase idêntico a uma seqüência de região variável que é descrita em uma base de dado linha germinativa, ou tem uma seqüência aminoácida que é comparável a outros anticorpos humanos. Posição inferior é dada para anticorpos mutantes contendo uma substituição ami- noácida que é raramente encontrada em ou seqüências linha germinativa ou seqüências de outros anticorpos humanos. A posição mais baixa é dada para anticorpos mutantes com uma substituição aminoácida que não tenha sido encontrada em uma seqüência linha ger- minativa ou a seqüência de outro anticorpo humano. Como revelado acima, anticorpos mu- tantes compreendendo pelo menos um resíduo aminoácido de atividade aumentada locali- zado em CDR3 é preferido sob CDR2 que é preferido sob CDR1. Os CDRs das regiões va- riáveis de cadeia pesada são preferidos sob aqueles da região variável de cadeia leve.

Os anticorpos mutantes podem também ser estudados para melhoria na atividade, por exemplo, quando comparado ao seu anticorpo parental correspondente. A melhoria na atividade do anticorpo mutante pode ser determinada, por exemplo, por ensaios de neutrali- zação, ou especifidade/afinidade de ligação por análise de ressonância plásmon de superfí- cie (ver Exemplo 3 da Patente dos EUA No. 6.914.128). Preferivelmente, o melhoramento na atividade pode ser pelo menos 2-20 vezes mais alto que o anticorpo parental. O melhor- mento na atividade pode ser pelo menos "x1" a "x2" vezes mais alto que o anticorpo parental em que "x1" e "x2" são números inteiros entre e incluindo 2 a 20, incluindo variações dentro do estado de variação, por exemplo, 2-15, por exemplo, 5-10.

Os anticorpos mutantes com o resíduo aminoácido de atividade aumentada tam- bém podem ser estudados para determinar se pelo menos outra propriedade desejável tem sido retida após mutação. Por exemplo, com testes de anticorpos anti-hlL-12 para, (1) pre- servação de reatividade não cruzada com outras proteínas ou tecidos humanos, (2) preser- vação do reconhecimento do epítopo, isto é, reconhecimento de um epítopo p40 preferivel- mente no contexto do heterodímero p70 (p40/035), assim prevenindo a interferência de liga- ção a partir da p40 solúvel livre; e (3) geração de anticorpos com seqüências aminoácidas de cadeia pesada e leve que estão tão próximas quando possível para suas respectivas seqüências de imunoglobulina linha germinativa, e determinando que possa ser pelo menos provável elicitar uma resposta imune humana baseada no número de diferenças a partir da seqüência linha germinativa. As mesmas observações podem ser feitas em um anticorpo tendo mais que um resíduo aminoácido de atividade aumentada, por exemplo, pelo menos dois ou pelo menos três resíduos aminoácidos de atividade aumentada, para determinar se a retenção da propriedade desejável ou característica ocorreu.

Um exemplo do uso de uma "abordagem de mutagênese seletiva", na mutagênese de Y61 é descrita abaixo. As mutações individuais H31S—>E,L50—>Y, ou L94G—>Y cada me- lhorou a atividade de neutralização do anticorpo. Entretanto, quando clones de combinação foram testados, a atividade do clone combinado H31S->E + L50—>Y + L94G—>Y não foi me- lhor que L50—>Y + L94G—>Y (J695). Assim, mudando o resíduo aminoácido linha germinati- va Ser por Glu na posição 31 do CDR1 foi desnecessário para melhorar a atividade do J695 sob Y61. A abordagem de mutagênese seletiva dessa forma identificou o número mínimo de mudanças que contribuíram para atividade final, assim reduzidno o potencial imunogênico do anticorpo final e preservando outras propriedades desejadas do anticorpo.

DNA isolado codificando a VP e VL produzido aboragem de mutagênese seleciona- da pode ser convertida em genes de cadeia de anticorpo de comprimento inteiro, para ge- nes de fragmento Fab como para um gene scFV, como descrito na seção IV. Para expres- são de regiões VH e VL produzidas pela abordagem de mutagênese selecionada, vetores de expressão codificando a cadeia pesada e leve pode ser transfectada em uma variedade de células hospedeiras como descrito em detalhes na seção IV. Células hospedeiras prefe- ridas incluem ou células hospedeiras procarióticas, por exemplo, E. coli, ou células hospe- deiras eucaróticas, por exemplo, células de levedura, por exemplo, S. cerevisae. Células eucarióticas mais preferidas são células hospedeiras mamíferas, descritos em detalhes na seção IV.

A abordagem de mutagênese seletiva provê um método de produzir anticorpos com atividades melhoradas sem maturação de afinidade anterior do anticorpo por outros meios. A abordagem de mutagênese seletiva provê um método de anticorpos de produção com afinidades melhoradas que têm sido sujeitos às mutações retrógradas. A abordagem de mu- tagênese seletiva também provê um método de melhorar a atividade de afinidade de anti- corpos maduros.

O versado na técnica reconhece que a abordagem de mutagênese seletiva pode ser utilizada nas técnicas de manipulação de anticorpo padrão conhecido na técnica. Exem- plos incluem, mas não são limitados a, anticorpos enxertados CDR1 anticorpos quiméricos, fragmentos scFv, fragmentos Fab de anticorpos de comprimento inteiro e anticorpos huma- nos a partir de fontes, por exemplo, camundongos transgênicos.

Rápida análise mutacional em larga escala de anticorpos inclui transcrição e tradu- ção in vitro utilizando tecnologia de revelação de ribossomo (ver, por exemplo, Hanes et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. 94:4937-4942; Dall Acqua et al (1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8:443-450; He et al (1997) Nucleic Acid Res 25:5132-5134), e Patente dos EUA Nos. 5.643.768 e 5.658.754 emitido para Kawasaki. A abordagem de mutagênese seletiva tam- bém provê um método de produção de anticorpos com atividades melhoradas que podem ser selecionados utilizando técnicas de revelação de ribossoma.

Nos métodos da invenção, anticorpos ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo são ainda modificados por posições individuais alteradsa nos CDRs do RVCP e/ou RVCL. Embora essas modificações possam ser feitas em anticorpos revelados por fago, o método é vantajoso em que ele pode ser feito com anticorpos que são expressos em outros tipos de sistemas hospedeiros, tal como sistemas de expressão em célula de bactéria, levedura ou mamífera. As posições individuais dentro dos CDRs selecionados para modificação são baseadas nas posições sendo uma posição de contanto e/ou hipermutação.

Posições de contanto preferidas e posições hipermutação como aqui definidos são mostrados na tabela 3 da Patente dos EUA No. 6.914.128 (ver Apêndice A da Patente dos EUA No. 6.914.128) e sua modificação de acordo com o método da invenção é descrito em detalhe no Exemplo 2 da Patente dos EUA No. 6.914.128. Posições de contato preferidas são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96. Posições de hipermutação preferidas são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 e L93. Resíduos aminoácidos mais preferidos (referidos como "posições de mutagênese sele- tivas preferidas") são ambas, posições de contato e hipermutação e são selecionadas a par- tir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L50, L91, L93, L94. Posições de contato particularmente preferidas são selecionadas a partir do grupo consistindo de L50 e L94.

Resíduos aminoácidos de atividade aumentada preferida substituem resíduos ami- noácidos localizados nas posições selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L94 e L96. Resíduos aminoácidos de ati- vidade aumentada mais preferidos substituem resíduos aminoácidos localizados nas posi- ções H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Particu- larmente, resíduos aminoácidos de atividade aumentada preferidos substituem resíduos aminoácidos localizados nas posições selecionadas a partir do grupo consistindo de L50 e L94.

Em geral, o método da invenção envolve seleção de uma posição de mutagênese seletiva particularmente preferida, posição de contato e/ou hipermutação dentro de um CDR de cadeia pesada ou leve de um anticorpo parente de interesse, ou porção Iigadora de antí- geno do mesmo, mutando aleatoriamente esta posição individual (por exemplo, por meios genéticos utilizando um oligonucleotídeo mutagênico para gerar uma "mini-biblioteca" de anticorpos modificados), ou mutando uma posição para aminoácidos desejados específicos, para identificar resíduos aminoácidos de atividade aumentada expressando, e purificar os anticorpos modificados (por exemplo, em um sistema hospedeiro que revela não fago), me- dindo a atividade dos anticorpos modificados para antígeno (por exemplo, por medir taxas Koff por análise BIAcore), repetindo esses passos para outras posições CDR1 como neces- sária, e combinando mutações individuais mostrado para ter atividade aumentada e testar se a(s) combinação(s) gera(m) um anticorpo com mesmo atividade melhor (por exemplo, afinidade ou potência de neutralização) que o anticorpo parente, ou porção Iigadora de antí- geno do mesmo.

Consequentemente, em uma modalidade, a invenção provê um método para me- lhorar a atividade de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, compreen- dendo:

a)prover um anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo;

b) selecionando a fim de 1) posição mutagênese seletiva preferida, 2) posição de contato, ou 3) posição de hipermutação dentro de uma região determinante de complemen- tariedade (CDR) para mutação, assim identificando uma posição de mutagênese seletiva preferida selecionada, posição de contato ou hipermutação;

c) mutação individual a referida posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação para pelo menos dois outros resíduos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mutados ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo;

d) avaliando a atividade do painel dos anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo, relativas ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo;

e) opcionalmente, passos repetidos a) a d) para pelo menos uma outra posição mu- tagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação;

f) combinando, no anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, mutações individuais mostrados para ter atividade melhorada, para formar combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo; e

g) avaliando a atividade da combinação dos anticorpos, ou porções Iigadoras de an- tígeno do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo; até um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada, relativo ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do memo, é obtido. Preferi- velmente, o anticorpo ou anticorpos selecionados têm uma atividade melhorada sem perda ou com retenção de pelo menos uma característica desejável ou propriedade do anticorpo parental como descrito acima. A característica desejada ou propriedade pode ser medida ou observada pelo versado na técnica utilizando técnicas reconhecidas na técnicas.

Posições de contato preferido são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96. Posições de hiper- mutação preferida são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 e L93. Posições de mutagênese seletivas mais preferi- das são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 e L94. Posições de contato particularmente preferidos são selecionados a partir do grupo consistindo de L50 e L94.

Em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a atividade de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, compreendendo:

a)provendo um anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo;

b) selecionando uma posição de mutagênese seletiva preferida, posição contato ou hipermutação dentro de uma região determinante de complementariedade (CDR) para mu- tação;

c) mutação individual referida selecionou posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação em pelo menos dois resíduos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mutados, ou porções de ligação de antígeno do mesmo;

d) avaliando a atividade do painel de anticorpos mutados, ou porções de ligação de antígeno do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mes- mo, assim identificando um resíduo aminoácido de atividade aumentada;

e) opcioanalmente, passos repetidos a) a d) para pelo menos outra posição de mu- tagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação;

f) combinando, no anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada individuais mostrando ter atividade au- mentada, para formar anticorpos, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo; e

g) avaliando a atividade da combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de an- tígeno do mesmo com dois resíduos aminoácidos com capacidade aumentada, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo; até um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, com uma atividade aumentada, relativa ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é obti- do.

Posições de contato preferidas são selecionadas a partir do grupo consistind de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96. Posições de hipermutação preferidas são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 e L93. Posições de mutagênese seletivas mais pre- feridas são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L32, L50, L91, L92, L93 e L94. Posições de contato particularmente preferi- das são selecionadas a partir do grupo consistindo de L50 e L94.

Em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a atividade de um anticorpo, ou porção lígadora de antígeno do mesmos, compreendendo:

a)prover um anticorpo parente ou porção Iigadora do mesmo; b)selecionar uma posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação dentro de uma região determinante de commplementariedade (CDR) para mutação;

c) mutação individual referida selecionou a posição de mutagênese seletiva preferi- da, posição de contato ou hipermutação para pelo menos dois resíduos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mutadas, ou porções Iigadoras de antígeno do memso;

d) avaliar a atividade do painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de an- tígeno do mesmo, relativas so anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, assim identificando um resíduo aminoácido aumentador de atividade;

e) opcionalmente, repetindo passos a) a d) por pelo menos uma outra posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação;

f) combinando, no anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, três resíduos aminoácidos de atividade aumentada individuais mostraram ter atividade au- mentada, para formar combinações de anticorpos, ou porções Iigadoras de antígenos; e

g) avaliando a atividade da combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de an- tígenos dos mesmos com dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada, relativos para o anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo;

até um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, com uma atividade aumentada, realtiva ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é obti- do.

Preferivelmente, o resíduo aminoácido de atividade aumentada substitui resíduos aminoácidos localizados em posições selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96.

Seguindo a mutagênse de posições individuais selecionadas, clones mutados po- dem ser sequenciados para identificar quais resíduos aminoácidos têm sido introduzidos na posição selecionada em cada clone. Um número pequeno de clones (por exemplo, cerca de 24) pode ser selecionado para sequenciamento, que estatisticamente devem produzir 10-15 anticorpos únicos, em bora números maiores de clones (por exemplo, maior que 60) podem ser sequenciados para garantir que anticorpos com cada substituição possível na posição selecionada são identificados.

Em uma modalidade, posições de contato e/ou hipermutação dentro das regiões CDR3 das cadeias pesada e/ou leve são primeiro selecionadas para mutagênese. Entretan- to, para anticorpos que tenham já sido maturados para afinidade in vitro por mutagênese aleatória das regiões CDR3 através da seleção que revela fago, eles podem preferivelmente primeiro selecionar posições de contato e/ou hipermutação dentro do CDR1 e CDR2 da ca- deia pesada e/ou leve. Em uma modalidade mais preferida, posições de mutagênese seletivas preferidas dentro das regiões CDR3 das cadeias pesada e/ou leve são primeiro selecionadas para mu- tagênese. Entretanto, para anticorpos que tenham já sido maturados para afinidade in vitro por mutagênese aleatória das regiões CDR3 através da seleção que revela fago, eles po- dem preferivelmente primeiro selecionar posições de mutagênese seletiva dentro do CDR1 e CDR2 da cadeia pesada e/ou leve.

Em outra modalidade preferida, a otimização de um anticorpo selecionado pela a- bordagem de mutagênese seletiva é feita seqüencialmente como segue: posições de muta- gênese seletiva preferida a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 são mutados primeiro em pelo menos 2 outros aminoácidos cada (preferivelmente 5-14 outros aminoácidos) e os anticorpos resul- tantes são caracterizados para afinidade aumentada, potência de neutralização (e possivel- mente também por pelo menos outra característica retida ou propriedade discutida em outro lugar). Se uma mutação de uma posição de mutagênese seletiva preferida única não au- menta a afinidade ou potência de neutralização em todos ou suficientemente e se mesmo a combinação de múltiplos aminoácidos de atividade aumentada substituindo aminoácidos nas posições de mutagênese seletivas preferidas não resulta em uma combinação de anti- corpo que encontra a atividade alvo (incluindo afinidade e/ou potências de neutralização), resíduos aminoácidos adicionais serão selecionados para mutagênese seletiva a partir do grupo consistindo de H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A e L96 são mutados para pelo menos outros aminoácidos cada (preferivelmente 5-14 outros aminoácidos) e os anticorpos resultantes são caracterizados para afinidade aumentada, potência de neutraliza- ção (e possivelmente também para pelo menos outra característica retida ou propriedade discutida em outro lugar).

Se a mutação de um resíduo aminoácido único selecionado a partir do grupo con- sistindo de H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A e L96 não aumenta a atividade (incluindo afinidade e/ou potências de neutralização) total ou não suficientemente e se mesmo a combinação de aminoácidos de atividade aumentada múltipla substituindo amino- ácidos naquelas posições não resulta em um anticorpo de combinação que encontra a ativi- dade alvo (incluindo afinidade e/ou potência de neutralização do alvo), resíduos aminoáci- dos adicionais serão selecionados para mutagênese seletiva a partir do grupo consistindo de H33B, H52B, L31A e são mutados em pelo menos 2 outros aminoácidos cada (preferi- velmente 5-14 outros aminoácidos) e os anticorpos resultantes são caracterizados para afi- nidade aumentada, potência de neutralização (e possivelmente também para pelo menos uma outra característica retida ou propriedade discutida em outro lugar).

Deve ser entendido que a abordagem de mutagênese seletiva seqüencial pode terminar em quaisquer dos passos ressaltados acima tão logo o anticorpo com a atividade desejada (incluindo afinidade e potência de neutralização) tenha sido identificado. Se muta- gênese das posições pré-selecionadas tece resíduos aminoácidos de atividade aumentada identificados, mas a combinação de anticorpo ainda não encontra o alvo selecionado para atividade (incluindo afinidade e potência de neutralização) e/ou se aminoácidos de atividade aumentada identificados também afetam outras características desejadas e são assim não aceitáveis, os resíduos CDR remanescentes podem ser sujeitadas à mutagênese (ver seção IV).

O método da invenção pode ser utilizado para aumentar a atividade de um anticor- po, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, para alcançar uma atividade alvo pre- determinada (por exemplo, uma afinidade pré-determinada e/ou potência de neutralização, e/ou uma propriedade desejada ou característica).

Consequentemente, a invenção provê um método de melhorar a atividade de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, para ater uma atividade alvo pré- determinada, compreendendo:

a)prover um anticorpo parente, uma porção Iigadora de antígeno do mesmo;

b) selecionar uma posição de mutagênese seletiva preferida selecionada a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L50, L91, L92, L93, L94;

c) mutação individual da posição de mutagênese seletiva preferida selecionada pa- ra pelo menos dois outros resíduos aminoácidos para assim criar um primeiro painel de anti- corpos mutados, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo;

d) avaliar a atividade do primeiro painel de anticorpos mutados, ou porções Iigado- ras de antígeno do mesmo para determinar se a mutação de uma posição de mutagênese seletiva única produz um anticorpo ou porção Iigadora de antígeno do mesmo com a ativi- dade alvo pré-determinada ou uma atividade alvo parcial;

e) combinando em uma maneira gradativa, no anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, mutações individuais mostraram ter atividade melhorada, para for- mar combinações de anticorpos, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo.

f) avaliar a atividade da combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de antíge- no do mesmo, para determinar se a combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de an- tígeno dos mesmos têm a atividade alvo pré-determinada ou atividada alvo parcial.

g) se passos d) ou f) não resultarem em um anticorpo ou porção Iigadora de antíge- no do mesmo tendo a atividade algo pré-determinada, ou resulta em anticorpo com somente uma atividade parcial, resíduos aminoácidos adicionais selecionados a partir do grupo con- sistindo de H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A e L96 são mutados para pelo menos dois outros resíduos aminoácidos assim criando um segundo painel de anticorpos mutados ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo; h) avaliar a atividade do segundo painel de anticorpos mutados ou porções Iigado- ras de antígeno dos mesmos, para determinar se mutação de um resíduo aminoácido único selecionado a partir do grupo consistindo de H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A e L96 resulta em um anticorpo ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, tendo uma atividade alvo pré-determinada ou atividade parcial;

i) combinando de forma gradativamente no anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno dom esmo, mutações individuais do passo g) mostraram ter uma atividade aumen- tada, para formar combinações de anticorpos, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo;

j) avaliar a atividade da combinação de anticorpos ou porções Iigadoras de antígeno dos mesmos, para determinar se a combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de antí- geno do mesmo têm a atividade alvo pré-determinada ou uma atividade alvo parcial;

k) se passos h) ou j) não resultaram em um anticorpo ou porção Iigadora de antíge- no do mesmo tendo a atividade alvo pré-determinada, ou resultar em um anticorpo com so- mente uma atividade parcial, resíduos aminoácidos adicionais selecionadas a partir do gru- po consistindo de H33B, H52B e L31A são mutados para pelo menos dois outros resíduos aminoácidos assim criando um terceiro painel de anticorpos mutados ou porções Iigadoras de antígeno dos mesmos;

I) avaliar a atividade do terceiro painel de anticorpos mutados ou porções de ligação de antígeno do mesmo, para determinar se uma mutação de um resíduo aminoácido único selecionado a partir do grupo consistindo de H33B, H52B e L31A resultado em um anticorpo ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, tendo a atividade alvo pré-determinada ou ativi- dade parcial;

m) combinando em uma maneira gradativa no anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, mutação individual do passo k) mostrou ter uma atividade aumenta- da, para formar combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de antígeno do memo;

n) avaliar a atividade da combinação dos anticorpos ou porções Iigadoras de antí- geno do mesmo, para determinar se a combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo te, a atividade alvo pré-determinada para assm produzir um anticorpo ou porção Iigadora de antígeno com uma atividade alvo pré-determinada.

Um número de métodos de mutagênese pode ser utilizado, incluindo a união PCR, Kunkel (dut-ung-) e mutagênese direcionada a oligonucleotídeo tiofosfato (kit Amersham Sculptor).

Uma grande variedade de sistemas de expressão hospedeiros pode ser utilizada para expressar anticorpos mutados, incluindo sistemas de expressão bacterianos, levedura, baculoviral e mamífero (bem como sistemas de expressão que revela fago). Um exemplo de um vetor de expressão bacteriano adequado é pUC110(Sfi). Outros sistemas de expressão de anticorpo são conhecidos na técnica e/ou são descritos abaixo na seção IV. Os anticorpos modificados, ou porções Iigadoras de antígeno dos mesmos, produ- zidos pelo método da invenção podem ser identificados sem a confiança nos métodos que revelam fago para seleção. Consequentemente, o método da invenção é particularmente vantajoso para melhorar a atividade de um anticorpo parente recombinante ou porção Iiga- dora de antígeno do mesmo, que foi obtida por seleção em um sistemaque revela fago, mas cuja atividade não pode ainda melhorar por mutagênese no sistema que revela fago.

Consequentemente, em outra modalidade, a invenção provê um método para me- lhorar a afinidade de um anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, compreen- dendo:

a)prover um anticorpo parente recombinante ou porção ligadora de antígeno do mesmo; que foi obtido por seleção em um sistema que revela fago mas cuja atividade não pode ser ainda melhorada por mutagênese no referido sistema que revela fago;

b) selecionar uma posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação dentro de uma região de determinação de complementariedade (CDR) para mutação, assim identificando um contato selecionado ou posição de hipermutação;

c) mutação individual referida selecionada da posição de mutagênese seletiva pre- ferida, posição de contato ou hipermutação para pelo menos dois resíduos aminoácidos pa- ra assim criar um painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo, e expressando o referido painel em um sistema que revela não fago;

d) avaliar a atividade do painel de anticorpos mutados, ou porções ligadoras de an- tígenos do mesmo, relativo para anticorpo parente ou porção ligadora ao antígeno do mes- mo;

e) opcionalmente repetindo passos b) a d) por pelo menos outra posição de muta- gênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação;

f) combinar, no anticorpo parente, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, muta- ções individuais mostradas terem atividade melhorada, para formar combinação de anticor- por, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo; e

g) avaliar a atividade da combinação de anticorpos, ou porções ligadoras de antí- geno, relativa ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo; até um anti- corpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, com uma atividade aumentada, relativa ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é obtido.

Posições de contato preferidas são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96. Posições de hipermutação preferidas são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 e L93. Posições de mutagênese seletiva mais pre- feridas são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, Η56, Η58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 e L94. Posições de contato particularmente preferidas são selecionadas a partir do grupo consistindo de L50 e L94.

Com métodos disponíveis não é possível ou é extremamente trabalhoso derivar um anticorpo com afinidade Iigadora aumentada e potência de neutralização enquanto retém outras propriedades ou características dos anticorpos como discutido acima. O método des- ta invenção, entretanto, pode facilmente identificar tais anticorpos. Os anticorpos sujeitos ao método desta invenção podem vir de qualquer fonte.

Assim, em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a ativida- de de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, compreendendo:

a)prover um anticorpo parente recombinante ou porção Iigadora de antígeno do mesmo;

b) selecionar uma posição mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hi- permutação dentro de uma região determinando de complementariedade (CDR) para muta- ção, assim identificando uma posição de mutagênese seletiva preferida selecionada, posi- ção de contato ou hipermutação;

c) mutação individual referida selecionou posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação para pelo menos dois outros resíduos aminoácidos pa- ra assim criar um painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígeno do mes- mo e expressando o referido painel em um sistema de expressão apropriado;

d) avaliar a atividade do painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de an- tígenos do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, assim identificando um resíduo aminoácido de atividade aumentada;

e) avaliar o painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo, relativos ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo para pelo menos outra propriedade ou características, em que a propriedade ou característica é uma que precisa ser retida no anticorpo;

até um anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada e pelo menos uma propriedade retida ou característica, relativa ao anticorpo pa- rente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é obtido.

Em uma modalidade preferida, as posições de contato são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96 e outra característica é selecionada a patir de 1) preservação da não reatividade cru- zada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconheci- mento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anti- corpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa. Em outra modalidade preferida, as posições de hipermutação são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 e L93 e outra característica é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cru- zada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconheci- mento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anti- corpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

Em uma modalidade mais preferida os resíduos para mutagênese são selecionados a patir das posições de mutagênese seletivas preferidas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 e outra característica é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cruzada com ou- tras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconhecimento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 pre- venindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anticorpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

Em uma modalidade mais preferida, as posições de contato são selecionadas a partir do grupo consistindo de L50 e L94 e outra característica é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cruzada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) pre- servação do epítopo de reconhecimento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anticorpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

Se dessa forma, a afinidade de um anticorpo para um antígeno específico deve ser melhorada, mas onde a método revela o fago (ou sistema relacionado incluindo revelação de ribossomo) não é mais aplicável, e outras propriedades desejáveis ou características podem ser retidas, o método da invenção pode ser utilizado. Consequentemente, em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a atividade de um anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, compreendendo:

a) provendo um anticorpo parente recombinante ou porção Iigadora de antígeno domesmo; que foi obtido em um sistema que revela fago mas cuja atividade não pode ser ainda melhorada por mutagênese no referido sistema que revela fago;

e) avaliar o painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo, relativos ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo para pelo menos outra propriedade ou características, em que a propriedade ou característica é uma que precisa ser retida, até um anticorpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada e pelo menos uma propriedade retida ou característica, relativa ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, ser obtida.

f) opcionalmente, repetir passos a) a e) por pelo menos uma outra posição de mu- tagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação;

g) combinando, no anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, pelo menos dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada individual mostrando ter atividade aumentada e pelo menos uma propriedade retida ou característica, para formar combinação de anticorpos, ou porções de ligação de antígeno do mesmo; e

h) avaliar a atividade da combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de antí- geno do mesmo, relativa ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo; até um anticorpo ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada e pelo menos uma retida outra propriedade ou característica, relativa ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, seja obtida.

Em uma modalidade preferida, as posições de contato são selecionados a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96 outra característica é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cru- zada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconheci- mento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anti- corpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

Em outra modalidade preferida, as posições de hipermutação são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53, e L93 e a outra característica é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cru- zada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconheci- mento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anti- corpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa. Em uma modalidade mais preferida os resíduos para mutagênese seletiva são se- lecionados a partir de posições de mutagênese preferidas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 e a outra ca- racterística é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cruzada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconhecimento, isto é, reco- nhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenin- do a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anticorpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

Em uma modalidade mais preferida, as posições de contato são selecionadas a partir do grupo consistindo de L50 e L94 e a outra característica é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cruzada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) pre- servação do epítopo de reconhecimento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anticorpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

a) provendo um anticorpo parente recombinante ou porção ligadora de antígeno do mesmo; que foi obtido em um sistema que revela fago mas cuja atividade não pode ser ain- da melhorada por mutagênese no referido sistema que revela fago;

c) mutação individual referida selecionou posição de mutagênese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação para pelo menos dois outros resíduos aminoácidos pa- ra assim criar um painel de anticorpos mutados, ou porções ligadoras de antígeno do mes- mo e expressando o referido painel em um sistema de expressão apropriado;

d) avaliar a atividade do painel de anticorpos mutados, ou porções ligadoras de an- tígenos do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo, assim identificando um resíduo aminoácido de atividade aumentada;

e) avaliar o painel de anticorpos mutados, ou porções ligadoras de antígenos do mesmo, relativos ao anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo para pelo menos outra propriedade ou características, em que a propriedade ou característica é uma que precisa ser retida, até um anticorpo, ou porção ligadora do antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada e pelo menos uma propriedade retida ou característica, relativa ao anticorpo parente, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, ser obtida. Em uma modalidade preferida, as posições de contato são selecionados a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96 outra característica é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cru- zada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconheci- mento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anti- corpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

Em outra modalidade preferida, as posições de hipermutação são selecionadas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53, e L93 e a outra característica é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cru- zada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconheci- mento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anti- corpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

Em uma modalidade mais preferida os resíduos para mutagênese seletiva são se- lecionados a partir de posições de mutagênese preferidas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 e a ou- tra característica é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cruzada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconhecimento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 pre- venindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anticorpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

a)provendo um anticorpo parente recombinante ou porção Iigadora de antígeno do mesmo; que foi obtido em um sistema que revela fago mas cuja atividade não pode ser ain- da melhorada por mutagênese no referido sistema que revela fago;

f) opcionalmente, repetir passos a) a e) por pelo menos outra posição de mutagê- nese seletiva preferida, posição de contato ou hipermutação;

Em uma modalidade mais preferida os resíduos para mutagênese seletiva são se- lecionados a partir de posições de mutagênese preferidas a partir do grupo consistindo de H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 e a outra ca- racterística é selecionada a partir de 1) preservação da não reatividade cruzada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconhecimento, isto é, reco- nhecendo epítopo p40 preferivelmente no contexto do heterodímero p70 p40/p35 prevenin- do a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anticorpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germinativa.

IV. Modificações de outros resíduos CDR

Ultimamente, todos os resíduos CDR no dado par antígeno-anticorpo identificado por qualquer meio ser requerido como resíduo aminoácido de atividade aumentada e/ou requerido diretamente ou indiretamente par aligar ao antígeno e/ou reter outras proprieda- des desejáveis ou características do anticorpo. Tais resíduos CDR são referidos como "po- sições de mutagênese seletivas preferidas". Deve ser notado que em cirscuntâncias especí- ficas que resíduos de mutagênese seletiva preferidos podem ser identificados também por outros meios incluindo co-cristalização do anticorpo e antígeno e modelagem molecular.

Se as tentativas preferidas para identificar aminoácidos de atividade aumentada fo- cando nas posições de mutagênese seletiva preferida, posições de contato ou hipermutação descritas acima são exaustos, ou se melhoramentos adicionais são requeridos, os resíduos CDR remanescentes podem ser modificados como descrito abaixo. Deve ser entendido que o anticorpo deve já estar modificado em qualquer uma ou mais posições de hipermutação de acordo com as modalidades discutidas acima mas podem requerer melhoramentos adi- cionais. Assim, em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a ativida- de de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, compreendendo:

a) prover um anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo;

b) selecionar um resíduo aminoácido dentro de uma região determinante de com- plementariedade (CDR) para mutação outro que H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96;

c) mutação individual referida selecionou posição, por exemplo, para pelo menos dois outros resíduos aminoácidos para assim criar um anticorpo mutado ou um painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo;

d) avaliar a atividade do painel de anticorpos mutados, ou o painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, assim identificando um resíduo aminoácido de ativi- dade aumentada;

e) avaliar o anticorpo mutado ou o painel de anticorpos mutados, ou porções Iigado- ras de antígenos do mesmo, relativos ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo para mudanças em pelo menos outra propriedade ou características até um anti- corpo, ou porção Iigadora do antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada relativa ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, ser obtida.

Preferivelmente, a outra característica ou propriedade é selecionada de 1) preser- vação da não reatividade cruzada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconhecimento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contex- to do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anticorpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germina- tiva.

Se mutagênese de um resíduo único não é suficiente, outros resíduos podem ser inclusos; assim, em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a ativi- dade de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno, compreendendo:

a)prover um anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo; b) selecionar um resíduo aminoácido dentro de uma região determinante de com- plementariedade (CDR) para mutação outro que H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96;

c) mutação individual referida selecionou posição, por exemplo, para pelo menos dois outros resíduos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mutados, ou por- ções Iigadoras de antígeno do mesmo;

e) repetindo passos b) a d) por pelo menos uma outra posição CDR que é nem a posição selecionada sob b) nem a posição a H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, Η52Α, Η53, Η54, Η56, Η58, Η95, Η96, Η97, Η98, Η101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96;

f) combinando, em anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, pelo menos dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada individual mostrando ter atividade melhorada, para formar combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de antí- geno; e

g) avaliar a atividade da combinação dos anticorpos, ou porções Iigadoras de antí- geno do mesmo com dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada, realtivo ao anti- corpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo até um anticorpo, ou porção liga- dora de antígeno do mesmo, com uma atividade aumentada, relativa ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, seja obtido.

Se tentativas preferidas para identificar a atividade de aminoácidos de atividade aumentada focando nas posições de contato ou hipermutação descrito acima são exaustos, ou se melhoramentos adicionais são requeridos, e o anticorpo em questão pode não mais ser otimizado por mutagênese e métodos que revelam o fago (ou relacionados a revelação de ribossomo) a permanência de resíduos CDR pode ser modificada como descrito abaixo. Deve ser entendido que o anticorpo pode já ser modificado em qualquer uma ou mais posi- ções de mutagênese seletiva preferida, posições de contato ou hipermutação de acordo com as modalidades discutidas acima, mas podem requer melhoramentos adicionais.

Assim em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a ativida- de de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, compreendendo:

a)provendo um anticorpo parente recombinante ou porção Iigadora de antígeno do mesmo; que foi obtido por seleção em um sistema que revela fago mas aquela atividade não pode ser ainda melhorada por mutagênese no referido sistema de revelação de fago;

b) selecionar um resíduo aminoácido dentro de uma região determinante de com- plementariedade (CDR) para mutação outro que H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e;

c) mutação individual referida selecionou posição de contanto ou hipermutação para pelo menos dois outros resíduos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mu- tados, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo, e expressando o referido painel em um sistema de revelação não fago;

d) avaliar a atividade do painel de anticorpos mutados, ou porções ligadoras de an- tígenos do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, assim identificando um resíduo aminoácido de atividade aumentada;

e) avaliando o painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, para mu- danças em pelo menos uma outra propriedade ou característica, até um anticorpo, ou por- ção ligadora de antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada, relativa ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, seja obtido.

Se uma mutagênese única não é suficiente para aumentar a afinidade do anticorpo outros resíduos podem ser inclusos na mutagênese. Assim, em outra modalidade, a inven- ção provê um método para aumentar a atividade de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, compreendendo:

a)provendo um anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo; que foi obtido por seleção em um sistema que revela fago mas aquela atividade não pode ser ainda melhorada por mutagênese no referido sistema de revelação de fago;

c) mutação individual referida selecionou posição para pelo menos dois outros resí- duos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo, e expressando o referido painel em um sistema de revelação não fago;

d) avaliar a atividade do painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de an- tígenos do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo, assim identificando um resíduo aminoácido de atividade aumentada;

e) repetindo passos b) a d) por pelo menos uma ou outra posição não é nem a po- sição selecionada sob b) nem uma posição a H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94;

g) combinando, no anticorpo parente, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, pelo menos dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada individual mostrou ter ativi- dade melhorada, formar combinação de anticorpos, ou porções ligadoras de antígeno do mesmo; e

h) avaliar a atividade e outra propriedade ou característica da combinação de anti- corpos, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo com dois resíduos aminoácidos de ati- vidade aumentada, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de anticorpo do mesmo; até um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada, relativo ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, seja obtido.

A tentativa preferida de identificar aminoácidos de atividade aumentada focando nas posições de mutagênese seletiva preferida, posições de contato ou hipermutação des- crita pode ser exausta, ou melhoramentos adicionais podem ser requeridos, e eles são im- portantes para reter outras propriedades ou características do anticorpo.

Assim, em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a ativida- de de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, sem afetar outras caracte- rísticas, compreendendo:

a)prover um anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo;

b) selecionar um resíduo aminoácido dentro de uma região determinante de com- plementariedade (CDR) para mutação outro que H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, Η95.Ή96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96;

c) mutação individual referida selecionou posição para pelo menos dois outros resí- duos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo;

e) avaliando o painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, para mu- danças em pelo menos uma outra propriedade ou característica, até um anticorpo, ou por- ção Iigadora de antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada, relativa ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, seja obtido.

Se mutagênese de um resíduo único não é suficiente, outros resíduos podem ser inclusos; assim, em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a ativi- dade de um anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, compreendendo:

a)prover um anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo;

c) mutação individual referida selecionou posição para pelo menos dois outros resí- duos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mutados, ou porções ligadoras de antígeno do mesmo;

e) avaliando o painel de anticorpos mutados, ou porções ligadoras de antígenos do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo, para mu- danças em pelo menos uma outra característica ou propriedade;

e) repetindo passos b) a e) por pelo m enos uma outra posição CDR que não é a posição selecionada sob b) nem uma posição a H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96;

f) combinando, no anticorpo parente, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, pelo menos dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada mostrou ter atividade mel- hroada e não afeta pelo menos um outra propriedade ou característica, para formar a com- binação de anticorpos, ou porções ligadoras de antígeno; e

g) avaliando a atividade e a retenção de pelom enos uma outra propriedade ou ca- racterística da combinação de anticorpos, ou porções ligadoras de antígenos do mesmo com dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada, relativo ao anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo até um anticorpo, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada e pelo menos um reteve outra propriedade ou carac- terística, relativa ao anticorpo parente, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, ser obti- do.

Mutagênese da posição de mutagênese seletiva preferida, resíduos de contato e hipermutação podem não ter aumentado a afinidade do anticorpo suficientemente, e muta- gênese e o método que revela fago (ou relacionado ao método que revela o ribossomo) po- de não mais ser útil e pelo menos uma outra característica ou propriedade do anticorpo deve ser retida.

Assim em outra modalidade a invenção provê um método para melhorar a afinidade de um anticorpo ou porção ligadora de antígeno do mesmo, compreendendo:

a) prover um anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo que foi obtido por seleção em um sistema que revela fago mas cuja atividade não pode ser acidi- cionalmente melhorado por mutagênese no referido sistema que revela fago;

c) mutação individual referida selecionou posição para pelo menos dois outros resí- duos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mutados, ou porções ligadoras de antígeno do mesmo e expressão em um sistema que revela não fago;

e) avaliando o painel de anticorpos mutados, ou porções ligadoras de antígenos do mesmo, relativo ao anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo, para mu- danças em pelo menos outra propriedade ou característicaaté um anticorpo, ou porção liga- dora de antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada, relativa ao anticorpo parente, ou porção ligadora de antígeno, ser obtido.

Preferivelmente1 a outra característica ou propriedade é selecionada de 1) preser- vação da não reatividade cruzada com outras proteínas ou tecidos humanos, 2) preservação do epítopo de reconhecimento, isto é, reconhecendo epítopo p40 preferivelmente no contex- to do heterodímero p70 p40/p35 prevenindo a interferência de ligação da p40 livre solúvel e/ou 3) produzir um anticorpo com uma seqüência próxima à imunoglobulina linha germina- tiva.

Se mutagênese de um resíduo único não é suficiente, outros resíduos podem ser inclusos; assim, em outra modalidade, a invenção provê um método para melhorar a ativi- dade de um anticorpo, ou porção ligadora de antígeno, compreendendo:

a)prover um anticorpo parente ou porção ligadora de antígeno do mesmo que foi obtido por seleção em um sistema que revela fago mas cuja atividade não pode ser acidi- cionalmente melhorado por mutagênese no referido sistema que revela fago;

b) selecionar um resíduo aminoácido dentro de uma região determinante de com- plementariedade (CDR) para mutação outro que H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96; c) mutação individual referida selecionou posição para pelo menos dois outros resí- duos aminoácidos para assim criar um painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo e expressão em um sistema que revela não fago;

d) avaliar a atividade e retenção de pelo menos uma outra propriedade ou caracte- rísticas do painel de anticorpos mutados, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo, re- lativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, assim identificando um resíduo aminoácido de atividade aumentada;

e) repetindo passos b) a d) por pelo menos uma outra posição CDR que não é a posição selecionada sob b) nem uma posição a H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 e L96;

f) combinando, no anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, pelo menos dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada mostrou ter atividade melho- rada e não afeta pelo menos um outra propriedade ou característica, para formar a combi- nação de anticorpos, ou porções Iigadoras de antígeno; e

g) avaliando a atividade e a retenção de pelo menos uma outra propriedade ou ca- racterística da combinação de anticorpos, ou porções Iigadoras de antígenos do mesmo com dois resíduos aminoácidos de atividade aumentada, relativo ao anticorpo parente ou porção Iigadora de antígeno do mesmo até um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, com uma atividade melhorada e pelo menos um reteve outra propriedade ou carac- terística, relativa ao anticorpo parente, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, ser obti- do.

V. Expressão de Anticorpos

Um anticorpo, ou porção do anticorpo, da invenção pode ser preparado por expres- são recombinante de genes de cadeia leve e pesada da imunoglobulina em uma células hospedeira. Para expressar um anticorpo recombinantemente, uma célula hospedeira é transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinante carreando fragmentos de DNA codificando as cadeias leves e pesadas da imunoglobulina do anticorpo tal que as ca- deias leve e pesada são expressas na célula hospedeira e, preferivelmente, secretado no meio em que as células hospedeiras são cultivadas, a partir de tal meio os anticorpos po- dem ser recuperados. Metodologias de DNA recombinante padrão são utilizadas para obter genes de cadeia pesada e leve de anticorpo, incorporando esses genes em vetore de ex- pressão recombinante e introduzindo os vetores em células hospedeiras, tal como aquelas descritas em Sambrook, Fritsch e Maniatis (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, Nl (1989), Ausubel, F. M. et al (eds) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1989) e na Patente dos EUA No. 4.816.397 por Boss et al. Para obter um fragmento de DNA codificando a região variável de cadeia pesada do Joe 9 wt ou um anticorpo relacionado a Joe 9 wt, anticorpos específicos para IL-12 hu- mano foram selecionados partir de bibliotecas humanas e mutadas, como descrito na seção II. Uma vez que fragmentos de DNA codificando Joe 9 wt ou segmentos VP e VL relaciona- do a Joe 9 wt são obtidos, mutagênese dessas seqüências é realizada por métodos pa- drões, tal como mutagênese direcionada para o sítio PCR (mutagênese mediada por PCR em que os nucleotídeos mutados são incorporados nos iniciadores PCR tal que o produto PCR contém as mutações) ou métodos de mutagênese direcionada para o sítio. Anticorpos IL-12 humanos que revelam um nível de atividade e especifidade/efinidade de ligação que foi desejável, por exemplo, J695, foram ainda manipulados por técnicas de DNA recombi- nantes padrão, por exemplo, para converter os genes da região variável para genes de ca- deia de anticorpo de comprimento inteiro, para genes de fragmento de Fab ou para um gene scFv. Nessas manipulações, o fragmento de DNA codificando VL e VP é operativamente ligado a outro fragmento de DNA codificando outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um Iigador flexível. O termo "ligado operativamente", como utilizado neste contexto, é tencionado significar que dois fragmentos de DNA são unidos tal que as seqüên- cias aminoácida codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem estruturados.

O DNA isolado codificando a região VP pode ser convertido para um gene de ca- deia pesada de comprimenro inteiro por operativamente ligar o DNA codificando a VP à ou- tra molécula de DNA codificando regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As seqüências dos genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E.A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH, No. 91-3242) e fragmentos de DNA compreendendo essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD e qualquer variante alotípica da mesma como descrito em Kabat (Kabat, E.A. et al (1991), Sequences of Proteins of Immu- nological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH, No. 91-3242), mas mais preferivelmente é uma região constante de IgGI ou lgG4. Para um gene de cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA codificando VP pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA codificando somente a região constante de CH1 de cadeia pesada.

O DNA isolado codificando a região VL pode ser convertida a um gene de cadeia leve de comprimento inteiro (bem como um gene de cadeia leve Fab) por operativamente ligando o DNA codificando VL para outra molécula DNA codificando a região constante de cadeia leve, CL. As seqüências de genes de região constante de cadeia leve humana são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E.A., et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest1 Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH1 No. 91-3242) e fragmentos DNA compreendendo essas regiões po- dem ser obtidas por amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda, mas mais preferivelmente é uma região cons- tante lambda.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA codificando VP e VL são operati- vamente ligados a outro fragmento codificando um Iigador flexível, por exemplo, codificando a seqüência aminoácida (Gly4-Ser)3, tal que as seqüências VP e VL podem ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VP juntas por um Iigador flexível (ver, por exemplo, Bird et al (1988) Science 242: 423-426; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85:5879-5883; McCafferty et al, Nature (1990) 348:552-554).

Para expressar os anticorpos, ou porções de anticorpos da invenção, DNAs codifi- cando cadeias leves ou pesadas de comprimento inteiro ou parcial, obtidos como descrito acima, são inseridos em vetores de expressão tal que os genes são operativamente ligados às seqüências transcricional e traducional. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" é tencionado significar que um gene de anticorpo está ligado em um vetor tal que seqüên- cias de controle de transcrição e tradução dentro do vetor serve sua função tencionada de regular a transcrição e tradução do gene do anticorpo. O vetor de expressão e seqüências controle de expressão são escolhidos serem compatíveis com a expressão da célula hospe- deira utilizada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos no vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementar no fragmento do gene do anticorpo e vetor, ou ligação a extremidade cega se nenhuma restrição está pre- sentes). Antes da inserção das seqüências de cadeia leve e pesado J695 ou relacionado a J695, o vetor de expressão podem já carrear seqüências da região constante. Por exemplo, uma abordagem converte seqüências Vp e VL de J695 ou relacionado ao J695 para genes do anticorpo de comprimento inteiro é para inserir os mesmos nos vetores de expressão já codificando as regiões constantes de cadeia pesada e de cadeia leve, respectivamente, tal que o segmento VP é operativamente ligado ao(s) segmento(s) CP dentro do vetor e o seg- mento VL é operativamente ligado ao(s) segmento (s) CP dentro do vetor e o segmento VL é operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativa- mente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um sinal peptídeo que facilita a secreção da cadeia do anticorpo a partir de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo sinal está ligado pela estrutura ao amino terminal do gene da cadeia do anticorpo. O sinal peptídico pode ser um peptídeo sinal da imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal a partir de uma proteína não imunoglobulina).

Em adição aos genes de cadeia do anticorpo, os vetores de expressão recombinan- te da invenção carreiam as seqüências regulatórias que controlam a expressão dos genes da cadeia do anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "seqüência regulatória" é tencio- nado incluir promotores, aumentadores e outros elementos que controlam a expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia do anticorpo. Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, São Diego, CA (1990). Será apreciado pelos versados na técnica que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção das seqüências regulatórias pode depender de tais fatores como a esco- lha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada etc. Seqüências regulatórias preferidas para expressão na célula hospedeira mamífera incluem elementos virais que direcionam altos níveis da expressão proteíca em células mamíferas, tais como promotores e/ou aumentadores derivados de citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/aumentador CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como o promotor/aumentador SV40), adenovírus (por exemplo, promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polio- ma. Para descrição adicional dos elementos regulatórios virais, e seqüências dos mesmos, ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 5.168.062 por Stinski. Patente dos EUA No. 4.510.245 por Bell et al, e Patente dos EUA No. 4.968.615 por Schaffner et al, Patente dos EUA No. 5.464.758 por Bujard et al, e Patente dos EUA No. 5.654.168 por Bujard et al.

Em adição aos genes de cadeia do anticorpo e seqüências regulatórias, os vetores de expressão recombinante da invenção podem carrear seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam replicação do vetor em células do hospeira (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção das células hospedeiras em que o vetor tem sido introduzido (ver, por exemplo, Pa- tentes dos EUA Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todos por Axel et al). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência às drogas, tal como G418, higromicina ou metrotrexato, em uma célula hospedeira em que o vetor tem sido introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene diidrofolato reductase (DHFR) (para uso nas células hospedeiras dhfr- com seleção/amplificação com metotrexato) e o ge- ne neo (para seleção G418). Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(s) de expressão(s) codifican- do as cadeias pesada e leve é transfectado em uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" são tencionadas compreender uma grande varie- dade de técnicas comumente utilizadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospdeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação cálcio- fosfato, transfecção DEAD-dextrano e semelhantes. Embora é teoricamente possível ex- pressar os anticorpos da invenção em ou células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, expressão de anticorpos em células eucarióticas, e mais preferivelmente células hospedei- ras mamíferas, é mais preferida porque tais células eucarióticas, e em particular células mamíferas, é mais provável que as células procarióticas para unir e secretar um anticorpo dobrado propriamente e imunologicamente ativo. Células hospedeiras mamíferas preferidas por expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descrito em Urlaub e Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 77:4216-4220), utilizado com um marcador selecionábel DHFR, por exem- plo, como descrito em R.J. Kaufman e P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Quando vetores de expressão recombinante são produzidos pela cultura das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secre- ção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são crescidas. Anticor- pos podem ser recuperados a partir de meio de cultura utilizando métodos de purificação da proteína padrão.

Células hospedeiras podem também ser utilizadas para produzir porções de anti- corpos intactos, tais como fragmentos Fab ou moléculas scFv. Será entendido que varia- ções no procedimento acima estão dentro do objetivo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificando ou a cadeia leve ou a cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo desta invenção. Tecnologia de DNA recombinante pode também ser utilizada para remover algumou todo DNA codificando uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não é necessária para ligar a hlL-12. As moléculas expressas a patir de tais moléculas de DNA truncado são também compreendidas pelos anticorpos da invenção. Em adição, anticorpos bifuncionais podem ser produzidos em que uma cadeia pesada e uma leve são um anticorpo da invenção e outra cadeia pesada e leve são específicas para um antígeno outro que hlL-12 por ligação cruzada de um anticorpo da invenção para um segundo anticorpo por métodos de ligação cruzada química padrão.

Em um sistema preferido para expressão recombinante de um anticorpo, ou porção ligadora do antígeno do mesmo, da invenção, um vetor de expressão recombinante codifi- cando ambos, a cadeia pesada do anticorpo e a cadeia leve do anticorpo é introduida nas células dhfr-CHO por transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expres- são recombinante, os genes de cadeia pesada e leve do anticorpo são cada operacional- mente ligados aos elementos aumentadores/promotores regulatórios (por exemplo, derivado a partir de SV40, CMV, adenovírus e semelhantes, tale omo um aumentador CMV/elemento regulatório promotor AdMLP ou um aumentador SV40/elemento regulatório promotor Ad- MLP) para dirigir níveis altos de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carreia um gene DHFR, que permite para a seleção das células CHO que têm sido transfectado com o vetor utilizando seleção/amplificação metotrexato. As células hospedei- ras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão de cadeias pesa- da e leve do anticorpo e anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são utilizadas para preparar a vetor de expressão recombinan- te, transfectar as células hospedeiras, selecionar para transformantes, cultura de células hospedeiras e recuperação do anticorpo a partir do meio de cultura. Anticorpos ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo da invenção podem ser expressos em um animal (por e- xemplo, um camundongo) que é trangênico para genes da imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor, LD et al (1992) Nucl. Acids. Res. 20:6287-6295). Células de planta podem também ser modificadas para criar plantas transgênicas que expressam o anticorpo ou por- ção Iigadora de antígeno do mesmo, da invenção.

Em vista do antecedente, outro aspecto da invenção pertence ao ácido nucléico, vetor e composições de célula hospedeira que pode ser usado para expressão recombinan- te dos anticorpos e porções do anticorpo da invenção. Preverivelmente, a invenção retrata ácidos nucléicos isolados que codificam CDRs de J695, ou a região variável da cadeia pe- sade e/ou leve inteira de J695. Consequentemente, em uma modalidade, a invenção retrata um ácido nucléico variável codificando uma região variável de cadeia pesada do anticorpo que codifica o CDR3 de cadeia pesada J695 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:25. Preferivelmente, o ácido nucléico codifica a região variável de cadeia pesa- da do anticorpo ainda codifica uma cadeia pesada J695 CDR2 que compreende a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:27. Mais preferivelmente, o ácido nucléico codificando a região variável de cadeia pesada do anticorpo ainda codifica uma cadeia pesada J695 CDR1 que compreende a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:29. Ainda mais preferivelmente, o áci- do nucléico codifica uma região variável de cadeia pesada do anticorpo compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:31 (a região VP inteira do J695).

Em outras modalidades, a invenção retrata um ácido nucléico isolado codificando uma região variável de cadeia leve do anticorpo que codifica a cadeia leve H695 CDR3 compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:26. Preferivelmente, o ácido nu- cléico codificando a região variável de cadeia leve do anticorpo ainda codifica uma cadeia leve J695 CDR2 que compreende a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:28. Mais preferi- velmente, o ácido nucléico codificando a região variável de cadeia leve do anticorpo ainda codifica uma cadeia leve J695 CDR1 que compreende a seqüência aminoácida da SEQ ID N0:30. Ainda mais preferível, o ácido nucléico isolado codifica uma região variável de ca- deia leve do anticorpo compreendendo a seqüência aminoácida da SEQ ID NO:32 (a região VL inteira do J695).

A invenção também provê vetores de expressão recombinante codificando ambos, uma cadeia pesada de anticorpo e uma cadeia leve de anticorpo. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção provê um vetor de expressão recombinante codificando:

a)uma cedia pesada de anticorpo tendo uma região variável compreendendo a se- qüência aminoácida da SEQ ID NO:31; e

b) uma cadeia leve do anticorpo tendo uma região variável compreendendo a se- quência aminoácida da SEQ ID NO:32.

A invenção também provê células hospedeiras nas quais um ou mais dos vetores de expressão recombinante da invenção têm sido introduzidos. Preferivelmente1 a célula hospedeira é uma célula hospedeira mamífera, mais preferivelmente a célula hospedeira é uma célula CHO, uma célula NSO ou uma célula COS. Ainda adicionalmente a invenção provê um método de sintetizar um anticorpo humano recombinante da invenção por cultivar uma célula hospedeira da invenção em um meio de cultura adequado até um anticorpo hu- mano recombinante da invenção é sintetizado. O método pode ainda compreender isolar o anticorpo humano recombinante a partir do meio de cultura.

VI. Composições Farmacêuticas e Administração Farmacêutica Os anticorpos e porções do anticorpo da invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um paciente. Tipicamente, a composição farmacêutica adequada para administração a um paciente. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como utilizado, "veículo farmaceuticamente acei- tável" inclui qualquer e todos os solventes, meia de dispersão, revestimentos, agentes anti- bacterianos e antigfúngicos, agentes isotônicos e de atraso de absorção, e semelhantes que são compatíveis fisiologicamente. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis in- cluem um ou mais de água, salina, salina tamponada por fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como composições dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ainda compreender quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umidificantes ou emulsi- onantes, conservantes ou tampões, que aumentam a meia de vida de estocagem ou efetivi- dade do anticorpo ou porção do anticorpo.

Os anticorpos e porções de anticorpo da invenção podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para administração parental. Preferivelmente, o anti- corpo ou porções do anticorpo estarão preparados como uma solução injetável contendo 0,1-250 mg/ml_ do anticorpo. A solução injetável pode ser composta de ou um liquido ou uma forma de dosagem Iiofilizada em um sílex ou frasco âmbar, ampola ou seringa pré- enchida. O tampão pode ser L-histidina (1-50 mM), otimamente 5-10 mM no pH 5,0 a 7,0 (otimamente pH 6.0). Outros tampões adequados incluem, mas não são limitados a succina- to de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Cloreto de sódio pode ser utilizado para modificar a toxicidade da solução em uma concentração de 0-300 mM (o- timamente 150 mM para uma forma de dosagem líquida). Crioprotetores podem ser inclusos para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente 0-10% de sacarose (otimamente 0,5- 1,0%). Outros crioprotetores adequados incluem trealose e lactose, Agentes espessantes podem ser inclusos para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente 1-10% de mani- tol (otimamente 2-4%). Estabilizadores podem ser utilizados em ambas as formas de dosa- gem líquida e liofilizadas, principalmente 1-50 mM de L-Metionina (otimamente 5-10 mM). Outros agentes espessantes adequados incluem glicina, arginina, podem ser inclusos como 0-0,05% de polisorbato-80 (otimamente 0,005-0,01%). Tensoativos adicionais incluem mas não são limitados para polisorbato 20 e tensoativos BRIJ.

Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica inclui o anticorpo em uma dose de cerca de 100 mg - 200 mg de dose.

As composições desta invenção podem ser feitas em uma variedade de formas. Esses incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, Iipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo tencioado da administração e aplicação terapêutica. Composições preferidas típicas estão na forma de soluções injetáveis ou infundíveis, tais como composições similares para aque- les utilizados para imunização passiva de humanos com outros anticorpos. O modo preferi- do de administração é parental (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, in- tramuscular). Em uma modalidade preferida, o anticorpor é administrado por injeção subcu- tânea. Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condi- ções de fabricação e estocagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomo, ou outras estruturas ordenadas adequadas para alta concentração da droga. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorpora- ção do composto ativo (isto é, anticorpo ou porção do anticorpo) na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados aci- ma, como requerido, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e requer outros ingredientes a partir desses enumerados acima. No caso de pós estéreis Iiofilizados para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os méto- dos preferidos da preparação são secagem a vácuo e secagem por pulverização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução estéril filtrada previamente da mesma. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerida no caso da dispersão e pelo uso de tensoativos. Absor- ção prolongada de composições injetáveis pode ser trazida por incluir na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.

Os anticorpos e porções de anticorpos da presente invenção podem ser adminis- trados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplica- ções terapêuticas, a via preferida/modo de administração é injeção subcutânea, injeção in- travenosa ou infusão. Bem como ser apreciada pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração variará dependendo sob resultados desejados. Em certas modalidades, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que protegerá o composto contra a libe- ração rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesi- vos transdérmicos, e sistemas de distribuição microencapsulados. Biodegradáveis, políme- ros biocompatíveis podem ser utilizados, tais como acetato de vinila, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoéster, e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controleed Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.

Em certas modalidades, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser oralmente administrado, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível as- similável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) pode também ser colocado em uma cápsula de gelatina dura ou mole, compressa em comprimidos, ou incorporada direta- mente na dieta dos pacientes. Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e utilizados na forma de comprimidos íngeríveis, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e semelhantes. Para ad- ministrar um composto da invenção por outra administração parenteral, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrado o composto com, um material para prevenir sia inativação.

Compostos suplementares ativos podem também ser incorporados nas composi- ções. Em certas modalidades, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é co- formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais que são úteis para tratar distúrbios em que a atividade de IL-12 está em detrimento. Por exem- plo, um anticorpo anti-hlL-12 ou porção do anticorpo da invenção pode ser co-formulado e/ou co-administrado com um ou mais anticorpos adicionais que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que se ligam a outras citocinas ou que se ligam a moléculas de superfí- cie celular). Além disso, um ou mais anticorpos da invenção pode ser utilizados em combi- nação com dois ou mais dos antecedentes agentes terapêuticos. Tais terapias de combina- ção podem vatajosamente utilizar doses menores de agentes terapêuticos administrados, então evitando possíveis toxicidades ou complicações associadas com as várias monotera- pias. Será apreciado pelo versada na técnica que quando os anticorpos da invenção são utilizados como parte de uma terapia de combinação, uma dose menor do anticorpo pode ser desejável que quando o anticorpo sozinho é administrado a um paciente (por exemplo, um efeito terapêutico sinergístico pode ser alcançado através do uso de terapia de combina- ção que, por sua vez, permite o uso de uma dose menor do anticorpo para alcançar o efeito terapêutico desejado).

Interleucina 12 desempenha um papel crítico na patologia associada com uma variedade de doenças envolvendo elementos imunes e inflamatórios. Essas doenças incluem, mas não são limitados para artrite reumatóide, osteoartrite, artrite crônica juvenil, artrite de Lyme1 artrite psoriática, artrite reativa, espondiloartropatia, lúpus eritematoso sistêmico, do- ença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória do intestino delgado, diabetes mellitus dependente de insulina, tiroidite, asma, doenças alérgicas, psoríase, dermatite esclerodér- mica, dermatite atópica, doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante de órgão, doença imune aguda ou crônica associada com transplante de órgão, sarcoidose, ateroesclerose, coagulação intravascular disseminada, doença de Kawasaki, doença de Grave, síndrome nefrótica, síndrome de fadiga crônica, granulomatose de Wegener, púrpura Henoch-Schoenlein, vasculite microscópica dos rins, hepatite crônica ativa, uveite, choque séptico, síndrome do choque tóxico, síndrome sepsis, caquexia, doenças infeciosas, doen- ças parasitárias, síndrome da imunodeficiência adquirida, mielite transversa aguda, córea de Huntington, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, derrame, cirrose biliar primária, anemia hemolítica, malignâncias, falências cardíaca, infarto do miocárdio, doença de Addi- son, esporádico, deficiência poliglandular do tipo I e deficiência poliglandular do tipo II, sín- drome de Schmidt, síndrome de estresse respiratório adulto (agudo), alopécia, alopécia are- ata, artropatia soronegativa, doença de Reiter, artropatia psoriática, artropatia colítica ulcera- tiva, sinovite enteropática, clamídia, artropatia associada à yersínia e salmonela, espondilo- artropatia, doença ateromatosa/arterioesclerose, alergia atópica, doença bolhosa autoimune, pemphigus vulgaros, pemphigus foliaceus, penfigóide, doença de IgA linear anemia hemotlí- tica autoimune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalite miálgica/Doença Livre Real, candídíase mucocutânea crônica, arterite de célula gigante, hepatite esclerosante primária, hepatite autoimune criptogênica, Síndrome da Doença da Imunodeficiência Adquirida, Doenças Relacionadas a Imunodefici- ência Adquirida, Hepatite C, imunodeficiência variada comum (hipogamaglobulinemia variá- vel comum), cardiomiopatia dilatada, infertilidade feminina, falência ovariana, falência ovari- ana prematura, doençafibrótica pulmonar, alveolite criptogênica fibrosante, doença pulmonar intersticial pós-inflamatória, pneumonite intersticial, doença tissular conectiva associada à doença pulmonar intersticial, doença tissular conectiva misturada associada com doença pulmonar, esclarose sistêmica associada com doença pulmonar intersticial, artrite reumatói- de associada com doença pulmonar intersticial, lúpus sistêmico eritematoso associado com doença pulmonar, dermatomiosite/polimiosite associada em doença pulmonar, doença de Sjogren associada com doença pulmonar, espondilite anquilosane associada a doença pul- monar, doença pulmonar vasculítica difusa, hemosiderose associada a doença pulmonar, doença pulmonar intersticial induzida por droga, fibrose de radiação, bronquiolite obliterante, pneumonia eosinofílica crônica, doença pulmonar infiltrada linfocítica, doença pulmonar in- tersticial pós-infecciosa,artrite gotosa, hepatite autoimune, hepatite autoimune do tipo 1 (au- toimune clássica ou hepatite lupóide), hepatite autoimune do tipo 2 (hepatite do anticorpo anti-LKM), hipoglicemia mediada por autoimunidade, resistência a insulina do tipo B com acantose nigricans, hipoparatiroidismo, doença imune aguda associada com transplante de órgão, doença imune crônica associada com transplante de órgão, osteoartrose, colangite esclerosante primária, Ieucopenia idiopática, neutropenia autoimune, doença renal NOS, glomerulonefrite, vasculote microscópica dos rins, doença de lyme, lúpus eritematoso dis- cóide, infertilidade idiopática masculina ou NOS, autoimunidade do esperma, esclerose múl- tipla (todos os subtipos), diabetes mellites dependente de insulina, oftalmia simpatética, hi- pertensão pulmonar secundária para a doença do tecido conectivo, síndrome de Goodpastu- re, manifestação pulmonar de poliarterite nodosa, febre reumática aguda, espondilite reuma- tóide, doença de Still, esclerose sistêmica, doença/arterite de Takayasu, trombocitopenia autoimune, trompocitopenia idiopática, doença da tireóide autoimune, hipertiroidismo, hipoti- reoidismo autoimune goitrous (doença de Hashimoto), hipotiroidismo autoimune atrópico, mixoedema primário, uveite phagogenic, vasculite primária e vitiligo. Os anticorpos huma- nos, e porções de anticorpo da invenção podem ser utilizados para tratar doenças autoimu- nes, em particular àquelas associadas com inflamação, incluindo, espondilite reumatóide, alergia, diabetes autoimunes, uveites autoimunes.

Preferivelmente, os anticorpos da invenção ou porções Iigadoras de antígenos dos mesmos, são utilizados para tratar artrite reumatóide, doença de Crohn, esclerose múltipla, diabetes mellitus dependente de insulina e psoríase, como descrito em mais detalhes na seção VII.

Um anticorpo humano, ou porção do anticorpo, da invenção também pode ser ad- ministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis no tratamento das doen- ças autoimunes e inflamatórias.

Anticorpos da invenção, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo pode ser utili- zados sozinho ou em combinação para tratar tais doenças. Deve ser entendido que os anti- corpos IL-12 da invenção ou porção Iigadora de antígeno do mesmo pode ser utilizado sozi- nho ou em combinação com um agente adicional, por exemplo, um agente terapêutico, o referido agente adicional sendo selecionados pelo versado na técnica para seu propósito tencionado. Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente terapêutico recocnhecido na técnica como sendo útil para tratar a doença ou condição sendo tratado pelo anticorpo pela presente invenção. O agente adicional também pode ser agente que dá um atributo benéfico para a composição terapêutico, por exemplo, um agente que afeta a viscosidade da composição.

Deve ser ainda entendido que as combinações que são para serem inclusas dentro desta invenção são aquelas combinações úteis para seu propósito tencionado. Os agentes revelados abaixo são ilustrativos para propósitos e não tencionam selrem limitados. As combinações que sã parte desta invenção pode ser os anticorpos da presente invenção e pelo menos um agente adicional selecionado a partir da lista abaixo. A combinação pode também incluir mais que um agente adicional, por exemplo, dois ou três agentes adicionais se a combinação é tal que a composição formada pode desempenhar sua função tenciona- da. Além disso, agentes adicionais desrcritos aqui usados em combinação com um anticor- po IL-12, não são limitados para o distúrbio ao qual eles são atribuídos para tratamento.

Combinação(s) preferida(s) é/são droga(s) antiinflamatória(s) não esteroidal(s) tam- bém referidas como AINES que incluem drogas tipo ibuprofeno. Outras combinações prefe- ridas são corticosteróides incluindo prednisolina; os bem conhecidos efeitos colaterais do uso do esteróide podem ser reduzidos ou menos eliminados por diminuir a dose de esterói- de requerida quando pacientes tratados em combinação com anticorpos anti-IL-12 desta invenção. Exemplos não Iimitantes de agentes terapêuticos para artrite reumatóide com os quais um anticorpo, ou porção de anticorpo da invenção podem ser combinados incluem o seguinte: droga(s) antiinflamatória(s) supressora(s) de citocina (CSAIDs); anticorpos para os antagonistas de outras citocinas humanas ou fatores de crescimento, por exemplo, TNF (in- cluindo adalimumab/HUMIRA), LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, 11-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, e PDGF. Anticorpos da invenção, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo, podem ser combinados com anticorpos para moléculas de superfície celular tais como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, ou seus Iigantes incluindo CD154 (gp39 ou CD40L).

Combinações preferidas de agentes terapêuticos podem interferir em pontos dife- rentes na autoimunidade e cascata inflamatória subsequente; exemplos preferidos incluem antagonistas de TNF do tipo quimérico, anticorpos TNF humanizados ou humanos, D2E7, (Pedido Seriado dos EUA número 08/599.226, depositado em 9 de Fevereiro de 19960, cA2 (Remicade®), CDP 571, fragmentos do anticorpo anti-TNF (por exemplo, CDP870), e recep- tores de TNF p55 ou p75 solúvel, derivados dos mesmos, (p75TNFRIgG (Enbrel®) ou p55TNFRIgG (Lenercept), receptor de 11-12 solúvel (sIL-13), e também inibidores da enzima conversora de TNFct (ECTA); similarmente inibidores de IL-1 (por exemplo, inibidores da enzima conversora da interleucina 1, taos como Vx740, ou IL-1 RA etc) pode ser efetivos para as mesmas razões. Outras combinações preferidas incluem interleucina 11, ligante de glicoproteína anti-P7s e p-selectina (PSGL). Ainda outra combinação preferida são outras peças chaves da resposta autoimune que podem atuar em paralelo a, dependente de ou junto com a função da IL-12; especialmente preferidos são antagonistas de IL-18 incluindo anticorpos IL-18 ou receptores de IL-18 solúveis, ou proteínas de ligação de 11-18. Tem sido mostrado que IL-12 e IL-18 têm se sobreposto mas funções distintas e uma combinação de antagonistas para ambas podem ser mais efetiva. Aind aoutra combinação preferida são inibidores anti-CD4 não depletantes. Ainda outras combinações preferidas incluem antago- nistas da via co-estimulatória CD80 (B7.1) ou CD86 (B7.2) incluindo anticorpos, receptores solúveis ou ligantes antagonísticos.

Anticorpos anti-IL-12, ou porções Iigadoras de antígenos dos mesmos, podem tam- bém serem combinados com agentes, tais como metotrexato, 6-MP, azatioprina sulfasalazi- na, mesalazima, olsalazima cloroquinina/hidroxiloroquina, penilamina, aurotiomalato (intra- muscular e oral), azatioprina, cochicina, corticosteróides (oral, inalado e injeção local), ago- nistas beta-2-aderenoreceptor (salbutamol, terbutalina, salmeteral), xantinas (teofilina, ami- nofilina), cromoglicato, nedocromil, cetotifeno, ipratrópio e oxitrópio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato de mofetila, leflunomida, AINES, por exemplo, ibuprofeno, corticos- teróides tais como prednisolona, inibidores da fosfodiesterase, agonistas de adenosina, a- gentes antitrombóticos, inibidores do complemento, agentes adrenérgicos, agentes que in- terferem com sinalização por citocinas pró-inflamatórias tais como TNFa ou IL-1 (por exem- plo, inibidores da IRAK, NIK, IKK1 p38 ou MAP quinase), inibidores da enzima conversora de IL-β (por exemplo, Vx740), anti-P7s, ligante de glicoproteína p-selectina (PSGL), inibidores da enzima conversora de TNFct (TACE), inibidores da sinalização de célula T tais como ini- bidores quinase, inibidores da metaloproteinase, sulfasalazina, azatioprina, mercaptopurinas 6, inibidores da enzima conversora de angiotensina, receptores de citocina solúveis e deri- vados dos mesmos (por exemplo, receptor de TNF p55 ou p75 solúveis e seus derivados p75TNFRIgG (Enbrel®) e p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-1 RI, sIL-1 RII, sIL-6R, receptor de II- 13 solúvel (sIL-12)) e citocinas antiinflamatórias (por exemplo, IL-4, 11-10, IL-11, IL-13 e TGFβ). Combinações preferidas incluem metotrexato ou leflunomida e em casos de artrite reumatóide moderada ou severa, ciclosporina.

Exemplos não Iimitantes de agentes terapêuticos para doença inflamatória do intes- tino com os quais um anticorpo anti-IL-12, ou porção do anticorpo, podem ser combinados incluem o seguinte: budenosida; fator de crescimento epidermal; corticosteróide; ciclospori- na, sulfasalazina; aminosalicitado; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inibidoreas da lipoxigenase; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inibidores do tromboxa- no; antagonistas do receptor de IL-1; anticorpos monoclonais anti-IL-1/?; anticorpos mono- clonais anti-IL-6; fatores de crescimento; inibidores de elastase; compostos piridinil-imidazol; anticorpos para ou antagonistas de outras citocinas humanas ou fatores de crescimento, por exemplo, TNF (incluuindo adalimumab/HUMIRA), LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II1 GM-GSF1 FGF1 e PDGF. Anticorpos da invenção, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo, podem ser combinados com anticorpos para moléculas de superfície celular taisoc orno CD2, CD3, CD4, Cd8, CD25, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 ou seus ligantes. Os anticorpos da invenção, ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo, podem também ser combinados com agentes, tais como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapami- cina, micofenolato deo mofetil, leflunomida, AINES, por exemplo, ibuprofeno, corticosterói- des tais como prednisolona, inibidores da fosfodiesterase, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inibidores do complemento, agentes adranérgicos, agentes que interferem com sinalização por citocinas pró-inflamatórias tais como TNFa ou IL-1 (por exemplo, inibi- dores da IRAK, NIK, IKK, p38 ou MAP quinase), inibidores da enzima conversora IL-1/? (por exemplo, Vx740), anti-P7s, Iigante de glicoproteína p-selectina (PSGL), inibidores da enzima conversora de TNFa1 inibidores da sinalização de célula T tais como inibidores quinase, ini- bidores da metaloproteinase, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inibidores da enzima conversora de angiotensina, receptores de citocina solúveis e derivados dos mes- mos (por exemplo, receptores de TNF p55 ou p75 solúveis, slL-1 RI, slL-1 Rll, slL-6R, recep- tor de IL-13 solúvel)) e citocinas antiinflamatórias (por exemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 e TGFβ).

Exemplos preferidos de agentes terapêuticos para doença de Crohn em que um an- ticorpo ou uma porção Iigadora de antígeno pode ser combinado incluem o seguinte: anta- gonistas do TNF, por exemplo, anticorpos anti-TNF, D2E7 (adalimumab/HUMIRA), cA2 (Remicade®), CDP571, fragmentos de anticorpo anti-TNF (por exemplo, CDP870), constru- ções TNFR-Ig (p75TNFRIgG (Enbrel®) e p55TNFTIgG (Lenercept)), anti-P7s, Iigante de glicoproteína p-selectina (PSGL), receptor de IL-13 solúvel (slL-13), e inibidores de PDE4. Anticorpos da invenção ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo, podem ser combina- dos com corticosteróides, por exemplo, budenosida e dexametasona. Anticorpos podem também ser combinados com agentes tais como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico e ol- salazina, e agentes que intereferem com síntese ou ação de citocinas pró-inflamatórias tal como IL-1, por exemplo, inibidores da enima conversora de IL-1/? (por exemplo, Vx740) e IL- 1ra. Anticorpos ou porção Iigadora de antígeno do mesmo podem também ser utilizados com inibidores de sinalização de célula T, por exemplo, inibidores da tirosina quinase, 6- mercaptopurinas. Anticorpos ou porções de ligação de antígeno dos mesmos, podem ser combinados com IL-11.

Exemplos não Iimitantes de agentes terapêuticos para esclerose múltipla com um anticorpo, ou porção do anticorpo, podem ser combinados incluem a seguinte: corticosterói- de; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferon-/?1a (Avonex; Biogen); interferon-/?1 b (Betaseron; Chi- ron/Berlex); Copolímero 1 (Cop-1; Copaxona; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxigê- nio hiperbárico; imunoglobulina intravenosa; clabribina; anticorpos para ou antagonistas de outras citocinas humanas de fatores de crescimento, por exemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF1 e PDGF. Anticorpos da invenção, ou porções Iigadores de antígeno dos mesmos, podem ser combinados com anticorpos para moléculas de superfície celular tais como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 ou seus ligantes. Os anticorpos da invenção, ou porções ligadoras de antígeno dos mesmos, podem também ser combinados com agentes, tais co- mo metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato de mofetila, leflunimida, Al- NEs, por exemplo, ibuprofeno, corticosteróides tais como prednisolina, inibidores da fosfodi- esterase, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inibidores do complemento, a- gentes adrenérgicos, agentes que interferem com a sinalização por citocinas pró- inflamatórias tais como TNFa e IL-1 (por exemplo, inibidores da IRAK, NIK, IKK, p38 ou MAP quinase), inibidores da enzima conversora de IL-1ß (por exemplo, Vx740), anti-P7s, ligante de glicoproteína p-selectina (PSGL)1 inibidores da TACE,, inibidores da sinalização de célula T tal como inibidores quinse, inibidores de metaloproteinase, sulfasalazina, azatio- prina, 6-mercaptopurinas, inibidores da enzima conversora de angiotensina, receptores de citocina solúveis e derivados dos mesmos (por exemplo, receptores de TNF p55 ou p75 so- lúveis, sIL-1RI, sIL-IRII, sIL-6R, receptor de II-13 solúvel (sIL-13)) e citocinas antiinflamató- rias (por exemplo, IL-4, IL-10, IL-13 e TGFß).

Exemplos preferidos dos agentes terapêuticos para esclerose múltipla em que o an- ticorpo ou porção ligadora de antígeno do mesmo podem ser combinados para incluir inter- feron β, por exemplo, IFNß1a e IFNßb; copaxona, corticosteróides, inibidores de IL-1, inibi- dores de TNF, e anticorpos para Iigante de CD40 e CD80.

Um anticorpo, porção de anticorpo, pode ser utilizado em combinação com outros agentes para tratar condições da pele. Por exempllo, um anticorpo, porção de anticorpo, ou outro inibidor de IL-12 da invenção é combinado com terapia PUVA. PUVA é uma combina- ção de psoraleno (P) e radiação ultravioleta de onda longa (UVA) que é utilizada para tratar muitas condições diferentes da pele. Os anticorpos, porções de anticorpos, ou outros inibi- dores da IL-12 da invenção podem também ser combinados com pimecrolimus. Em outra modalidade, os anticorpos da invenção são utilizados para tratar psoríase, em que os anti- corpos são administrados em combinação com tacrolimus. Em uma modalidade adicional, tacrolimus e inibidores de IL-12 são administrados em combinação com metotrexato e/ou ciclosporina. Em ainda outra modalidade, o inibidor de IL-12 da invenção é administrada com tratamento de excímer laser para tratar psoríase.

As composições farmcêuticas da invenção podem incluir uma "quantidade terapeu- ticamente efetiva" ou uma "quantidade profilaticamente efetiva" de um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente efetiva" refere-se a uma quan- tidade efetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo ou porção de anticorpo pode variar de acordo com os fatores tais como estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a habilidade do anticorpo ou porção do anticorpo para elicitar uma res- posta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é também uma em que qualquer efeito tóxico ou que causa detrimento do anticorpo ou porção do anticorpo são resolvidos pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaicamente efeti- va" refere-se a uma quantidade efetiva, em doses e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, desnde que a dose profilática é utilizada em pacientes antes de ou em um estágio anterior da doença, o quantidade profilati- camente efetiva será menor que a quantidade terapeuticamente efetiva.

Regimes de dose podem ser ajustados para prover a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta profilática ou terapêutica). Por exemplo, uma pílula única pode ser administrada, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado por exigências da situa- ção terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de dose única para fácil administração e uniformidade de dose. Forma de dose única como aqui utilizado refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como doses únicas pa- ra os pacientes mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade pre- determinada do composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veíuclo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dose única da invenção são direcionadas por e diretamente dependente de (a) características únicas do composto ativo e a terapêutica particular ou efeito profilático a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técnica de compostos tal um composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

Em uma modalidade, o anticorpo IL-12, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, é administrado ou um regime de dose quinzenalmente, incluindo, por exemplo, variando a dose quinzenalmente a partir de cerca de 50 a 300 mg, uma variação de dose de cerca de 100 mg a cerca de 200 mg, e uma dose de cerca de 125 a cerca de 175 mg. Alternativa- mente, o anticorpo IL-12 pode ser administrado como um tem um tempo de dose, incluindo, por exemplo, uma dose de cerca de 200 mg de dose, uma dose de cerca de 100 mg. Em outra modalidade, o anticorpo IL-12 é administrado em um regime de dose semanal, incluin- do, por exemplo, uma dose variando de cerca de 50 a 300 mg, uma dose variando de cerca de 100 mg a cerca de 200 mg, e uma dose de cerca de 125 a cerca de 175 mg. Deve ser notado que doses dentro das variações especificadas são também inclusos aqui, por exem- plo, 85 mg, 97 mg etc.

Em outra modalidade, um anticorpo IL-12 humano, ou porção ligadora de antígeno do mesmo, é administrado como uma dose única a um paciente tendo um distúrbio em que atividade de IL-12 ser em detrimento, por exemplo, psoríase, que resulta em tratamento. Uma resposta ao anticorpo IL-12, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, pode ser man- tida por um período prolongado em um paciente. Manutenção de uma resposta pode ser monitorada de acordo com o distúrbio sendo tratado. Por exemplo, manutenção de uma re- posta com um anticorpo IL-12, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, para tratar psorí- ase podem ser determinado pela resposta PASI 75 do paciente ao longo do tempo.

É para ser notado que valores de dosagem podem variar com o tipo e severidade da condição a ser tratada. É para ainda ser entendido que para qualquer paciente particular, regimes de dose específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a ne- cessidade individual e julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições e estar variações de dose reveladas aqui é exemplares somente, e não tencionam limitar o objetivo ou prática da composição reivindicada.

VII. Usos da Invenção

A invenção provê um método para inibir a atividade de IL-12 em um paciente so- frendo de um distúrbio em que a atividade de IL-12 é maléfica. Em uma modalidade, a in- venção provê um método de tratar psoríase compreendendo a administração de uma dose única de um anticorpo IL-12, ou uma porção Iigadora de antígeno do mesmo.

IL-12 tem sido implicada na patofisiologia de uma grande variedade de distúrbios (Windhagen et al (1995) J. Exp. Med. 182:1985-1996; Morita et al (1998) Arthritis and Rheumatism 41:306-314; Bucht et aI (1996) Clin. Exp. Immunol. 103:347-367; Fais et al (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Parronchi et al (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Mon- teleone et al (1997) Gastroenterology 112:1169-1178, e Berrebi et al (1998) Am J Path 152:667-672; Parronchi et al (1997) Am J Path 150:823-832). A invenção prove métodos para inibir a atividade de IL-12 em um paciente sofrendo de tal distúrbio, cujo método com- preende a administração ao paciente de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção tal que a atividade de IL-12 no paciente é inibida. Preferivelmente, a IL-12 é IL-12 humana e o paciente é um paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero ex- pressando uma IL-12 com a qual um anticorpo da invenção reage de forma cruzada. Ainda adicional o paciente pode ser um mamífero em que tenha sido introduzida hlL-12 (por e- xemplo, por administração da hlL-12 ou por expressão de um trangênico hlL-12). Um anti- corpo da invenção pode ser administrado a um pacietne humano para propósitos terapêuti- cos (discutido ainda abaixo). Além disso, um anticorpo da invenção pode ser administrado a um mamífero não humano expressando uma IL-12 com a qual o anticorpo reage cruzada- mente por propósitos veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Com re- lação ao último, tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos da invenção (por exemplo, testando as doses e cursos temporais de administra- ção).

Como aqui utilizado, a frase "um distúrbio em que a atividade de IL-12 é maléfica" é tencionado incluir doenças e outros distúrbios em que a presença de IL-12 em um paciente sofrendo do distúrbio tem sido mostrada ser ou é suspeitado ser responsável pela patofisio- logia do distúrbio ou um fator que contribui para a piora do distúrbio. Consequentemente, um distúrbio em que a atividade da IL-12 é maléfica é um distúrbio em que a inibição da ativida- de de IL-12 é esperada para aliviar os sintomas e/ou progressão do distúrbio. Tais distúrbios podem ser evidenciados, por exemplo, pelo aumento na concentração da IL-12 em um fluído biológico a um paciente sofrendo a partir do distúrbio (por exemplo, um aumento na concen- tração da IL-12 no soro, plasma, fluído sinovial etc, do paciente), que pode ser detectada, por exemplo, utilizando um anticorpo anti-IL-12 como descrito acima. Existem numerosos exemplos de distúrbios em que a atividade de IL-12 é maléfica. Em uma modalidade, os anticorpos ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo, podem ser utilizados na terapia para tratar as doenças ou distúrbios descritos abaixo. Em outra modalidade, os anticorpos ou porções Iigadoras de antígeno dos mesmos, podem ser utilizados para fabricação de um medicamento para tratar as doenças ou distúrbios descritos aqui. O uso dos anticorpos e porções de anticorpos da invenção no tratamento de uns poucos distúrbios específicos não Iimitantes é discutido ainda abaixo:

A.Artrite Reumatóide

Interleucina 12 tem sido implicada em desempenhar um papel nas doenças inflama- tórias tal como artrite reumatóide. Mensagem de IL-12p40 induzível tem sido detectada na sivóvia a partir de pacientes com artrite reumatóide e IL-12 tem sido mostrado estar presen- te nos fluídos sinoviais de pacientes com artrite reumatóide (ver, por exemplo, Morita et al (1998) Arthritis and Rheumatism 41:306-314). Células positivas para IL-12 têm sido encon- tradas estarem presentes na camada celular da sinóvia da artrite reumatóide. Os anticorpos, e porções de anticorpos da invenção podem ser utilizados para tratar, por exemplo, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite Lyme, espondilite reumatóide, osteroartrite e artrite gotosa. Tipicamente, o anticorpo, ou porção de anticorpo, é administrado sistemati- camente, embora para certos distúrbios, administração local do anticorpo ou porção do anti- corpo pode ser benéfica. Um anticorpo, ou porção do anticorpo, da invenção também pode ser administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis no tratamento de doenças autoimunes.

No modelo murino de artrite induzida por colágeno (AIC) para artrite reumatóide, tratamento de camundongos com um anti-IL-12 mAb (anticorpo IL-12 monoclonal rat anti- camundongo, C17.15) antes da artrite profundamente suprimir o início, e reduzido a indifên- cia e severidade da doença. Tratamento com anti-IL-12 mAb antes do início da seeridade da artrite reduzida, mas tratamento tardio de camudongos com anti-IL-12 mAb após o início de doença tiveram efeito mínimo na severidade da doença.

B. Doença de Crohn

Interleucina 12 também desempenha um papel na doença do inflamatória do intes- tino, doença de Crohn. Expressão aumentada da IFN-γ e IL-12 ocorre na mucosa intestinal dos pacientes com doença de Crohn (ver, por exemplo, Fais et al (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Parronchi et al (1997) Amer. J. Pathol. 150:823-832; Monteleone et al (1997) Gastroenterology 112:1169-1178; Berrebi et al (1998) Amer. J. Pathol. 152:667-672). Anti- corpos anti-IL-12 têm sido mostrado para suprimir doença em modelos camundongo de coli- te, por exemplo, colite de camundongo deficiente para IL-2 induzida por TNBS, e recente- mente em camundongos deficiente IL-10. Consequentemente, os anticorpos, e porções de anticorpo, da invenção, podem ser utilizados no tratamento de doenças inflamatódias do intestino.

C. Esclero Múltipla

Interleucina 12 tem sido implicada como mediador chave de esclerose múltipla. Ex- pressão de mensageiro de IL-12p40 induzível ou IL-12 por si só pode ser demonstrada em lesões de pacientes com esclerose múltipla (Windhagen et al (1995) J. Exp. Med. 182:1985- 1996, Drulovix et al (1997) J. Neurol. Sei. 147: 145-150). Pacientes crônicos progressivos com esclerose múltipla têm elevados níveis circulantes de IL-12. Investigações com células T e células aprensentadoras de antígeno (APCs) a partir de pacientes com esclerose múlti- pica revelou uma série de auto-perpetuação de interações imunes como a base da esclero- se múltipla progressiva levando a uma resposta imune do tipo Th1. Secreção aumentada do IFN-γ a partir de células T levam a produção de IL-12 aumentada por APCs, que perpetua- ram o ciclo levando a um estado crônico de uma ativação imune tipo Th1 e doença (Bala- shov et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. 94:599-603). O papel de IL-12 na esclerose múltipla tem sido inventigada utilizando modelos encefalomielite alérgica experimental de camun- dongo e rato (EAE) de esclerose múltipla. Em um modelo EAE decair-remitir de esclerose múltipla em camundongos, pré-tratamento com anti-IL-12 mAb retarda a paralisia e reduz índices clínicos. Tratamento com anti-IL-12 mAb no pico da paralisia ou durante a subse- quente período de remissão reduziu índices clínicos. Consequentemente, os anticorpos ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo da invenção podem servir para aliviar sintomas associados com esclerose múltipla em humanos.

D. Diabetes Mellitus Dependente de Insulina

Interleucina -12 tem sido implicada como um mediador importante de diebetes mel- litus dependente de insulina (DMDI). DMDM foi induzida em camundongos NOD por admi- nistração da IL-12, e anticorpos anti-IL-12 foram protetora em um modelo de transfência adotiva de DMDI. Pacientes DMDI com início precoce sempre experienciam um assim cha- mado "período de lua de mel" durante o qual algum resíduo de função das células das ilho- tas é mantido. Essas células da ilhota residuais produzem insulina e regulam níveis de gli- cose sangüínea melhor que a insulina administrada. Tratamento desses pacientes com iní- cio precoce com um anticorpo anti-IL-12 pode prevenir destruição adicional das células da ilhota, assim mantendo uma fonte endógena de insulina.

E. Psoríase

Interleucina-12 (IL-12) e a relatada citocina IL-23 têm sido implicadas como media- dores chaves em psoríase. Psoríase envolve lesões cutâneas agudas e crônicas que são associadas com um perfil de expressão de citocina do tipo Th1 (Hamid et al (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1:225231; Turka et a/(1995) Mol. Med. 1:690-699). Ambas, IL-12 e IL-23 con- tribuem para o desenvolvimento da resposta imune de célula T auxiliar do tipo 1 (Th1) em psoríase. Além disso, RNA mensageiro de 11-12 p40 e IL-23 p40 é superexpresso em lesões cutâneas psoriáticas. Consequentemente, os anticorpos ou porções Iigadoras de antígeno do mesmo da invenção podem servir para aliviar distúrbios cutâneos tal com psoríase.

Em uma modalidade, a invenção provê um método para tratar psoríase. Tratamento para psoríase sempre inclui um corticosteróide tópico, análogos de vitamina D, e retinóides tópicos ou orais, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, um anticorpo IL-12 e/ou IL-23 é administrado em combinação com ou a presença de um desses tratamentos comuns. Agentes terapêuticos adicionais que podem ser combinados com o anticorpo IL-12 e/ou IL-23 para tratamento de psoríase são descritos em maiores detalhes abaixo.

O diagnóstico da psoríase é usualmente baseado na aparência da pele. Adicional- mente uma biópsia da pele, ou raspagem e cultura de adesivos da pele podem ser necessá- rias para excluir outros distúrbios da pele. Um raio X pode ser utilizado para checar para artrite psoríaca se dores nas juntas estão presentes e persistentes.

Melhoramentos em psoríase em um paciente podem ser monitorados por Área Pso- riática e índice de Severidade (PASI) dos pacientes. O método para determinar o PASI tem sido descrito em Fredriksson e Pettersson (1978) Dermatológica 157:238 e Marks et al (1989) Arch Dermetol 125:235. Brevemente, o índice é baseado na avaliação dos quatro sítios anatômicos, incluindo a cabeça, extremidades superiores, tronco, e extremidades infe- riores, para eritema, induração e descamação utilizando uma escale de 5 pontos (0= ne- nhum sintoma; 1- leve, 2= moderado, 3= maracado; 4= muito marcado). Baseado na exten- são das lesões em um dado sítio anatômico, a área afetada é assinalada com um valor nu- mérico (0=0; 1=<10%; 2=10-29%; 3=30-49%; 4=-50-69%; 5=70-89%; 6=90-100%). O índice PASI é então calculado, em que o variação possível do índice PASI é 0,0 a 72,0 com o índi- ce mais alto representando eritroderma completo do mais severo grau.

Em uma modalidade da invenção, um anticorpo IL-12 e/ou IL-23 é utilizado para o tratamento da psoríase, incluindo placa psoriática crônica, psoríase gotosa, psoríase inver- sa, psoríase pustular, pemphigus vulgaris, psoríase eritrodérmica, psoríase associada com doença inflamatória do intestino (DII)1 e psoríase associada com artrite reumatóide (AR). Em outra modalidade, um anticorpo IL-12 e/ou IL-23, tal como J695/ABT-874, é utilizado para tratar pacientes que têm psoríase em combinação com PsA. Tipos específicos de psoríases incluídas nos métodos de tratamento da invenção são descritos em detalhes abaixo:

a.Placa psoriáica crônica

Placa psoriática crônica (também referido como psoríase vulgaris) é a forma mais comum de psoríase. Placa psoriática crônica é caracterizada pelo aumento de placas ver- melhas da pele, variando de um tamanho de moeda a muito maiores. Na placa psoriática crônica, as placas podem ser únicas ou múltiplas, elas podem variar em tamanho a partir de poucos milímetros para vários centímetros. As placas são usualmente vermelhas com uma superfície escamosa, e refletem luz quando gentilmente raspadas, criando um efeito "prate- ado". Lesões (que são sempre simétricas) a partir da placa psoriática crônica ocorrem em todo o corpo, mas com predileção para superfícies extensoras, incluindo joelhos, cotovelos, regiões lombo-sacrais, escalpo, e unhas. Ocasionalmente placa psoriática crônica pode o- correr no pênis, vulva e flexões, mas escamação é usualmente ausente. Diagnóstico de pa- cientes com placa psoriática crônica é usualmente baseado nas características clínicas des- critas acima. Em particular, a distribuição, cor e escamação prateada típico da lesão na pla- ca psoriática crônica são características da placa psoriática crônica.

b. Psoríase Gotosa

Psoríase gotosa refere-se a uma forma de psoríase com placas escamosas no for- mato de gotas de água características. Rubores de psoríase gotosa geralmente seguem uma infecção, mais notavelmente uma infecção de garganta estreptocócica. Diagnóstico de psoríase gotosa é usualmente baseado na aparência da pele, e o fato que existe sempre uma história de dor de garganta recente.

c. Psoríase Inversa

Psoríase inversa é uma forma de psoríase em que o paciente tem pele suave, usu- almente áreas úmidas da pele que são vermelhas e inflamadas, que é improvável a esca- mação associada com placa psoriática. Psoríase inversa é também referida como uma pso- ríase intertriginosa ou psoríase flexural. Psoríase inversa ocorre na maioria das vezes em axilas, virilha, sob os seios e em outras dobraduras da pele ao redor dos genitais e nádegas, e, como um resultado das localizações de apresentação, rubor e suor podem irritar as áreas afetadas.

d. Psoríase Pustular

Psoríase pustular, também referida como psoríase palmar plantar, é uma forma de psoríase que causa bolhas cheias de pus que variam de tamanho e localização, mas sem- pre ocorrem nas mãos e nos pés. As bolhas podem ser localizadas, ou espalhadas ao longo de áreas do corpo. Psoríase pustular pode ser ambos, suave ou dolorosa, pode causa fe- bres.

e. Outros distúrbios psoriáticos

Outros exemplos de distúrbios psoriáticos que podem ser tratados com anticorpo IL-12 e/ou IL-23 incluem psoríase eritrodérmica, vulgaris, psoríase associada com IBD, e psoríase associada com artrite, incluindo artrite reumatóide.

A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como Iimitantes em qualquer modo. Os conteúdos de todas as referências cita- das, incluindo referências de literatura, patentes emitidas, e pedidos de patente publicados, como citado através deste pedido são aqui incorporados por referência. Deve ser ainda en- tendido que os conteúdos de todas as tabelas em anexo aqui (ver Apêndice A da Patente dos EUA No. 6.914.128) bem como os conteúdos inteiros da Patente dos EUA No. 6.914.128 são aqui incorporados por referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Eficácia do Anticorpo Monoclonal Inteiro IL-12/IL-23 Humano, ABT-874, No Tratamento de Placa Psoriática Moderada a Severa

ABT-874 é um anticorpo humano completo contra interleucina 12 (IL-12) e IL-23. Ele se liga com grande afinidade à subunidade p40 comum de ambos, IL-12 e IL-23, ambos alvos validados no tratamento de psoríase (Ps).

O objetivo do seguinte estudo foi avaliar a aficácia das injeções subcutâneas de ABT-874 no tratamento de pacientes com placa Ps moderada a severa.

Pacientes adultos com Ps afetando ≥10% de área de superfície corporal (ASC) e uma Área Psoriática e índice de Severidade (PASI) ≥12 na linha de base foram eleitos para este estudo de 12 semanas, duplo-cego, controlado por placebo. Pacientes foram aleatori- amente para 1 de 6 braços: 1) 100 mg de ABT-874 a cada outra semana (cos) por 12 sema- nas; 2) uma dose de 200 mg de ABT-874 na semana 0; 3) 200 mg de ABT-874 a cada se- mana por 4 semanas; 4) 200 mg de ABT-874 cos por 12 semanas; 5) 200 mg de ABT-874 a cada semana por 12 semanas; ou 6_ placebo. Ponto primário foi uma resposta ≥PASI75 na Semana 12. Outras avaliações de aficácia incluíram o PASI50 e a Avaliação Global do Mé- dico (AGM). Pacientes que encontraram o ponto primário entraram na fase cega/re- tratamento na semana 36 e foram monitorados por tempo de perda de resposta.

Um total de 180 pacientes participou do estudo, 30 em cada braço. Características de base foram similares entre braços e indicaram Ps de moderada a severa (todos os valo- res são média exceto % macho): idade, 46 anos, 74% machos; 21 anos duração Ps; ≥PASI19; e 25% de ASC afetado. Na semana 12, as porcentagens de pacientes alcançaram ASI75 foram estatisticamente significantemente maior para pacientes em cada um dos 5 braços ABT-874 vs. Placebo (93%, 63%, 90%, 93%, 90% vs. 3%, respectivamente, p<0,001, ITT). Em adição, as porcentagens de pacientes alcançaram ≥PASI50 foram estatisticamen- te significantemente maior para pacientes em cada um dos 5 braços ABT-874 vs. Placebo (100%, 77%, 97%, 97% e 100% vc. 17%, p<0,001). A média de porcentagem diminui (me- lhoria) em PASI na Semana 12 foram 90%, 70%, 92%, 92% e 90%, respectivamente, nos braços ABT-784, e 26% placebo. Similarmente, as porcentagens de pacientes com um ASC de Clara/Mínima foram 83%, 50%, 73%, 87% e 87%, respectivamente, nos braços ABT-874, e 3% para placebo.

Em conclusão, ABT-874 foi significantemente mais eficaz que placebo no tratamen- to de placa psoriática moderada a severa.

Exemplo 2: Segurança e Eficácia do Anticorpo Monoclonal Inteiro IL-12/IL-23 Hu- mano, ABT-874, No Tratamento de Placa Psoriática Moderada a Severa

ABT-874 é um anticorpo humano completo contra interleucina 12 (IL-12) e IL-23. Ele se liga com grande afinidade à subunidade p40 comum de ambos, IL-12 e IL-23, alvos validados no tratamento de psoríase (Ps). O objetivo desta Fase Il foi investigar a aficácia e segurança das injeções subcutâneas de ABT-874 no tratamento de pacientes com placa Ps moderada a severa.

Pacientes adultos com Ps afetando >10% de área de superfície corporal (ASC) e um índice PASI >12 foram eleitos para este estudo de 12 semanas, duplo-cego, controlado por placebo. Pacientes foram aleatoriamente para 1 de 6 braços: 1) 100 mg de ABT-874 a cada outra semana (cos) por 12 semanas; 2) uma dose de 200 mg de ABT-874 na semana 0; 3) 200 mg de ABT-874 a cada semana por 4 semanas; 4) 200 mg de ABT-874 cos por 12 semanas; 5) 200 mg de ABT-874 a cada semana por 12 semanas; ou 6) placebo. Ponto primário foi uma resposta >PASI75 na Semana 12. Pacientes que encontraram o ponto pri- mário entraram na fase cega/re-tratamento na semana 36 e foram monitorados por tempo de perda de resposta. Todos os pacientes foram avaliados para segurança na semana 54. 180 pacientes participaram 30 em cada braço. Características de base foram simila- res entre braços (todos os valores são média exceto % macho): idade, 46 anos, 74% ma- chos; 21 anos duração Ps; PAS119; e 25% de ASC afetado. Na semana 12, as porcenta- gens de pacientes com ^ASI75 foram estatisticamente significantemente maior para paci- entes em cada um dos 5 braços ABT-874 vs. Placebo (93%, 63%, 90%, 93%, 90% vs. 3%, respectivamente, p<0,001, ITT). Durante a semana 12, fase DC, EAs infeccioso para os grupos ABT-874 variou de 23-43% e para o grupo placebo foi 23% com a mais comum sen- do nasofaringite (7-17% para ABT-874, 3% para placebo). Não existiram diferenças signifi- cativas entre os braços. Nenhuma infecção série EAs foi reportada, e nenhuma morte ocor- reu.

Em conclusão, ABT-874 foi significantemente mais eficaz que placebo no tratamen- to de placa Ps moderada a severa, e parece ter uma perfil de segurança favorável.

Exemplo 3: Manutenção de Resposta com o Anticorpo Monoclonal Inteiro IL-12/IL- - 23 Humano, ABT-874, No Tratamento de Placa Psoriática Moderada a Severa

A eficácia e segurança do ABT-874 foram avaliadas na semana 12, Fase II, em tri- agem controlada e aleatória e 36 semanas de fase de acompanhamento. O objetivo do se- guinte exemplo foi analisar a manutenção da resposta seguindo a descontinuação de terapia durante a segunda semana 12 desta Fase Il das injeções subcutâneas do ABT-874 no tra- tamento da placa Ps moderada a severa.

Adultos com Ps afetando >10% de área de superfície corporal (ASC) e um índice PASI >12 foram eleitos para este estudo de 12 semanas, duplo-cego, controlado por place- bo. Pacientes foram aleatoriamente para 1 de 6 braços:

1) 100 mg de ABT-874 a cada outra semana (cos) por 12 semanas;

2) uma dose de 200 mg de ABT-874 na semana 0;

3) 200 mg de ABT-874 a cada semana por 4 semanas;

4) 200 mg de ABT-874 cos por 12 semanas;

5) 200 mg de ABT-874 a cada semana por 12 semanas; ou

6) placebo.

O ponto primário foi uma resposta >PASI75 na Semana 12. Pacientes que encon- traram o ponto primário entraram na fase cega/re-tratamento na semana 36. Tratamento com a droga de estudo foi descontinuado, e pacientes foram monitorados por tempo para perda de resposta (uma diminuição no índice PASI, qualquer tempo durante as 36 semanas que se seguiram ao período, para <PASI50). Manutenção da resposta PASI foi avaliada até a Semana 24.

Um total de 180 pacientes participou do estudo, 30 em cada braço. Características de base foram similares entre braços (valores são média exceto % macho): idade, 46 anos, 74% machos; 21 anos duração Ps; PASI19; e 25% de ASC afetado.

Na semana 12, as porcentagens de pacientes com ^ASI75 foram estatisticamente significantemente maior para pacientes em cada um dos 5 braços ABT-874 vs. Placebo (Ta- bela 1). Na semana 24, porcentagens substanciais de responssivos ao PASI 75 nos braços de tratamentos ativos mantiveram pelomenos uma resposta PASI 50.

Tabela 1. Eficácia na Semana 24 do ABT-874 <table>table see original document page 96</column></row><table>—

*p<0.001 vs. placebo, NRI.

Em conclusão, ABT-874 foi significantemente mais eficaz que placebo no tratamen- to de placa Ps moderada a severa. Porcentagens substanciais de PASI 75 de responssivos mantiveram essas respostas na Semana 24, seguindo descontinuação da terapia ativa.

Exemplo 4: Segurança e Eficácia do ABT-874, um Anticorpo Monoclonal Inteiro IL- 12/IL-23 Humano, ABT-874, No Tratamento de Placa Psoriática Moderada a Severa

O objetivo do seguinte exemplo foi demonstrar a eficácia e segurança de uma vari- edade de doses de um anticorpo monoclonal IL-12/23 humano (ABT-874) comparado com o placebo no trtamento de pacientes com placa psoriátiva crônica moderada a crônica clini- calmente estável.

I.Materiais e Métodos

A.Desenho do Estudo: O seguinte estudo foi uma triagem de 12 semanas, multicen- tro, aleatória, duplo-cega, de fase II, controlada por placebo que foi conduzida em 24 centros dos Estados Unidos (16 sítios) e Canadá (8 sítios). ABT-874 (Laboratórios Abbott, Abbott Park, IL) é um anticorpo monoclonal humano com regiões determinantes de complementa- res geneticamente construídos que têm alta afinidade para para a proteína da subunidade p40 de IL-12/23. Pacientes foram aleatorizados em uma proporção de 1:1:1:1:1:1 para rece- ber 1 de 6 tratamentos: 200 mg de ABT-874, 1 dose na semana 0 (200 mg χ 1); 100 mg de ABT-874 a cada outra semana (cos) por 12 semanas; 200 mg de ABT-874 semanalmente para as primeiras 4 semanas (200 mg χ 4); 200 mg de ABT-874 cos por 12 semanas (200 mg cos); 200 mg de ABT-874 a cada semana por 12 semanas (200 mg semanalmente); ou placebo. Após a semana 12, todos os pacientes que alcançaram pelo menos uma redução de 75% de resposta na área psoriática e índice de severidade (PASI 75) continuada nas 36 semanas de fase de observação cega/ e re-tratamento.

B. Pacientes: Pacientes foram >18 anos de idade e tiveram diagnóstico clínico de psoríase por pelo menos 6 meses (determinado por entrevista com o paciente e confirmação do diagnóstico através de exame físico pelo investigador), placa psoriática estável por pelo menos 2 meses antes de selecionar e em visitas de base como determinado pela entrevista do paciente, placa psoriárica moderada a severa definida por >10% da área de superfície corporal (ASC) envolvida na visita de base, um índice PASE de >12 na visita de base, e uma avaliação global do médico (AGM) de pelo menos doença moderada na visita de base.

Pacientes foram inelegíveis se eles tiveram prévia exposição à terapia sistêmica ou biológica anti-IL-12; psoríase não placa; inabilidade para descontinuar as seguintes terapias antes da visita de base: terapias de psoríase tópica pelo menos 2 semanas antes, fototera- pia com luz ultravioleta B pelo menos 2 semanas antes, fototerapia de psoraleno-luz- ultravioleta em pelo menos 4 semanas antes, terapias sistênicas pelo menos 4 semanas antes, e terapias biológicas pelo menos 12 semanas antes; ingestão requerida de corticoste- róides orais ou injetáveis durante o estudo (corticosteróide inalado para condições médicas estáveis foram permitidas); uma exarcebação da asma requerendo hospitalização nos 10 anos anteriores da seleção; uma infecção ou fatores de risco para infecção severa; uma história de malignâncias outro que carcinoma celular basal tratada com sucesso (pacientes com uma história de carcinoma celular escamoso foram excluídos) ou carcinoma cervical no local; ou uma história de reação imunológica principal (por exemplo doença sérica ou reação anafilactóide) para um agente contendo imunoglobulina G (por exemplo, gama globulina intravenosa, uma proteína de fusão, ou anticorpo monoclonal).

Pacientes foram permitidos continuar tratamento com xampú medicado que não contém corticosteróides, emolientes brandos (sem ácidos beta- ou alfa-hidróxi), ou corticos- teróide tópico de baixa potência de Caísse Vl e Vll em suas palmas, solas, face, área infla- matória, e área da virilha durante o curso do estudo. Aplicação dessas terapias de psoríase tópica não foi ocorrer dentro de 24 horas de uma visita de estudo. Vacinação com um agen- te viral vivo não foi permitido dentro de 1 mês antes do doseamento com ABT-874, durante o estudo, ou por 1 mês após a última dose da droga em estudo ser administrada.

Ocorrência de qualquer dos seguintes resultados de laboratório clinicamente signifi- cantemente anormais levaram a imediata retirada de um paciente do estudo: aspartato tran- saminase ou alanina transaminase > 5 vezes o limite superior normal; bilirrubina sérica total > 3 vezes o limite superior normal; creatinina séria > 3 vezes o limite superior normal; creati- na fosfoquinase > 5 vezes o limite superior normal; hemoglibina < 8 g/dL; contagem de célu- las brancas 2x109/L; ou contagem de plaquetas < 75x109/L.

C. Avaliação da eficácia: A avaliação da eficácia primária foi a porcentagem de pa- cientes alcançando uma resposta PASI 75 na semana 12, definida como pelo menos 75% de redução no índice PASI relativo ao índice da linha de base. PASI é uma medida da seve- ridade das lesões psoriáticas (em termos de eritema, induração e descamação) e a exten- são do envolvimento ASC. O índice PASI varia de 0 (sem psoríase) a 72 (doença severa) (Fredriksson T, Pettersson U., Dermatológica 1978; 157:238-44). Outras medidas de eficácia incluíram a porcentagem de pacientes que alcançaram pelo menos PASI 75 nas semena 1, 2, 4 e 8; o porcentagem de pacientes que alcançaram pelo PASI 50 ou PASI 90 nas sema- nas 1,24,8e12;ea porcentagem de pacientes que realizaram um AGM limpo ou mínimo na semana 12 e nas semanas 1, 2, 4 e 8. O AGM mede a severidade da doença em um escala de 6 pontos, que varia de 0 (nenhuma doença, ou limpo) a 5 (muito severo) (Ko H-S Clinicai trial design in psoriasis. Apresentado na 49a Reunião do Comitê Consultivo Dermato- lógico e Oftalmológico; 20 de Março de 1998; Bethesda, MD).

D. Avaliação de Segurançã: Eventos adversos, dados de laboratórios, e sinais vitais foram avaliados através do estudo. Pacientes foram monitorados de perto para sinais de infecção, malignância, e reação imunológica. Tratamento-emergência de EAs foi definido como aqueles eventos que ocorreram entre a semana os primeiros 45 dias após a última dose da droga de estudo não perdida ou dia 1 antes da primeira dose de re-tratamento (para aqueles pacientes que continuaram na semana 36 de triagem).

E. Análise Estatística: O tamanho da amostra foi calculado utilizando nQuery Advi- sor® 4.0 (Statistical Solutions, Saugus, MA). Assumindo que 15% dos pacientes no grupo placebo podem alcançar uma resposta PASI 75 na semana 12, os idealizadores do estudo determinaram que um tamanho de amostra de 26 em cada grupo de dosagem pode ser a- dequado para detectar pelo menos 45% de diferença a partir do grupo tratado utiliando o teste exato de Fisher com 90% de potência em um nível de 0,05 2-lados de significância. O estudo foi desenhado para compreender aproximadamente 180 pacientes, com 30 pacientes em cada grupo.

A população com intenção de tratar incluiu todos os pacientes que foram aleatórios na semana o e receberam pelo menos 1 injeção da droga em estudo; esta população foi utilizada para a análise de eficácia. Todos os testes foram feitos em σ=0,05. Inserção dos não responssivos foi utilizada para todas as análises de eficácia; qualquer paciente com uma perda do índice de PASI ou AGM em qualquer visita foi considerado um não responssi- vo naquela visita. Para avaliar o impacto dos dados perdidos, análises de sensibilidade dos dados na semana 12 foram completadas utilizando o método da última observação realizada adiante. A análise primária da resposta PASI 75 na semana 12 foi feita utilizando a seguinte ordem seqüencial para ajustar para multiplicidade: 200 mg semanalmente versus placebo, 200 mg cos versus placevo, 100 mg cos versus placebo, 200 mg χ 4 versus placebo, e 200 mg χ 1 versus placebo. A diferença de tratamento entre cada grupo tratado com ABT-874 e o grupo placebo para mudança da média de porcentagem no índice PASI foi avaliado utili- zando análise de variância, com índice PASI de linha de base e grupo de tratamento como fatores. As análises de segurança foram conduzidas utilizando a população segura, que in- cluiu todos os pacientes que receberam pelo menos uma injeção da droga em estudo.

II. Resultados

A.Pacientes: um total de 180 pacientes foram alistados aleatoriamente para 1 de 6 grupos de tratamento (Figura 1). A maioria dos pacientes (76,7% dos pacientes tratados com placebo e 98% de todos os pacientes do grupo de tratamento com ABT-874) completou a porção de 12 semanas do estudo.

Pacientes foram bem balanceados entre os grupos de tratamento com respeito às características demográficas e atividade da doença (tabela 1). Pacientes foram predominan- temente machos (74,4%) e brancos (92,2%). Média de envolvimento ASC foi 25% e a média de Índice PASI foi 18,8.

B. Eficácia: A porcetangem de pacientes alcançanado o ponto primário de resposta PASI75 na semana 12 foi estatisticamente significantemente maior (p<0,001) em todos os grupos de tratamento com ABT-874 (200 mg χ 63,3%, 19 de 30; 100 mg cos: 93,3%, 28 de 30; 200 mg χ 4: 90,0%, 27 de 30; 200 mg cos: 93,3%, 28 de 30; 200 mg semanalmente:

90,0% 27 de 30) comparados com placebo (3,3%, 1 de 30). Para a relativamente curta du- ração desta triagem, respostas PASI 75 em todos os grupos de tratamento ABT-874 foram similares com a excessão do grupo de tratamento 200 mg χ 1 tratamento (Figura 2).

Uma análise do subgrupo por demografia (sexo, idade, raça, e peso), característi- cas da doença de base (história da artrite psoriática, ASC, e índice PASI), e terapia de base para psoríase dentro de 12 meses de receber o tratamento do estudo (biológico e não bioló- gico sistêmico, tópico e fototerapia) demonstrou que os pacientes tratados com ABT-874 dentro de vários subgrupos consistentemente alcançaram altos níveis de resposta PASI 75 na semana 12.

Quase 100% dos grupos de dosagem ABT-874 mais altas chegaram a pelo menos uma resposta PASI 50 na semana 12 (200 mg χ 1: 76,7%, 23 de 30; 100 mg cos: 100,0%, 30 de 30, 200 gm χ 4: 96,7%, 29 de 30; 200 mf cos: 96,7%, 29 de 30; 200 mg semanalmen- te: 100,0%, 30 de 30; placebo: 16,7%, 5 de 30; p<0,001 para cada comparação com place- bo). A porcetagem de pacientes que alcançaram pelo menos uma resposta PASI 90 na se- mana 12 foi estatisticamente significantemente meior (p<0,001) em todos menos 1 (200 mg x1) dos grupos de tratamento ABT-874 quando comparados com placebo, como segue: 200 mg x1: 16,7%, 5 de 30; 100 mg cos: 53,3%, 16 de 30; 200 mg x4: 63,3%, 19 de 30; 200 mg cos: 76,6%, 23 de 30; 200 mg semanalmente: 53,3%, 16 de 30; e placebo: 0%, 0 de 30. Em adição, na semana 12, significantemente mais (p<0,001) pacientes em todos os grupos de tratamento ABT-874 tiveram conquistadas uma taxa de AGM limpa ou mínima comparada com pacientes no grupo placebo, como segue: 200 mg χ 50,0%, 15 de 30; 100 mg cos: 83,3%, 25 de 30; 200 mg x4: 73,3%, 22 de 30; 200 mg cos: 86,7%, 26 de 30; 200 mg sema- nalmente: 86,7%, 26 de 30; versus placebo: 3,3%, 1 de 30.

A porcentagem de pacientes alcançando o ponto primário da resposta PASI 100 na semana 12 foi estatisticamente significantemente maior (p<0,001) nos seguintes grupos de tratamento com ABT-874 (200 mg cos:46,7%, 14 de 30; 200 mg semanalmente: 36,7%, 11 de 30, comparado com placebo (0%, 0 de 30).

Resposta ao ABT-874 foi rápida. A média de porcentagem melhorada nos índices PASI a partir da linha de base aumentou ao longo do tempo para todos os grupos de trata- mento ABT-874 (Figura 3) e foram estatisticamente significantemente maiores para cada grupo de tratamento ABT-874 comparado como placebo em cade ponto (p<0,001, exceto para o grupo 100 mg cos na semana 1, p=0,023).

C. Segurança: Terapia com ABT-874 foi geralmente bem tolerada (Tabela 2). Um paciente (0,7%) tratado com ABT-874 descontinuou o estudo devido a uma descoloração localizada na pele; 2 (6,7%) pacientes tratados com placebo descontinuaram o estudo, 1 por artropatia psoriática e 1 por câncer de ovário. Dois (1,1%) pacientes experimentaram sérios efeitos adversos (EAs); 1 paciente tratado com placebo foi diagnosticado com câncer de ovário no dia 37, e 1 paciente tratado com ABT-874 (200 mg, x1) foi diagnosticado com cos- tocondrite no dia 10. Nenhum paciente experimentou infarto do miocárdio ou cerebral, e não houve mortes.

Pacientes recebendo qualquer dose de ABT-874 foram significantemente (0=0,033) mais provavelmente que pacientes recebendo placebo para experimentar um AE pelo me- nos possivelmente relacionado a droga de estudo (ABT-874: 36,0%, 54 de 150; placebo: 10,0%, 3 de 30; tabela 2); a maioris desses EAs foram relacionados ao sítio de injeção (rea- ção no sítio de injeção, eritema, prurido ou irritação).

A maioria dos EAs foi leve (EAs leves ocorreram em 46,0% [69 de 150] de pacien- tes tratados com ABT-874 e 30,0% [9 de 30] paciente tratados com placebo). O AE mais comum foi reação no local de injeção, ocorrendo em 16,7% (25 de 150) dos pacientes trata- dos com qualquer dose de ABT-874 (nenhum relato de reações no sítio de injeção para pa- cientes tratados com placebo; p=0,028, tabela 3). Não existiram diferenças estatisticamente significantes entre as incidências de outros EAs em pacientes tratados com ABT-874 com- parados com pacientes tratados com placebo. Os próximos mais freqüentemente EAs repor- tados foram nasofaringite e infecção do trato respiratório superior.

EAs infecciosos foram reportados por 32,8% (59 de 180) de todos os pacientes (placebo: 23,3%, 7de 30; todos os pacientes tratados com ABT-874, 34,7%, 52 de 150). Os EAs infecciosos mais comuns reportados para qualquer grupo de tratamento ABT-874 foram nasofaringite (12,0%, 18 de 150), infecção do trato respiratório superior (10,7%, 16 de 150), e bronquite e infecção viral (ambos 2,7%, 4 de 150). Nenhum EAs sério foi reportado.

Dois pacientes reportaram malignâncias durante o estudo. Um paciente tratado com placedo foi diagnosticado com câncer de ovário, que foi ocorrido como dia 129. Um paciente tratado com ABT-874 (200 mg x4) foi diagnosticado com um câncer de pele não melanoma (carcinoma celular escamoso) que foi removido no dia 133. O histórico médico para estes pacientes incluíram remoção de um crescimento de pele benigno em Março de 2005.

Não houve hematologia clinicamente significante, químico (incluindo concentrações de glicosa sangüínea), ou mudanças de sinais vitais comparados com placebo. <table>table see original document page 102</column></row><table> <table>table see original document page 103</column></row><table> Tabela 2: Resumo dos eventos adversos emergentes do tratamento clinico

<table>table see original document page 104</column></row><table> <table>table see original document page 105</column></row><table> <table>table see original document page 106</column></row><table> <table>table see original document page 107</column></row><table> III. Conclusão

A triagem de fase II, multicentro, aleatória, duplo-cega, controlada com placebo descrita neste Exemplo demonstrou estatisticamente e clinicamente significância de eficácia do ABT-874 no tratamento de placa psoriática crônica moderada a severa. Com a excessão do grupo de tratamento ABT-874 200 mg χ 1, 90% ou mais de pacientes em todos os grupos de tratamento com ABT-874 alcançaram PASI 75 ou maior na semana 12, comparado com 3,3% de pacientes tratados com placebo. Mesmo no grupo que recebeu somente 1 dose da droga de estudo (200 mg x1), uma maioria (63,3%) de pacientes alcançara pelo menos PASI 75 na semana 12. Em adição, quase 100% dos pacientes tratados com ABT-874 al- cançaram PASI 50 ou mais, que é considerado ser uma melhora clínica significante (Carlin CS, Feldman SR, Jrueger JG, Menter A, Krueger GG. J Am Acad Dermatol 2004; 50: 859- 66) na semana 12. Os resultados para outros pontos secundários tais como PASI 90 e AGM de limpo a mínimo, foram consistentes com e deu suporte a análise de aficácia primária.

Resposta ao ABR-874 foi rápida. Separação estatisticamente significante entre pa- cientes tratados com placebo- e ABT-874 ocorreu tão precoce como na semana 1 para a média de porcentagem de melhoria nos índices PASI. Melhoria foi sustentada pelas 12 se- manas de duração da triagem, mesmo para pacientes nos grupos de dosagem ABT0874 200 mg x1 e 200 mg x4.

ABT-874 foram bem tolerados, e mais EAs foram levem. Embora pacientes tratados com ABT-874 foram significantemente mais provavelmente para experimentar um AE pelo menos possivelmente relacionado a droga de estudo, a maioris desses foram EAs relacio- nados ao sítio de injeção (reação ao sítio de injeção, eritema, prurido, ou irritação). Não e- xiste associação entre uma dose aumentada do ABT-874 e uma incidência aumentada de EAs. DE nota, não existiu infartos do miocárdio ou cerebral.

Eventos imunológicos relacionados são de particular interesse para pacientes rece- bendo anticorpos anti-IL-12/23. Os mais freqüentes EAs infecciosos relatados foram nasofa- ringite, infecção do trato respiratório superior, bronquite, e infecção viral. Não existiu EAs infecciosos sérios relatados durante a duração desta triagem. Das 2 malignâncias diagnosti- cadas durante o estudo, câncer de ovário foi diagnosticado em um paciente tratado com placebo, e câncer de pele não melanoma foi diagnosticado em um paciente tratado com ABT-874 que tinha uma história de um crescimento de pele benigno.

Em resumo, ABT-874 demonstrou benefício estatisticamente e clinicamente signifi- cante para o tratamento de pacientes com placa psoriática crônica moderada a severa e foi bem tolerado.

Exemplo 5: Manutenção de Resposta com o Anticorpo Monoclonal Inteiro IL-12/IL- 23 Humano, ABT-874, No Tratamento de Placa Psoriática Moderada a Severa

Adultos com Ps afetando ≥ 10% de área de superfície corporal (ASC) e um índice PASI ≥ 12 foram eleitos para este estudo de 12 semanas, duplo-cego, controlado por place- bo. Pacientes foram aleatoriamente para 1 de 6 braços:

1) 100 mg de ABT-874 a cada outra semana (cos) por 12 semanas;

2) uma dose de 200 mg de ABT-874 na semana 0;

3) 200 mg de ABT-874 a cada semana por 4 semanas;

4) 200 mg de ABT-874 cos por 12 semanas;

5) 200 mg de ABT-874 a cada semana por 12 semanas; ou

6) placebo.

O ponto primário foi uma resposta ≥ PASI75 na Semana 12. Pacientes que encon- traram o ponto primário entraram na fase cega/re-tratamento na semana 36. Tratamento com a droga de estudo foi descontinuado, e pacientes foram monitorados para índice PASI em vários tempos durante as 36 semanas que se seguiram ao período, para respostas PASI 50, PASI 75 e PASI 90. Manutenção da resposta PASI foi avaliada até a Semana 24.

Na semana 12, as porcentagens de pacientes com ≥ PASI75 foram estatisticamente significantemente maior para pacientes em cada um dos 5 braços ABT-874 vs. Placebo (Ta- bela 4). Na semana 24, porcentagens substanciais de responssivos ao PASI 75 nos braços de tratamentos ativos mantiveram pelo menos um índice PASI de PASI áO. Ainda, porcen- tagens substanciais de responssivos PASI 75 nos braços de tratamentos ativos tiveram também mantiveram pelo menos um índice PASI de ≥PASI 75, bem como um índice PASI de ≥PASI 90 (Tabela 4 e Figuras 4A-C). A porcentagem de pacientes mantendo uma res- posta PASI 75 ao longo do tempo durante o período de 24 semanas é revelado na Figura 4D.

Tabela 4: Eficácia Semanal do ABT-874 <table>table see original document page 110</column></row><table>

*p<0.001 vs. placebo, NRI.

Em conclusão, ABT-874 foi significantemente mais eficaz que placebo no tratamen- to de placa Pd moderado a severa. Porcentagens substanciais de PASI 75 responssivos mantiveram uma resposta de >PASI 50, ^3ASI 75, e ^3ASI 90 na semana 24, seguindo a descontinuação da terapia ativa.

EQUIVALENTES

Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar utilizando não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes para modalidades específicas da invenção descritas aqui. Tais equivalentes são tencionados serem compreendidos pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de com- preender os passos de: (i) selecionar um paciente que esteja sofrendo de psoríase crônica; e (ii) administrar ao paciente um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mes- mo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23; assim tratando psoríase crônica no paciente.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido paciente tem tido um diagnóstico clínico de psoríase por pelo menos 6 meses.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido paciente tem tido placa psoriática estável por pelo menos 2 meses.

4. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de com- preender os passos de: (i) selecionar um paciente que não tenha tido uma condição selecionada a partir do grupo consistindo de prévia exposição à terapia anti-IL-12 sistêmica ou biológica; psoríase não em placa; inabilidade de descontinuar terapias tópicas de psoríase pelo menos 2 sema- nas antes do tratamento; fototerapia de luz ultravioleta B pelo menos 2 semanas antes do tratamento; fototerapia de luz ultravioleta-psoraleno pelo menos 4 semanas antes do trata- mento; terapias sistêmicas pelo menos 4 semanas antes do tratamento; terapias biológicas pelo menos 12 semanas antes do tratamento; ingestão requerida de corticosteróides orais ou injetáveis durante o tratamento; uma exacerbação da asma requerendo hospitalização nos 10 anos anteriores à seleção; uma infecção ou fatores de risco para infecção severa; uma história de malignâncias outra que carcinoma celular basal tratado com sucesso; e uma história de reação imunológica principal para um agente contendo imunoglobulina G; e (ii) administrar ao paciente um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mes- mo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23; assim tratando psoríase no paciente.

5. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de com- preender os passos de: (i) selecionar um paciente que não tenha tido vacinação com um agente viral vivo dentro de 1 mês; e (ii) administrar a um paciente um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é capaz de ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23; assim tratando psoríase no paciente.

6. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de com- preender os passos de: (i) administrar um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é ca- paz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23 a um paciente, (ii) monitorar o paciente para um resultado laboratorial anormal clinicamente signifi- cante selecionado a partir do grupo consistindo de aspartato transaminase ou alanina tran- saminase > 5 vezes o limite superior do normal; bilirrubina total sérica > 3 vezes o limite su- perior do normal; creatinina sérica > 3 vezes o limite superior do normal; creatinina fosfoqui- nase > 5 vezes o limite superior do normal; hemoglobina < 8 g/dL; contagem de célula san- güínea branca < 2x109/L; e contagem de plaqueta <7 5 χ 109/L; (iii) administração descontinuada do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, em um paciente em que o resultado laboratorial anormal clinicamente significante é detectado; assim tratando psoríase no paciente.

7. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção igadora de antígeno do mesmo, é administrado quinzenalmente.

8. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Ligadora de antígeno do mesmo, é administrado se- manalmente.

9. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 200 mg.

10. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 100 mg.

11. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é capaz de se ligar ao epítopo da subunidade p40 quando a subunidade p40 está ligada à subunidade p35 da IL-12.

12. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é capaz de se ligar ao epítopo da subunidade p40 quando a subunidade p40 está ligada à subunidade p19 da IL-23.

13. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Ligadora de antígeno do mesmo, é capaz de se ligar ao epítopo da subunidade p40 quando a subunidade p40 está ligada à subunidade p35 da IL-12 e quando a subunidade p40 está ligada a uma subunidade p19 da IL-23.

14. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que a psoríase crônica é placa psoriática crônica.

15. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 4-6, CARACTERIZADO pelo fato de que a psoríase é psoríase crônica.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a psoríase crônica é placa psoriática crônica.

17. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração ao paciente de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é capaz de ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23, em que o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 90 por um período prolongado se- guindo a administração inicial do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno, assim tratando psoríase no paciente.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o período prolongado é pelo menos 12 semanas.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado quinzenalmente.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado semanalmente.

21. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é administrado em uma dose única.

22. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 200 mg.

23. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 100 mg.

24. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a psoríase é psoríase crônica.

25. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração ao paciente de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23 ao paciente, em que o paciente mantém uma taxa de AGM limpa ou mínima por um período prolongado seguindo administração inicial do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno, assim tratando psoríase no paciente.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o período prolongado é pelo menos cerca de 12 semanas.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado quinzenalmente.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado semanalmente.

29. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose única.

30. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 200 mg.

31. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 100 mg.

32. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a psoríase é psoríase crônica.

33. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração ao paciente de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23 ao paciente, em que o paciente exibe um índice PASI aumentado por cerca de 8 semanas se- guindo a administração inicial do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, as- sim tratando psoríase no paciente.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente exibe um índice PASI aumentado por cerca de 4 semanas seguindo a adminis- tração inicial do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente exibe um índice PASI aumentado por cerca de 2 semanas seguindo a adminis- tração inicial do anticorpo, òu porção Iigadora de antígeno do mesmo.

36. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente exibe um índice PASI aumentado por cerca de 1 semana seguindo a administra- ção inicial do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo.

37. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado quinzenalmente.

38. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado semanalmente.

39. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose única.

40. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 200 mg.

41. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 100 mg.

42. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a psoríase é psoríase crônica.

43. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração ao paciente de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23, em que o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 100 por um período prolongado seguindo a administração inicial do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno, assim tratan- do psoríase no paciente.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o período prolongado é pelo menos cerca de 12 semanas.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado quinzenalmente.

46. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado semanalmente.

47. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 200 mg.

48. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a psoríase é psoríase crônica.

49. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração ao paciente de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23, em que o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 50 por um período prolongado se- guindo a descontinuação da administração do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno, assim tratando psoríase no paciente.

50. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração ao paciente um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23, em que o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 75 por um período prolongado se- guindo a descontinuação da administração do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno, assim tratando psoríase no paciente.

51. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração ao paciente de um anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar a um epítopo da subunidade p40 da IL-12 e/ou IL-23, em que o paciente mantém pelo menos uma resposta PASI 90 por um período prolongado se- guindo a descontinuação da administração do anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno, assim tratando psoríase no paciente

52. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 49-51, CARACTERIZADO pelo fato de que o período prolongado é pelo menos cerca de 12 semanas.

53. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 49-51, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é administrado por pelo menos cerca de 12 semanas.

54. Método, de acordo com quaisquer reivindicações 49-51, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado quin- zenalmente.

55. Método, de acordo com quaisquer reivindicações 49-51, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado sema- nalmente.

56. Método, de acordo com quaisquer reivindicações 49-51, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose única.

57. Método, de acordo com quaisquer reivindicações 49-51, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 200 mg.

58. Método, de acordo com quaisquer reivindicações 49-51, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou porção Iigadora de antígeno do mesmo, é administrado em uma dose de cerca de 100 mg.

59. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 49-51, CARACTERIZADO pelo fato de que a psoríase é psoríase crônica.

60. Método de tratar psoríase em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração de um anticorpo direcionado contra a IL-12 humana e IL-23 humana para o paciente em um regime de dose quinzenal, tal que a psoríase é tratada.