BRPI0719290A2 - Fusões de receptor de fgf e fc solúveis modificadas com melhor atividade biológica - Google Patents

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FUSÕES DE RECEPTOR DE FGF E Fc SOLÚVEIS MODIFICADAS COM MELHOR A- TIVIDADE BIOLÓGICA".
Campo da Invenção e Introdução 5 A presente invenção refere-se a fusões de receptor de FGF e Fc
solúveis modificadas compreendendo uma fusão de um fragmento ou domí- nio solúvel do receptor de FGF com uma região Fc de uma imunoglobulina, com melhor atividade biológica, a composições que as contenham e a um método de produção dessas moléculas de fusão de receptor de FGF e Fc 10 solúveis modificadas. Particularmente, as fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas têm melhor atividade antiangiogênica e atividades de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo antitumoral, a saber, ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpo) e/ou CDC (ci- totoxicidade dependente de complemento), e são, portanto, úteis no trata- 15 mento de câncer, tumores metastáticos e para reduzir o crescimento de tu- mores em um sujeito. A invenção também refere-se a métodos de inibição do crescimento de tumores e métodos para o tratamento ou prevenção de situações patológicas incluindo, mas não limitadas a, câncer de mama, me- lanoma, leucemia, metástases cerebrais, câncer renal, melanoma primário, 20 câncer de cólon primário, câncer de bexiga primário, hemangioma infantil, câncer de ovário, câncer de próstata e câncer de pulmão.
Antecedentes e Relevância da Invenção
Angiogênese, isto é, a formação de novos vasos sanguíneos a partir de pré-existentes, envolve uma coordenação completa de proliferação 25 de células endoteliais, migração, degradação de membranal basal e organi- zação de neovasos (Ji et al., 1998, FASEB J. 12:1731-1738). A liberação descontrolada local de fatores de crescimento angiogênico e/ou alterações da produção de inibidores angiogênicos naturais, com conseqüente altera- ção do equilíbrio angiogênico (Hanahan et al, 1996, Cell. 86: 353-64) são 30 responsáveis pela proliferação descontrolada de células endoteliais que o- corre durante a neovascularização de turmores e em doenças dependentes de angiogênese (Folkman, 1995, Nat. Med. 1 :27-31). Foram identificados inúmeros indutores naturais de angiogêne- se, incluindo membros da famílica de fatores de crescimento endotelial vas- cular (VEGF), angiopoietinas, fator de crescimento transformador α e β (TGF-α e -β), fatores de crescimento derivados de plaqueta (PDGF), fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucinas, quimiocinas, e os membros da fa- mília de fatores de crescimento de fibroblasto (FGF). Esses potentes fatores angiogênicos frequentemente são superexpressados por tecidos tumorais (Presta, 2005, Cytokine & Growth Factors Reviews. 16: 159-178; Grose, 2005, Cytokine & Growth Factors Reviews. 16: 179-186). Da fator, FGFs e, mais particularmente, FGF2 estão superexpressados em inúmeros cânceres humanos, incluindo melanoma (Halaban, 1996, Semin Oncol. 23:673-81; Hanada, 2001 , Cancer Res. 61: 5511-5516), leucemia (Krejci et al, 2001 Leucemia. 15:228-37, Bieker et al, 2003, Cancer Res. 63: 7241-7246), cân- cer renal (Hanada, 2001 , Cancer Res. 61: 5511-5516), câncer de cólon (Tassi, 2006, Cancer Res. 66:1191-1198), câncer de ovário (Whitworth et al,
2005, Clin Cancer Res. 11:4282-4288, Gan et al, 2006, Pharm Res. 23:1324- 31), câncer de próstata (Aigner et al, 2002 Oncogene, 21:5733-42; Kwabi- Addo et al, 2004, Endocr Relat Cancer. 11:709-24) e câncer de pulmão (Ta- kanami et al, 1996, Pathol Res Pract. 192:1113-20; Volm et al, 1997, Anti- 20 cancer Res. 17:99-103; Brattstrom et al, 1998, Anticancer Res. 18: 1123- 1127). Além disso, a superexpressão de FGF2 pode estar correlacionada com uma quimiorresistência em certos cânceres, incluindo cânceres de be- xiga, mama, cabeça e pescoço (Gan et al, 2006, Pharm Res. 23:1324-31). Com relação a membros da família FGF, como FGFs secretadas por células 25 tumorais têm afinidades pelas cadeias colaterais de glicosaminoglicano de superfície celular e proteoglicanos de matriz, esses FGFs secretados são mais provavelmente seqüestrados por células tumorais próximas, formando reservatórios de FGF. Isso torna o FGF particularmente interessante como uma boa estratégia para direcionar uma molécula ativa que precise de uma 30 molécula alvo expressada de maneira estável e facilmente acessível. Vários produtos à base de anticorpos são atualmente usados como fármacos te- rap~euticos, e vários anticorpos monoclonais (mAbs) estão atualmente a- provados em várias áreas terapêuticas, como oncologia, inflamação, doen- ças infecciosas e doenças cardiovasculares. Esses mAbs induzem a morte de células tumorais por múltiplos mecanismos, incluindo recrutamento do sistema imune (Harris, 2004, Lancet Oncol, 5: 292-302). A fração Fc de mAbs é responsável por essas funções efeturas mediadas pelo sistema i- mune, que incluem dois mecanismos principais: Citotoxicidade Mediada por Células Dependente de Anticorpo (ADCC) e Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC). ADCC ocorre quando um mAb primeiro se liga medi- ante seu sítio de ligação a antígeno a seu alvo em células tumorais e, então, a parte Fc é reconhecida por receptores Fc específicos (FcR) em células efetoras (isto é, NK, neutrófilos, macrófagos e outros) que atacam a célula alvo. CDC é um processo em que uma cascata de diferentes proteínas do complemento se tornam ativadas quando um mAb se liga a C1q, levando à formação de C3b na superfície de células tumorais revestidas com anticor- pos próximo ao sítio de ativação do complemento. A presença de C3b con- trola a formação do complexo de ataque a membrana C5-C9 que pode ser inserido na membrana para Iisar células tumorais (Sharkey, 2007, CA Can- cer J CHn, 56: 226-243). A capacidade de mAbs de estimular ADCC depen- de de seu isotipo. Anticorpos IgGI e lgG3 se ligam fortemente a FcRs, ao passo que anticorpos lgG4 e lgG2 se ligam fracamente. A capacidade de CDC do mAb também depende do isotipo de mAb. lgG3 e, em menor medi- da, IgGI são os isotipos mais eficazes para estimular a cascata clássica do complemento. mAbs lgG2 são menos eficientes na ativação da cascata do complemento, ao passo que lgG4 é incapaz de fazê-lo (Strome, 2007, The Oncologist, 12:1084-1095).
O uso de uma proteína de fusão que possa ter, como anticorpos, uma funcionalidade dupla com uma parte de ligação exibindo um alvo espe- cífico e uma parte efetora capaz de induzir a Iise de células alvo por recru- tamento do sistema imune, é um aspecto dessas estratégias terapêuticas. 30 Além disso, para ser útil em terapia, essa molécula precisaria ter proprieda- des farmacocinéticas PK vantajosas. A fração Fc pode aumentar de maneira detectável a meia-vida sérica da fusão receptor de FGF e Fc solúvel modifi- cada, mas ainda há necessidade de uma proteína de fusão com uma meia- vida sérica mais longa. Finalmente, se essa proteína de fusão tiver de ser usada como um fármaco, é necessário que seja produzida prontamente, efi- cientemente e com produtividade apropriada.
5 Assim, há necessidade de uma proteína de fusão com atividades
ADCC e/ou CDC que tenha como alvo FGF para o tratamento câncer, tumo- res metastáticos e para reduzir o crescimento de tumores em um sujeito, com melhores características PK, e que possa ser produzida eficientemente.
Os requerentes descobriram agora que proteínas de fusão solú- veis entre a parte receptora FGF (fração de ligação ou busca de alvo) e a parte Fc (fração de função efetora) (sFGFR-Fc) que sejam modificadas para ter um perfil de glicanos particular têm, de fato, atividades biológicas subs- tancialmente melhores, incluindo atividades ADCC e/ou CDC, e podem, por- tanto, ser usadas como fármacos antiangiogênicos e antitumorais eficazes, para o tratamento de crescimento celular descontrolado ou câncer. Essas proteínas de fusão solúveis modificadas têm propriedades PK vantajosas, devido a sua taxa de sialilação, e podem ser produzidas com produtividade apropriada e agregação mínima, por causa de seu padrão de glicosilação. Sumário da Invenção A presente invenção refere-se, portanto, a um receptor de FGF
Fc solúvel modificado compreendendo uma fusão de um fragmento ou do- mínio solúvel de um receptor de FGF com uma região Fc de uma imunoglo- bulina, em que pelo menos o 5o sítio de N-glicosilação da fração receptor de FGF está ocupado, e em que no máximo 45% dos N-glicanos da fração re- 25 ceptor de FGF não têm nenhum grupo sialila. Além disso, de acordo com uma modalidade preferida adicional da invenção, os 3o, 4o, 6o e 7o sítios de N-glicosilação da fração receptor de FGF estão ocupados. De preferência, todos os sítios de N-glicosilação estão ocupados. Em uma modalidade prefe- rida adicional, o número médio de ácidos siálicos por N-glicano na fração 30 receptor de FGF das fusões da invenção é de pelo menos 0,9; ainda mais preferivelmente, é de pelo menos 1,2. Cada molécula de N-glicano da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada de acordo com a presente in- venção compreende 3 resíduos de manose, em média 1,5 a 3,0 resíduos de galactose, 3,5 a 5 de N-acetilglucosamina e 0,6 a 1 resíduos de fucose. A presente invenção também refere-se a fusões de receptor de FGF e Fc solú- veis modificadas compreendendo uma fusão de um fragmento ou domínio 5 solúvel de um receptor de FGF com uma região Fc de uma ímunoglobulina, em que todos os sítios de N-glicosilação estão ocupados, e em que no má- ximo 45% dos N-glicanos da fração receptor de FGF não têm nenhum grupo sialila, e em que o N-glicano da região Fc é 60 a 100% fucosilado. Em uma modalidade, o fragmento ou domínio solúvel do receptor de FGF é o domínio 10 solúvel ou extracelular do receptor de FGF 1 (sFGFRI) ou do receptor de FGF 2 (sFGFR2). Em outra modalidade, o fragmento ou domínio solúvel do receptor de FGF é o domínio solúvel ou extracelular do receptor de FGF 1 isotipo ou variante Illc (sFGFRI(IIIc)) ou do receptor de FGF 2 isotipo Illc (sFGFR2(lllc)).
De acordo com uma modalidade preferida, a fusão de receptor
de FGF e Fc solúvel modificada é codificada por um polinucleotídeo com a seqüência de nucleotídeos exposta na SEQ ID NO: 1 , ou um polinucleotídeo com pelo menos 80% de identidade com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferida adicional, a fusão de receptor 20 de FGF e Fc solúvel modificada da invenção tem a seqüência de aminoáci- dos exposta na SEQ ID NO : 2 ou uma seqüência com pelo menos 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a seqüência exposta na SEQ ID NO:
2.
A fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção tem atividade ADCC e/ou CDC e é, portanto, útil para o tratamento de doen- ças como câncer. A presente invenção também refere-se a composições farmacêuticas compreendendo essas fusões de receptor de FGF e Fc solú- veis modificadas.
A presente invenção também refere-se à combinação da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada com um agente quimioterápico ou um agente bioterápico com propriedades antitumorais e/ou antiangiogêni- cas. Outro objeto da presente invenção é um método de tratamento de câncer ou um método de prevenção ou redução do crescimento e volume tumorais e de tumores metastáticos compreendendo a administração a um sujeito da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da presente invenção em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
Breve Descrição das figuras
As figuras IAeB mostram mapas dos vetores de expressão pa- ra SIAT6 (ST3GAL3) e B4GT1 (B4GALT1), respectivamente.
As figuras 2A e B mostram as seqüências de ácido nucléico (SEQ ID No. 9) e aminoácidos (SEQ ID No. 10) de B4GT1(B4GALT1) para expressão em pXL4551.
As figuras 3A e B mostram as seqüências de ácido nucléico (SEQ ID No. 11) e aminoácidos (SEQ ID No. 12) de SIAT6 (ST3GAL3) para expressão em pXL4544.
A figura 4A corresponde à seqüência de ácido nucléico de sFG-
FR2-Fc para expressão em pXL4410, pXL4429 ou pXL4636 (SEQ ID No. 1), a Fig 4B à seqüência de aminoácidos de sFGFR2-Fc (os sítios de N- glicosilação estão indicados em negrito) codificada por pXL4410 pXL4429 ou pXL4636 (SEQ ID No. 2), a Fig 4C à seqüência de aminoácidos de sFGFR2 20 (SEQ ID No. 4), a Fig 4D à seqüência de aminoácidos de Fc (SEQ ID No. 6), a Fig 4E à seqüência de aminoácidos do elo, e a Fig 4F à seqüência de ami- noácidos do peptídio de sinal (SEQ ID No. 8). É o peptídio de sinal descrito para interleucina-2. Observou-se que a fusão desse peptídio a montante da seqüência representada pela SEQ ID No.2 leva a uma proteína secretada 25 com uma seqüência de aminoácidos N-terminais homogênea.
A figura 5 é uma representação esquemática da estratégia usa- da para construir pXL4636, que codifica sFGFR2-Fc e Glutamina Sintetase.
As figuras 6A e B mostram mapas dos vetores de expressão pXL4429 para sFGFR2-Fc e DHFR e pXL4417 que codifica o gene de resis- tência à neomicina.
A figura 7 é um gráfico mostrando a correlação entre o número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFGFR2 e a depuração de sFG- FR2-Fc no sangue - Razão ótima > 1,2. Razão preferida > 0,9.
A figura 8 mostra SDS-PAGE (condições não redutoras) of 1 μg de sFGFR2-Fc incubado na ausência (-) ou na presença (+) de PNGase F. M: marcador de peso molecular.
A figura 9 mostra a posição de N-glicanos e a numeração no dí-
mero sFGFR2-Fc. A numeração começa a partir da seqüência de aminoáci- dos N-terminais de FGFR2 (FGFR2JHUMAN), de modo que a posição N1 corresponde a Asn83, N2 a Asn123, N3 a Asn228, N4 a Asn241 , N5 a Asn 265, N6 a Asn 297, N7 a Asn318, N8 a Asn331. A posição N297 correspon- de à posição Asn no Fc humano (lgG1).
A figura 10 é um gráfico mostrando a cinética de desapareci- mento da proteína sFGFR2-Fc (quadrados) no sangue no tempo até 72 ho- ras.
A figura 11 mostra a quantidade de recuperações de proteína sFGFR2-Fc no plasma e fígado expressa em % da dose injetada.
A figura 12 é um gráfico da análise do volume do tumor A549 após tratamento até o dia 40 (100 μg/camundongo/admin: triângulos; 300 μg/camundongo/admin: quadrados; 500 μg/camundongo/admin: círculos fe- chados; controle PBS: círculos abertos).
A figura 13 é um gráfico da análise do peso do tumor A549 após
tratamento no dia 40.
A figura 14 é um gráfico da análise do volume do tumor H460 após tratamento até o dia 22 (grupo tratado: círculos fechados; grupo de controle PBS: círculos abertos).
A figura 15 é um gráfico da análise do peso do tumor H460 após
tratamento no dia 22.
A figura 16 é um gráfico da avaliação da atividade ADCC in vitro de sFGFR2-Fc em células tumorais H460 e A549.
A figura 17 mostra gráficos da análise do volume do tumor A549 quando implantado em três cepas de camundongos, isto é, SCID (figura 17A), NOD/SCID (figura 17B) e SCID/bg (figura 17C), até o dia 41 (sFGFR2- Fc 100 μg/camundongo/admin: diamantes; controle PBS: círculos abertos). A figura 18 mostra gráficos da análise do volume do tumor H460 quando implantado em três cepas de camundongos, isto é, SCID (figura 18A), NOD/SCID (figura 18B) e SCID/bg (figura 18C), até o dia 22 (sFGFR2- Fc 100 ϊμg/camundongo/admin: diamantes; controle PBS: círculos abertos).
5 A figura 19A mostra um mapa do plasmídio que codifica sFG-
FR2-Fc (A265 em Fe), e a figura 19B mostra a seqüência de proteína de sFGFR2-Fc (A265 em Fe) (SEQ ID No. 14). A posição 392 é a posição da mutação no domínio Fc (Asp265Ala) e está representada em negrito.
A figura 20 é um gráfico mostrando a análise do volume do tu- 10 mor H460 quando implantado em cepas de camundongos nus até o dia 23 (círculos abertos: controle PBS; diamantes: sFGFR2-Fc 500 μg/camundongo/admin; quadrado aberto: sFGFR2-Fc (A265Fc) 500 μg/camundongo/admin). **: p<0,01 versus pós-teste Anova e Newman-Keuls de controle).
Descrição Detalhada
Neste relatório, os requerentes refere-sem a artigos de jornal, documentos de patente, referências publicadas, páginas da web, informa- ções de seqüência disponíveis em bases de dados e outras fontes de infor- mações. Aqueles versados na técnica podem usar todo o conteúdo de qual- quer uma das citadas fontes de informações para preparar e usar aspectos desta invenção. Cada uma e todas as fontes de informações citadas são aqui especificamente incorporadas por referência em sua inteireza. Partes dessas fontes podem ser incluídas neste documento conforme permitido ou requerido. Entretanto, o significado de qualquer termo ou expressão especi- ficamente definida ou explicada neste relatório não deve ser modificado pelo teor de qualquer das fontes. A descrição e os exemplos que se seguem são apenas exemplificativos do âmbito desta invenção e do conteúdo deste rela- tório. Aqueles versados na técnica podem imaginar e fazer inúmeras modifi- cações nos exemplos relacionados abaixo, sem sair do âmbito desta inven- ção.
A presente invenção refere-se a fusões de proteínas solúveis compreendendo domínios de receptores de FGF. A invenção engloba gene- ricamente fragmentos, domínios e, particularmente, domínios solúveis ou extracelulares do receptor de FGF. O domínio extracelular do receptor de FGF está ligado a um parceiro de fusão apropriado, como uma unidade Fc de imunoglobulina. Consequentemente, no sentido mais amplo, as fusões 5 com receptor de FGF solúveis modificadas da invenção podem ser proteí- nas, fragmentos, domínios, domínios extracelulares, domínios solúveis e qualquer um desses do receptor de FGF (FGFR) ligados a um parceiro de fusão, particularmente um parceiro de fusão de região Fe.
O requerente descobriu que uma fusão de receptor de FGF e Fc 10 solúvel modificada compreendendo uma fusão de um domínio solúvel de um receptor de FGF com uma região Fc de uma imunoglobulina em que no má- ximo 45% dos N-glicanos não têm nenhum grupo sialila tem propriedades vantajosas. As vantagens do padrão de sialilação da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção incluem um melhor perfil farmaco- 15 cinético e uma melhor resistência à clivagem in vivo.
Tipicamente, N-glicanos são ligados concomitantemente na tra- dução mediante resíduos asparagina (Asn) específicos. A seqüência de con- senso Asn-X-Ser/Thr (em que X é qualquer aminoácido exceto Pro) é es- sencial, mas não suficiente, pelo fato de que a estrutura secundária local 20 pode determinar a adição (Jefferis et al., 2006, Nature Biotechnology 24:1241). Acredita-se que vários fatores sejam responsáveis pelos sítios de N-glicosilação não ocupados (Jones et al., 2005, Biochimica et Biophysica Acta 1726: 121). Vários sítios de N-glicosilação estão presentes nos recepto- res de FGF solúveis da invenção. Por exemplo, há 8 sítios de N-glicosilação 25 no domínio extracelular de FGFR2lllc (veja a figura 9). Os N-glicanos con- têm um núcleo oligossacarídico conservado ligado a Asn. Esse núcleo é composto por três resíduos monossacarídicos manose (Man) e dois N- acetilglucosamina (GlcNAcs). GlcNAcs adicionais normalmente estão ligados em β1,2 ao a6 Man ou a3 Man, ao passo que o ácido N-acetilneuramínico 30 (NeuAca2,6), galactose (Gaipi,4), fucose (Fuca1,6) e GIcNAc bissetor (β 1,4) podem estar presentes ou ausentes (Jefferis et al., 2006, Nature Bio- technology 24: 1241 ). O requerente demonstrou que a presença de um N-glicano no 5o sítio de N-glicosilação a partir da terminação N da fração FGFR confere pro- priedades vantajosas para produtividade e baixa agregação, conforme mos- trado nos Exemplos Experimentais. Em particular, na ausência de glicosila- 5 ção nesse sítio particular, a produtividade cai dramaticamente, ao passo que aumenta a agregação. Além disso, a presença desse N-glicano se mostrou necessária para a ligação a FGF.
A presente invenção refere-se, portanto, a uma fusão de recep- tor de FGF e Fc solúvel modificada compreendendo uma fusão de um domí- 10 nio solúvel de um receptor de FGF com uma região Fc de uma imunoglobu- lina, em que pelo menos o 5o sítio de N-glicosilação da fração receptor de FGF está ocupado, e no máximo 45% dos N-glicanos da dita fração receptor de FGF não têm nenhum grupo sialila.
De acordo com uma modalidade adicional da invenção, os 3o, 4o, 15 6o e 7o sítios de N-glicosilação da fração receptor de FGF estão ocupados. Quando pelo menos 7 dos sítios de N-glicosilação da fração receptor de FGF estão glicosilados, a fusão da invenção tem propriedades ainda melho- res com relação à produtividade e baixa agregação. Assim, em outro aspec- to, a invenção refere-se a uma fusão de um fragmento ou domínio solúvel de 20 um receptor de FGF com uma região Fc de uma imunoglobulina, em que pelo menos 7 sítios de N-glicosilação estão ocupados e no máximo 45% dos N-glicanos da fusão de receptor de FGF e Fc não têm nenhum grupo sialila. Em uma modalidade específica da invenção, todos os sítios de N- glicosilação estão ocupados.
Em outro aspecto, a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel mo-
dificada da invenção tem um número médio de ácidos siálicos por N-glicano da fração receptor de FGF é de pelo menos 0,9, isto é, esse número pode ser 0,9 ou qualquer valor acima de 0,9. Em uma modalidade preferida, a fu- são de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção tem um núme- 30 ro médio de ácidos siálicos por N-glicano de pelo menos 1,2. O requerente descobriu que essa razão assegura uma concentração maximizada no san- gue da fusão com receptor de FGF solúvel da invenção, que seria compará- vel à concentração ótima no sangue encontrada para moléculas de Fe.
A presente invenção também refere-se a uma fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada compreendendo uma fusão de um fragmen- to ou domínio solúvel de um receptor de FGF com uma região Fc de uma 5 imunoglobulina, em que todos os sítios de N-glicosilação estão ocupados, e em que no máximo 45% dos N-glicanos da fração receptor de FGF não têm nenhum grupo sialila, e em que os N-glicanos da região Fc não estão fucosi- lados. Em outra modalidade, a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modi- ficada da invenção está parcialmente fucosilada, por exemplo, O a 60% fuco- 10 silada. Em ainda outra modalidade, a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção está inteiramente fucosilada. Em uma modalidade preferida, a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção está de 60 a 100% fucosilada. Em uma modalidade preferida adicional, cada molécula de N-glicano da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada 15 de acordo com a presente invenção também compreende 3 resíduos de ma- nose, e uma média de 1,5 a 3,0 resíduos galactose, 3,5 a 5 de N- acetilglucosamina por molécula de glicano, e 0,6 a 1 resíduo de fucose.
De acordo com a invenção, a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada se liga ao Iigante FGF com grande afinidade. Por exem- 20 pio, a dita fusão se liga a FGF2 com um valor Kd medido por Biacore™ compreendido entre 1 e 5 nM. Em uma modalidade preferida da invenção, o valor Kd da dita fusão para FGF2 medido por Biacore™ é de cerca de 1,5 nM.
Essas fusões modificadas conforme acima descritas são utilizá- 25 veis como inibidores potentes e terapeuticamente eficazes do crescimento tumoral. De fato, o requerente demonstrou que as fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas da invenção são capazes de inibir o cresci- mento tumoral in vivo. Além do mais, as ditas fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas da invenção são capazes de desencadear resposta 30 ADCC e/ou CDC tanto in vitro, quanto in vivo. Como moléculas mediadores de ADCC e/ou CDC eficazes, esses compostos são particularmente úteis para tratar tumores cancerosos com superexpressão de FGF. As seqüências de FGFR usadas para os compostos de FGFR, comprimento total ou fragmentos de um FGFR, seqüências sintéticas de FGFR, domínios extracelulares, domínios solúveis ou fusões desses podem ser selecionadas de quaisquer seqüências disponíveis ou conhecidas. FGFR pertence à família de receptores da tirosina quinase e à família do superge- ne de imunoglobulinas (lg). Em formas transmembrana do receptor, o domí- nio tirosina quinase é intracelular, e os domínios do tipo Ig são extracelula- res. Tanto as formas transmembrana, quanto secretadas se ligam a FGF. Há pelo menos quatro genes que codificam FGFRs que têm uma estrutura co- mum de duas ou três alças do tipo (Ig) de imunoglobulina extracelular (Igl- Iglll) e um domínio de tirosina quinase intracelular. Também se conhecem produtos de splicing alternativo de éxons que codificam a região extracelular, resultando em múltiplas formas de receptor. A terceira alça do tipo Ig leva a pelo menos três variantes de receptor, e duas formas que atravessam a membrana são produzidas por splicing alternativo de dois éxons (lllb e lllc) que codificam a segunda metade da alça III. Por exemplo, um sítio de polia- denilação seletiva precedendo os éxons Illb e Illc é usado para produzir uma forma solúvel de FGFR1 (IIIa). Em seres humanos e camundongos, a varian- te de splice Igllla de FGFR1 codifica uma proteína que aparentemente não tem nenhum domínio hidrofóbico que atravesse a membrana e pode, portan- to, ser uma forma secretada ou solúvel do receptor. Os compostos de FGFR também podem utilizar seqüências de FGFR1 (locus de proteína no NCBI, NP_075598); FGFR2 (locus de proteína no NCBI, NP_000132); FGFR3 (lo- cus de proteína no NCBI, P22607); e FGFR4 (locus de proteína no NCBI, NP_002002) (Kiefer et al., 1991 , Growth Factors 5:115-127).
Formas solúveis de receptores de FGF, compreendendo os do- mínios extracelulares, também foram discutidos nas patentes norte- americanas n° 5.288.855, 6.656.728, WO 91/00916, WO 92/00999, WO 00/46380, WO 2005/016966, WO 2005/113295, WO 2006/113277, WO 30 2007/014123 e patente europeia 529 076. Os fragmentos, domínios ou do- mínios solúveis ou extracelulares de FGFR conforme usados na invenção podem incluir o fragmento de um FGFR que seja extracelular em sua forma nativa ou consiste total ou parcialmente na forma naturalmente secretada. Além disso, as seqüências de FGFR conforme usadas nesta invenção po- dem ser aquelas especificamente descritas ou relacionadas e seqüências com cerca de 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% de iden- 5 tidade da seqüência de aminoácidos por todo o comprimento da seqüência polipeptídica descrita ou representa, ou com cerca de 95%, 90%, 85%, 80% ou 75% de identidade da seqüência de ácido nucléico no região codificadora de polipeptídio para ácidos nucléicos que codifiquem as seqüências de FG- FR da invenção. O fragmento ou domínio também poderia incluir aminoáci- 10 dos adicionais ou outras regiões do FGFR, contanto que esses aminoácidos adicionais ou regiões não impedissem ou reduzissem significativamente a capacidade do composto de FGFR de ser usado conforme descrito nesta invenção. Um polipeptídio ou proteína de fusão consistindo essencialmente em um domínio ou fragmento de FGFR pode conter outros aminoácidos, 15 contanto que seja retida a capacidade de ser expressado em uma célula de mamífero e se ligar a FGF, e opcionalmente, além disso, contanto que seja retida a capacidade de reduzir o crescimento celular ou reduzir a vasculari- zação.
Em uma modalidade, o fragmento ou domínio solúvel do recep- tor de FGF é o domínio solúvel ou extracelular do receptor de FGF 1 (sFG- FRI ) ou receptor de FGF 2 (sFGFR2).
Os fragmentos de FGFR1 e FGFR2 selecionados podem ter uma ou mais das seguintes mutações: uma deleção N-terminal; de 1-7 ami- noácidos; ou substituição N-terminal; uma deleção da seqüência de alça 1; 25 uma deleção da seqüência de caixa ácida. Polinucleotídeos que codificam mutantes de seqüência de aminoácidos podem ser preparados por vários métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada a sítio), mutagênese por PCR e mutagênese de cassete de um mutante previamente preparado ou de uma 30 versão não mutante da molécula de interesse (veja, por exemplo, Kunkel, 1985, Proc Natl Acad Sci USA 82:488).
Em outra modalidade, o fragmento ou domínio solúvel do recep- tor de FGF é o domínio solúvel ou extracelular do receptor de FGF 1 isotipo Illc (sFGFRI (IIIc)) e receptor de FGF 2 isotipo Illc (sFGFR2(lllc)).
Modalidades preferidas incluem o fragmento ou domínio solúvel do receptor de FGF 2 isotipo ou variante Illc codificado por um polinucleotí- 5 deo com a seqüência de SEQ ID NO: 3, e/ou com a seqüência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência com pelo menos 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
De acordo com esta última modalidade, a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada (sFGFR2-Fc) da presente invenção tem vanta- josamente uma alta afinidade por seu Iigante natural FGF2 ou elevado valor Kd da ordem nanomolar, compreendido entre 1 e 5 nM e, mais precisamen- te, de cerca de 1,5 nM.
Exemplos específicos de domínios de imunoglobulina incluem, mas não se limitam a, a região Fc de uma molécula de imunoglobulina; a 15 região de articulação de uma molécula de imunoglobulina; a região CHi de uma molécula de imunoglobulina; a região CH2 de uma molécula de imuno- globulina; a região CH3 de uma molécula de imunoglobulina; a região CH4 de uma molécula de imunoglobulina; e a cadeia leve de uma molécula de imu- noglobulina, e variantes humanizadas de qualquer uma dessas. As sequên- 20 cias para essas regiões também estão disponíveis para aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Hucketal., 1986, NucIeicAcids Res. 14:1779).
Conforme usado no relatório e reivindicações, "região Fc de i- munoglobulina ou Fe" significa a parte earbóxi terminal de uma região cons- tante de cadeia pesada de imunoglobulina. As regiões Fc são particularmen- 25 te importantes na determinação das funções biológicas da imunoglobulina, e essas funções biológicas são chamadas de funções efetoras. Conforme co- nhecido na técnica, as cadeias pesadas das subclasses de imunoglobulina compreendem quatro ou cinco domínios: IgM e IgE têm cinco domínios de cadeia pesada, e IgA, IgD e IgG têm quatro domínios de cadeia pesada. A 30 região Fe de IgA, IgD e IgG é um dímero dos domínios articulação-CH2~ CH3, e, em IgM e IgE, é um dímero dos domínios articulação-CH2--CH3-CH4. Além disso, o domínio CH3 de IgM e IgE é estruturalmente equivalente ao domínio CH2 de IgG1 e o domínio CH4 de IgM e IgE é o homólogo do domí- nio CH3 de IgG (veja, W. E. Paul, ed., 1993, Fundamental Immunology, Ra- ven Press, New York, New York). Qualquer uma das regiões Fc conhecidas seria utilizável como a região Fc nas fusões de receptor de FGF e Fc solú- 5 veis modificadas da invenção.
Em uma modalidade, 0 gene que codifica a região Fe de IgG humana (Fcy) é obtido por transcrição reversa e PCR usando RNA prepara- do a partir de leucócitos humanos e primers 5’ e 3’ apropriados. Os fragmen- tos de DNA resultantes contêm seqüências completas dos domínios de arti- 10 culação, CH2 e CH3 de IgG e podem ser usados como molde para gerar va- riantes em que certos aminoácidos sejam substituídos, conforme se sabe na técnica. Um primer que codifica um elo peptídico, incluindo um sítio de enzi- ma de restrição opcional, pode ser incorporado no processo de PCR. Os fragmentos de DNA resultantes sãoinseridos em um vetor de suporte e con- 15 firmados por sequenciamento de DNA.
De preferência, usa-se a região Fc de imunoglobulina gama-1, que inclui pelo menos parte da região de articulação, região CH-ι, região CH2 e região CH3. Além disso, a região Fc de imunoglobulina gama-1 pode ser uma Fe deletada de CHi ou uma Fe deletada de CH2, e inclui uma parte de 20 uma região de articulação e uma região CH3, em que a região CH-ι e/ou CH2 tenha sido deletada. Uma Fc deletada de CH2 foi descrita por Gillies et al., (1990, Hum. Antibod. Hybridomas, 1:47).
Mais preferivelmente, a região Fe de IgGI compreende a se- qüência codificada por um polinucleotídeo com a seqüência de SEQ ID NO: 25 5, e/ou a seqüência de aminoácidos conforme exposta em SEQ ID NO: 6 ou uma seqüência com pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 6. En- tretanto, regiões Fc de outras classes de imunoglobulinas, IgA, IgD, IgE e IgM, também seriam úteis como a região Fe.
Além disso, podem-se preparar construtos de deleção dessas regiões Fc em que um ou mais dos domínios contantes estejam deletados. Aqueles versados na técnica poderiam preparar esses construtos de deleção usando técnicas bem conhecidas de biologia molecular. Além disso, a região Fe usada pode ser uma que tenha cerca de 99%, ou cerca de 98%, ou cerca de 95%, ou cerca de 90%, ou cerca de 85%, ou cerca de 80% ou cerca de 75% de identidade de aminoácidos com a mostrada na SEQ ID NO:6.
Mutações específicas em comparação com SEQ ID NO: 6 que 5 podem ser selecionadas e usadas individualmente ou em qualquer combina- ção são: uma deleção ou substituição de uma das Cys nos primeiros 20 a- minoácidos N-terminais; uma deleção de Cys na posição 5 em SEQ ID NO: 6; ou uma substituição de Cys na posição 5. A seqüência da região Fc esco- lhida pode aumentar de maneira detectável a meia-vida sérica da fusão de 10 receptor de FGF e Fc solúvel modificada.
A fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção pode compreender uma articulação, ou uma região espaçadora pode ser usada entre a parte de receptor solúvel e a região Fc (Ashkenazi et al., 1997, Current Opinion in Immunology, 9:195-200). Exemplos incluem um elo peptí- 15 dico flexível de cerca de 20 ou menos aminoácidos de comprimento. Mais preferivelmente, o elo peptídico pode ter pelo menos três aminoácidos de comprimento, e/ou um elo peptídico compreendendo dois ou mais dos se- guintes aminoácidos: glicina, serina, alanina e treonina. Em uma modalidade preferida, o elo peptídico não inclui um sítio de clivagem por protease. O elo 20 mais preferido é SAL (Ser-Ala-Leu).
A presente invenção também apresenta a construção de polinu- cleotídeos que codificam a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modifica- da de acordo com a presente invenção, assim como um vetor capaz de ex- pressar a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada quando introdu- 25 zido em uma célula hospedeira apropriada. De acordo com a modalidade preferida, o polinucleotídeo que codifica a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada tem a seqüência de SEQ ID NO: 1, ou uma seqüência que compartilhe pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 1. Con- forme aqui usado, "vetor" é entendido como significando qualquer ácido nu- 30 cléico compreendendo uma seqüência nucleotídica de interesse e capaz de ser incorporado em uma célula hospedeira e, opcionalmente, expressar uma proteína ou polipeptídio codificado. Os vetores incluem ácidos nucléicos Ii- neares, plasmídios, fagemídios, cosmídios e outros, todos do conhecimento daqueles versados na técnica. Polinucleotídeos que codificam o FGFR ou composto de fusão da invenção, assim como vetores contendo esses ácidos nucléicos e células hospedeiras em que esses vetores tenham sido introdu- 5 zidos também são especificamente incorporados no âmbito da invenção.
Mais preferivelmente, as moléculas de fusão da invenção são codificadas por DNA compreendendo um domínio extracelular de um FGFR fusionado na terminação C da região Fcyl do gene da imunoglobulina γ1 humana. A região Fcyl do gene da imunoglobulina γ1 inclui pelo menos pelo menos uma parte do domínio de articulação e do domínio CH3, ou pelo me- nos uma parte do domínio de articulação, do domínio CH2 e do domínio CH3. O DNA que codifica as moléculas polipeptídicas quiméricas de acordo com a presente invenção pode estar em sua configuração genômica ou sua confi- guração de cDNA. Podem-se usar peptídios de sinal para iniciar eficiente- mente o transporte de uma proteína através da membrana do retículo endo- plasmático. Seqüências de sinal foram bem caracterizadas na técnica, e se sabe que tipicamente contêm de 16 a 30 resíduos de aminoácidos, embora outros tamanhos sejam possíveis. Uma discussão detalhada de seqüências de peptídio de sinal é apresentada em von Heijne (1986, Nucleic Acids Res., 14:4683). De acordo com uma modalidade preferida, o peptídio de sinal é tirado de um peptídio de sinal de interleucina-2 (SEQ ID No. 8), conforme se sabe na técnica. O requerente observou que a fusão desse peptídio a um domínio extracelular de um FGFR gera uma proteína secretada com uma seqüência de aminoácidos N-terminais homogênea, o que não é o caso quando se usa um peptídio de sinal de FGFR endógeno.
Um vetor de expressão contendo as seqüências codificadoras da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção postas sob o controle de seqüências reguladoras de transcrição e tradução apropri- adas pode ser construído por tecnologia de DNA recombinante, conforme se 30 sabe na técnica. Esse vetor de expressão é introduzido em uma célula hos- pedeira por qualquer técnica conhecida por aqueles versados na técnica. A célula contendo vetor resultante é, então, cultivada para produzir uma fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada ou seu fragmento, usando-se qualquer técnica conhecida por aqueles versados na técnica.
De acordo com a invenção, podem-se usar vários sistemas de expressão para expressar as moléculas de fusão de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas. Em um aspecto, esses sistemas de expressão repre- sentam veículos pelos quais as seqüências codificadoras de interesse po- dem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também repre- sentam células que podem, quando transfectadas transitoriamente com as seqüências codificadoras de nucleotídeos apropriadas, expressar uma molé- cuia de fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção in situ. Células de mamíferos são comumente usadas para a expressão de uma molécula de fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada recom- binante, particularmente para a expressão de uma molécula de fusão de re- ceptor de FGF e Fc solúvel modificada recombinante inteira. Por exemplo, células de mamíferos, como células HEK293 ou CHO, juntamente com um vetor contendo o sinal de expressão, como um portador do elemento promo- tor de gene precoce intermediário maior do citomegalovírus humano, são um sistema eficaz para a expressão das fusões de receptor de FGF e Fc solú- veis modificadas da invenção (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).
Além disso, escolhe-se uma célula hospedeira que modula a expressão das seqüências inseridas ou modifica e processa o produto de gene da maneira específica desejada. Essas modificações (por exemplo, glicosilação) e o processamento de produtos protéicos podem ser importan- 25 tes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm caracterís- ticas e mecanismos específicos para o processamento pós-tradução e modi- ficação de proteínas e produtos de gene. Podem-se escolher linhagens celu- lares ou sistemas hospedeiros apropriados para assegurar a modificação e o processamento corretor da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modifica- 30 da de interesse expressada. Portanto, podem-se usar células hospedeiras eucarióticas que possuam a maquinaria celular para o processamento apro- priado do transcrito primário, glicosilação do produto de gene. Essas células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não se limitam a, células CHO1 COS, HEK293, 3T3 ou de mieloma. A célula hospedeira pode ser cotrans- fectada com dois ou mais vetores de expressão, incluindo o vetor que ex- pressa a proteína da invenção. Por exemplo, uma célula hospedeira pode 5 ser transfectada com um primeiro vetor que codifica um polipeptídio de fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, conforme acima descrito, e um segundo vetor que codifica um polipeptídio de glicosiltransferase. Alternati- vamente, o segundo vetor poderia expressar um pequeno RNA de interfe- rência contra uma glicosiltransferase.
Para produção de longo prazo e alto rendimento de proteínas
recombinantes, prefere-se uma expressão estável. Em uma modalidade da invenção, podem-se manipular linhagens celulares que expressam de ma- neira estável a molécula de fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modifica- da. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens de replicação 15 virais, as células hospedeiras são transformadas com DNA sob o controle de elementos reguladores de expressão apropriados, incluindo, promotores, intensificadores, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação e ou- tras seqüências apropriadas conhecidas por aqueles versados na técnica e um marcador selecionável. Depois da introdução do DNA estranho, células 20 manipuladas podem ser deixadas crescer durante um a dois dias em um meio enriquecido e, então, são trocadas para um meio seletivo. O marcador selecionável na plasmídio recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem de maneira estável o plasmídio em um cro- mossomo e sejam expandidas em uma linhagem celular.
Podem-se usar inúmeros sistemas de seleção de acordo com a
invenção, incluindo, mas não limitados a, os genes de timidina quinase do vírus da herpes simples (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina- guanina fosforribosiltransferas (Szybalska et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 48:202), seleção de glutamato sintetase na presença de metionina sul- 30 foximida (Adv Drug Del Rev, 2006, 58: 671 , e website ou literatura do Lonza Group Ltd.) e adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Da mesma forma, pode-se usar a resistência a antimetabólitos como a base de seleção para os seguin- tes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA 77:357); gpt, que confere resistência a ácido mico- fenólico (Mulligan et al., 1981 , Proc Natl Acad Sci USA 78:2072); neo, que 5 confere resistência ao aminoglicosídeo, G-418 (Wu et al., 1991, Biotherapy 3:87); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Métodos conhecidos na tecnologia de DNA recombinante po- dem ser rotineiramente aplicadas para selecionar o clone recombinante de- sejado, e esses métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al., 10 eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993). Os níveis de expressão de uma molécula de fusão de receptor de FGF e Fc so- lúvel modificada podem ser aumentados por amplificação de vetor. Quando um marcador no sistema vetor que expressa uma fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada é amplificável, um aumento no nível de inibidor pre- 15 sentes na cultura aumentará o número de cópias do gene marcador. Como a região amplificada está associada ao gene que codifica a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção, a produção da dita fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada também aumentará (Crouse ef al., 1983, Mol Cell Biol 3:257).
Aqueles versados na técnica conhecem inúmeros fatores que
influenciam o nível de glicosilação de uma glicoproteína. Por exemplo, po- dem-se usar células hospedeiras de mamífero modificadas para alterar o perfil de glicosilação da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada por aumento ou diminuição da expressão de glicosiltransferase. Essas célu- 25 Ias hospedeiras de mamífero modificadas incluem, mas não se limitam a, células CHO, COS, HEK293, PER.C6, 3T3, YB2/0 e de mieloma (Stanley et al., 1986, Archives of Biochemistry and Biophysics, 249:533; Mori et al.,
2006, Biotechnology e Bioengineering 94:68; Chitlaru et al., 1998, Biochem. J. 336:647; Umana et al., 1999 Nature Biotechnology 17:176). Aqueles ver- sados na técnica também sabem que fators de bioprocesso afetam a bios- síntese do oligossacarídeo de glicoproteína (Goochee et al., 1994, Curr Opin Biotechnol. 5:546). O efeito das condições de cultura celular, como concen- tração de glicose ou íons amônio, pH, soro e os efeitos de outros fatores do bioprocesso, como taxa de crescimento celular, tempo de cultivo, inflenciam a glisoilação ligada a N (Biotechnol. Bioeng. 39:327 (1993); Biotechnol. Bio- eng. 68:370 (2000); Bio/technology 11 :720 (1993); Cytotechnology 17:13 5 (1995); Biochem J. 272:333 (1990)). Também se sabe, além das células hospedeiras e dos fatores de bioprocesso, o processamento do oligossaca- rídeo é influenciado pelo ambiente local em cada sítio de N-glicosilação pen- dente no ambiente da glicoproteína local. Diferenças sítio a sítio podem ser amplas, conforme se observou com t-PA, ou podem envolver diferenças 10 mais sutis na ramificação e processamento terminal, conforme se observou com os três sítios de N-glicosilação de EPO (Goochee et al, 1991 , Bi- o/Technology 9: 1347).
Depois de ter sido produzida, uma fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, de troca de íons, afinidade, particularmente por afinidade de Proteína A por Fc e assim por diante), cen- trifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padronizada para a purificação de proteínas. A identificação de ácido siálico quantitativa (resíduos de ácido N-acetilneuramínico), a análise de composição de carboi- dratos e o mapeamento quantitativo de oligossacarídeos de N-glicanos nas proteínas de fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada purificadas podem ser realizadas essencialmente conforme anteriormente descrito (Saddic et al. Methods Mol. Biol. 194:23-36 (2002) e Anumula et al. Glyco- biology 8:685-694 (1998)).
Proteínas de fusão incorporando domínios de receptor de FGF solúvel podem ser produzidas por métodos familiares àqueles versados na técnica para outras fusões de mamíferos, expressáveis ou biologicamente ativas, mutatis mutandis. Por exemplo, métodos relatados para combinar as 30 regiões Fe de IgG com os domínios de citocinas e receptores solúveis po- dem ser adaptados para projetar e produzir os compostos de FGFR da in- venção (veja, por exemplo, Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989); Cha- mow et al., Trends Biotechnol., 14:52-60 (1996); patentes norte-americanas n° 5.116.964, 5.349.053 e 5.541.087). Outros exemplos de proteínas de fu- são receptor-lg que podem ser adotados incluem aqueles das patentes nor- te-americanas n° 5.726.044, 5.707.632 e 5.750.375. Como os domínios ex- tracelulares de receptor de FGF compartilham um grau significativo de ho- mologia com a família de genes de imunoglobulina e o domínio extracelular de FGFR contém segmentos do tipo Ig, o uso de regiões Fc é particularmen- te preferido. Em um exemplo, a fusão é uma proteína homodimérica ligada mediante resíduos cisteína na região de articulação de Fe de IgG, resultando em uma molécula com características similares a uma molécula de IgG. Uma vantagem de se usar uma região Fc é a meia-vida circulante estendida. Além disso, as modificações de glicosilação das proteínas de fusão de re- ceptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção levam a melhores pro- priedades farmacocinéticas, pois as fusões da invenção exibem perfis far- macocinéticos in vivo comparáveis a IgG humana de um isotipo similar.
Uma modalidade adicional da presente invenção apresenta um método para a preparação de uma proteína de fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada compreendendo um fragmento ou domínio de FGFR domain, um elo peptídico flexível e uma variante Fe de IgG humana, esse método compreendendo: (a) a geração de uma linhagem celular derivada de CHO; (b) o cultivo da linhagem celular sob condições em que a proteína de fusão recombinante seja expressada; e (c) a purificação da proteína expres- sada da etapa (b). Nesse caso, de preferência, o elo peptídico flexível com- preendendo pelo menos cerca de 3 aminoácidos entre o receptor de FGF solúvel e a variante Fe de IgG humana compreende dois ou mais aminoáci- dos selecionados do grupo que consiste em glicina, serina, alanina e treoni- na. Em modalidades adicionais e relacionadas, o elo peptídico não está pre- sente ou só tem um aminoácido de comprimento. Em uma modalidade prefe- rida, o elo peptídico não inclui um sítio de clivagem por protease. O elo mais preferido é SAL (Ser-Ala-Leu).
De preferência, a proteína de fusão com receptor de FGF solúvel modificada é produzida em células CHO em um modo de suspensão, con- forme descrito nos presentes Exemplos.
Conforme mostrado nos presentes Exemplos, as fusões de re- ceptor de FGF e Fc solúveis modificadas da presente invenção têm atividade antitumoral, pelo menos mediante indução de respostas ADCC e/ou CDC, e 5 são, portanto, utilizáveis no tratamento de tumores metastáticos e doenças como câncer. Um aspecto da invenção refere-se, portanto, a uma fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada conforme acima descrita com ativi- dades ADCC e/ou CDC.
São de interesse especial as fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas capacidade aumentada de mediar funções efetoras citotóxicas celulares, como ADCC. Essas proteínas podem ser obtidas fa- zendo-se substituições únicas ou múltiplas na região Fc da molécula, alte- rando, dessa forma, sua interação com os receptores de Fe. Métodos para projetar esses mutantes podem ser encontrados, por exemplo, em Lazar et al. (2006, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 103(11): 4005-4010) e Okazaki et al. (2004, J. Mol. Biol. 336(5): 1239-49). Veja também WO 03/074679, WO 2004/029207, WO 2004/099249, W02006/047350, WO 2006/019447, WO 2006/105338, WO 2007/041635. Também é possível usar linhagens celula- res especificamente manipuladas para a produção de fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas aperfeiçoadas. Em particular, essas linha- gens têm regulação alterada da via de glicosilação, resultando em fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas que são mal fucosiladas ou mesmo totalmente desfucosiladas. Essas linhagens celulares e métodos pa- ra sua manipulação são apresentados em, por exemplo, Shinkawa et at. (2003, J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473), Ferrara et al. (2006, J. Biol. Chem. 281(8): 5032-5036; 2006, Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-61), EP 1331266, EP 1498490, EP 1498491, EP 1676910, EP 1792987, e WO 99/54342.
Métodos de inibição do crescimento de tumores em um sujeito e métodos para o tratamento ou prevenção de metástases em um sujeito, compreendendo a administração de uma quantidade eficiente dessas fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas conforme acima descritas, são um aspecto da invenção. A invenção, portanto, também refere-se à fu- são de receptor de FGF e Fc solúvel modificada conforme acima descrita como um medicamento. A presente invenção também refere-se ao uso da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada conforme acima descrita para a preparação de um medicamento para tratamento ou inibição de cres- 5 cimento tumoral em um sujeito. Outro aspecto da invenção refere-se a com- posições farmacêuticas da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modifica- da da invenção. As composições farmacêuticas da invenção tipicamente compreende a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da inven- ção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme aqui usado, "veí- 10 culo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, tam- pões, soluções salinas, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibac- terianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e outros que sejam fisiologicamente compatíveis. O tipo de veículo pode ser selecionado com base na via de administração desejada. Em várias modali- 15 dades, o veículo é adequado para administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica, transdérmica ou oral. Veículos farmaceu- ticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetá- veis estéreis. O uso de meios e agentes para substâncias farmaceuticamen- 20 te ativas é bem conhecido na técnica. Conforme detalhado abaixo, compos- tos ativos adicionais também podem ser incorporados nas composições, como agentes anticâncer e/ou antiangiogênese; em particular, o composto ativo adicional pode ser um agente antiangiogênico, um agente quimioterá- pico ou um agente de baixo peso molecular. Uma composição farmacêutica 25 típica para infusão intravenosa poderia ser preparada para conter 250 ml_ de solução de Ringer estéril e 100 mg da combinação. Métodos reais para a preparação de compostos administráveis por via parenteral são conhecidos ou ficarão claros para aqueles versados na técnica e são descritos em maio- res detalhes, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Science, 17a 30 ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), e suas edições 18° e 19°, que são incorporados por referência.
A fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção também pode ser preparada com veículos e formulações de liberação con- trolada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulada. Podem-se usar polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, como etileno acetato de vinila, pollianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, 5 ácido polilático e copolímeros poliláticos, poliglicólicos (PLG). Muitos méto- dos para a preparação dessas formulações são genericamente conhecidos por aqueles versados na técnica.
A fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada na compo- sição é formulada, de preferência, em uma quantidade eficaz. Uma "quanti- 10 dade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante pe- ríodos de tempo necessários, para conseguir o resultado desejado, como modulação das atividades de FGF e/ou FGFR e indução de resposta ADCC e/ou CDC. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quanti- dade suficiente para influenciar o curso terapêutico de um estado patológico 15 particular. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do agente sejam superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
Para aplicações terapêuticas, as fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas da invenção são administradas a um mamífero, de pre- ferência um ser humano, em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável, como aquelas acima discutidas, incluindo aquelas que possam ser administradas a um ser humano por via intravenosa como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea, intra-articular, intrassinovi- al, intratecal, oral, tópica ou por inalação. As fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas também são adequadamente administradas pelas vias intratumoral, peritumoral, intralesional ou perilesional, para exercer efeitos terapêuticos locais, assim como sistêmicos. Espera-se que a via intraperito- neal seja particularmente útil, por exemplo, no tratamento de tumores ovari- anos.
Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta ótima. Por exemplo, pode-se administrar um único bolo, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo, ou a dose po- de ser proporcionalmente reduzida ou aumentada. As composições da in- venção podem ser administradas a um sujeito para afetar a atividade de crescimento celular em um sujeito. Conforme aqui usado, o termo "sujeito" 5 pretende incluir organismos vivos em que exista um crescimento celular de- pendente de FGF e inclui especificamente mamíferos, como coelhos, cães, gatos, camundongos, ratos, macacos, suas espécies transgênicas e seres humanos.
As fusões de receptor de FGF e Fc solúveis modificadas e as composições farmacêuticas da invenção são utilizáveis no tratamento ou prevenção de vários cânceres, incluindo (mas não limitados a) os seguintes: carcinoma, incluindo o de bexiga, mama, cólon, cabeça e pescoço, rim, in- cluindo carcinoma de células renais, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estô- mago, cérvix, tireóide e pele; incluindo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, Iinfoma de células B, Iinfoma de células T, Iinfoma de Burkitt; tumores hematopoiéticos de linhagem mie- lóide, incluindo Ieucemias mielogênicas agudas e crônicas e leucemia pró- mielocítica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rab- domiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocar- cinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e peri- férico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwannomas; tumo- res de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmen- toso, ceratoactantoma, seminoma, câncer folicular da tireóide e teratocarci- noma, e outros cânceres ainda a serem determinados que sejam causados por superexpressão de FGF. Em uma modalidade preferida, a fusão de re- ceptor de FGF e Fc solúvel modificada da invenção é usada para tratar me- lanoma, leucemia, câncer renal, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama ou cân- cer de cabeça e pescoço.
A presente invenção refere-se, portanto, ao uso da fusão de re- ceptor de FGF e Fe solúvel modificada acima descrita para a preparação de um medicamento para o tratamento ou inibição de doenças relacionadas a câncer em um sujeito. É um aspecto ou objeto da presente invenção apre- sentar um método de tratamento de doenças e processos que resultem da 5 proliferação de células cancerosas, e uma composição para o tratamento ou repressão do crescimento de um câncer. Ainda outro aspecto da invenção é apresentar composições e métodos utilizáveis para terapia genética para modulação de câncer. O método da presente invenção pode ser usado em particular para o tratamento de melanoma, leucemia, câncer renal, câncer de 10 cólon, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama ou câncer de cabeça e pescoço.
A eficácia da fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada na prevenção ou tratamento de doença pode ser melhorada pela administra- ção da dita fusão de maneira seriada ou em combinação com outro agente que seja eficaz para essas finalidades, como fator de necrose tumoral (TNF), um antagonista capaz de inibir ou neutralizar a atividade angiogênica de fa- tor de crescimento de fibroblastos ácido ou básico (FGF), fator de cresci- mento derivado de plaquetas (PDGF), ou fator de crescimento de hepatóci- tos (HGF), um antagonista capaz de inibir ou neutralizar as atividades coa- gulantes de fator tissular, proteína C ou proteína S (veja a WO 91/01753), um antagonista como um anticorpo capaz de se ligar ao receptor de HER2 (veja a patente norte-americana n° 5.772.997), ou um ou mais agentes tera- pêuticos convencionais como por exemplo, agentes de alquilação, antago- nistas de ácido fólico, antimetabólitos do metabolismo de ácidos nucléicos, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracila, cisplatina, nucleosídeos de purina, aminas, aminoácidos, nucleosídeos de triazol ou corticosteróides.
Em outro aspecto da invenção, a administração é combinada com a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um a- gente quimioterápico como, por exemplo, taxol (paclitaxel) ou taxotere (doce- taxei).
Agentes quimioterápicos incluem, sem limitação, agentes antimi- crotúbulos, como diterpenóides e alcalóides da vinca; complexos de coorde- nação com platina; agentes de alquilação, como mostardas nitrogenadas, oxazafosforinas, alquilsulfonatos, nitrosoureias e triazenos; agentes antibióti- cos, como antraciclinas, actinomicinas e bleomicinas; inibidores da topoiso- merase II, como epipodofilotoxinas; antimetabólitos, como análogos da puri- na e pirimidina e compostos antifolato; inibidores da topoisomerase I, como camptotecinas; hormônios e análogos hormonais; inibidores da via de trans- dução de sinal; inibidores da angiogênese não receptores de tirosina quina- se; agentes imunoterápicos; agentes pró-apoptóticos; e inibidores da sinali- zação do ciclo celular. Além disso, os métodos da invenção podem ser com- binados com outro tratamento anticâncer, agente antiangiogênico ou agente quimioterápico ou terapia de radiação. Um exemplo preferido é o docetaxel ou taxotere. Outros exemplos incluem gemcitabina, cisplatina, diterpenóides e alcalóides da vinca, paclitaxel, vinblastina, vincristina e vinorelbina, carbo- platína, ciclofosfamida, melphalan, e clorambucil, busulfan, carmustina, da- carbazina, ciclofosfamida, melfalan, clorambucil, busulfan, carmustina, da- carbazina, agentes antineoplásicos incluindo, mas não limitados a, actinomi- cinas, como dactinomicina, antraciclinas, como daunorubicina e doxorubici- na, bleomicinas, epipodofilotoxinas, etoposida e teniposida; agentes neo- plásticos antimebatólitos, 5-fluorouracila, metotrexato, citarabina, mecapto- purina, tioguanina, camptotecinas, irinotecan HCI e topotecan HCI.
Vários agentes quimioterápicos ou polipeptídios anticâncer dife- rentes também podem ser selecionados. Fontes de informações, como www.clinicaltrials.gov,www.ncbi.nlm.nih e www.drugs.com. incluem referên- cias a polipeptídios e agentes que podem ser selecionados.
Esses outros agentes, por exemplo, agentes antiangiogênicos
ou agentes quimioterápicos podem estar presentes na composição que é administrada ou podem ser administrados separadamente. Em um aspecto da invenção, a administração é realizada com o outro princípio ativo simultâ- nea, separada ou seqüencialmente ao longo do tempo. Quando se realiza a 30 administração simultaneamente, os dois princípios ativos podem ser combi- nados em uma única composição farmacêutica compreendendo as duas composições, como um comprimido ou cápsula de gel. Por outro lado, os dois princípios ativos podem, quer administrados simultaneamente ou não, estar presentes em composições farmacêuticas separadas. Com essa finali- dade, a combinação pode estar na forma de um kit compreendendo, por um lado, a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada conforme acima 5 descrita e, por outro lado, o segundo princípio ativo, a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada conforme acima descrita e o segundo princípio ativo estando em compartimentos separados e devendo ser administrados simultânea, separada ou seqüencialmente ao longo do tempo.
A combinação de acordo com a presente invenção pode ser par- 10 ticularmente administrada para terapia de tumores em combinação com quimioterapia, terapia com proteína (isto é, usando um agente terapêutico como um anticorpo ou proteína recombinante), terapia genética, radioterapi- a, imunoterapia, intervenção cirúrgica ou uma combinação dessas. Também é possível uma terapia de longo prazo como uma terapia adjuvante no con- 15 texto de outras estratégias de tratamento, conforme acima descrito.
Os exemplos que se seguem são apenas exemplificativos do âmbito desta invenção e do conteúdo deste relatório. Aqueles versados na técnica podem conceber e construir inúmeras modificações dos exemplos relacionados abaixo, sem sair do âmbito desta invenção.
Exemplos
Exemplo 1: Produção em HEK293 de sFGFR2-Fc com alto teor de ácido siálico e baixa depuração sanguínea.
cDNAs que codificam a-1,4-galactosiltransferase humana (B4GT1) (SEQ ID No. 9) ou p-2,3-sialiltransferase humana (SIAT6) (SEQ ID 25 No. 11) foram recuperados de uma coleção de clones (Invitrogen) e clona- dos no vetor de expressão em mamíferos pXL4214, cuja expressão é acio- nada pelo promotor de CMV. O mesmo vetor de expressão também foi usa- do para clonar a proteína de fusão sFGFR2-Fc e gerar pXL4410. Os mapas dos plasmídios pXL4551 que codifica B4GT1, pXL4544 que codifica SIAT6 e 30 pXL4410 que codifica a fusão FGFR2lllc-Fc solúvel modificada (aqui desig- nada por sFGFR2-Fc) são apresentados nas figuras 1 e 5, assim como as seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos correspondentes de B4GT1 (figura 2), SIAT6 (figura 3) e sFGFR2-Fc (figuras4A e B). sFGFR2-Fc foi produzida em células HEK293 EBNA aderentes (Invitrogen) portransfec- ção transitória de um a três plasmídios de expressão que codifiquem sFG- FR2-Fc, B4GT1 ou SIAT6 em complexo com JET PEI (Q-Biogen). A razão 5 de plasmídio foi de 90/5/5 para pXL4410/pXL4544/pXL4551. A razão de plasmítio teve de ser otimizada para assegurar uma produtividade e uma qualidade ótimas do polipeptídio sFGFR2-Fc. As proteínas secretadas foram colhidas oito dias após a transfecção e centrifugadas. As proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade em Proteína G Sepharose (Amer- 10 sham Biosciences) após eluição da coluna com 100 mM de glicina/HCI pH 2,7. As proteínas sFGFR2-Fc foram formuladas em PBS e filtradas a 0,22 μηι. A concentração de proteína foi determinada pelo Ensaio microBC (Inter- chim).
A identificação quantitativa de ácido siálico, a análise de compo- sição de carboidratos e o mapeamento quantitativo de oligossacarídeos de N-glicanos nas proteínas purificadas sFGFR2-Fc foram realizadas essenci- almente conforme acima descrito (Saddic et al. 2002. Methods Mol. Biol. 194:23-36 e Anumula et al.1998. Glycobiology 8:685-694). Em primeiro lu- gar, os resíduos de ácido siálico foram liberados sob hidrólise suave de sFGFR2-Fc e fluorescentemente marcados com orto-fenilenodiamina e se- parados por HPLC em fase reversa. Os picos individuais foram detectados por detecção de fluorescência (excitação, 230 nm; emissão, 425 nm), identi- ficados e quantificados por comparação com padrões de ácidos N- acetilneuramínico e N-glicolilneuramínico. Em segundo lugar, a composição de carboidratos foi determinada após hidrólise ácida de amostras de sFG- FR2-Fc para liberar os monossacarídeos individuais. Após a hidrólise, os monossacarídeos (açúcares neutros e amino) foram derivatizados com ácido antranílico e, então, separados por HPLC em fase reversa e detectados por detecção de fluorescência (excitação, 360 nm; emissão, 425 nm). Os picos individuais foram identificados e quantificados por comparação com padrões de monossacarídeos. Em terceiro lugar, os oligossacarídeos foram enzimati- camente liberados com PNGase F e fluorescentemente marcados com ácido antranílico antes da separação de acordo com seu número de resíduos áci- do siálico por HPLC de troca de ânions em fase normal em uma coluna Asa- hipak-NH2P (Phenomenex). Os glicanos marcados foram detectados e quantificados por detecção de fluorescência (excitação, 360 nm; emissão, 5 425 nm). O número médio de ácidos siálicos por N-glicano no domínio FG- FR2 foi calculado com base na quantidade total de moles de N-glicano por mol de FGFR2-Fc e de moles de N-glicano por mol de Fc obtidos após libe- ração do Fc por papaína.
As proteínas sFGFR2-Fc purificadas foram injetadas na cauda 10 de camundongos nus suíços (Charles River). Um total de três camundongos foram usados por batelada de proteína. O sangue foi coletado 6 horas após a injeção de 500 μg de sFGFR2-Fc, o plasma foi obtido, e a concentração de FGFR2-Fc foi determinada por ELISA utilizando-se o método de sanduíche com um anticorpo monoclonal anti-FGFR2 humano (R&D system) e um anti- 15 corpo policlonal anti-conjugado de IgG humana-HRP (Pierce) (2 análises a 2 diluições em triplicata). Nos experimentos de controle, os camundongos fo- ram pré-tratados com fetuína e asiolofetuína uma hora antes da injeção de sFGFR2-Fc.
A Tabela 1 resume as condições de produção de diferentes ba- teladas de sFGFR2-Fc, o perfil de N-glicanos e a composição de monossa- carídeos de cada batelada e a concentração plasmática de sFGFR2-Fc 6 horas após a injeção intravenosa em camundongos.
Tabela 1 - Teor de N-glicanos e farmacocinética de FGFR2-Fc produzida
em HEK293
Proteína expressada sFGFR2-Fc sFGFR2-Fc + sFGFR2-Fc + Sl- em HEK293EBNA SIAT6 AT6 e BAGT1 % de espécies sialila- das de sFGFR2-Fc 1 - não sialilada 69% 46% 34% 2 - monossialilada 23% 19% 22% 2 - dissialilada 6% 26% 35% 3 - trissialilada 1,5% 10% 10% Teor de ácido siálico: 1 - pmoles de ácido 3,4 6,4 6,8 N-acetilneuramínico por pmol de sFGFR2- Fc 2 - Número médio de 0,4 1 ácidos siálicos por N- glicano de sFGFR2 Composição de mo¬ nossacarídeos de N- glicanos de sFGFR2- Fc para 3 manoses 1 - Glucosamina (nú¬ 4,3 4,1 4,1 mero por 3 manoses) 2 - Galactose (núme¬ 1,5 1,4 1,6 ro por 3 manoses) Número de fucoses 0,73 0,61 0,63 em N-glicanos de Fc para 3 manoses Depuração sanguínea [sFGFR2-Fc] no plas¬ 258 20.000 ma 6 horas após inje¬ ção i.v. (ng/mL) [sFGFR2-Fc] no plas¬ 229 Não feito Não feito ma 6 horas após inje¬ ção i.v. (ng/mL) quan¬ do os camundongos foram pré-tratados com fetuína [sFGFR2-Fc] no plas¬ 19.276 Não feito Não feito ma 6 horas após inje¬ ção i.v. (ng/mL) quan¬ do os camundongos foram pré-tratados com asialofetuína Um melhor padrão de sialilação de proteínas de fusão sFGFR2-
Fc produzidas em HEK293EBNA foi demonstrado por co-expressão transitó- ria da proteína de fusão com a-1,4-galactosiltransferase ou β-2,3- sialiltransferase humana. Essa grande melhora do status de sialilação ficou 5 evidente por uma redução de 2 vezes da porcentagem de glicanos não siali- lados, um aumento de 2 vezes no teor total de ácido siálico por mol de prote- ína e um aumento de 2,5 vezes no número médio de ácidos siálicos por N- glicano. Deve-se notar que o teor de monossacarídeos não foi afetado (veja a Tabela 1).
Esse aumento de 2,5 vezes no N-glicano sialilado está direta- mente correlacionado com os parâmetros farmacocinéticos significativamen- te melhores do sFGFR2-Fc. Em particular, um aumento de 100 vezes da presença de sFGFR2-Fc no plasma foi medido 6 horas após a injeção i.v. em camundongos.
A farmacocinética também foi melhorada 100 vezes quando os
camundongos foram pré-tratados com asialofetuína em comparação com o pré-tratamento com fetuína. Sabe-se que a asialofetuína, mas não a fetuína, se liga ao receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGPR) (Webster et al., 2003, Xenobiotica 33:945).
Tomados juntos, esses resultados indicam que a ligação especí-
fica ao receptor de asialoglicoproteína mediante resíduos galactose termi- nais expostos do N-glicano é responsável pela depuração de sFGFR2-Fc, ao passo que a presença de um ácido siálico por N-glicano na sFGFR2-Fc di- minuía significativamente essa depuração.
Exemplo 2: Triagem de clones estáveis de CHO que expressam
a proteína sFGFR2-Fc com um número médio de resíduos ácido siálico por N-glicano de FGFR2 maior que 1,2 para uma farmacocinética ótima
O plasmídio para expressão em mamíferos pXL4636 para ex- pressão estável de sFGFR2-Fc em células CHO foi gerado a partir do plas- mídio pEE14.4 que codifica o marcador de seleção glutamina sintetase (Lonza) e do plasmídio pXL4410 que contém a seqüência de cDNA que co- difica sFGFR2-Fc, Fig 5. O plasmídio pXL4636 foi introduzido em células CHO K1 por nucleofecção utilizando o kit Nucleofactor de linhagem celular AMAXA conforme recomendado pelo fornecedor. As células transfectadas foram transferidas para meio seletivo e, após amplificação das células, os sete melhores semiclones CHO/GS produtores (SC n° 9, 11, 26, 58, 112, 118, 170) foram triados quanto ao teor de ácido siálico das moléculas de sFGFR2-Fc purificadas. Os dois semiclones com o maior teor de ácido siáli- co (SC n° 11 e 118) foram selecionados para clonagem e produção em es- cala; em particular, o clone de SC n° 118 foi adicionalmente descrito como GC111.
Embora as moléculas de sFGFR2-Fc produzidos por todos os semiclones tivessem um alto teor de ácido siálico, não levaram à mesma farmacocinética. Interessantemente, observou-se que, de dois semiclones (SC n° 11 e 118), sFGFR2-Fc com o maior teor de ácido siálico levou à mai- or concentração de sFGFR2-Fc no sangue 6 horas após a injeção i.v. em 5 camundongos, conforme descrito na Tabela 2. E dos dois clones (SC n° 9 e 170), sFGFR2-Fc com o menor teor de ácido siálico teve a menor concen- tração de sFGFR2-Fc no sangue 6 horas após a injeção i.v. em camundon- gos.
Tabela 2 - Clones estáveis de CHO que expressam proteína sFGFR2-Fc com uma razão de resíduos ácido siálico por N-glicano de sFG-
FR2 maior que 1,2 para uma farmacocinética ótima
sFGFR2-Fc SC n° 9 SC n° SC n° SC n° SC n° SC n° SC n° 170 purificado de 11 26 58 112 118 semiclone CHO-GS SC n° % de espécies sialiladas de sFGFR2-Fc 1 - não sialilada 50 42 48 48 45 43 53 2 - monossiali- 28 30 30 30 30 30 28 Iada 3 - dissialilada 14 18 14 15 16 17 13 4 - trissialilada 8 10 7 8 9 10 6 Número médio 1,07 1,45 1,29 0,98 de ácidos siáli¬ cos por N- glicano de SFGFR2 [sFGFR2-Fc]/ 55% 100% 81% 45% [SFGFR2- Fcjmax [sFG- FR2-Fc] encon¬ trada no plasma 6 horas após injeção i.v. [SFGFR2- Fcjmax encon¬ trada para SC n° 11 A triagem de clones com base em N-glicano altamente sialilado
de sFGFR2-Fc é preditiva de parâmetros farmacocinéticos ótimos de sFG- FR2-Fc.
Exemplo 3: Correlação entre o número médio de ácidos siálicos
por N-glicano de sFGFR2-Fc e a depuração de sFGFR2-Fc no sangue Em outro experimento similar ao experimento descrito no Exem- plo 2, clones CHO/DHFR estáveis que expressam sFGFR2-Fc foram gera- dos usando-se o sistema de seleção e amplificação DHFR com os plasmí- dios de expressão em mamíferos apropriados pXL4429 e plasmídio p- 5 XL4417 (figura 6). Esses clones CHO-DHFR também foram triados quanto ao teor de ácido siálico por molécula de sFGFR2-Fc, e a depuração de sFG- FR2-Fc produzida por esses clones também foi ensaiada.
O número médio de ácidos siálicos por N-glicano no domínio FGFR2 foi calculado com base na quantitade total de moles de N-glicano por 10 mol de FGFR2-Fc e de moles de N-glicano por mol de Fc obtido após libera- ção da Fc por papaína. Os resultados apresentados na figura 7 mostraram que uma razão de resíduos ácido siálico por N-glicano de FGFR2 maior que 1,2 assegurava uma concentração ótima de sFGFR2-Fc no sangue em comparação com a concentração ótima no sangue encontrada para molécu- 15 Ias de Fe. Apenas os clones selecionados atingiram essa razão ótima. Con- sequentemente, a triagem de clones pela razão de resíduos ácido siálico por N-glicano de FGFR2 permite àqueles versados na técnica predizerem a bai- xa depuração de sFGFR2-Fc no sangue.
Exemplo 4: Seqüência de aminoácidos da proteína de fusão
sFGFR2-Fc
A proteína sFGFR2-Fc codificada pelo plasmídio pXL4410 ou pXL4636 ou pXL4429 (figuras 5 e 6) é uma proteína de fusão da seqüência humana de FGFR2 solúvel com o fragmento Fc derivado da seqüência de IgGI humana.
A seqüência do polinucleotídeo que codifica sFGFR2-Fc é ex-
posta na SEQ ID NO: 1 e na figura 4A. Da mesma forma, a seqüência com- pleta de aminoácidos da proteína sFGFR2-Fc é exposta na SEQ ID NO: 2 na figura 4B. Aminoácidos das posições 1 a 350 correspondem ao isotipo FG- FR2IIIC (veja a Fig 4C, SEQ ID NO: 4) e são os aminoácidos das posições 30 27 a 376 descritos em SwissProt (FGFR2_HUMAN). Aminoácidos das posi- ções 354 a 584 são aminoácidos de IgGI das posições 99 a 329, conforme descrito em SwissProt (IGHG1_HUMAN); veja a Fig 4D e a SEQ ID NO: 6. Aminoácidos das posições 351 a 353 são aminoácidos de um elo sintético: SAL (Ser Ala Leu); veja a Fig 4E.
Exemplo 5: Teor de N-glicano definido de sFGFR2-Fc produzida no clone estável de CHO GC111 5 As condições foram otimizadas para produzir sFGFR2-Fc de
modo que a razão de resíduos ácido siálico por N-glicano de sFGFR2 fosse maior que 1,2. Este exemplo apresenta as condições para atingir essa con- dição.
Um biorrreator Celligen de 5 L (New Brunswick) enchido com 4,4 L de meio livre de proteína CD-CHO, suplementado com 100 μΜ de suple- mentos MSX e 1X GS1 foi semeado a uma densidade celular inicial de 3,5 x 105 células/mL de clone GC111 e cultivado a 37°C. Empregou-se aeração por asperção usando-se uma mistura de oxigênio, nitrogênio, ar e dióxido de carbono ou oxigênio puro, e o oxigênio dissolvido foi mantido a 30% da satu- ração do ar. O pH foi mantido em 7,2 pela adição de dióxido de carbono e injeção de bicarbonato de sódio a 1 M no meio de cultura. A taxa de agitação usada foi de 110 rpm usando-se um Propulsor Cell Lift. A solução de alimen- tação (450 g/L de glicose) foi continuamente alimentada para manter a glico- se em um nível alvo de 2 - 3 g/L. A alimentação foi iniciada no dia 5, quando a concentração de glicose residual atingiu 2,5 g/L. A alimentação contínua de nutriente se baseou no crescimento celular e consumo de gilcose predi- tos, com uma taxa de alimentação de nutrientes igual à taxa de consumo de glicose. A concentração de glutamato foi mantida em 1 - 3 mmoles/L por adi- ção em pulsos seguindo um controle off-line diário. A cultura celular foi moni- torizada quanto à contagem celular, viabilidade e metabólitos (glicose, Iacta- to, glutamina, amônia e glutamato) e quanto à concentração de produto du- rante a fase de produção. A cultura foi interrompida quando a viabilidade celular caiu para 55%, e a colheita de cultura foi coletada. A colheita de cul- tura celular foi clarificada, e a sFGFR2-Fc foi purificada por cromatografia de afinidade (ProsepvA, Millipore) e duas etapas de cromatografia de troca de íons, então, filtrada estéril e armazenada em salina tamponada com fosfato antes de análises adicionais e testes in vivo. A massa molecular aparente de sFGFR2-Fc obtida da análise SDS-PAGE sob condições não redutoras era de 180 kDa. Isso contrastava com a massa molecular teórica de 130 kDa calculada com base na seqüên- cia de aminoácidos do homodímero sFGFR2-Fc. Essa grande diferença en- 5 tre as massas moleculares aparente e calculada foi atribuída à presença a- dicional de cerca de 30% de N-glicanos, veja a Tabela 3. De fato, com a di- gestão da sFGFR2-Fc por Peptídio-N-glicosidase F (PNGase F, Roche) se- guida por análise por SDS-PAGE sob condições não redutoras, a massa molecular da sFGFR2-Fc desglicosilada era de cerca de 160 kDa (figura 7).
A composição de carboidratos e o perfil de N-glicanos de sFGFR2-Fc foram analisados conforme descrito no Exemplo 1 e relatados na Tabela 3.
Tabela 3 - Composição de carboidratos e perfil de N-glicanos de
sFGFR2-Fc produzida em condições ótimas
Proteína expressada no clone estável de CHO-GS GC111 sFGFR2-Fc % de espécies sialiladas de sFGFR2-Fc 1 - não sialilada 30% 2 - monossialilada 34% 3 - dissialilada 23% 4 - trissialilada 13% Número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFGFR2- 1,34 Fc Composições de monossacarídeos de N-glicanos de sFG- FR2-Fc por 3 manoses 1 - Glucosamina (número por 3 manoses) 4,9 2 - Galactose (número por 3 manoses) 2,7 3 - Fucose (número por 3 manoses) 0,96 Composições de fucose do N-glicano de Fc por 3 manoses 1,1 Em comparação com os resultados obtidos na Tabela 2, sFG- FR2-Fc, produzida pelo clone GC111 em condições ótimas, tinha mais N- glicanos sialilados do que sFGFR2-Fc produzida com o semiclone SC n° 118, que deu origem ao clone GC111 produzido em condições padroniza- das. Por exemplo, a % de espécies não sialiladas diminuiu de 43% para 30%.
Com base na quantidade total de moles de N-glicano por mol de FGFR2-Fc e de moles de N-glicano por mol de Fc obtida após a liberação da Fc por papaína, mediu-se que havia sete N-glicanos por FGFR2. Conse- 5 quentemente, a maioria dos sítios do domínio FGFR2 estão quase todos completamente ocupados.
Exemplo 6: Sítios de N-glicosilação importantes para afinidade por FGF e produtividade
A proteína de fusão sFGFR2-Fc tem oito sítios de N-glicosilação 10 no domínio FGFR2 e um no domínio Fc1 veja a figura 8 e a Tabela 5 para a definição das posições de N-glicanos N1 a N8. As proteínas 4493 e 4565, duas variantes de sFGFR2-Fc que perderam o domínio do tipo Ig 1, foram produzidas. 4493 exibia características similares a FGFR2-Fc de tipo selva- gem derivada de pXL4636 em termos de produtividade e ligação a FGF-2 ou 15 heparina. Em contraste, 4565, em que todos os sítios de glicosilação no do- mínio sFGFR2 sofreram mutação (substituição de N para Q), não podia ser caracterizada devido a uma redução de mais de 50 vezes na produtividade do mutante, veja a Tabela 4.
Tabela 4. Características físico-químicas de variantes de sFG-
FR2-Fc
ID da pro¬ Sítios de N- Resíduos de Produ¬ Ligação a Ligação a teína glicosilação no aminoácidos no ção FGF-2** heparina domínio FGFR2 sítio de N- (mg/L) glicosilação S £ [NaCI] O para elui- cb ção de heparina (mM) 4410 8 (N1 a N8) N 75 1,39 370 4493 6 (N3 a N8) N 67 1,19 442 4565 6 (N3 a N8) Q < 1 ND ND ** A ligação a FGF-2 foi determinada em um instrumento BIAco- re™ utilizando um um modelo de "reação de dois estados com alteração de conformação" conforme descrito por Gamsjaeger et al., Biochem. J. 7 Apr. 2005 / BJ20050156. Em resumo, a integração foir ealizada no sensograma 5 inteiro, exceto nas áreas de "efeito a granel". A faixa de concentração foi se- lecionada entre 1 e 8 nM. O método de cinética ka/kd simultânea permite as medições de dois ka e dois kd considerando as seguintes equações: ka1 e kd1 para A+B AB
ka2 e kd2 para AB <-> AB* que pode representar a dimerização de comple- xos (FGF - FGFR2-Fc)
A constante de dissociação K0 foi calculada pela seguinte fórmula:
1_
(ka-i/kd-ι) x (1 + ka2/kd2)
De acordo com os dois modelos competitivos relatados (o mode- 15 Io de duas extremidades simétricas de Mohammadi e o modelo assimétrico de Pellegrini), os sítios N3 a N7 podiam potencialmente interagir com resí- duos de aminoácidos de FGF1 ou FGFR2c e/ou interagir com heparina, ao passo que o sítio N8 é improvável de estar envolvido em interações em to- das as estruturas cristalinas (Pellegrini et al. 2000. Nature 407: 1029; Ibrahi- 20 mi et al. 2005 Mol. Cell. Biol. 25: 671).
Com base na informação acima, era relevante estudas os sítios de N-glicosilação nas posições N3 a N7 por substituição do Asn correspon- dente por Gln e por manutenção da posição N8 inalterada, para permitir uma produtividade significativa. A influência posicionai dos N-glicanos nas carac- 25 terísticas físico-químicas de sFGFR2-Fc foi avaliada estatisticamente com um experimento fatorial fracionado de dois níveis. Cinco variáveis (ocupação de sítios de glicosilação nas posições N3 a N7) foram selecionadas, e foram estudados 16 construtos independentes. O projeto fracionado 25'1 experi- mental e a análise de dados foram realizados conforme descrito (Statistics 30 for Experimenters, G. Box Ed., Willey, 1978).
Projeto Fatorial Fracionado
Variantes de N-glicosilação específicas para sítio foram projeta- das com base em 4493, e o projeto fatorial em dois níveis com cinco variá- veis (N3 a N7) que podiam estar em um nível mais (N) ou um nível menos (Q). O projeto era fracionado com 16 construtos (25'1, isto é, resolução ver- sus projeto), permitindo a identificação dos efeitos principais e de interações de 2 fatores, mas confundindo interações de 2 fatores com de 3 fatores.
Os 16 construtos de plasmídios foram obtidos por PCR seqüen- cial e clonagem para gerar substituição de N em Q na posição N3, N4, N5, N6 ou N7, mas mantendo a posição N8 e o sítio de N-glicosilação do domí- nio Fc inalterado. Essas variantes de proteína só diferiam de 4493 pelas mu- tações de 2 ou 4 pontos relacionadas na Tabela 5.
Tabela 5. Matriz de projeto
Status de posição de M-glicosilação Posição de Construto N3 N4 N5 N6 N7 N8 N 297 Asn na figu¬ (Fe) ra 9 Posição de 228 241 265 297 318 331 Asn em FG- FR2HUMA N 4572 _ _ _ _ + + + 4570 + _ _ _ + + 4577 _ + _ _ + + 4571 + + _ _ + + + 4587 _ + _ _ + + 4585 + - + _ + + + 4586 _ + + _ + + + 4573 + + + _ + + 4574 _ + _ + + 4575 + _ _ + + + + 4588 _ + _ + + + + 4576 + + _ + _ + + 4579 _ + + + 4569 + _ + + _ + + 4578 _ + + + _ + + 4493 + + + + + + + Os 16 construtos projetados foram testados quanto à produção em pequena escala. Duas variantes (4572 e 4574) eram produtores muito baixos (cerca de 2 mg/L). Os 14 construtos restantes foram produzidos na escala de um litro e purificados em paralelo sob condições padronizadas 5 com uma recuperação razoável do produto. Foram, então, analisados por SDS-PAGE, filtração em gel, BIAcore™. Os resultados foram analisados com resolução fatorial fracionada estatística - 25'1 DOE.
Produtividade
A N-glicosilação em N3, N4, N5, N6, N7 teve uma contribuição positiva sobre a produtividade. Houve um efeito quantitativo similar para to- das as posições estudadas (isto é, N3, N4, N5, N6 e N7) e nenhum efeito significativo de interações de dois fatores.
Tabela 6. Produtividade
Construto Título (mg/L) da produção a 1 Resposta (mg/L) Variável L 4572 0 28 Média 4570 13 17 N3 4577 9 14 N4 4571 34 20 N5 4587 5 13 N6 4585 40 13 N7 4586 42 -8 N3-N4 4573 32 3 N3-N5 4574 0 1 N3-N6 4575 30 -2 N3-N7 4588 37 -2 N4-N5 4576 27 -1 N4-N6 4579 30 6 N4-N7 4569 54 4 N5-N6 4578 37 0 N5-N7 4493 67 -1 N6-N7 Agregação
Proteínas purificadas foram analisadas por filtração em gel (Su- perdex 2000) para quantificar a porcentagem de espécies de alto peso mo- lecular (HMW; %) em preparações purificadas. O maior valor (pior caso) de 5 80,2% de HMW foi obtido para 4587 e foi usado na análise DOE para os dois construtos (4572 e 4574) que não puderam ser produzidos (a porcenta- gem média do valor de HMW obtido dos 14 construtos também foi usada para comparação, fornecendo uma conclusão similar). A N-glicosilação na posição N5 e, em menor medida, na posição N6 foi desfavorável ao apare- 10 cimento de espécies HMW. A interação N5-N6 exibiu um efeito similar sobre a agregação.
Tabela 7. Formação de agregado
Construto HMW (%) Resposta (%) Variável 4572 80 57 Média 4570 73,0 -12 N3 4577 71,6 -5 N4 4571 72,1 -33 N5 4587 80,2 -18 N6 4585 47,5 -7 N7 4586 47,7 6 N3-N4 4573 57,5 -8 N3-N5 4574 80 -5 N3-N6 4575 69,6 2 N3-N7 4588 71,8 -2 N4-N5 4576 72,9 3 N4-N6 4579 35,2 -4 N4-N7 4569 12,0 -18 N5-N6 4578 39,4 -6 N5-N7 4493 3,6 1 N6-N7 Ligação a FGF-2 A afinidade de ligação a FGF-2 foi determinada com BIAcore™ para cada construto. Valores de constante de dissociação (K0) entre 0,49 e 2,31 nM foram obtidos para construtos mostrando afinidade mensurável. Pa- ra construtos que não se ligavam a FGF-2 ou que não podiam ser produzi- 5 dos, usou-se um valor de 10 nM para a análise DOE. A N-glicosilação nas posições N5 e, em menor medida, nas posições N6 e N3 teve um efeito po- sitivo sobre a ligação a FGF-2. As interações N3-N5 e N5-N6 tiveram um efeito positivo sobre a ligação, ao passo que as interações N3-N6 e N4-N7 tiveram um efeito negativo sobre a ligação.
_Tabela 8. Ligação a FGF-2___
Construto Kd (nM) Resposta Variável (nM) 4572 10 6,8 Média 4570 10 -2,2 N3 4577 10 -0,5 N4 4571 10 -6,5 N5 4587 10 -2,3 N6 4585 2,7 0,5 N7 4586 10 0,0 N3-N4 4573 0,49 -2,2 N3-N5 4574 10 2,0 N3-N6 4575 10 0,1 N3-N7 4588 10 -0,5 N4-N5 4576 10 0,1 N4-N6 4579 2,31 2,0 N4-N7 4569 0,99 -2,3 N5-N6 4578 0,66 0,5 N5-N7 4493 1,19 0,0 N6-N7 Essa reolução-V 25"1 D.O.E. revelou que a N-glicosilação tinha
uma contribuição positiva sobre a produtividade nas posições N3, N4, N5, N6, N7; tinha um impacto positivo sobre a ligação a FGF-2, nas posições N5 » N6 e N3; e era desfavorável ao aparecimento de moléculas de alto peso molecular em todas as posições, particularmente N5 > N6.
Consequentemente, a ocupação de N-glicano é mandatória na posição N5, e recomendada nas posições N3, N4, N6 e N7, respectivamente (posição 265, 228, 241, 297 e 318, respectivamente, em FGFR2_HUMAN (Swissprot)).
Exemplo 7: Farmacocinética da proteína de fusão sFGFR2-Fc No exemplo 7, sFGFR2-Fc é a proteína de fusão correspon- dendte à seqüência de aminoácidos SEQ ID No. 2, com um número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFGFR2 de 1,3. Três camundongos por 10 vez foram injetados com 500 μρ da proteína de fusão na veia da cauda. Em vários momentos após a injeção do produto, coletou-se sangue. A figura 10 mostra a concentração de proteína no plasma e no fígado. A figura 11 mos- tra a quantidade de recuperação de proteína no plasma e fígado nos mo- mentos iniciais expressa em porcentagem de dose injetada.
Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando-se
análise não compartimental. A meia-vida de alimentação foi calculada com os últimos 6 pontos de dados que forneceram o melhor ajuste da fase termi- nal Iog-Iinear (Tabela 9).
Tabela 9
Parâmetro Unidades sFGFR2-Fc t1/2 h 70,1 Túltimo h 72,0 Cúltima μ9/ηπ|_ 27,6 AUCúltima hVg/mL 3138 Clobs mL/h/kg 4,2 Vss mL/kg 406 AUCúltima: Área sob a curva do momento da dosagem até a
última concentração mensurável.
Cl obs: depuração total do corpo para administração extravascu-
lar.
Cúltima: concentração correspondente a Túltima.
t1/2: meia-vida terminal. Túltimo: tempo da última concentração mensurável (não zero).
Vss: uma estimativa do volume de distribuição em estado cons- tante.
Após a administração intravenosa, sFGFR2-Fc mostrou um perfil farmacocinético favorável com uma longa meia-vida de eliminação (quase 3 dias) e uma reduzida depuração total do corpo. O volume de distribuição era limitado e menor que o volume de água corporal total, sugerindo uma distri- buição tissular limitada. Em 72 h, a concentração plasmática de sFGFR2-Fc permanece em uma concentração muito alta, e a depuração também é boa. Os parâmetros farmacocinéticos de sFGFR2-Fc são muito compatíveis com o uso dessa proteína de fusão como uma substância terapêutica. De fato, conforme mostrado nos Exemplos, a concentração plasmática após a inje- ção intravenosa em camundongos é substancialmente alta, e a depuração permanece muito baixa 72 h após a injeção. De maneira importante, a ciné- tica de clivagem de sFGFR2-Fc in vivo também é muito baixa, pois a sFG- FR2-Fc foi apenas parcialmente clivada (40% após 18 h), e a concentração de molécula de comprimento total permaneceu inalterada até 72 h.
Consequentemente, a molécula de fusão, conforme exposta na SEQ ID NO: 2, e um número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFG- FR2 de 1,3 mostraram um perfil farmacocinético favorável, com uma longa meia-vida de aliminação (quase 3 dias) e uma depuração total do corpo sa- tisfatória.
Exemplo 8: Eficácia da proteína de fusão sFGFR2-Fc no modelo de tumor subcutâneo A549 Neste exemplo, sFGFR2-Fc é a proteína de fusão corresponden-
te à seqüência de aminoácidos SEQ ID No. 2, com um número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFGFR2 de 1,3.
Modelo de tumor subcutâneo A549
A linhagem celular A549 foi identificada como uma linhagem de células tumorais para avaliar a eficácia de sFGFR2-Fc. O requerente de- monstrou in vitro que essa linhagem celular expressa FGF2 e também que sFGFR2-Fc pode suprimir a proliferação autócrina dessas células. Um mo- delo de tumor subcutâneo A549 foi estabelecido pelo requerente em camun- dongos nus Balb/c. Além disso, o tumor in vivo expressa FGF2.
Neste experimento, a eficácia da molécula de sFGFR2-Fc foi avaliada no modelo de crescimento tumoral A549. Os produtos foram injeta- dos por via subcutânea duas vezes por semana. Diferentes doses, isto é, 25, e 5 mg/kg de sFGFR2-Fc, foram avaliadas.
Após a análise global do volume do tumor, a evolução dos três grupos tratados com sFGFR2-Fc foi estatisticamente diferente da evolução do volume do tumor do grupo tratado com PBS. sFGFR2-Fc é eficiente so- bre o crescimento tumoral nesse modelo à dose de 5 mg/kg duas vezes por semana.
Projeto Experimental
5.105 células A549 em 200 μΙ_ foram injetadas por via subcutâ- nea em camundongos nus Balb/c no dia 0. Após a injeção no mesmo dia, os 15 camundongos foram randomizados por blocos de 4 em quatro grupos, com base no peso corporal. Os tratamentos começaram após a randomização, no dia seguinte à injeção de células. Cada grupo recebeu por via subcutânea 500, 300 ou 100 μg/camundongo/administração, correspondendo, respecti- vamente, a 25, 15 e 5 mg/kg, duas vezes por semana: segunda-feira e sex- 20 ta-feira, durante 39 dias.
Resultados
Análise do volume do tumor
Conforme mostrado na figura 12, o volume do tumor foi analisa- do até o dia 40. Os grupos de 100 μg (triângulos), 300 μg (quadrados) e 500 μg/camundongo/administração (círculos fechados) eram estatisticamente diferentes do grupo de PBS (círculos abertos). Concluímos que sFGFR2-Fc diminuía o crescimento do tumor às doses de 25, 15 e 5 mg/kg.
Peso do tumor no dia 40
Conforme mostrado na figura 13, os tumores foram colhidos e pesados ao término do experimento. Os grupos de 100 μg, 300 μg e 500 μg/camundongo/administração eram estatisticamente diferentes do grupo de PBS. Concluímos que sFGFR2-Fc de acordo com a presente invenção dimi- nuía o peso do tumor às doses de 25, 15 e 5 mg/kg. A evolução do crescimento tumoral dos grupos de sFGFR2- Fc_100, sFGFR2-Fc _300 e sFGFR2-Fc _500 foi estatisticamente diferente da do grupo tratado com PBS. A proteína de fusão sFGFR2-Fc de acordo com a presente invenção (seqüência de aminoácidos SEQ ID No. 2), com um número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFGFR2 de 1,3, é ca- paz de diminuir substancialmente o crescimento tumoral à dose de 5 mg/kg.
Exemplo 9: Eficácia da proteína de fusão sFGFR2-Fc no modelo de tumor subcutâneo H460
No exemplo 9, sFGFR2-Fc é a proteína de fusão corresponden- do à seqüência de aminoácidos SEQ ID No. 2, com um número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFGFR2 de 1,6.
Modelo de tumor subcutâneo H460
A linhagem celular H460 foi identificada como uma linhagem de células tumorais para avaliar a eficácia de sFGFR2-Fc. Demonstrou-se in vitro que essa linhagem celular expressa FGF2. Neste experimento, a eficá- cia de sFGFR2-Fc foi avaliada sobre o crescimento tumoral. Os produtos foram injetados por via subcutânea duas vezes por semana à dose de 25 mg/kg. Após análise global da evolução do volume tumoral, sFGFR2-Fc di- minuiu o crescimento tumoral.
Projeto Experimental
5.106 células H460 em 200 μΙ_ foram injetadas por via subcutâ- nea no flanco direito de camundongos nus Balb/c no dia 0. Após a injeção das células, no dia da inoculação das células (Dia 0), os camundongos fo- ram randomizados com base no peso corporal medido e foram alocados aos grupos de tratamento.
Os tratamentos foram administrados duas vezes por semana por injeções subcutâneas (200 μΙ_) durante 3 semanas consecutivas (segunda- feira e sexta-feira). A primeira administração foi realizada no Dia 1 após a inoculação das células, para maximizar a exposição das células ao trata- mento.
Resultados Análise do volume do tumor
A figura 14 mostra a análise do volume do tumor até o dia 22. Concluímos que sFGFR2-Fc diminuía substancialmente o crescimento tumo- ral.
5 Análise do peso do tumor
A figura 15 mostra a análise do peso do tumor no dia 22. Conclu- ímos que sFGFR2-Fc diminuía substancialmente o peso do tumor. A evolu- ção do crescimento tumoral do grupo de sFGFR2-Fc foi estatisticamente diferente da evolução do grupo tratado com PBS. Concluímos claramente 10 que a proteína de fusão de acordo com a presente invenção (seqüência de aminoácidos SEQ ID No. 2, com um número médio de ácidos siálicos por N- glicano de sFGFR2 de 1,6) é capaz de diminuir substancialmente o cresci- mento do tumor H460 à dose de 25 mg/kg.
Exemplo 10: Avaliação das atividade ADCC in vitro da proteína de fusão sFGFR2-Fc sobre as linhagens celulares A549 e H460
Neste exemplo, sFGFR2-Fc é a proteína de fusão correspon- dendo à seqüência de aminoácidos SEQ ID No. 2, com um número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFGFR2 maior que 1,6. A capacidade de sFGFR2-Fc de mediar uma atividade ADCC in vitro foi avaliada em ambos 20 os modelos de células tumorais H460 e A549 selecionados (veja os exem- plos 8 e 9).
Projeto Experimental
Células tumorais (A549 e H460) em PBS com 2% de BSA (1 mi- Ihão/mL) foram incubadas durante 30 min a 4°C com 500 ng/mL de FGF2 25 (R&DSystems) e 2 μg/mL de sFGFR2-Fc ou IgGI humana de controle (Sig- ma). As células tumorais foram diluídas em RPMI com 1% de FBS e incuba- das em uma placa de 96 poços a 5.000 células por poço. NK purificada foi adicionada em uma razão de NK/células tumorais de 20/1 e 6/1. As placas foram incubadas durante 4 horas a 37°C, então, centrifugadas, e a Iactato 30 desidrogenase foi titulada no sobrenadante (kit ROCHE). 100% de Iise foi obtido usando-se Triton X100 a 0,2%. A ADCC induzida por sFGFR2-Fc es- pecífica foi calculada conforme requerido pelo fabricante. Resultados
Os resultados ilustrados na figura 16 mostram uma Iise de célu- las tumorais mediada por células matadoras naturais (NK) na presença de sFGFR2-Fc tanto nas células tumorais A549, quanto nas H460 próxima de 25% nas condições de 20/1 (NK/célula tumoral), indicando que sFGFR2-Fc é capaz de mediar um efeito ADCC sobre essas células tumorais.
Exemplo 11: Avaliação de atividades ADCC e CDC in vivo da proteína de fusão sFGFR2-Fc no modelo de tumor subcutâneo A549
Neste exemplo, sFGFR2-Fc é a proteína de fusão correspon- dendo à seqüência de aminoácidos SEQ ID No. 2, com um número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFGFR2 maior que 1,6.
Modelo de tumor subcutâneo A549
A linhagem celular A549 foi identificada como uma linhagem de células tumorais para avaliar a eficácia da sFGFR2- Fe, pois essas células expressavam um alto nível de FGF2 in vivo e eram sensíveis a ADCC medi- ada por sFGFR2-Fc in vitro.
Cepas de Camundongos
Três cepas de camundongos diferentes (camundongos SCID, NOD/SCID e SCID/bg) foram selecionadas para avaliar a capacidade de 20 sFGFR2-Fc para mediar atividades ADCC e/ou CDC in vivo. Camundongos SCID mantiveram as funções de NK e complemento e são capazes de de- senvolver respostas ADCC e CDC e foram selecionados como controle posi- tivo. Camundongos NOD/SCID não têm função de NK nem a capacidade de estimular a atividade do complemento e foram incapazes de desenvolver 25 atividades ADCC ou CDC. Camundongos SCID/bg não têm função de NK e foram incapazes de desenvolver atividade ADCC.
Neste experimento, a eficácia da molécula de sFGFR2-Fc foi avaliada no tumor A549 implantado subeutaneamente em três cepas diferen- tes de camundongos. sFGFR2-Fc foi injetada por via subcutânea duas vezes por semana à dose de 5 mg/kg durante o curso inteiro do estudo.
Projeto Experimental
A549 foi implantado subeutaneamente em camundongos SCID, NOD/SCI D e SCID/bg conforme anteriormente descrito (veja o exemplo 8). Os tratamentos foram administrados duas vezes por semana por injeções subcutâneas durante 6 semanas consecutivas. Durante o curso do estudo, o peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas vezes por semana.
Resultados
Conforme mostrado na figura 17, o volume do tumor foi analisa- do até o dia 41 nos 3 experimentos. Em camundongos SCID, o grupo tratado por sFGFR2-Fc a 5 mg/kg (diamantes) era estatisticamente diferente do gru- po de controle (círculos abertos) e mostrou uma inibição do tumor (calculada 10 como 100 - (Volume do grupo tratado / volume do grupo de controle x 100)) de 39%. Nos camundongos NOD/SCID, sFGFR2-Fc a 5 mg/kg na exibiu ne- nhuma atividade. Nos camundongos SCID/bg, sFGFR2-Fc a 5 mg/kg recu- perou parcialmente sua atividade (inibição do tumor = 18%). De acordo com esses resultados, mecanismos de CDC e ADCC estavam envolvidos na efi- 15 cácia da sFGFR2-Fc.
Exemplo 12: Avaliação de atividades ADCC e CDC in vivo da proteína de fusão sFGFR2-Fc no modelo de tumor subcutâneo H460
Neste exemplo, sFGFR2-Fc é a proteína de fusão correspon- dendo à seqüência de aminoácidos SEQ ID No. 2, com um número médio de ácidos siálicos por N-glicano de sFGFR2 maior que 1,6.
Modelo de tumor subcutâneo H460
A linhagem celular H460 foi identificada como uma linhagem de células tumorais para avaliar a eficácia da sFGFR2-Fc, essas células ex- pressavam altos níveis de FGF2 in vivo e eram sensíveis a ADCC mediada por sFGFR2-Fc in vitro.
Cepas de Camundongos
Conforme anteriormente descrito no exemplo 11, três cepas de camundongos com diferentes funções imunes (camundongos SCID, NOD/SCID e SCID/bg) foram selecionadas para avaliar a capacidade de sFGFR2-Fc para mediar atividades ADCC e/ou CDC in vivo em H460.
Neste experimento, a eficácia da molécula de sFGFR2-Fc foi avaliada em tumor H460 implantado subeutaneamente nas três cepas de camundongos diferentes. sFGFR2-Fc foi injetada por via subcutânea duas vezes por semana à dose de 25 mg/kg durante o curso inteiro do estudo.
Projeto Experimental
H460 foi implantado subeutaneamente em camundongos SCID, NOD/SCID e SCID/bg, conforme anteriormente descrito (veja exemplo 9). Os tratamentos foram administrados duas vezes por semana por injeções sub- cutâneas durante 3 semanas consecutivas. Durante o curso do estudo, o peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas vezes por semana.
Resultados
Conforme mostrado na figura 18, o volume do tumor foi analisa-
do até o dia 22 nos 3 experimentos. Em camundongos SCID, o grupo tratado com sFGFR2-Fc a 25 mg/kg (diamantes) era estatisticamente diferente do grupo de controle (círculos abertos) e mostrou uma inibição do tumor de 29%. Nos camundongos NOD/SCID, sFGFR2-Fc a 5 mg/kg exibiu uma per- 15 da de atividade com uma inibição do tumor de 14%. Nos camundongos SCID/bg, sFGFR2-Fc a 5 mg/kg recuperou toda sua atividade (inibição do tumor = 32%). Nesses estudos, conforme observado no modelo de tumor A549 (veja o exemplo 11), mecanismos de CDC e ADCC estavam envolvi- dos na eficácia da sFGFR2-Fc.
Exemplo 13 - Avaliação da eficácia de sFGFR2-Fc in vivo em
comparação com sFGFR2-Fc (A265 Fe) no modelo de tumor subcutâneo H460
Shields at al. descreveram uma mutação pontual Asp265Ala no domínio Fe da IgGI humana nomeada (A265 Fe) que conferia uma ligação 25 reduzida a todos os receptores de FcyR e citotoxicidade celular dependente de anticorpos muito baixa (2001 J. Biol. Chem 276:6591). Essa mutação pontual foi introduzida no domínio Fc da seqüência de DNA que codifica sFGFR2-Fc do plasmídio pXL4547 (figura 19), resultando na seqüência poli- nucleotídica representada pela SEQ ID No. 13. Clones estáveis de 30 CHO/DHFR expresando sFGFR2-Fc (A265 Fe) (SEQ ID No. 14) foram gera- dos usando-se o sistema de seleção e amplificação DHFR com os plasmí- dios de expressão em mamíferos apropriados pXL4547 e plasmídio p- XL4417 conforme descrito no Exemplo 3. A proteína sFGFR2-Fc (A265 Fe) foi, então, produzida e purificada para estudos in vivo. Verificou-se que seu teor de glicano era similar ao teor de glicano encontrado para sFGFR2-Fc produzida nos Exemplos 3 ou 5.__
Proteína expressada por CHO-DHFR estável sFGFR2-Fc (A265 Fe) % de espécies sialiladas de sFGFR2-Fc 1 - não sialilada 40% 2 - monossialilada 28% 3 - dissialilada 22% 4 - trissialilada 10% Composição de monossacarídeos de N-glicanos de sFGFR2-Fc por 3 manoses 1 - Glucosamina (número por 3 manoses) 4,35 2 - Galactose (número por 3 manoses) 2,74 3 - Fucose (número por 3 manoses) 0,89 Modelo de tumor subcutâneo 460
A linhagem celular H460 foi identificada como uma linhagem de células tumorais para avaliar a eficácia da sFGFR2-Fc; essas células ex- pressavam altos níveis de FGF2 in vivo e eram sensíveis a ADCC mediada por sFGFR2-Fc in vitro.
Neste experimento, a eficácia da molécula de sFGFR2-Fc e da
molécula de sFGFR2-Fc modificada (A265 Fe) foi avaliada em tumor H460 implantado subeutaneamente em camundongos nus.
Projeto Experimental
H460 foi implantado subeutaneamente em camundongos Balb/C
nus conforme anteriormente descrito (veja o exemplo 9). Os tratamentos fo- ram administrados duas vezes por semana durante o curso inteiro do estu- do. Durante o curso do estudo, o peso corporal e o volume do tumor foram medidos duas vezes por semana.
Resultados
Conforme mostrado na figura 20, o volume do tumor foi analisa-
do até o dia 23. O grupo tratado por sFGFR2-Fc a 25 mg/kg (diamantes) era estatisticamente diferente do grupo de controle (círculos abertos) e mostrou uma inibição do tumor de 50%. A sFGFR2-Fc modificada (A265 Fe) a 25 mg/kg exibiu uma perda de atividade com apenas uma inibição do tumor de 25% (NS). A mutação dentro do Fc de sFGFR2-Fc (A265 Fe) induziu uma diminuição da atividade.
Como se mostrou que essa modificação diminuía a citotoxicida- de celular dependente de anticorpo, o exemplo 13 apresenta uma prova indi- reta de que sFGFR2-Fc agia in vivo por um mecanismo envolvendo ADCC. Listagem de Seqüência
<110> CENTELION
<120> FUSÕES DE RECEPTOR DE FGF E Fc SOLÚVEIS MODIFICADAS COM MELHOR ATIVIDADE BIOLÓ- GICA
<130> FR2006-084 PCT
<150> EP 06291824.8 <151> 2006-11-28
<150> EP 07290042.6 <151> 2007-01-11
<160> 14
<170> Patente versão 3.3
<210> 1
<211> 1755
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS <222> (1)..(1755)
<400> 1
tta gtt gag gat acc aca tta gag cca gaa gag cca cca act aaa tac 48
Leu Val Glu Asp Thr Thr Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr
1 5 10 15
caa ate tet caa cca gaa gtg tac gtg gct gea cca ggg gag tcg cta 96
Gln Ile Ser Gln Pro Glu vai Tyr vai Ala Ala Pro Gly Glu Ser Leu 20 25 30
gag gtg cgc tgc ctg ttg aaa gat gcc gcc gtg ate agt tgg act aag 144
Glu Val Arg Cys Leu Leu Lys Asp Ala Ala Val Ile Ser Trp Thr Lys 35 40 45
gat ggg gtg cac ttg ggg ccc aac aat agg aca gtg ctt att ggg gag 192
Asp Gly vai His Leu Gly Pro Asn Asn Arg Thr Val Leu Ile Gly Glu 50 55 60
tac ttg cag ata aag ggc gcc acg cct aga gac tcc ggc ctc tat gct 240
Tyr Leu Gln Ile Lys Gly Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala 65 70 75 80
tgt act gcc agt agg act gta gac agt gaa act tgg tac ttc atg gtg 288 Cys Thr Ala Ser Arg Thr Val Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met Val 85 90 95
aat gtc aca gat gcc ate tea tcc gga gat gat gag gat gac acc gat 336
Asn Val Thr Asp Ala Ile Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Asp Thr Asp 100 105 110
ggt gcg gaa gat ttt gtc agt gag aac agt aac aac aag aga gea cca 384
Gly Ala Glu Asp Phe Val Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro 115 120 125
tac tgg acc aac aca gaa aag atg gaa aag cgg ctc cat gct gtg cct 432 Tyr Trp Thr Asn Thr Glu Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala VaT Pro 130 135 140
gcg gcc aac act gtc aag ttt cgc tgc cca gcc ggg ggg aac cca atg 480 Ala Ala Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Gly Gly Asn Pro Met FR2006-084 PCT.ST25.txt
145 150 155 160
cca acc atg cgg tgg ctg aaa aac ggg aag gag ttt aag cag gag cat
Pro Thr Met Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Gln Glu His
165 170 175
cgc att gga ggc tac aag gta cga aac cag cac tgg age ctc att atg
Arg Ile Gly Gly Tyr Lys vai Arg Asn Gln His Trp Ser Leu Ile Met
180 185 190
gaa agt gtg gtc cca tet gac aag gga aat tat acc tgt gtg gtg gag
Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Lys GTy Asn Tyr Thr Cys VaT VaT Glu
195 200 205
aat gaa tac ggg tcc ate aat cac acg tac cac ctg gat gtt gtg gag
Asn Glu Tyr GTy Ser Ile Asn His Thr Tyr His Leu Asp Val VaT Glu
210 215 220
cga tcg cct cac cgg ccc ate ctc caa gcc gga ctg ecg gea aat gcc
Arg ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala GTy Leu Pro Ala Asn Ala
225 230 235 240
tcc aca gtg gtc gaa gga gac gta gag ttt gtc tgc aag gtt tac agt
Ser Thr VaT Val GTy Gly Asp Val Glu Phe Val Cys Lys vai Tyr ser
245 250 255
gat gcc cag ccc cac ate cag tgg ate aag cac gtg gaa aag aac ggc
Asd Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Ile Lys His vaT Glu Lys Asn cTy
260 265 270
agt aaa tac ggg ccc gac ggg ctg ccc tac ctc aag gtt ctc aag gcc
Ser Lys Tyr Gly Pro Asp GTy Leu Pro Tyr Leu Lys Val Leu Lys Ala
275 280 285
gcc ggt gtt aac acc acg gac aaa gag att gag gtt ctc tat att cgg
Ala GTy Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ile Glu vai Leu Tyr Ile Arg
290 295 300
aat gta act ttt gag gac gct ggg gaa tat acg tgc ttg gcg ggt aat
Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala GTy Glu Tyr Thr Cys Leu Ala GTy Asn
305 310 315 320
tet att ggg ata tcc ttt cac tet gea tgg ttg aca gtt ctg cca gcg
ser Ile GTy Ile Ser Phe His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Pro Ala
325 330 335
cct gga aga gaa aag gag att aca gct tcc cca gac tac ctg tea gcg
Pro GTy Arg Glu Lys Glu Ile Thr Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Ser Ala
340 345 350
cta gag ccc aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca
Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
355 360 365
gea cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa
Ala Pro Glu Leu Leu Giy Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
370 375 380
ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg
Pro Lys Asp Thr Leu Met ile ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys VaT
385 390 395 400
gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac
VaT VaT Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
405 410 415
gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag
VaT Asp GTy VaT Glu VaT His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
528
576
624
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296 420 FR2006-084 PCT.ST25. txt 430 425 cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg VaT Val Ser Val Leu Thr vai Leu His 435 440 445 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa Gln Asp Trp Leu Asn GTy Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys 450 455 460 gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 465 470 475 480 ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg CCC cca tcc cgg gat gag ctg Pro Arg GlU Pro Gln VaT Tyr Thr teu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 485 490 495 acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys GTy Phe Tyr Pro 500 505 510 age gac ate gçc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac Ser Asp Ile Ala VaT Glu Trp Glu Ser Asn Giy Gln Pro Glu Asn Asn 515 520 525 tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc Tyr Lys Thr Thr Pro Pro VaT Leu Asp Ser Asp GTy Ser Phe Phe Leu 530 535 540 tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc Tyr ser Lys Leu Thr VaT ASp Lys ser Arg Trp Gln Gln GTy Asn vai 545 550 555 560 ttc tea tgc tcc SIf atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag Phe Ser Cys Ser 565 Met Hi S Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 570 575 aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt tga Lys ser Leu Ser Leu Ser Pro GTy 580 <210> 2 sapiens <211> 584 <212> PRT <213> Homo <400> 2 I Leu vai Glu Asp Thr Thr Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Gln Ile Ser Gln Pro Glu Val Tyr Val Ala Ala Pro Gly Glu Ser Leu 20 25 30 Glu Val Arg Cys Leu Leu Lys ASp Ala Ala Val Ile Ser Trp Thr Lys 35 40 45 Asp Gly vai His Leu Gly Pro Asn Asn Arg Thr Val Leu Ile Gly Glu 50 55 60
1344
1392
1440
1488
1536
1584
1632
1680
1728
1755
Tyr Leu Gln Ile Lys Gly Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala 65 70 75 80 Cys Thr Ala Ser Arg Thr vai Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met Val 85 90 95
Asn Val Thr Asp Ala Ile Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Asp Thr Asp 100 105 110
Gly Ala Glu Asp Phe vai Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro 115 120 125
Tyr Trp Thr Asn Thr Glu Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala vai Pro 130 135 140
Ala Ala Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Gly Gly Asn Pro Met 145 150 155 160
Pro Thr Met Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Gln Glu His 165 170 175
Arg Ile Gly Gly Tyr Lys vai Arg Asn Gln His Trp Ser Leu Ile Met 180 185 190
Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Val Val Glu 195 200 205
Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr His Leu Asp Val Val Glu 210 215 220
Arq Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Ala 225 230 235 240
Ser Thr vai Val Gly Gly Asp Val Glu Phe Val Cys Lys vai Tyr ser 245 250 255
Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Ile Lys His vai Glu Lys Asn Gly 260 265 270
Ser Lys Tyr Gly Pro Asp Gly Leu Pro Tyr Leu Lys Val Leu Lys Ala 275 280 285
Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ile Glu vai Leu Tyr ile Arg 290 295 300
Asn Val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn 305 310 315 320
Ser Ile Gly Ile Ser Phe His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Pro Ala 325 330 335
Pro Gly Arg Glu Lys Glu ile Thr Ala Ser Pro Asp Tyr Leu ser Ala 340 345 350 Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 355 360 365
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys 370 375 380
Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 385 390 395 400
Val vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 405 410 415
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 420 425 430
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 435 440 445
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 450 455 460
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 465 470 475 480
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 485 490 495
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro 500 505 510
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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 530 535 540
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 545 550 555 560
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 580
<210> 3
<211> 1050
<212> DNA
<213> Homo sapiens FR2006-084 PCT.ST25.txt
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1050)
<400> 3
tta gtt gag gat acc aca tta gag cca gaa gag cca cca act aaa tac
Leu Val Glu Asp Thr Thr Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr 10 15
caa ate tet caa cca gaa gtg tac gtg gct gea cca ggg gag tcg cta Gln Ile Ser Gln Pro Glu Val Tyr VaT Ala Ala Pro GTy Glu Ser Leu 25 30
gag gtg cgc tgc ctg ttg aaa gat gcc gcc gtg ate agt tgg act aag Glu VaT Arg Cys Leu Leu Lys Asp Ala Ala VaT Ile Ser Trp Thr Lys 40 45
gat ggg gtg cac ttg ggg ccc aac aat agg aca gtg ctt att ggg gag Asp GTy VaT His Leu GTy Pro Asn Asn Arg Thr VaT Leu Ile GTy Glu 50 55 60
tac ttg cag ata aag ggc gcc acg cct aga gac tcc gac ctc tat gct Tyr Leu Gln Ile Lys GTy Ala Thr Pro Arg Asp Ser GTy Leu Tyr Ala 65 70 75 80
tgt act gcc agt agg act gta gac agt gaa act tgg tac ttc atg gtg Cys Thr Ala Ser Arg Thr vai Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met vaT 85 90 95
aat gtc aca gat gcc ate tea tcc gga gat gat gag gat gac acc gat Asn vai Thr Asp Ala Ile Ser ser GTy Asp Asp Glu Asp Asp Thr Asp 100 105 110
ggt gcg gaa gat ttt gtc agt gag aac agt aac aac aag aga gea cca GTy Ala Glu Asp Phe Val Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro 115 120 125
tac tgg acc aac aca gaa aag atg gaa aag cgg ctc cat gct gtg cct Tyr Trp Thr Asn Thr Glu Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala VaT Pro 130 135 140
gcg gcc aac act gtc aag ttt cgc tgc cca gcc ggg ggg aac cca atg Ala Ala Asn Thr vai Lys Phe Arg Cys Pro Ala GTy GTy Asn Pro Met 145 150 15 5 160
cca acc atg cgg tgg ctg aaa aac ggg aag gag ttt aag cag gag cat Pro Thr Met Arg Trp Leu Lys Asn GTy Lys Glu Phe Lys Gln Glu His 165 170 175
cgc att gga ggc tac aag gta cga aac cag cac tgg age ctc att atg Arg Ile GTy GTy Tyr Lys vai Arg Asn Gln His Trp Ser Leu Ile Met 180 185 190
gaa agt gta gtc cca tet gac aag gga aat tat acc tgt gtg gtg gag Glu Ser VaT vai Pro Ser Asp Lys GTy Asn Tyr Thr Cys VaT VaT Glu 195 200 205
aat gaa tac ggg tcc ate aat cac acg tac cac ctg gat gtt gtg gag Asn Glu Tyr GTy Ser Ile Asn His Thr Tyr His Leu Asp vai VaT Glu 210 215 220
cga tcg cct cac cgg ccc ate ctc caa gcc gga ctg ccg gea aat gcc Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala GTy Leu Pro Ala Asn Ala 225 230 235 240
tcc aca gtg gtc gga gga gac gta gag ttt gtc tgc aag gtt tac agt Ser Thr VaT Val GTy GTy Asp Val Glu Phe vai Cys Lys Val Tyr Ser 245 250 255
48
96
144
192
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768 gat gcc cag ccc cac ate cag tgg ate aag cac gtg gaa aag aac ggc Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Ile Lys HiS val Glu Lys Asn Gly 260 265 270 agt aaa tac ggg ccc gac 999 ctg ccc tac CtC aag gtt CtC aag gcc ser Lys Tyr Giy Pro Asp Gly Leu Pro Tyr Leu Lys val Leu Lys Ala 275 280 285 gcc ggt gtt aac acc acg gac aaa gag att gag gtt ctc tat att cgg Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ile Glu Val Leu Tyr Ile Arg 290 295 300 aat gta act ttt gag gac gct ggg gaa tat acg tgc ttg gcg ggt aat Asn vai Thr Phe Glu Asp Ala Giy Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn 305 310 315 320 tet att ggg ata tcc ttt cac tet gea tgg ttg aca gtt ctg cca gcg ser Ile GIy He Ser Phe His Ser Ala Trp Leu Thr val Leu pro Ala 325 330 335 cct gga aga gaa aag gag att aca gct tcc cca gac tac ctg Pro Gly Arg Glu Lys Glu Ile Thr Ala Ser Pro Asp Tyr Leu 340 345 350 <210> 4 sapiens <211> 350 <212> PRT <213> Homo <400> 4 Leu Val Glu Asp Thr Thr Leu Glu pro Glu Glu pro Pro Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Gln Ile Ser Gln Pro Glu vai Tyr vai Ala Ala Pro Gly Glu ser Leu 20 25 30 Glu Val Arg Cys Leu Leu Lys Asp Ala Ala Val Ile Ser Trp Thr Lys 35 40 45 Asp Gly Val Hi S Leu Gly Pro Asn Asn Arg Thr val Leu He Gly Glu 50 55 60 Tyr Leu Gln Ile Lys Gly Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala 55 70 75 80 Cys Thr Ala Ser Arg Thr Val Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met val 85 90 95 Asn vai Thr Asp Ala Ile Ser ser Gly Asp Asp Glu ASp Asp Thr ASp 100 105 110 Gly Ala Glu Asp Phe Val Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro 115 120 125
816
864
912
950
1008
1050
Tyr Trp Thr Asn Thr Glu Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala Val Pro 130 135 140 Ala Ala Asn Thr val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Gly Gly Asn Pro Met 145 150 155 160
Pro Thr Met Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Gln Glu His 165 170 175
Arg ile Gly Gly Tyr Lys val Arg Asn Gln His Trp Ser Leu Ile Met 180 185 190
Glu Ser val val Pro ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys val val Glu 195 200 205
Asn Glu Tyr Gly Ser ile Asn His Thr Tyr His Leu Asp val Val Glu 210 215 220
Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Ala 225 230 235 240
Ser Thr val val Gly Gly Asp Val Glu Phe val Cys Lys Val Tyr Ser 245 250 255
Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Ile Lys His val Glu Lys Asn Gly 260 265 270
Ser Lys Tyr Gly Pro Asp Gly Leu Pro Tyr Leu Lys val Leu Lys Ala 275 280 285
Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ile Glu Val Leu Tyr Ile Arg 290 295 300
Asn val Thr Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn 305 310 315 320
Ser Ile Gly Ile Ser Phe His Ser Ala Trp Leu Thr val Leu Pro Ala 325 330 335
Pro Gly Arg Glu Lys Glu Ile Thr Ala Ser Pro Asp Tyr Leu 340 345 350
<210> 5
<211> 696
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS <222> CD . · (696)
<400> 5
gag ccc aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gea 48
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 10 15 cct gaa ctc ctg ggg gga ccg Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 aag gac acc ctc atg ate tcc Lys Asp Thr Leu Met ile Ser 35 SI? gac gtg age cac gaa gac Asp val Ser His Glu Asp 50 55 gac ggc si? gag si? cat aat Asp Gly Glu HiS Asn 65 70 tac aac age Thr tac cgt SI? Tyr Asn Ser Tyr Arg 85 gac tgg ctg aat ggc aag gag Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 100 ctc cca gcc CCC ate gag aaa Leu pro Ala pro Ile Glu Lys 115 cga gaa cca cag gtg tac acc Arg Glu pro Gln val Tyr Thr 130 135 aag aac cag gtc age ctg acc Lys Asn Gln val ser Leu Thr 145 150 gac ate gcc gtg gag tgg gag Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 165 aag acc acg cct CCC SS ctg Lys Thr Thr pro Pro Leu 180 age aag ctc acc SI? gac aag Ser Lys Leu Thr Asp Lys 195 tea tgc tcc gtg atg cat gag Ser Cys Ser Val Met His Glu 210 215 age ctc tcc ctg tet ccg ggt Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 6
<211> 231
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys 1 5
FR2006-084 PCT.ST25.txt tea gtc ttc ctc ttc ccc
Ser val Phe Leu Phe Pro 25
cgg acc cct gag gtc aca
Arg Thr Pro Glu val Thr 40 45
cct gag gtc aag ttc aac Pro Glu Val Lys Phe Asn 60
gcc aag aca aag ccg cgg
Ala Lys Thr Lys Pro Arg 75
gtc age gtc ctc acc gtc
Val Ser Val Leu Thr val 90
tac aag tgc aag gtc tcc
Tyr Lys Cys Lys val ser 105
acc ate tcc aaa gcc aaa
Thr Ile Ser Lys Ala Lys
120 125
ctg ccc cca tcc cgg gat Leu Pro Pro Ser Arg Asp 140
tgc ctg gtc aaa ggc ttc Cys Leu val Lys Gly Phe 155
age aat ggg cag ccg gag Ser Asn Glg Gln Pro Glu
gac tcc gac ggc tcc ttc Asp ser Asp Gly Ser Phe 185
age agg tgg cag cag ggg Ser Arg Trp Gln Gln Gly 200 205
gct ctg cac aac cac tac Ala Leu His Asn His Tyr 220
tga
Thr His Thr Cys pro Pro 10
cca aaa ccc 96
Pro Lys Pro 30
tgc gtg gtg 144
Cys val val
tgg tac gtg 192 Trp Tyr val
gag gag cag 240 Glu Glu Gln 80
ctg cac cag 288 Leu His Gln 95
aac aaa gcc 336 Asn Lys Ala 110
ggg cag ccc 384 Gly Gln Pro
gag ctg acc 432
Glu Leu Thr
tat ccc age 480
Tyr Pro Ser 160
aac aac tac 528
Asn Asn Tyr 175
ttc ctc tac 576
Phe Leu Tyr
190
aac gtc ttc 624
Asn Val Phe
acg cag aag 672 Thr Gln Lys
696
Cys Pro Ala 15 FR2006-084 PCT-ST25.txt Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 25 30
Lys Asp Thr Leu Met lie ser Arg Thr Pro Glu vai Thr Cys vai Val 40 45
Val Asp vai Ser His Glu Asp Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60
Asp Gly vai Glu Val His Asri Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln 85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Ala 100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125
Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro ser 145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe 195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS <222> (1)..C60)
<400> 7
atg tac agg atg caa ctc ctg tct tgc att gca cta agt ctt gca ctt FR2006-084 PCT.ST25.txt Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 10 15
gtc acg aat tca 60
vai Thr Asn Ser 20
<210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 8
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 10 15
Val Thr Asn Ser 20
<210> 9 <211> 1197 <212> DNA <213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS <222> (1)..(1197)
<400> 9
atg agg ctt cgg gag ccg ctc ctg age ggc age gcc gcg atg cca ggc Met Arg Leu Arg Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 10 15
48
gcg tcc cta cag cgg gcc tgc cgc ctg ctc gtg gcc gtc tgc gct ctg 96
Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu vai Ala Val Cys Ala Leu
25 30
cac ctt ggc gtc acc ctc gtt tac tac ctg gct ggc cgc gac ctg age 144
His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 40 45
cgc ctg ccc caa ctg gtc gga gtc tcc aca ccg ctg cag ggc ggc tcg 192
Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln Gly Gly Ser
50 55 60
aac agt gcc gcc gcc ate ggg cag tcc tcc ggg gag ctc cgg acc gga 240
Asn ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln ser ser Gly Glu Leu Arg Thr Gly 65 70 75 80
ggg gcc cgg ccg ccg cct cct cta ggc gcc tcc tcc cag ccg cgc ccg 288
Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser ser Gln Pro Arg Pro 85 90 95
ggt ggc gac tcc age cca gtc gtg gat tet ggc cct ggc ccc gct age
Gly Gly Asp Ser Ser Pro Val vai Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser
100 105 110
336
aac ttg acc tcg gtc cca gtg ccc cac acc acc gea ctg tcg ctg ccc 384
Asn Leu Thr Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 115 120 125
gcc tgc cct gag gag tcc ccg ctg ctt gtg ggc ccc atg ctg att gag 432
Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu vai Gly Pro Met Leu Ile Glu FR2006-084 PCT.ST25.txt 130 135 140
ttt aac atg cct gtg gac ctg gag ctc gtg gca aag cag aac cca aat 480 Phe Asn Met Pro vai Asp Leu Glu Leu vai Ala Lys Gln Asn Pro Asn 145 150 155 160
gtg aag atg ggc ggc cgc tat gcc ccc agg gac tgc gtc tct cct cac 528
vai Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys vai ser Pro His 165 170 175
aag gtg gcc ate ate att cca ttc cgc aac cgg cag gag cac ctc aag 576
Lys vai Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu Lys 180 185 190
tac tgg cta tat tat ttg cat cca gtc ctg cag cgc cag cag ctg gac 624 Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln Gln Leu Asp 195 2OO 205
tat ggc ate tat gtt ate aac cag gcg gga gac act ata ttc aat cgt 672 Tyr Gly Ile Tyr vai Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile Phe Asn Arg 210 215 220
gct aag ctc ctc aat gtt ggc ttt caa gaa gcc ttg aag gac tat gac 720
Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp 225 230 235 240
tac acc tgc ttt gtg ttt agt gac gtg gac ctc att cca atg aat gac 768 Tyr Thr Cys Phe VaT Phe Ser Asp VaI Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp 245 250 255
cat aat gcg tac agg tgt ttt tca cag cca cgg cac att tcc gtt gca 816 His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val Ala 260 265 270
atg gat aag ttt gga ttc age cta cct tat gtt cag tat ttt gga gqt 864
Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr Phe Gly Gly 275 280 285
gtc tct gct cta agt aaa caa cag ttt cta acc ate aat gga ttt cct 912 vai ser Ala Leu ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr lie Asn Gly Phe Pro 290 295 300
aat aat tat tgg ggc tgg gga gga gaa gat gat gac att ttt aac aga 960 Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg 305 310 315 320
tta gtt ttt aga ggc atg tct ata tct cgc cca aat gct gtg gtc ggg 1008 Leu vai Phe Arg Gly Met ser lie ser Arg Pro Asn Ala vai vai Gly 325 330 335
agg tgt cgc atg ate cgc cac tca aga gac aag aaa aat gaa ccc aat 1056 Arg Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn 340 345 350
cct cag agg ttt gac cga att gca cac aca aag gag aca atg ctc tct 1104 Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser 355 360 365
gat ggt ttg aac tca ctc acc tac cag gtg ctg gat gta cag aga tac 1152 Asp Gly Leu Asn ser Leu Thr Tyr Gln VaT Leu Asp Val Gln Arg Tyr 370 375 380
cca ttg tat acc caa ate aca gtg gac ate ggg aca ccg age tag 1197
Pro Leu Tyr Thr Gln Ile Thr VaT Asp Ile GTy Thr Pro Ser 385 390 395
<210> 10 FR2006-084 PCT.ST25.txt
<211> 398 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 10
Met Arg Leu Arq Glu Pro Leu Leu Ser Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 10 15
Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu vai Ala Val Cys Ala Leu 25 30
His Leu Gly vai Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Ser 40 45
Arg Leu Pro Gln Leu vai Gly vai ser Thr Pro Leu Gln Gly Gly ser 50 55 60
Asn Ser Ala Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu Arg Thr Gly 65 70 75 80
Gly Ala Arg Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln Pro Arg Pro 85 90 95
Gly Gly Asp Ser ser Pro vai vai Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser 100 105 110
Asn Leu Thr ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro 115 120 125
Ala Cys Pro Glu Glu ser Pro Leu Leu vai Gly Pro Met Leu Ile Glu 130 135 140
Phe Asn Met Pro Val Asp Leu Glu Leu vai Ala Lys Gln Asn Pro Asn 145 150 155 160
vai Lys Met Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His 165 170 175
Lys vai Ala Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu Lys 180 185 190
Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln Gln Leu Asp 195 200 205
Tyr Gly Ile Tyr vai lie Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile Phe Asn Arg 210 215 220
Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp 225 230 235 240
Tyr Thr Cys Phe Val Phe Ser Asp vai Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp 245 250 255 His Asn Ala Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val Ala 260 265 270
Met Asp Lys Phe Gly Phe ser Leu Pro Tyr vai Gln Tyr Phe Gly Gly 275 280 285
vai ser Ala Leu ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro 290 295 300
Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arq 305 310 315 320
Leu vai Phe Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala vai Val Gly 325 330 335
Arg Cys Arg Met lie Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn 340 345 350
Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser 355 360 365
Asp Gly Leu Asn ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp vai Gln Arg Tyr 370 375 380
Pro Leu Tyr Thr Gln lie Thr vai Asp Ile Gly Thr Pro Ser 385 390 395
<210> 11
<211> 1128
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS <222> (1).,(11283
<400> 11
atg gqa ctc ttg gta ttt gtg cgc aat ctg ctg cta gcc ctc tgc ctc 48
Met Gly Leu Leu Val Phe VaT Arg Asn Leu Leu Leu Ala Leu Cys Leu 10 15
ttt ctg gta ctg gqa ttt ttg tat tat tct gcg tgg aag cta cac tta 96
Phe Leu Val Leu Gly Phe Leu Tyr Tyr Ser Ala Trp Lys Leu His Leu 25 30
ctc cag tgg gag gag gac tcc aat tca gta gtt ctt tcc ttt gac tcc 144
Leu Gln Trp Glu Glu Asp Ser Asn Ser vai Val Leu Ser Phe Asp ser 40 45
gct gga caa aca cta ggc tca gag tat gat cgg ttg ggc ttc ctc ctg 192
Ala Gly Gln Thr Leu Gly Ser Glu Tyr Asp Arg Leu GTy Phe Leu Leu 50 55 60
aat ctg gac tct aaa ctg cct gct gaa tta gcc acc aag tac gca aac 240
Asn Leu Asp Ser Lys Leu Pro Ala Glu Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Asn 65 70 75 80 ttt tca gag gga gct tgc aag cct ggc tat gct tca gcc ttg atg acg 288
Phe Ser Glu Gly Ala Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Met Thr 85 90 95
gcc ate ttc ccc cgg ttc tcc aag cca gea ccc atg ttc ctg gat gac 336
Ala lie Phe Pro Arg Phe Ser Lys Pro Ala Pro Met Phe Leu Asp Asp
100 105 110
tcc ttt cgc aag tgg gct aga ate cgg gag ttc gtg ccg cct ttt ggg 384
Ser Phe Arg Lys Trp Ala Arg Ile Arg Glu Phe Val Pro Pro Phe Gly 115 120 125
ate aaa ggt caa gac aat ctg ate aaa gcc ate ttg tca gtc acc aaa 432
lie Lys Gly Gln Asp Asn Leu Ile Lys Ala Ile Leu Ser vai Thr Lys 130 135 140
gag tac cgc ctg acc cct gcc ttg gac age etc cgc tgc cgc cgc tgc 480
Glu Tyr Arg Leu Thr Pro Ala Leu Asp ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys 145 150 155 160
ate ate gtg ggc aat gga ggc gtt ctt gcc aac aag tet ctg ggg tca 528
lie lie vai Gly Asn Gly Gly vai Leu Ala Asn Lys Ser Leu Gly Ser 165 170 175
cga att gac gac tat gac att gtg gtg aga ctg aat tca gea cca gtg 576
Arg Ile Asp Asp Tyr Asp Ile Val Val Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val
180 185 190
aaa ggc ttt gag aag gac gtg ggc age aaa acg aca ctg cgc ate acc 624
Lys Gly Phe Glu Lys Asp vai Gly Ser Lys Thr Thr Leu Arg Ile Thr 195 200 205
tac ccc gag ggc gcc atg cag cgg cct gag cag tac gag cgc gat tet 672
Tyr Pro Glu Gly Ala Met Gln Arg Pro Glu Gln Tyr Glu Arg Asp Ser 210 215 220
etc ttt gtc ctc gcc ggc ttc aag tgg cag gac ttt aag tgg ttg aaa 720
Leu Phe vai Leu Ala Gly Phe Lys Trp Gln Asp Phe Lys Trp Leu Lys 225 230 235 240
tac ate gtc tac aag gag aga gtg agt gea tcg gat ggc ttc tgg aaa 768
Tyr Ile vai Tyr Lys Glu Arg vai ser Ala Ser Asp Gly Phe Trp Lys 245 250 255
tet gtg gcc act cga gtg ccc aag gag ccc cct gag att cga ate ctc 816
Ser Val Ala Thr Arg Val Pro Lys Glu Pro Pro Glu Ile Arg Ile Leu
260 265 270
aac cca tat ttc ate cag gag gcc gcc ttc acc ctc att ggc ctg ccc 864
Asn Pro Tyr Phe Ile Gln Glu Ala Ala Phe Thr Leu Ile Gly Leu Pro 275 280 285
ttc aac aat ggc ctc atg ggc cgg ggg aac ate cct acc ctt ggc agt 912
Phe Asn Asn Giy Leu Met Gly Arg Gly Asn Ile Pro Thr Leu Gly Ser 290 295 300
gtg gea gtg acc atg gea cta cac ggc tgt gac gag gtg gea gtc gea 960
Val Ala Val Thr Met Ala Leu His Gly Cys Asp Glu VaT Ala vai Ala 305 310 315 320
gga ttt ggc tat gac atg age aca ccc aac gea ccc ctg cac tac tat 1008
Gly Phe Gly Tyr Asp Met Ser Thr Pro Asn Ala Pro Leu His Tyr Tyr 325 330 335
gag acc gtt cgc atg gea gcc ate aaa gag tcc tgg acg cac aat ate 1056
Glu Thr Val Arg Met Ala Ala Ile Lys Glu Ser Trp Thr His Asn Ile
340 345 350 cag cga gag aaa gag ttt ctg cgg aag ctg gtg aaa gct cgc gtc ate 1104 Gln Arg Glu Lys Glu Phe Leu Arg Lys Leu vai Lys Ala Arg Val Ile 355 360 365
act gat cta age agt ggc ate tga Thr Asp Leu Ser ser Gly Ile 370 375
<210> 12
<211> 375
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Gly Leu Leu vai Phe vai Arg Asn Leu Leu Leu Ala Leu Cys Leu 10 15
Phe Leu Val Leu Gly Phe Leu Tyr Tyr Ser Ala Trp Lys Leu His Leu 25 30
Leu Gln Trp Glu Glu Asp Ser Asn Ser vai vai Leu Ser Phe Asp Ser 40 ' 45
Ala Gly Gln Thr Leu Gly Ser Glu Tyr Asp Arg Leu Gly Phe Leu Leu 50 55 60
Asn Leu Asp Ser Lys Leu Pro Ala Glu Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Asn 65 70 75 80
Phe ser Glu Gly Ala Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Met Thr 85 90 95
Ala Ile Phe Pro Arg Phe Ser Lys Pro Ala Pro Met Phe Leu Asp Asp 100 105 110
Ser Phe Arg Lys Trp Ala Arg Ile Arg Glu Phe Val Pro Pro Phe Gly 115 120 125
Ile Lys Gly Gln Asp Asn Leu Ile Lys Ala lie Leu ser Val Thr Lys 130 135 140
Glu Tyr Arg Leu Thr Pro Ala Leu Asp ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys 145 150 155 160
Ile Ile Val Gly Asn Gly Gly vai Leu Ala Asn Lys Ser Leu Gly ser 165 170 175
Arg lie Asp Asp Tyr Asp Ile vai Val Arg Leu Asn Ser Ala Pro vai 180 185 190
Lys Gly Phe Glu Lys Asp vai Gly ser Lys Thr Thr Leu Arg Ile Thr 195 200 205
1128 Tyr Pro Glu Gly Ala Met Gln Arg Pro Glu Gln Tyr Glu Arg Asp Ser 210 215 220
Leu Phe vai Leu Ala Gly Phe Lys Trp Gln Asp Phe Lys Trp Leu Lys 225 230 235 240
Tyr Ile vai Tyr Lys Glu Arg vai Ser Ala ser Asp Gly Phe Trp Lys 245 250 255
Ser Val Ala Thr Arg Val Pro Lys Glu Pro Pro Glu Ile Arg Ile Leu 260 265 270
Asn Pro Tyr Phe Ile Gln Glu Ala Ala Phe Thr Leu Ile Gly Leu Pro 275 280 285
Phe Asn Asn Gly Leu Met Gly Arg Gly Asn lie Pro Thr Leu Gly Ser 290 295 300
vai Ala vai Thr Met Ala Leu His Gly Cys Asp Glu Val Ala Val Ala 305 310 315 320
Gly Phe Gly Tyr Asp Met Ser Thr Pro Asn Ala Pro Leu His Tyr Tyr 325 330 335
Glu Thr Val Arg Met Ala Ala lie Lys Glu Ser Trp Thr His Asn lie 340 345 350
Gln Arg Glu Lys Glu Phe Leu Arg Lys Leu Val Lys Ala Arg Val Ile 355 360 365
Thr Asp Leu Ser Ser Gly Ile 370 375
<210> 13
<211> 1722
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS <222> Cl)·.(1722)
<400> 13
tta gtt gag gat acc aca tta gag cca gaa gag cca cca act aaa tac 48
Leu Val Glu Asp Thr Thr Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr 10 15
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Glu VaT Arg Cys Leu Leu Lys Asp Ala Ala vai Ile Ser Trp Thr Lys 40 45 FR2006-084 PCT.ST25.txt gat ggg gtg cac ttg ggg ccc aac aat agg aca gtg ctt att ggg gag 192
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115 120 125
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cca acc atg cgg tgg ctg aaa aac ggg aag gag ttt aag cag gag cat 528
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624
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210 215 220
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225 230 235 240
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260 265 270
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Asn vai Thr Phe Glu Asp Ala GTy Glu Tyr Thr Cys Leu Ala GTy Asn 305 310 315 320 FR2006-084 PCT.ST25.txt tct att ggg ata tcc ttt cac tct gca tgg ttg aca gtt ctg cca gcg 1008 Ser lie Gly xle Ser Phe His Ser Ala Trp Leu Thr vai Leu Pro Ala 325 330 335
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ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct 1152 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 370 375 380
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aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc 1296 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 420 425 430
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aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc 1392 Lys vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 450 455 460
aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca 1440 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 465 470 475 480
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ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg 1632 GTy Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr VaT Asp Lys Ser Arg Trp 530 535 540
cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac Gln Gln GTy Asn Val Phe Ser Cys Ser vaT Met His Glu Ala Leu His 545 550 555 560
1680
aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tct ccg ggt tga 1722
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GTy 565 570
<210> 14 <211> 573 <212> PRT FR2Q06-084 PCT-ST25.txt
<213> Homo sapiens <400> 14
Leu Val Glu Asp Thr Thr Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Thr Lys Tyr 10 15
Gln rle ser Gln Pro Glu Val Tyr vai Ala Ala Pro Gly Glu ser Leu 25 BO
Glu vai Arg Cys Leu Leu Lys Asp Ala Ala Val Ile Ser Trp Thr Lys 40 45
Asp Gly vai His Leu Gly Pro Asn Asn Arg Thr vai Leu Ile Gly Glu 50 55 60
Tyr Leu Gln Ile Lys Gly Ala Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Ala 65 70 75 80
Cys Thr Ala Ser Arg Thr Val Asp Ser Glu Thr Trp Tyr Phe Met Val 85 90 95
Asn vai Thr Asp Ala He Ser Ser Gly Asp Asp Glu Asp Asp Thr Asp 100 105 110
Gly Ala Glu Asp Phe vai Ser Glu Asn Ser Asn Asn Lys Arg Ala Pro 115 120 125
Tyr Trp Thr Asn Thr Glu Lys Met Glu Lys Arg Leu His Ala vai Pro 130 135 140
Ala Ala Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Gly Gly Asn Pro Met 145 150 155 160
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Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr His Leu Asp vai Val Glu 210 215 220
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ser Thr vai vai Gly Gly Asp vai Glu Phe vai Cys Lys vai Tyr Ser 245 250 255 FR2006-084 PCT,ST25.txt Asp Ala Gln Pro His Ile Gln Trp Ile Lys His vai Glu Lys Asn Gly 260 265 270
Ser Lys Tyr Gly Pro Asp Gly Leu Pro Tyr Leu Lys Val Leu Lys Ala 275 280 285
Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ile Glu Val Leu Tyr Ile Arg 290 295 300
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Ser Ile Gly Ile Ser Phe His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Pro Ala 325 330 335
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 465 470 475 480
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 515 520 525 FR2006-084 PCT.ST25.txt Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 545 550 555 560
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 565 570

Claims (39)

1. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada compreen- dendo uma fusão de um fragmento ou domínio solúvel de um receptor de FGF com uma região Fc de uma imunoglobulina, em que pelo menos o 5o sítio de N-glicosilação da fração receptor de FGF está ocupado, e no máxi- mo 45% dos N-glicanos da dita fração receptor de FGF não têm nenhum grupo sialila.
2. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acordo com a reivindicação 1, em que, além disso, os 3o, 4o, 6o e 7o sítios de N- glicosilação da fração receptor de FGF estão ocupados.
3. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acordo com a reivindicação 2, em que pelo menos 7 sítios de N-glicosilação da fra- ção receptor de FGF estão ocupados.
4. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acordo com a reivindicação 3, em que todos os sítios de N-glicosilação da fração receptor de FGF estão ocupados.
5. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o número médio de ácidos siálicos por N-glicano da fração receptor de FGF é de 0,9 ou mais.
6. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acordo com a reivindicação 5, em que o número médio de ácidos siálicos por N- glicano da fração receptor de FGF é de 1,2 ou mais.
7. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o valor K0 da dita fusão para FGF2 medido por Biacore™ está compreendido entre 1 e 5 nM.
8. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acordo com a reivindicação 7, em que o valor Kd da dita fusão para FGF2 medido por Biacore™ é de cerca de 1,5 nM.
9. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita fusão possui atividades ADCC e/ou CDC.
10. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que os N-glicanos da dita fusão estão 60-100% fucosilados.
11. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada compreende 3 resíduos mano- se, uma média de 1,5 a 3,0 resíduos galactose, uma média de 3,5 a 5 de resíduos N-acetilglucosamina, e uma média de 0,6 a 1 resíduo fucose por molécula de glicano.
12. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que os N-glicanos da dita fusão estão 0-60 % fucosilados.
13. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o receptor de FGF é selecionado de receptor de FGF 1 (FGFR1) ou receptor de FGF 2 (FGFR2).
14. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o receptor de FGF é selecionado de receptor de FGF 1 isotipo Illc e receptor de FGF 2 isotipo 11Io.
15. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o domínio de receptor de FGF solúvel tem uma seqüência conforme exposta em SEQ ID NO: 4, ou uma seqüência com uma identidade de pelo menos 95% com a SEQ ID NO: 4.
16. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a parte Fc tem uma seqüência conforme exposta em SEQ ID NO: 6, ou uma seqüência com uma identidade de pelo menos 95% com a SEQ ID NO: 6.
17. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada também compreende uma se- quência de elo de pelo menos 3 resíduos de aminoácido.
18. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com a reivindicação 17, em que a seqüência de elo é SAL (SerAIaLeu).
19. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que fusão de re- ceptor de FGF e Fc solúvel modificada tem a seqüência polipeptídica expos- ta em SEQ ID NO: 2, ou uma seqüência com uma identidade de pelo menos 95% com a SEQ ID NO: 2.
20. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada também compreende o peptídio de sinal de SEQ ID NO: 8.
21. Polinucleotídeo que codifica a fusão modificada de receptor de FGF de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.
22. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21, em que o dito polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.
23. Vetor compreendendo um polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 21 e 22.
24. Célula compreendendo um vetor como definido na reivindi- cação 23.
25. Fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modificada, de acor- do com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 como um medicamento.
26. Composição farmacêutica compreendendo uma fusão modi- ficada de receptor de FGF como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20.
27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, em que a dita composição contém um agente terapêutico adicional.
28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27, em que o dito agente terapêutico adicional é um agente antiangiogênico ou um agente quimioterápico.
29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação28, em que o dito agente antiangiogênico é um fator de necrose tumoral, ou um antagonista de um fator de crescimento de fibroblastos ácido ou básico (FGF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator tissular (TF), proteí- na C, proteína S, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) ou re- ceptor de HER2.
30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação28, em que o dito agente quimioterápico é selecionado do grupo: agentes antimicrotúbulos; complexos de coordenação de platina; agentes de alquila- ção; agentes antibióticos; inibidores da topoisomerase II; antimetabólitos; inibidores da topoisomerase I; hormônios e análogos de hormônios; inibido- res da via de transdução de sinal; inibidores da angiogênese não receptores de tirosina quinase; agentes imunoterápicos; agentes pró-apoptóticos; e ini- bidores da sinalização do ciclo celular.
31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação28, em que o dito agente quimioterápico é selecionado do grupo do taxol e taxotere.
32. Uso de uma fusão de receptor de FGF e Fc solúvel modifi- cada como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 20 para a preparação de um medicamento para tratamento de câncer.
33. Uso, de acordo com a reivindicação 32, compreendendo o uso de um agente terapêutico adicional na fabricação da mesma composi- ção ou de uma diferente.
34. Uso, de acordo com a reivindicação 33, em que o dito agente terapêutico adicional é um agente antiangiogênico ou um agente quimioterá- pico.
35. Uso, de acordo com a reivindicação 34, em que o dito agente antiangiogênico é um fator de necrose tumoral, ou um antagonista de um fator de crescmento de fibroblastos ácido ou básico (FGF), fator de cresci- mento de hepatócitos (HGF), fator tissular (TF), proteína C, proteína S, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) ou receptor de HER2.
36. Uso, de acordo com a reivindicação 34, em que o dito agente quimioterápico é selecionado do grupo: agentes antimicrotúbulos; complexos de coordenação de platina; agentes de alquilação; agentes antibióticos; ini- bidores da topoisomerase II; antimetabólitos; inibidores da topoisomerase I; hormônios e análogos de hormônios; inibidores da via de transdução de si- nal; inibidores da angiogênese não receptores de tirosina quinase; agentes imunoterápicos; agentes pró-apoptóticos; e inibidores da sinalização do ciclo celular.
37. Uso1 de acordo com a reivindicação 34, em que o dito agente quimioterápico é selecionado do grupo do taxol e taxotere.
38. Uso, de acordo com a reivindicação 32, em que o dito câncer é selecionado do grupo de carcinoma, incluindo o de bexiga, mama, cólon, cabeça e pescoço, rim, incluindo carcinoma de células renais, fígado, pul- mão, ovário, pâncreas, estômago, cérvix, tireóide e pele; incluindo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, inclu- indo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, Iin- foma de células B, Iinfoma de células T, Iinfoma de Burkitt; tumores hemato- poiéticos de linhagem mielóide, incluindo Ieucemias mielogênicas agudas e crônicas e leucemia pró-mielocítica; tumores de origem mesenquimal, inclu- indo fibrosarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melano- ma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do siste- ma nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glio- ma e schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrosarco- ma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo mela- noma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, câncer folicular de tireóide e teratocarcinoma.
39. Uso, de acordo com a reivindicação 38, em que o dito câncer é selecionado do grupo de melanoma, leucemia, câncer renal, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama e câncer de cabeça e pescoço.
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