ES2366160T3 - Fusiones de fc con receptor para fgf soluble modificadas con actividad biológica mejorada. - Google Patents
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Abstract
Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada que comprende una fusión de un fragmento o dominio soluble de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, en donde el número promedio de ácido siálico por N-glicano del resto receptor para FGF es 0,9 o superior.
Description
Campo de la invención e Introducción
La invención se refiere a fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas que comprenden una fusión de un fragmento o dominio soluble del receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, que tienen actividad biológica mejorada, composiciones que las contienen, y método para producir tales moléculas de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificadas. Particularmente, las fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas han mejorado la actividad anti-angiogénica y las actividades de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos anti-tumorales, concretamente ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) y/o CDC (citotoxicidad dependiente de complemento), y son así útiles en el tratamiento de cáncer, tumores metastáticos y para reducir el crecimiento tumoral en un sujeto. La invención se refiere además a dichas fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas para usar en la inhibición del crecimiento tumoral y para el tratamiento o prevención de situaciones patológicas que incluyen, aunque no están limitadas a, cáncer de mama, melanoma, leucemia, metástasis cerebral, cáncer renal, melanoma primario, cáncer de colon primario, cáncer de vesícula primario, hemangioma infantil, cáncer de ovario, cáncer de próstata y cáncer de pulmón.
Antecedentes y Relevancia de la Invención
La angiogénesis, es decir, la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los pre-existentes, implica una compleja coordinación de proliferación de células endoteliales, migración, degradación de la membrana basal, y organización de los nuevos vasos (Ji et al., 1998, FASEB J. 12:1731-1738). La liberación local, incontrolada, de factores de crecimiento angiogénicos y/o alteraciones de la producción de inhibidores angiogénicos naturales, con una posterior alteración del balance angiogénico (Hanahan et al, 1996, Cell. 86: 353-64) son responsables de la proliferación incontrolada de células endoteliales que tiene lugar durante la neovascularización tumoral y en las enfermedades dependientes de angiogénesis (Folkman, 1995, Nat. Med. 1:27-31).
Se han identificado numerosos inductores naturales de angiogénesis, incluyendo miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, que transforman el factor de crecimiento α y β (TGF-α y β), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factor-a de necrosis tumoral (TNF- a), interleuquinas, quemocinas, y los miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Estos potentes factores angiogénicos están a menudo sobre-expresados por tejidos tumorales (Presta, 2005, Cytokine & Growth Factors Reviews. 16: 159-178; Grose, 2005, Cytokine & Growth Factors Reviews. 16: 179-186).
De hecho, los FGFs, y más especialmente FGF2, están sobre-expresados en numerosos cánceres humanos que incluyen melanoma (Halaban, 1996, Semin Oncol. 23:673-81; Hanada, 2001, Cancer Res. 61: 5511-5516), leucemia (Krejci et al, 2001 Leukemia. 15:228-37, Bieker et al, 2003, Cancer Res. 63: 7241-7246), cáncer renal (Hanada, 2001, Cancer Res. 61: 5511-5516), cáncer de colon (Tassi, 2006, Cancer Res. 66:1191-1198), cáncer de ovario (Whitworth et al, 2005, Clin Cancer Res. 11:4282-4288, Gan et al, 2006, Pharm Res. 23:1324-31), cáncer de próstata (Aigner et al, 2002 Oncogene, 21:5733-42; Kwabi-Addo et al, 2004, Endocr Relat Cancer. 11:709-24) y cáncer de pulmón (Takanami et al, 1996, Pathol Res Pract. 192:1113-20; Volm et al, 1997, Anticancer Res. 17:99103; Brattstrom et al, 1998, Anticancer Res. 18: 1123-1127). Además, la sobre-expresión de FGF2 puede correlacionarse con una quimioresistencia en ciertos cánceres que incluyen cánceres de vejiga, mama, cabeza y cuello (Gan et al, 2006, Pharm Res. 23:1324-31). Con respecto a los miembros de la familia de FGF, como los FGFs secretados por células tumorales tienen afinidades por las cadenas laterales de glicosaminoglicanos de los proteoglicanos de la superficie y matriz celular, estos FGFs secretados se retienen más probablemente cerca de células tumorales que forman depósitos de FGF. Esta particularidad hace que el FGF dirija una buena estrategia para dirigir una molécula activa que necesita una molécula diana expresada de forma estable y fácilmente accesible.
Diversos productos basados en anticuerpos se usan normalmente como fármacos terapéuticos y diversos anticuerpos monoclonales (mAbs) están aprobados actualmente en diversas áreas terapéuticas tales como oncología, inflamación, enfermedad infecciosa y enfermedad cardiovascular. Estos mAbs inducen la matanza de células tumorales mediante múltiples mecanismos que incluyen el reclutamiento del sistema inmune (Harris, 2004, Lancet Oncol, 5: 292-302). El resto Fc de los mAbs es responsable de estas funciones inductoras mediadas de forma inmune que incluyen dos mecanismos principales: Citotoxicidad mediada por Células Dependientes de Anticuerpos (ADCC) y Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC). ADCC se da cuando un mAb se enlaza primero por medio de su sitio de enlace a antígeno a su diana en las células tumorales, y después la parte Fc se reconoce mediante receptores Fc específicos (FcR) en las células inductoras (es decir, NK, neutrófilos, macrófagos...) que atacan a la célula diana. CDC es un proceso donde una cascada de proteínas complemento diferentes se activan cuando un mAb se enlaza a C1q llevando a la formación de C3b en la superficie de células tumorales recubiertas con anticuerpos cerca del sitio de activación del complemento. La presencia de C3b controla la formación del complejo de ataque a la membrana C5-C9 que puede insertarse en la membrana para lisar células tumorales (Sharkey, 2007, CA Cancer J Clin, 56: 226-243). La capacidad de los mAbs para estimular ADCC depende de su isotipo. Los anticuerpos IgG1 e IgG3 enlazan fuertemente con FcRs, mientras que los anticuerpos IgG4 e IgG2 enlazan débilmente. La capacidad CDC de mAb también depende del isotipo de mAb. IgG3 y, en menor grado, IgG1 son los isotipos más eficaces para estimular la cascada de complemente clásica. Los mAbs de IgG2 son menos eficaces en la activación de la cascada de complemento, mientras que IgG4 es incapaz de hacerlo (Strome, 2007, The Oncologist, 12:1084-1095).
El uso de una proteína de fusión que puede tener, como los anticuerpos, una funcionalidad dual con una parte de enlace que muestra un reconocimiento específico y una parte inductora capaz de inducir la lisis de células diana por reclutamiento del sistema inmune, es un aspecto de estas estrategias terapéuticas. Además, para ser útil en terapia, esta molécula necesitaría tener propiedades farmacocinéticas PK ventajosas. El resto Fc puede aumentar de forma detectable la vida media en suero de la fusión Fc con receptor FGF soluble modificado, aunque hay aún una necesidad de proteína de fusión con una vida media en suero más larga. Finalmente, si esta proteína de fusión se va a usar como un fármaco, es necesario que se produzca de forma fiable, eficaz y con productividad apropiada.
Así, hay una necesidad de una proteína de fusión con actividades ADCC y/o CDC que dirijan el FGF para el tratamiento de cáncer, tumores metastáticos y para reducir el crecimiento tumoral en un sujeto, con características PK mejoradas, y que pueda producirse de forma eficaz.
Se han descrito diferentes fusiones Fc con receptores para FGF solubles en técnicas anteriores pero ninguna de ellas se produjeron en una línea celular modificada para mejorar sus propiedades (Powell, 2002, J. Biol. Chem, 277:28554-28563 ; Anderson, 1998, Hum. Mol. Genet., 7:1475-1483; documento WO00/46380).
Los solicitantes han descubierto ahora que las proteínas de fusión solubles entre la parte del receptor para FGF soluble (resto de enlace o director) y la parte Fc (resto de función inductora) (sFGFR-Fc) que se modifican para tener un perfil glicano particular tienen, de hecho, actividades biológicas esencialmente mejoradas, que incluyen las actividades ADCC y/o CDC, y pueden usarse así como eficaces fármacos anti-angiogénicos y anti-tumorales, para el tratamiento de crecimiento celular incontrolado o cáncer. Estas proteínas de fusión solubles modificadas tienen ventajosas propiedades PK debido a su grado de sialilación, y pueden producirse con productividad apropiada y agregación mínima por su patrón de glicosilación.
La presente invención está dirigida así a un Fc con receptor para FGF soluble modificado que comprende una fusión de un fragmento o dominio soluble de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, en donde al menos el 5º sitio de N-glicosilación del resto receptor para FGF está ocupado, y en donde como máximo el 45% de los N-glicanos del resto de receptor para FGF no tienen grupo sialilo. Además, según una realización preferida adicional de la invención, los sitios 3º, 4º, 6º y 7º de N-glicosilación del resto del receptor para FGF están ocupados. Preferiblemente, todos los sitios de N-glicosilación están ocupados. En una realización preferida adicional, el número promedio de ácido siálico por N-glicano en el resto del receptor para FGF de las fusiones de la invención es al menos 0,9; incluso más preferiblemente, es al menos 1,2. Cada molécula de N-glicano de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la presente invención comprende 3 residuos de manosa, por término medio de 1,5 a 3,0 residuos de galactosa, de 3,5 a 5 residuos de N-acetilglucosamina, y de 0,6 a 1 residuos de fucosa.
La presente invención está dirigida también a fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas que comprenden una fusión de un fragmento o dominio soluble de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, en donde todos los sitios de N-glicosilación están ocupados, y en donde como máximo el 45% de los N-glicanos del resto de receptor para FGF no tienen grupo sialilo, y en donde el N-glicano de la región Fc está fucosilado de 60 a 100%.
En una realización, el fragmento o dominio soluble del receptor para FGF es el dominio soluble o extracelular del receptor 1 para FGF (sFGFR1) o del receptor 2 para FGF (sFGFR2).
En otra realización, el fragmento o dominio soluble del receptor para FGF es el dominio soluble o extracelular del isotipo o variante IIIc del receptor 1 para FGF (sFGFR1(lllc)) o del isotipo IIIc del receptor 2 para FGF (sFGFR2(lllc)).
Según una realización preferida, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada está codificada por un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1, o un polinucleótido que tiene una identidad de al menos 80% con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2.
La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención tiene actividad ADCC y/o CDC y es así útil para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer.
La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas.
La presente invención se refiere además a la combinación de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada con un agente quimioterapéutico o un agente bioterapéutico con propiedades anti-tumorales y/o anti-angiogénicas.
Otro objeto de la presente invención es un método para el tratamiento del cáncer, o un método para prevenir o reducir el crecimiento y volumen tumorales y los tumores metastáticos, que comprende administrar a un sujeto la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la presente invención en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Las Figuras 1A y B muestran mapas de los vectores de expresión para SIAT6 (ST3GAL3) y B4GT1 (B4GALT1), respectivamente.
Las Figuras 2 A y B muestran las secuencias de ácido nucleico (SEQ ID NO. 9) y aminoácido (SEQ ID NO. 10) de B4GT1 (B4GALT1) para la expresión a partir de pXL4551
Las Figuras 3 Ay B muestran las secuencias de ácido nucleico (SEQ ID NO. 11) y aminoácido (SEQ ID NO. 12) de SIAT6 (ST3GAL3) para la expresión a partir de pXL4544
La Figura 4 A corresponde a la secuencia de ácido nucleico de sFGFR2-Fc para la expresión a partir de pXL4410, pXL4429 o pXL4636 (SEQ ID NO. 1), la Fig 4B a la secuencia de aminoácidos de sFGFR2-Fc (los sitios de N-glicosilación se indican en el tipo destacado) codificada por pXL4410, pXL4429 o pXL4636 (SEQ ID NO. 2), la Fig 4C a la secuencia de aminoácidos de sFGFR2 (SEQ ID NO. 4), la Fig 4 D a la secuencia de aminoácidos de Fc (SEQ ID NO. 6), la Fig 4 E a la secuencia de aminoácidos del ligador, y la Fig 4F a la secuencia de aminoácidos del péptido de señal (SEQ ID NO. 8). Es el péptido de señal descrito para la interleuquina-2. Se observó que la fusión de este péptido corriente arriba de la secuencia representada por SEQ ID NO. 2 lleva a una proteína secretada con una secuencia de aminoácidos N-terminal homogénea.
La Figura 5 es una representación esquemática de la estrategia usada para construir pXL4636, codificando sFGFR2-Fc y Glutamina Sintetasa
Las Figuras 6 A yB muestran mapas de los vectores de expresión pXL4429 para sFGFR2-Fc y DHFR y pXL4417 que codifican el gen de resistencia a la neomicina.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la correlación entre el número promedio de ácido siálico por sFGFR2 Nglicano y el aclaramiento de sFGFR2-Fc en sangre - Relación óptima > 1,2. Relación preferida > 0,9.
La Figura 8 muestra SDS-PAGE (condiciones no reductoras) de 1 µg de sFGFR2-Fc incubado en ausencia (-) o en presencia (+) de PNGasa F. M: marcador de peso molecular
La Figura 9 muestra la posición de N-glicano y la numeración en el dímero sFGFR2-Fc. La numeración comienza a partir de la secuencia de aminoácidos N-terminal de FGFR2 (FGFR2_HUMANO) de manera que la posición N1 corresponde a Asn83, N2 a Asn123, N3 a Asn228, N4 a Asn241, N5 a Asn 265, N6 a Asn 297, N7 a Asn318, N8 a Asn331. La posición N297 corresponde a la posición Asn en el Fc humano (IgG1).
La Figura 10 es un gráfico que muestra las cinéticas de desaparición de proteína sFGFR2-Fc (cuadrados) en sangre en el tiempo hasta 72 horas.
La Figura 11 muestra las cantidades de recuperaciones de proteína sFGFR2-Fc en plasma e hígado, expresadas en % de dosis inyectada.
La Figura 12 es un gráfico del análisis del volumen del tumor A549 después del tratamiento hasta el día 40 (100 μg/ratón/administración: triángulos; 300 μg/ratón/administración: cuadrados; 500 μg/ratón/administración: círculos llenos; control con PBS: círculos huecos).
La Figura 13 es un gráfico del análisis del peso del tumor A549 después del tratamiento en el día 40.
La Figura 14 es un gráfico del análisis del volumen del tumor H460 después del tratamiento hasta el día 22 (grupo tratado: círculos llenos; grupo de control con PBS: círculos huecos).
La Figura 15 es un gráfico del análisis del peso del tumor H460 después del tratamiento en el día 22.
La Figura 16 es un gráfico de la evaluación de la actividad ADCC in vitro de sFGFR2-Fc en células tumorales H460 y A549.
La Figura 17 muestra gráficos del análisis de volumen del tumor A549 cuando se implanta en tres cepas de ratón, es decir SCID (Fig. 17A), NOD/SCID (Fig. 17B) y SCID/bg (Fig. 17C), hasta el día 41 (sFGFR2-Fc 100 µg/ratón/administración: diamantes; control de PBS: círculos huecos).
La Figura 18 muestra gráficos del análisis de volumen del tumor H460 cuando se implanta en tres cepas de ratón, es decir SCID (Fig. 18A), NOD/SCID (Fig. 18B) y SCID/bg (Fig. 18C), hasta el día 22 (sFGFR2-Fc 100 µg/ratón/administración: diamantes; control de PBS: círculos huecos).
La Figura 19A muestra un mapa del plásmido que codifica sFGFR2-Fc (A265 en Fc), y la Fig. 19B muestra la secuencia de proteína de sFGFR2-Fc (A265 en Fc) (SEQ ID NO. 14). La posición 392 es la posición de la mutación en el dominio Fc (Asp265Ala) y se representa en tipo marcado.
La Figura 20 es un gráfico que muestra el análisis de volumen del tumor H460 cuando se implanta en cepas de ratón desnudo hasta el día 23 (círculos huecos: control de PBS; diamantes: sFGFR2-Fc 500 µg/ratón/administración; cuadrado hueco: sFGFR2-Fc (A265Fc) 500 µg/ratón/administración). **: p<0,01 frente a control Anova & Newman-Keuls después del ensayo).
Descripción Detallada
A lo largo de esta memoria descriptiva, los solicitantes hacen referencia a artículos de revistas, documentos de patente, referencias publicadas, páginas de Internet, información de secuencias disponible en bases de datos y otras fuentes de información. Un experto en la técnica puede usar todo el contenido de cualquiera de las fuentes de información citadas para crear y emplear aspectos de esta invención. Todas y cada una de las fuentes de información citadas se incorporan de forma específica, en su totalidad y por referencia, en este documento. Partes de estas fuentes pueden incluirse en este documento según se permita o se necesite. Sin embargo, el significado de cualquier término o frase específicamente definido o explicado en esta memoria descriptiva no debe ser modificado por el contenido de ninguna de las fuentes. La descripción y los ejemplos que siguen son meramente ilustrativos del alcance de esta invención y del contenido de esta memoria descriptiva. Un experto en la técnica puede diseñar y construir numerosas modificaciones de los ejemplos que figuran a continuación, sin salirse del alcance de esta invención.
La presente invención se refiere a fusiones de proteína soluble que comprende dominios de receptores para FGF. La invención abarca en general fragmentos, dominios, y especialmente dominios solubles o extracelulares, de receptor para FGF. El dominio extracelular del receptor para FGF está unido a un copartícipe apropiado en la fusión, tal como una unidad Fc de inmunoglobulina. Por tanto, en el sentido más amplio, las fusiones con receptor para FGF soluble modificadas, de la invención, pueden ser proteínas, fragmentos, dominios, dominios extracelulares, dominios solubles, y cualquiera de éstos, de receptor para FGF (FGFR), unidos a un copartícipe en la fusión, en especial un copartícipe de fusión consistente en una región Fc.
Este solicitante ha encontrado que una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada que comprende una fusión de un dominio soluble de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina en donde como mucho el 45% de los N-glicanos no tienen grupo sialilo, tiene propiedades ventajosas. Las ventajas del patrón de sialilación de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención, incluyen un mejor perfil farmacocinético y una resistencia mejorada a la escisión in vivo.
Típicamente los N-glicanos están unidos de forma co-translacional a través de residuos específicos de asparagina (Asn). La secuencia de consenso Asn-X-Ser/Thr (donde X es cualquier aminoácido excepto Pro) es esencial, aunque no suficiente, en que la estructura secundaria local puede determinar la adición (Jefferis et al., 2006, Nature Biotechnology 24:1241). Se cree que diversos factores explican los sitios de N-glicosilación no ocupados (Jones et al., 2005, Biochimica et Biophysica Acta 1726: 121). Varios sitios de N-glicosilación están presentes en los receptores para FGF soluble de la invención. Por ejemplo, hay 8 sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular de FGFR2IIIc (véase Fig. 9). Los N-glicanos contienen un núcleo de oligosacárido conservado unido a Asn. Este núcleo está compuesto de tres residuos de monosacárido manosa (Man) y dos N-acetilglucosamina (GlcNAcs). Se unen normalmente GlcNacs adicionales a β1,2-unidos a la α6 Man o α3 Man, mientras el ácido N-acetilneuramínico (NeuAcα2,6), galactosa (Galβ1,4), fucosa (Fucα1,6) y GlcNAc bisectriz (β1,4) pueden estar presentes o ausentes (Jefferis et al., 2006, Nature Biotechnology 24:1241).
El solicitante ha demostrado que la presencia de un N-glicano en el 5º sitio de N-glicosilación a partir del N-terminal del resto FGFR confiere propiedades ventajosas para la productividad y baja agregación, como se muestra en los Ejemplos Experimentales. En particular, en ausencia de glicosilación en este sitio particular, la productividad cae dramáticamente, mientras que la agregación se aumenta. Además, la presencia de este N-glicano se encontró que era necesario para la unión de FGF.
La presente invención está dirigida así a una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada que comprende una fusión de un dominio soluble de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, en donde al menos el 5º sitio de N-glicosilación del resto receptor para FGF está ocupado, y como máximo el 45% de los Nglicanos de dicho resto de receptor para FGF no tienen grupo sialilo.
Según una realización adicional de la invención, los sitios 3º, 4º, 6º y 7º de N-glicosilación del resto del receptor para FGF están ocupados. Cuando al menos 7 de los sitios de N-glicosilación del resto del receptor para FGF están glicosilados, la fusión de la invención tiene incluso mejores propiedades ya que tiene en cuenta la productividad y la baja agregación. Así, en otro aspecto, la invención está dirigida a una fusión de un fragmento o dominio soluble de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, en donde al menos 7 sitios de N-glicosilación están ocupados y como máximo el 45% de los N-glicanos de la fusión Fc del receptor para FGF no tienen grupo sialilo. En una realización específica de la invención, todos los sitios de N-glicosilación están ocupados.
En otro aspecto, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención tiene un número promedio de ácido siálico por N-glicano del resto receptor para FGF que es al menos 0,9, es decir, este número puede ser 0,9 o cualquier valor por encima de 0,9. En una realización preferida, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención tiene un número promedio de ácido siálico por N-glicano de al menos 1,2. Dicha relación se encontró por el solicitante para asegurar una concentración maximizada en la sangre de la fusión con receptor para FGF soluble de la invención, que sería comparable a la concentración óptima en sangre encontrada para moléculas Fc.
La presente invención está dirigida además a una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada que comprende una fusión de un fragmento o dominio solubles de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, en donde todos los sitios de N-glicosilación están ocupados, y en donde como máximo el 45% de los N-glicanos del resto de receptor para FGF no tiene grupo sialilo y en donde los N-glicanos de la región Fc no están fucosilados. En otra realización, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención está parcialmente fucosilada, por ejemplo, 0 a 60% fucosilada. En aún otra realización, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención está totalmente fucosilada. En una realización preferida, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención está de 60 a 100% fucosilada. En una realización preferida adicional, cada molécula de N-glicano de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la presente invención, comprende además 3 residuos de manosa y una media de 1,5 a 3,0 residuos de galactosa, de 3,5 a 5 de N-acetilglucosamina por molécula de glicano, y de 0,6 a 1 residuos de fucosa.
Según la invención, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada enlaza el ligando FGF con alta afinidad. Por ejemplo, dicha fusión enlaza el FGF2 con un valor KD medido por Biacore™ comprendido entre 1 y 5 nM. En una realización preferida de la invención, el valor KD de dicha fusión para FGF2 medido por Biacore™ es alrededor de 1,5 nM.
Dichas fusiones modificadas como se describen arriba son útiles como inhibidores potentes y terapéuticamente eficaces del crecimiento tumoral. Es más, el solicitante ha demostrado que las fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas de la invención son capaces de inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Además, dichas fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas de la invención son capaces de provocar respuestas ADCC y/o CDC tanto in vitro como in vivo. Como moléculas mediadoras de ADCC y/o CDC eficaces, estos compuestos son especialmente útiles para tratar tumores cancerosos que sobre-expresan FGF.
Las secuencias de FGFR empleadas para los compuestos de FGFR, longitud completa o fragmentos de un FGFR, secuencias de FGFR sintéticas, dominios extracelulares, dominios solubles o fusiones de éstos, pueden ser elegidas entre cualquier secuencia disponible o conocida. El FGFR pertenece a la familia de receptores de tirosina quinasa, y a la familia del supergen de las inmunoglobulinas (Ig). En las formas transmembrana del receptor, el dominio de tirosina quinasa es intracelular y los dominios semejantes a Ig son extracelulares. Tanto la forma transmembrana como la forma secretada se unen a FGF. Hay al menos cuatro genes que codifican los FGFRs que tienen una estructura común de dos o tres bucles similares a inmunoglobulina (Ig) extracelulares (Igl-Iglll) y un dominio de tirosina-quinasa intracelular. También se conocen productos de escisión alternativa, procedentes de exones que codifican la región extracelular, y que dan lugar a múltiples formas de receptor. El tercer bucle semejante a Ig lleva al menos a tres variantes de receptor y se producen dos formas transmembrana por escisión alternativa de dos exones (IIIb y IIIc) que codifican la segunda mitad del bucle III. Por ejemplo, se usa un sitio de poliadenilación selectiva que precede a los exones lllb y lllc para producir una forma soluble de FGFR1 (IlIa). En seres humanos y en ratones, la variante de escisión Igllla de FGFR1 codifica una proteína que aparentemente carece de dominio transmembrana hidrófobo y que, por tanto, puede ser una forma secretada o soluble del receptor. Los compuestos de FGFR pueden utilizar también secuencias de FGFR1 (locus de proteína en NCBI, NP_075598); de FGFR2 (locus de proteína en NCBI, NP_000132); de FGFR3 (locus de proteína en NCBI, P22607); y FGFR4 (locus de proteína en NCBI, NP_002002) (Kiefer et al., 1991, Growth Factors 5:115-127).
También se han tratado formas solubles de receptores para FGF, que comprenden los dominios extracelulares, en las Pat. de EE.UU. Núms. 5.288.855; 6.656.728; WO 91/00916; WO 92/00999; WO 00/46380; WO 2005/016966; WO 2005/113295; WO 2006/113277; WO 2007/014123; y Patente Europea 529 076. Los fragmentos, dominios, o dominios solubles o extracelulares de FGFR, tal como se usan en la invención, pueden incluir el fragmento de un FGFR que sea extracelular en su forma nativa o que consista en toda o parte de la forma naturalmente secretada. Además, las secuencias de FGFR usadas en esta invención pueden ser las específicamente descritas o enumeradas, y secuencias que tengan una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% o 90% a lo largo de toda la secuencia polipeptídica descrita o dibujada, o que tengan una identidad de secuencia de ácido nucleico de aproximadamente 95%, 90%, 85%, 80% o 75% a lo largo de la región que codifica el polipéptido para ácidos nucleicos que codifiquen las secuencias de FGFR de la invención. El fragmento o dominio podría incluir también aminoácidos adicionales u otras regiones del FGFR siempre que estos aminoácidos o regiones adicionales no eviten o reduzcan de manera significativa la capacidad del compuesto de FGFR para ser empleado tal como se describe en esta invención. Un polipéptido o proteína de fusión que consista esencialmente en un dominio o fragmento de FGFR puede contener otros aminoácidos siempre que se conserve la capacidad de expresarse en una célula de mamífero y la de unirse a FGF, y además, opcionalmente, siempre que se conserve la capacidad de reducir el crecimiento celular o de reducir la vascularización.
En una realización, el fragmento o dominio soluble del receptor para FGF es el dominio soluble o extracelular del receptor 1 para FGF (sFGFR1) o del receptor 2 para FGF (sFGFR2).
Los fragmentos de FGFR1 y de FGFR2 seleccionados pueden tener una o más de las siguientes mutaciones: una deleción N-terminal; de 1-7 aminoácidos; o sustitución en el extremo N; una deleción de la secuencia del bucle 1; una deleción de la secuencia de la caja ácida. Los polinucleótidos que codifican mutantes de secuencia de aminoácidos pueden prepararse por una variedad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, aunque no están limitados a, mutagénesis mediada (o dirigida al sitio) por oligonucleótidos, mutagénesis por PRC y mutagénesis en módulo de una versión mutante o no mutante preparada anteriormente de la molécula de interés (véase, por ejemplo, Kunkel, 1985, Proc Natl Acad Sci USA 82:488).
En otra realización, el fragmento o dominio soluble del receptor para FGF es el dominio soluble o extracelular del isotipo IIIc del receptor 1 para FGF (sFGFR1(lllc)) y del isotipo IIIc del receptor 2 para FGF (sFGFR2(lllc)).
Las realizaciones preferidas incluyen el fragmento o dominio soluble del isotipo o variante IIIc del receptor 2 para FGF codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3, y/o que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o bien una secuencia con una identidad de al menos 95%, 97%, 98% o 99% con la SEQ ID NO: 4.
De acuerdo con esta última realización, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada (sFGFR2-Fc) de la presente invención tiene ventajosamente una alta afinidad hacia su ligando natural FGF2 o un elevado valor de KD en el orden nanomolar, comprendido entre 1 y 5 nM, y más exactamente en torno a 1,5 nM.
Los ejemplos específicos de dominios de inmunoglobulina incluyen, aunque no están limitados a, la región Fc de una molécula de inmunoglobulina; la región bisagra de una molécula de inmunoglobulina; la región CH1 de una molécula de inmunoglobulina; la región CH2 de una molécula de inmunoglobulina; la región CH3 de una molécula de inmunoglobulina; la región CH4 de una molécula de inmunoglobulina; y la cadena ligera de una molécula de inmunoglobulina y variantes humanizadas de cualquiera de éstas. Las secuencias para estas regiones están disponibles también para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Huck et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14:1779).
Tal como se emplea en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión "región Fc de inmunoglobulina
o Fc" significa la parte carboxilo terminal de una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina. Las regiones Fc son particularmente importantes para determinar las funciones biológicas de la inmunoglobulina, y estas funciones biológicas se denominan funciones de inductor. Como se sabe en la técnica, las cadenas pesadas de las subclases de inmunoglobulina comprenden cuatro o cinco dominios: IgM y la IgE tienen cinco dominios de cadena pesada, e IgA, IgD e IgG tienen cuatro dominios de cadena pesada. La región Fc de IgA, IgD e IgG es un dímero de los dominios bisagra-CH2--CH3, y en IgM e IgE es un dímero de los dominios bisagra-CH2--CH3--CH4. Además, el dominio CH3 de IgM y IgE es estructuralmente equivalente al dominio CH2 de IgG, y el dominio CH4 de IgM y IgE es el homólogo del dominio CH3 de IgG (véase, W. E. Paul, ed., 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, Nueva York). Cualquiera de las regiones Fc conocidas sería útil como la región Fc en las fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas de la invención.
En una realización, el gen que codifica la región Fc de la IgG humana (Fcγ) se obtiene por transcripción inversa y PCR usando ARN preparado a partir de leucocitos humanos y cebadores 5' y 3' apropiados. Los fragmentos de ADN resultantes contienen secuencias completas de los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG, y se pueden usar como plantilla para generar variantes en las que están sustituidos ciertos aminoácidos, como se conoce en la técnica. Se puede incorporar en el proceso PCR un cebador que codifica un enlazador peptídico, que incluye un sitio para enzima de restricción adicional. Los fragmentos de ADN resultantes se insertan en un vector soporte, y se confirman por secuenciación de ADN.
Se usa preferiblemente la región Fc de la inmunoglobulina gamma-1, que incluye al menos parte de la región bisagra, la región CH1, la región CH2 y la región CH3. Además, la región Fc de la inmunoglobulina gamma-1 puede ser una Fc que ha sufrido deleción en CH1 o una Fc que ha sufrido deleción en CH2, e incluye una parte de una región bisagra y una región CH3 en donde ha sufrido deleción la región CH1 y/o CH2. Se ha descrito una Fc con deleción de CH2 por Gillies et al. (1990, Hum. Antibod. Hybridomas, 1:47).
Lo más preferiblemente, la región Fc de lgG1 comprende la secuencia codificada por un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 5, y/o la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 o bien una secuencia con una identidad de al menos 95% con la SEQ ID NO: 6. No obstante, también serían útiles regiones Fc de las otras clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE e IgM como la región Fc.
Se puede preparar, además, construcciones por deleción de estas regiones Fc, en las que han sufrido deleción uno
o más de los dominios constantes. Un experto ordinario en la técnica podría preparar tales construcciones por deleción empleando técnicas de biología molecular bien conocidas. Además, la región Fc empleada puede ser una que tenga una identidad de aminoácidos de aproximadamente 99%, o aproximadamente 98%, o aproximadamente 95%, o aproximadamente 90%, o aproximadamente 85%, o aproximadamente 80%, o aproximadamente 75% respecto a la mostrada en SEQ ID NO:6.
Son mutaciones específicas en comparación a SEQ ID NO: 6 que pueden seleccionarse y usarse individualmente o en cualquier combinación: una deleción o sustitución de una de las Cys dentro de los 20 primeros aminoácidos desde el extremo N; una deleción de Cys en la posición 5 de la SEQ ID NO: 6; o una sustitución de Cys en la posición 5. La secuencia de región Fc elegida puede incrementar de manera detectable la vida media de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada en el suero.
La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención puede comprender una región bisagra o espaciadora que puede usarse entre la parte de receptor soluble y la región Fc (Ashkenazi et al., 1997, Current Opinion in Immunology, 9:195-200). Los ejemplos incluyen un enlazador peptídico flexible con una longitud de aproximadamente 20 aminoácidos o menos. Más preferiblemente, el enlazador peptídico puede tener una longitud de al menos tres aminoácidos, y/o un enlazador peptídico que comprenda dos o más de los siguientes aminoácidos: glicina, serina, alanina y treonina. En una realización preferida, el enlazador peptídico no incluye un sitio de escisión por proteasa. El enlazador más preferido es SAL (Ser-Ala-Leu).
La presente invención proporciona además la construcción de polinucleótidos que codifican la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la presente invención, así como un vector que es capaz de expresar la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada cuando se introduce en una célula huésped apropiada. Según la realización preferida, el polinucleótido que codifica la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que comparte al menos 80% de la identidad con la SEQ ID NO: 1. Tal como se usa en este documento, se entiende que el término "vector" significa cualquier ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de interés y es capaz de incorporarse a una célula huésped y expresar opcionalmente una proteína o polipéptido codificados. Los vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos y similares, todos ellos dentro de los conocimientos de una persona experta en la técnica. Los polinucleótidos que codifican el FGFR o el compuesto de fusión de la invención, así como vectores que contienen estos ácidos nucleicos y células huésped en donde se han introducido estos vectores, también se incorporan específicamente en el alcance de la invención.
Lo más preferiblemente, las moléculas de fusión de la invención están codificadas por ADN que comprende un dominio extracelular de un FGFR fusionado en el extremo C a la región Fcγ1 del gen γ1 de la inmunoglobulina humana. La región Fcγ1 del gen γ1 de la inmunoglobulina incluye al menos una parte del dominio bisagra y del dominio CH3, o al menos una parte del dominio bisagra, del dominio CH2 y del dominio CH3. El ADN que codifica las moléculas quiméricas de polipéptido según la presente invención puede estar en su configuración genómica o en su configuración de cADN. Se pueden usar péptidos señal para iniciar de manera eficaz el transporte de una proteína a través de la membrana del retículo endoplásmico. Las secuencias señal han sido bien caracterizadas en la técnica, y se sabe que contienen típicamente de 16 a 30 residuos de aminoácido, aunque son posibles otros tamaños. Una discusión detallada de las secuencias del péptido señal se proporciona por von Heijne (1986, Nucleic Acids Res., 14:4683). Según una realización preferida, el péptido señal se toma del péptido señal de interleuquina-2 (SEQ ID NO. 8) como se conoce en la técnica. El solicitante ha observado que fusionando este péptido a un dominio extracelular de un FGFR lleva a una proteína secretada con una secuencia de aminoácidos N-terminal homogénea, que no es el caso cuando se usa el péptido señal FGFR endógeno.
Un vector de expresión que contiene las secuencias de codificación de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención colocadas bajo el control de secuencias regulatorias transcripcionales y traduccionales apropiadas puede construirse mediante tecnología de ADN recombinante como se conoce en la técnica. Dicho vector de expresión se introduce en una célula huésped mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica. La célula que contiene un vector resultante se hace crecer entonces para producir una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada o un fragmento de la misma, usando cualquier técnica conocida por el experto en la técnica.
Según la invención, puede usarse una variedad de sistemas de expresión para expresar las moléculas de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificadas. En un aspecto, dichos sistemas de expresión representan vehículos por medio de los que las secuencias de codificación de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, aunque también representan células que, cuando se transfectan de forma transitoria con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, expresan una molécula de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención in situ. Las células de mamíferos se usan normalmente para la expresión de una molécula de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada recombinante, especialmente para la expresión de la molécula de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada recombinante entera. Por ejemplo, las células de mamíferos tal como células HEK293 o CHO, en conjunto con un vector, que contienen la señal de expresión tal como una que lleva el principal elemento promotor génico intermedio temprano de citomegalovirus humano, son un sistema eficaz para expresar las fusiones Fc con receptor para FGF solubles modificadas de la invención (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).
Además, se elige una célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o que modifica y procesa el producto génico de la forma específica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y el procesado de productos de proteínas pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células huésped tienen características y mecanismos específicos para el procesado post-traduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Se eligen líneas celulares o sistemas huésped apropiados para asegurar la correcta modificación y procesado de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada expresada de interés. Por lo tanto, pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesado apropiado del transcrito primario, glicosilación del producto génico. Estas células huésped de mamífero incluyen, pero no están limitadas a, células CHO, COS, HEK293, 3T3 o células de mieloma. La célula huésped puede co-transfectarse con dos o más vectores de expresión, que incluyen el vector que expresa la proteína de la invención. Por ejemplo, una célula huésped puede transfectarse con un primer vector que codifica un polipéptido de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificado, como se describe arriba, y un segundo vector que codifica un polipéptido de glicosiltransferasa. De forma alternativa, el segundo vector podría expresar un pequeño ARN de interferencia contra una glicosiltransferasa.
Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo, de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. En una realización de la invención, pueden construirse las líneas celulares que expresan de forma estable la molécula de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada. Más que usando vectores de expresión que contiene orígenes virales de replicación, las células huésped se transforman con ADN bajo el control de los elementos regulatorios de expresión apropiados, que incluyen promotores, mejoradores, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, y otras secuencias apropiadas conocidas por el experto en la técnica, y un marcador genético. Después de la introducción del ADN extraño, puede permitirse el crecimiento de las células modificadas por ingeniería durante uno o dos días en un medio enriquecido, y después se pasan a un medio de selección. El marcador genético en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de manera estable el plásmido en un cromosoma y expandirse en una línea celular.
Puede usarse un número de sistemas de selección según la invención, que incluyen aunque no están limitados al virus simple de Herpes timidina quinasa (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 48:202), selección de glutamato sintasa en presencia de sulfoximida de metionina (Adv Drug Del Rev, 2006, 58: 671, y sitio web o literatura de Lonza Group Ltd.) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) con genes en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, puede usarse la resistencia antimetabolito como base de la selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA 77:357); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., 1981, Proc Natl Acad Sci USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido, G-418 (Wu et al., 1991, Biotherapy 3:87); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Métodos conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante pueden aplicarse de forma rutinaria para seleccionar el clon recombinante deseado, y estos métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Los niveles de expresión de una molécula de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada puede aumentarse por amplificación vectorial. Cuando un marcador presente en el sistema de vector que expresa una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada es amplificable, un aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo aumentará el número de copias del gen marcador. Como la región amplificada se asocia con el gen que codifica la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención, la producción de dicha fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada aumentará también (Crouse et al., 1983, Mol Cell Biol 3:257).
Se conocen un número de factores por el experto en la técnica para influir el nivel de glicosilación de una glicoproteína. Por ejemplo, las células huésped de mamífero modificadas pueden usarse para alterar el perfil de glicosilación de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada aumentando o disminuyendo la expresión de glicosiltransferasa. Dichas células huésped de mamífero modificadas incluyen, aunque no están limitadas a, CHO, COS, HEK293, PER.C6, 3T3, YB2/0 y células mieloma (Stanley et al., 1986, Archives of Biochemistry and Biophysics, 249:533; Mori et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering 94:68; Chitlaru et al., 1998, Biochem. J. 336:647; Umana et al., 1999 Nature Biotechnology 17:176). También se conoce por el experto en la técnica que los factores del bioproceso afectan a la biosíntesis del oligosacárido de glicoproteína (Goochee et al., 1994, Curr Opin Biotechnol. 5:546). El efecto de las condiciones del cultivo celular, tal como concentración de glucosa o iones amonio, pH, suero, y los efectos de otros factores del bioproceso, tal como la velocidad de crecimiento celular, tiempo de cultivo, influencia de la glicosilación unida a N (Biotechnol. Bioeng. 39:327 (1993); Biotechnol. Bioeng.
68:370 (2000); Bio/technology 11:720 (1993); Cytotechnology 17:13 (1995); Biochem J. 272:333 (1990)). Se conoce también que además de las células huésped y los factores del bioproceso, el procesado de oligosacáridos está influido por el medioambiente local en cada sitio de N-glicosilación pendiente del medioambiente de la glicoproteína local. Las diferencias sitio a sitio pueden ser extensivas como se observó con t-PA o pueden implicar más diferencias sutiles en la ramificación y el procesado terminal como se observa para los tres sitios de N-glicosilación de EPO (Goochee et al, 1991, Bio/Technology 9: 1347).
Una vez que se ha producido, una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad de Proteína A por Fc después, etcétera), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas.
La identificación cuantitativa de ácido siálico (residuos de ácido N-acetilneuramínico), el análisis de la composición de carbohidratos y el mapeo cuantitativo de oligosacáridos de N-glicanos en las proteínas de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificadas purificadas puede realizarse esencialmente como se describe anteriormente (Saddic et al. Methods Mol. Biol. 194:23-36 (2002) y Anumula et al. Glycobiology 8:685-694 (1998)).
Las proteínas de fusión que incorporan dominios de receptor para FGF solubles pueden producirse mediante métodos familiares para los expertos en la técnica, para cualquier otra fusión de mamífero, expresable o biológicamente activa, mutatis mutandis. Por ejemplo, se pueden adoptar métodos publicados para combinar las regiones Fc de IgG con los dominios de citoquinas y receptores solubles, a fin de diseñar y producir los compuestos de FGFR de la invención (véase, por ejemplo, Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989); Chamow et al., Trends Biotechnol., 14:52-60 (1996); documentos de EE.UU. 5.116.964, 5.349.053 y 5.541.087). Otros ejemplos de proteínas de fusión receptor-lg que se pueden adoptar incluyen las de los documentos US 5.726.044; 5.707.632; y
5.750.375. Dado que los dominios extracelulares de receptor para FGF comparten un grado significativo de homología con la familia génica de las inmunoglobulinas, y que el dominio extracelular de FGFR contiene segmentos similares a Ig, se prefiere especialmente el empleo de regiones Fc. En un ejemplo, la fusión es una proteína homodimérica unida a través de residuos de cisteína en la región bisagra de Fc de IgG, dando como resultado una molécula con características similares a las de una molécula de IgG. Una ventaja para usar una región Fc es la vida media circulante extendida. Además, las modificaciones de glicosilación de las proteínas de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificadas de la invención llevan a propiedades farmacocinéticas mejoradas, ya que las fusiones de la invención muestran in vivo perfiles farmacocinéticos comparables al IgG humano de un isotipo similar.
Una realización adicional de la presente invención proporciona un método para preparar una proteína de fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada que comprende un fragmento o dominio de FGFR, un enlazador peptídico flexible, y una variante de Fc de IgG humana, cuyo método comprende: (a) generar una línea celular derivada de CHO; (b) cultivar la línea celular en condiciones tales que se exprese la proteína de fusión recombinante; y (c) purificar la proteína expresada a partir de la etapa (b). Preferiblemente, en este caso, el enlazador de péptido flexible que comprende al menos aproximadamente 3 aminoácidos entre el receptor para FGF soluble y la variante Fc de IgG humana, comprende dos o más aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en glicina, serina, alanina y treonina. En realizaciones adicionales y relacionadas, no está presente el péptido enlazador, o tiene una longitud de un sólo aminoácido. En una realización preferida, el enlazador peptídico no incluye un sitio de escisión por proteasa. El enlazador más preferido es SAL (Ser-Ala-Leu).
Preferiblemente, la proteína de fusión con receptor para FGF soluble modificada se produce en células CHO en un modo de suspensión, tal como se describe en los Ejemplos de este documento.
Como se muestra en los Ejemplos en este documento, las fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas de la presente invención tienen actividad anti-tumoral, al menos a través de inducción de respuestas ADCC y/o CDC, y son así útiles en el tratamiento de tumores metastáticos y enfermedades tal como cáncer. Un aspecto de la invención se dirige así a una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada como se describe arriba con actividades ADCC y/o CDC.
De especial interés son las fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas con capacidad mejorada para mediar funciones inductoras de citotoxicidad celular tal como ADCC. Dichas proteínas se pueden obtener haciendo sustituciones sencillas o múltiples en la región Fc de la molécula, alterando de ese modo su interacción con los receptores Fc. Los métodos para designar tales mutantes se pueden encontrar por ejemplo en Lazar et al. (2006, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 103(11): 4005-4010) y Okazaki et al. (2004, J. Mol. Biol. 336(5):1239-49). Véase también los documentos WO 03/074679, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO2006/047350, WO 2006/019447, WO 2006/105338, WO 2007/041635. También es posible usar líneas celulares fabricadas específicamente para la producción de fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas mejoradas. En particular, estas líneas han alterado la regulación de la ruta de glicosilación, dando como resultado fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificada que están débilmente fucosiladas o incluso totalmente defucosiladas. Dichas líneas celulares y métodos para su diseño se describen, por ejemplo, en Shinkawa et al. (2003, J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473), Ferrara et al. (2006, J. Biol. Chem. 281(8): 5032-5036; 2006, Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-61), documentos EP 1331266, EP 1498490, EP 1498491, EP 1676910, EP 1792987 y WO 99/54342.
Dichas fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas como se describen arriba para usar en la inhibición del crecimiento tumoral en un sujeto, y para el tratamiento o prevención de metástasis en un sujeto, son un aspecto de la invención. La invención así se refiere también a la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada como se describe arriba como un medicamento. La presente invención también se refiere al uso de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada como se describe arriba para la preparación de un medicamento para tratar o inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto. Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden típicamente la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se emplea en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, agentes tamponadores, soluciones salinas, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Se puede elegir el tipo de vehículo en base a la ruta de administración deseada. En diversas realizaciones, el vehículo es adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, transdérmica u oral. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para preparar extemporáneamente disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En la técnica es bien conocido el uso de medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas. Tal como se detalla más adelante, también pueden incorporarse compuestos activos adicionales en las composiciones, tales como agentes anticancerosos y/o antiangiogénicos; en particular, el compuesto activo adicional puede ser un agente antiangiogénico, un agente quimioterapéutico o un agente de bajo peso molecular. Se puede preparar una composición farmacéutica típica para infusión intravenosa que contenga 250 ml de disolución de Ringer estéril y 100 mg de la combinación. Los métodos concretos para preparar compuestos administrables por vía parenteral se conocerán o serán evidentes para los expertos en la técnica, y se describen más detalladamente, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, 17ª edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), y en las ediciones 18ª y 19ª del mismo, que se incorporan en este documento por referencia.
También se puede preparar la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada, de la invención, con vehículos y formulaciones de liberación controlada, entre ellos implantes y sistemas de reparto microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etilenvinil-acetato, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, poli(ácido láctico), y copolímeros polilácticos y poliglicólicos (PLG). Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones se conocen generalmente por los expertos en la técnica.
La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada en la composición se formula preferiblemente en una cantidad eficaz. Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y para periodos de tiempo necesario, para alcanzar el resultado deseado, tal como la modulación de actividades de FGF y/o de FGFR y la inducción de respuestas ADCC y/o CDC. La expresión "una cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad suficiente para influir en el curso terapéutico de una enfermedad particular. También es una cantidad terapéuticamente eficaz aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del agente se ve contrarrestado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
Para las aplicaciones terapéuticas, se administran fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas de la invención a un mamífero, preferiblemente un ser humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable tal como las tratadas arriba, incluyendo las que pueden administrarse a un ser humano por vía intravenosa como un bolo o por infusión continua a lo largo de un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Las fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas se administran también, convenientemente, por vía intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para producir efectos terapéuticos tanto locales como sistémicos. Se espera que la vía intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovario.
Pueden ajustarse las posologías para proporcionar la respuesta óptima. Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o puede disminuirse o aumentarse la dosis de forma proporcional. Se pueden administrar las composiciones de la invención a un sujeto para provocar actividad de crecimiento celular en un sujeto. Se pretende que el término "sujeto", tal como se emplea en este documento, incluya organismos vivos en los cuales exista un crecimiento celular dependiente de FGF, e incluye específicamente mamíferos, tales como conejos, perros, gatos, ratones, ratas, monos, especies transgénicas de los mismos y seres humanos.
Las fusiones Fc con receptor para FGF soluble modificadas y las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles en el tratamiento o prevención de una variedad de cánceres, que incluyen (aunque no están limitados a) los siguientes: carcinoma, que incluyen los de vejiga, mama, colon, cabeza y cuello, riñón, que incluye carcinoma de células renales, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello del útero, tiroides y piel; que incluye carcinoma de células escamosas ; tumores hematopoyéticos de trazado linfático, que incluyen leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda , linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de trazado mieloide, incluidos leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; otros tumores, que incluyen melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluidos fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, que incluyen melanoma, xeroderma pigmentoso, keratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma, y otros cánceres aún por determinar que están provocados por sobre-expresión de FGF. En una realización preferida, la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada de la invención se usa para tratar melanoma, leucemia, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama o cáncer de cabeza o cuello.
La presente invención se refiere así al uso de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada descrita arriba, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o inhibición de enfermedades relacionadas con cáncer en un sujeto. Es un aspecto u objeto de la presente invención el proporcionar un método para tratar enfermedades y procesos que resultan de la proliferación celular cancerígena, y una composición para tratar o reprimir el crecimiento de un cáncer. Aún otro aspecto de la invención es proporcionar composiciones y métodos útiles para la terapia génica para la modulación del cáncer. El método de la presente invención puede usarse en particular para el tratamiento de melanoma, leucemia, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama o cáncer de cabeza o cuello.
Se puede mejorar la eficacia de la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada, en la prevención o tratamiento de la enfermedad, administrando dicha fusión en serie o en combinación con otro agente que sea eficaz para esos propósitos, tal como factor de necrosis tumoral (TNF), un antagonista capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento fibroblástico (FGF) ácido o básico, del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un antagonista capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, de la proteína C o de la proteína S (véase el documento WO 91/01753), un antagonista tal como un anticuerpo capaz de fijarse al receptor HER2 (véase el documento US 5.772.997), o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico, anti-metabolitos del metabolismo del ácido nucleico, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol o corticosteroides.
En otro aspecto de la invención, la administración se combina con una administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico, tal como por ejemplo taxol (paclitaxel) o taxotere (docetaxel).
Los agentes quimioterapéuticos incluyen, sin limitación ninguna, agentes antimicrotúbulos tales como diterpenoides y alcaloides de la vinca; complejos de coordinación con platino; agentes alquilantes tales como mostazas nitrogenadas, oxazafosforinas, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas y triazenos; agentes antibióticos tales como antraciclinas, actinomicinas y bleomicinas; inhibidores de la topoisomerasa II tales como epipodofilotoxinas; antimetabolitos tales como análogos de purina y pirimidina y compuestos antifolato; inhibidores de la topoisomerasa I tales como camptotecinas; hormonas y análogos hormonales; inhibidores de la ruta de transducción de señal; inhibidores de angiogénesis de tipo distinto al de receptor de tirosina-quinasa; agentes inmunoterapéuticos; agentes proapoptóticos; e inhibidores de la señalización del ciclo celular. Además, pueden combinarse los métodos de la invención con otro tratamiento anticanceroso, agente antiangiogénico, o agente quimioterapéutico o terapia de radiación. Un ejemplo preferido es docetaxel o taxotere. Otros ejemplos incluyen gemcitabina, diterpenoides de cisplatino y alcaloides de la vinca, paclitaxel, vinblastina, vincristina y vinorelbina, carboplatino, ciclofosfamida, melfalano y clorambucilo, busulfano, carmustina, dacarbazina, ciclofosfamida, melfalano, clorambucilo, busulfano, carmustina, dacarbazina, agentes antineoplásicos que incluyen, aunque no están limitados a, actinomicinas tales como dactinomicina, antrociclinas tales como daunorubicina y doxorubicina, bleomicinas, epipodofilotoxinas, etopósido y tenipósido; agentes neoplásicos antimetabolitos, 5-fluorouracilo, metotrexato, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, camptotecinas, irinotecano HCI, y topotecano HCI.
También pueden seleccionarse una variedad de diferentes agentes quimioterapéuticos o polipéptidos anticancerosos. Fuentes de información tales como www.clinicaltrials.gov, www.ncbi.nlm.nih y www.druqs.com, incluyen referencias a polipéptidos y agentes que pueden seleccionarse.
Dichos otros agentes, por ejemplo, agentes anti-angiogénicos o agentes quimioterapéuticos, pueden estar presentes en la composición que se administra o pueden administrarse separadamente. En un aspecto de la invención, la administración se lleva a cabo con el otro principio activo, sea de manera simultánea, separada o secuencial en el tiempo. Cuando la administración se lleva a cabo de manera simultánea, los dos principios activos pueden estar combinados en una única composición farmacéutica que comprende las dos composiciones, tal como un comprimido o una cápsula de gel. Por otro lado, los dos principios activos pueden estar presentes, se administren o no de manera simultánea, en composiciones farmacéuticas separadas. Para ello, la combinación puede estar en forma de un equipo que comprenda, por un lado la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada tal como se ha descrito antes, y por otro lado el segundo principio activo, estando en compartimientos separados la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada tal como se ha descrito antes y el segundo principio activo, y estando destinados a ser administrados de manera simultánea, separada, o secuencial en el tiempo.
La combinación según la presente invención puede administrarse especialmente para terapia tumoral en combinación con quimioterapia, terapia de proteína (es decir, usando un agente terapéutico tal como un anticuerpo o proteína recombinante), terapia génica, radioterapia, inmunoterapia, intervención quirúrgica o una combinación de éstas. Es igualmente posible una terapia a largo plazo en forma de terapia complementaria en el contexto de otras estrategias de tratamiento, como se ha descrito arriba.
Los ejemplos que siguen son meramente ilustrativos del alcance de esta invención y del contenido de esta memoria descriptiva. Un experto en la técnica puede diseñar y construir numerosas modificaciones de los ejemplos enumerados a continuación, sin salirse del alcance de esta invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción en HEK293 de sFGFR2-Fc con un alto contenido en ácido siálico y bajo aclaramiento sanguíneo.
Los cADNs que codifican la α-1,4-galactosiltransferasa humana (B4GT1) (SEQ ID NO. 9) o la β-2,3-sialiltransferasa humana (SIAT6) (SEQ ID NO. 11) se recuperaron de la colección de clones (Invitrogen) y se clonaron en el vector de expresión de mamíferos pXL4214 a partir del cual la expresión se conduce desde el promotor CMV. El mismo
vector de expresión se usó también para clonar la fusión de proteína sFGFR2-Fc y generar pXL4410. El mapa de plásmidos pXL4551 que codifica B4GT1, pXL4544 que codifica SIAT6 y pXL4410 que codifica la fusión FGFR2IIIcFc soluble modificada (designada en este documento como sFGFR2-Fc), se presentan en la Fig. 1 y 5 además del ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de B4GT1 (Fig. 2), SIAT6 (Fig. 3) y sFGFR2-Fc 5 (Fig.4A y B). La sFGFR2-Fc se produjo en células HEK293 EBNA adherentes (Invitrogen) mediante transfección transitoria de uno a tres plásmidos de expresión que codifican sFGFR2-Fc, B4GT1 o SIAT6 complejados con JET PEI (Q-Biogen). La relación de plásmidos fue 90/5/5 para pXL4410/pX14544/pXL4551. La relación de plásmidos tuvo que optimizarse para asegurar la productividad y calidad óptima del polipéptido sFGFR2-Fc. Las proteínas secretadas se recogieron ocho días después de la transfección y se centrifugaron. Las proteínas se purificaron por
10 cromatografía de afinidad en Proteína G Sefarosa (Amersham Biosciences) después de la elución desde la columna con glicina 100 mM/HCl pH 2,7. Las proteínas sFGFR2-Fc se formularon en PBS y se filtraron 0,22 µm. La concentración de proteína se determinó mediante el Ensayo microBC (Interchim).
La identificación cuantitativa de ácido siálico, el análisis de composición de carbohidratos y el mapeo cuantitativo de oligosacáridos de N-glicanos en las proteínas purificadas de sFGFR2-Fc se llevaron a cabo esencialmente como se 15 describe anteriormente (Saddic et al. 2002. Methods Mol. Biol. 194:23-36 y Anumula et al. 1998. Glycobiology 8:685694). Primero, los residuos de ácido siálico se liberaron después de hidrólisis suave de GFR2-Fc y se marcaron de forma fluorescente con orto-fenilendiamina y se separaron por HPLC en fase inversa. Se detectaron picos individuales mediante detección por fluorescencia (excitación, 230 nm; emisión, 425 nm), se identificaron y cuantificaron por comparación con patrones de ácido N-acetilneuramínico y N-glicolilneuramínico. Segundo, la 20 composición de carbohidratos se determinó después de hidrólisis ácida de muestras de sFGFR2-Fc para liberar los monosacáridos individuales. Después de la hidrólisis, los monosacáridos (neutros y aminoazúcares) se derivaron con ácido antranílico y después se separaron por HPLC en fase inversa y se detectaron por detección por fluorescencia (excitación, 360 nm; emisión, 425 nm). Se identificaron y cuantificaron los picos individuales por comparación con patrones de monosacárido. Tercero, los oligosacáridos se liberaron de forma enzimática con 25 PNGasa F y se marcaron de forma fluorescente con ácido antranílico antes de la separación según su número de residuos de ácido siálico por HPLC de intercambio aniónico en fase normal en una columna Asahipak-NH2P (Phenomenex). Los glicanos marcados se detectaron y cuantificaron por detección por fluorescencia (excitación, 360 nm; emisión, 425 nm). El número promedio de ácido siálico por N-glicano en el dominio FGFR2 se calculó en base a la cantidad total de moles de N-glicano por mol de FGFR2-Fc y los moles de N-glicano por mol de Fc obtenido
30 después de la liberación del Fc mediante papaina.
Las proteínas sFGFR2-Fc purificadas se inyectaron en la cola de ratones Desnudos Suizos (Charles River). Se usaron un total de tres ratones por carga de proteína. La sangre se recogió 6 horas después de la inyección de 500 µg de sFGFR2-Fc, se obtuvo el plasma y la concentración de FGFR2-Fc se determinó por ELISA utilizando el método sándwich con un anticuerpo monoclonal FGFR2 anti-humano (sistema R&D) y un anticuerpo policlonal
35 conjugado IgG-HRP anti-humano (Pierce) (2 análisis a 2 diluciones por triplicado). En los experimentos de control, los ratones se pretrataron con fetuina y asiolofetuina una hora antes de la inyección de sFGFR2-Fc.
La Tabla 1 resume la condición de producción de las diferentes cargas de sFGFR2-Fc, el perfil de N-glicano y la composición de monosacáridos de cada carga y la concentración en plasma de sFGFR2-Fc 6 horas después de la inyección intravenosa en los ratones.
40 Tabla 1- Contenido en N-glicano y farmacocinética de FGFR2-Fc producido en HEK293 El patrón de sialilación mejorado de proteínas de fusión sFGFR2-Fc producidas en HEK293EBNA se ha demostrado por co-expresión transitoria de la proteína de fusión con α-1,4-galactosiltransferasa humana o β-2,3-sialiltransferasa humana. Esta gran mejora del estado de sialilación se evidenció por una reducción en 2 veces del porcentaje de glicanos no sialilados, un aumento en 2 veces en el contenido total de ácido siálico por mol de proteína y un
- Proteína expresada en HEK293EBNA
- sFGFR2-Fc sFGFR2-Fc + SIAT6 sFGFR2-Fc + SIAT6 & B4GT1
- % de especies sialiladas de sFGFR2-Fc:
- 1-no sialilada
- 69% 46% 34%
- 2-monosialilada
- 23% 19% 22%
- 2-disialilada
- 6% 26% 35%
- 3-trisialilada
- 1,5% 10% 10%
- Contenido en ácido siálico:
- 1-pmol de ácido N-acetilneuramínico por pmol de sFGFR2Fc
- 3,4 6,4 6,8
- 2-Número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano
- 0,4 1
- Composición de monosacáridos de sFGFR2-Fc N-glicanos para 3 manosas
- 0,73 0,61 0,63
- Proteína expresada en HEK293EBNA
- sFGFR2-Fc sFGFR2-Fc + SIAT6 sFGFR2-Fc + SIAT6 & B4GT1
- 1-Glucosamina (número por 3 manosas)
- 4,3 4,1 4,1
- 2-Galactosa (número por 3 manosas)
- 1,5 1,4 1,6
- Número de fucosa en Fc N-glicanos para 3 manosas
- 0,73 0,61 0,63
- Aclaramiento sanguíneo
- [sFGFR2-Fc] en plasma 6 horas después de la inyección i.v. (ng/mL)
- 258 20000
- [sFGFR2-Fc] en plasma 6 horas después de la inyección i.v. (ng/mL) cuando los ratones se pretrataron con fetuina
- 229 no realizado no realizado
- [sFGFR2-Fc] en plasma 6 horas después de la inyección i.v. (ng/mL) cuando los ratones se pretrataron con asialofetuina
- 19276 no realizado no realizado
5 aumento de 2,5 veces en el número promedio de ácido siálico por N-glicano. Digno de mención, el contenido de monosacárido no se afectó (véase la Tabla 1).
Este aumento de 2,5 veces en el N-glicano sialilado se dirige correlacionado con los parámetros farmacocinéticos significativamente mejorados de sFGFR2-Fc. En particular, un aumento de 100 veces de la presencia de sFGFR2Fc en el plasma se ha medido 6 horas después de la inyección iv en ratones.
10 La farmacocinética también se mejoró en 100 veces cuando los ratones se pretrataron con asialofetuina en comparación con el pretratamiento con fetuina. La asialofetuina, aunque no la fetuina, se conoce por enlazar con el receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGPR) (Webster et al., 2003, Xenobiotica 33:945)
Tomado junto, estos resultados indican que el enlace específico al receptor de asialoglicoproteína por medio de residuos de galactosa terminales expuestos a partir de N-glicano es responsable del aclaramiento de sFGFR2-Fc
15 mientras que la presencia de un ácido siálico por N-glicano en sFGFR2-Fc disminuye significativamente este aclaramiento.
Ejemplo 2: Cribado de clones estables de CHO que expresan la proteína sFGFR2-Fc con un número promedio de residuos de ácido siálico por FGFR2 N-glicano mayor que 1,2 para farmacocinéticas óptimas
El plásmido de expresión de mamíferos pXL4636 para la expresión estable de sFGFR2-Fc en células CHO se
20 generó a partir del plásmido pEE14.4 que codifica el marcador de selección de glutamina sintetasa (Lonza) y el plásmido pXL4410 que contiene la secuencia de cADN que codifica la sFGFR2-Fc, Fig 5. El plásmido pXL4636 se introdujo en células CHO K1 mediante nucleofección utilizando la línea celular AMAXA del equipo Nucleofactor como se recomienda por el suministrador. Las células transfectadas de transfirieron en medio selectivo y después de la amplificación celular los siete mejores productores de semi-clones CHO/GS (SCnº 9, 11, 26, 58, 112, 118, 170) se
25 cribaron por el contenido en ácido siálico de las moléculas sFGFR2-Fc purificadas. Los dos semi-clones con el mayor contenido en ácido siálico (SC nº 11 y 118) se seleccionaron para el clonaje y producción a gran escala; en particular, el clon a partir de SC nº 118 se describió adicionalmente como GC111.
Aunque las moléculas sFGFR2-Fc producidas a partir de todos los semi-clones tenían alto contenido en ácido siálico, no llevaron a las mismas farmacocinéticas. De forma interesante, se observó que a partir de dos semi-clones
30 (SCnº11 y 118), la sFGFR2-Fc con el mayor contenido en ácido siálico llevó a la mayor concentración de sFGFR2Fc en sangre 6 horas después de la inyección iv en ratones, como se describe en la Tabla 2. Y a partir de dos clones (SCnº 9 y 170), la sFGFR2-Fc con el menor contenido en ácido siálico tenía la menor concentración de sFGFR2-Fc en sangre 6 horas después de la inyección iv en ratones.
35
Tabla 2- Clones estables de CHO que expresan la proteína sFGFR2-Fc con una relación de residuos de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano mayor que 1,2 para farmacocinéticas óptimas
- sFGFR2-Fc purificadas a partir de semi-clones CHO-GS SC nº
- SCnº 9 SCnº 11 SCnº 26 SCnº 58 SCnº 112 SCnº 118 SCnº 170
- % de especies sialiladas de sFGFR2-Fc:
- 1-no sialilada
- 50 42 48 48 45 43 53
- 2-monosialilada
- 28 30 30 30 30 30 28
- 3-disialilada
- 14 18 14 15 16 17 13
- 4-trisialilada
- 8 10 7 8 9 10 6
- Número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano
- 1,07 1,45 1,29 0,98
- [sFGFR2-Fc]/[sFGFR2-Fc]max [sFGFR2-Fc] se encontró en plasma 6 horas después de la inyección i.v. [sFGFR2-Fc]max se encontró para SCnº 1
- 55% 100% 81% 45%
El cribado de clones en base al N-glicano altamente sialilado de sFGFR2-Fc es predictivo de parámetros farmacocinéticos óptimos de sFGFR2-Fc.
5 Ejemplo 3: Correlación entre el número promedio de ácido siálico por sFGFR2-Fc N-glicano y el aclaramiento de sFGFR2-Fc en sangre
En otro experimento similar al experimento descrito en el Ejemplo 2, se generaron clones CHO/DHFR estables que expresan sFGFR2-Fc usando el sistema de selección y amplificación DHFR con los plásmidos de expresión de mamíferos apropiados pXL4429 y el plásmido pXL4417 (Fig. 6). Estos clones CHO-DHFR también se han cribado
10 por el contenido de ácido siálico por molécula sFGFR2-Fc y el aclaramiento de sFGFR2-Fc producido por estos clones también se ensayó.
El número promedio de ácido siálico por N-glicano en el dominio FGFR2 se calculó en base a la cantidad total de moles de N-glicano por mol de FGFR2-Fc y los moles de N-glicano por mol de Fc obtenido después de la liberación del Fc mediante papaina. Los resultados presentados en la Fig. 7 mostraron que una relación de residuos de ácido
15 siálico por FGFR2 N-glicano mayor que 1,2 aseguraba la concentración óptima de sFGFR2-Fc en sangre en comparación con la concentración óptima en sangre encontrada para moléculas Fc. Solo los clones seleccionados alcanzaron esta relación óptima.
Por lo tanto, los clones cribados por la relación de residuos de ácido siálico por FGFR2 N-glicano permite al experto predecir el bajo aclaramiento de sFGFR2-Fc en sangre.
20 Ejemplo 4: Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión sFGFR2-Fc
La proteína sFGFR2-Fc codificada por el plásmido pXL4410 o pXL4636 o pXL4429 (Figura 5 y 6) es una proteína de fusión de la secuencia humana de FGFR2 soluble con el fragmento Fc derivado de la secuencia de lgG1 humana.
La secuencia del polinucleótido que codifica sFGFR2-Fc está expuesta en SEQ ID NO: 1 y en la Figura 4A. Asimismo, la secuencia entera de aminoácidos de la proteína sFGFR2-Fc se expone en SEQ ID NO: 2 en la Figura
25 4B. Los aminoácidos de las posiciones 1 a 350 corresponden al isotipo FGFR2IIIc (véase Fig 4C SEQ ID; NO: 4) y son los aminoácidos de la posición 27 a 376 descritos en SwissProt (FGFR2_HUMANO). Los aminoácidos de las posiciones 354 a 584 son aminoácidos de lgG1 desde la posición 99 hasta la 329, tal como se describe en SwissProt (IGHG1_HUMANO). véase Fig 4D y SEQ ID NO: 6. Los aminoácidos de las posiciones 351 a 353 son aminoácidos de un enlazador sintético: SAL (Ser Ala Leu) véase Fig 4E.
30 Ejemplo 5: Contenido de N-glicano definido de sFGFR2-Fc producido en el clon GC111 estable de CHO
Las condiciones se han optimizado para producir sFGFR2-Fc de manera que la relación de residuos de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano sería mayor que 1,2. Este ejemplo proporciona condiciones para alcanzar esta condición.
Un bioreactor de 5 L Celligen (New Brunswick) lleno con 4,4 L de medio libre de proteína CD-CHO, suplementado con suplementos MSX 100 µM y 1X GS se sembró a una densidad celular inicial de 3,5 x 105 células/mL de clon
GC111 y se cultivaron a 37°C. Se empleó la aireación por burbujeador usando una mezcla de oxígeno, nitrógeno, aire y dióxido de carbono u oxígeno puro, y el oxígeno disuelto se mantuvo a 30% de saturación de aire. El pH se mantuvo a 7,2 mediante adición de dióxido de carbono y la inyección de bicarbonato sódico 1 M en el medio de cultivo. La velocidad de agitación usada fue 110 rpm usando un Impulsor por Elevación Celular. La disolución de 5 alimentación (450 g/L de glucosa) se alimentó de forma continua para mantener la glucosa a un nivel diana de 2-3 g/L. La alimentación se comenzó en el día 5 cuando la concentración de glucosa residual alcanzó 2,5 g/L. La alimentación continua de nutrientes se basó en el crecimiento celular predicho y el consumo de glucosa con una velocidad de alimentación de nutrientes igual al de la velocidad de consumo de glucosa. La concentración de glutamato se mantuvo a 1-3 mmol/L mediante la adición en pulsos siguiendo un control diario no en serie. El cultivo
10 celular se monitorizó para el conteo celular, viabilidad y metabolitos (glucosa, lactato, glutamina, amonio y glutamato) y para la concentración de producto durante la fase de producción. El cultivo se paró cuando la viabilidad celular cayó al 55%, y se recogió la cosecha de cultivo.
La cosecha del cultivo celular se clarificó y la sFGFR2-Fc se purificó por cromatografía de afinidad (ProsepvA, Millipore) y dos etapas de cromatografía de intercambio iónico, después se filtro en estéril y se almacenó en solución
15 salina tampón de fosfato antes del análisis adicional y ensayo in vivo.
La masa molecular aparente de sFGFR2-Fc obtenida a partir del análisis SDS-PAGE en condiciones no reductoras fue 180 kDa. Esta estaba en contraste con la masa molecular teórica de 130 kDa calculada en base a la secuencia de aminoácidos del homodímero de sFGFR2-Fc. Esta gran diferencia entre las masas moleculares aparente y calculada se atribuye a la presencia adicional de aproximadamente 30% de N-glicanos, véase Tabla 3. Es más, en la
20 digestión de sFGFR2-Fc mediante Péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F, Roche) seguido por análisis mediante SDSPAGE en condiciones no reductoras, la masa molecular del sFGFR2-Fc desglicosilado estuvo alrededor de 160 kDa (Fig. 7).
La composición de carbohidratos y el perfil de N-glicano de sFGFR2-Fc se analizó como se describe en el Ejemplo 1 y se presentó en la Tabla 3.
25 Tabla 3 Composición de carbohidratos y perfil de N-glicanos de sFGFR2-Fc producido en condiciones óptimas
- Proteínas expresadas a partir del clon GC111 de CHO-GS estable
- sFGFR2-Fc
- % de especies sialiladas de sFGFR2-Fc:
- 1-no sialilada
- 30%
- 2-monosialilada
- 34%
- 3-disialilada
- 23%
- 4-trisialilada
- 13%
- Número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano
- 1,34
- Composición de monosacáridos de sFGFR2-Fc N-glicanos por 3 manosas
- 1-Glucosamina (número por 3 manosas)
- 4,9
- 2-Galactosa (número por 3 manosas)
- 2,7
- 3-Fucosa (número por 3 manosas)
- 0,96
- Composición de fucosa de Fc N-glicano por 3 manosas
- 1,1
En comparación con los resultados obtenidos en la Tabla 2, la sFGFR2-Fc, producida a partir del clon GC111 en las condiciones óptimas, tenía más N-glicano sialilado que la sFGFR2-Fc producido a partir del semi-clon SCnº 118, padre del clon GC111, producido en condiciones estándar. Por ejemplo, el % de especies no sialiladas disminuyó de 43% a 30%.
30 En base a la cantidad total de moles de N-glicano por mol de FGFR2-Fc y los moles de N-glicano por mol de Fc obtenido después de la liberación del Fc mediante papaina, se midió que había siete N-glicanos por FGFR2. Por lo tanto, la mayoría de los sitios del dominio FGFR2 están casi todos totalmente ocupados.
Ejemplo 6: Sitios de N-glicosilación importantes para la afinidad y productividad de FGF
La proteína de fusión sFGFR2-Fc tiene ocho sitios de N-glicosilación en el dominio FGFR2 y uno en el dominio Fc, 35 véase Fig 8 y Tabla 5 para la definición de las posiciones N-glicano N1 a N8. Se produjeron proteínas 4493 y 4565, dos variantes de sFGFR2-Fc no teniendo ya el dominio 1 semejante a Ig. 4493 mostró características similares al tipo salvaje de FGFR2-Fc derivado de pXL4636 en términos de productividad y enlace a FGF-2 o heparina. En contraste, 4565 en el que todos los sitios de glicosilación en el dominio sFGFR2 se mutaron (sustitución N a Q), podría no caracterizarse debido a la reducción de más que 50 veces en la productividad del mutante, véase Tabla 4.
Tabla 4. Características físico-químicas de variantes de sFGFR2-Fc
- ID de Proteína
- Sitios de Nglicosilación en el dominio FGFR2 Residuo de aminoácido en el sitio de Nglicosilación Producción (mg/L) enlace FGF-2 ** Enlace heparina
- Kd (10-9 M)
- [NaCl] para la elución a partir de heparina (mM)
- 4410
- 8 (N1 a N8) N 75 1,39 370
- 4493
- 6 (N3 a N8) N 67 1,19 442
- 4565
- 6 (N3 a N8) Q < 1 ND ND
- ** El enlace a FGF-2 se determinó en un instrumento BIAcore™ que utiliza un modelo "de reacción en dos estados con cambio de conformación" como se describe por Gamsjaeger et al., Biochem. J. 7 Apr. 2005 / BJ20050156. En breve, la integración se llevó a cabo en el sensograma entero excepto en las áreas de "efecto en masa". El intervalo de concentración se seleccionó entre 1 a 8 nM. El método de cinéticas ka/kd simultáneas permite las medidas de dos ka y dos kd asumiendo las siguientes ecuaciones:
ka1 y kd1 para A+B � AB
ka2 y kd2 para AB � AB* que representa la dimerización de complejos (FGF - FGFR2-Fc) La constante de disociación KD se calculó a partir de la siguiente fórmula:
10 Según los dos modelos competitivos presentados (el modelo de dos extremos simétricos de Mohammadi y el modelo asimétrico de Pellegrini), los sitios N3 a N7 podrían interactuar potencialmente con residuos de aminoácidos de o bien FGF1 o FGFR2c y/o interactuar con heparina, mientras que el sitio N8 es improbable que esté implicado en interacciones en todas las estructuras cristalinas (Pellegrini et al. 2000. Nature 407: 1029; Ibrahimi et al. 2005 Mol. Cell. Biol. 25: 671).
15 En base a la información anterior, fue relevante estudiar los sitios de N-glicosilación en las posiciones N3 a N7 mediante sustitución de la correspondiente Asn por Gln y manteniendo la posición N8 inalterada para permitir una productividad significativa. La influencia posicional de los N-glicanos en las características físico-químicas de sFGFR2-Fc se evaluó estadísticamente con un experimento factorial fraccionario de dos niveles. Se seleccionaron cinco variables (ocupación de sitios de glicosilación en las posiciones N3 a N7) y se estudiaron 16 construcciones
20 independientes. El diseño fraccionario 25-1 experimental y el análisis de datos se llevaron a cabo como se describe (Statistics for Experimenters, G. Box Ed., Willey, 1978).
Se diseñaron variantes de N-glicosilación específicas del sitio en base a 4493 y el diseño factorial a dos niveles con cinco variables (N3 a N7) que podrían ser o bien un nivel más (N) o un nivel menos (Q). El diseño fue fraccionario
25 con 16 construcciones (2 5-1, es decir, resolución de diseño V), permitiendo la identificación de los efectos principales y de las interacciones de factor 2 aunque confundiendo las interacciones de factor 2 con factor 3.
Las construcciones de 16 plásmidos se obtuvieron por PCR secuencial y clonaje para generar la sustitución N a Q en la posición N3, N4, N5, N6 o N7 aunque manteniendo la posición N8 y el sitio de N-glicosilación del dominio Fc sin cambios. Estas variantes de proteína solo difirieron de 4493 por las mutaciones en los puntos 2 o 4 enumerados
30 en la Tabla 5.
Tabla 5. Matriz de diseño
- Estado de la posición de N-glicosilación
- Posición de Asn en la Figura 9
- Construcción N3 N4 N5 N6 N7 N8 N 297 (Fc)
- Posición de Asn en FGFR2_HUMANO
- 228 241 265 297 318 331
- 4572
- - - - - + + +
- 4570
- + - - - - + +
- 4577
- - + - - - + +
- 4571
- + + - - + + +
- 4587
- - - + - - + +
- 4585
- + - + - + + +
- 4586
- - + + - + + +
- 4573
- + + + - - + +
- 4574
- - - - + - + +
- 4575
- + - - + + + +
- 4588
- - + - + + + +
- 4576
- + + - + - + +
- 4579
- - - + + + + +
- 4569
- + - + + - + +
- 4578
- - + + + - + +
- 4493
- + + + + + + +
Las 16 construcciones diseñadas se ensayaron para producción a pequeña escala. Dos variantes (4572 y 4574) fueron productores muy bajos (alrededor de 2 mg/L). Las restantes 14 construcciones se produjeron a escala-libre y se purificaron en paralelo en condiciones estándar con razonable recuperación de producto. Se analizaron después
5 por SDS-PAGE, filtración en gel, BIAcore™. Los resultados se analizaron con la resolución factorial fraccionaria estadística - 25-1 DOE.
La N-glicosilación en N3, N4, N5, N6, N7 tuvo una contribución positiva en la productividad. Hubo un efecto cuantitativo similar para todas las posiciones estudiadas (es decir, N3, N4, N5, N6 y N7) y ningún efecto significativa 10 de interacciones de dos factores.
Tabla 6. Productividad
- Construcción
- Titrado (mg/L) a partir de la producción a 1L Respuesta (mg/L) Variable
- 4572
- 0 28 Media
- 4570
- 13 17 N3
- 4577
- 9 14 N4
- 4571
- 34 20 N5
- 4587
- 5 13 N6
- 4585
- 40 13 N7
- 4586
- 42 -8 N3-N4
- 4573
- 32 3 N3-N5
- 4574
- 0 1 N3-N6
- 4575
- 30 -2 N3-N7
- 4588
- 37 -2 N4-N5
- 4576
- 27 -1 N4-N6
- 4579
- 30 6 N4-N7
- 4569
- 54 4 N5-N6
- 4578
- 37 0 N5-N7
- 4493
- 67 -1 N6-N7
Las proteínas purificadas se analizaron por filtración en gel (Superdex 2000) para cuantificar el porcentaje de especies de alto peso molecular (HMW; %) en preparados purificados. El mayor valor (peor caso) de 80,2 % de 5 HMW se obtuvo para 4587 y se usó en el análisis DOE para las dos construcciones (4572 y 4574) que no podrían producirse (el porcentaje medio del valor HMW obtenido a partir de las 14 construcciones se usó también por comparación, dando una conclusión similar). La N-glicosilación en la posición N5 y una menor extensión en la posición N6, desfavoreció la aparición de especies HMW. La interacción N5-N6 mostró un efecto similar en la agregación.
10
Tabla 7. Formación de agregado
- Construcción
- HMW (%) Respuesta (%) Variable
- 4572
- 80 57 Media
- 4570
- 73,0 -12 N3
- 4577
- 71,6 -5 N4
- 4571
- 72,1 -33 N5
- 4587
- 80,2 -18 N6
- 4585
- 47,5 -7 N7
- 4586
- 47,7 6 N3-N4
- 4573
- 57,5 -8 N3-N5
- 4574
- 80 -5 N3-N6
- 4575
- 69,6 2 N3-N7
- 4588
- 71,8 -2 N4-N5
- 4576
- 72,9 3 N4-N6
- 4579
- 35,2 -4 N4-N7
- 4569
- 12,0 -18 N5-N6
- 4578
- 39,4 -6 N5-N7
- 4493
- 3,6 1 N6-N7
La afinidad de enlace a FGF-2 se determinó con BIAcore™ para cada construcción. Los valores de la constante de disociación (KD) entre 0,49 y 2,31 nM se obtuvieron para construcciones que mostraban afinidad medible. Para las construcciones que no enlazaron a FGF-2 o no pudieron producirse, se usó un valor de 10 nM para el análisis DOE. La N-glicosilación en posiciones N5 y en una menor extensión, en posiciones N6 y N3, tuvo un efecto positivo en el enlace a FGF-2. Las interacciones N3-N5 y N5-N6 tuvieron un efecto positivo significativo en el enlace, mientras que las interacciones N3-N6 y N4-N7 tuvieron un efecto negativo en el enlace.
Tabla 8. Enlace a FGF-2
- Construcción
- KD (nM) Respuesta (nM) Variable
- 4572
- 10 6,8 Media
- 4570
- 10 -2,2 N3
- 4577
- 10 -0,5 N4
- 4571
- 10 -6,5 N5
- 4587
- 10 -2,3 N6
- 4585
- 2,7 0,5 N7
- 4586
- 10 0,0 N3-N4
- 4573
- 0,49 -2,2 N3-N5
- 4574
- 10 2,0 N3-N6
- 4575
- 10 0,1 N3-N7
- 4588
- 10 -0,5 N4-N5
- 4576
- 10 0,1 N4-N6
- 4579
- 2,31 2,0 N4-N7
- 4569
- 0,99 -2,3 N5-N6
- 4578
- 0,66 0,5 N5-N7
- 4493
- 1,19 0,0 N6-N7
Esta resolución-V 25-1 D.O.E. reveló que la N-glicosilación tuvo una contribución positiva en la productividad, en las 10 posiciones N3, N4, N5, N6, N7; tuvo un impacto positivo en el enlace a FGF-2, en posiciones N5 >> N6 y N3; y
desfavoreció la aparición de moléculas de alto peso molecular en todas las posiciones, especialmente N5 > N6.
Por lo tanto, la ocupación de N-glicanos es obligatoria en la posición N5, y recomendada en las posiciones N3, N4, N6 y N7 respectivamente (posición 265, 228, 241, 297 y 318 respectivamente en FGFR2_HUMANO (Swissprot).
5 Ejemplo 7: Farmacocinéticas de la proteína de fusión sFGFR2-Fc
En el ejemplo 7, sFGFR2-Fc es la proteína de fusión que corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 con un número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano de 1,3. A tres ratones por punto temporal se les inyectaron 500 μg de proteína de fusión en la vena caudal. A diversos puntos temporales después de la inyección del producto, se recogió sangre, la Figura 10 muestra la concentración de proteína en plasma e hígado. La Figura 11
10 muestra la cantidad de recuperación de proteína en puntos temporales tempranos en plasma e hígado expresadas en porcentaje de la dosis inyectada.
Los parámetros farmacocinéticos se calcularon empleando análisis no compartimental. La vida media de eliminación se calculó con los 6 últimos puntos de datos que proporcionaban el mejor ajuste de la fase terminal logarítmico-lineal (Tabla 9).
15 Tabla 9
Parámetro Unidades sFGFR2-Fc
t½ hora 70,1 Tlast hora 72,0 Clast µg/mL 27,6 AUClast hr*µg/mL 3138 Clobs mL/hora/kg 4,2 Vss mL/kg 406
AUClast Área bajo la curva desde el momento de la dosificación hasta la última concentración medible.
Cl obs Aclaramiento total corporal para la administración extravascular
Clast Concentración correspondiente a Tlast
t½ Vida media terminal
20 Tlast Tiempo de la última concentración medible (no cero).
Vss Una estimación del volumen de distribución en estado estacionario
Tras la administración intravenosa, la sFGFR2-Fc mostró un perfil farmacocinético favorable con una prolongada vida media de eliminación (casi 3 días) y un aclaramiento corporal total reducido. El volumen de distribución fue limitado e inferior al volumen de agua corporal total, lo que sugiere una distribución tisular limitada. A las 72 horas, la 25 concentración en plasma de sFGFR2-Fc se mantiene a una concentración muy alta, y el aclaramiento también es bueno. Los parámetros farmacocinéticos de sFGFR2-Fc son muy compatibles con el empleo de esta proteína de fusión como agente terapéutico. En efecto, tal como se ha mostrado en los Ejemplos, la concentración en plasma después de la inyección intravenosa en ratones es sustancialmente elevada, y el aclaramiento permanece muy bajo a las 72 horas tras la inyección. De manera importante, la cinética de escisión de sFGFR2-Fc in vivo es también muy
30 baja, ya que la sFGFR2-Fc fue escindida sólo parcialmente (40% tras 18 horas) y la concentración de la molécula de longitud completa permaneció inalterada hasta las 72 horas. Por tanto, la molécula de fusión, al menos tal como se enumera en la SEQ ID NO: 2 y un número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano de 1,3, mostró un perfil farmacocinético favorable con una larga vida media de eliminación (casi 3 días) y un aclaramiento corporal total satisfactorio.
En este ejemplo, sFGFR2-Fc es la proteína de fusión que corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 con un número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano de 1,3.
Se había identificado la línea celular A549 como una línea celular tumoral para evaluar la eficacia de sFGFR2-Fc. El solicitante ha demostrado in vitro que esta línea celular expresa FGF2 y también que la sFGFR2-Fc puede detener la proliferación autocrina de estas células. El solicitante estableció un modelo tumoral A549 subcutáneo en ratones "desnudos" Balb/c. Además, el tumor in vivo expresa FGF2.
En este experimento, la eficacia de la molécula sFGFR2-Fc se evaluó en el modelo de crecimiento tumoral A549. Se inyectaron los productos de forma subcutánea dos veces por semana. Se evaluaron distintas dosis, es decir, 25, 15 y 5 mg/kg de sFGFR2-Fc.
Después de todos los análisis de la evolución del volumen tumoral de los tres grupos tratados con FGFR2-Fc, fueron estadísticamente diferentes a la evolución tumoral del grupo tratado con PBS. La sFGFR2-Fc es eficaz en el crecimiento tumoral en este modelo a la dosis de 5 mg/kg dos veces a la semana.
Diseño experimental
Se inyectaron de forma subcutánea 5.106 células A549 en 200 µl a ratones desnudos Balb/c en el día 0. El mismo día, después de la inyección celular, se distribuyeron aleatoriamente los ratones en bloques de cuatro, dentro de cuatro grupos basados en el peso corporal. Los tratamientos comenzaron tras la aleatorización el día después de la inyección celular. Cada grupo recibió de forma subcutánea 500, 300 o 100 μg/ratón/administración, que correspondía respectivamente a 25, 15 y 5 mg/kg dos veces por semana: lunes y viernes, durante 39 días.
Resultados
Tal como se muestra en la Figura 12, se analizó el volumen del tumor hasta el día 40. Los grupos de 100 μg (triángulos), 300 μg (cuadrados) y 500 μg/ratón/administración (círculos llenos) eran estadísticamente diferentes del grupo de PBS (círculos huecos). Se concluyó que la sFGFR2-Fc redujo el crecimiento tumoral a las dosis de 25, 15 y 5 mg/kg.
Tal como se muestra en la Figura 13, al final del experimento se cosecharon los tumores y se pesaron. Los grupos de 100 μg, 300 μg y 500 μg por ratón y por administración eran estadísticamente diferentes del grupo con PBS. Se concluyó que la sFGFR2-Fc según la presente invención, redujo el peso del tumor a las dosis de 25, 15 y 5 mg/kg.
La evolución del crecimiento tumoral en los grupos de sFGFR2-Fc_100, sFGFR2-Fc_300 y sFGFR2-Fc_500 fue estadísticamente diferente de la evolución en el grupo tratado con PBS. La proteína de fusión sFGFR2-Fc según la presente invención (secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 con un número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano de 1,3, es capaz de disminuir sustancialmente el crecimiento tumoral a la dosis de 5 mg/kg.
Ejemplo 9: Eficacia de la proteína de fusión sFGFR2-Fc en el modelo tumoral subcutáneo H460
En el ejemplo 9, la sFGFR2-Fc es la proteína de fusión que corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 con un número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano de 1,6.
Se había identificado la línea celular H460 como una línea celular tumoral para evaluar la eficacia de sFGFR2-Fc. Se ha demostrado in vitro que esta línea celular expresa FGF2. En este experimento se evaluó la eficacia de sFGFR2Fc sobre el crecimiento tumoral. Se inyectaron los productos de forma subcutánea, dos veces por semana, a la dosis de 25 mg/kg. Después del análisis global de la evolución del volumen tumoral, la sFGFR2-Fc redujo el crecimiento del tumor.
Se inyectaron de forma subcutánea 5.106 células H460, en 200 μl, en el ijar derecho de ratones desnudos Balb/c en el día 0. Tras la inyección celular, en el día de la inoculación celular (día 0) se distribuyó aleatoriamente a los ratones en función del peso corporal medido, y se les ubicó en los grupos de tratamiento.
Los tratamientos se administraron dos veces por semana mediante inyecciones subcutáneas (200 μl) durante 3 semanas consecutivas (lunes y viernes). La primera administración se realizó el día 1 después de la inoculación celular, a fin de maximizar la exposición de las células al tratamiento.
Resultados
La Figura 14 muestra el análisis del volumen tumoral hasta el día 22. Se concluyó que la sFGFR2-Fc redujo sustancialmente el crecimiento tumoral.
La Figura 15 muestra el análisis del peso tumoral en el día 22. Se concluyó que la sFGFR2-Fc redujo sustancialmente el crecimiento tumoral.
La evolución del crecimiento tumoral del grupo sFGFR2-Fc fue estadísticamente diferente de la evolución del grupo tratado con PBS. Se concluyó claramente que la proteína de fusión según la presente invención (secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 con un número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano de 1,6, es capaz de disminuir esencialmente el crecimiento tumoral de H460 a la dosis de 25 mg/kg.
Ejemplo 10: Evaluación de actividad ADCC in vitro de la proteína de fusión sFGFR2-Fc en líneas celulares A549 y H460
En este ejemplo, la sFGFR2-Fc es la proteína de fusión que corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 con un número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano mayor que 1,6. La capacidad de sFGFR2-Fc para mediar una actividad ADCC in vitro se ha evaluado en los modelos seleccionados de células tumorales tanto H460 como A549 (véase los ejemplos 8 y 9).
Diseño experimental
Las células tumorales (A549 y H460) en PBS al 2% de BSA (1 millón/mL) se han incubado 30 min a 4°C con 500 ng/mL de FGF2 (R&DSystems) y 2 µg/mL de sFGFR2-Fc o IgG1 humano de control (Sigma). Las células tumorales se han diluido en RPMI al 1% de FBS y se han incubado en una placa de 96 pocillos a 5000 células por pocillo. Se ha añadido NK purificado en la relación NK/células tumorales 20/1 y 6/1. Las placas se han incubado 4 horas a 37°C, después se han centrifugado y la lactato deshidrogenasa se ha titulado en el sobrenadante (equipo ROCHE). Se obtuvo el 100% de lisis usando tritón X100 al 0,2%. Se calculó el ADCC inducido por sFGFR2-Fc específico como se solicita por el fabricante.
Los resultados ilustrados en la Figura 16, muestran una lisis de células tumorales mediada por células asesinas naturales (NK) en presencia de sFGFR2-Fc en células tumorales tanto A549 como H460 cerca del 25% en las condiciones 20/1 (NK/célula tumoral), que indica que sFGFR2-Fc es capaz de mediar el efecto ADCC en esas células tumorales.
Ejemplo 11: Evaluación de actividades ADCC y CDC in vivo de la proteína de fusión sFGFR2-Fc en el modelo tumoral subcutáneo A549
En este ejemplo, la sFGFR2-Fc es la proteína de fusión que corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 con un número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano mayor que 1,6.
La línea celular A549 se ha identificado como una línea de células tumorales para evaluar la eficacia de la sFGFR2Fc, ya que estas células expresaron alto nivel de FGF2 in vivo y fueron sensibles a ADCC mediado por sFGFR2-Fc in vitro.
Se seleccionaron tres cepas diferentes de ratón (ratones SCID, NOD/SCID y SCID/bg) para evaluar la capacidad de la sFGFR2-Fc para mediar las actividades ADCC y/o CDC in vivo. Los ratones SCID mantuvieron las funciones NK y complementarias y son capaces de desarrollar respuestas ADCC y CDC y se seleccionaron como control positivo. Los ratones NOD/SCID no tienen ni la función NK ni la capacidad de estimular la actividad complementaria y fueron incapaces de desarrollar actividades ni ADCC ni CDC. Los ratones SCID/bg no tienen función NK y fueron incapaces de desarrollar actividad ADCC.
En este experimento, la eficacia de la línea de moléculas sFGFR2-Fc se evaluó en el tumor A549 implantado de forma subcutánea en tres diferentes cepas de ratón. Se inyectó sFGFR2-Fc de forma subcutánea dos veces a la semana a la dosis de 5 mg/kg durante el curso entero del estudio.
El A549 se implantó de forma subcutánea en ratones SCID, NOD/SCID y SCID/bg como se describe anteriormente (véase ejemplo 8). Los tratamientos se han administrado dos veces a la semana mediante inyecciones subcutáneas durante 6 semanas consecutivas. Durante el curso del estudio, el peso corporal y el volumen tumoral se han medido dos veces a la semana.
Tal como se muestra en la Figura 17, se analizó el volumen del tumor hasta el día 41 en los 3 experimentos. En los ratones SCID, el grupo tratado por sFGFR2-Fc a 5 mg/kg (diamantes) fue estadísticamente diferente del grupo control (círculos huecos) y mostró una inhibición tumoral (calculada como 100 - (Volumen del grupo tratado / Volumen del grupo control x 100)) de 39%. En los ratones NOD/SCID, la sFGFR2-Fc a 5 mg/kg no mostró actividad. En los ratones SCID/bg, la sFGFR2-Fc a 5 mg/kg recuperó parcialmente su actividad (inhibición tumoral = 18%). Según estos resultados, los mecanismos CDC y ADCC estuvieron implicados en la eficacia de sFGFR2-Fc.
Ejemplo 12: Evaluación de actividades ADCC y CDC in vivo de la proteína de fusión sFGFR2-Fc en el modelo tumoral subcutáneo H460
En este ejemplo, la sFGFR2-Fc es la proteína de fusión que corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 con un número promedio de ácido siálico por sFGFR2 N-glicano mayor que 1,6.
La línea celular H460 se ha identificado como una línea de células tumorales para evaluar la eficacia de sFGFR2-Fc, ya que estas células expresaron alto nivel de FGF2 in vivo y fueron sensibles a ADCC mediado por sFGFR2-Fc in vitro.
Como se describe anteriormente en el ejemplo 11, se seleccionaron tres cepas de ratón con diferentes funciones inmunes (ratones SCID, NOD/SCID y SCID/bg) para evaluar la capacidad de sFGFR2-Fc para mediar las actividades ADCC y/o CDC in vivo en H460.
En este experimento, la eficacia de la molécula sFGFR2-Fc se evaluó en el tumor H460 implantado de forma subcutánea en las tres diferentes cepas de ratón. Se inyectó sFGFR2-Fc de forma subcutánea dos veces a la semana a la dosis de 25 mg/kg durante el curso entero del estudio.
Diseño Experimental
El H460 se implantó de forma subcutánea en ratones SCID, NOD/SCID y SCID/bg como se describe anteriormente (véase ejemplo 9). Los tratamientos se han administrado dos veces a la semana mediante inyecciones subcutáneas durante 3 semanas consecutivas. Durante el curso del estudio, el peso corporal y el volumen tumoral se han medido dos veces a la semana.
Tal como se muestra en la Figura 18, se analizó el volumen del tumor hasta el día 22 en los 3 experimentos. En los ratones SCID, el grupo tratado con sFGFR2-Fc a 25 mg/kg (diamantes) fue estadísticamente diferente del grupo control (círculos huecos) y mostró una inhibición tumoral de 29%. En los ratones NOD/SCID, la sFGFR2-Fc a 5 mg/kg mostró una pérdida de actividad con una inhibición tumoral de 14%. En los ratones SCID/bg, la sFGFR2-Fc a 5 mg/kg recuperó toda su actividad (inhibición tumoral = 32%). En estos estudios, como se observa en el modelo tumoral A549 (véase ejemplo 11), los mecanismos CDC y ADCC estuvieron implicados en la eficacia de sFGFR2-Fc.
Ejemplo 13 Evaluación de la eficacia in vivo de sFGFR2-Fc en comparación con sFGFR2-Fc (A265 Fc) en el modelo tumoral subcutáneo H460
Shields at al. describió una mutación puntual Asp265Ala en el dominio Fc de IgG1 humano denominado (A265 Fc) que confería un enlace reducido a todos los receptores FcyR y muy baja citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (2001 J. Biol. Chem 276:6591). Esta mutación puntual se introdujo en el dominio Fc de la secuencia de ADN que codifica sFGFR2-Fc del plásmido pXL4547 (Fig. 19), dando por resultado la secuencia de polinucleótido representada por SEQ ID NO. 13. Los clones CHO/DHFR estables que expresan sFGFR2-Fc (A265 Fc) (SEQ ID NO. 14) se generaron usando el sistema de selección y amplificación DHFR con los plásmidos de expresión de mamíferos apropiados pXL4547 y el plásmido pXL4417 como se describe en el Ejemplo 3. La proteína sFGFR2-Fc (A265 Fc) se produjo entonces y se purificó para estudios in vivo. Se verificó que su contenido en glicanos fue similar al contenido en glicanos encontrado para la sFGFR2-Fc producida en los Ejemplos 3 o 5.
- Proteína expresada a partir de CHO-DHFR estable
- sFGFR2-Fc (A265 Fc)
- % de especies sialiladas de sFGFR2-Fc:
- 1-no sialilada
- 40%
- 2-monosialilada
- 28%
- 3-disialilada
- 22%
- 4-trisialilada
- 10%
- Composición de monosacáridos de sFGFR2-Fc N-glicanos por manosas
- 3
- 1-Glucosamina (número por 3 manosas)
- 4,35
- 2-Galactosa (número por 3 manosas)
- 2,74
- 3-Fucosa (número por 3 manosas)
- 0,89
Se ha identificado la línea celular H460 como una línea celular tumoral para evaluar la eficacia de sFGFR2-Fc. Estas células expresaron alto nivel de FGF2 in vivo y eran sensibles al ADCC mediado por sFGFR2-Fc in vitro.
En este experimento, la eficacia de la molécula sFGFR2-Fc y la molécula modificada sFGFR2-Fc (A265 Fc) se 5 evaluó en el tumor H460 implantado de forma subcutánea en ratones desnudos.
Diseño Experimental
H460 se implantó de forma subcutánea en ratones Balb/C desnudos como se describe anteriormente (véase ejemplo 9). Los tratamientos se han administrado dos veces a la semana durante el curso entero del estudio. Durante el curso del estudio, el peso corporal y el volumen tumoral se han medido dos veces a la semana.
Tal como se muestra en la Figura 20, se analizó el volumen del tumor hasta el día 23. El grupo tratado con sFGFR2Fc a 25 mg/kg (diamantes) fue estadísticamente diferente del grupo control (círculos huecos) y mostró una inhibición tumoral de 50%. La sFGFR2-Fc (A265 Fc) modificada a 25 mg/kg mostró una pérdida de actividad con solo una inhibición tumoral de 25% (NS). La mutación en el Fc de sFGFR2-Fc (A265 Fc) indujo una disminución de la
15 actividad.
Como se ha mostrado que esta modificación disminuye la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, el ejemplo 13 proporciona una evidencia indirecta de que sFGFR2-Fc actuó in vivo mediante un mecanismo que implica ADCC.
<110 > CENTELION
<120> FUSIONES Fc CON RECEPTOR PARA FGF SOLUBLE MODIFICADAS CON ACTIVIDAD BIOLOGICA MEJORADA
<130> documento FR2006-084 PCT
<150> documento EP 06291824.8
<151> 2006-11-28
<150> documento EP 07290042.6
<151> 2007-01-11
<160> 14
<170 > Versión PatentIn 3.3
<210> 1
<211> 1755
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221 > CDS
<222> (1)..(1755)
<400> 1
- 5
- <210><211><212><213> 2 S84 PRT Homo sapiens
- <400>
- 2
- 5
- <210><211> <212><213> 3 1050 ADN Homo sapiens
- 30
- <220> <221<222>
- > CDS (1)..(1050)
- 5
- <400> 3
- 5
- <210><211> <212><213> 4 350 PRT Homo sapiens
- <400>
- 4
- <210>
- 5
- <211>
- 696
- <212>
- ADN
- 5
- <213> Homo sapiens
- <220>
- <221
- > CDS
- <222>
- (1)..(696)
- 10
- <400>
- 5
- 5
- <210><211<212><213> 6 > 231 PRT Homo sapiens
- <400>
- 6
- <210>
- 7
- <211>
- 60
- <212>
- ADN
- 5
- <213> Homo sapiens
- <220>
- <221
- > CDS
- <222>
- (1)..(60)
- 10
- <400 >
- 7
- 5
- <210 > <211<212><213> 8 > 20 PRT Homo sapiens
- <400>
- 8
- 10
- <210> <211> <212><213> 9 1197 ADN Homo sapiens
- 15
- <220> <221<222> > CDS (1)..(1197)
- 5
- <210 > <211> <212><213> 10 398 PRT Homo sapiens
- <400>
- 10
- 37
- <210 >
- 11
- <211>
- 1128
- <212>
- ADN
- 5
- <213> Homo sapiens
- <220>
- <221
- > CDS
- <222>
- (1)..(1128)
- 10
- <400>
- 11
- 5
- <210 > <211> <212><213> 12 375 PRT Homo sapiens
- <400 >
- 12
- <210>
- 13
- <211>
- 1722
- <212>
- ADN
- 5
- <213> Homo sapiens
- <220>
- <221
- > CDS
- <222>
- (1)..(1722)
- 10
- <400>
- 13
- 5
- <210 > <211> <212><213> 14 573 PRT Homo sapiens
- <400>
- 14
- 44
Claims (38)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada que comprende una fusión de un fragmento o dominio soluble de un receptor para FGF con una región Fc de una inmunoglobulina, en donde el número promedio de ácido siálico por N-glicano del resto receptor para FGF es 0,9 o superior.
-
- 2.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 1, en donde el número promedio es ácido siálico por N-glicano del resto receptor para FGF es 1,2 o superior.
-
- 3.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 1 o 2, en donde como mucho el 45% de los N-glicanos de dicho resto receptor para FGF no tiene grupo sialilo.
-
- 4.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al menos el 5º sitio de N-glicosilación del resto receptor para FGF está ocupado.
-
- 5.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 4, en donde, además, los sitios 3º, 4º, 6º y 7º de glicosilación del resto receptor para FGF están ocupados.
-
- 6.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 5, en donde al menos 7 sitios de N-glicosilación del resto receptor para FGF están ocupados.
-
- 7.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 6, en donde todos los sitios de N-glicosilación del resto receptor para FGF están ocupados.
-
- 8.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquier reivindicación anterior, en donde el valor KD de dicha fusión para FGF2 medido por Biacore™ está comprendido entre 1 y 5 nM
-
- 9.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 8, en donde el valor KD de dicha fusión para FGF2 medida por Biacore™ es alrededor de 1,5 nM.
-
- 10.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha fusión posee actividades ADCC y/o CDC.
-
- 11.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los N-glicanos de dicha fusión están fucosilados al 60-100%.
-
- 12.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada comprende 3 residuos de manosa, una media de 1,5 a 3,0 residuos de galactosa, una media de 3,5 a 5 residuos de N-acetilglucosamina, y una media de 0,6 a 1 residuos de fucosa por molécula de glicano.
-
- 13.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde los N-glicanos de dicha fusión están fucosilados al 0-60%.
-
- 14.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el receptor para FGF se selecciona entre receptor para FGF 1 (FGFR1) o receptor para FGF 2 (FGFR2).
-
- 15.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el receptor para FGF se selecciona entre isotipo IIIc de receptor para FGF 1 e isotipo IIIc de receptor para FGF 2.
-
- 16.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio soluble de receptor para FGF tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 4, o bien una secuencia que tiene una identidad de al menos 95% con la SEQ ID NO: 4.
-
- 17.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la parte Fc tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 6, o bien una secuencia que tiene una identidad de al menos 95% con la SEQ ID NO: 6.
-
- 18.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada comprende además una secuencia enlazadora de al menos 3 residuos aminoácido.
-
- 19.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 18, en donde la secuencia enlazadora es SAL (Ser-Ala-Leu).
-
- 20.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada tiene una secuencia polipeptídica como se expone en SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 95% con la SEQ ID NO: 2.
-
- 21.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada comprende además el péptido señal de SEQ ID
-
- 22.
- Una célula huésped que comprende (i) un ácido nucleico que codifica el receptor para FGF de fusión modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, (ii) un ácido nucleico que codifica α-1,4galactosiltransferasa y (iii) un ácido nucleico que codifica β-2,3-sialiltransferasa.
-
- 23.
- La célula huésped según la reivindicación 22, en donde dicho ácido nucleico que codifica el receptor para FGF de fusión modificado comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.
-
- 24.
- La fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, como un medicamento.
-
- 25.
- Una composición farmacéutica que comprende un receptor para FGF de fusión modificado, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.
-
- 26.
- La composición farmacéutica según la reivindicación 25, en donde dicha composición contiene un agente terapéutico adicional.
-
- 27.
- La composición farmacéutica según la reivindicación 26, en donde dicho agente terapéutico adicional es un agente anti-angiogénico o un agente quimioterapéutico.
-
- 28.
- La composición farmacéutica según la reivindicación 27, en donde dicho agente anti-angiogénico es un factor de necrosis tumoral, o un antagonista de un factor de crecimiento fibroblástico (FGF) ácido o básico, factor de crecimiento hepatocítico (HGF), factor tisular (TF), proteína C, proteína S, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o receptor HER2.
-
- 29.
- La composición farmacéutica según la reivindicación 27, en donde dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo: agentes antimicrotúbulos; complejos de coordinación con platino; agentes alquilantes; agentes antibióticos; inhibidores de topoisomerasa II; antimetabolitos; inhibidores de topoisomerasa I; hormonas y análogos de hormonas; inhibidores de la ruta de transducción de señal: inhibidores de angiogénesis de tipo distinto al de receptor de tirosina-quinasa; agentes inmunoterapéuticos; agentes pro-apoptóticos; e inhibidores de la señalización del ciclo celular.
-
- 30.
- La composición farmacéutica según la reivindicación 27, en donde dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo de taxol y taxotere.
-
- 31.
- Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para usar en el tratamiento de cáncer.
-
- 32.
- Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 31 en asociación con un agente terapéutico adicional.
-
- 33.
- Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 32, en donde dicho agente terapéutico adicional es un agente anti-angiogénico o un agente quimioterapéutico.
-
- 34.
- Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 33, en donde dicho agente anti-angiogénico es un factor de necrosis tumoral, o un antagonista de un factor de crecimiento fibroblástico (FGF) ácido o básico, factor de crecimiento hepatocítico (HGF), factor tisular (TF), proteína C, proteína S, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o receptor HER2.
-
- 35.
- Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 33, en donde dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo: agentes antimicrotúbulos; complejos de coordinación con platino; agentes alquilantes; agentes antibióticos; inhibidores de topoisomerasa II; antimetabolitos; inhibidores de topoisomerasa I; hormonas y análogos de hormonas; inhibidores de la ruta de transducción de señal; inhibidores de angiogénesis de tipo distinto al de receptor de tirosina quinasa; agentes inmunoterapéuticos; agentes proapoptóticos; e inhibidores de la señalización del ciclo celular.
-
- 36.
- Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 33, en donde dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo de taxol y taxotero.
-
- 37.
- Una fusión Fc con receptores para FGF soluble modificada según la reivindicación 31, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo de carcinoma, que incluye el de vejiga, mama, colon, cabeza y cuello, riñón, que incluye carcinoma de células renales, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello de útero, tiroides y piel; que incluye carcinoma de células escamosas ; tumores hematopoyéticos de trazado linfático, que incluye leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda , linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoyéticos de trazado mieloide, incluidos leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; otros tumores, que
incluyen melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, que incluyen astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, que incluyen melanoma, xeroderma pigmentoso, keratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma.5 38. Una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según la reivindicación 37, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo de melanoma, leucemia, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama y cáncer de cabeza y cuello. - 39. El proceso de preparación de una fusión Fc con receptor para FGF soluble modificada según cualquiera delas reivindicaciones 1 a 21, que consiste en cultivar una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 22 10 o 23 y en cosechar la proteína secretada.
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