BRPI0717035B1 - Moduladores de benzotriazol cinase - Google Patents

Abstract

moduladores de benzotriazol cinase. a presente invenção refere-se a novos derivados de benzotriazol de fórmula (i) em que r1, r2, r3, e m são como definidos na descrição e nas reivindicações, bem como sais fisiologicamente aceitáveis destes. estes compostos são moduladores de jnk e cdk.

Description

A presente invenção refere-se a um ‘método para modulação de cinases N-terminais c-Jun (JNK) e cinases dependentes de ciclina (CDK), e um método para tratamento de um indivíduo afligido com uma doença ou condição que pode ser aliviada por modulação de JNKs ou CDKs com compostos heterocíclicos, mais particularmente, para derivados de benzotriazol. A invenção também refere-se a novos compostos heterocíclicos e composições farmacêuticas compreendendo o referido composto.

As cinases N-terminais c-Jun (JNKs) são membros da família de proteína cinase ativada por mitógeno juntamenté com p38 e cinases reguladas por sinal extracellular (ERKs). Três genes distintos (jnk1, jnk2 e jnk3) codificando 10 variantes de união foram identificados (Y.T. Ip e R.J. Davis, Curr. Opin. Cell Biol.(,1998) 10:205-19). JNK1 e JNK2 foram expressos em A uma ampla variedade de tecidos, enquanto JNK3 é principalmente expresso em neurônios, e em uma menor extensão no coração e testes (D.D. Yang e outro, Nature(1997) 389:865-70). Membros da fàmília JNK são ativados por citocinas pró-inflamatórias tais como fator çxde necrose de tumor (TNF-a) e interleucina-1β(IL-1β), bem como estresses ambientais. A ativação de JNKs é mediada por suas cinases a montante, MKK4 e MKK7, por meio de fosfori- lação dual de Thr-183 e Tyr-185 (B. Derijard e’’outro, Cell(1994) 76:102537). Foi mostrado que MKK4 e MMK7 podem ser ativados pelas diversas cinases a montante, incluindo MEKK1 e MEKK4; dependendo dos estímulos externos e contexto celular (D. Boyle e outro, Artrite Rheum(2003) 48:245024). A especificidade de sinalização de JNK é .obtida por formação de um complexo de sinalização específico de JNK contendo múltiplos componentes 1 da cascata de cinase utilizando proteínas andaime chamadas proteínas de interação de JNK (J. Yasuda e outro, Mol. Cell. Biol.(1999) 19:7245-54). JNKs foram mostrados desempenhar importantes papéis na inflamação, fun- 30 ções de célula T, apoptose e sobrevivência celular por fosforilação de substratos específicos, incluindo fatores de transcrição tais como c-Jun, o componente da família de proteína ativadora 1 (AP1), e ATF2, bem como fatores de não transcrição tais como IRS-1 e Bcl-2 (A.M. Manning e R.J. Davis, Nat. Rev. Drug Discov. (2003) 2:554-65). Superativação de JNK é acreditada ser um importante mecanismo em doenças autoimunes, inflamatórias, metabólicas, neurológicas bem como câncer.

Artrite reumatóide (RA) é uma doença autoimune sistêmica caracterizada por inflamação crônica das articulações. Além do inchaço na ar-ticulação e dor causada pelo processo inflamatório, a maioria dos pacientes de RA finalmente desenvolve dano de articulação debilitante e deformação. Diversas linhagens dé evidências farmacológica e genética compelentes em 10 modelos celular e animal fortemente sugerem a relevância e importância do JNK ativado na patogênese de RA. Primeiro, ativação anormal de JNK foi detectada tanto em articulações artríticas de humano de pacientes de RA (G. Schett e outro, Artrite Rheum(2000) 43:2501-12) quanto em articulações artríticas de roedor de modelos animais de artrite (Z. Han e outro, J. Clin. Invest.(2001) 108:73-81). Além disso, a inibição de ativação de JNK por inibidores de JNK seletivos bloqueou a produção de MMP e citocinas pró- inflamatórias em sinoviócitos, macrófagos e linfócitos humanos (Z. Han e outro, (2001) supra). Importantemente, a administração dos inibidores de JNK seletivos em ratos com artrite adjuvante (Z. Han e outro, (2001) supra) 20 ou em camundongos com artrite induzida por colágeno (P. Gaillard e outro, J Med Chem. (2005) 14:4596-607) eficazmente protegeu as articulações de destruição e significantemente reduziu o inchaço da pata por inibição de ci- tocina e expressão de colagenase. Além disso, camundongos deficientes de JNK2 foram parcialmente protegidos de destruição da articulação, porém 25 mostraram pequeno efeito sobre inchaço de pata e inflamação no modelo de artrite induzida por colágeno passivo. Estes estudos indicam que JNK2 é funcionalmente redundante com JNK1 com referência aos seus papéis na degradação de matriz, inflamação e inchaço da pata. Portanto, inibição combinada de ambas atividades de JNK1 e JNK2 é requerida para terapia eficaz para RA (Z. Han e outro, Artrite Rheum.(2002) 46:818-23).

Asma é uma doença inflamatória crônica de vias aéreas, caracterizada pela presença de um processo inflamatório celular e por hipersensi- bilidade brônquica associada à mudanças estruturais das vias aéreas (B. Bradley e outro, J. Allergy Clin. Immunol.(1991) 88:661-74). Este distúrbio foi mostrado ser conduzido por muitos tipos de células nas vias aéreas, incluindo linfócitos T, eosinófilos, mastócitos, neutrófilos e células epiteliais (J. 5 Bousquet e outro, Am. J. Respir. Crit. Care Med.(2000) 161:1720-45). JNKs têm emergido como alvos terapêuticos de promessa para asma baseados nos estudos proof-of-concept recentes nos modelos celular e animal de asma utilizando inibidores de JNK seletivos (K. Blease e outro, Expert Opin. Emerg. Drugs(2003) 8:71-81). Foi mostrado que inibidores de JNK signifi- 10 cantemente bloqueiam a produção de RANTES nas células lisas das vias aéreas humanas ativadas (K. Kujime e outro, J. Immunol.(2000) 164:322228).Mais importantemente, os inibidores de JNK mostraram boa eficácia em modelos de rato e camundongo crônicos quanto suas capacidades de reduzir infiltração celular, inflamação, hipersensibilidade, proliferação de músculo 15 liso, e produção de IgE (P. Nath e outro, Eur. J. Pharmacol.(2005) 506:27383; P. Eynott e outro, Br. J. Pharmacol.(2003) 140:1373-80). Estas observações sugerem papéis importantes de JNKs na inflamação alérgica, processo de remodelagem das vias aéreas associado com hipersensibilidade. Portan- I to, bloqueio da atividade de JNK é esperado ser benéfico para o tratamento 20 de asma.

Diabetes tipo 2 é a mais grave e prevalente doença metabólica caracterizada por resistência à insulina e comprometimento da secreção de insulina como um resultado de inflamação de baixo nível crônica e metabolismo de lipídeo anormal associado com estresse oxidativo. Foi relatado que 25 a atividade de JNK é anormalmente elevada em vários tecidos-alvos diabéticos sob condições obesas e diabéticas (J. Hirosumi e outro, Nature(2002) 420:333-36; H. Kaneto, Expert. Opin. Ther. Targets(2005) 9:581-92). Ativação da série de reação de JNK por citocinas pró-inflamatórias e estresses oxidativos negativamente regula a sinalização de insulina por meio de fosfo- 30 rilação de substrato de_receptor de insulina 1 (IRS-1) em Ser307, portanto contribui para resistência à insulina e tolerância à glicose (J. Hirosumi e outro,Nature(2002) supra; Y. Lee e outro, J. Biol. Chem. (2003) 278:2896-902; Y. Nakatani e outro, J. Biol. Chem. (2004) 279:45803-09). Evidência genética compelente veio de estudos de modelo animal elegantes utilizando camundongos jnk’A cruzados com camundongos obesos genéticos (ob/ob)ou camundongos obesos de dieta. Perda de JNK1 (JNKTA), porém não das 5 funções de JNK2 (jnk2’A), protegeu camundongos obesos de ganhos corporais, aumentou níveis de estado estável de glicose sanguínea, e diminuiu níveis de insulina plasmática (J. Hirosumi e outro, Nature(2002) supra). Além disso, os efeitos benéficos foram observados em um modelo diabético genético (camundongos db/db) por administração de um inibidor de JNK de 10 molécula pequena, CC105 (B. Bennett e outro, Curr. Opin. Pharmacol. (2003) 3:420-25) ou um peptídeo I inibitório de JNK (JIP) derivado do domínio de ligação de JNK da proteína 1de interação de JNK (JIP-1) (H. Kaneto e outro, Nat. Med. (2004) 10:1128-32), incluindo níveis de glicose sanguínea < menores e insulina plasmática maiores significantes. Mais interessantemen- 15 te, outro relato recente (A. Jaeschke e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. (2005) 102:6931-35) revelou que JNK2 desempenha um papel importante em diabetes tipo 1 causada por destruição autoimune de células β de produção de insulina. Camundongos diabéticos não obesos deficientes em expressão de JNK2 mostraram insulite destrutiva reduzida e menos progressão 20 de doença para diabetes, provavelmente devido à polarização enviesada com respeito ao fenótipo de Th2. Tomados juntos, estes estudos demonstraram a utilidade de inibidores de JNK no tratamento de obesidade/diabetes tipo 2. -

Doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer 25 (AD), doença de Parkinson (PD) e acidente vascular cerebral são caracterizadas por perda sináptica, atrofia neuronal e morte. A série de reação de JNK levando à ativação de c-Jun foi mostrada desempenhar um papel causal em apoptose de neurônios embriônicos primários isolados e múltiplas linhagens de célula neuronal sob indução de uma variedade de estímulos (D. Bozyczko-Coyne e outro, Curr. Drug Targets CNS Neurol. Disord.(2002) 1:31-49). Superativação de JNK foi observada em cérebros humanos de pacientes de AD (J. Pei e outro, J. Alzheimers Dis. (2001) 3:41-48) ou secções crista, estão juntadas entre'si. .18. Transportador tubular helicoidal (100), de acordo com a rei-vindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que os distintos passos (Gh) do transportador tubular helicoidal estão unidos entre si ao menos parcial- 5 mente por uma costura de solda (S) em espiral sobre o invólucro do transportador tubular helicoidal.19. Transportador tubular-helicoidal, de acordo com uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que o transportador tubular helicoidal apresenta em ao menos uma de suas extremidades um flange 10 (140), que está fixado, p.ex. soldado, de preferência às talas dobradas na região da extremidade do transportador tubular helicoidal. 20. Transportador tubular helicoidal, de acordo com a reivindica-ção 19, caracterizado pelo fato de que o flange (140) é executado em uma extremidade do transportador tubular helicoidal em forma de uma cremalhei- 15 ra, que para a rotação do transportador tubular helicoidal pode ser levada a engate com um pinhão (151) acionado por um dispositivo de acionamento (150). , \ 21. Transportador tubular helicoidal (100), de acordo com a rei-vindicação 19 ou 20, cara'cterizado pelo fato de que o flange em uma extre- 20 midade eventualmente contraposta â cremalheira é executado como anel de rolamento (142) para a montagem giratória do transportador tubular helicoidal (100) sobre rolamentos (160) executados de preferência cônicos. 22. Transportador tubular helicoidal (100), de acordo com uma * das reivindicações 15 a 21, produzido pelo processo como definido na rei- 25 vindicação 2 ou 3, caracterizado por um espaço oco 172 entre um alojamento 170, a crista 113’ e o segmento de base 112’, sendo que o espaço oco 172 é de preferência evacuado. expressão de gene bcl-2 anti-apoptótico. interessantemente, a resistência a múltiplos fármacos e hiper-proliferação vistas em pacientes de AML refratários ao tratamento foram causalmente ligadas à atividade de JNK sustentada presente nestas amostras de AML (L. Cripe e outro, Leukemia(2002) 5 16:799-812). Ativação de JNK em células leucêmicas resultou em expressão induzida de bombas de efluxo tais como mdr1 e MRP1 responsáveis por re-sistência a múltiplos fármacos. Além disso, genes com um benefício de sobrevivência em resposta ao estresse oxidativo incluindo glutationa-S- transferase π e y-glutamil cisteína sintase foram também superregulados pe- 10 la série de reação de JNK ativada.

Consequentemente, moduladores de JNK são úteis no tratamento de uma variedade de doenças e/ou condições.

O papel de cinases dependentes de ciclina ("cdks") na regulação de proliferação celular é bem-estabelecido. Existe um corpo extensivo da 15 literatura validando o uso de compostos que inibem alvos nas séries de reação de Cdk4 , Cdk2 e Cdk1 como agentes terapêuticos antiprolefarativos. Veja, por exemplo, J. Lukas e outro, Nature(1995) 79:573-82; J.R. Nevins, Science (1992) 258:424-29; I.K. Lim e outro, Mol Carcinogen(1998) 23:2535; S.W. Tam e outro, Oncogene(1994) 9:2663-74; B. Driscoll e outro, Am. J. Physiol.(1997) 273 (Lung Cell. Mol. Physiol.) L941-L949; e J. Sang e outro, Chin. Sci. Bull. (1999) 44:541-44. Inibidores de proliferação celular agem como agentes citostáticos reversíveis que são úteis no tratamento de processos de doença que caracterizam crescimento celular anormal, tais como cânceres e outros distúrbios prol iterativos celulares incluindo, por exemplo 25 inflamação (por exemplo, hiperplasia de próstata benigna, adenomatose familiar, polipose, neuro-fibromatose, ate rose le rose, fibrose pulmonar, artrite, psoríase, doença do intestino inflamatória, infecções de rejeições a transplante), infecções virais (incluindo, sem limitação, herpes vírus, poxvirus, Epstein-Barr vírus), doença autoimune (por exemplo, lúpus, artrite reumatói- de, psoríase, doença do intestino inflamatória), distúrbios neurodegenerati- vos (incluindo, sem limitação, doença de Alzheimer), e doenças neurodege- nerativas (por exemplo, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, atrofia muscular espinhal, e degeneração cerebral).

Um aspecto da invenção fornece um composto de fórmula I:

ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que R é alquila inferior, hidróxi-alquila inferior, ou um radical selecionado de:

cada Ra é independentemente H, alquila inferior, OH, ou hidróxi-alquila inferior; cada Rb é independentemente H, alquila inferior, halo, nitro, ou halo-alquila inferior; p é 2, 3, ou 4; X é O, CR4R5, C(=O), OU S(O)X; R1 é hidrogênio, halo, alquila, ou NH2; cada de R3 é independentemente halo, -NO2, alquila inferior, -CN, -OR7, -NR8R9, -C(O)-R7, -O-C(O)-R7, -era, -OMRs, -SO2-R10, OU dois de R3 formam alquileno dióxi; R4 é hidrogênio, alquila inferior, ciano, -(CH2)nOR7, -(CH2)nNR8R9, -(CH2)n-C(O)-NR8R9, -(CH2)n-OC(O)-NR8R9, -(CH2)n- C(O)-OR7; -NR7-SO2-R10, -(CH2)n-NR8-C(O)-R11, ou -(CH2)n-NR8-C(O)- OR6; R5 é hidrogênio ou alquila; ou R4 e R5 juntos formam alquileno dióxi; R6 é hidrogênio, alquila inferior, heteroalquila, cicloalquila, hete- rociclilalquila, ou -NR8R9; R10 é alquila, cicloalquila, heterociclilalquila, ou -NR8R9; R11 é alquila, cicloalquila, heteroalquila, ou (heterociclil)alquila; R2 e R7 são cada qual independentemente hidrogênio ou alquila inferior; R8 é hidrogênio, alquila inferior, ou acila; R9 é hidrogênio, alquila inferior, heteroalquila, arila, heteroarila, heterociclila, cicloalquila; ou R8 e R9 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são conecta- dos para formar uma heterociclila compreendendo pelo menos um átomo de w anel de nitrogênio, opcionalmente substituído com OH, oxo, alquila inferior, alcóxi inferior, ou acila; cada de m e x é independentemente um número inteiro de 0 a 2; Y é hidrogênio, -(CH2)n-OR7, -(CH2)n-C(O)-R7 ou -(CH2)n- C(O)-OR7; cada de y e z é independentemente 0 ou 1; e n é um número inteiro de 0 a 4.

A invenção também fornece composições farmacêuticas, méto-dos de utilização, e métodos de preparação dos compostos acima mencio-nados.

Compostos e composições da invenção são úteis no tratamento 25 e/ou prevenção de um distúrbio mediado por cinase N-terminal c-Jun, tais como distúrbios autoimunes, distúrbios antiinflamatórios, distúrbios metabólicos, doenças neurológicas, e câncer. Em algumas modalidades, compostos e composições da invenção são úteis no tratamento e/ou prevenção de artrite reumatóide, asma,-diabetes tipo II, doença de Alzheimer, doença de Par- 30 kinson e/ou acidente vascular cerebral.

Compostos e composições da invenção são úteis no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio mediado por CDK, que são geralmente pro- cessos de doença que caracterizam crescimento celular anormal, tais como cânceres e outros distúrbios proliferativos celulares incluindo, por exemplo inflamação (por exemplo, hiperplasia de próstata benigna, adenomatose familiar, polipose, neuro-fibromatose, aterosclerose, fibrose pulmonar, artrite, 5 psoríase, doença do intestino inflamatória, infecções de rejeições a transplante), infecções virais (incluindo, sem limitação, herpes vírus, poxvirus, Epstein-Barr vírus), doença autoimune (por exemplo, lúpus, artrite reumatói- de, psoríase, doença do intestino inflamatória), distúrbios neurodegenerati- vos (incluindo, sem limitação, doença de Alzheimer), e doenças neurodege- 10 nerativas (por exemplo, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, atrofia muscular espinhal, e degeneração cerebral).

A menos que de outra maneira estabelecida, os seguintes termos utilizados neste Pedido, incluindo a especificação e reivindicações, têm as definições fornecidas abaixo. Deve ser observado que, como utilizado na 15 especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um, uma", "um, uma" e "o, a" incluem os referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outra maneira.

"Alquila"significa a porção de hidrocarboneto saturada linear ou ramificada monovalente, consistindo somente de átomos de carbono e hi- 20 drogênio, tendo de um a doze átomos de carbono. "Alquila inferior" refere-se a um grupo alquila de um a seis átomos de carbono, isto é, Ci-C6alquila. Exemplos de grupos alquila incluem, porém não estão limitados a, metila, etila, propila, isopropila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila, n-hexila, octi- la, dodecila. "Alquila ramificada" refere-se a uma porção de alquila tendo 25 pelo menos uma ramificação, por exemplo, isopropila, isobutila, terc-butila, e os similares. Similarmente, "alcóxi inferior" refere-se a uma porção da forma -OR, e "acila" refere-se a uma porção da forma -C(O)R, onde R é alquila inferior.

"Alquileno"-significa uma porção de hidrocarboneto divalente sa- 30 lurada linear de um a seis átomos de carbono ou um radical de hidrocarboneto divalente saturado ramificado de três a seis átomos de carbono, por exemplo, metileno, etileno, 2,2-dimetiletileno, propileno, 2-metilpropileno, butileno, pentileno.

"Alquileno dióxi" significa uma porção divalente da fórmula -0- R-O-, onde R é alquileno como definido aqui.

"Arila" significa uma porção de hidrocarboneto aromático cíclico monovalente consistindo em um anel aromático mono-, bi- ou triccílcico. Fe- nila ou naftila é preferida. O grupo arila pode ser opcionalmente substituído como definido aqui. Exemplos de porções de arila incluem, porém não estão limitadas a, fenila, naftila, fenantrila, fluorenila, indenila, pentalenila, azuleni- la, oxidifenila, bifenila, metilenodifenila, aminodifenila, difenilsulfidila, difenil-sulfonila, difenilisopropilidenila, benzodioxanila, benzofuranila, benzodioxilila, benzopiranila, benzoxazinila, benzoxazinonila, benzopiperadinila, benzopipe- „ razinila, benzopirrolidinila, benzomorfolinila, metilenodioxifenila, etilenodioxi- fenila opcionalmente substituídas, incluindo derivados parcialmente hidroge- * nados destes.

"Cicloalquila" significa uma porção carbocíclica saturada monovalente consistindo em anéis mono- ou bicíclicos. Cicloalquila pode opcio-nalmente ser substituída com um ou mais substituintes, em que cada substi- tuinte é independentemente hidróxi, alquila, alcóxi, halo, haloalquila, amino, monoalquilamino, ou dialquilamino, a menos que de outra maneira especifi- camente indicado. Cicloalquila preferida é C3-7 cicloalquila monocíclica. E-xemplos de porções de cicloalquila incluem, porém não estão limitadas a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila, cicloeptila, incluindo derivados parcialmente insaturados destes.

"Cicloalquilalquila" significa uma porção da fórmula -Ra-Rb, on- de Ra é alquileno e Rb é cicloalquila como definido aqui.

"Heteroalquila" significa uma porção de alquila como definido aqui, incluindo uma C4-C7 alquila ramificada, em que um, dois ou três átomos de hidrogênio foram substituídos com um substituinte independentemente-selecionado do grupo consistindo -em -0Ra, -NRbRc, e -S(O)nRd (on- de n é um número inteiro de 0 a 2), com 0 entendimento de que o ponto de ligação do radical de heteroalquila é através de um átomo de carbono, em que Ra é hidrogênio, acila, alquila, cicloalquila, ou cicloalquilalquila; Rb e Rc são independentemente um do outro hidrogênio, acila, alquila, cicloalquila, ou cicloalquilalquila; e quando n for 0, Rd será hidrogênio, alquila, cicloalquila, ou cicloalquilalquila; quando n for 1, Rd será alquila, cicloalquila, ou cicloalquilalquila; e quando n for 2, Rd será alquila, cicloalquila, cicloalquilalquila, 5 amino, acilamino, monoalquilamino, ou dialquilamino. Exemplos representativos incluem, porém não estão limitados a, 2-hidroxietila, 3-hidroxipropila, 2- hidróxi-1-hidroximetiletila, 2,3-diidroxipropila, 1 -hidroximetiletila, 3- hidroxibutila, 2,3-diidroxibutila, 2-hidróxi-1 -metilpropila, 2-aminoetila, 3- aminopropila, 2-metilsulfoniletila, aminossulfonilmetila, aminossulfoniletila, 10 aminossulfonilpropila, metilaminossulfonilmetila, metilaminossulfoniletila, me- tilaminossulfonilpropila.

"Heteroarila" significa uma porção monocíclica ou bicíclica de 5 a 12 átomos de anel tendo pelo menos um anel aromático contendo um, dois, ou três heteroátomos de anel selecionados de N, O, ou S, os átomos de anel 15 restantes sendo C, com o entendimento de que o ponto de ligação do radical de heteroarila será sobre um anel aromático. O anel de heteroarila pode ser opcionalmente substituído como definido aqui. Exemplos de porções de heteroarila incluem, porém não estão limitadas a, imidazolila, oxazolila, isoxa- zolila, tiazolila, isotiazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, pirazinila, tienila, tiofeni- 20 la, furanila, piranila, piridinila, pirrolila, pirazolila, pirimidila, piridazinila, quino- linila, isoquinolinila, benzofurila, benzofuranila, benzotiofenila, benzotiopirani- la, benzimidazolila, benzoxazolila, benzooxadiazolila, benzotiazolila, benzoti- adiazolila, benzopiranila, indolila, isoindolila, indazolila, triazolila, triazinila, quinoxalinila, purinila,.quinazolinila, quinolizinila, naftiridinila, pteridinila, car- 25 bazolila, azepinila, diazepinila, acridinila opcionalmente substituídas incluindo derivados parcialmente hidrogenados destes.

Os termos "halo,""halogênio," e "haleto" são utilizados alterna-damente aqui e referem-se a um substituinte fluoro, cloro, bromo, ou iodo.

"Haloalquila" significa alquila como definido aqui em que um ou 30 mais hidrogénios foram substituídos com os mesmos ou diferentes halogê- nios. Haloalquilas exemplares incluem -CH2CI, -CH2CF3, -CH2CCl3, perfluoroalquila (por exemplo, -CF3).

"Heterociclila"significa uma porção saturada monovalente, con-sistindo em um a três anéis, incorporando um, dois, ou três ou quatro hete- roátomos (escolhido de nitrogênio, oxigênio ou enxofre). Uma heterociclila monocíclica, tendo 3 a 8 átomos de anel, é preferida. O anel de heterociclila 5 pode ser opcionalmente substituído como definido aqui. Exemplos de porções de heterociclila incluem, porém não estão limitadas a, piperidinila, pipe- razinila, homopiperazinila, azepinila, pirrolidinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piridinila, piridazinila, pirimidinila, oxazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinuclidinila, quinolinila, isoquinolini- 10 la, benzimidazolila, tiadiazolilidinila, benzotiazolidinila, benzoazolilidinila, dii- drofurila, tetraidrofurila, diidropiranila, tetraidropiranila, tiamorfolinila, tiamor- folinilsulfóxido, tiamorfolinilsulfona, diidroquinolinila, diidroisoquinolinila, te- traidroquinolinila, tetraidrisoquinolinila opcionalmente substituídas.

"Opcionalmente substituído", quando utilizado em associação 15 com "arila", "fenila", "heteroarila" ou "heterociclila", significa uma arila, fenila, heteroarila ou heterociclila que é opcionalmente substituída independentemente com um ou mais substituintes, preferivelmente um a quatro, e mais preferivelmente, um a três substituintes selecionados de Ci-6 alquila, Ci-θ heteroalquila, oxo (isto é, =0), haloalquila, -(CH2)mCOR7, -(CH2)mSO2R7, Ci-ealcóxi, halogênio, C-i-6 alquilti- o, Ci-6 alquilsulfonila, -SO2NR8R9, ciano, nitro, e -NR8R9, onde m, R7, R8, e R9 são como definidos aqui.

Radicais preferidos para os grupos químicos cujas definições 25 são fornecidas acima são aqueles especificamente exemplificados nos Exemplos.

"Grupo de partida" significa um grupo com o significado conven-cionalmente associado com ele em química orgânica sintética, isto é, um átomo ou grupo deslocável sob condições de reação de substituição. Exem- 30 pios de grupos de partida incluem, porém não estão limitados a, halogênio, alcano ou arilenossulfonilóxi, tais como metanossulfonilóxi, etanossulfonilóxi, tiometila, benzenossulfonilóxi, tosilóxi, e tienilóxi, dihalofosfinoilóxi, benzilóxi, isopropilóxi, acilóxi opcionalmente substituídos.

"Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circuns-tância subsequentemente descrito pode porém não necessitar ocorrer, e que a descrição inclui exemplos onde o evento ou circunstância ocorre e exem- 5 pios em que não ocorre.

"Doença" e "Estado de doença" significa qualquer doença, con-dição, sintoma, distúrbio ou indicação.

"Solvente orgânico inerte" ou "solvente inerte" significa o solvente ser inerte sob as condições da reação sendo descritas em conjunção com 10 ele, incluindo por exemplo, benzeno, tolueno, acetonitrilo, tetra-hidrofurano, N,N-dimetilformamida, clorofórmio, cloreto de metileno ou diclorometano, dicloroetano, éter dietílico, acetato de etila, acetona, metil etil cetona, metanol, etanol, propanol, isopropanol, terc-butanol, dioxano, piridina. A menos que especificado ao contrário, os solventes utilizados nas reações da pre- 15 sente invenção são solvente inertes.

"Farmaceuticamente aceitável" significa aquele que é útil na pre-paração de uma composição farmacêutica que é geralmente segura, não tóxica, e nem biologicamente nem de outra maneira indesejável e inclui a-quele que é aceitável para uso farmacêutico veterinário bem como humano.

"Sais farmaceuticamente aceitáveis" de um composto significa sais que são farmaceuticamente aceitáveis, como definidos aqui, e que pos-suem a atividade farmacológica desejada do composto origem. Tais sais incluem:sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos tais 25 como ácido hidroclórico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico; ou formados com ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido benzenossulfônico, benzóico, ácido canforsulfônico, ácido cítrico, ácido etanossulfônico, ácido fumárico, ácido glucoeptônico, ácido gluconico, ácido glutâmico, ácido glicólico, ácido hidroxinaftóico, ácido 230 hidroxietanossulfônico, ácido lático, ácido maléico, ácido málico, ácido malô- nico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido mucônico, ácido 2- naftalenossulfônico, ácido propiônico, ácido salicílico, ácido sucínico, ácido tartárico, ácido p-toluenossulfônico, ácido trimetilacético; ou sais formados quando um próton acídico presente no composto origem é substituído por um íon de metal, por exemplo, um íon de metal de álcali, um íon alcalino terroso, ou um íon de alumínio; ou coordena-se com uma base orgânica ou 5 inorgânica. Bases orgânicas aceitáveis incluem dietanolamina, etanolamina, N-metilglucamina, trietanolamina, trometamina. Bases inorgânicas aceitáveis incluem hidróxido de alumínio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio. Os sais farmaceuticamente aceitáveis preferidos são os sais formados de ácido acético, ácido hidroclórico, 10 ácido sulfúrico, ácido metanossulfônico, ácido maléico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido cítrico, sódio, potássio, cálcio, zinco, e magnésio.

"Grupo protetor" ou "grupo de proteção" significa o grupo que seletivamente bloqueia um sítio reativo em um composto multifuncional tal que uma reação química possa ser realizada seletivamente em outro sítio 15 reativo desprotegido no significado convencionalmente associado com ele em química sintética. Certos processos desta invenção contam com os grupos protetores para bloquear átomos de nitrogênio e/ou oxigênio reativos presentes nos reagentes. Por exemplo, os termos "grupo de proteção de amino"e "grupo de proteção de nitrogênio" são utilizados alternadamente 20 aqui e referem-se aqueles grupos orgânicos destinados a proteger o átomo de nitrogênio contra reações indesejáveis durante os procedimentos sintéticos. Grupos de proteção de nitrogênio exemplares incluem, porém não estão limitados a, trifluoroacetila, acetamido, benzila (Bn), benziloxicarbonila (car- bobenzilóxi, CBZ), p-metoxibenziloxicarbonila, p-nitrobenziloxicarbonila, terc- butoxicarbonila (BOC). Pessoas versadas conhecerão como escolher um grupo para facilidade de remoção e para a capacidade de resistir às seguintes reações.

"Indivíduo" significa mamíferos e não mamíferos. Mamíferos sig-nificam qualquer membro da classe mamífera incluindo, porém não limitados 30 a, humanos; primatas não humanos tais como chimpanzés e outras espécies macacos (apes), macacos (monkeys); animais de fazenda tais como gado, cavalos, ovelha, cabras, e porco; animais domésticos tais como coelhos, cachorros, e gatos; animais de laboratório incluindo roedores, tais como ratos, camundongos, e cobaias. Exemplos de não-mamíferos incluem, porém não estão limitados a, aves. O termo "indivíduo" não denota uma idade ou sexo particular.

"Quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de um composto que, quando administrada a um indivíduo para tratamento de uma estado de doença, é suficiente para realizar tal tratamento para o estado de doença. A "quantidade terapeuticamente eficaz" variará dependendo do composto, estado de doença a ser tratada, da severidade ou da 10 doença tratada, da idade e saúde relativa do indivíduo, da rotina e forma de administração, do diagnóstico do prático veterinário ou médico assistente, e outros fatores.

Os termos "aqueles definidos acima" e "aqueles definidos aqui" quando referindo-se a uma variável incorporam por referência a ampla defi- 15 nição da variável bem como definições preferidas, mais preferidas e ainda mais preferidas, se existirem.

"Tratando" ou "tratamento" de uma estado de doença inclui: (i) prevenção do estado de doença, isto é, fazendo com que os sintomas clínicos do estado de doença não se desenvolvam em um indiví- 20 duo que pode ser exposto a, ou predisposto ao estado de doença, porém ainda não experimentou ou apresentou sintomas do estado de doença. (ii) inibição do estado de doença, isto é, interrompendo o desenvolvimento do estado de doença ou seus sintomas clínicos, ou (iii) abrandamento do estado de doença , isto é, causando re- 25 gressão temporária ou permanente do estado de doença ou seus sintomas clínicos.

Os termos "tratando", "contactando" e "reagindo" quando refe-rindo-se a uma reação química significa adicionar ou misturar dois ou mais reagentes sob condições apropriadas para produzir o produto indicado e/ou 30 desejado. Deve ser apreciado que a reação que produz o produto indicado e/ou desejado pode não necessariamente resultar diretamente da combinação de dois reagentes que foram inicialmente adicionados, isto é, podem existir um ou mais intermediários que são produzidos na mistura que finalmente levam à formação do produto indicado e/ou desejado.

Em geral, a nomenclatura utilizada neste Pedido é baseada em AUTONOM® v.4.0, um sistema computadorizado do Beilstein Institute para a geração de nomenclatura sistemática IUPAC. Estruturas químicas mostradas aqui foram preparadas utilizando ISIS® versão 2.2. Qualquer valência aberta aparecendo em um átomo de carbono, oxigênio ou nitrogênio nas estruturas anexas indica a presença de um átomo de hidrogênio.

Quando um carbono quiral está presente em uma estrutura quí-mica, é pretendido que todos os estereoisômeros associados com aquele carbono quiral sejam abrangidos pela estrutura.

Todas as patentes e publicações identificadas aqui são incorpo-radas aqui por referência em sua totalidade.

Um aspecto da invenção fornece compostos de fórmula I:

ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que R é alquila inferior, hidróxi-alquila inferior, ou um radical selecionaDo De:

cada Ra é independentemente H, alquila inferior, OH, ou hidróxi-alquila inferior; cada Rb é independentemente H, alquila inferior, halo, nitro, ou halo-alquila inferior; p é 2, 3, ou 4; X é O, CR4R5, C(=O), OU S(O)X; R1 é hidrogênio, halo, alquila, ou NH2; cada de R3 é independentemente halo, -NO2, alquila inferior, - CN, -OR7, -NR8R9, -C(O)-R7, -O-C(O)-R7, -GPa, -CHF2, -SO2-RW, OU dois de R3 formam alquileno dióxi; R4 é hidrogênio, alquila inferior, ciano, -(CH2)nOR7, -(CH2)nNR8R9, -(CH2)n-C(O)-NR8R9, -(CH2)n-OC(O)-NR8R9, -(CH2)n-C(O)- OR7; -NR7-SO2-R10, -(CH2)Π-NR8-C(O)-R11, OU -(CH2)n-NR8-C(O)-OR6; R5 é hidrogênio ou alquila; ou R4 e R5 juntos formam alquileno dióxi; R6 é hidrogênio, alquila inferior, heteroalquila, cicloalquila, hete- 15 rociclilalquila, ou -NR8R9; R10 é alquila, cicloalquila, heterociclilalquila, ou -NR8R9; R11 é alquila, cicloalquila, heteroalquila, ou (heterociclil)alquila; R2 e R7 são cada qual independentemente hidrogênio ou alquila inferior;R8 é hidrogênio, alquila inferior, ou acila; R9 é hidrogênio, alquila inferior, heteroalquila, arila, heteroarila, heterociclila, cicloalquila; ou R8 e R9 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são conecta-dos para formar uma heterociclila compreendendo pelo menos um átomo de 25 anel de nitrogênio, opcionalmente substituído com OH, oxo, alquila inferior, alcóxi inferior, ou acila; cada de m e x é independentemente um número inteiro de 0 a 2; Y é hidrogênio, -(CH2)n-OR7, -(CH2)n-C(O)-R7 ou -(CH2)n- C(O)-OR7; cada de y e z é independentemente 0 ou 1; e n é um número inteiro de 0 a 4.

Em algumas modalidades, R2 é hidrogênio ou metila.

Em outras modalidades, R e ,

onde z e 1 e X é O ou CR4R5. Em algumas modalidades, R4é OH, -C(O)NR8R9, -NRδR9, - NR7SO2R10, OU -OR7.

Ainda em outras modalidades, m é 0.

Ainda mais em outras modalidades, R1 é hidrogênio, metila, cloro, ou fluoro.

Em uma modalidade, X é CR4R5, onde R4 e R5 são aqueles defi-nidos aqui.

Em outras modalidades, R5 é hidrogênio ou metila.

Ainda em algumas modalidades, z é 1.

Ainda mais em outras modalidades, R4 é -NR7-SO2-R10, onde R-, e R10 são aqueles definidos aqui.

Em outras modalidades, x é 2, R7 é hidrogênio ou metila, e R10 é metila, etila, ou -N(CH3)2.

Mais ainda em outras modalidades, z é 1, e R4 é hidrogênio, alquila inferior, ciano, -(CH2)nOR7, ou -(CH2)nNR8R9, ou R4 e R5 juntos formam alquileno dióxi, onde n, R7, R8, e R9 são aqueles definidos aqui.

Em ainda outras modalidades, R4 é -(CH2)nOR7, n é 0 ou 1, e R7 é hidrogênio ou metila.

Ainda em outras modalidades, R4 é -(CH2)nNR8R9, onde n, R8, e R9 são aqueles definidos aqui. Dentro destas modalidades, em casos n é 0 e R8 é hidrogênio, e R9 é hidrogênio, pirimidin-2-ila, ou piridin-2-ila. Ainda em outros casos dentro destas modalidades, n é 0 e R8 e R9 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são conectados para formar 2,5-dioxo- 25 pirrolidin-1 -ila.

Ainda mais em outras modalidades, R4 é hidrogênio, metila, etila, ou ciano.

Em outras modalidades, R4 e R5 juntos formam etileno dióxi.

Ainda em outras modalidades, compostos de fórmula I incluem aqueles onde z é 1, e R4 é -(CH2)n-NR8-C(O)-R11, onde n, R8, e R11 sãoaqueles definidos aqui. Dentro destas modalidades, em alguns exemplos n é " Ò, R8 é hidrogênio ou metila, e R" é metila, etila, metoximetila, hidroximetila, (morfo|in-4-i|)meti|a, ou (4-metil-piperazin-1-il)metila.

Ainda mais em outras modalidades, z é 1, e R' é -(CH2)n-C(O)- NR8R9, em que n, R8, e R' são aqueles definidos aqui. Dentro destas modalidades, em alguns exemplos n é 0, e R8 e R9 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são conectados para formar morfolin-4-ila, pirrolidin- 1-ila, ou 4-metil-piperazin-1-ila. Ainda em outros exemplos n é 0, e R8 é hidrogênio ou metila, e R9 é (2-amino-2-metil)propila, (2-hidróxi)etila, tetraidrolO piran-4-ila, ciclopropila, ou etila.

Em outras modalidades, z é 1, e R' é -(CH2)n-C(O)-OR', em que n e R' são aqueles definidos aqui. Dentro destas modalidades, em al- guns exemplos n é 0 e R' é hidrogênio ou metila.

Ainda em outras modalidades, R' e R' são hidrogênio, z é 0, y é 1, e Y é hidróxi na posição 3 da porção de anel de ciclopentila.

Ainda mais em outras modalidades, R' e R' são hidrogênio, z é 1, y é 1, e Y é hidróxi, hidroximetila, ou grupo -CO2CH,CH3 na posição 2 da porção de anel de cicloexila.

Em algumas modalidades do composto de fórmula I, z é 1, e X é O, C(=O), ou S(O)2.

Em outras modalidades do composto de fórmula I, X é NR', em que R6 é aquele definido na reivindicação 1. Dentro destas modalidades, em alguns exemplos R' é hidrogênio, -S(O)2CH3, ou -CH2C(O)NH2.

Deve ser apreciado que combinações dos diferentes grupos descritos aqui podem formar outras modalidades. Desta maneira, uma variedade de diferentes compostos é incorporada dentro da presente invenção. Por exemplo, em uma modalidade, X é CR'R5, onde R' e R5 são aqueles definidos aqui. Dentro desta modalidade, em alguns exemplos R5 é hidrogê- nio ou metila. Ainda em outros exemplos dentro desta modalidade, z é 1, e R' é -NR'-SO,-R'°, onde R' e R'° são aqueles definidos aqui Dentro destes exemplos, em alguns casos R7 é hidrogênio ou metila, e R10 é metila, etila, ou -N(CH3)2. Ainda em outros exemplos dentro desta modalidade, z é 1, e R4 é hidrogênio, alquila inferior, ciano, -(CH2)nOR7, ou -(CH2)nNR8R9, ou R4 e R5 juntos formam alquileno dióxi, onde n, R7, R8, e R9 são aqueles definidos aqui. Dentro destes exemplos, em alguns casos R4 é -(CH2)nOR7, n é 0 ou 1, e R7 é hidrogênio ou metila. Em outros casos dentro destes e- 5 xemplos, R4 é -(CH2)nNR8R9, onde n, R8, e R9 são aqueles definidos aqui.

Dentro destes casos, alguns dos compostos particulares incluem aqueles onde n é 0 e R8 é hidrogênio, e R9 é hidrogênio, pirimidin-2-ila, ou piridin-2- ila. Outros compostos particulares dentro destes casos incluem aqueles onde n é 0 e R8 e R9 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são 10 conectados para formar 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ila. Ainda em outros casos, R4 é hidrogênio, metila, etila, ou ciano. Em alguns exemplos dentro desta modalidade, R4 e R5 juntos formam etileno dióxi.

Ainda em outras modalidades, compostos de fórmula I incluem aqueles onde z é 1, e R4 é -(CH2)n-NR8-C(O)-R11, onde n, R8, e R11 são 15 aqueles definidos aqui. Dentro destas modalidades, em alguns exemplos n é 0, R8 é hidrogênio ou metila, e R11 é metila, etila, metoximetila, hidroximetila, (morfolin-4-il)metila, ou (4-metil-piperazin-1-il)metila.

Ainda mais em outras modalidades, z é 1, e R4 é -(CH2)n-C(O)- NR8R9, em que n, R8, e R9 são aqueles definidos aqui. Dentro destas moda- 20 lidades, em alguns exemplos n é 0, e R8 e R9 juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são conectados para formar morfolin-4-ila, pirrolidin- 1-ila, ou 4-metil-piperazin-1-ila. Ainda em outros exemplos n é 0, e R8 é hidrogênio ou metila, e R9 é (2-amino-2-metil)propila, (2-hidróxi)etila, tetraidro- piran-4-ila, ciclopropila, ou etila.

Em outras modalidades, z é 1, e R4 é -(CH2)n-C(O)-OR7, em que n e R7 são aqueles definidos aqui. Dentro destas modalidades, em al-guns exemplos n é 0 e R7 é hidrogênio ou metila.

Ainda em outras modalidades, R4 e R5 são hidrogênio, z é 0, y é 1, e Y é hidróxi na posição 3 da porção de anel de ciclopentila.

Ainda mais em outras modalidades, R4 e R5 são hidrogênio, z é 1, y é 1, e Y é hidróxi, hidroximetila, ou grupo -CO2CH2CH3 na posição 2 da porção de anel de cicloexila.

Em algumas modalidades do composto de fórmula I, z é 1, e X é O, C(=O), ou S(O)2.

Em outras modalidades do composto de fórmula I, X é NR6, em que R6 é aquele definido na reivindicação 1. Dentro destas modalidades, em alguns exemplos R6 é hidrogênio, -S(O)2CH3, ou -CH2C(O)NH2.

Ainda em outras modalidades, compostos de fórmula I são da fórmula IA:

ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, onde X, R1, R2, R3 , X, Y, m, y, e z são aqueles definidos aqui.

Compostos representativos da invenção são mostrados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1. Composto representativo de fórmula I.

Síntese

Compostos da presente invenção pode ser preparados por uma variedade de métodos descritos nos exemplos ilustrativos mostrados na seção de exemplos abaixo. Os materiais de partida e reagentes utilizados na 5 preparação destes compostos geralmente são disponibilizados por fornecedores comerciais, tais como Aldrich Chemical Co., ou são preparados por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica seguindo os procedi-mentos mencionados nas referências tais como Fieser and Fieser’s Reagents tor Organic Synthesis; Wiley & Sons: Nova Iorque, 1991, Volumes 1 a Rodd's Chemist/y of Carbon Compounds, Elsevier Science Publishers, 1989, Volumes 1 a 5 e Suplementares; e Organic Reactions, Wiley & Sons: Nova lorque, 1991, Volumes 1 a 40. Os seguintes esquemas de reação sintéticos são meramente ilustrativos de alguns métodos pelos quais os compostos da presente invenção podem ser sintetizados, e várias modificações nestes esquemas de reação sintéticos podem ser feitas e serão sugeridas por alguém versado na técnica tendo referido à descrição contida neste pedido.

Os materiais de partida e os intermediários dos esquemas de reação sintéticos podem ser isolados e purificados se desejado, utilizando técnicas convencionais, incluindo porém não limitadas a, filtração, destila- ção, cristalização, cromatografia, e os similares. Tais materiais podem ser caracterizados utilizando métodos convencionais, incluindo constantes físicas e dados espectrais.

A menos que especificado ao contrário, as reações descritas aqui preferivelmente são conduzidas sob atmosfera inerte, em pressão atmosférica, em uma faixa de temperatura de reação de cerca de -78°C a cerca de 230°C, e mais preferivelmente e convenientemente em temperatura Iocal (ou ambiente), por exemplo, cerca de 20°C.

No esquema I, R,, R e R3 e z são como definidos acima, Y é Cl ou SMe, e Z é MeSO2 ou Cl. Na Etapa A, uma 4-cloropirimidina substituída passa por uma reação de SnAr com um 1 /7-benzotriazol varialmente substituído na presença de uma base tal como hidreto de sódio e em um solvente aprótico polar tal como A/,A/-dimetilformamida em uma temperatura variando 5 entre 0eC e cerca de RT.

Na etapa B o grupo tiometila Y é convertido em um grupo de partida por oxidação com ácido 3-cloroperoxibenzóico em solventes apróti- cos tais como clorofórmio, ou por clorinação com A/-clorossucinimida.

Na Etapa C, o grupo de partida Y ou Z (Cl ou MeSO2) é removi- 10 do por uma amina primária a termicamente, por aquecimento da mistura em um solvente aprótico polar tal como 1-metil-2-pirrolidinona em uma temperatura variando entre cerca de 100sC e cerca de 130sC ou por tratamento com uma base tal como trietilamina em uma temperatura variando entre TA e 60eC em um solvente aprótico polar tal como tetra-hidrofurano. Aminas a 15 podem compreender, por exemplo: cicloalquilaminas tais como cicloexilami- nas e ciclopentilaminas varialmente substituídas; alquil aminas tais como isobutilamina; hidroxialquilaminas tais como 4-amino-1 -butanol; aminas hete- rocíclicas tais como 4-amino-tetra-hidropirano, 4-amino-1-BOC-piperidina. Numerosas alquila, cicloalquila e aminas heterocíclicas a varialmente substi- 20 tuídas são comercialmente disponíveis ou são facilmente preparadas por técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

Os produtos podem em seguida ser purificados, por exemplo, por extração, cristalização, HPLC preparativa, cromatografia instantânea, cromatografia de camada fina, e os similares.

Um composto de fórmula genérica (iv) pode passar pelas transformações mostradas no Esquema II para fornecer os compostos que são o objetivo desta invenção.

No esquema II, R3, Rn, Rθe R9são como definidos acima. Ra é CORn, CH2CONR8R9, SO2Rn, OU SO2NR8R9. Rb θ alquila, heteroalquila, (heterocíclica)alquila. Rc e Rd são independentemente H, alquila, cicloalquila, 5 alcoxialquila, hidroxialquila, ou heterocíclica. Re e Rf são independentemente H, alquila, cicloalquila ou heterocíclica. Z é heterocíclica. Rg é COR11, SO2R11OU SO2NR5R8. Rh é alquila ou arila.

Etapa F: b ou ç, NMP, aquecimento ou d, NMP, MW ou NaBH4, e, MeOH.

Etapa G: NaH, f, NP.F.

Etapa H: NaOH, THF.

Etapa I: a, BOP, DIPEA, THF.

Etapa J: LAH, THF.

Etapa N: 1. IBX, DMSO; 2. h, NaBH(OAc)3, AcOH, DCE.

Etapa K: PPh3, DIAD, i, PhMe.

Etapa L: j, N2H4, EtOH, aquecimento.

Etapa M: 1. HCI, THF; 2. k, THF.

Quando Rx for NH2 um composto de fórmula genérica (iv) poderá passar por uma acilação ou uma reação de sulfonilação, como descrito na etapa F, utilizando por exemplo um agente de acilação b tal como anidrido acético em um solvente aprótico polar tal como 1-metil-2-pirrolidinona em uma temperatura variando entre cerca de TA e 70eC; sob as mesmas condi- 5 ções (iv) pode ser sulfonilado utilizando, por exemplo, anidrido metanossul- fônico como agente de sulfonilação ç. Alternativamente (iv) pode passar por uma reação de arilação utilizando um heteroarilhaleto d, por exemplo, 2- fluoropiridina sob condições de micro-ondas em um solvente aprótico polar tal como 1-metil-2-pirrolidinona em temperatura elevada.

Os agentes de acilação e sulfonilação b e ç podem compreender por exemplo anidridos de alquila, anidridos cíclicos, cloretos de acila e ben- zoíla, anidridos de alquilsulfonila e cloretos de alquilsulfonila e sulfonila de benzoíla.

Uma maneira alternativa de obter o produto de fórmula genérica 15 (v) é por uma reação de aminação redutiva, utilizando, por exemplo, boroi-dreto de sódio e um aldeído e tal como formaldeído em um solvente prótico polar tal como metanol e o produto pode subsequentemente ser acilado ou sulfonilado utilizando as mesmas condições como descrito acima. Numerosos aldeídos de alquila, cicloalquila e arila e são comercialmente disponíveis 20 ou são facilmente preparados por técnicas bem conhecidas por aqueles ver- • sados na técnica.

Na etapa G uma amina, amida ou sulfonamida de fórmula genérica (v) é alquilada utilizando uma base tal como hidreto de sódio e um agente de alquilação f tal como iodeto de metila em um solvente aprótico polar tal 25 como 1-metil-2-pirrolidinona. Agentes de alquilação f podem compreender haletos de alquila, heteroalquila e haletos de (heterocíclica)alquila.

Quando RxforCOOMe ou COOEt um éster de fórmula (iv) poderá ser hidrolisado no ácido carboxílico correspondente utilizando uma solução aquosa de uma base inorgânica tal como hidróxido de sódio em um sol- 30 vente aprótico polar tal como tetra-hidrofurano como descrito na etapa H.

Subsequentemente um ácido carboxílico (vi) pode ser acoplado com uma amina primária ou secundária g na presença de um agente de acoplamento tal como BOP e uma base tal como diisopropiletílamina em um solvente a- prótico polar tal como tetra-hidrofurano como descrito na etapa I para fornecer uma amida de fórmula genérica (vii). Aminas g podem compreender por exemplo alquilaminas, alcoxialquilaminas, hidroxialquilaminas, cicloalquila- 5 minas e aminas heterocíclicas.

Quando Rx for COOEt ou COOMe um éster de fórmula (iv) pode ser reduzido no álcool correspondente por tratamento com hidreto de alumínio de lítio em um solvente aprótico polar tal como THF em temperaturas variando entre cerca de -78-C e cerca de TA como descrito na Etapa J. O 10 álcool de fórmula genérica (ix) pode ser oxidado no aldeído correspondente por tratamento com um agente de oxidação tal como ácido o-iodoxibenzóico em um solvente aprótico polar tal como DMSO. O aldeído obtido desta ma-neira pode subsequentemente passar por uma reação de aminação redutiva com uma amina primária ou secundária h tal como morfolina na presença de 15 triacetoxiboroidreto de sódio e ácido acético glacial em um solvente apoiar tal como 1,2-dicloroetano (etapa N). Aminas h podem compreender por exemplo alquilaminas, cicloalquilaminas e aminas heterocíclicas. Alternativamente o álcool (ix) pode passar por uma reação Mitsunobu com uma imida i tal como ftalimida na presença de trifenilfosfina e DIAD em um solvente a- 20 prótico apoiar tal como tolueno como descrito na etapa K. As iminas i podem compreender iminas cíclicas e heterocíclicas. Um composto de fórmula genérica (viii) quando Z for ftalimida poderá ser tratado com hidrazina em um solvente prótico polar tal como etanol em temperatura elevada para fornecer a amina primária correspondente que pode em seguida ser acilada ou sulfo- 25 nilada por tratamento com um agente de acilação ou sulfonilação tal como cloreto de acetila na presença de uma base tal como trietilamina como descrito na etapa L. Agentes de acilação e sulfonilação podem incluir cloretos de acila e arila, sulfonila e cloreto de benzenossulfonila que são comercialmente disponíveis ou facilmente preparados através de técnicas conhecidas por 30 aqueles versados na técnica.

Quando Rx for O(CH2)2O, um cetal (iv) poderá ser convertido na cetona correspondente por tratamento com uma solução aquosa de HCI em um solvente aprótico polar tal como tetra-hidrofurano em temperatura elevada; a cetona obtida desta maneira pode passar por uma reação de adição com um reagente Grignard k em um solvente aprótico polar tal como tetra- hidrofurano em temperatura baixa para fornecer o álcool terciário correspon- 5 dente como descrito na etapa M. Numerosos reagentes Grignard de alquila, cicloalquila e arila k são comercialmente disponíveis ou são facilmente preparados por técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica.

Os produtos podem em seguida ser purificados, por exemplo, por extração, cristalização, HPLC preparativa, cromatografia instantânea, 10 cromatografia de camada fina e os similares.

Utilidade

Os compostos desta invenção são moduladores de CDK e JNK e como tais são esperados ser eficazes no tratamento de uma ampla faixa de distúrbios mediados por CDK e JNK. Distúrbios mediados por JNK exem- 15 piares incluem, porém não estão limitados a, distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio metabólico, doença neurológica, e câncer. Consequentemente, compostos da invenção podem ser utilizados para tratar um ou mais de tais distúrbios. Em algumas modalidades, compostos da invenção podem ser utilizados para tratar um distúrbio mediado por JNK tal como artrite reumatóide, asma, diabetes tipo II, doença de Alzheimer, doença de Parkinson ou acidente vascular cerebral. Distúrbios mediados por CDK exemplares incluem, sem limitação, inflamação (por exemplo, hiperplasia de próstata benigna, adenomatose familiar, polipose, neurofibromatose, ateros- clerose, fibrose pulmonar, artrite, psoríase, doença do intestino inflamatória, 25 infecções de rejeições a transplante), infecções virais (incluindo, sem limitação, herpes vírus, poxvirus, Epstein-Barr vírus), doença autoimune (por exemplo, lúpus, artrite reumatóide, psoríase, doença do intestino inflamatória), distúrbios neurodegenerativos (incluindo, sem limitação, doença de Alzheimer), e doenças neurodegenerativas (por exemplo, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, atrofia muscular espinhal, e degeneração cerebral).

Administração e Composição Farmacêutica

A invenção inclui composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um composto da presente invenção, ou um isômero individual, mistura racêmica ou não racêmica de isômeros ou um sal farmaceuticamen- te aceitável ou solvato deste, juntamente com pelo menos um veículo farma- 5 ceuticamente aceitável, e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos e/ou profiláticos.

Em geral, os compostos da invenção serão administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz por qualquer um dos modos aceitos de administração para agentes que servem para utilidades similares. Faixas 10 de dosagem adequadas são tipicamente 1-500 mg diariamente, preferivelmente 1-100 mg diariamente, e mais preferivelmente 1-30 mg diariamente, dependendo de numerosos fatores tais como a severidade da doença a ser tratada, a idade e saúde relativa do indivíduo, a potência do composto utilizado, a rotina e forma de administração, a indicação com respeito a que a 15 administração é direcionada, e as preferências e experiência do prático médico envolvido. Alguém versado na técnica de tratar tais doenças será capaz, sem experimentação indevida e em confiança no conhecimento pessoal e na descrição deste Pedido, de verificar a quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos da presente invenção para uma determinada doença.

Compostos da invenção podem ser administrados como formulações farmacêuticas incluindo aquelas adequadas para administração oral (incluindo bucal e sublingual), retal, nasal, tópica, pulmonar, vaginal, ou parenteral (incluindo intramuscular, intra-arterial, intratecal, subcutânea e intravenosa) ou em uma forma adequada para administração por inalação ou 25 insuflação. A maneira preferida de administração é geralmente oral utilizando um regime de dosagem diário conveniente que pode ser ajustado de acordo com o grau de aflição.

Um composto ou compostos da invenção, juntamente com um ou mais-adjuvantes, veículos, ou diluentes convencionais, podem ser colo- 30 cados na forma de composições farmacêuticas e dosagens unitárias. As composições farmacêuticas e formas de dosagem unitária podem ser compreendidas de ingredientes convencionais em proporções convencionais, com ou sem compostos ativos adicionais ou princípios, e as formas de do-sagem unitária podem conter qualquer quantidade eficaz adequada do ingrediente ativo comensurada com a faixa de dosagem diária pretendida a ser empregada, As composições farmacêuticas podem ser empregadas co- 5 mo sólidos, tais como comprimidos ou cápsulas carregadas, semissólidos, pós, formulações de liberação sustentada, ou líquidos tais como soluções, suspensões, emulsões, elixires, ou cápsulas carregadas para uso oral; ou na forma de supositórios para administração retal ou vaginal; ou na forma de soluções injetáveis estéreis para uso parenteral. Formulações contendo cer- 10 ca de um (1) mg de ingrediente ativo ou, mais amplamente, cerca de 0,01 a cerca de um cento (100) mg, por comprimido, são consequentemente formas de dosagem unitária representativas adequadas.

Os compostos da invenção podem ser formulados em uma ampla variedade de formas de dosagem de administração oral. As composições 15 farmacêuticas e formas de dosagem podem compreender um composto ou compostos da presente invenção ou sais farmaceuticamente aceitáveis destes como o componente ativo. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser sólidos ou líquidos. Preparações de forma sólida incluem pós, comprimidos, pílulas, cápsulas, selos, supositórios, e grânulos dispersíveis.

Um veículo sólido pode ser uma ou mais substâncias que podem também agir como diluentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, aglutinantes, preservativos, agentes desintegrantes de comprimido, ou um material de encapsulação. Em pós, o veículo geralmente é um sólido bem dividido que é uma mistura com o componente ativo 25 bem dividido. Em comprimidos, o componente ativo geralmente é misturado com o veículo tendo a capacidade de ligação necessária em proporções adequadas e compactado na forma e tamanho desejado. Os pós e comprimidos preferivelmente contêm de cerca de um (1) a cerca de setenta (70) porcento do composto ativo. Veículos adequados incluem porém não estão limi- 30 tados a carbonato de magnésio, éstearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, carboxime- tilcelulose de sódio, uma cera de fusão baixa, manteiga de cacau, e os simi- lares. 0 termo "preparação"destina-se a incluir a formulação do composto * ativo com material de encapsulação como veículo, fornecendo uma cápsula » em que o componente ativo, com ou sem veículos, é circundado por um veículo, que está em associação com ele. Similarmente, selos e pastilhas são 5 incluídos. Comprimidos, pós, cápsulas, pílulas, selos, e pastilhas podem ser como formas sólidas adequadas para administração oral.

Outras formas adequadas para administração oral incluem pre-parações de forma líquida incluindo emulsões, xaropes, elixires, soluções aquosas, suspensões aquosas, ou preparações de forma sólida que são pre- 10 tendidas ser convertidas concisamente antes do uso em preparações de forma líquida. Emulsões podem ser preparadas em soluções, por exemplo, i em soluções de propileno glicol aquosas ou podem conter agentes emulsifi- cantes, por exemplo, tais como lecitina, mono-oleato de sorbitan, ou acácia. Soluções aquosas podem ser preparadas por dissolução do componente 15 ativo em água e adição de agentes corantes, aromatizantes, estabilizantes, e espessantes adequados. Suspensões aquosas podem ser preparadas por dispersão do componente ativo bem dividido em água com material viscoso, tais como gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, carboximetil- celulose de sódio, e outros agentes de suspensão bem conhecidos. Prepa- 20 rações de forma sólida incluem soluções, suspensões, e emulsões, e podem conter, além do componente ativo, agentes corantes, aromatizantes, estabi- lizantes, tampões, adoçantes artificiais e naturais, dispersantes, espessantes, solubilizantes, e os similares.

Os compostos da invenção podem ser formulados para adminis- 25 tração parenteral (por exemplo, por injeção, por exemplo injeção em bolo ou infusão contínua) e podem estar presentes em forma de dose única em ampolas, seringas pré-carregadas, infusão de volume pequeno ou em recipientes de múltiplas doses com um preservativo adicionado. As composições podem tomartais formas como suspensões, soluções, ou emulsões em veí- 30 culos oleosos ou aquosos, por exemplo soluções em polietileno glicol aquoso. Exemplos de veículos oleosos ou não-aquosos, diluentes, solventes ou veículos incluem propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais (por exem- plo, óleo de oliva), e ésteres orgânicos injetáveis (por exemplo, oleato de etila), e podem conter agentes formulatórios tais como preservantes, umec- tantes, emulsificantes ou de suspensão, agentes estabilizantes e/ou disper- santes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser em forma de pó, obti- 5 do por isolamento asséptico de sólido estéril ou por liofilização de solução para constituição antes do uso com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirógeno, estéril.

Os compostos da invenção podem ser formulados para adminis-tração tópica à epiderme como unguentos, cremes ou loções, ou como um emplastro transdérmico. Unguentos e cremes podem, por exemplo, ser for-mulados com uma base aquosa ou oleosa com a adição de agentes espes- santes e/ou gelificantes adequados. Loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa e em geral também conterão um ou mais agentes emulsificantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensão, agentes espessantes, ou agentes corantes. Formulações ade-quadas para administração tópica na boca incluem pastilhas compreendendo agentes ativos em uma base aromatizada, habitualmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia; e antissépti-cos bucais compreendendo o ingrediente ativo em um veículo líquido ade-quado.

Os compostos da invenção podem ser formulados para adminis-tração como supositórios. Uma cera de fusão baixa, tal como uma mistura de glicerídeos de ácido graxo ou manteiga de cacau é primeiro fundida e o componente ativo é disperso homogeneamente, por exemplo, por agitação. A mistura homogênea fundida é em seguida vertida em moldes de tamanho conveniente, deixada resfriar, e solidificar.

Os compostos da invenção podem ser formulados para adminis-tração vaginal. Pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou s- 30 prays contendo além do ingrediente ativo tais veículos como são conhecidos na técnica ser apropriados.

Os compostos objetos podem ser formulados para administração nasal. As soluções ou suspensões são aplicadas diretamente à cavidade ü nasal por métodos convencionais, por exemplo, com um conta-gotas, pipeta « ou spray. As formulações podem ser fornecidas em uma forma de múltiplas doses ou única. No último caso de um conta-gotas ou pipeta, isto pode ser 5 obtido pelo paciente administrando um volume predeterminado, apropriado da solução ou suspensão. No caso de um spray, isto pode ser obtido por exemplo por meio de uma bomba de spray atomizante de medição.

Os compostos da invenção podem ser formulados para administração aerosol, particularmente ao trato respiratório e incluindo administrate! ção intranasal. O composto geralmente terá um tamanho de partícula pequeno por exemplo da ordem de cinco (5) microns ou menos. Um tal tama- •snho de partícula pode ser obtido por métodos conhecidos na técnica, por exemplo por micronização. O ingrediente ativo é fornecido em um pacote pressurizado com um propelente adequado tal como um clorofluorocarbono 15 - (CFC), por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, ou dicloro- tetrafluoroetano, ou dióxido de carbono ou outro gás adequado. O aerosol pode convenientemente também conter um tensoativo tal como lecitina. A dose de fármaco pode ser controlada por uma válvula medidora. Alternativamente os ingredientes ativos podem ser fornecidos na forma de um pó 20 seco, por exemplo uma mistura de pó do composto em uma base em pó adequada tal como láctose, amido, derivados de amido tais como hidroxipro- pilmetil celulose e polivinilpirrolidina (PVP). O veículo em pó formará um gel na cavidade nasal. A composição em pó pode estar presente em forma de dose única por exemplo em cápsulas ou cartuchos de por exemplo, gelatina 25 ou pacotes de empola dos quais o pó pode ser administrado por meio de um inalador.

Quando desejado, formulações podem ser preparadas com re-vestimentos entéricos adaptados para administração de liberação sustentada ou controlada do ingrediente ativo. Por exemplo, os compostos da pre- 30 sente invenção podem ser formulados em dispositivos de distribuição de fármaco transdérmica ou subcutânea. Estes sistemas de distribuição são vantajosos quando liberação sustentada do composto for necessária e quando concordância do paciente com um regime de tratamento for crucial. Compostos em sistemas de distribuição transdérmica são frequentemente ligados a um suporte sólido adesivo de pele. O composto de interesse pode também ser combinado com um relaçador de penetração, por exemplo, A- 5 zone (1-dodecilazacicloeptan-2-ona). Sistemas de distribuição de liberação sustentada são inseridos subcutaneamente na camada subdérmica por cirurgia ou injeção. Os implantes subdérmicos encapsulam o composto em uma membrana solúvel em lipídeo, por exemplo, borracha de silicone, ou um polímero biodegradável, por exemplo, ácido polilático.

As preparações farmacêuticas são preferivelmente em formas de dosagem unitária. Em tal forma, a preparação é subdividida em doses únicas contendo quantidades apropriadas do componente ativo. A forma de dosagem unitária pode ser uma preparação empacotada, o pacote contendo quantidades discretas de preparação, tais como comprimidos, cápsulas, e pós empacotados em frasconetes ou ampolas. Além disso, a forma de dosagem unitária pode ser uma cápsula, comprimido, selo, ou pastilha propriamente dita, ou pode ser o número apropriado de qualquer um destes em forma empacotada.

Outros veículos farmacêuticos adequados e suas formulações 20 são descritos em Flemington: The Science and Practice of Pharmacy1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19§ edição, Easton, Pensilvânia. Formulações farmacêuticas representativas contendo um composto da presente invenção são descritas abaixo.

Os compostos desta invenção podem ser utilizados em combi- 25 nação (administrados em combinação ou sequencialmente) com tratamentos anticâncer conhecidos tais como terapia de radiação ou com agentes citostá- ticos ou citotóxicos, tais como por exemplo, porém não limitados a, agentes interativos de DNA, tais como cisplatina ou doxorubicina; inibidores de topoisomerase II tais como etoposídeo: inibidores de topoisomerase I tais como CPT-11 ou topotecan; agentes de interação de tubulina, tais como paclitaxel, docetaxel ou epotilonas; agentes hormonais tais como tamoxifeno: inibidores de timidilaato sintase, tais como 5-fluorouracila; e antimetabolitos tais como metotrexato. Compostos de fórmula I podem também ser úteis em combinação com moduladores de transativação de p53.

Se formulados como uma dose fixa, os produtos de combinação descritos acima incluem os compostos desta invenção dentro da faixa de 5 dosagem descrita acima e o outro agente farmaceuticamente ativo ou tratamento dentro de sua faixa de dose aprovada. Por exemplo, um inibidor de cdk1 precoce olomucina foi descoberto agir sinergisticamente com agentes citotóxicos bem conhecidos em indução de apoptose. (J. Cell Sei. (1995) 108:2897-904). Compostos de fórmula I podem também ser administrados 10 sequencialmente com agentes citotóxicos ou anticâncer conhecidos quando administração concomitante ou uma combinação for inapropriada. Esta invenção não é limitada na sequência de administração: compostos de fórmula I podem ser administrados antes de ou após a administração do agente anticâncer ou citotóxico conhecido. Por exemplo, a atividade citotóxica do inibi- 15 dor de cdk flavopiridol é afetada pela sequência de administração com agentes anticâncer. (Cancer Res(1997) 57:3375).

As propriedades farmacológicas dos compostos desta invenção podem ser confirmadas por vários ensaios farmacológicos. Os ensaios farmacológicos exemplificados que seguem foram realizados com os compos- 20 tos de acordo com a invenção e seus sais. Os compostos da invenção exibiram atividade de cdk4/ciclina D com valores de IC50 e valores de Ki de menos do que 1,0 μM. Adicionalmente, a potência antiproliferativa de alguns compostos da invenção foi testada na linhagem de célula de tumor de cólon humano HCT116 com valores de IC90'relatados de um ensaio de MTT de 25 menos do que 30 pM, preferivelmente menos do que 5 pM.

Objetivos adicionais, vantagens, e novas características desta invenção tornar-se-ão evidentes para aqueles versados na técnica sob exame dos seguintes exemplos desta, que não são pretendidos ser limitantes.

Exemplos

Lista de Abreviações BOP Benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamno)fosfônio hexafluorofosfato 1,2-Dicloroetano Diclorometano/Cloreto de metileno Di-isopropiletilamina N,N-dimetilformamida Azodicarboxilato de diisopropila Sulfoxide de dimetila Acetate de etila Hidreto de alumínio de litio Ácido o-lodoxibenzóico Ácido 3-Cloroperoxibenzóico Metanol Cloreto de metanossulfonila Micro-ondas N-Clorossucinimida 1 -Metil-2-pirrolidinona Temperatura ambiente TriacetOxiboroidreto de sódio Trietilamina THF Tetra-hidrofurano TLC Cromatografia de camada fina

Exemplo 1: Síntese de 2,4,5-tricloro-pirimidina A síntese de 2,4,5-tricloro-pirimidina foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema A.

Esquema A

5-Clorouracila (4,5 g, 30,82 mmols) foi dissolvido em oxicloreto fosforoso (100 ml_) e pentacloreto fosforoso (19,2 g, 92,46 mmols) foi adicio-nado. A mistura reacional foi aquecida ao refluxo durante a noite; ela foi em seguida resfriada para TA e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida.

O resíduo foi resfriado para 0 9C e flocos de gelo foram cuidadosamente adi- cionados. A mistura resultante foi agitada durante 10 minutos; ela foi em se-guida dividida entre água e DCM. A fase orgânica foi separada e lavada 3 vezes com água. As camadas aquosas foram combinadas e extraídas duas vezes com DCM. Os extratos orgânicos combinados foram secados sobre 5 Na2SO4, filtrados e evaporados sob pressão reduzida para fornecer 6 g (95% de rendimento) de 2,4,5-tricloro-pirimidina como um óleo amarelo sem outras purificações.

Exemplo 2: Síntese de 1-(2,5-dicloro-pirimidin-4-il)-1 /-/-benzotriazol A síntese de 1-(2,5-dicloro-pirimidin-4-il)-1H-benzotriazol foi rea- 10 lizada de acordo com o processo mostrado no esquema B.

Esquema B

Uma solução de benzotriazol (2,14 g, 18,03 mmols) em DMF (10 mL) foi lentamente adicionada a 09C a uma solução de NaH (60% em óleo mineral, 0,850 g, 21,3 mmols) em DMF (20 mL) sob atmosfera de nitrogênio.

A mistura reacional foi agitada a 0sC durante 15 minutos; uma solução de 2,4,5-tricloropirimidina (3 g, 16,39 mmols) em DMF (20 mL) foi em seguida lentamente adicionada a 09C. A mistura reacional foi deixada alcançar a RT ao mesmo tempo que agitando durante a noite. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida; o resíduo foi absorvido com EtOAc e lavado 3X com água. As camadas aquosas foram combinadas e extraídas 3 vezes com E- tOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secados sobre Na2SO4, filtrados e evaporados sob pressão reduzida para fornecer um óleo bruto. Este material foi purificado por meio de cromatografia instantânea (heptano/ EtOAc, 8/2) para fornecer 1,5 g (34% de rendimento) de 1 -(2,5-dicloro-pirimidin- 4-il)-1 H-benzotriazol.

Os seguintes compostos foram similarmente preparados utili-zando a cloropirimidina apropriada:1 -(2-C loro-pirim id in-4-il)-1 H-benzotriazol; 1 -(2-Cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-1 /7-benzotriazol; e 1 -(2-Cloro-5-metil-pirimidin-4-il)-1 /7-benzotriazol.

Exemplo 3: Síntese de 1-(2-metanossulfonil-pirimidin-4-il)-1/7-benzotriazol

A síntese de 1-(2-metanossulfonil-pirimidin-4-il)-1 /7-benzotriazol foi realizada de acordo com o processo mostrado no Esquema C.

Esquema C

Etapa 1: síntese de 1-(2-metilsulfanil-pirimidin-4-il)-1/7- benzotriazol

Um frasco de base redonda de 1 L foi carregado com dispersão 10 de hidreto de sódio (10,0 g, 250 mmols, 60% em óleo mineral) e 200 mL de DMF, e a suspensão resultante resfriada com um banho gelado. Benzotriazol (18,02 g, 151 mmols) foi adicionado porção a porção durante um período de 10-12 minuto A mistura reacional foi agitada durante 10 min para permitir a evolução de gás baixar; o banho gelado foi em seguida removido e 4-cloro-2-metiltiopirimidina (24,07 g, 150 mmols) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada em RT durante 15 minutos, em seguida colocada em um banho de óleo a 90eC durante 1,5 hora. O banho de aquecimento foi desligado e a mistura reacional foi deixada resfriar lentamente com agitação durante a noi-te. A mistura reacional foi em seguida vertida em 500 mL de água e agitada durante 20 min, e em seguida filtrada. Os sólidos coletados foram lavados com 3 porções de água e 3 porções de uma mistura de hexanos/EtOAc (10:1 a 5:1), em seguida secados para fornecer l-(2-metilsulfanil-pirimidin-4- il)-1 H-benzotriazol como um sólido esbranquiçado (27,05 g, 74% de rendimento), mp = 180,5-181,7 SC; MS = 244 (M+H)+.

Etapa 2: síntese de 1-(2-metanossulfonil-pirimidin-4-il)-1 H-benzotriazol 1-(2-Metilsulfanil-pirimidin-4-il)-1 H-benzotriazol (27,05 g, 111 mmols) foi dissolvido/suspenso em 600 mL de CHCI3em um frasco de base redonda de 2 L. A mistura foi resfriada com um banho gelado e m-CPBA (58,03 g, 259 mmols, ca. 77%) foi lentamente adicionado porção a porção, ao mesmo tempo que mantendo a temperatura de reação abaixo de 15 2C. A mistura reacional foi lentamente aquecida para RT e agitada durante 16 horas, em seguida refluxada durante 1 hora. Ela foi resfriada e tratada com ti- 5 ossulfato de sódio aquoso; a camada orgânica foi separada e lavada com 3 porções de bicarbonato de sódio aquoso. Ela foi em seguida secada sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida até a formação de uma suspensão, que foi filtrada e secada para fornecer o 1-(2- metanossulfonil-pirimidin-4-il)-1 /7-benzotriazol como um sólido branco (20,78 10 g, 68% de rendimento), mp = 201,8-202,5 SC; MS = 276 (M+H)+.

Exemplo 4: Síntese de A/-Pirimidin-2-il-cicloexano-frans-1,4-diamina » A síntese de A/-Pirimidin-2-il-cicloexano-frans-1,4-diamina foirealizada de acordo com o processo mostrado no Esquema D.

Esquema D

A uma solução a 902C de frans-1,4-diaminocicloexano (10,10 g, 88 mmols) em dioxano/MeOH (40 mU40 mL) foi lentamente adicionada uma solução de 2-cloropirimidina (3,14 g, 45 mmols) em dioxano/MeOH (40 mL/40 mL). A mistura reacional foi refluxada durante a noite, em seguida resfriada e a suspensão que se formou foi filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para formar outra suspensão que foi filtrada novamente. Os líquidos coletados foram divididos entre EtOAc e NaHCOs aquoso. O produto permaneceu na camada aquosa, e foi extraído com 3 porções de CH2CI2, secado sobre Na2SO4 e filtrado; o solvente foi evaporado sob pres-são reduzida. O resíduo bruto foi recristalizado de hexanos/CH2Cl2 (1/1) θ secado para fornecer /V-pirimidin-2-il-cicloexano-frans-1,4-diamina como um sólido esbranquiçado (1,20 g, 14% de rendimento), mp = 126,9-128,4 SC; MS = 193 (M+H)+.

Exemplo 5: Síntese de aminas A síntese de várias aminas foi cesso mostrado no Esquema E. realizada de acordo com o pro-processo mostrado no Esquema E.

Esquema E

Etapa 1: SÍntese de éster (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-propílico de ácido metanossulfônico 2-(S)-Boc-amino-propanol (10 g, 57,1 mmols, 1,00 equivalente) foi dissolvido em DCM (200 mL) sob atmosfera de nitrogênio; e trietilamina (7,49 g, 10,32 mL, 74,2 mmols, 1,30 eq) foi adicionada em RT. A mistura reacional foi resfriada para 0 SC e cloreto de mesila (7,39 g, 4,99 mL, 64,5 mmol, 1,13 eq) foi adicionado sob atmosfera de nitrogênio. A mistura resultante foi agitada a 0 9C durante 3 horas, em seguida lavada 3 vezes com H2O (100 mL), as fases aquosas foram combinadas, e extraídas 3 vezes com DCM (50 mL). Os extratos orgânicos foram combinados, secados sobre Na2SO4, filtrados e evaporados para fornecer éster (S)-2-terc- butoxicarbonilamino-propílico de ácido metanossulfônico como um sólido branco (14,17 g, 98% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 4,56 - 4,70 (1 H, m), 4,17 - 4,27 (1 H, m), 4,10 - 4,17 (1 H, m), 3,89 - 4,02 (1 H, m), 2,97-3,05 (3 H, m), 1,38 - 1,47 (9 H, m), 1,22 (3 H, d, J = 6,85 Hz).

Da mesma maneira foi preparado éster (R)-2-terc-butoxicarbonil- amino-propílico de ácido metanossulfônico (sólido branco) utilizando o 2-(fí)- boc-2-amino-propanol como material de partida (rendimento = 14,09 g, 97% de rendimento); 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 4,55 - 4,67 (1 H, m), 4,17 - 4,27 (1 H, m), 4,11 - 4,17 (1 H, m), 3,90 - 4,02 (1 H, m), 3,02 (3 H, s), 1,43 (9 H, s), 1,22 (3 H, d, J = 6,85 Hz).

Etapa 2: Síntese de amina A

Éster (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-propílico de ácido metanos-sulfônico (1,00 g, 3,94 mmol, 1 eq) foi dissolvido em DMF (16 mL), sob at-mosfera de nitrogênio, K2CO3 (1,09 g, 7,89 mmols, 2 eq) e a amina apropriada da fórmula RR’NH (3,95 mmols, 1 equiv,) foram em seguida adicionados em RT. A mistura reacional foi agitada a 90 SC durante 1 hora. A mistura re-Síntese de ester (S)-2-terc-butoxicarbonilamino- sultante foi concentrada para fornecer um sólido bruto que foi dissolvido com ' uma mistura de iPrOH/CHCh de 1:1, lavado duas vezes com H2O (10 mL).

As fases aquosas foram combinadas, extraídas 3 vezes com uma mistura deiPrOH/CHCI3 de 1:1 (20 mL). Os extratos orgânicos foram combinados, se- 5 cados sobre Na2SO4, filtrados e evaporados para fornecer a amina desejada bruta.

Reações similares foram realizadas com os derivados de mesil- tato de (S)- e (R)- boc amino, e as seguintes aminas para obter os produtos correspondentes: Sucinimida; 2-pirrolidinona; 5,5-dimetiloxazolidina-2,4- diona; 5-metil-1 H-tetrazol; 1,2,3-triazol; 1,2,4-triazol; carboxilato de metil-4- imidazol; e metil-1,2,3-triazol-3-carboxilato.

1H RMN’s das misturas brutas foram realizados. Estes derivados de boc amino foram utilizados na próxima etapa sem purificação.

Etapa 3: Síntese de amina B

O derivado de (S)-boc-amino A (3,5 mmols, 1 equivalent) foi dissolvido em uma solução de 4 N de HCI em 1,4-dioxano (5 mL). A mistura reacional foi agitada durante 18 horas em RT. A mistura reacional foi con-centrada sob pressão reduzida fornecendo um sólido bruto que foi utilizado sem outra purificação na próxima etapa.

Utilizando este procedimento as seguintes aminas foram preparadas: 3-((R)-2-Amino-propil)-5,5-dimetil-oxazolidina-2,4-diona; 1-((R)-2-Amino-propil)-pirrolidina-2,5-diona; (R)-1 -Metil-2-[1,2,3]triazol-2-il-etilamina; 25 (R)-1 -Metil-2-[1,2,4]triazol-1 -il-etilamina; 1-((S)-2-Amino-propil)-pirrolidina-2,5-diona; (S)-1 -Metil-2-[1,2,3]triazol-2-il-etilamina; (S)-1-Metil-2-[1,2,4]triazol-1-il-etilamina; e (R)-1 -Metil-2-(5-metil-tetrazol-1 -il)-etilaminá.

Exemplo 6: Síntese de (4-benzotriazol-1 -il-5-cloro-pirimidin-2-il)-ciclo-hexil- amina

A síntese de (4-benzotriazol-1-il-5-cloro-pirimidin-2-il)-ciclo-hexil- amina foi realizada de acordo com o processo mostrado no Esquema F.

Esquema F

Ciclo-hexilamina (0,21 mL, 1,88 mmol) foi adicionada porção a porção a uma solução de 1 -(2,5-dicloro-pirimidin-4-il)-1 H-benzotriazol (250 5 mg, 0,94 mmol) em THF (30 mL) em RT sob atmosfera de nitrogênio. A solução incolor resultante foi agitada em RT durante 4 horas. TEA (2,82 mmols) foi em seguida adicionado e a mistura reacional foi agitada em RT durante a noite. A mistura foi dividida entre água (50 mL) e EtOAc (50 mL). A camada orgânica foi separada, lavada duas vezes com água (50 mL) e uma 10 vez com salmoura (50 mL), em seguida secada sobre Na2SO4, filtrada e evaporada sob pressão reduzida para fornecer um sólido esbranquiçado. Este material bruto foi purificado por meio de cromatografia instantânea (tolue- no/EtOAc, 98/2) para fornecer 162 mg (53% de rendimento) de (4- benzotriazol-1-il-5-cloro-pirimidin-2-il)-ciclo-hexil-amina como um sólido es- 15 branquiçado. MS: 329,14 (M+1)+, 301,14 ((M+1)+-28).

Os seguintes compostos foram preparados utilizando o procedi-mento similar e os derivados de amina e pirimidina apropriados: trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarbonitrilo; MS: 320,15 (M+1)+, 292,18 ((M+1)+-28); (4-Benzotriazol-1 -il-5-metil-pi rim idin-2-il)-ciclo-hexil-am ina; MS:309,23 (M+1)+, 281,24 ((M+1 )+-28); (4-Benzotriazol-1-il-5-fluoro-pirimidin-2-il)-ciclo-hexil-amina; MS: 313,17 (M+1)+, 285,21 ((M+1)+-28); 3-[(R)-2-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-propil]-5,5- dimetil-oxazolidina-2,4-diona; MS: 381,94 (M+1), 353,98 ((M+1 )-28); 1 -[(R)-2-(4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-propil]- pirrolidina-2,5-diona; MS: 351,96 (M+1), 324,01 ((M+1)-28); (4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-il)-((R)-1 -metil-2-[1,2,3]triazol-2-il- etil)-amina; MS: 321,99 (M+1), 293,98 ((M+1 )-28); (4-Benzotriazol-1 -il-piri m id in-2-il)-((R)-1 -m etil-2-[ 1,2,4]triazol-1 -II- etil)-amina; MS: 321,99 (M+1), 293,98 ((M+1)-28); 1 -[(S)-2-(4-Benzotriazol-1 -il-pirim id in-2-ilam ino)-propil]- pirrolidina-2,5-diona; MS: 351,96 (M+1), 324,1 ((M+1)-28); (4-Benzotriazol-1 -il-pirim id in-2-il)-((S)-1 -m etil-2-[1,2,3]triazol-2-il- eti|)-amina; MS: 321,99 (M+1), 293,98 ((M+1 )-28); (4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-[(R)-1-metil-2-(5-metil-tetrazol- 1-il)-etil]-amina; MS: 337,16 (M+1)+, 309,13 ((M+1)+-28); e(4-Benzotriazol-1 -i l-pi rim idin-2-i l)-((S)-1 -m eti l-2-[ 1,2,4]triazol-1 -il- etil)-amina; MS: 322,17 (M+1), 294,15 ((M+1)-28).

Exemplo 7: Síntese de frans-4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexanol

A síntese de frans-4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexanol foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema G.

Esquema G

A uma solução benzotriazol (1,59 g, 6 mmols) aminocicloexano (3,11 g, 27 mmols) e a mistura resultante foi agitada a 120 -C durante 2 horas. Ela foi em seguida resfriada, vertida em 100 mL de água, agitada e deixada descansar durante a noite. A suspensão resultante foi filtrada, os sólidos coletados foram lavados com água e dissolvidos com CH2CI2; o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo sólido formado foi absorvido com EtOAc, filtrado e secado para fornecer trans-4-(4- benzotriazol-1-il-pírimidin-2-ilamino)-cicloexanol como um sólido branco (910 mg, 51 % de rendimento), mp = 224,8-228,1 -C; MS = 311 (M+H)+.

Os seguintes compostos foram preparados utilizando um proce-dimento similar e as aminas apropriadas: c/s-4-(4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanol (sólido branco); mp = 220,0-221,0 QC; MS = 311 (M+H)+; » trans-2-(4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanol (sóli do cristalino branco); mp = 166,9-169,3 eC; MS = 311 (M+H)+; 5 (1R, 3F?)-3-(4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-ciclopentanol (sólido branco); mp = 194,5-196,5 SC; MS = 297 (M+H)+; (1S, 3S/3-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclopentanol (sólido branco); mp = 194,1-195,9 eC; MS = 297 (M+H)+; (4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-(4-etil-ciclo-hexil)-amina (sólido 10 branco); mp = 191,2-191,7 SC; MS = 323 (M+H)+; (4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-piperidin-4-il-amina (sólido , branco, obtido da desproteção de carbamato de terc-butila padrão de éster terc-butílico de ácido 4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-piperidina-1- carboxílico; que foi obtido utilizando 4-amino-1-piperidinacarboxilato de terc- 15 butila); mp = 230,1-233,9 SC; MS = 296 (M+H)+; (4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-(4-metil-ciclo-hexil)-amina (sólido branco); mp = 192,5-196,0 SC; MS = 309 (M+H)+; (4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-(trans-4-metóxi-ciclo-hexil)- amina (sólido branco) (4-metóxi-ciclo-hexilamina foi obtido de oxima de 420 metóxi-cicloexanona como descrito em J. Org. Chem. (1985) 50:1160, que foi obtido de 4-metóxi-cicloexanona como descrito em J. Med. Chem. (1977) 20:289, que foi obtido de 4-metóxi-cicloexanol como descrito em J. Med. à Chem. (1989) 32:355); mp = 184,0-186,9 2C; MS = 325 (M+H)+;

R-(4-Benzotriazoi-1-il-pirimidin-2-il)-N'-pirimidin-2-il-cicloexano- trans-l,4-diamina (sólido branco) (A/-Pirimidin-2-il-cicloexano-trans-1,4-diamina foi preparado como descrito na Preparação 4); mp = 286,0-286,4 SC; MS = 388 (M+H)+;

Sal de sulfonato de bis-metano de A/-(4-Benzotriazol-1-il- pirimidin-2-il)-N,-pirimidin-2-il-cicloexano-trans-1,4-diamina que foi preparado 30 adicionando um excesso de ácido metanossulfônico a uma solução de bis- metano de /V-(4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-il)-N'-pirimidin-2-il-cicloexano- trans-l,4-diamina (150 mg) em 100 mL de CH2CI2 e aproximadamente 20 mL de MeOH. A mistura resultante foi concentrada e recristalizada de CH2CI2/EtOAc. O sólido foi filtrado e secado para fornecer o sal de ácido me- tanossulfônico como um sólido branco (214 mg, 95% de rendimento); mp = 282,6-288,9 9C; MS = 388 (M+H)+.

Similarmente, sal de ácido metanossulfônico dos seguintes compostos foi preparado: (4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-(1,4-dioxa-espiro[4,5]dec-8-il)- amina (sólido branco); mp = 207,9-209,0 9C; MS = 353 (M+H)+; (4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-(tetra-hidro-piran-4-il)-amina (cristais de agulha fina brancos); mp = 202,0-202,4 9C; MS = 297 (M+H)+; e (4-Benzotriazol-1 -il-pi rim idin-2-il)-( 1,1 -dioxo-hexa-hidro-1 À6- tiopiran-4-il)-amina (pó branco); mp = 268,5-270,2 9C; MS = 345 (M+H)+.

Exemplo 8: Síntese de (4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-ciclo-hexil-amina Síntese de (4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-ciclo-hexil-amina foi realizada de acordo com o processo mostrado no Esquema H.

Esquema H

A uma solução de 1-(2-metilsulfanil-pirimidin-4-il)-1H- benzotriazol (376 mg, 1,5 mmol) em 4 mL de NMP foram adicionados N- clorossucinamida (250 mg, 1,9 mmol) e 0,5 mL de água. A mistura foi colo- 20 cada em um banho de óleo a 130 9C durante 5-10 minutos, ciclo-hexilamina (450 mg, 5 mmols) foi em seguida adicionada e a mistura reacional foi agitada em um banho de óleo a 130 9C durante 30 minutos. A mistura reacional resfriada foi dividida entre água (40 mL) e EtOAc (40 mL). A camada orgânica foi separada e lavada duas vezes com água (40 mL), em seguida secada 25 sobre Na2SC>4, filtrada e o solvente removido sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia instantânea e recristalizado de CH2CI2/EtOAc para fornecer (4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-ciclo-hexil- amina como um sólido cristalino de agulha curta branco (255 mg, 56% de rendimento), mp = 202,0-204,0 eC; MS = 295 (M+H)+.

Exemplo 9: Síntese de (1S, 2fí)-[2-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- ciclo-hexil]-metanol

Síntese de (1S, 2F?)-[2-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- 5 ciclo-hexii]-metanol foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema I.

Esquema I

Etapa 1: Síntese de éster etílico de ácido cis-(1S, 2R)-2-(4- benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico.

Hidrobrometo de éster etílico de ácido (1S, 2fí)-cis-2-Amino-1-cicloexanocarboxílico (0,41 g, 1,62 mmol) e trietilamina (0,30 mL, 2,16 mmol) foram adicionados a uma solução de 1-(2-metanossulfonil-pirimidin-4-il)-1H- benzotriazol (0,30 g, 1,09 mmol) em 2 mL de NP.F. A mistura reacional foi agitada durante 45 minutos a 120 QC e em seguida vertida em 50 mL de ace- tato de etila. A camada orgânica foi separada, lavada com água, secada sobre Na2SO4 e filtrada; o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi triturado com uma solução de metanol e diclorometano; ele foi em seguida filtrado e secado para fornecer o éster etílico de ácido cis-(1S, 2/?>2-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico como um sólido esbranquiçado (0,22 g, 55% de rendimento); mp = 106,3-107,9 SC; MS = 367 (M+H)+.

Etapa 2: Síntese de (1S, 2fí)-[2-(4-benzotriazol-1 -il-pirimidin-2- ilamino)-ciclo-hexil]-metanol

Hidreto de alumínio de lítio (1,0 M em THF, 0,52 mL, 0,52 mmol) foi adicionado gota a gota a uma solução a -78-C de éster etílico de ácido c/s-(1 S, 2fí)-2-(4benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico (0,19 g, 0,52 mmol) em 5 mL de THF. A mistura reacional foi agitada durante * 2 horas, em seguida aquecida para RT durante urn periodo de 10 minutos.

• Após uma preparação Fieser padrão (1:1:3 de H2O, NaOH a 15%, H2O), a mistura reacional foi deixada agitar em RT durante cerca de 18 horas. Aceta- 5 to de etila foi adicionado e a mistura foi filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e o resíduo bruto dissolvido em clorofórmio, filtrado através de uma almofada de celita, concentrado sob pressão reduzida, e secado para fornecer (1S, 2R?)-[2-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]- metanol como um sólido branco (0,04 g, 24% de rendimento); mp = 206,1 10 207,8 SC; MS = 325 (M+H)+. trans-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]- e metanol foi preparado de uma maneira similar utilizando o aminoéster apropriado; MS: 325,19 (M+1)+, 297,17 ((M+1)+-28).

Exemplo 10: Síntese de A/-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-cicloexano- 15 trans-l, 4-diamina

Síntese de A/-(4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-il)-cicloexano-trans- 1,4-diamina foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema J.

Esquema J

Uma solução quente de 1-(2-metanossulfonil-pirimidin-4-il)-1H- 20 benzotriazol (10,07 g, 37 mmols) em 80 mL de NMP foi adicionada gota a gota durante um período de 10 minutos por meio de funil de adição a uma solução a 115 9C de trans-1,4-diaminocicloexano (25,58 g, 224 mmols) em 100 mL de NP.F. A mistura reacional foi agitada durante 1,5 hora em um banho de óleo a 115-120 9C; em seguida ela foi lentamente resfriada para 25 RT durante a noite. A mistura reacional foi vertida em 300 mL de água e agitada durante 4 horas; ela foi em seguida extraída duas vezes com EtOAc (400 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados uma vez com água (o produto é solúvel em água), secados sobre Na2SO4 e filtrados. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida até o produto começar a cristalizar. O sólido foi filtrado, lavado com EtOAc/hexanos e secado para fornecer ? a primeira colheita do composto título. Colheitas adicionais foram obtidas de

uma maneira similar dos licores-mãe para fornecer um total de 6,47 g (57% de rendimento) de /V-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-cicloexano-frans-1,4- diamina como um sólido esbranquiçado; mp = 223,5-227,8 9C; MS = 310 (M+H)+.

Exemplo 11: Síntese de A/-[frans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- ciclo-hexil]-acetamida. Síntese de /V-[trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]-acetamida foi realizada de acordo com o processo mostrado no . esquema K.

Esquema K

A uma suspensão" de N-(4-bénzõtriazol-il-pirimidin-2-il)- 15 cicloexano-frans-1,4-diamina (0,22 g, 0,71 mmol) em 1,5 mL de NMP foi adicionado anidrido acético (0,13 mL, 1,38 mmol). A reação foi agitada durante 1 hora. Acetato de etila foi adicionado à suspensão e a mistura resultante foi agitada durante 10 minutos. O precipitado foi filtrado, triturado com dicloro- metano, e secado para fornecer /V-[t/-ans-4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2- 20 ilamino)-ciclo-hexil]-acetamida como um sólido branco (0,18 g, 74% de rendimento); mp = 286,6-287,6 9C; MS = 352 (M+H)+.

Os seguintes compostos foram similarmente preparados, utilizando o agente de acilação apropriado:

Mesilato de /V-[trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- 25 ciclo-hexil]-acetamida (sólido branco); mp = 202,2-206,6 gC; MS = 352 (M+H)+; /V-[frans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]- metanossulfonamida (sólido branco); mp = 279,2-280,0 SC; MS = 388 (M+H)+;

Metanossulfonato(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-(4- metanossulfonilamino-ciclo-hexil)-amônio (sólido branco, 161 mg, 90% de rendimento); mp = 252,3-256,6 SC; MS = 388 (M+H)+;A/-[frans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]-propionamida (sólido branco); mp = 293,0-294,3 SC; MS = 366 (M+H)+; [trans-4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]-amida de ácido etanossulfônico (sólido branco); mp = 282,1-287,3 BC; MS = 402 (M+H)+; [trans-4-(4-benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-il-amino)-ciclo-hexil] ami-da de ácido dimetilsulfâmico (sólido branco); mp = 242,0-244,0 QC; MS = 417 (M+H)+; e 2-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-piperidin-1-il]- acetamida (sólido esbranquiçado); mp = 247,9-249,3 eC; MS = 353 (M+H)+.

Exemplo 12: Síntese de /V-[trans-4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- ciclo-hexil]-A/-metil-acetamida Síntese de A/-[trans-4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- ciclo-hexil]-A/-metil-acetamida foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema L.

Esquema L

Etapa 1: Síntese de (4-benzotriazol-il-pirimidin-2-il)-A/-metil- cicloexano-frans-1,4-diamina.

Uma suspensão de /V-4-benzotriazol-il-pirimidin-2-il)-cicloexano- trans-1,4-diamina (0,30 g, 0,97 mmol), formaldeído (0,5 mL, 37% em água, 25 0,87 mmol) e metanol (5 mL) foi agitada durante 4 horas em RT sob atmos fera de nitrogênio. Boroidreto de sódio (0,06 g, 1,59 mmol) foi adicionado porção a porção e a suspensão foi agitada durante 1 hora. Uma solução de hidróxido de sódio (1 M, 10 mL) foi adicionada. A mistura reacional foi resfriada em um banho de água a 252C e agitada durante 30 minutos. Acetato de etila (50 mL) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada durante 5 minutos, em seguida filtrada. A camada orgânica do filtrado foi descartada. A ca- 5 mada aquosa foi extraída com EtOAc; a camada orgânica foi separada; secada sobre Na2SO4 e filtrada; o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O sólido bruto foi purificado por cromatografia de coluna instantânea utilizando 15% de MeOH/CH2CÍ2 para fornecer (4-benzotriazol-il-pirimidin-2-il)- /V'-metil-cicloexano-trans-1,4-diamina como um sólido (0,05 g, 16% de ren- 10 dimento). MS = 324 (M+H)+.

Etapa 2: Síntese de A/-[frans-4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2- ilamino)-ciclo-hexil]-/V-metil-acetamida.

O composto título foi obtido como um pó esbranquiçado de uma maneira similar como descrito no Exemplo 11 de (4-benzotriazol-il-pirimidin- 15 2-il)-/V-metil-cicloexano-trans-l ,4-diamina. MS = 366 (M+H)+.

N-[trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]-N- metil-metanossulfonamida (sólido esbranquiçado) foi preparado de uma maneira similar utilizando cloreto de metanossulfonila; mp = 249,9-251,7 eC; MS = 402 (M+H)+.

Exemplo 13: Síntese de cloridrato de /V-(4-benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-il)-/V- piridin-2-il-cicloexano-trans-1 ,4-diamina Síntese de cloridrato de A/-(4-benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-il)-/V- piridin-2-il-cicloexano-frans-1,4-diamina foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema M.

Esquema M

Uma solução de /V-(4-benzotriazol-il-pirimidin-2-il)-cicloexano- trans-1,4-diamina (0,20 g, 0,65 mmol) e 2-fluoropiridina (0,11 mL, 1,28 mmol) e 1,5 mL de NMP foi aquecida em um reator de micro-ondas a 230 eC durante 20 minutos. O NMP foi removido por destilação. O sólido foi lavado com bicarbonato de sódio saturado, triturado com éter, e purificado porTLC preparativa. A base livre obtida desta maneira foi transformada no sal de clori- drato correspondente por adição de HCI em éter para fornecer o composto título como um sólido amarelo (0,04 g, 16% de rendimento); mp = 207,0210,02C. MS = 387 (M+H)+.

Exemplo 14: Síntese de /V-{trans-4-[(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-metil- amino]-ciclo-hexil}-/V-metil-metanossulfonamida Síntese de A/-{trans-4-[(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-metil- amino]-ciclo-hexil}-/V-metil-metanossulfonamida foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema N.

Esquema N

A uma solução de /V-[trans-4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2- 15 ilamino)-ciclo-hexil]-metanossulfonamida (0,13 g, 0,3 mmol) em 4 mL de NMP foi adicionado um excesso de NaH (dispersão em óleo mineral). Imediatamente a mistura tornou-se amarela em cor e a reação pareceu ser ligeiramente exotérmica; ela foi em seguida agitada em RT durante 10-15 minutos, em seguida um par de gotas de iodometano foi adicionado. A cor amare- 20 la desbotou e a mistura reacional foi agitada durante 15 minutos. Ela foi em seguida vertida em 100 mL de água e extraída com 100 mL de EtOAc. A camada orgânica foi separada e lavada duas vezes com 100 mL de água; ela foi em seguida secada sobre Na2SO4 e filtrada. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo bruto foi purificado por cromatografia ins- 25 tantânea (EtOAc/hexanos, 1:1). Recristalização de EtOAc/hexanos forneceu o produto título como um sólido branco (51 mg, 37% de rendimento); mp = 203,5-204,0 eC; MS = 416 (M+H)+. ciclo-hexil]-pirrolidina-2,5-diona

Síntese de 1-[frans-4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-s ciclo-hexil]-pirrolidina-2,5-diona foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema O.

Esquema O

Uma solução de A/-(4-benzotriazol-il-pirimidin-2-il)-cicloexano- trans-1 ,4-diamina (0,26 g, 0,8 mmol) e anidrido succínico (0,09 g, 0,9 mmol) em 2 mL de NMP foi colocada em um tubo de reação, selado em seguida aquecida para 60-65 θC durante 17 horas. A mistura reacional resfriada foi 10 concentrada e tratada com 8 mL de anidrido acético e acetato de sódio (0,09 g, 1,10 mmol). A mistura foi aquecida ao refluxo e agitada durante 21 horas. A mistura reacional foi vertida em água gelada e neutralizada com 1 M de hidróxido de sódio. O precipitado foi filtrado e purificado por TLC preparativa para fornecer o composto título como um sólido branco (0,07 g, 21% de ren- 15 dimento). mp = 205,0-210,0 eC; MS = 392 (M+H)+.

Exemplo 16: Síntese de 4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexanona.

Síntese de 4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexanona foi realizada de acordo com o processo mostrado no Esquema 20 P.

Esquema P

A uma suspensão de (4-benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-il)-(1,4-dioxa-espiro[4,5]dec-8-il)-amina (preparada de uma maneira similar como descrito no exemplo 2) (1,53 g, 4 mmols) em 80 mL de THF foram adicionados 25 mL de uma solução aquosa a 3 M de HCI. A mistura reacional foi agitada em RT durante 20 minutos. A reação foi aquecida ao refluxo durante 30 minutos. Ela foi em seguida resfriada, e vertida em uma solução de NaHCOs aquosa. A mistura resultante foi extraída com EtOAc, secada sobre Na2SO4 e filtrada. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida até o produto começar a cristalizar da solução; ele foi em seguida filtrado e secado para fornecer o produto título como um pó branco (942 mg, 70% de rendimento); mp10 = 204,9-206,5 SC; MS = 309 (M+H)+.

Exemplo 17: Síntese de 4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-1-metil- cicloexanol.

Síntese de 4-(4-benzotriazol-1 -il-pirim id in-2-ilam ino)-1 -metil-cicloexanol foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema Q.

Esquema Q

A uma solução de 4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexanona (764 mg, 2,5 mmols) em 80 mL de THF, resfriada a -78 eC, foi adicionado gota a gota cloreto de metilmagnésio (3,5 mL, 3,0 M em THF, 10,5 mmols). A mistura reacional imediatamente tornou-se amarelo brilhante em cor; ela foi em seguida deixada aquecer para RT. A reação não alcançou a conclusão, assim ela foi novamente resfriada para -78 eC e uma alíquota adicional de MeMgCI (3 mL, 9 mmols) foi adicionada. A mistura resultante foi aquecida para RT e em seguida vertida em uma solução aquosa de NH4CI; ela foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi separada, secada sobre Na2SO4 e filtrada; o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna (1-5/99-95 de MeOH/CH2Cl2) para fornecer, um transisômero menos polar (130 mg, 16% de rendimento, mp = 193,0-195,4 SC; MS = 325 (M+H)+), e o cis-isômero mais polar (360 mg, 45% de rendimento, mp = 202,1-205,6 2C; MS = 325 (M+H)+) como sólidos cristalinos brancos.

Exemplo 18: Síntese de ácido trans-4-(4-benzotriazol-1-il-5-cloro-pirimidin- 2-ilamino)-cicloexanocarboxílico Síntese de ácido trans-4-(4-benzotriazol-1-il-5-cloro-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico foi realizada de acordo com o processo mostradono Esquema R.

Esquema R

Etapa 1: Síntese de éster metílico de ácido 4-(4-benzotriazol-1-il- 10 5-cloro-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico.

Éster metílico de ácido trans-4-Amino-cicloexanocarboxílico (727 mg, 3,76 mmols) foi adicionado porção a porção, em RT sob atmosfera de nitrogênio, a uma solução de 1-(2,5-dicloro-pirimidin-4-il)-1/-/-benzotriazol (500 mg, 1,88 mmol) em THF (50 mL) seguido por TEA (0,79 mL, 5,64 15 mmols). A suspensão branca resultante foi agitada em RT durante a noite, e em seguida a 60 2C durante 2,5 dias. A mistura foi dividida entre água (100 mL) e EtOAc (100 mL). A camada orgânica foi separada, lavada duas vezes com água (100 mL) e uma vez com salmoura (100 mL), em seguida secada sobre Na2SO4, filtrada e o solvente evaporado sob pressão reduzida para fornecer um sólido esbranquiçado. Este material bruto foi purificado por meio de cromatografia instantânea (tolueno/EtOAc, 90/10) para fornecer 538 mg (74% de rendimento) de éster metílico de ácido 4-(4-benzotriazol-1-il-5-cloro- pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico como um sólido esbranquiçado. MS: 387,10 (M+1)+, 359,13 ((M+1)+-28).

Os seguintes compostos foram similarmente preparados utilizando a pirimidina apropriada:éster metílico de ácido trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-5-fluoro- 5 pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 371,12 (M+1)+, 343,14 ((M+1) +-28);éster metílico de ácido trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-5-metil- pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 367,20 (M+1) +, 339,23 ((M+1)+-28); e éster metílico de ácido trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2- ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 353,21 (M+1)+, 325,19 ((M+1)+-28).

Etapa 2: Síntese de ácido trans-4-(4-benzotriazol-1-il-5-cloro- pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico

Uma solução aquosa de NaOH (2 M, 10 mL) foi adicionada a 15 uma solução incolor de éster metílico de ácido 4-(4-benzotriazol-1-il-5-cloro- pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico (482 mg, 1,25 mmol) em THF (10 mL) em RT. A mistura reacional foi agitada em RT durante a noite; ela foi em seguida diluída com água (15 mL) e acidificada até pH 3 por adição de HCI (2 M). O precipitado branco formado foi coletado por filtração, lavado com 20 água e secado por ar para fornecer 435 mg (85% de rendimento) de ácido frans-4-(4-benzotriazol-1-il-5-cloro-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico como um sólido branco. MS: 373,12 (M+1)+, 345,15 ((M+1)+-28).

Os seguintes compostos foram similarmente preparados utilizando a pirimidina apropriada: ácido trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 339,21 (M+1)+, 311,21 ((M+1)+-28); e ácido trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-5-fluoro-pirimidin-2-ilamino)- cicloexanocarboxílico; MS: 357,12 (M+1)+, 329,15 ((M+1)+-28).

Exemplo 19: Síntese de etilamida de ácido trans-4-(4-benzotriazol-1-il-5- 30 cloro-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico

Síntese de etilamida de ácido trans-4-(4-benzotriazol-1-il-5- cloro-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema S.

Esquema S

Uma mistura de ácido trans-4-(4-benzotriazol-1-il-5-cloro- pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico (70 mg, 0,17 mmol), etil amina (21 5 μL, 0,26 mmol), BOP (114 mg, 0,26 mmol) e DIPEA (59 μL, 0,34 mmol) em THF (60 mL) foi agitada em RT durante 2 dias. O sólido branco formado foi removido por filtração e o filtrado foi diluído com água (25 mL) e extraído 3 vezes com uma mistura de isopropanol/clorofórmio (1/1, 20 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secados sobre Na2SO4, filtrados e evaporados 10 sob pressão reduzida para fornecer um resíduo esbranquiçado que foi purificado por meio de cromatografia instantânea (DCM/MeOH, 98/2) para fornecer 68 mg (rendimento quantitativo) de etilamida de ácido trans-4-(4- benzotriazol-1 -il-5-cloro-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico como um sólido branco. MS: 400,17 (M+1)+, 372,17 ((M+1)+-28). 1H RMN (250 MHz, 15 CD3OD) δ ppm: 8,55 (1 H, s), 8,09 - 8,21 (2 H, m), 7,69 (1 H, dd, J = 7,50 Hz), 7,55 (1 H, dd, J = 7,50 Hz), 3,71 - 3,88 (1 H, m), 3,18 (2 H, q, J = 7,29 Hz), 2,10 - 2,25 (3 H, m), 1,82 - 1,95 (2 H, m), 1,50 - 1,71 (2 H, m), 1,26 - 1,48 (2 H, m), 1,10 (3 H, t, J = 7,29 Hz).

Os seguintes compostos foram similarmente preparados utili- 20 zando os derivados de amina e pirimidina apropriados: trans-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]-(4- metil-piperazin-1-il)-metanona; 1H RMN (400 MHz, MeOD) δ ppm 8,54 - 8,99 (1 H, bd), 8,44 (1 H, d, J = 5,38 Hz), 8,11 (1 H, d, J = 8,31 Hz), 7,70 (1 H, m), 7,55 (1 H, m), 7,44 (1 H, d, J = 5,38 Hz), 4,15 - 4,29 (1 H, m), 3,70 - 4,10 (2 25 H, m), 3,14 - 3,39 (6 H, m), 2,90 (3H, s), 2,83 - 2,94 (1 H, m), 2,00 - 2,13 (2 H, m), 1,80 - 1,99 (4 H, m), 1,65 - 1,77 (2 H, m); ciclopropilamida de ácido tra/is-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2- ilamino)-cicloexanocarboxilico; MS: 378,22 (M+1)+, 350,22 ((M+1)+-28); trans-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]- pirrGlidin-1-il-metanona; MS: 391,21 (M+1)+; (2-hidróxi-etil)-amida de ácido trans-4-(4-Benzotriazol-1-il- 5 pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 382,18 (M+1)+; c/s-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]-(4-metil- piperazin-1-il)-metanona; MS: 421,23 (M+1)+; (tetra-hidro-piran-4-il)-amida de ácido frans-4-(4-Benzotriazol-1- il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 422,24 (M+1)+; (2-hidróxi-etil)-metil-amida de ácido frans-4-(4-Benzotriazol-1 -il- pinmidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 396,12 (M+1)+; frans-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]- morfolin-4-il-metanona; MS: 408,26 (M+1)+; (2-amino-2-metil-propil)-amida de ácido trans-4-(4-Benzotriazol- 15 1-il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 409,27 (M+1)+; etilamida de ácido trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2- ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 366,19 (M+1)+, 338,23 ((M+1)+-28); trans-[4-(4-Benzotriazol-1-il-5-fluoro-pirimidin-2-ilamino)-ciclo- hexil]-morfolin-4-il-metanona; MS: 426,15 (M+1)+, 398,14 ((M+1)+-28); trans-[4-(4-Benzotriazol-1 -il-5-metil-pirimidin-2-ilamino)-ciclo- hexil]-morfolin-4-il-metanona; MS: 422,18 (M+1)+, 394,15 ((M+1)+-28); etilamida de ácido trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-5-fluoro-pirimidin- 2-ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 384,15 (M+1)+, 356,17 ((M+1)+-28); e etilamida de ácido trans-4-(4-Benzotriazol-1-il-5-metil-pirimidin-2- 25 ilamino)-cicloexanocarboxílico; MS: 380,18 (M+1)+, 352,21 ((M+1)+-28), Exemplo 20: Síntese de trans-(4-aminometil-ciclo-hexil)-(4-benzotriazol-1-il- pirimidin-2-il)-amina.

Síntese de trans-(4-aminometil-ciclo-hexil)-(4-benzotriazol-1 -il- pirimidin-2-il)-amina foi realizada de acordo com o processo mostrado no 30 esquema T.

Etapa 1: Síntese de trans-2-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2- ilamino)-cicloexilmetil]-isoindol-1,3-diona

Trifenilfosfina (972 mg, 1,2 eq) foi adicionada a uma solução de trans-[4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]-metanol (1g, 1 equivalente; preparada de uma maneira similar como descrito no exemplo 4) em tolueno (100 mL), ela foi então seguida pela adição gota a gota de DIAD (0,73 mL, 1,2 eq). A mistura reacional foi agitada em RT durante 10 minutos e em seguida ftalimida (545 mg, 1,2 eq) foi adicionada. A mistura foi agitada durante a noite em RT, água foi em seguida adicionada e a mistura resultante foi extraída 3 vezes com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram secados sobre Na2SO4, filtrados e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi triturado com MeOH para fornecer 976 mg (70% de rendimento) de trans-2-[4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexilmetil]-isoindol-1,3-diona; MS = 454,40 (M+1)+. trans-4-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexilmetil]- morfolina-3,5-diona foi preparado de uma maneira similar utilizando a imida apropriada; MS: 422,35 (M+1)+.

Etapa 2: Síntese de frans-(4-aminometil-ciclo-hexil)-(4- benzotriazol-1 -il-pirim id in-2-il)-am ina

Mono-hidrato de hidrazina (0,28 mL, 2,7 eq) foi adicionado a uma solução de trans-2-[4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexilmetil]-isoindol-1,3-diona (976 mg, 1 equivalente) em EtOH (60 mL). A mistura reacional foi agitada durante a noite a 70 eC, uma segunda alíquota de mono-hidrato de hidrazina (0,22 mL, 2,0 eq) foi em seguida adicionada e a mistura foi agitada em refluxo durante 7 horas. O solvente foi em seguida evaporado sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em uma mistura de isopropanol e clorofórmio e foi acidificado até pH 3 pela adição de HCI (1 M). A fase orgânica foi lavada 3 vezes com água. A fase aquosa foi basificada 5 para pH 8-9 pela adição de NaOH (1 M) e foi extraída 5 vezes com uma mistura de isopropanol e clorofórmio. Os extratos orgânicos combinados foram secados sobre Na2SO4, filtrados e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. Este procedimento de extração de ácido/base foi repetido 3 vezes a fim de remover ftalazinona. frans-(4-Aminometil-ciclo-hexil)-(4-benzotriazol- 10 1 -il-pirimidin-2-il)-amina foi obtido em 71% de pureza (450 mg, 65% de ren dimento). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8,53 - 8,85 (1 H, bd), 8,40 (1 H, d, J = 5,50 Hz), 8,09 (1 H, d, J = 8,31 Hz), 7,67 (1 H, m), 7,53 (1 H, m), 7,39 (1 H, d, J = 5,50 Hz), 3,76 - 3,89 (1 H, m), 2,60 (2 H, d, J = 6,60 Hz), 2,11 - 2,28 (2 H, m), 1,88 - 2,02 (2 H, m), 1,08 -1,54 (5 H, m).

Exemplo 21: Síntese de frans-/V-[4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexilmetil]-acetamida

Síntese de trans-A/-[4-(4-benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexilmetil]-acetamida foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema U.

Esquema U

TEA (52 μL, 0,37 mmol) foi adicionado, sob atmosfera de nitrogênio, a uma solução de trans-(4-aminometil-ciclo-hexil)-(4-benzotriazol-1-il- pirimidin-2-il)-amina (60 mg, 0,185 mmol) em DCM (3 mL). A mistura foi resfriada para -78 -C e cloreto de acetila (13,2 μL, 0,185 mmol) foi adicionado.

A mistura reacional foi agitada em RT durante a noite; ela foi em seguida vertida em água e extraída 3 vezes com uma mistura de isopropanol e clorofórmio. Os extratos orgânicos combinados foram secados sobre Na2SO4, filtrados e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por meio de TLC preparativa para fornecer 10 mg de trans-N-[4- * (4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-cicloexilmetil]-acetamida. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 8,55 (1 H, d, J = 8,19 Hz), 8,41 (1 H, d, J = 5,14 5 Hz), 8,12 (1 H, d, J = 8,19 Hz), 7,57 - 7,67 (1 H, m), 7,42 - 7,51 (2 H, m), 7,16 - 7,24 (0,3 H, m), 5,55 - 5,64 (0,7 H, m), 5,18 - 5,43 (1 H, m), 3,80 - 3,93 (1 H, m), 3,11 - 3,25 (2 H, m), 2,27 (1 H, s), 2,19 - 2,35 (2 H, m), 2,00 (2 H, s), 1,85 - 1,95 (2 H, m), 1,50 - 1,63 (1 H, m), 1,11 - 1,37 (4 H, m). trans-N-N’-[4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexilmetil]-dimetilsulfanoil uréia foi preparado de uma maneira similar utilizando cloreto de dimetilsulfamoíla como 0 agente de acilação. 1H RMN , (400 MHz, CDCI3) δ ppm 8,52 (1 H, d, J = 8,19 Hz), 8,34 - 8,42 (1 H, bd), 8,11 (1 H, d, J = 8,19 Hz), 7,60 (1 H, m), 7,41 - 7,51 (2 H, m), 3,75 - 3,89 (1 H, m), 2,94 (2 H, d, J = 6,36 Hz), 2,79 (6 H, s), 2,20 - 2,33 (2 H, m), 1,86 - 15 2,00 (2 H, m), 1,48 -1,62 (1 H, m), 1,09 -1,39 (4 H, m).

Exemplo 22: Síntese de (4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-(4-morfolin-4- ilmetil-ciclo-hexil)-amina

Síntese de (4-benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-il)-(4-morfolin-4-ilmetil- ciclo-hexil)-amina foi realizada de acordo com 0 processo mostrado no Esquema V.

Esquema V

Etapa 1: Síntese de 4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- cicloexanocarbaldeído.

Ácido iodoxibenzóico (830 mg, 2,96 mmols) foi adicionado a uma 4 ' ' solução de frans-[4-(4-benzotriazoÍ-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]- * metanol (640 mg, 1,97 mmol) em DMSO (10 mL) e a mistura resultante foi agitada em RT durante 23 horas. Uma alíquota adicional de ácido o- iodoxibenzóico (830 mg, 2,96 mmols) foi em seguida adicionado. Após algumas horas, a reação foi interrompida. Água foi adicionada e a mistura resultante foi agitada durante 20 minutos, o sólido formado foi filtrado e o filtrado foi extraído 3 vezes com EtOAc. Os extratos orgânicos combinados foram lavados uma vez com água, secados sobre Na2SO4 e filtrados; o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O sólido branco formado foi lavado diversas vezes com EtOAc e ele foi combinado com o sólido previamente obtido, para fornecer 789 mg de resíduo bruto. Este material bruto foi purificado por meio de cromatografia instantânea (heptano/EtOAc, com um gradiente de ’ 20% a 50% de EtOAc) para fornecer 452 mg (70% de rendimento) de 4-(4 benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexanocarbaldeído.

Etapa 2: Síntese de (4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-(4-morfolin-4-ilmetil-ciclo-hexil)-amina

Uma mistura de 4-(4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo- hexanocarbaldeído(39 mg), morfolina (14 μL) e ácido acético (2 gotas) em DCE (2 mL) foi agitada em RT durante 2 horas; triacetoxiboroidreto de sódio foi em seguida adicionado. A mistura resultante foi agitada durante 3 horas em RT. Água foi adicionada; a camada orgânica foi separada e lavada 3 vezes com água. A camada aquosa foi re-extraída com DCM. Os extratos orgânicos combinados foram secados sobre Na2SO4 e filtrados; o solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por meio de TLC preparativa para fornecer 13,2 mg de (4-benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-(4- morfolin-4-ilmetil-ciclo-hexil)-amina. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 8,56 (1 H, d, J = 8,31 Hz), 8,36 - 8,46 (1 H, bd), 8,12 (1 H, d, J = 8,31 Hz), 7,55 - 7,69 (1 H, m), 7,40 - 7,52 (2 H, m), 5,22 - 5,64 (1 H, m), 3,49 - 3,96 (5 H, m), 2,12 - 2,56 (6 H, m), 1,46 - 2,04 (5 H, m), 1,03 - 1,46 (4 H, m).

Os seguintes compostos foram similarmente preparados utilizando a amina apropriada:

Éster terc-butílico de ácido trans-4-[4-(4-benzotriazol-1-il- pirimidin-2-ilamino)-cicloexilmetil]-piperazina-1-carboxílico. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 8,56 (1 H, d, J = 8,43 Hz), 8,41 (1 H, bd), 8,12 (1 H, d, J = 8,43 Hz), 7,61 (1 H, m), 7,43 - 7,51 (2 H, m), 5,10 - 5,87 (1 H, m), 3,81 - 5 3,94 (1 H, m), 3,39 - 3,47 (4 H, m), 2,33 - 2,42 (3 H, m), 2,19 - 2,32 (4 H, m), 1,87 - 2,02 (2 H, m), 1,50 - 1,83 (2 H, m), 1,45 (9 H, s), 1,05 - 1,41 (4 H, m); e trans-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-il)-{4-[(2-metóxi-etilamino)- metil]-ciclo-hexil}-amina. 1H RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 8,56 (1 H, d, J = 10 8,31 Hz), 8,38 - 8,45 (1 H, m), 8,12 (1 H, d, J = 8,31 Hz), 7,61 (1 H, m), 7,42 - 7,50 (2 H, m), 5,17 - 5,64 (1 H, bd), 3,76 - 3,94 (1 H, m), 3,47 - 3,54 (2 H, m), 3,36 (3 H, s), 2,75 - 2,82 (2 H, m), 2,50 - 2,58 (2 H, m), 2,18 - 2,35 (1 H, m), 1,89 - 1,99 (1 H, m), 1,60 - 1,83 (4 H, m), 1,10 - 1,41 (4 H, m).

Exemplo 23: Síntese de trans-/V-(4-Amino-ciclo-hexil)-2-(4-metil-piperazin-1- 15 il)-acetamida.

Síntese de trans-/V-(4-Amino-ciclo-hexil)-2-(4-metil-piperazin-1 -il)-acetamida foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema W.

Esquema W

Etapa 1: Síntese de éster terc-butílico de ácido trans-[4-(2-cloro- acetilamino)-ciclo-hexil]-carbâmico.

A uma solução gelada de frans-4-metil-ciclo-hexilamina (520 mg, 1,5 mmol) em DCM (15 mL) foi adicionada piridina (0,36 mL, 4,5 mmols), seguido por cloreto de cloroacetila (1 equivalente) adicionado gota a gota. A 25 mistura foi deixada aquecer até a RT e foi agitada durante 3 dias. Uma alíquota adicional de piridina (1 equivalente) e cloreto de cloroacetila (1 equivalente) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada durante a noite. A mistura reacional foi diluída com EtOAc, lavada com uma solução aquosa saturada de NaHCO3, extraída em EtOAc, e lavada novamente com água. As camadas orgânicas combinadas foram secadas sobre Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para produzir 478 mg de éster terc- 5 butílico de ácido trans-[4-(2-cloro-acetilamino)-ciclo-hexil]-carbâmico sem outra purificação.

Etapa 2: Síntese de éster terc-butílico de ácido trans-{4-[2-(4- metil-piperazin-1-il)-acetilamino]-ciclo-hexil}-carbâmico.

Uma solução de éster terc-butílico de ácido teans-[4-(2-cloro- 10 acetilamino)-ciclo-hexil]-carbâmico (330 mg, 1,14 mmol) em DCM (12 mL) foi adicionada a uma solução de metilpiperazina (0,1 mL, 0,95 mmol) em DCM (1 mL) em RT. A mistura resultante foi deixada agitar durante a noite, em seguida diluída com DCM, e lavada com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A fase aquosa foi extraída com DCM e em seguida EtOAc. As fa- 15 ses orgânicas combinadas foram secadas sobre Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para produzir 199 mg de éster terc-butílico de ácido trans-{4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-acetilamino]-ciclo-hexil}-carbâmico sem outra purificação.

Etapa 3: Síntese de trar)s-/V-(4-Amino-ciclo-hexil)-2-(4-metil- 20 piperazin-1-il)-acetamida.

Uma solução aquosa de HCI (2 M, 15 mL) foi adicionada a uma solução de éster terc-butílico de ácido trans-{4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)- acetilamino]-ciclo-hexil}-carbâmico (199 mg, 0,56 mmol) em MeOH (15 mL) em RT, e a mistura resultante foi agitada durante a noite. A mistura reacional 25 foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer um resíduo sólido. Et2O foi adicionado a este material, e a suspensão resultante foi sonicada. A fase de éter foi decantada, resultando em um sólido marrom em pó que foi purificado por TLC preparativa. O óleo resultante foi dissolvido na quantidade mínima de MeOH, e Et2O foi adicionado. Um sólido precipitou-se; a fase líquida 30 foi decantada para fornecer, após secagem, 75 mg de trans-A/-(4-amino- ciclo-hexil)-2-(4-metil-piperazin-1-il)-acetamida como um pó fino.

De uma maneira similar, utilizando os materiais de partida apro- priados, os seguintes compostos foram também preparados: - frans-A/-(4-Amino-ciclo-hexil)-2-morfolin-4-il-acetamida; - trans-/V-(4-Amino-ciclo-hexil)-2-metóxi-acetamida; e - trans-A/-(4-Amino-ciclo-hexil)-2-hidróxi-acetamida.

Exemplo 24: Síntese de frans-A/-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirimidin-2-ilamino)- ciclo-hexil]-2-metóxi-acetamida.

Síntese de trans-/V-[4-(4-Benzotriazol-1-il-pirÍmidin-2-ilamino)- ciclo-hexil]-2-metóxi-acetamida foi realizada de acordo com o processo mostrado no esquema X.

Esquema X

A um tubo selável de 10 mL carregado com 1-(2- metanossulfonil-pirimidin-4-il)-1H-benzotriazol (99,1 mg, 0,36 mmol) foram adicionados NMP (1 mL) e di-isopropiletilamina (0,19 mL, 1,09 mmol). A um segundo tubo selável de 5 mL carregado com /V-(4-amino-ciclo-hexil)-2- metóxi-acetamida (100 mg, 0,36 mmol) foi adicionado NMP (1 mL). Ambos os tubos foram aquecidos a 1209C e em dissolução completa dos sólidos a solução de 1-(2-metanossulfonil-pirimidin-4-il)-1/7-benzotriazol foi transferida por meio de cânula no tubo contendo a solução de /V-(4-amino-ciclo-hexil)-2- metóxi-acetamida. A mistura resultante foi agitada durante 1,5 hora a 120eC, em seguida resfriada para a RT e vertida em água (15 mL). A mistura resultante foi agitada durante a noite, em seguida diluída com DCM e lavada com água. A camada aquosa foi separada e extraída com DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secadas sobre Na2SO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para fornecer um óleo que foi dissolvido em uma pe- quena quantidade de EtOAc e hexano foi adicionado para precipitar os sólidos. A mistura resultante foi deixada assentar durante 1h, após o que o so- brenadante líquido foi cuidadosamente decantado. O sólido remanescente foi secado sob pressão reduzida para produzir 86 mg (63% de rendimento) de trans-/V-[4-(4-benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]-2-metóxi- acetamida. MS = 381 [M+H]+; MP = 233,5-235,4 SC.

De uma maneira similar, utilizando o material de partida apropriado, os seguintes compostos foram também preparados: - trans-A/-[4-(4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]- 2-hidróxi-acetamida, MS = 368 [M+H]+; - trans-A/-[4-(4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]- 10 2-morfolin-4-il-acetamida,MS = 437 [M+H]+; e - trans-/V-[4-(4-Benzotriazol-1 -il-pirimidin-2-ilamino)-ciclo-hexil]- 2-(4-metil-piperazin-1-il)-acetamida, MS = 450 [M+H]+.

Formulações

Preparações farmacêuticas para distribuição por várias rotas são' formuladas como mostrado nas seguintes tabelas. "Ingrediente ativo" ou "Composto ativo" como utilizado nas tabelas significa um ou mais dos compostos de fórmula I.

Os ingredientes são misturados e dispenses em cápsulas con- 20 tendo cerca de 100 mg cada; uma cápsula aproximar-se-ia de uma dosagem diária total.

Os ingredientes são combinados e granulados utilizando um solvente tal como metanol. A formulação é em seguida secada e formada em comprimidos (contendo cerca de 20 mg de composto ativo) com uma máquina de comprimido apropriada.

Os ingredientes são misturados para formar a suspensão para administração oral.

O ingrediente ativo é dissolvido em uma porção da água para injeção. Uma quantidade suficiente de cloreto de sódio é em seguida adicionada com agitação para tornar a solução isotônica. A solução é preparada para pesar com o restante da água para injeção, filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 micron e empacotada sob condições estéreis.

Os ingredientes são fundidos juntos e misturados em um banho de vapor, e vertidos em moldes contendo 2,5 g de peso total.

Todos dos ingredientes, exceto água, são combinados e aqueci dos a cerca de 60°C com agitação. A quantidade suficiente de água a cerca de 60°C é em seguida adicionada com agitação vigorosa para emulsificar os ingredientes, e água em seguida adicionada q.s. cerca de 100 g. Formulações de Spray Nasal

Diversas suspensões aquosas contendo de cerca de 0,025-0,5 porcento de composto ativo são preparadas como formulações de spray nasal. As formulações opcionalmente contêm ingredientes ativos tais como, por exemplo, celulose microcristalina, carboximetilcelulose de sódio, dextrose, e os similares. Ácido hidroclórico pode ser adicionado para ajustar o pH. As formulações de spray nasal podem ser distribuídas por meio de uma bomba medidora de spray nasal tipicamente distribuindo cerca de 50-100 microlitros de formulação por acionamento. Uma tabela de dosagem típica é 2-4 sprays a cada 4-12 horas.

Exemplo 28 Ensaios de Cinase A: Medida de ICgo

Para determinar a atividade de inibição de Cdk4, Cdk2 e Cdk1, ensaios de cinase foram conduzidos utilizando ensaios FlashPlate® (NEN®- Life Science Products). Ensaios FlashPlate foram realizados utilizando complexos de B-CDK1 ciclina humana recombinante, E-CDK2 ciclina humana ou D1-CDK4 ciclina humana. Clones de cDNA de GST-ciclinaE (GST-cycE), 10 CDK2, GST-ciclinaB (GST-cycB), CDK1, GST-CDK4 e ciclina D1 (cycD1) em vetores de baculovírus foram fornecidos por Dr. W. Harper no Bailor College of Medicine, Houston, TX. Proteínas foram co-expressas em células de inseto High Five® e o complexo foi purificado sobre resina Sepharose® de gluta- tiona (Pharmacia, Piscataway, NJ) como previamente descrito (J.W. Harper 15 e outro, Cell(1993) 75:805-16). Uma forma truncada rotulada de 6X-Histidina de proteína de retinoblastoma (Rb) (aminoácidos 386-928) foi utilizada como 0 substrato para os ensaios de cycD1-CDK4, cycB-CDK1 e cycE-CDK2 (o plasmídeo de expressão foi fornecido pela Dr. Veronica Sullivan, Department of Molecular Virology, Roche Research Centre, Welwyn Garden City, United 20 Kingdom). A proteína de Rb é um substrato natural para fosforilação por CDK4, CDK2 e CDK1 (veja Herwig e Strauss Eur. J. Biochem. (1997) 246:581-601 e as referências citadas aqui).

A expressão da proteína de 62 Kd foi sob 0 controle de um promotor induzível por IPTG em uma linhagem de E. co//M15. As células foram 25 lisadas por sonicação e purificação foi realizada por lisados de ligação em pH 8,0 em uma coluna de agarose quelada por Ni pré-tratada com 1 mM de imidazol. A resina foi em seguida lavada diversas vezes com tampões de pH incrementalmente decrescentes para pH 6,0, e eluída com 500 mM de imidazol. Proteína eluída foi dialisada contra 20 mM de HEPES pH 7,5, 30% de 30 glicerol, 200 mM de NaCI, e 1 mM de DTT. Matérias-primas de proteína de fusão de Rb purificadas foram quantificadas quanto à concentração de proteína, aliquotadas, e armazenadas a -70°C.

Para todos os três ensaios de cinase relatados aqui, FlashPlates de 96 cavidades foram revestidas com proteína de Rb em 10 μg/ml, utilizando 100 μl por cavidade. As placas foram incubadas a 4°C durante a noite ou em RT durante 3 horas em um agitador. Para controlar quanto à fosforilação 5 não-específica, uma fileira de cavidades foi revestida com 100 μl/cavidade de tampão de revestimento (20 mM de HEPES, 0,2 M de NaCI). As placas foram em seguida lavadas duas vezes com tampão de lavagem (0,01% de Tween® 20 em salina tamponada por fosfato). Compostos a serem testados ("compostos testes") foram adicionados às cavidades em concentração final 10 de 5x. As reações foram iniciadas por adição imediata de 40 μl de mistura de reação (25 mM de HEPES, 20 mM de MgCI2, 0,002% de Tween 20, 2 mM de DTT, 1 μM de ATP, 4 nM de 33P-ATP) e uma quantidade suficiente de enzima para fornecer contas que foram pelo menos 10 vezes acima do antecedente. As placas foram incubadas em RT em um agitador durante 30 minu- 15 tos. As placas foram lavadas quatro vezes com o tampão de lavagem, seladas, e contadas no contador de cintilação TopCount (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL]. A inibição percentual de fosforilação de Rb, que é uma medida da inibição de atividade de CDK, foi determinada de acordo com a seguinte fórmula:

onde "composto teste" refere-se às contas médias por minuto das duplicatas de teste, "não específico" refere-se às contas médias por minuto quando nenhuma CiclinaD/Cdk4, etc., for adicionada, e "total" refere-se às contas médias por minuto quando nenhum composto for adicionado. O valor de IC5o é a concentração de composto teste que reduz em 50% a incorporação in- 25 duzida por proteína cinase do radiorótulo sob as condições testes descritas.

B. Medida de K,

Alternativamente, atividade de inibição pode ser medida utilizando Ki. Utilizando as construções de proteína descritas acima no exemplo 28(A) acima, ensaios de CDK1, CDK2, e CDK4 HTRF foram estabelecidos.

Estes foram feitos em formato de 96 cavidades e lidos em formato de placa de 384 cavidades. Os ensaios foram conduzidos em 3x seus respectivos Kms para ATP.

No ensaio de CDK4, compostos testes foram diluídos para 3xsuas concentrações finais em 25 mM de Hepes, pH 7,0, 6,25 mM de MgCI2)1,5 mM de DTT, 135 μM de ATP. A concentração de DMSO não foi maior do que 4,76%. Vinte microlitros foram adicionados às cavidades de uma placa de 96 cavidades. A reação de cinase foi iniciada pela adição de 40 μl /cavidade da solução contendo 0,185 μM de Rb e 2,25 μg/ml de CDK4 em 25 mM de HEPES, pH 7,0, 6,25 mM de MgCI2, 0,003% de Tween-20, 0,3 10 mg/ml de BSA, 1,5 mM de DTT. Cavidades vazias sem CDK4 foram incluídas. As placas foram incubadas a 37°C durante 30 minutos com agitação. A reação de cinase foi terminada pela adição de 15 μl/cavidade de 1,6 μM de anticorpo antifosfo-Rb (Ser 780) (Cell Signaling Inc.) em 25 mM de HEPES, ■ pH 7,0,24 mM de EDTA, 0,2 mg/ml de BSA. Após 30 minutos a 37°C, 15 μl/cavidade de 3 nM de IgG anticoelho rotulada por Lance-Eu-W1024 e 60 nM de anti-His6 conjugado de Aloficocianina (PerkinElmer Life Sciences) em 25 mM de Hepes, pH 7,0, 0,5 mg/ml de BSA foram adicionados. Seguindo uma incubação de uma hora a 37SC, 35 μl de cada cavidade, em duplicata, foram transferidos para placas pretas de 384 cavidades. As placas foram lidas utilizando leitoras ViewLux ou Victor V (PerkinElmer Life Sciences) utilizando um comprimento de onda de excitação de 340 nm e comprimentos de ondas de emissão dual de 615 nm e 665 nm. Valores de IC50 (a concentração de compostos testes reduzindo a leitura de fluorescência de controle de ensaio em 50%) foram primeiro calculados de leituras em rede em 665 nm, normalizados para leituras európio em 615 nm. Para inibidores competitivos de ATP, os valores de Ki foram calculados de acordo com a seguinte equação: Ki = IC50/(1 + S/Km) onde S refere-se à concentração de substrato e Km refere-se à constante de Michaelis-Menten.

Os ensaios de CDK1 e CDK2 foram similarmente conduzidos, exceto para pequenas diferenças em concentrações de reagente e proteína:

Os tampões de composto e enzima para ambos os ensaios con- tinham 10 mM de MgCfe. Para CDK1 e CDK2, as respectivas concentrações de ATP de reagente foram 162 μM e 90 μM. CDK1 em uma concentração de reagente de 0,15 ng/μl e CDK2 em uma concentração de reagente de 0,06 ng/μl foram utilizados. Concentrações de reagente de reagentes de detecção 5 foram ajustadas entre 3-12 nM de Eu-Ab e 60-90 nM de APC-antiis 6 para fornecer relações de sinal para base de pelo menos 10 para 1.

Exemplo 29 Ensaios com base em célula (ensaio de proliferação de tintura de tetrazólio) ("ensaio MTT")

Proliferação foi avaliada pelo ensaio de tintura de tetrazólio de acordo com o procedimento de Denizot e Lang (F. Denizot e R. Lang, J Immunol Meth(1986) 89:271-77). A linhagem celular utilizada foi HCT116, uma linhagem de célula de carcinoma colorretal obtida da American Type Cell Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). As células foram cultivadas em meio 5A de McCoy suplementado com FCS a 10% e L-glutamina.

As células foram semeadas na densidade de semeação apropriada para fornecer crescimento logarítmico durante o curso do ensaio em uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C em um incubador umidificado com 5% de CO2. No 20 próximo dia, os compostos testes foram serialmente diluídos para quatro vezes a concentração final no meio apropriado contendo 1,2% de DMSO. Um quarto do volume final de cada diluição foi adicionado em duplicata às placas contendo células. Os mesmo volume de 1,2% de DMSO em meio foi adicionado a uma fileira de "cavidades de controle" de modo que a concen- 25 tração final de DMSO em cada cavidade seja 0,3%. As cavidades às quais nenhuma célula foi adicionada serviram como o "vazio." As cavidades às quais nenhum inibidor foi adicionado serviram como "nenhum controle de inibidor."As placas foram voltadas para o incubador, e em determinados pontos do tempo (determinados por suas curvas de crescimento) as placas 30 foram analisadas como descrito abaixo.

Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (azul de tiazolila; MTT; Sigma) foi adicionado a cada cavidade para produzir uma concentração final de 1 mg/ml. As placas foram voltadas para o incubador por 2,5-3 horas a 379C. O meio contendo MTT foi removido e o metabolito de formazan resultante foi solubilizado em 100% de etanol com agitação durante 15 minutos em RT. Leituras de absorvência foram empregadas em uma leitura de placa de microtítulo (leitoras de placa Dynatech e Molecular Devices foram utilizadas alternadamente) em um comprimento de onda de 570 nm com uma referência de 650 nm. Inibição percentual (% INH) é calcu-lada subtraindo-se a absorvência da cavidade vazia de todas as cavidades, em seguida subtraindo a taxa da absorvência média de cada duplicata de teste (SAVE) Pθla média dos controles (CAVE) de 1,00. O número final é em seguida multiplicado por 100 (% INH = (1,00 - SAVE/CAVE) X 100). A concen-tração na qual 90% de inibição de proliferação celular é obtida (o IC90) é de-terminada a partir da regressão linear de um plote do logaritmo da concen-tração versus inibição percentual.

Células SW1353 adquiridas de American Tissue Culture Collection (ATCC) são cultivadas em uma placa de 6 cavidades em uma densidade de 3 x 105 células por cavidade contendo 2 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) suplementado com soro bovino fetal a 10% (Invitro- gen) até confluência a 37SC. As células são em seguida colocadas com meio livre de soro durante 2 hrs a 37eC. Matéria-prima de composto (10 mM) é diluída em dimetilsulfóxido (DMSO) e adicionada a cada cavidade como uma solução concentrada em 1000x em um volume de 3 μl, misturada e pré- incubada com células durante 30 minutos. O DMSO de veículo de composto é mantido em uma concentração final de 0,3% em todas as amostras. TNF (Roche Biochem) é adicionado como uma solução concentrada em 10x pre-parada em meios de crescimento e adicionada em um volume de 30 μl por cavidade com uma concentração final de 1 ng/ml em um volume total de 300 μl de meio livre de soro. Placas de célula são em seguida incubadas durante minutos a 37eC. Após a remoção de meios de célula, os lisados de célula são coletados em 120 μl de tampão de lise (Biosource). Concentrações de proteína para as amostras de lisado são determinadas por ensaio Lowry de acordo com instrução do fabricante (Bio-Rad).

Amostras de lisado de célula (15 μg de proteínas totais por a-mostra) são carregadas sobre gel Bis-Tris NuPAGE a 10% (Invitrogen) e transferidas para membrana de nitrocelulose (Invitrogen). A membrana é bloqueada em leite seco a 5% em 1xTBS durante 1 hora em RT. Para de- 5 terminar os níveis tanto de cJun fosforilado quanto total nas amostras, a membrana é simultaneamente sondada com anticorpos cJun anti-p-cjun de coelho e antitotal de camundongo (Cell Signaling) em tampão de bloqueio Odyssey (Li-cor) com 0,1% de Tween 20 (Roche Biochem) durante a noite a 49C.

A membrana é lavada 3 vezes em 1xPBS com 0,1% de Tween®

Como os anticorpos secundários, IgG anticamundongo de cabra IRDye 700 (Rockland) e IgG anticoelho de cabra IRDye 800 (Rockland) são utiliza-das em uma diluição de 1:6500 em tampão de bloqueio Odyssey. A mem-branaBlot é sondada e quantificada utilizando o Imageador Infravermelho Odyssey (Li-cor Cat. N9 9201).

As intensidades normalizadas de p-c-Jun vs c-Jun total são utili-zadas para cálculo de lC5o com o programa XlfitS de Microsoft Excel. O valor de IC50 é interpolado de um gráfico de concentração de inibidor vs. inibição percentual.

Exemplo 30 Ensaio de JNK in vitro

Atividade de JNK é medida por fosforilação de GST-ATF2 (1996) com [y-33P] ATP. A reação de enzima é conduzida em concentrações Km de ATP e o substrato em volume final de 40 μl em tampão contendo 25 mM 25 de Hepes, pH 7,5, 2 mM de ditiotreitol, 150 mM de NaCI, 20 mM de MgCh, 0,001% de Tween® 20, 0,1% de BSA e 10% de DMSO. Ensaio de JNK2a2 humano contém 1nM de enzima, 1 μM de ATF2, 8 μM de ATP com 1uCi [y- 33P] de ATP. Ensaio de JNKIod humano contém 2 nM de enzima, 1 μM de ATF2, 6 μM de ATP com 1 μCi [y-33P] de ATP. Ensaio de JNK3 humano 30 (Upstate Biotech #14-501M) contém 2 nM de enzima, 1 μM de ATF2, 4 μM de ATP com 1 μCi [y-33P] de ATP. O ensaio de enzima é realizado na presença ou ausência de dez concentrações de composto. JNK e composto são pré-incubados durante 10 minutos. Em seguida, a reação enzimática é inici-ada por adição de ATP e o substrato. A mistura reacional é incubada a 30sC durante 30 minutos. No final da incubação, a reação é terminada por transfe-rência de 25 μl da mistura reacional para 150 μl de suspensão de sefarose 5 de glutationa a 10% (Amersham # 27-4574-01) contendo 135 mM de EDTA.

O produto de reação é capturado sobre a resina de afinidade e lavado sobre uma placa de filtração (Millipore, MABVNOB50) com salina tamponada por fosfato durante seis vezes para remover radio nucleotídeo livre. Em seguida a incorporação de 33P em ATF2 é quantificada em uma contadora de cintila- 10 ção de microplaca (Packard Topcount). Potência de inibição de compost sobre JNK é medida por valor de IC50 gerado de curva de inibição de dez concentrações ajustada no modelo de 3 parâmetros: % de inibição = Máxi- mo/(1+ (IC5o/[lnibidor])'ncllnaçao). Os dados são analisados em Microsoft Excel para estimativa de parâmetro.

Exemplo 31 Ensaio de Produção de IL-6 Induzido por TNFα in vivo de Rato

Ratos Wistar-Han fêmeas obtidos de Charles River Laboratories são deixados aclimar durante uma semana antes do uso e alcançar um peso 5 corporal aproximado de 95-130g . Ratos são administrados de composto teste por meio de gavagem oral, injeção subcutânea ou injeção intravenosa (veia da cauda) 30 min antes de um desafio intraperitoneal de 0,5 μg de TNF-a de rato recombinante (Biosource). O sangue é coletado por meio de cardiocentese 90 min após o desafio de TNF-a. Plasma é preparado utili- 10 zando tubos de separação de heparina de lítio (BD microtainer) e congelado a -802C até ser analisado. Níveis de IL-6 são determinados utilizando um kit de ELISA de IL-6 específico de rato (Biosource). A inibição percentual e valores de ED50 (calculados como a dose de composto na qual produção de TNF-a é 50% do valor de controle) são determinados.

Exemplo 32 . Artrite induzida por coláqeno de Roedor

Ratos Lewis fêmeas obtidos de Harlan Laboratories em 7-8 se-manas de idade são deixados aclimar durante uma semana antes do uso e alcançar um peso corporal aproximado de 120-140 g . No dia 0 do estudo, 20 os ratos são injetados intradermicamente (i.d.) em diversos sítios no dorso com uma emulsão de 100 μg de Colágeno Tipo II Bovino (Chondrex) em adjuvante de Freund incompleto (IFA; total de 0,1 ml em 2-3 sítios). Indução de artrite é geralmente observada 12-14 dias de injeção; entretanto uma injeção fomentadora de 100 μg de colágeno/IFA é fornecida em torno de 7-10 dias (i.d. até 0,1 ml total) na base da cauda ou um sítio alternado no dorso para sincronizar a indução da doença. A dosagem do composto pode ser profilática (iniciando no momento do reforço ou 1-2 dias antes) ou terapêutica (começando após o reforço e coincidindo com escores de doença iniciais de 1-2 5 - veja escore clínico abaixo). Os animais são avaliados quanto ao desenvolvimento e progressão da doença durante os próximos 21 dias.

Os ratos são avaliados utilizando um sistema de escore (descrito abaixo), medidas de volume de pata utilizando um pletismômetro para cada pata, ou medindo-se a espessura da pata ou articulação com um compasso. 10 Medidas de base são realizadas no dia 0 e iniciando novamente nos primeiros sinais ou aumentando para até três vezes por semana até o final do experimento. O escore foi avaliado como segue para cada pata: 1 = inchaço e/ou vermelhidão da pata ou um dígito. 2 = inchaço em duas ou mais articulações. 3 = inchaço volumoso da pata com mais do que duas articula ções envolvidas. 4 = artrite severa da pata inteira e dígitos.

O índice artrítico para cada rato foi avaliado por adição dos quatro escores das patas individuais, fornecendo um escore máximo de 16. A 20 fim de serialmente medir o início e progressão da doença, o volume da pata das patas traseiras é também determinado através do uso de um pletismômetro.

No final do estudo, as patas traseiras (e outros tecidos) são cole-tadas para determinação do peso, histologia, análise celular e/ou molecular.

Adicionalmente, o sangue é coletado por meio de cardiocentese, plasma é preparado utilizando tubos de separação de heparina de lítio (BD microtai- ner) e congelado a -80sC até ser analisado. Níveis de citocina inflamatória (por exemplo, TNF-α, IL-1 e IL-6) do plasma ou de tecido de articulação ho-mogeneizado são determinados utilizando kits de ELISA específicos de rato (R&D). O nível de proteção ou inibição da doença é determinado como um compósito de mudanças em escores clínicos, volumes da pata e histopato- logia comparado para controlar animais.

Exemplo 33 . Ensaio de produção de IL-8 em células SW1353 de Condrossarcoma Huma- v no induzido por TNFa

Células SW1353 são adquiridas da American Tissue Culture Collection e mantidas em meios de crescimento consistindo em meio DMEM (Invitrogen) com soro bovino fetal a 10% (Invitrogen), ácidos ascórbico (Sig-ma) e penicilina (Invitrogen) sob a condição de cultura de 37eC em 5% de CO2. As células são semeadas em uma densidade de 1,0 x 104 células por cavidade em 100 μl de meios 48 horas antes do tratamento por composto. Imediatamente antes do tratamento por composto, os meios são substituídos com 160 μl de meios frescos. Matéria-prima de composto (10 mM) é diluída é em meios de crescimento e adicionada a cada cavidade como uma solução concentrada em 10x em um volume de 20 μl, misturada e deixada pré- incubar com células durante 30 minutos. O veículo composto (DMSO) é mantido em uma concentração final de 1% em todas as amostras. Após 30 minutos as células são ativadas com 10 ng/ml de TNF-α (Roche Biochem). TNF-a é adicionado como uma solução concentrada em 10x preparada em meios de crescimento e adicionada em um volume de 20 μl por cavidade. Placas de célula são cultivadas durante 5 horas. Meios celulares são colhi- dos e armazenados a -20°C. Alíquotas de meios são analisadas por ELISA sanduíche quanto à presença de IL-8 como pelas instruções do fabricante (BD Bioscience). Os valores de IC5o são calculados como a concentração do composto em que a produção de IL-8 foi reduzida para 50% do valor de con-trole utilizando Xlfit3 em programa Microsoft Excel. Certos compostos têm um valor de IC50 variando de 0,1-20 μM neste ensaio.

Claims (20)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula:

ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que R é um radical selecionado de:

cada Raé independentemente H, C1-C6 alquila; cada Rbé independentemente H, C1-C6 alquila; p é 1, 2, 3, ou 4; X é O, CR4R5, C(=O), ou S(O)x; R1é hidrogênio, halo, alquila; R4 é hidrogênio, Ci-C6alquila, -(CH2)nNR8R9-NR7-SO2-R10; R5é hidrogênio ou C1-C6 alquila; R10 é C1-C12 alquila, ou -NR8R9; R2 e R7 são cada qual independentemente hidrogênio ou C1-C6 alquila; R8 é hidrogênio, C1-C6 alquila, ou acila; R9 é hidrogênio ou C1-C6 alquila; m é 0 e x é um número inteiro de 0 a 2; Y é hidrogênio ou -(CH2)n-OR7; cada de y e z é independentemente 0 ou 1; e n é um número inteiro 0 a 4.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R2 é hidrogênio ou metila.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1é hidrogênio, metila, cloro, ou flúor.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X é CR4R5.

5. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R5é hidrogênio ou metila.

6. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que z é 1, e R4 é -NR7-SO2-R10

7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que R7 é hidrogênio ou metila, e R10 é metila, etila, ou -N(CH3)2.

8. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que z é 1, e R4 é hidrogênio, C1-6 alquila, ou -(CH2)nNR8R9

9. Composto de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que R4 é -(CH2)nNR8R9

10. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que n é 0 e R8 é hidrogênio, e R9 é hidrogênio.

11. Composto de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que R4 é hidrogênio, metila ou etila.

12. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 são hidrogênio, z é 0, y é 1, e Y é hidróxi na posição 3 da porção de anel de ciclopentila.

13. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 são hidrogênio, z é 1, y é 1, e Y é hidróxi, hidroximetila, ou grupo -CO2CH2CH3 na posição 2 da porção de anel de cicloexila.

14. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R é

z é 1, e X é O ou CR4R5.

15. Composto de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que R4 é-NR8R9, ou -NR7SO2R10.

16. Processo para fabricação dos compostos da fórmula (III),

caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de reação de compostos da fórmula (I),

ou compostos da fórmula (II),

com RNH2, em que R, R1 e R3 são como definidos na reivindicação 1 e Y é Cl ou SMe e Z é MeSO2 ou Cl.

17. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1 a 15 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

18. Uso do composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de medicamentos para o tratamento terapêutico e profilático de um distúrbio mediado por cinase N-terminal c-Jun.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o distúrbio mediado por cinase N-terminal c-Jun é distúrbio autoimune, distúrbio inflamatório, distúrbio metabólico, doença neurológica, ou câncer.

20. Uso de acordo com reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o distúrbio mediado por cinase N-terminal c-Jun é artrite reumatóide, asma, diabetes tipo II, doença de Alzheimer, doença de Parkinson ou acidente vascular cerebral.