BRPI0712459A2

BRPI0712459A2 - composiÇço farmacÊutica para tratamento de infecÇÕes virais e/ou doenÇas de tumor atravÉs de inibiÇço de dobra de proteÍna e degradaÇço de proteÍna

Info

Publication number: BRPI0712459A2
Application number: BRPI0712459-7A
Authority: BR
Inventors: Ulrich Schubert
Original assignee: Virologik Gmbh
Priority date: 2006-06-01
Filing date: 2007-06-01
Publication date: 2012-07-31
Also published as: CA2654276A1; AU2007267082A1; RU2008152796A; CN101453998A; JP2009538881A; ZA200810531B; MX2008015259A; DE102006026464A1; WO2007138116A2; KR20090048403A; IL195611A0; EP2029125A2; NO20085243L; WO2007138116A3; US20090156473A1

Abstract

COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE INFECÇÕES VIRAIS E/OU DOENÇAS DE TUMOR ATRAVÉS DE INIBIÇçO DE DOBRA DE PROTEÍNA E DEGRADAÇçO DE PROTEÍNA. A invenção refere-se a uma composição farmacêutica que contem pelo menos um inibidor de proteassoma e um inibidor de enzimas de dobramento de proteína como componentes ativos. Estes agentes são apropriados para tratamento de infecções agudas e crônicas por vírus que são patogênicos para humanos e animais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE INFECÇÕES VIRAIS E/OU DOENÇAS DE TUMOR ATRAVÉS DE INIBIÇÃO DE DOBRA DE PROTEÍNA E DEGRADAÇÃO DE PROTEÍNA"

Descrição

A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que contem pelo menos um inibidor de proteassoma e um inibidor de enzi- mas de dobra de proteína como componentes ativos. Estes agentes são a- propriados para tratamento de infecções agudas e crônicas por vírus pato- gênicos para humanos e animais. Tais vírus incluem em particular patóge- nos de doenças infecciosas tais como AIDS, hepatite, febre hemorrágica, SARS, varíola, sarampo, pólio ou gripe. A matéria objeto da invenção são agentes que por um lado contem inibidores de dobra de proteína como in- gredientes ativos. Eles incluem inibidores de enzimas de dobra celular (as enzimas chaperonas) assim como substâncias que interferem com dobra de proteína através de chaperonas químicas. Por outro lado, estes agentes con- têm componentes que interferem com o sistema ubiquitina - proteassoma, especialmente agentes que inibem o proteassoma 26S. Através de combi- nação destes agentes terapêuticos, pode ser possível interferir com a efici- ência de biossíntese de proteína e a degradação de proteínas impropriamen- te dobradas,separadamente uma da outra ou simultaneamente. Na soma destes efeitos, também pode ser possível sistematicamente prejudicar a via- bilidade de células de tumor degeneradas e/ou células agudamente e/ou cronicamente infectadas por vírus e assim direcionar as mesmas para morte de célula programada (apoptose). Áreas de aplicação são o tratamento de infecções virais e/ou doenças de tumor.

Técnica Anterior

Inibidores de enzimas de dobra de proteína são conhecidos de WO 2005/063281 A2.

Inibidores de proteassoma foram descritos para tratamento de doenças de tumor (por exemplo, US 6083903) e também para tratamento de infecções virais (WO 02/30455). Até agora uma combinação de inibidores de enzimas de dobra de proteína e inibidores de proteassoma não foi descrita. Somente a combi- nação de inibidores de protease que não são seletivos para proteassomas com inibidores) de enzimas de dobra de proteína foi mencionada em WO 2005/063281 A2.

Objeto da Invenção

O objeto da invenção foi prover novas composições farmacêuti- cas para tratamento de infecções virais e/ou doenças de tumor.

Realização do Objeto

O objeto foi realizado de acordo com as características das rei- vindicações. A combinação inventiva de inibidores de enzimas de dobra de proteína e inibidores de proteassoma é superior à técnica anterior. De acor- do com a invenção, foi provida uma composição farmacêutica que contem pelo menos um inibidor do sistema ubiquitina - proteassoma e um inibidor de sistemas de dobra de proteína como componentes ativos, ou um proces- so para influenciar dobra de proteína.

O inibidor de enzimas de dobra de proteína é preferivelmente pelo menos um inibidor de chaperonas celulares ou pelo menos uma subs- tância química que influencia diretamente dobra de proteína (anti-chaperona química).

Hipertermia local é preferivelmente usada como um processo para influenciar dobra de proteína.

Ainda uma realização preferida da invenção compreende uso, como inibidores de chaperonas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que

a) inibem, regulam ou de outro modo influenciam a dobra e ma- turação proteolítica de proteínas de vírus e pelo que inibem a liberação e replicação de vírus, especialmente de patógenos de doenças infecciosas como AIDS, hepatite, febre hemorrágica, SARS, varíola, sarampo, pólio ou gripe,

ou

b) interferem com a proliferação de células degeneradas, espe- cialmente células de tumor, através de direcionamento das mesmas para morte de célula programada devido a acumulação de proteínas dobradas incorretamente.

A composição farmacêutica inventiva é caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de chaperonas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que influenciam especialmente as atividades enzimá- ticas de enzimas de dobra molecular das células hospedeiras. As células de eucariotes superiores absorvem estes inibidores ou substâncias e, após ab- sorção por célula, bloqueiam a dobra de proteína de proteínas estruturais virais e de proteínas de células de tumor. Os inibidores ou substâncias po- dem ser administrados in vivo em várias formas orais, intravenosas, intra- musculares ou subcutâneas, ou em forma encapsulada, com ou sem mu- danças que implicam especificidade de célula, têm baixa citotoxidez em vir- tude do uso de uma aplicação bem definida e/ou regime de dosagem, não disparam nenhum ou somente leves efeitos colaterais, têm uma meia - vida metabólica relativamente longa e exibem uma taxa de depuração relativa- mente lenta no organismo.

A composição farmacêutica inventiva é ainda caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de chaperonas celulares ou de anti- chaperonas químicas, substâncias que

a) são isoladas em forma natural de microorganismos ou outras fontes naturais, ou

b) são formadas de substâncias naturais através de modifica- ções químicas, ou

c) são produzidas através de processos completamente sintéticos, ou

d) são sintetizadas in vivo através de processos de terapia de gene.

Os inibidores de chaperonas celulares ou as anti-chaperonas químicas interferem com os processos altamente organizados de montagem e maturação proteolítica de proteínas estruturais virais e pelo que suprimem a liberação e produção de progênie infecciosa de vírus. Além disso, estas substâncias regulam, interferem com ou bloqueiam a dobra de proteínas vi- rais e/ou de proteínas específicas de tumor através de interferência com os processos posteriores de replicação de vírus, tais como montagem, brota- mento, maturação proteolítica e liberação de vírus. O processamento proteo- lítico de proteínas precursoras de poli - proteínas virais é pelo que interferi- do. Além disso, a atividade de proteases virais é bloqueada.

Ainda uma realização preferida da invenção compreende uso, como inibidores de chaperonas celulares ou de anti-chaperonas química, substâncias que interferem com as atividades de proteases celulares e/ou de enzimas, tais como ligases, cinases, hidrolases, enzimas de glicosilação, fosfatases, DNAses, RNAses, helicases e transferases, que estão envolvi- das em maturação de vírus. Os inibidores inventivos de chaperonas celula- res ou as anti-chaperonas químicas possuem uma ampla faixa de ação e por isso podem ser usados como novos virostáticos de amplo espectro para pre- venção e/ou para terapia de diferentes infecções virais.

A composição farmacêutica é caracterizada em que ali são usa- das, como inibidores de chaperonas celulares ou de anti-chaperonas quími- cas, substâncias que bloqueiam ou inibem chaperonas celulares tais como proteínas de choque térmico (hsp), especialmente as atividade das proteínas de choque térmico Hsp27, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp72, Hsp90, Hsp104 e Hsc70.

Como inibidores de chaperonas celulares ali podem ser usadas substâncias que pertencem à seguintes classes de substâncias e seus deri- vados: geldanamicina (inibe Hsp90), radicicol (inibidor de tirosina cinase; inibe Hsp90), desoxispergualina (inibe Hsc70 e Hsp90), 4-PBA (butirato de 4-fenila; regulação descendente de expressão de proteína e ARNm de Hsc70), herbimicina A (inibidor de tirosina cinase com indução de Hsp72/73), epolactaeno (inibidor de Hsp60), Scythe and Reaper (inibe Hsp70), artemisi- nina (inibidor de Hsp90), CCT0180159 (como um inibidor de pirazol de Hsp90) e SNX-2112 (inibidor de Hsp90), radanamicina (quimera de macrolí- deo de radicicol e geldanamicina), novobiocina (inibidor de Hsp90), querceti- na (inibidor de expressão de Hsp70) Como anti-chaperonas químicas ali podem ser usadas substân- cias que regulam, interferem com ou bloqueiam a conformação e dobra de proteína de vírus e/ou proteínas específicas de tumor. Elas incluem substân- cias tais como glicerol, trimetilamina, betaína, trealose, ou água deuterada (D2O). Além disso, ali podem ser usadas substâncias que são apropriadas para o tratamento, terapia e inibição de infecções com diferentes vírus que são patogênicos para humanos ou animais, ou substâncias que são apropri- adas para o tratamento, terapia e inibição de infecções com patógenos de doenças infecciosas crônicas como AIDS (HIV-1 e HIV-2), de hepatite (HCV e HBV), do patógeno de "Síndrome Respiratória Aguda Severa" (SARS), ou em outras palavras o SARS CoV (vírus corona), de vírus de sarampo, de patógenos de febre hemorrágica viral (VHF), tal como o vírus Ebola, que são representativos da família Filoviridae, e patógenos de gripe como o vírus de influenza A. Elas incluem, por exemplo, ciclosporina A e/ou tacrolimus.

A composição farmacêutica inventiva é ainda caracterizada em que os inibidores de UPS compreendem pelo menos uma substância que

a) na forma de inibidores de proteassoma influencia as ativida- des enzimáticas do completo complexo proteassoma 26S e da estrutura de proteassoma cataliticamente ativa 20S livre que não é montada com subuni- dades reguladoras, ou

b) inibe especialmente a ação de ubiquitina ligases, ou

c) inibe especialmente a ação de ubiquitina hidrolases, ou

d) inibe especialmente a ação de enzimas de ativação de ubiquitina, ou

e) inibe especialmente a mono - ubiquitinilação de proteínas, ou

f) inibe especialmente a poli - ubiquitinilação de proteínas.

Os inibidores de proteassoma são absorvidos por eucariotes su- periores e, após absorção em célula, interagem com as subunidades catalíti- cas do proteassoma e assim bloqueiam todas ou individuais atividades pro- teolíticas do proteassoma - a tripsina, a quimiotripsina e/ou atividades hidro- lizantes de peptídeo pós-glutamila - dentro de complexo proteassoma 26S ou mesmo o 20S irreversivelmente ou reversivelmente. Como inibidores de proteassoma ali são usadas substâncias que

c) são produzidas através de processos completamente sintéti- cos, ou

d) são sintetizadas in vivo através de processos de terapia gené- tica, ou

e) são produzidas in vitro por processos de engenharia genética,

ou

f) são produzidas em microorganismos.

Os inibidores de proteassoma são compostos que pertencem às seguintes classes de substâncias:

a) inibidores de proteassoma ocorrendo naturalmente:

. derivados de peptídeos que contêm estruturas epóxi cetona terminal-C, ou

. derivados de beta-lactona, ou

. aclacinomicina A (também conhecida como aclarubicina), ou lactacistina e suas variantes modificadas químicas, tais como a variante penetrante em membrana "clasto-lactacisteína beta-lactona"

b) inibidores de proteassoma produzidos sinteticamente:

. peptídeo aldeídos modificados como N-carbo benzoxi-L- leucinil-L-leucinil-L-leucinal (também conhecido como MG132 ou zLLL), seu 25 derivado de ácido bórico MG232; N-carbo benzoxi-Leu-Leu-Nva-H (designa- do MG115; N-acetil-L-leucinil-L-leucinil-L-norleucinal (designado LLnL), N- carbo benzoxi-lle-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (também conhecido como PSI);

c) peptídeos que contêm estruturas alfa,beta-epoxi cetona termi- nal-C, e também vinil sulfonas como carbo benzoxi-L-leucinil-L-leucinil-L- leucina vinil sulfona ou 4-hidroxi-5-iodo-3-nitro fenil lactetil-L-leucinil-L- leucinil-L-leucina vinil sulfona (NLVS);

d) grupo ácido bórico ou glioxálico tais como . pirazil-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutil)B(OH)2) assim como

. derivados de ácido dipeptidil bórico ou

e) pinacol ésteres tais como benziloxi carbonil(Cbz)-Leu-Leu- boroLeu pinacol ésteres.

Inibidores de proteassoma particularmente são as epóxi cetonas epoxomicina (epoxomicina, fórmula molecular: C28H86N4O7) e/ou eponemici- na (eponemicina, fórmula molecular: C20H36N2O5) ou inibidores de proteas- soma das séries PS de compostos:

a) PS-519 como a beta-lactona e também como o derivado de lactacistina o composto 1 R-[1 S,4R,5S]}-1 -(1 -hidroxi-2-metil propil)-4-propil-6- oxa-2-azabiciclo[3.2.0] heptano-3,7-diona, fórmula molecular: Ci2H19NO4,

e/ou

b) PS-314 como o derivado de ácido peptidil bórico o composto ácido N-pirazino carbonil-L-fenil alanin-L-leucina bórico, fórmula molecular: C19H25BN4O4, e/ou

c) PS-273 (morfolin-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)- B(OH)2) e seu enantiômero PS-293, e/ou

d) o composto PS-296 (8-quinolil sulfonil-CONH-(CH-naftil)- CONH(-CH-isobutil)-B(OH)2), e/ou

e) PS-303(NH2(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2), e/ou

f) PS-321 como (morfolina-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-fenil alanina)-B(OH)2), e/ou

g) PS-334 (CH3-NH-(CH-naftil-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2), e/ou

h) o composto PS-325 (2-quinol-CONH-(CH-homo-fenil alanina)- CONH-(CH-ISobutiI)-B(OH)2), e/ou

i) PS-352 (fenil alanina-CH2-CH2-CONH-(CH-fenil alanina)- CONH-(CH-isobutil)-1 -B(OH)2), e/ou

j) PS-383 (piridil-CONH-(CHpF-fenil alanina)-CONH-(CH- isobutil)-B(OH)2)

são usados.

As composições farmacêuticas descritas são apropriadas como produtos medicinais ou para produção de agentes para o tratamento de in- fecções virais e/ou doenças de tumor. Combinação com outros agentes para tratamento de infecções virais e/ou doenças de tumor também é possível.

Estes agentes podem ser usados de acordo com a invenção na forma de

. inalações

. formas depósito

. emplastros

. em sistemas micro-eletrônicos ("pílulas inteligentes")

É também possível o uso em oncologia e/ou oncologia e virolo- gia para tratamento de

. glioblastoma (tumores malignos de cérebro)

. CA de mama (CA = câncer)

. CA de cabeça, pescoço

. CA epitelial escamoso

. CA de ovário

. CA bronquial (célula pequena, célula grande)

. CA de tiróide

. CA de pulmão

. CA de cólon

. CA pancreático

. leucemia (AML, ALL, CML, CLL)

. mielóica aguda, crônica

. linfática aguda, crônica

. linfoma (não-Hodgkins)

. CA cervical

. neuroblastoma

. CA de pele (melanoma)

. CA de prostate

. CA de bexiga

. sarcoma (osso e polpa)

. CA frênico

. CA gastrointestinal (tal como estômago, esôfago) . CA testicular

. metástases (tal como medula óssea)

. vírus linfoma

. herpes simplex

. citomegalia

. varíola

. varicella zoster

. sarampo

. febre de Lassa

. AIDS

. caxumba (-meningite, -orquite)

. enterite; gripe (todas as formas)

. encefalite

. hepatite (A, B, C1 D, E, G)

. sarampo Alemão

. Coxsackie B

. pólio (-mielite)

. encéfalomielite

. pancreatite

. pneumonia

. miocardite

. doenças tropicais (virais)

. todos os vírus de ADN e ARN de fita simples e fita dupla que são patogênicos para humanos.

Surpreendentemente, foi verificado que proteínas com dobra- mento extensivo deficiente são formadas através de interferência com os mecanismos de dobra de proteína. Estes produtos deficientes de biossíntese de proteína são normalmente degradados pelo sistema ubiquitina- proteas- soma (UPS) e assim são removidos do metabolismo de célula. Durante inibi- ção do UPS, por exemplo através de inibidores de proteassoma e/ou através de inibidores de ubiquitina ligases, estes produtos deficientes de biossíntese de proteína, que são usualmente poli ubiquitinilizadose impropriamente do- brados, se acumulam na célula e pelo que disparam diversas interferências com o metabolismo de célula. A soma dos efeitos destas interferências dire- cionará a célula em questão preferencialmente para morte programada de célula (apoptose). Uma vez que a taxa de biossíntese de proteína é particu- larmente alta em células de tumor dividindo-se rapidamente e infectadas com vírus, tais células em particular reagirão fortemente à ação de inibidores do UPS e de dobramento de proteína, enquanto células normais e saudáveis permanecerão grandemente não-afetadas por estes inibidores. É sobre este princípio que o mecanismo fundamental de ação do novo processo terapêu- tico proposto de acordo com a invenção é baseado.

Em uma particular realização da invenção, o efeito destes inibi- dores é usado para tratamento de células de plasmacitoma de pacientes com mieloma múltiplo. Estes tumores de célula-B são caracterizados por uma taxa extremamente alta de síntese de imunoglobulinas. É conhecido que estas células plasmacitoma são particularmente sensíveis a tratamento com inibidores de proteassoma. Assim inibidores de proteassoma, especial- mente na forma de peptídeos de ácido bórico (nome comercial Velcade) têm sido usados com sucesso para o tratamento de mieloma múltiplo. Não obs- tante, deve-se ter em mente que existe uma janela terapêutica muito estreita para tratamento com inibidores de proteassoma, uma vez que o limite entre a dose terapêutica e a dose tóxica tolerável é muito estreita. Em virtude do tratamento com inibidores de dobramento de proteína, tais células plasmaci- toma são sensibilizadas para ação sobre inibidores de proteassoma. A com- binação de inibidores de proteasssoma e inibidores de dobramento de prote- ína faz com que o efeito de ambos ingredientes sejam potencializados siner- gisticamente. Ao mesmo tempo, as duas medicações podem ser usadas em doses sub-tóxicas com maior eficácia, assim no total aumentando substanci- almente as perspectivas de sucesso da terapia.

A solução inventiva oferece as seguintes vantagens comparada com a técnica anterior:

. evita resistências

. cura de certas doenças . maior taxa de resposta

. tratamento de várias formas de tumor (casos suaves, modera- dos, severos)

Ainda uma realização preferida da invenção refere-se à ação anti-viral quando os dois ingredientes ativos são combinados. É conhecido que inibidores de proteassoma interferem com a replicação de vírus de imu- no deficiência humana (HIV) e outros vírus, induzindo acumulação de proteí- nas Gag dobradas impropriamente, assim interferindo com os ordenados processos de montagem e liberação de vírus progênie. Esta ação terapêuti- ca de inibidores de proteassoma é grandemente potencializada quando a célula infectada com vírus é tratada simultaneamente com inibidores de do- bramento de proteína. Pelo que o número de proteínas estruturais dobradas impropriamente do vírus é aumentado, assim intensivamente interferindo com a montagem de proteínas virais e pelo que a formação de vírus de pro- gênie em um mecanismo trans-negativo, ou em outras palavras um modo de ação semelhante a príon. Esta realização da invenção é genericamente váli- da para todas as infecções virais nas quais ocorre montagem ordenada de proteínas estruturais virais re-sintetizadas.

A invenção será explicada em mais detalhes nas bases de reali- zações exemplares, sem ser limitada a estes exemplos.

Realizações Exemplares

Exemplo 1: O inibidor de Hsp90 17-AAG em uma concentração de até 10 nM não exibe qualquer citotoxidez em células CEM

Células de linfa CD4+ T (células CEM) foram semeadas em uma placa de 96 cavidades em uma densidade de 1x104 células por 100 μL. A- propriadas quantidades de 17-AAG foram adicionadas ao meio anteriormen- te (ver Exemplo 4a), para atingir concentrações finais de 1 μΜ, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM e 0,01nM de 17-AAG. Após 30 horas de incubação a 37°C e 5% CO2, 10 μL de AlamarBlue (Invitrogen) foram adicionados e todas as preparações foram incubadas a 37°C por ainda 4 horas. Foi possível deter- minar um critério para a viabilidade das células CEM (reportada em MTT CEM) sob a influência de 17-AAG através de medição de mudança de cor do meio usando medição de fluorescência em 530/590 nm. Preparações em triplicata foram usadas em todos os casos.

Exemplo 2: Sob a influência de 17-AAG. células HeLaSS6 transfectadas com pNLenvl exibem reduzido processamento de Gaq na fração vírus e in- tensificada expressão de Hsp70 na fração célula.

Cinéticas de tempo foram estudadas para análise bioquímica da influência de 17-AAG sobre as cinéticas de processamento de Gag e libera- ção de vírus. Os detalhes experimentais de cultura, transfecção, troca de meios e cinéticas de tempo são reportadas no Exemplo 4 a/b. Para este pro- pósito foram usadas culturas de células HeLaSS6 que foram transfectadas com pNLenvl (Schubert et al., 1995). Seguindo incubação em meio conten- do 17-AAG (17-AAG 100 nM) ou meio isento de inibidor, os estudos de ciné- ticas foram iniciados após distintas etapas de lavagem e obtenção de alíquo- tas das preparações. Alíquotas de culturas de células foram tomadas em cada tempo e separadas em frações de células, vírus e sobrenadante de cultura de células através de centrifugação. As proteínas de HIV foram sepa- radas por SDS PAGE1 transferidas sobre membranas de PVDF e então fei- tas visíveis sobre filmes de raios-x através de quimioluminescência mediada por anticorpo.

Exemplo 3: 17-AAG e também a combinação com PS341 inibe a replicacão de vírus X4-trófico Hl no modelo HLAC.

Amígdalas humanas foram maceradas e transferidas para pla- cas de 96 cavidades. Após um dia de incubação, as células foram infectadas com vírus X4-trófico Hl, misturadas com os correspondentes inibidores e lavadas no dia seguinte. Estas e também as etapas subseqüentes são des- critas em detalhes sob Exemplo 4 c-d. Em cada ponto cinético, 150 μι. de meio foram removidos e estocados a -80°C até medição em temperatura ambiente. O meio que foi novamente adicionado conteve as concentrações de inibidor necessárias para a preparação especial.

Após 15 dias, a proporção de vírus Hl funcionais formada foi de- terminada por meio de ensaios RT (ver Exemplo 4e) dos sobrenadantes es- tocados. Exemplo 4: Material e Processos

Exemplo 4a: Cultura de Células

Células CEM foram cultivadas em RPMI 1640 com 10% (VA/) soro de bezerro fetal, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mL e streptomicina 100 Mg/m L.

Células HeLa (ATCC CCL2) foram cultivadas em meio Eagle's modificado Dulbeccos' (DMEM) com soro fetal de bezerro10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mLe streptomicina 100 pg/mL.

Células de amígdalas foram cultivadas em RPMI 1640 com soro fetal de bezerro 15% (V/V), L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mL, strepto- micina 100 pg/mL, Fungizona 2,5 pg/mL, pirovato (??) de sódio 1 mM, solu- ção de aminoácido não - essencial MEM 1% e gentanamicina 50 pg/mL ("meio amígdala").

Exemplo 4b: Transfecção, troca de meios e cinéticas

Células HeLa (ATCC CCL2) foram transfectadas usando uma mistura de pNLAenv e lipofectamina2000 em OPTI-MEM. Uma troca de mei- os foi empreendida após 8 horas de incubação a 37°C e 5% CO2. Em uma das duas preparações, a concentração final de 100 nM de 17-AAG foi adi- cionada ao meio, que foi incubado por ainda 16 horas. Após distintas etapas de lavagem em PBS, alíquotas foram tomadas nos tempos correspondentes. Nos tempos correspondentes, as células foram separadas do sobrenadante por centrifugação (5 minutos; 50000 rpm) e depois foram lisadas por meio de lise CHAPS/DOC (3 minutos sobre gelo). Os VLPs no sobrenadante foram feitos pelotas sobre uma almofada de sucrose 20% (90 minutos; 14000 rpm) e, da mesma maneira como os lisatos das pelotas de células, foram separa- dos por meio de SDS PAGE 10%, transferidos por mancha úmida para membranas de PVDF e bloqueados em leite em pó 10% (em PBS / Tween 0,1%). As proteínas específicas de célula e específicas de HIV foram detec- tadas via anticorpos específicos (para Hsp70; Hsp90; p24; PR55; beta- actina). Por meio de reação com anticorpos secundários e sua quimiolumi- nescência acoplada, foi possível detectar os sinais sobre filmes de raios-x.

Exemplo 4c: Transfecção e extração de estoques de vírus Para produzir preparações de vírus, ADN plasmídeo de ADN de HIV-1 molecular foi transfectado em células HeLa usando o processo de precipitação com fosfato de cálcio. Para este propósito, culturas confluentes de células HeLa (5x106 células) foram incubadas com 25 pg de ADN plasmí- deo em cristais de fosfato de cálcio, produzidos de acordo com um processo de Graham e van der Eb (1973), então submetidas a choque de glicerol de acordo com Gorman et al. (1982). Para obter preparações concentradas de vírus, os sobrenadantes de cultura de células foram colhidos dois dias após transfecçao. A seguir as células assim como seus constituintes foram sepa- radas por centrifugação (1000 g, 5 minutos, 4°C) e filtração (tamanho de po- ro de 0,45 pm). Partículas de vírus foram pelotizadas por ultracentrifugação (rotor Beckman SW55, 1,5 horas, 35000 rpm, 10°C) e então re-suspensas em 1 mL de meio DMEM. As preparações de vírus foram esterilizadas por filtração (tamanho de poro de 0,45 pm) e foram congeladas em porções (- 80°C). Preparações de vírus individuais foram padronizadas através de de- terminação da atividade de transcriptase reversa, especificamente nas bases de um teste já descrito (Willey et al., 1988), usando incorporação de [32P]- TTP em um molde oligo(dT)-poli(A).

Exemplo 4d: Modelo HLAC (extração, infeccão, cinéticas)

O tecido de amígdalas foi lavado em PBS, então limpo de coá- gulos de sangue e cortado em peças medindo 1 a 2 mm2 com o escalpelo. Células individuais foram obtidas por prensagem mecânica através de uma tela de peneira. Seguindo centrifugação das células isoladas (5 minutos, 1200 rpm), as células foram contadas, semeadas em placas de 96 cavida- des e incubadas por toda noite a 37°C e 5% de CO2. Infecção das células foi obtida pela adição de 10 ng de estoques de HIV X4-trófico e simultânea apli- cação das correspondentes concentrações de inibidor. No dia seguinte, 50 pL de sobrenadante foram retirados ("1dpi") e estocados a -80°C. Com o que as células foram centrifugadas (5 minutos, 1200 rpm) e ainda 50 pL de so- brenadante foram retirados. Seguindo re-suspensão das células em 100 pL de meio amígdala, esta etapa de lavagem foi repetida duas vezes.

Meio amígdala com as correspondentes contrações de inibidor foram adicionados e então as células foram re-incubadas a 37°C e 5% de CO2. Nos dias 3, 6, 9 e 12, 150 μΙ_ de meio foram retirados e estocados a - 80°C, e 150 μί de meio com as correspondentes concentrações de inibidor foram adicionados. No dia 15, somente 150 μί de sobrenadante foram re- movidos e estocados a -80°C, após o que as células foram descartadas.

Exemplo 4e: Ensaio RT

Os sobrenadantes de amígdalas estocados a -80°C foram en- saiados através de determinação da atividade de transcriptase reversa, es- pecificamente nas bases de um teste já descrito (Willey et al., 1988), usando incorporação de [32P]-TTP em um molde oligo(dT)-poli(A).

Títulos de Figuras

Figura 1:

Até uma concentração de 10 nM, o 17-AAG inibidor de Hsp90 não exibe qualquer citotoxidez em células CEM. Células de Iinfa CD4+ T (cé- lulas CEM) foram incubadas com várias concentrações de 17-AAG e a mu- dança de cor dependente de tempo, que corresponde ao número de células viáveis, foi determinado por meio de medição de fluorescência após adição de AlamarlIue (Invitrogen).

Figura 2:

Sob a influência de 17-AAG, células HeLaSS6 transfectadas com vetor de expressão de HIV-1 sub-genômico pNLenvl exibiu reduzido processamento Gag na fração de vírus e intensificada expressão de Hsp70 na fração de células.

Figura 3:

Efeito antiviral de 17-AAG sozinho e também em combinação com o inibidor de proteassoma PS341 versus vírus Hl X4-trófico no modelo HLAC, plotado sobre as bases dos dados RT dos respectivos pontos cinéti- cos de duas amígdalas diferentes (A e B).

Replicação dos vírus Hl X4-tróficos em amígdala A(A) não foi claramente influenciada tanto por incubação com PS341 inibidor de proteas- soma 1 nM, 17-AAG 1 nM ou 17-AAG 10 nM. Somente a combinação das duas substâncias (PS341 5 nM e 17-AAG 1 nM) obteve uma clara diminui- ção de replicação de vírus. Neste sentido, foi verificado que este efeito aditi- vo durante aplicação de ambas substâncias ainda pode ser potencializada por uma maior concentração de 17-AAG inibidor de Hsp90 (10 nM). Amígda- la B (B) também não exibe qualquer influência sobre replicação de HIV X4- trófico durante incubação com PS341 1 nM ou 17-AAG 1 nM. Em contraste a amígdala A, uma distinta redução de replicação de vírus em amígdala B já foi verificada através de adição de 17-AAG 10 nM. Para todas as combina- ções de inibidor de proteassoma PS341 com 17-AAG inibidor de Hsp90, não foi mais possível detectar qualquer replicação de vírus.

Claims

1. Composição farmacêutica que contem pelo menos um inibidor do sistema proteassoma - ubiquitina e um inibidor de enzimas de dobramen- to de proteína como componentes ativos.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada em que o inibidor de enzimas de dobramento de proteína é pelo menos um inibidor de chaperonas celulares ou pelo menos uma subs- tância química que influencia diretamente dobramento de proteína (anti- chaperona química).

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de chaperonas celula- res ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que a) inibem, regulam ou de outro modo influenciam a dobra e ma- turação proteolítica de proteínas de vírus e pelo que inibem a liberação e replicação de vírus, especialmente de patógenos de doenças infecciosas como AIDS, hepatite, febre hemorrágica, SARS, varíola, sarampo, pólio ou gripe, ou b) interferem com a proliferação de células degeneradas, espe- cialmente células de tumor, através de direcionamento das mesmas para morte de célula programada devido a acumulação de proteínas dobradas incorretamente.

4. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindica- ções 2 ou 3, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que influen- ciam especialmente as atividades enzimáticas de enzimas de dobramento das células hospedeiras.

5. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindica- ções 2 ou 3, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que são ab- sorvidas pelas células de eucariotes superiores e, após absorção pela célu- la, bloqueiam o dobramento de proteína de proteínas estruturais virais e de proteínas de células de tumor.

6. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindica- ções 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de chape- ronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que são admi- nistradas em várias formas in vivo oral, intravenosa, intramuscular ou subcu- tânea, ou em forma encapsulada, com ou sem mudanças que influenciam especificidade de célula, têm baixa citotoxidez em virtude do uso de um re- gime de dosagem e/ou aplicação bem definido, não disparam nenhum ou insignificantes efeitos colaterais, têm uma meia vida metabólica relativamen- te longa e exibem uma taxa de depuração relativamente lenta no organismo.

7. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindica- ções 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de chape- ronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que a) são isoladas em forma natural de microorganismos ou outras fontes naturais, ou b) são formadas de substâncias naturais através de modificação química, ou c) são produzidas através de processos completamente sintéti- cos, ou d) são sintetizadas in vivo através de processos terapêuticos genéticos.

8. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindica- ções 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de chape- ronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que interferem com os processos altamente organizados de montagem e maturação proteo- lítica de proteínas estruturais virais e pelo que suprimem a liberação e pro- dução de vírus de progênie infecciosos.

9. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindica- ções 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de chape- ronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que regulam, interferem com ou bloqueiam o dobramento de proteínas virais e/ou de pro- teínas específicas de tumor.

10. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que interfe- rem com os processos de replicação de vírus, como montagem, brotamento, maturação proteolítica e liberação de vírus.

11. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que interfe- rem com o processamento proteolítico de proteínas precursoras de poliprote- ínas virais.

12. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que bloquei- am a atividade de proteases virais.

13. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que interfe- rem com as atividades de proteases celulares e/ou de enzimas, tais como ligases, cinases, hidrolases, enzimas de glicosilação, fosfatases, DNAses, RNAses, helicases e transferases, que estão envolvidas em maturação de vírus.

14. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que possu- em uma ampla faixa de ação e por isso podem ser usadas como novos vi- rostáticos de amplo espectro para prevenção e/ou para terapia de diferentes infecções virais.

15. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que bloquei- am chaperonas celulares tais como proteínas de choque térmico (hsp).

16. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que inibem as atividades das proteínas de choque térmico Hsp27, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp72, Hsp73, Hsp90, Hsp104 e Hsc70.

17. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares, substâncias que pertencem às seguintes classes de substâncias e seus derivados: geldanamicina (inibe Hsp90), radicicol (inibi- dor de tirosina cinase; inibe Hsp90), desoxispergualina (inibe Hsc70 e Hsp90), 4-PBA (butirato de 4-fenila; regulação descendente de expressão de proteína e ARNm de Hsc70), herbimicina A (inibidor de tirosina cinase com indução de Hsp72/73), epolactaeno (inibidor de Hsp60), Scythe and Reaper (inibe Hsp70), artemisinina (inibidor de Hsp90), CCT0180159 (como um ini- bidor de pirazol de Hsp90) e SNX-2112 (inibidor de Hsp90), radanamicina (quimera de macrolídeo de radicicol e geldanamicina), novobiocina (inibidor de Hsp90), quercetina (inibidor de expressão de Hsp70)

18. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas celulares, substâncias que regulam, interferem com ou bloqueiam a conformação e dobramento de proteína de proteínas virais e/ou específicas de tumor.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada em que ali são usadas, como anti-chaperonas químicas, subs- tâncias tais como glicerol, trimetil amina, betaína, trealose, ou água deutera- da (D2O).

20. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações - 18 e 19, caracterizada em que ali são usadas, como anti-chaperonas quími- cas, substâncias que são apropriadas para o tratamento, terapia e inibição de infecções com diferentes vírus que são patogênicos para humanos ou animais.

21. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de cha- peronas moleculares ou de anti-chaperonas químicas, substâncias que são apropriadas para o tratamento, terapia e inibição de infecções com patóge- nos de doenças infecciosas crônicas tais como AIDS (HIV-1 e HIV-2), de hepatite (HCV e HBV), do patógeno de "Síndrome Respiratória Aguda Seve- ra" (SARS), o SARS CoV (vírus corona), de vírus de sarampo, de patógenos de febre hemorrágica viral (VHF), tal como o vírus Ebola, que são represen- tativos da família Filoviridae, e patógenos de gripe como o vírus de influenza A.

22. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 2 a 5, caracterizada em que ali são usadas ciclosporina A e/ou tacro- limus.

23. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada em que os inibidores de UPS compreendem pelo menos uma substância que a) na forma de inibidores de proteassoma influencia as ativida- des enzimáticas do completo complexo proteassoma 26S e da estrutura de proteassoma cataliticamente ativa 20S livre que não é montada com subuni- dades reguladoras, ou b) inibe especialmente a ação de ubiquitina ligases, ou c) inibe especialmente a ação de ubiquitina hidrolases, ou d) inibe especialmente a ação de enzimas de ativação de ubiqui- tina, ou e) inibe especialmente a mono - ubiquitinilação de proteínas, ou f) inibe especialmente a poli - ubiquitinilação de proteínas.

24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada em ali são usadas substâncias que, como inibidores de prote- assoma, são absorvidas por eucariotes superiores e, após absorção por cé- lula, interagem com as subunidades catalíticas do proteassoma e assim blo- queiam todas ou individuais atividades proteolíticas do proteassoma - as atividades hidrolizantes de peptídeo pós-glutamila e/ou a quimiotripsina, a tripsina - dentro de complexo proteassoma 26S ou mesmo o 20S irreversi- velmente ou reversivelmente.

25. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de proteasso- ma, substâncias que a) são isoladas em forma natural de microorganismos ou outras fontes naturais, ou b) são formadas de substâncias naturais através de modifica- ções químicas, ou c) são produzidas através de processos completamente sintéti- cos, ou d) são sintetizadas in vivo através de processos de terapia de gene, ou e) são produzidas in vitro através de processos de engenharia genética, ou f) são produzidas em microorganismos.

26. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi- cações 23 a 25, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de proteassoma, substâncias que pertencem às seguintes classes de substân- cias: a) inibidores de proteassoma ocorrendo naturalmente: derivados de peptídeos que contêm estruturas epóxi cetona terminal-C, ou . derivados de beta-lactona, ou . aclacinomicina A (também conhecida como aclarubicina), ou . lactacistina e suas variantes modificadas químicas, tais como a variante penetrante em membrana "clasto-lactacisteína beta-lactona" b) inibidores de proteassoma produzidos sinteticamente: . peptídeo aldeídos modificados como N-carbo benzoxi-L- leucinil-L-leucinil-L-leucinal (também conhecido como MG132 ou zLLL), seu derivado de ácido bórico MG232; N-carbo benzoxi-Leu-Leu-Nva-H (designa- do MG115; N-acetil-L-leucinil-L-leucinil-L-norleucinal (designado LLnL), N- carbo benzoxi-lle-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (também conhecido como PSI); c) peptídeos que contêm estruturas alfa,beta-epoxi cetona termi- nal-C, e também vinil sulfonas como carbo benzoxi-L-leucinil-L-leucinil-L- leucina vinil sulfona ou 4-hidroxi-5-iodo-3-nitro fenil Iactetil-L-Ieucinil-L- leucinil-L-Ieueina vinil sulfona (NLVS); d) grupo ácido bórico ou glioxálico tais como pirazil-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutil)B(OH)2) assim como derivados de ácido dipeptidil bórico ou e) pinacol ésteres tais como benziloxi carbonil(Cbz)-Leu-Leu- boroLeu pinacol ésteres.

27. Composição farmacêutica de acordo com uma de reivindica- ções 23 a 25, caracterizada em que ali são usadas, como inibidores de pro- teassoma particularmente apropriados, as epóxi cetonas epoxomicina (epo- xomicina, fórmula molecular: C28H86N4O7) e/ou eponemicina (eponemicina, fórmula molecular: C20H36N2O5).

28. Composição farmacêutica de acordo com uma de reivindica- ções 23 a 25, caracterizada em que ali são usado, como inibidores de prote- assoma particularmente apropriados das séries PS, os compostos: PS-519 como a beta-lactona e também como o derivado de lac- tacistina o composto 1R-[1S,4R,5S]}-1-(1-hidroxi-2-metil propil)-4-propil-6- oxa-2-azabiciclo[3.2.0] heptano-3,7-diona, fórmula molecular: C12H1 9NO4, e/ou b) PS-314 como o derivado de ácido peptidil bórico o composto ácido N-pirazino carbonil-L-fenil alanin-L-leucina bórico, fórmula molecular: C19H25BN4O4, e/ou c) PS-273 (morfolin-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)- B(OH)2) e seu enantiômero PS-293, e/ou d) o composto PS-296 (8-quinolil sulfonil-CONH-(CH-naftil)- CONH(-CH-isobutil)-B(OH)2), e/ou e) PS-303(NH2(CH-naftil)-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2), e/ou f) PS-321 como (morfolina-CONH-(CH-naftil)-CONH-(CH-fenil alanina)-B(OH)2), e/ou g) PS-334 (CH3-NH-(CH-naftil-CONH-(CH-isobutil)-B(OH)2), e/ou h) o composto PS-325 (2-quinol-CONH-(CH-homo-fenil alanina)- CONH-(CH-ISobutiI)-B(OH)2), e/ou i) PS-352 (fenil alanina-CH2-CH2-CONH-(CH-fenil alanina)- CONH-(CH-isobutil)-1 -B(OH)2), e/ou j) PS-383 (piridil-CONH-(CHpF-fenil alanina)-CONH-(CH- isobutil)-B(OH)2).

29. Agentes, para tratamento de infecções virais e/ou doenças de tumor, que têm uma composição de acordo com uma das reivindicações -1 a 28.

30. Uso da composição de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 28 para tratamento de infecções virais e/ou doenças de tumor.

31. Uso da composição de acordo com uma de reivindicações 1 a 28 para produção de agentes para tratamento de infecções virais e/ou do- enças de tumor.

32. Uso de acordo com a reivindicação 30 ou 31 em combinação com outros agentes que são usados para tratamento de infecções virais e/ou doenças de tumor.

33. Uso de acordo com uma de reivindicações 30 a 32 na forma de . inalações . formas depósitos . emplastros . em sistemas micro-eletrônicos ("pílulas inteligentes").

34. Uso de acordo com uma de reivindicações 30 a 33 em onco- logia e/ou oncologia e virologia.

35. Uso de acordo com a reivindicação 30 ou 31 para tratamento de . glioblastoma (tumores malignos de cérebro) . CA de mama (CA = câncer) . CA de cabeça, pescoço . CA epitelial escamoso . CA de ovário . CA bronquial (célula pequena, célula grande) . CA de tiróide . CA de pulmão . CA de cólon . CA pancreático . leucemia (AML, ALL, CML, CLL) . mielóica aguda, crônica . linfática aguda, crônica . linfoma (não-Hodgkins) . CA cervical . neuroblastoma . CA de pele (melanoma) . CA de prostate . CA de bexiga . sarcoma (osso e polpa) . CA frênico . CA gastrointestinal (tal como estômago, esôfago) . CA testicular . metástases (tal como medula óssea) . vírus linfoma . herpes simplex . citomegalia . varíola . varicella zoster . sarampo . febre de Lassa . AIDS . caxumba (-meningite, -orquite) . enterite; gripe (todas as formas) . encefalite . hepatite (A, B, C, D, E, G) . sarampo Alemão . Coxsackie B . pólio (-mielite) . encéfalomielite . pancreatite . pneumonia . miocardite . doenças tropicais (virais) . todos os vírus de ADN e ARN de fita simples e fita dupla que são patogênicos para humanos.