TWI719446B - 醫藥組合物及其用於製備抑制胃癌細胞增生藥物的用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種醫藥組合物及其用途，所述醫藥組合物係由卡瓦胡椒素B和化療藥物所組成，其可有效抑制腫瘤細胞之細胞存活，並對腫瘤具有體內抑制效果，藉此本發明之醫藥組合物可用以製備抑制腫瘤細胞增生之藥物。

Description

醫藥組合物及其用於製備抑制胃癌細胞增生藥物的用途

本發明是有關於一種醫藥組合物及其用途，特別是一種可用於抑制腫瘤細胞增生的醫藥組合物及其用於製備抑制腫瘤細胞增生之藥物之用途。

癌症又名為惡性腫瘤，為細胞不正常增生，且這些增生的細胞可能侵犯身體的其他部分，為由控制細胞分裂增殖機制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不斷增加的趨勢，癌症係國人十大死因之一，且已連續二十七年為居十大死因之榜首。

其中胃癌為發生在胃部黏膜的癌症，根據世界衛生組織的調查結果，胃癌為全球第三大的致死癌症。早期胃癌症狀包括胃灼熱，上腹疼痛、噁心及食慾不振等，其症狀與消化性潰瘍相當類似，常使患者延誤就醫。而一旦出現例如體重下降及持續性腹痛等明顯的症狀時，經常已進展到無法完全治癒的進行性胃癌。胃癌的診斷多藉由消化道內視鏡來進行檢測，進行消化道內視鏡檢測時常會對患者帶來諸 多不適，使患者望之卻步，進而造成胃癌的延遲診斷，錯失胃癌治療的先機，進而提高胃癌患者的死亡率。

目前胃癌的治療以手術切除、局部放射治療以及全身化學性治療為主。在手術切除方面，早期胃癌有機會以進行根除性手術的方式而達到治癒的效果，然而，對於晚期胃癌患者而言，晚期的胃癌病程已過度發展，使其無法以手術進行切除，即使可進行切除亦具有相當高的復發機率。而在化學藥物治療方面，對早期胃癌的患者施用化學藥物進行治療，效果相較於胃切除手術而言其十分有限，而根據前人的整合分析研究結果顯示，不論是以手術方式或進行化學治療等現行療法對胃癌進行治療，患者的存活率以及預後狀況均不甚理想。因此，如何尋找與開發一種治療胃癌的新策略遂成為相關學界業界所努力的方向。

因此，本發明之一態樣是在提供一種醫藥組合物，其係由卡瓦胡椒素B(Flavokawain B,FKB)和化療藥物所組成，其中所述化療藥物為阿黴素(doxorubicin)或順鉑(cisplatin)。

依據前述之醫藥組合物，其中卡瓦胡椒素B和阿黴素之重量比例範圍可為0.1：1至10：1。

依據前述之醫藥組合物，其中卡瓦胡椒素B和順鉑之重量比例範圍可為1：1至1：2。

依據前述之醫藥組合物，其中卡瓦胡椒素B的有效劑量可為0.1mg/kg至10mg/kg，且化療藥物的有效劑量可為1mg/kg至2mg/kg。較佳地，卡瓦胡椒素B的有效劑量可為0.5mg/kg至0.75mg/kg，且化療藥物的有效劑量可為1.5mg/kg。

依據前述之醫藥組合物，其中醫藥組合物可為錠劑、丸劑、粒劑、粉末、膠囊或液劑。

本發明之另一態樣是在提供一種醫藥組合物之用途，其係用以製備抑制腫瘤細胞增生之藥物。所述醫藥組合物係由卡瓦胡椒素B(Flavokawain B,FKB)和化療藥物所組成，其中所述化療藥物為阿黴素(doxorubicin)或順鉑(cisplatin)。

依據前述之醫藥組合物之用途，其中所述抑制腫瘤細胞增生之藥物可為抑制胃癌細胞增生之藥物。

依據前述之醫藥組合物之用途，其中所述抑制腫瘤細胞增生之藥物可為誘導腫瘤細胞自噬作用之藥物或誘導腫瘤細胞凋亡之藥物。

藉此，本發明所提供的醫藥組合物係由卡瓦胡椒素B和化療藥物所組成，能使卡瓦胡椒素B和化療藥物產生顯著的協同作用以抑制腫瘤細胞增生，包含藉由調控腫瘤細胞的自噬作用和誘導腫瘤細胞凋亡以抑制腫瘤細胞的增生，特別是抑制胃癌細胞的增生。且本發明之醫藥組合物中所含的化療藥物有效劑量遠低於臨床上的使用劑量，藉此可減少化療藥物的使用量，以減少化療藥物所引起的副作用。 因此本發明所揭露之醫藥組合物，可用以製備抑制腫瘤細胞增生的藥物，特別是抑制胃癌細胞增生的藥物，以提升胃癌的治癒成功率。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖為本發明實施例1之醫藥組合物促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡之結果圖；第1B圖為處理本發明實施例1之醫藥組合物後人類胃腺癌細胞株AGS中自噬作用相關蛋白和細胞凋亡相關蛋白之西方墨點法分析結果圖；第2A圖、第2B圖、第2C圖、第2D圖、第2E圖、第2F圖、第2G圖和第2H圖為本發明實施例1之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS細胞凋亡之分析結果圖；第3A圖、第3B圖、第3C圖、第3D圖、第3E圖、第3F圖和第3G圖為本發明實施例1之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用狀況分析結果圖；第4A圖、第4B圖、第4C圖、第4D圖、第4E圖、第4F圖、第4G圖和第4H圖為本發明實施例1之醫藥組合物同時 誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用和細胞凋亡之分析結果圖；第5A圖和第5B圖為處理本發明實施例1之醫藥組合物和JNK1/2抑制劑後人類胃腺癌細胞株AGS的分析結果圖；第5C圖和第5D圖為處理本發明實施例1之醫藥組合物和ERK1/2抑制劑後人類胃腺癌細胞株AGS的分析結果圖；第5E圖和第5F圖為處理本發明實施例1之醫藥組合物和p38抑制劑後人類胃腺癌細胞株AGS的分析結果圖；第6A圖、第6B圖、第6C圖、第6D圖和第6E圖為本發明實施例1之醫藥組合物促進人類胃腺癌細胞株AGS中活性氧化物所介導的自噬作用之分析結果圖；第7A圖、第7B圖和第7C圖為本發明實施例1之醫藥組合物抑制小鼠腫瘤生長的結果圖；第8A圖和第8B圖為本發明實施例2之醫藥組合物後促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡之分析結果圖；第8C圖為本發明實施例2之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用之分析結果圖；以及第8D圖和第8E圖為處理本發明實施例2之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS細胞凋亡之分析結果圖。

本發明提供一種醫藥組合物，其係由卡瓦胡椒素B(Flavokawain B,FKB)和化療藥物所組成，其中所述化療藥物為阿黴素(doxorubicin)或順鉑(cisplatin)。當化 療藥物為阿黴素時，卡瓦胡椒素B和阿黴素之重量比例範圍可為0.1：1至10：1。當化療藥物為順鉑時，卡瓦胡椒素B和順鉑之重量比例範圍可為1：1至1：2。本發明之醫藥組合物中卡瓦胡椒素B的有效劑量可為0.1mg/kg至10mg/kg，且化療藥物的有效劑量可為1mg/kg至2mg/kg。較佳地，卡瓦胡椒素B的有效劑量可為0.5mg/kg至0.75mg/kg，且化療藥物的有效劑量可為1.5mg/kg。此外，本發明之醫藥組合物可為錠劑、丸劑、粒劑、粉末、膠囊或液劑。

本發明另提供一種前述醫藥組合物用以製備抑制腫瘤細胞增生之藥物的用途，所述抑制腫瘤細胞增生之藥物可為抑制胃癌細胞增生之藥物、誘導腫瘤細胞自噬作用之藥物或誘導腫瘤細胞凋亡之藥物。本說明書中並以腫瘤細胞株之體外試驗，證明本發明之醫藥組合物能藉由誘導腫瘤細胞的細胞凋亡和自噬作用達到促進腫瘤細胞死亡的效果。並由小鼠之體內試驗進一步驗證本發明之醫藥組合物能抑制腫瘤的生長，因此，本發明之醫藥組合物可作為潛在的有效抑制腫瘤細胞增生的藥物。

本發明所述之「卡瓦胡椒素B(Flavokawain B,FKB)」為萃取自卡瓦(Kava)的查耳酮類(Chalcones)化合物，其結構如化學式I所示：

流行病學指出，常飲用卡瓦飲料(piper methylsticum)的南太平洋島國家(例如萬那杜共和國、斐濟及西薩摩亞獨立國)比未飲用國家罹患癌症的比率少約三分之一，更發現卡瓦胡椒素B的消耗量與癌症彼此呈負關聯性。但有文獻指出，卡瓦胡椒素B可能有肝毒性，其顯著增強對Acetaminophen誘導C57BL/6小鼠的肝毒性。

本發明所述之「阿黴素(doxorubicin)」屬於蒽環類(Anthracycline)抗生素，為一種作用於DNA的藥物，可以抑制拓撲異構酶(topoisomerase)酵素以抑制DNA和RNA的合成，其被廣泛使用於化學治療中用來治療多種癌症。然而阿黴素具有如下嚴重的副作用：在心臟血管方面的副作用為心肌病變、心室功能不全、鬱血性心衰竭和心律不整；在皮膚方面的副作用為掉髮、四肢及指甲有色素沉澱；在骨髓抑制的副作用為次發性急性骨髓；在腸胃方面的副作用為噁心、嘔吐、腹瀉、口腔炎和食道炎；在代謝及內分泌的副作用為高尿酸血症；在生殖方面的副作用為寡精蟲或無精蟲症。

本發明所述之「順鉑(cisplatin)」是一種含鉑的抗癌藥物，屬於細胞周期非特異性藥物，係藉由破壞DNA的藥物作用機轉毒殺癌細胞促使死亡，其對肉瘤、惡性上皮腫瘤、淋巴瘤及生殖細胞腫瘤等都有治療功效。而順鉑的副作用有骨髓抑制、腎臟損害、噁心、嘔吐、電解質不平衡(低血鈉、鎂、鈣)、神經損害、聽力減退、神智混淆、過敏等，其中順鉑的腎毒性是眾所周知且無法事前預測。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。

[試驗例] 一、本發明實施例1之醫藥組合物

本發明實施例1之醫藥組合物係由卡瓦胡椒素B和阿黴素所組成，其中卡瓦胡椒素B和阿黴素之重量比例範圍可為0.1：1至10：1。

1.1. 實施例1之醫藥組合物促進腫瘤細胞死亡

本試驗以含有不同重量比例卡瓦胡椒素B和阿黴素之本發明實施例1之醫藥組合物處理人類胃腺癌細胞株AGS，並進行細胞存活檢測，以及使用西方墨點法(Western blot)分析處理實施例1之醫藥組合物後，人類胃腺癌細胞株AGS中自噬相關蛋白和細胞凋亡相關蛋白的表現，以探討實施例1之醫藥組合物是否會促進人類胃腺癌細胞株AGS的死亡，以及其可能的機制。

試驗使用的細胞為人類胃腺癌細胞株AGS(BCRC 60102)，屬於上皮形態的胃腺癌細胞，90%以上的胃癌屬於胃腺癌。其購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)。人類胃腺癌細胞株AGS培養於含10%胎 牛血清(Fetal bovine serum；FBS)的RPMI-1640培養液中，放置培養箱維持5% CO₂、37℃恆溫。

細胞存活率(cell viability)之測定係以MTT測定法進行檢測。先將人類胃腺癌細胞株AGS以密度為8×10⁴cells/well接種於24孔盤中。將細胞置於37℃、5% CO₂培養至隔天細胞貼壁後，置換為新鮮培養液後，再加入實施例1之醫藥組合物或卡瓦胡椒素B作為實驗組。其中實驗組所加入實施例1之醫藥組合物固定阿黴素的使用濃度為0.5μg/mL，再進一步調整卡瓦胡椒素B的使用濃度為1.25μg/mL、2.5μg/mL或5μg/mL。單獨處理卡瓦胡椒素B的實驗組，所加入的卡瓦胡椒素B濃度分別為1.25μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO(dimethyl sulfoxide)的控制組。加入實施例1之醫藥組合物或卡瓦胡椒素B後，將細胞置於37℃、5% CO₂再培養24小時。後續進行細胞存活率檢測時，將細胞培養液移除後，每個孔各加入400μL的0.5mg/mL的1×MTT試劑，於37℃、5% CO₂培養箱反應1小時後，移除MTT試劑，再加入400μL的DMSO，以溶解藍紫色的MTT-formazan結晶使溶液呈色。取200μL混合溶液置於96孔盤中，以波長570nm吸光值測定。之後，帶入公式I便可以換算細胞存活率，單位以百分比呈現。

請參照第1A圖，為本發明之實施例1之醫藥組合物促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡之結果圖。結果顯 示，在單獨加入卡瓦胡椒素B的實驗組中，當加入的卡瓦胡椒素B濃度越高，其促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡的效果越好。而與單獨加入卡瓦胡椒素B的實驗組相比，在加入相同濃度的卡瓦胡椒素B的情況下，處理實施例1之醫藥組合物的實驗組其促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡的效果更佳，顯示本發明之醫藥組合物促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡的效果顯著優於單獨加入卡瓦胡椒素B的組別。

藥物對生物活性的效應，彼此間可能具有協同作用(synergism effect)、相加作用(additive effect)或拮抗作用(antagonism effect)。試驗上以卡瓦胡椒素B和阿黴素單獨劑量使用及不同劑量相互配對合併使用，測試其對於促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡的效果與藥物濃度效應間的關係。先根據卡瓦胡椒素B和阿黴素在醫藥組合物中所佔的比例來計算預計值，計算公式為：(%卡瓦胡椒素B×%阿黴素)/100。並根據Chou TC等人(1984)及Liang Zhao等(2004)提出之兩種藥物的聯用指數(combination index,CI)來分析卡瓦胡椒素B和阿黴素間的交互作用。評估的計算公式為：CI=C_{卡瓦胡椒素B,X}/IC_{X,卡瓦胡椒素B}+C_阿黴素,X/IC_X,阿黴素，其中C_{卡瓦胡椒素B,X}和C_阿黴素,X是指同時合併使用卡瓦胡椒素B和阿黴素兩種藥物達到X%有效時的各別部分藥物濃度，IC_{X,卡瓦胡椒素B}和IC_X,阿黴素是指單獨用一種藥物達到X%有效時的藥物濃度。計算出CI值後，如果CI<1認為卡瓦胡椒素B和阿黴素聯用為協同作用；如果CI=1認為卡 瓦胡椒素B和阿黴素聯用為相加作用；如果CI>1認為卡瓦胡椒素B和阿黴素聯用為拮抗作用。

請參照下表一，為含有不同重量比例卡瓦胡椒素B和阿黴素之實施例1之醫藥組合物對於促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡所計算出之聯用指數，其中卡瓦胡椒素B和阿黴素的重量比例分別為2.5：1、5：1和10：1。由表一的結果顯示，重量比例範圍為2.5：1至10：1的卡瓦胡椒素B和阿黴素經互相混合後，其促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡的效果大於卡瓦胡椒素B和阿黴素單獨起到的作用，特別是卡瓦胡椒素B和阿黴素的重量比例為10：1的實施例1之醫藥組合物。

再將分別處理實施例1之醫藥組合物或卡瓦胡椒素B的人類胃腺癌細胞株AGS反應24小時後，利用西方墨點法檢測人類胃腺癌細胞株AGS中自噬相關蛋白和細胞凋亡相關蛋白的表現。其中所加入實施例1之醫藥組合物固定 阿黴素的使用濃度為0.5μg/mL，再進一步調整卡瓦胡椒素B的使用濃度為1.25μg/mL、2.5μg/mL或5μg/mL。單獨處理卡瓦胡椒素B的實驗組，所加入的卡瓦胡椒素B濃度分別為1.25μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

請參照第1B圖，為處理實施例1之醫藥組合物後人類胃腺癌細胞株AGS中自噬相關蛋白和細胞凋亡相關蛋白之西方墨點法分析結果圖。結果顯示，於單獨加入卡瓦胡椒素B的組別，在人類胃腺癌細胞株AGS中，隨著卡瓦胡椒素B的劑量增加，自噬體標記蛋白LC3-I(light chain 3-I)和LC3-II(light chain 3-II)的表現呈現劑量依賴性(dose-dependent)的方式增加。其中LC3-II的增加，表示自噬體(autophagosome)形成的數量增高，此為判斷細胞自噬的指標之一。但於單獨加入卡瓦胡椒素B的組別，參與細胞凋亡下游路徑的凋亡蛋白Procaspase-3沒有減少，同時促進凋亡蛋白Caspase-3沒有活化，因此不會誘導細胞凋亡。而在處理實施例1之醫藥組合物的組別，可見當加入卡瓦胡椒素B的濃度為1.25μg/mL時，LC3-II的表現量最高，隨著卡瓦胡椒素B的劑量增加，LC3-I的表現量反而降低。但在人類胃腺癌細胞株AGS中，隨著卡瓦胡椒素B的劑量增加，LC3-I的表現呈現劑量依賴性(dose-dependent)的方式增加。此外，於處理實施例1之醫藥組合物的組別，Procaspase-3隨著卡瓦胡椒素B的劑量減少，同時Caspase-3亦卡瓦胡椒素B的劑量增加，顯示本發明之醫藥 組合物可以同時誘導人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用和細胞凋亡。

1.2. 實施例1之醫藥組合物誘導腫瘤細胞的細胞凋亡

本試驗例進一步地探討實施例1之醫藥組合物對於誘導人類胃腺癌細胞株AGS細胞凋亡的影響。將人類胃腺癌細胞株AGS分別處理實施例1之醫藥組合物(含有2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和0.5μg/mL的阿黴素)、2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B或0.5μg/mL的阿黴素作為實驗組，反應24小時後，利用TUNEL測定法和流式細胞分析儀(flow cytometry)檢測人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡狀況，並以西方墨點法和免疫螢光染色法檢測在人類胃腺癌細胞株AGS中細胞凋亡相關蛋白的表現。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

請參照第2A圖、第2B圖、第2C圖、第2D圖和第2E圖，為實施例1之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS細胞凋亡之分析結果圖，其中第2A圖為TUNEL測定法分析結果圖，第2B圖、第2D圖和第2E圖為西方墨點法分析結果圖，以及第2C圖為免疫螢光染色分析結果圖。

細胞凋亡的晚期會發生細胞核內DNA斷裂而造成DNA片段化(fragmentation)現象。當DNA被內生性核酸內切酶降解，產生帶有3’末端的切口或斷裂的DNA片段。TUNEL測定法係利用末端脫氧核苷酸轉移酶，使標有螢光色素特殊的核苷酸連接到DNA片段的3’末端，而螢光的強度與DNA片段含量成正比。在第2A圖中，綠色螢光的 數量表示TUNEL陽性細胞的數量，藍色螢光(DAPI)的數量表示細胞的數量。結果顯示，控制組和單獨處理卡瓦胡椒素B的組別未偵測到TUNEL陽性細胞，顯示單獨處理卡瓦胡椒素B不會誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。而單獨處理阿黴素的組別可偵測到少量的TUNEL陽性細胞，但在處理實施例1之醫藥組合物的組別則可偵測到大量的TUNEL陽性細胞，表示人類胃腺癌細胞株AGS的細胞核內DNA片段化的數量顯著增加，造成人類胃腺癌細胞株AGS細胞核內的DNA損傷程度增高，進而誘發人類胃腺癌細胞株AGS的死亡機制。

細胞凋亡過程可分為兩階段：開始階段和效應階段。在開始階段又可分為兩個途徑：外在途徑和內在途徑。其中外在路徑又稱為死亡接受路徑，主要經由許多死亡接受體(death receptor)傳遞訊息，例如Fas(D95)相對之受體Fas L結合後，啟動下游FADD蛋白(Fas-associated death domain)，進而開啟caspase-8，直接活化下游caspase-3，最終導致細胞凋亡。而內在途徑始於腫瘤抑制基因如p53受DNA損傷激發，再刺激Bcl-2家族中於細胞凋亡前起作用的成員(如Bax和Bad)的表達，進而導致粒線體內外膜間物質(如cytochrome C)的釋放。cytochrome C和胞質中的Apaf-1和Procaspase 9共同組成凋亡體，進而開啟caspase-9，直接活化下游caspase-3，最終導致細胞凋亡。

由第2B圖和第2C圖的結果顯示，單獨處理卡瓦胡椒素B的組別，人類胃腺癌細胞株AGS中的cytochrome C、Caspase-9、Procaspase-3、PARP(ploy(ADP-ribose)polymerase)的表現量和控制組相當，而Caspase-3沒有被活化，顯示處理卡瓦胡椒素B不會藉由內在途徑誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。而單獨處理阿黴素的組別，可見其cytochrome C的表現量增加、Caspase-9被活化、Procaspase-3的表現量減少以及Caspase-3被活化，顯示處理阿黴素可藉由內在途徑誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。此外，在單獨處理阿黴素的組別，PARP亦被裂解成89KDa的cleaved PARP，造成PARP失去DNA修復的功能，因此細胞核內的DNA損傷程度增高。而在處理實施例1之醫藥組合物的組別，亦可見cytochrome C的表現量增加、Caspase-9被活化、Procaspase-3的表現量減少以及Caspase-3被活化，且所增加的cytochrome C、Caspase-9和Caspase-3表現量比單獨處理阿黴素的組別更多。此外，處理實施例1之醫藥組合物的組別相較於單獨處理阿黴素的組別，亦可見更多的PARP被裂解成cleaved PARP。顯示處理實施例1之醫藥組合物亦可藉由內在途徑誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡，且細胞凋亡的程度大於單獨處理阿黴素。

第2D圖的結果顯示，單獨處理卡瓦胡椒素B的組別，人類胃腺癌細胞株AGS中的Fas L的表現量和控制組相當，雖Fas的表現量相較於控制組有增加，但Caspase-8 沒有被活化，顯示處理卡瓦胡椒素B不會藉由外在途徑誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。而單獨處理阿黴素的組別，人類胃腺癌細胞株AGS中的Fas L的表現量和控制組相當，但Fas的表現量相較於控制組有增加，且有少量的Caspase-8被活化，顯示單獨處理阿黴素可藉由外在途徑誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。而在處理實施例1之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS中的Fas L和Fas的表現量相較於控制組有增加，並可見有少量的Procaspase-8表現，以及大量的Caspase-8被活化，顯示處理實施例1之醫藥組合物可藉由外在途徑誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡，且細胞凋亡的程度大於單獨處理阿黴素。

細胞凋亡的反應決定因素是由抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2和促細胞凋亡蛋白Bax二聚體所調控，Bcl-2和Bax的相對濃度決定了二聚體的狀態。第2E圖的結果顯示，單獨處理卡瓦胡椒素B，可以顯著地降低人類胃腺癌細胞株AGS中Bcl-2的表現，造成Bax/Bcl-2比例增加，顯示單獨處理卡瓦胡椒素B會促進人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。而在單獨處理阿黴素的組別，人類胃腺癌細胞株AGS中的Bax的表現量增加，且Bcl-2的表現量降低，同樣造成Bax/Bcl-2比例增加，顯示單獨處理阿黴素會促進人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡，且細胞凋亡的程度大於單獨處理卡瓦胡椒素B。而在處理實施例1之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS中的Bax的表現量增加，且Bcl-2的 表現量降低，同樣造成Bax/Bcl-2比例增加，顯示單獨處理實施例1之醫藥組合物會促進人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。

本試驗例進一步地先預先加入或不加入細胞凋亡的抑制劑-半胱天冬酶抑制劑(z-VAD-FMK)20μM反應1小時，再將人類胃腺癌細胞株AGS處理實施例1之醫藥組合物(含有2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和0.5μg/mL的阿黴素)作為實驗組，反應24小時後，先在顯微鏡下觀察細胞形態，並使用MTT測定法檢測細胞存活率，再利用TUNEL測定法檢測人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡狀況。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

請參照第2F圖、第2G圖和第2H圖，為實施例1之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS細胞凋亡之分析結果圖。其中第2F圖為顯微照片圖，第2G圖為細胞存活率的量化圖，第2H圖為TUNEL測定法的分析結果圖。第2G圖的結果數據以平均值±標準差表示，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析。

第2F圖和第2G圖的結果顯示，未先預加入z-VAD-FMK而處理實施例1之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率降低至低於60%(***表示p<0.001)。而在預先加入z-VAD-FMK再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以回復人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率至大約80%，其具有統計意義的差異(##表示p<0.01)。由第2H圖的結果顯示，未先預加入z-VAD-FMK 而處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以偵測到大量的TUNEL陽性細胞。而在預先加入z-VAD-FMK再處理實施例1之醫藥組合物的組別，僅見少量的TUNEL陽性細胞，顯示加入z-VAD-FMK確實可以抑制實施例1之醫藥組合物所誘發的細胞凋亡。

1.3. 實施例1之醫藥組合物誘導腫瘤細胞的自噬作用

本試驗例進一步地探討實施例1之醫藥組合物對於誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用的影響。試驗上先預先加入或不加入1mM的早期自噬的抑制劑3-MA(3-Methyladenine)或1μM的晚期自噬的抑制劑CQ(chloroquine diphosphate)反應1小時，再將人類胃腺癌細胞株AGS處理實施例1之醫藥組合物(含有2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和0.5μg/mL的阿黴素)作為實驗組，反應24小時後，以吖啶橙染色法(Acridine orange staining)驗證人類胃腺癌細胞株AGS死亡的機制。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

吖啶橙染色法可將細胞內因為自噬作用產生的酸性囊狀胞器(Acidic vesicular organells,AVO)染色，在使用螢光顯微鏡觀察細胞內紅色螢光的表現量，紅色螢光的表現量增加，代表細胞內酸性囊狀胞器形成的數量增加。請參照第3A圖和第3B圖，為實施例1之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用狀況分析結果圖，其中第3A圖為預先加入3-MA的分析結果，第3B圖為預先加入CQ的分析結果。第3A圖的結果顯示，未先預加入3-MA而處理實 施例1之醫藥組合物的組別，可以在人類胃腺癌細胞株AGS中偵測到大量的酸性囊狀胞器產生。而在預先加入3-MA再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以逆轉回復人類胃腺癌細胞株AGS中酸性囊狀胞器的產生。而第3B圖的結果顯示，未先預加入CQ而處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以在人類胃腺癌細胞株AGS中偵測到少量的酸性囊狀胞器，而預先加入CQ再處理實施例1之醫藥組合物的組別，反而在人類胃腺癌細胞株AGS中偵測到大量的酸性囊狀胞器產生。由第3A圖和第3B圖的結果顯示，實施例1之醫藥組合物可以誘導人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用，且所誘導的為早期自噬作用。

細胞自噬作用是一種大分子物質的分解機制，細胞藉由自噬體其雙層膜狀構造包圍細胞質的物質，並和溶小體融合以分解物質，其整體過程受ATGs基因調控。哺乳類細胞內的LC3是一種類泛素蛋白，其間介自噬體膜的連結與半融和，並在自噬體的形成具有無可取代的重要性。游離於細胞質的LC3-I與自噬體膜上的磷脂醯乙醇胺共價結合形成LC3-II，並調節自噬體膜的形成與延伸。另一方面，半胱胺酸蛋白酶ATG4B在自噬作用中是一個關鍵的酵素，其可切割LC3前驅蛋白的C端片段產生LC3-I，此外，ATG4B也會催化自噬體膜外的LC3-II，使LC3-II被移除磷脂醯乙醇(phosphatidylethanolamine,PE)並轉換回LC3-I，造成自噬體形成的數量降低。

試驗上再將人類胃腺癌細胞株AGS分別處理實施例1之醫藥組合物(含有2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和0.5μg/mL的阿黴素)、2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B或0.5μg/mL的阿黴素作為實驗組，反應24小時後，利用RT-PCR檢測人類胃腺癌細胞株AGS中自噬相關蛋白LC3B的mRNA表現，以及利用西方墨點法和免疫螢光染色法檢測在人類胃腺癌細胞株AGS中自噬相關蛋白的表現。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

請參照第3C圖、第3D圖、第3E圖、第3F圖和第3G圖，為實施例1之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用狀況分析結果圖，其中第3C圖、第3F圖和第3G圖為西方墨點法分析結果圖，第3D圖為RT-PCR分析結果圖，第3E圖為免疫螢光染色法分析結果圖。

第3C圖的結果顯示，在單獨處理阿黴素的組別、單獨處理卡瓦胡椒素B的組別以及處理實施例1之醫藥組合物的組別，皆可觀察到LC3-II的表現量增加，特別是處理實施例1之醫藥組合物的組別，LC3-II表現量增加的幅度顯著大於其他組別，且亦可觀察到LC3-I的表示。顯示處理阿黴素、卡瓦胡椒素B和實施例1之醫藥組合物皆會誘導人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用，特別是處理實施例1之醫藥組合物，其誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用的程度大於單獨處理阿黴素和單獨處理卡瓦胡椒素B。

第3D圖和第3E圖分別為人類胃腺癌細胞株AGS中LC3B的mRNA表現和蛋白質表現的分析結果圖，其 中第3D圖的結果數據以平均值±標準差表示，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析。結果顯示，單獨處理卡瓦胡椒素B的組別相較於控制組，其LC3B的mRNA表現量雖然有增加，但還不具有統計上的顯著差異。單獨處理阿黴素的組別相較於控制組，其LC3B的mRNA表現量的增加具有統計意義的差異(**表示p<0.01)。而處理實施例1之醫藥組合物的組別相較於控制組，其LC3B的mRNA表現量的增加更顯著地具有統計意義的差異(***表示p<0.001)。顯示處理卡瓦胡椒素B、阿黴素和實施例1之醫藥組合物皆會誘導人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用，且誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用的程度為實施例1之醫藥組合物優於阿黴素和卡瓦胡椒素B。

第3F圖的結果顯示，在單獨處理阿黴素的組別、單獨處理卡瓦胡椒素B的組別以及處理實施例1之醫藥組合物的組別，皆可觀察到ATG4B的表現量減少，特別是處理實施例1之醫藥組合物的組別，ATG4B表現量減少的幅度顯著大於其他組別，顯示處理阿黴素、卡瓦胡椒素B和實施例1之醫藥組合物皆可抑制ATG4B的活性，減少LC3-II被移除磷脂醯乙醇，因此可以促使細胞自噬體形成，進而增加自噬作用的表現。

Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡和自噬作用間起到關鍵性雙重調控作用。Beclin-1為哺乳動物自噬基因，被證實可與Bcl-2家族的抑制凋亡蛋白(例如Bcl-2)結合直接調控自噬作用和細胞凋亡。當Beclin-1與Bcl-2/Bcl-xL結 合構成Beclin-1：Bcl-2/Bcl-xL複合體時可抑制Beclin-1啟動自噬作用，但當Bcl-2家族促凋亡蛋白(例如Bad)競爭性結合Bcl-2/Bcl-xL時，則Beclin-1被釋放誘發自噬。

第3G圖的結果顯示，在單獨處理阿黴素的組別、單獨處理卡瓦胡椒素B的組別以及處理實施例1之醫藥組合物的組別，皆可觀察到Bcl-2的表現量減少，特別是單獨處理卡瓦胡椒素B和處理實施例1之醫藥組合物的組別。而在處理實施例1之醫藥組合物的組別亦可觀察到Beclin-1的表現量增加，顯示處理阿黴素、卡瓦胡椒素B和實施例1之醫藥組合物皆可使Beclin-1/Bcl-2比例增加，因此可誘導人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用。

1.4. 實施例1之醫藥組合物同時誘導腫瘤細胞的自噬作用和細胞凋亡

本試驗例進一步地探討實施例1之醫藥組合物對於同時誘導人類胃腺癌細胞株AGS細胞凋亡和自噬作用的影響。試驗上先預先加入或不加入1mM的早期自噬的抑制劑3-MA或1μM的晚期自噬的抑制劑CQ反應1小時，再將人類胃腺癌細胞株AGS處理實施例1之醫藥組合物(含有2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和0.5μg/mL的阿黴素)作為實驗組，反應24小時後，先在顯微鏡下觀察細胞形態，並使用MTT測定法檢測細胞存活率，再利用西方墨點法檢測人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用相關蛋白和細胞凋亡相關蛋白的表現狀況。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

請參照第4A圖、第4B圖、第4C圖、第4D圖、第4E圖和第4F圖，為實施例1之醫藥組合物同時誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用和細胞凋亡之分析結果圖，其中第4A圖為預先加入3-MA的人類胃腺癌細胞株AGS的顯微照片圖，第4B圖為預先加入CQ的人類胃腺癌細胞株AGS的顯微照片圖，第4C圖為預先加入3-MA的人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率的量化圖，第4D圖為預先加入CQ的人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率的量化圖，第4E圖為預先加入3-MA的西方墨點法分析結果圖，第4F圖為預先加入CQ的西方墨點法分析結果圖。

第4A圖和第4C圖的結果顯示，未先預加入3-MA而處理實施例1之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率降低至低於60%(***表示p<0.001)。而在預先加入3-MA再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以回復人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率至大約70%，其具有統計意義的差異(#表示p<0.05)。由第4B圖和第4D圖的結果顯示，未先預加入CQ而處理實施例1之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率降低至低於60%(***表示p<0.001)。而在預先加入CQ再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以回復人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率至大約90%，其具有統計意義的差異(###表示p<0.001)。上述數據證明實施例1之醫藥組合物確實能造成人類胃腺癌細胞株AGS誘發自噬作用而死亡，且所誘發的可為早期自噬作用和晚期自噬作用。

第4E圖的結果顯示，未先預加入3-MA而處理實施例1之醫藥組合物的組別與控制組相比，人類胃腺癌細胞株AGS中LC3-I和LC3-II的表現量皆增加，且Caspase-3被活化。而在預先加入3-MA再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可見LC3-I和LC3-II的表現量增加的幅度減少，且Caspase-3被活化的程度亦減少。第4F圖的結果顯示，未先預加入CQ而處理實施例1之醫藥組合物的組別與控制組相比，人類胃腺癌細胞株AGS中LC3-I和LC3-II的表現量皆增加，且Procaspase-3的表現量降低，Caspase-3被活化。而在預先加入CQ再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可見LC3-I和LC3-II的表現量與預先加入CQ的組別相當，Procaspase-3的表現量降低的幅度亦與預先加入CQ的組別相當，但Caspase-3被活化的程度減少。上述的結果顯示，處理實施例1之醫藥組合物可以同時誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡和自噬作用，且實施例1之醫藥組合物所誘導的為早期自噬作用。

試驗例上進一步地先預先加入或不加入細胞凋亡的抑制劑z-VAD-FMK 20μM反應1小時，再將人類胃腺癌細胞株AGS處理實施例1之醫藥組合物(含有2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和0.5μg/mL的阿黴素)作為實驗組，反應24小時後，以西方墨點法檢測人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用相關蛋白和細胞凋亡相關蛋白的表現狀況，並以吖啶橙染色法驗證人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用狀況。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

請參照第4G圖和第4H圖，為實施例1之醫藥組合物同時誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用和細胞凋亡之分析結果圖，其中第4G圖為預先加入z-VAD-FMK的西方墨點法分析結果圖，第4H圖為預先加入z-VAD-FMK的吖啶橙染色法分析結果圖。

第4G圖的結果顯示，未先預加入z-VAD-FMK而處理實施例1之醫藥組合物的組別與控制組相比，人類胃腺癌細胞株AGS中LC3-I和LC3-II的表現量皆增加，且Procaspase-3的表現量降低，Caspase-3被活化。而在預先加入z-VAD-FMK再處理實施例1之醫藥組合物的組別與控制組相比，可見LC3-I和LC3-II的表現量增加的幅度不變，但Procaspase-3的表現量與控制組相當，且未見Caspase-3被活化。顯示加入z-VAD-FMK確實可以抑制實施例1之醫藥組合物所誘發的細胞凋亡，但不影響實施例1之醫藥組合物所誘發的自噬作用。

第4H圖的結果顯示，未先預加入z-VAD-FMK而處理實施例1之醫藥組合物的組別與控制組相比，可以在人類胃腺癌細胞株AGS中偵測到大量的酸性囊狀胞器產生。而在預先加入z-VAD-FMK再處理實施例1之醫藥組合物的組別，亦可以在人類胃腺癌細胞株AGS中偵測到大量的酸性囊狀胞器產生。顯示加入z-VAD-FMK不影響實施例1之醫藥組合物所誘發的自噬作用。

1.5. 實施例1之醫藥組合物抑制腫瘤訊息傳導的蛋白

癌細胞中MMPs及uPA活化的訊息傳導路徑以及細胞凋亡的信號轉導過程，係由一種serine/threonine kinases的激酶家族-活化絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogen activated protein kinases；MAPKs)參與。MAPKs包括ERK 1/2(extracellar signal-regluated kinase)，JNK/SAPK(c-Jun NH2-terminal kinase)以及p38。MAPK家族有多個成員及多條反應途徑，利用一連串的蛋白質磷酸化反應來進行訊息的傳導。

磷酸化的MAPK相關蛋白在細胞中可以傳遞許多訊息，MAPKs對細胞的生理功能的影響包括發炎反應(inflammination)、細胞凋亡(apoptosis)、致癌基因轉形、腫瘤細胞轉移，進而向下調控核內的轉錄因子，影響各種蛋白的表現，包括轉移相關蛋白。過去在不同細胞研究顯示經由ERK1/2、p38與JNK路徑會調控MMPs與uPA的表現，例如，抑制了p38的磷酸化，則能增加TIMP-2的表現量，降低癌細胞的轉移能力，而JNK在抑制癌細胞轉移上也占非常重要的角色。因此抑制MAPKs路徑與抑制血管新生、細胞增生與癌細胞轉移有關。

試驗上先預先加入或不加入25μM的JNK1/2的抑制劑SP600125、20μM的ERK1/2的抑制劑U0126或20μM的p38的抑制劑SB203580反應1小時，再將人類胃腺癌細胞株AGS處理實施例1之醫藥組合物(含有2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和0.5μg/mL的阿黴素)作為實驗組，反應24小時後，使用MTT測定法檢測細胞存活率，再 利用西方墨點法檢測人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用相關蛋白和細胞凋亡相關蛋白的表現狀況。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

請參照第5A圖和第5B圖，為處理實施例1之醫藥組合物和JNK1/2抑制劑SP600125後人類胃腺癌細胞株AGS的分析結果圖，其中第5A圖為西方墨點法的分析結果圖，第5B圖為細胞存活率的量化圖。第5A圖的結果顯示，在僅加入SP600125的組別，確實可觀察到JNK1/2的磷酸化表現被抑制。在未先預加入SP600125而處理實施例1之醫藥組合物的組別，可見JNK1/2的磷酸化表現量增加，且LC3-I和LC3-II的表現量亦增加，Caspase-3被活化。而在預先加入SP600125再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可觀察到JNK1/2的磷酸化表現被抑制，而LC3-I和LC3-II的表現量與控制組相當，且未見Caspase-3被活化。第5B圖的結果顯示，未先預加入SP600125而處理實施例1之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率降低至低於50%(**表示p<0.01)。而在預先加入SP600125再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以回復人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率至大約70%，其具有統計意義的差異(#表示p<0.05)。前述數據顯示實施例1之醫藥組合物確實能促進JNK1/2的磷酸化表現，進而誘發人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡和自噬作用。

請參照第5C圖和第5D圖，為處理實施例1之醫藥組合物和ERK1/2抑制劑U0126後人類胃腺癌細胞株 AGS的分析結果圖，其中第5C圖為西方墨點法的分析結果圖，第5D圖為細胞存活率的量化圖。第5C圖的結果顯示，在未先預加入U0126而處理實施例1之醫藥組合物的組別，可見ERK1/2的磷酸化表現大量增加，且LC3-I和LC3-II的表現量亦增加，Caspase-3被活化。而在預先加入U0126再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可觀察到ERK1/2的磷酸化表現被抑制，而LC3-II的表現量與為預先加入U0126的組別相較降低，且未見LC3-I的表現，Caspase-3被活化的情況亦降低。第5D圖的結果顯示，未先預加入U0126而處理實施例1之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率降低至約為40%(**表示p<0.01)。而在預先加入U0126再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以回復人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率至大約80%，其具有統計意義的差異(#表示p<0.05)。前述數據顯示實施例1之醫藥組合物確實能促進ERK1/2的磷酸化表現，進而誘發人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡和自噬作用。

請參照第5E圖和第5F圖為處理實施例1之醫藥組合物和p38抑制劑SB203580後人類胃腺癌細胞株AGS的分析結果圖，其中第5E圖為西方墨點法的分析結果圖，第5F圖為細胞存活率的量化圖。第5E圖的結果顯示，在未先預加入SB203580而處理實施例1之醫藥組合物的組別，p38的磷酸化表現量與控制組相當，但LC3-I和LC3-II的表現量增加，Caspase-3亦被活化。而在預先加入SB203580 再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可觀察到p38的磷酸化表現量增加，而與未預先加入SB203580的組別相比，LC3-II的表現量與控制組相當，但LC3-I的表現量稍微降低，且Caspase-3被活化的程度亦降低。第5F圖的結果顯示，未先預加入SB203580而處理實施例1之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率降低至低於50%(**表示p<0.01)。而在預先加入SB203580再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以回復人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率至大約60%，其具有統計意義的差異(##表示p<0.01)。前述數據顯示實施例1之醫藥組合物未能促進p38的磷酸化表現，p38不會影響實施例1之醫藥組合物所誘發人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡和自噬作用。

1.6. 實施例1之醫藥組合物促進腫瘤細胞中活性氧化物所介導的自噬作用

本試驗例進一步地探討實施例1之醫藥組合物對於同時誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用的機制。活性氧化物(reactive oxygen species；ROS)是生物體在細胞內的代謝和環境刺激下所產生的分子，如O^-2、˙OH和H₂O₂。細胞內自由基造成細胞凋亡的可能機制有自由基改變DNA以誘發細胞凋亡、蛋白質-自由基作用使蛋白質變性。近年來亦有很多研究指出ROS在正常細胞是重要的訊息傳導角色。

試驗上先預先加入或不加入10mM的活性氧化物抑制劑NAC(N-Acetyl-L-cysteine)反應1小時，再將人 類胃腺癌細胞株AGS處理實施例1之醫藥組合物(含有2.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和0.5μg/mL的阿黴素)作為實驗組，反應24小時後，利用脂溶性螢光染劑DCFH-DA反應15分鐘，觀察細胞內活性氧化物的表現量，並使用MTT測定法檢測細胞存活率，和利用西方墨點法檢測人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用相關蛋白和細胞凋亡相關蛋白的表現狀況。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

請參照第6A圖和第6B圖，為DCFH-DA染色結果圖，其中第6A圖為未預先加入NAC的組別，第6B圖為預先加入NAC的組別。結果顯示，處理實施例1之醫藥組合物會誘導人類胃腺癌細胞株AGS產生大量活性氧化物的累積，而加入NAC可以有效抑制細胞內活性氧化物的產生。顯示實施例1之醫藥組合物所誘導人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用可能是因促進活性氧化物的累積所造成的。

請參照第6C圖，為細胞存活率的量化圖，其結果數據以平均值±標準差表示，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析。結果顯示，未先預加入NAC而處理實施例1之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率降低至約40%(***表示p<0.001)。而在預先加入NAC再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可以回復人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率至大約80%，其具有統計意義的差異(##表示p<0.01)。再次證明實施例1之醫藥組合物可以促進活性氧化物的累積，進而誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬性的死亡。

請參照第6D圖和第6E圖，為西方墨點法的分析結果圖，未先預加入NAC而處理實施例1之醫藥組合物的組別與控制組相比，人類胃腺癌細胞株AGS中LC3-I和LC3-II的表現量皆增加，Caspase-3被活化，且PARP被裂解成89KDa的cleaved PARP，Atg4B的表現量亦減少。而在預先加入NAC再處理實施例1之醫藥組合物的組別，可見LC3-I和LC3-II的表現量與未預先加入NAC的組別相較大幅減少，Procaspase-3的表現量與控制組相當，Caspase-3未被活化，PARP的表現量亦與控制組相當，未偵測到cleaved PARP，且Atg4B的表現量減少程度未如未預先加入NAC的組別。上述的結果顯示，實施例1之醫藥組合物可以促進活性氧化物的累積，進而誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬性的死亡。

1.7. 實施例1之醫藥組合物抑制小鼠腫瘤的生長

根據上述結果，可知實施例1之醫藥組合物可以藉由誘發細胞凋亡和自噬作用促進人類胃腺癌細胞株AGS的死亡，以下將以體內試驗(in vivo)方式進一步驗證實施例1之醫藥組合物具有抑制腫瘤生長的效果。

體內試驗之試驗動物品系為BALB/cAnN.Cg-Foxnl ^nu /CrlNarl的無胸腺裸鼠(Nude mice)，購買自國家實驗研究院國家實驗動物中心，為六週齡的母鼠。每組的試驗數目為3隻，總試驗數目共18隻。進行試驗前先在無胸腺裸鼠的左大腿皮下利用異種移植模式(xenograft model)，種植人類胃腺癌細胞株AGS(2×10⁶ cells/70μL 1X PBS)以建立動物模式。試驗時，將每3隻無胸腺裸鼠分為一組，實驗組分為腹腔注射1.5mg/kg的阿黴素、0.5mg/kg的卡瓦胡椒素B、0.75mg/kg的卡瓦胡椒素B、含有1.5mg/kg的阿黴素和0.5mg/kg的卡瓦胡椒素B的實施例1之醫藥組合物和含有1.5mg/kg的阿黴素和0.75mg/kg的卡瓦胡椒素B的實施例1之醫藥組合物，每兩天進行一次前述藥物的腹腔注射。試驗上另包含腹腔注射1.5%DMSO的控制組。試驗動物每三天進行體重測量，並在試驗進行後的第51天，將無胸腺裸鼠犧牲與解剖取出腫瘤組織，並將取出的腫瘤組織秤重觀測腫瘤組織的發展。

請參照第7A圖、第7B圖和第7C圖，為實施例1之醫藥組合物抑制小鼠腫瘤生長的結果圖，其中第7A圖為無胸腺裸鼠的體重變化統計圖，第7B圖為腫瘤組織的照片圖，第7C圖為第7B圖中腫瘤重量的量化圖，第7C圖的結果數據以平均值±標準誤差表示，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析。

第7A圖的結果顯示，不管是施用阿黴素、卡瓦胡椒素B或是實施例1之醫藥組合物，在試驗期間無胸腺裸鼠的體重皆不會被影響。而由第7B圖和第7C圖的結果顯示，施用1.5mg/kg的阿黴素和0.75mg/kg的卡瓦胡椒素B不具有抑制腫瘤生長的效果，施用0.5mg/kg的卡瓦胡椒素B雖可抑制腫瘤的生長，但其未具有統計意義的差異。而施用實施例1之醫藥組合物的組別，不論是施用含有1.5mg/kg的阿黴素和0.5mg/kg的卡瓦胡椒素B的實施例1之 醫藥組合物，或是含有1.5mg/kg的阿黴素和0.75mg/kg的卡瓦胡椒素B的實施例1之醫藥組合物，腫瘤的重量皆顯著地降低，其具有統計意義的差異(*表示p<0.05)。且與單獨施用卡瓦胡椒素B的實驗組相比，在施用相同濃度的卡瓦胡椒素B的情況下，處理實施例1之醫藥組合物的實驗組其抑制無胸腺裸鼠的腫瘤生長的效果更佳，顯示本發明之醫藥組合物所含有的阿黴素和卡瓦胡椒素B的有效劑量低於臨床試驗所使用的濃度，但其抑制腫瘤生長的效果顯著地優於單獨施用卡瓦胡椒素B和阿黴素的組別。

二、本發明實施例2之醫藥組合物

本發明實施例2之醫藥組合物係由卡瓦胡椒素B和順鉑所組成，其中卡瓦胡椒素B和順鉑之重量比例範圍可為1：1至1：2。

2.1. 實施例2之醫藥組合物促進腫瘤細胞死亡

本試驗以含有卡瓦胡椒素B和順鉑之本發明實施例2之醫藥組合物處理人類胃腺癌細胞株AGS，將人類胃腺癌細胞株AGS分別處理實施例2之醫藥組合物[含有1.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和60μM(1.8μg/mL)的順鉑]、1.5μg/mL的卡瓦胡椒素B或60μM(1.8μg/mL)的順鉑作為實驗組，反應24小時後，先在顯微鏡下觀察細胞形態，並使用MTT測定法檢測細胞存活率，以探討實施例2之醫藥組合物是否會促進人類胃腺癌細胞株AGS的死亡。試驗上另包含僅加入0.1% DMSO的控制組。

請參照第8A圖和第8B圖，為本發明實施例2之醫藥組合物後促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡之分析結果圖，其中第8A圖為顯微照片圖，第8B圖為細胞存活率的量化圖，其結果數據以平均值±標準差表示，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析。結果顯示，單獨處理順鉑和單獨處理卡瓦胡椒素B的組別，人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率大約為80%(**表示p<0.01)。而在處理實施例2之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS的細胞存活率降低至低於50%(#表示p<0.05)，其促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡的效果更佳，顯示本發明之醫藥組合物促進人類胃腺癌細胞株AGS死亡的效果顯著優於單獨處理順鉑或單獨處理卡瓦胡椒素B的組別。

2.2. 實施例2之醫藥組合物誘導腫瘤細胞自噬作用

本試驗例進一步地探討實施例2之醫藥組合物對於誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用的影響。試驗上將人類胃腺癌細胞株AGS分別處理實施例2之醫藥組合物[含有1.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和60μM(1.8μg/mL)的順鉑]、1.5μg/mL的卡瓦胡椒素B或60μM(1.8μg/mL)的順鉑作為實驗組，反應24小時後，以吖啶橙染色法檢測人類胃腺癌細胞株AGS的自噬作用狀況。

請參照第8C圖，為實施例2之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用之分析結果圖。結果顯示，單獨處理順鉑和單獨處理卡瓦胡椒素B的組別，可以在人類胃腺癌細胞株AGS中偵測到少量的酸性囊狀胞器產 生。而在處理實施例2之醫藥組合物的組別，可以在人類胃腺癌細胞株AGS中偵測到大量的酸性囊狀胞器產生，其誘導人類胃腺癌細胞株AG自噬作用的效果更佳，顯示本發明之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS自噬作用的效果顯著優於單獨處理順鉑或單獨處理卡瓦胡椒素B的組別。

2.3. 實施例2之醫藥組合物誘導腫瘤細胞的細胞凋亡

本試驗例進一步地探討實施例2之醫藥組合物對於誘導人類胃腺癌細胞株AGS細胞凋亡的影響。。試驗上將人類胃腺癌細胞株AGS分別處理實施例2之醫藥組合物[含有1.5μg/mL的卡瓦胡椒素B和60μM(1.8μg/mL)的順鉑]、1.5μg/mL的卡瓦胡椒素B或60μM(1.8μg/mL)的順鉑作為實驗組，反應24小時後，以西方墨點法分析處理實施例2之醫藥組合物後，人類胃腺癌細胞株AGS中細胞凋亡相關蛋白的表現。

請參照第8D圖和第8E圖，為處理實施例2之醫藥組合物誘導人類胃腺癌細胞株AGS細胞凋亡之分析結果圖。

第8D圖的結果顯示，單獨處理卡瓦胡椒素B的組別，人類胃腺癌細胞株AGS中的Procaspase-3、Procaspase-8、Caspase-8、PARP的表現量和控制組相當，而Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9沒有被活化，PARP未被裂解成cleaved PARP，顯示處理1.5μg/mL的卡瓦胡椒素B不會誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。而單獨處理順鉑的組別，可見Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9被活化，PARP被裂解成cleaved PARP，顯示處理順鉑可以藉由內在途徑和外在途徑誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。而在處理實施例2之醫藥組合物的組別，亦可見Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9被活化，PARP被裂解成cleaved PARP，顯示處理實施例2之醫藥組合物亦可藉由內在途徑和外在途徑誘導人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。

第8E圖的結果顯示，單獨處理卡瓦胡椒素B和單獨處理順鉑的組別，人類胃腺癌細胞株AGS中Bax和Bcl-2的表現與控制組相當。而在處理實施例2之醫藥組合物的組別，人類胃腺癌細胞株AGS中的Bax的表現量增加，且Bcl-2的表現量降低，進而造成Bax/Bcl-2比例增加，顯示單獨處理實施例2之醫藥組合物會促進人類胃腺癌細胞株AGS的細胞凋亡。

綜上所述，本發明提供一種新穎的醫藥組合物，其係由卡瓦胡椒素B和化療藥物所組成，能使卡瓦胡椒素B和化療藥物產生顯著的協同作用以抑制腫瘤細胞增生，包含藉由調控腫瘤細胞的自噬作用和誘導腫瘤細胞凋亡以抑制腫瘤細胞的增生，特別是抑制胃癌細胞的增生。且本發明之醫藥組合物中所含的化療藥物有效劑量遠低於臨床上的使用劑量，藉此可減少化療藥物的使用量，以減少化療藥物所引起的副作用。因此本發明所揭露之醫藥組合物，可用以製備抑制腫瘤細胞增生的藥物，特別是抑制胃癌細胞增 生的藥物，以及誘導腫瘤細胞自噬作用之藥物或誘導腫瘤細胞凋亡之藥物，以提升癌症的治癒成功率。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

Claims (7)

1. 一種醫藥組合物，其係由一卡瓦胡椒素B(Flavokawain B,FKB)和一化療藥物所組成，其中該化療藥物為阿黴素(doxorubicin)或順鉑(cisplatin)，且該卡瓦胡椒素B和該阿黴素之重量比例範圍為0.1：1至10：1，該卡瓦胡椒素B和該順鉑之重量比例範圍為1：1至1：2。
2. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物，其中該卡瓦胡椒素B的有效劑量為0.1mg/kg至10mg/kg，且該化療藥物的有效劑量為1mg/kg至2mg/kg。
3. 如申請專利範圍第2項所述的醫藥組合物，其中該卡瓦胡椒素B的有效劑量為0.5mg/kg至0.75mg/kg，且該化療藥物的有效劑量為1.5mg/kg。
4. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物，其為錠劑、丸劑、粒劑、粉末、膠囊或液劑。
5. 一種如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物之用途，其係用以製備一抑制胃癌細胞增生之藥物。
6. 如申請專利範圍第5項所述的醫藥組合物之用途，其中該抑制胃癌細胞增生之藥物為一誘導胃癌細胞自噬作用之藥物。
7. 如申請專利範圍第5項所述的醫藥組合物之用途，其中該抑制胃癌細胞增生之藥物為一誘導胃癌細胞凋亡之藥物。

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